KR20110027661A - 혈액응고시간의 연장 원인의 판정법 - Google Patents

Abstract

정확하고 용이한 혈액응고시간의 연장 원인의 판정법을 제공하는 것이다.
피검혈장 중의 혈액응고시간 연장 원인의 판정법이며,
(1) (a) 피검혈장만, (b) 정상 혈장만 및 (c) 피검혈장과 정상 혈장을 적어도 1종의 혼합비로 혼합한 시료의 혈액응고시간을 측정하고,
(2) 세로축을 혈액응고시간, 또는 혈액응고시간의 연장율, 가로축을 피검혈장 또는 정상 혈장의 혼합비 또는 혼합율로서 상기(a), (b), (c)의 측정 결과를 플롯하여 얻어지는 절선 그래프를 그렸을 경우의 절선 아래쪽 면적 A와, 상기 (a) 및 (b)의 측정 결과의 플롯을 연결하는 선분 아래쪽 면적 B를 구하고,
(3) 면적 B에 대한, 면적 A로부터 면적 B를 뺀 면적(A－B)의 비율((A－B)/(B)): 면적비 X)을 산출하여,
(4) 응고인자 인히비터 양성 혈장에 대하여 상기 공정(1)~(2)의 조작을 행하여 미리 기준면적비 Y를 정하고,
(5) 면적비 X와 기준면적비 Y를 대비하여, Y≤X의 경우에 응고인자 인히비터형으로 판정하고, Y＞X의 경우에 응고인자 결핍형으로 판정하는 것을 특징으로 하는 판정법.

Description

혈액응고시간의 연장 원인의 판정법{METHOD FOR DETERMINING FACTOR CAUSING THE PROLONGATION OF BLOOD COAGULATION TIME}

본 발명은 혈액 시료 중의 혈액응고시간의 연장 원인을 판정하기 위한 방법에 관한 것이다.

혈액응고 시험은 활성화제 및/또는 Ca^{2 ＋} 등을, 검체 또는 검체 혼합물 중에 첨가한 시점으로부터, 검출 가능한 피블린 덩어리가 형성될 때까지의 시간(혈액응고시간, 이하, 단순히 응고시간이라고 하는 경우도 있다.)을 측정하는 것으로, 혈액응고반응계의 이상 유무의 스크리닝 또는 개별 인자의 활성 측정을 위해 실시되고 있다. 전형적인 예로서는 프로트롬빈 시간(PT), 활성화 트롬보플라스틴 시간(APTT), 트롬빈 시간 등이 있다.

PT란 피검혈장에 조직 트롬보플라스틴 및 Ca^{2 ＋}의 혼합액을 첨가하고 나서 응고할 때까지의 시간이며, 외인계 응고 기서에 관계하는 제 Ⅶ인자, 제 Ⅹ인자, 제 Ⅴ인자, 프로트롬빈, 피브리노겐 등의 응고 활성을 종합적으로 검사하는 것이다. 또, APTT란, 피검혈장에 충분한 양의 인지질 및 활성화제(카올린, 무수 규산, 엘라그산 등)와 적당량의 Ca^{2 ＋}를 첨가하여 응고할 때까지의 시간이며, 내인성 응고 기서에 관계하는 제 XⅡ인자, 제 XI인자, 프리칼리크레인, 고분자 키니노겐, 제 IX인자, 제 VⅢ인자, 제 X인자, 제 V인자, 프로트롬빈, 피브리노겐 등의 응고 활성을 종합적으로 검사하는 것이다. 일반적으로, 이들 혈액응고 시험에 있어서의 이상이라고 하는 것은 응고시간이 연장하는 것을 가리킨다. 혈액응고반응계의 이상은 생체 내에서의 출혈 경향 또는 혈전 경향(혈액응고 경향)의 징조를 반영하고 있다.

이 원인으로서는 1) 혈액응고인자의 결핍 또는 저하, 2) 혈액응고계를 구성하는 혈액성분에 대한 항체의 존재, 3) 혈액응고시간 측정시약 중의 성분에 대한 항체의 존재, 4) 혈액응고계를 구성하는 혈액성분과 혈액응고시간 측정시약 중의 성분과의 복합체에 대한 항체의 존재, 5) 혈액응고반응을 저해하는 약제 투여 등을 생각할 수 있다.

그러나, 단지, 혈액응고시간의 측정을 행하는 것만으로는 그 원인이 단순한 응고인자 결핍에 의한 활성 저하인지, 혈액응고계를 구성하는 성분 또는 혈액응고시간 측정시약중의 성분 등에 대한 항체(인히비터)의 응고반응 저지에 의한 활성 저하인지를 감별할 수 없다. 또, 이 원인의 차이에 의해 치료 방침이 다르기 때문에, 그 감별은 중요하다. 그래서, 피검혈장에 정상 혈장을 첨가하고, 그 혈액응고시간이 보정되는(정상화하는) 정도를 그래프화하여 판정하는 혈액응고 보정시험(믹싱 테스트)이 행해지고 있다(비특허문헌 1).

종래, 믹싱 테스트는 예를 들면, 다음과 같이 하여 실시되고 있다.

피검혈장에 정상 혈장을 첨가하고, 정상 혈장의 비율이 0, 20, 50, 80, 100%가 되도록 혼합하여 조제한 시료를 준비하여, APTT의 측정을 행한다. 그 결과를 그래프(가로축: 혼화한 정상 혈장의 비율 또는 피검혈장의 비율(%), 세로축: 응고시간(초))에 플롯하고, 이 그래프 형상으로부터 시각적으로 판정한다. 예를 들면, 응고인자 결핍의 경우, 소량의 정상 혈장의 첨가(도 1(A)에서는 20%)로 응고시간은 크게 단축하여 정상 혈장 경우의 값에 가까워지기 때문에, 피검혈장과 정상 혈장의 포인트를 연결한 직선(파선)보다도 아래에 볼록 커브를 나타낸다(도 1(A)).

응고인자 인히비터가 존재하는 경우는 정상 혈장의 첨가 비율을 높게 해도 정상 혈장 중의 이 응고인자를 실활 시키기 때문에, 정상 혈장의 첨가에 의한 응고시간의 개선 정도가 작고, 위에 볼록 커브를 나타낸다(도 1(B)).

그러나, 검체에 따라서는 파선과 같은 형상의 그래프(도 1(C))가 되는 경우가 있고, 그 경우는 매우 판정하기 어려운 문제로 되고 있었다.

또, 믹싱 테스트는 시각적으로 판정하는 것이며, 보정 정도를 정량화하는 통일된 방법은 없고, 최종적인 판정은 판정자에게 맡겨져 있으므로, 판정자의 숙련도에 의해 판정 결과가 바뀔 가능성이 있는 것도 문제였다.

더욱이 측정하는 시약의 응고인자 인히비터로의 감수성이 다름에 의해서도 판정 결과가 바뀔 가능성이 있었다. 특히, 시약의 감수성에 의존하는 응고인자 인히비터로서, 루프스안티코어그랜드(이하, LA)가 알려져 있다. LA는 개개의 응고인자에 대한 인히비터가 아니고, 인지질 의존성의 응고반응을 저해하는 면역 글로블린이다. 응고반응에는 인지질의 존재가 필수이기 때문에, 통상, 많은 혈액응고 측정시약에는 인지질이 풍부하게 포함되어 있다. LA는 시약중의 인지질과 반응하여, 이것을 소비하고, 결과적으로 응고반응을 저해하기 때문에, PT나 APTT와 같은 응고 검사가 이상하게 되어 발견되는 것이 많다. 그러나, LA는 인지질의 종류(유래, 인지질 조성 등)에 의해 반응 강도가 다르기 때문에, 사용하는 시약에 의해서도 판정 결과가 다른 것이 알려져 있다.

판정자의 숙련도에 의하지 않고, 판정을 용이하게 하기 위해, 피검혈장의 응고시간을 a, 피검혈장과 정상 혈장의 5:5의 혼합비의 응고시간을 b, 정상 혈장의 응고시간을 c로 하여, 다음과 같은 판정방법도 알려져 있다(비특허문헌 2).

1)(a＋c)/2≤b, 2)(b－c)/a≥x, 3) b－c≥x, 4) b/c≥x

상기 판정방법 1)은 그래프가 위로 볼록한 것인지, 아래로 볼록한 것인지를 수치화한 것뿐이며, 시각적인 판정과 결과는 바뀌지 않는다. 판정방법 2)는 Rosner　Index라고도 불리며, 특히 LA를 판정하는데 유용한 판정법이며, x는 0.15가 적당하다고 되어 있지만, 그 값은 카올린 응고시간(KCT)으로 설정된 값이다. 실제로는 각 시설에서 사용하는 시약에 적절한 x의 설정이 필요하지만, 설정법에 대해서는 불명료하다(비특허문헌 3). 판정방법 3)~4)에 대해서도, 각 시설에서 x의 설정이 필요하지만, 그 설정법에 대해서는 불명료하고, 판정방법으로서 충분하다고는 말할 수 없다.

비특허문헌 1: 검사와 기술, Vol. 34, No.8, 2006년 8월, p735－742 비특허문헌 2: 임상 검사법제요 제 32판, p443 비특허문헌 3: Thrombo. Haemost. Vol. 57, no. 2, 1987, p144－147

이상과 같이, 종래의 방법으로는 컷 오프 값의 설정 방법이 불명료하고, 응고인자 인히비터가 약 양성의 검체를 놓쳐 버리는 위험성이 있었다. 실제, 본 발명자들의 검토에서는 LA 약한 양성 검체의 경우에 믹싱 테스트로 얻어진 그래프가 아래로 볼록하게 되는 예도 보였다. 또, 믹싱 테스트는 측정하는 시약의 응고인자 인히비터로의 감수성의 차이에 크게 좌우되며, 시약에 의하여 측정 결과가 바뀔 가능성이 있었다. 게다가 목시에 의한 판정방법은 상기한 바와 같이, 판정자의 경험에 의한 것이 크고, 숙련도의 차이에 따라 판정 결과가 바뀌는 위험성이 있었다.

따라서, 시약의 응고인자 인히비터 감수성의 강약이나 판정자의 숙련도의 차이에 좌우되지 않고, 혈액응고시간의 연장 원인이 응고인자 인히비터의 존재에 의한 것인지, 응고인자의 결핍에 의한 것인지에 대하여, 일정한 판정 결과를 얻기 위한 판정방법의 개발이 강하게 요구되어 왔다.

본 발명자들은 예의 검토한 결과, 믹싱 테스트의 결과를 목시가 아닌 그래프 중의 면적비의 대비로 하고, 더욱이 컷 오프 값의 설정도 명확한 것으로 한, 다음과 같은 판정방법에 의해 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 다음의 발명을 제공하는 것이다.

1. 피검혈장 중의 혈액응고시간 연장 원인의 판정법이며,

(1) (a) 피검혈장만, (b) 정상 혈장만 및 (c) 피검혈장과 정상 혈장을 적어도 1종의 혼합비로 혼합한 시료의 인지질 의존성의 혈액응고시간을 측정하고,

(2) 세로축을 혈액응고시간, 또는 혈액응고시간의 연장율, 가로축을 피검혈장 또는 정상 혈장의 혼합비 또는 혼합율로서 상기(a), (b), (c)의 측정 결과를 플롯 하여 얻어지는 절선 그래프를 그렸을 경우의 절선 아래쪽 면적 A와, 상기 (a) 및 (b)의 측정 결과의 플롯을 연결하는 선분 아래쪽 면적 B를 구하고,

(3) 면적 B에 대한, 면적 A로부터 면적 B를 뺀 면적(A－B)의 비율((A－B)/(B)):면적비 X)를 산출하고,

(4) 응고인자 인히비터 양성 혈장에 대하여 상기 공정(1)~(2)의 조작을 행하는 미리 기준면적비 Y를 정하고,

(5) 면적비 X와 기준면적비 Y를 대비하여, Y≤X의 경우에 응고인자 인히비터형으로 판정하고, Y＞X의 경우에 응고인자 결핍형으로 판정하는 것을 특징으로 하는 판정법.

2. 응고인자 인히비터 양성 혈장에 대하여 기준면적비 Y가, 복수의 정상인 혈장의 혈액응고시간에 대하여 통계학적으로 구한 기준 범위의 상한치를 넘으며, 또한 이 상한치 ＋50%이내의 혈액응고시간을 나타내는 응고인자 인히비터 양성 혈장에 대하여 구한 것인 상기 1 기재의 판정법.

3. 정상인 혈장의 혈액응고시간에 대하여 기준 범위가, 복수의 정상인 혈장의 응고시간을 통계학적으로 처리하여 얻은 값인 상기 2기재의 판정법.

4. 상기 1의 공정(2)에서 세로축을 응고시간으로 하는 경우에 상기 면적 A 및 면적 B에 대하여, 정수를 뺀 값을 이용하는 상기 1 기재의 판정법.

5. 상기 정수가, 상기 절선 그래프를 그렸을 경우의 정상 혈장의 혈액응고시간의 플롯으로부터 가로축으로 평행한 보조선을 그렸을 경우의 이 보조선 아래쪽 면적인 상기 4 기재의 판정법.

6. 혈액응고시간이 PT(프로트롬빈 시간), APTT(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간), dPT(희석 PT), dAPTT(희석 APTT), KCT(카올린 응고시간) 및 dRVVT(희석 러셀 뱀독시간)로부터 선택되는 적어도 1종인 상기 1~5의 어느 하나의 기재의 판정법.

7. 응고인자 인히비터가, 루프스코안티그랜드(LA), 제 VⅢ 인자 인히비터, 제IX인자 인히비터 및 제 V인자 인히비터로부터 선택되는 적어도 1종인 상기 1~6의 어느 쪽인가에 기재의 판정법.

본 발명 방법에 의하면, 종래 판정이 곤란했던 응고인자 인히비터가 약한 양성의 혈장의 판정도, 보다 정확하게 실시할 수가 있다. 또한, 본 발명 방법에 의하면, 판정자의 숙련도에 영향을 받지 않고, 용이하게 정확한 판정을 행할 수가 있다. 따라서, 본 발명 방법에 의하면, 혈액응고시간 시험에 의해 응고시간이 연장한 환자의 올바른 치료 방침을 결정할 수 있는 것으로 된다.

도 1은 종래 법에 의한 믹싱 테스트의 결과를 나타내는 도면이다. (A)는 응고인자 결핍형, (B)는 응고인자 인히비터형, (C)는 원인이 불명확한 패턴을 나타낸다.
도 2는 공정(2)의 절선 그래프 아래쪽 면적의 예를 나타낸다.
도 3은 공정(2)의 절선 그래프 아래쪽 면적의 예를 나타낸다.
도 4는 공정(3)의 면적(A－B)의 예를 나타낸다(도 2에 대응).
도 5는 공정(3)의 면적(A－B)의 예를 나타낸다(도 3에 대응).
도 6은 검체 번호 1에 대하여 작도된 절선 그래프이다.
도 7은 검체 번호 4에 대하여 작도된 절선 그래프이다.
도 8은 검체 번호 6에 대하여 작도된 절선 그래프이다.

본 발명에 이용하는 피검혈장으로서는 혈액을 그대로 이용하는 것보다도 혈장을 이용하는 것이 바람직하고, 혈소판 제거 혈장을 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 이것은 혈장 중에 잔존하는 혈소판에 유래하는 인지질에 의해, LA와 같은 인지질 의존성의 응고인자 인히비터가 음성화할 가능성을 배제할 수 있기 때문이다.

피검혈장과의 혼합에 이용하는 정상 혈장은 자가 조제 또는 시판의 정상 혈장으로 좋고, 바람직하게는 혈소판 제거처리가 끝난 정상 혈장이 좋다. 상기의 혈소판 제거의 방법은 공지의 방법을 이용하면 좋고, 예를 들면 원심분리나 혈소판 제거 필터 처리 등을 이용할 수가 있다. 시판품으로서는 Pooled　Normal　Plasma(Precision　BioLogic 사제), Platelet　Poor　Plasma(Technoclone사), (LAtrol(Trade　Mark) Normal　Control(American　Diagnostica사) 등이 알려져 있다.

응고인자 인히비터로서는 LA 이외에도, 제 Ⅷ인자 인히비터, 제 IX인자 인히비터, 제 V인자 인히비터 등이 알려져 있고, 이들에 한정되는 것은 아니고, 대상으로 하는 응고인자 인히비터에 감수성을 나타내는 혈액응고시간 측정시약을 이용하면 본 발명 방법을 적용하는 것이 가능하다.

예를 들면, LA를 대상으로 하는 경우에는 LA에 감수성을 나타내는 인지질 의존성의 혈액응고시간 측정시약이면 어떤 것이든 좋고, PT, APTT, dAPTT, dPT, KCT 및 dRVVT 등을 측정하는 시약이 이용되고 있다. 또, 제 Ⅷ인자 인히비터, 제 IX인자 인히비터를 대상으로 하는 경우에는 APTT 측정시약 등, 제 V인자 인히비터를 대상으로 하는 경우에는 APTT 측정시약이나 PT측정시약 등이 이용되고 있다. 상기 시약으로서는 모두 시판품을 사용할 수 있다. 예를 들면, PT측정용 시약으로서는 예를 들면 코아그피아(등록상표) PT－S(세키스이메디컬사 제), 트론보체크 PT플러스(시스멕스사 제), 및 STA 시약 시리즈 PT(로슈사 제)등이 시판되고 있다. APTT 측정용 시약으로서는 예를 들면 코아그피아(등록상표) APTT－S(세키스이 메디컬 사제), 트론보체크 APTT－SLA(시스멕스 사제) 및 APTT 리키드 RD(로슈사 제)등이 시판되고 있다.

한편, 혈액응고 시험의 이상에 의해 결핍 또는 저하가 의심되는 응고인자로서는 피브리노겐, 프로트롬빈, 제 V인자, 제 Ⅶ인자, 제 Ⅷ인자, 제 IX인자, 제 X인자, 제 XI인자, 제 XII 인자, 프리칼리크레인, 고분자 키니노겐이나 폰 빌레브란드 인자(ｖWF) 등을 들 수 있다.

본 발명의 판정법의 공정(1)에 있어서는 (a) 피검혈장만, (b) 정상 혈장만 및 (c) 상기와 같이 하여 얻어진 혼합 시료의 혈액응고시간을 측정한다.

피검혈장과 정상 혈장을 적어도 1종의 혼합비로 혼합한 시료를 이용한 혈액응고시간의 측정(믹싱 테스트)에 있어서의 플롯수는 피검혈장 및 정상 혈장 그것을 포함하여 3점 이상이면 좋지만, 피검혈장과 정상 혈장과의 혼합비의 변동에 수반하는 응고시간의 변동 패턴을 명료하게 하기 위해서는 4점 이상, 더욱 바람직하게는 5점 이상이 좋다. 또한, 플롯수의 상한에 특히 제한은 없지만, 경제성이나 측정 시간을 고려하면 10점 이하가 바람직하고, 7점 이하가 보다 바람직하다.

응고시간의 연장율이란 정상 혈장의 응고시간과 피검혈장만의 경우의 응고시간의 차이를 1로 했을 경우의 상대 비율이다. 물론, 이 응고시간의 차이를 100으로 한 상대% 등으로 나타내도 좋다.

공정(2)는 (a) 피검혈장만의 응고시간, (b) 정상 혈장만의 응고시간 및 (c) 그들의 혼합액 응고시간의 측정 결과를 이용하여, 세로축을 혈액응고시간 또는 혈액응고시간의 연장율, 가로축을 피검혈장 또는 정상 혈장의 혼합비 또는 혼합율로서 상기 (a), (b), (c)의 측정 결과를 플롯하여 얻어지는 절선 그래프를 그렸을 경우의 절선 아래쪽 면적 A와, 상기 (a) 및 (b)의 측정 결과의 플롯을 연결하는 선분 아래쪽 면적 B를 구하는 공정이다. 예를 들면, 세로축을 응고시간의 연장율로 했을 경우의 절선 그래프의 예를, 도 2 및 도 3에 나타낸다(플롯수 3, 즉 혼합한 액은 1종의 예). 여기서, 면적(A)은 예를 들면 도 2 또는 도 3에 나타내는 사각형의 면적이다. 도 4는 도 2에 대각선을 가한 도면이며, 도 5는 도 3에 대각선을 가한 도면이다. 면적(B)은 도 4 또는 도 5와 같이 대각선을 사변으로 하는 직각 삼각형의 면적이다. 또한, 세로축을 혈액응고시간으로 하는 경우, 상기 면적 A 및 면적 B는 그대로의 값을 사용해도 좋지만, 쌍방으로부터 정수를 뺀 값을 이용할 수도 있다. 이 정수로서는 예를 들면 정상 혈장의 혈액응고시간의 플롯으로부터 가로축에 평행한 보조선을 그렸을 경우의 이 보조선 아래쪽 면적의 값을 이용할 수가 있다.

공정(3)은 피검혈장만 및 정상 혈장만의 혈액응고시간 또는 응고시간의 연장율을 연결하는 대각선을 사변으로 하는 직각 삼각형의 면적 (B)에 대한, 절선 그래프와 가로축과 세로축으로 작도되는 다각형의 면적 (A)으로부터 상기 삼각형의 면적을 뺀 면적(A－B)의 비율((A－B)/(B)): 면적비 X)을 산출하는 공정이다. 또한, 면적비는 백분율로 나타내도 좋다.

도 4의 경우에는 면적(A)은 면적(B)보다 크기 때문에, (A－B)/(B)는 양의 수가 된다. 한편, 도 5의 경우에는 면적(A)은 면적(B)보다 작기 때문에, (A－B)/(B)는 음의 수로 된다.

공정(4)은 컷 오프 값을 설정하는 공정이다.

컷 오프 값을 설정하기 위한 시료로서는 응고인자 인히비터의 검출 감도를 높이기 위해, 정상인 혈장에 있어서의 응고시간에 가까운 응고시간을 나타내는 응고인자 인히비터 양성 혈장을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 컷 오프 값 설정용 시료의 혈액응고시간은 복수의 정상인 혈장의 혈액응고시간을 통계학적으로 처리하여 얻은 정상인의 기준 범위의 상한치보다 크고, 상한치 ＋50%이내인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 ＋20%이내, 더욱 바람직하게는 ＋10%이내이다.

또, 상기 범위에 들어가는 응고인자 인히비터 양성 혈장이면 어느 것이든 좋고, 약 양성 혈장을 이용해도 좋고, 강 양성 혈장을 정상 혈장으로 단계적으로 희석한 것을 이용해도 좋다.

상기, 기존의 응고인자 인히비터 양성 혈장으로서는 시판품을 사용할 수도 있다. 예를 들면 LA 양성 혈장의 시판품으로서는 LAtrol(Trade　Mark)(American　Diagnostica사), Lupus　Positiｖe　Control(Precision　BioLogic사 제), Human　Plasma　Lupus　Anticoagulant(Geroge　King　Bio－Medical사) 등이 알려져 있다. 제 Ⅷ인자 인히비터의 시판품으로서는 Human　Plasma　FVIII　with　Inhibitor(Geroge　King　Bio－Medical사)나 Factor　VIII　Inhibitor　Plasma(Technoclone사) 등이 알려져 있다.

단, 이용하는 시약이나 측정 기기 등의 차이를 고려하여 믹싱 테스트를 실시하는 시설마다 컷 오프 값(기준면적비 Y)을 적당히 설정해도 좋다.

또한, 희석 시료의 혈액응고시간 측정시약과 정상인의 혈액응고시간 측정시약은 동일한 것을 이용한다. 예로서 코아그피아(등록상표) APTT－S(세키스이메디컬사 제, 이하 시약 A) 및 트론보체크 APTT－SLA(시스멕스사 제, 이하 시약 B)를 이용했을 경우의 APTT의 예를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

표 1중, 시약 A의 경우에는 컷 오프 값 설정용 시료는 APTT가 정상인의 기준 범위 36.6초보다 큰 39.9초를 나타내는 8배 희석 시료가 된다. 시약 B의 경우에는 APTT가 정상인의 기준 범위 35.7초보다 큰 35.8초를 나타내는 8배 희석 시료가 된다. 또한, 정상인의 기준 범위는 후술과 같이, 복수의 정상인 혈장의 혈액응고시간을 통계학적으로 처리하여 얻은 것이 바람직하다.

공정(5)은 응고인자 인히비터형 또는 응고인자 결핍형을 판정하는 공정이며, 면적비 X 와 기준면적비 Y를 대비하여, Y≤X의 경우에 응고인자 인히비터형으로 판정하고, Y＞X의 경우에 응고인자 결핍형으로 판정할 수가 있다. 판정은 수치에 의해 대비할 수 있으므로, 명확하고, 숙련을 필요로 하지 않는다. 여기서 응고인자 인히비터형은 혈액응고시간의 연장이 상기의 응고인자 인히비터를 원인으로 하는 것이다. 응고인자 결핍형은 혈액응고시간의 연장이, 상기 응고인자의 결핍을 원인으로 하는 것이다.

상기의 면적이나 면적비는 실제로 그래프를 작도하는 등으로 하여 산출해도 좋지만, 같은 계산 결과를 얻을 수 있다면, 그 수단은 상관없다. 즉 응고시간의 측정 기기에 이 계산 결과가 얻어지도록 기능을 부가하여 두고, 시료의 측정 결과로부터 자동적으로 산출시켜도 좋다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱이 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(1) 컷 오프 값의 설정용 시료의 결정

LA 양성 혈장을 정상 혈장으로 4~16배로 희석한 검체를 50μL씩 준비하여, APTT 측정시약 50μL를 첨가하고, 37℃에 3분간 가온한 후, 다시 염화칼슘액 50μL를 첨가하고, 전자동 혈액응고 분석 장치 코아프레스타(등록상표) 2000(세키스이메디컬사 판매)을 이용하여, 응고시간을 측정했다.

LA 양성 혈장으로서는 Lupus　Positiｖe　Control, 정상 혈장으로서는 Pooled　Normal　Plasma(함께 Precision　BioLogic 사제)를 이용했다. 또, APTT 측정시약으로서는 코아그피아(등록상표) APTT－S(세키스이메디컬사 제, 이하 시약 A) 및 트론보체크 APTT－SLA(시스멕스사 제, 이하 시약 B)를 이용했다. 시약의 정상 기준 범위는 각 시약으로 측정한 정상인 48명의 측정값을 기초로, 응고시간의 평균치 ±2SD로 설정했다.

상기 표 1에 나타내는 바와 같이, 시약 A에서는 10배 희석 검체로 36.0초와, 정상 기준 범위 내(26.5~36.6초)로 되었기 때문에, 컷 오프 값의 설정에는 8배 희석 검체를 사용하는 것으로 했다. 동일하게 하여 시약 B에서도 10배 희석 검체로 33.4초와 정상 기준 범위 내(24.6~35.7초)로 되었기 때문에, 컷 오프 값의 설정에는 8배 희석 검체를 사용하는 것으로 했다.

(2) 믹싱 테스트의 실시

(1)에서 이용한 8배 희석 검체 및 표 2에 나타내는 바와 같은 LA 양성 혈장(검체 번호 1~5), 응고인자 결핍 혈장(검체 번호 6~7), 와파린 투여 환자 혈장(검체 번호 8~10)을 이용하여, 이하의 순서에 따라 믹싱 테스트를 실시했다.

피검혈장의 비율이 0, 20, 50, 100%가 되도록 정상 혈장과 혼합한 시료를 준비하고, (1)에 나타낸 APTT 측정시약을 이용하여 응고시간을 측정했다.

다음으로, 각각의 응고시간으로부터 피검혈장 0%(정상 혈장만)에 대한 응고시간 연장율을 산출하고, 세로축을 응고시간 연장율, 가로축을 피검혈장의 비율로서 플롯하여, 절선 그래프를 작성했다.

피검혈장 100%의 응고시간 연장율과 피검혈장 0%(정상 혈장만)의 응고시간 연장율을 연결하는 대각선과 이 절선 그래프로 작도되는 다각형의 면적(도 6, 7, 8)을, 이 절선 그래프 아래쪽 면적으로부터 이 대각선을 사변으로 하는 직각 삼각형의 면적을 뺌으로써 산출하여, 이 대각선을 사변으로 하는 직각 삼각형의 면적에 대한 비율(면적비(%))을 산출했다(표 2).

8배 희석 검체로 산출된 면적비(%)를 각각 시약의 컷 오프 값으로 설정하고, 이 컷 오프 값 이상이 되는 경우에 응고인자 인히비터형(이하, 단지 「인히비터형」이라고 표기한다), 이 컷 오프 값 미만의 경우를 응고인자 결핍형(이하, 단지 「인자 결핍형」이라고 표기한다)으로 판정했다.

이번, 측정 포인트가 3포인트(피검혈장의 비율 0, 50, 100%)의 경우와, 4포인트(피검혈장의 비율 0, 20, 50, 100%)의 경우 두 가지의 면적비(%)를 산출하여, 각각 “본 발명 3point”, “본 발명 4point”로 하여 표 중에 나타냈다(표 2, 3).

[표 2]

비교예 1(시판 LA시약에서의 측정)

시판의 LA측정시약인 LA테스트 「그라디포아」(의학 생물학 연구소 사제) 및 스타크로트 LA(로슈 사제)를 이용하여, 상기와 같은 검체(검체 번호 1~5)에 대하여 첨부 문서에 따라서 측정을 실시했다.

LA테스트 「그라디포아」는“응고시간의 비율”(피검혈장의 응고시간/정상 혈장의 응고시간)을 산출하여, 그 비율이 1.3 이상이 되는 것을 LA양성, 스타크로트 LA는“응고시간의 차이”(피검혈장의 응고시간-정상 혈장의 응고시간)를 산출하여, 그 차이가 8초 이상의 것을 LA양성으로 판정했다.

비교예 2(믹싱 테스트 종래 법에 의한 응고시간의 연장 요인의 판정)

(2)에서 측정된 결과를 이용하여, 이하의 식에 적용시켜 계산했다.

종래 법 1: (a＋c)/2－b

종래 법 2(Rosner　Index): (b－c)/a

a: 피검혈장의 응고시간(초)

b: 피검혈장 50%일 때의 응고시간(초)

c: 피검혈장 0%일 때의 응고시간(초)

종래 법 1에서는 0 이하로 될 때 「인히비터형」이라고 판정하고, 종래 법 2에서는 상기 실시예 1의 (1)의 8배 희석 검체에서의 산출 값 이상으로 되는 경우에 「인히비터형」이라고 판정했다.

실시예와 비교예의 결과의 대비를 표 3에 나타냈다. LA 강양성 검체(검체 번호 1~3: 그라디포아 및 스타크로트 모두 양성)를 시약 A로 측정한 결과, 발명법, 종래 법의 어떤 산출법을 이용하여 판정했을 경우라도 「인히비터형」이라고 판정되었지만, 약양성 검체(검체 번호 4~5: 그라디포아 및 스타크로트의 한쪽이 양성)의 경우, 종래 법 1에서는 「인히비터형」을 검출할 수가 없었다. 게다가 LA 음성 검체에 대하여 확인했더니, 응고인자 결핍 검체(검체 번호 6~7)에서는 어떤 산출법에서도 「인자 결핍형」이라고 판정되었다. 그러나, 와파린 투여 검체(검체 번호 8~10)의 경우, 종래 법 2에서는 검체 번호 9에 있어서 「인히비터형」으로 되는 의양성이 인정되긴 하지만, 본 발명법(3point, 4point)에서는 그라디포아 및 스타크로트와 마찬가지로 「인자 결핍형」이라고 판정할 수 있었다. 이것으로부터, 본 발명법은 특이적으로 「인히비터형」을 검출할 수 있는 것을 알 수 있다.

[표 3]

동일하게, 시약 B를 이용하여 측정한 결과를 표 4 및 표 5에 나타냈다. LA 강양성 검체(검체 번호 1~3)에서의 결과는 발명법, 종래 법의 어떤 산출법을 이용하여 판정했을 경우라도 「인히비터형」으로 되긴 하지만, 그라디포아에서 LA음성으로 판정된 약 양성 검체(검체 번호 4)에 있어서, 3point법과 종래 법 1에서는 「인자 결핍형」이라고 판정되었다. 그러나, 측정 포인트수를 4point로 늘어나는 것으로 「인히비터형」이라고 판정되어, 판정의 정밀도를 향상시키는 것이 판명되었다.

[표 4]

[표 5]

Claims (7)

1. 피검혈장 중의 혈액응고시간 연장 원인의 판정법이며,
   (1) (a) 피검혈장만, (b) 정상 혈장만 및 (c) 피검혈장과 정상 혈장을 적어도 1종의 혼합비로 혼합한 시료의 혈액응고시간을 측정하고,
   (2) 세로축을 혈액응고시간 또는 혈액응고시간의 연장율, 가로축을 피검혈장 또는 정상 혈장의 혼합비 또는 혼합율로서 상기 (a), (b), (c)의 측정 결과를 플롯하여 얻어지는 절선 그래프를 그렸을 경우의 절선 아래쪽 면적 A와, 상기(a) 및 (b)의 측정 결과의 플롯을 연결하는 선분 아래쪽 면적 B를 구하고,
   (3) 면적 B에 대한, 면적 A에서 면적 B를 뺀 면적(A－B)의 비율((A－B)/(B)): 면적비 X)을 산출하여,
   (4) 응고인자 인히비터 양성 혈장에 대하여 상기 공정(1)~(2)의 조작을 행하여 미리 기준면적비 Y를 정하고,
   (5) 면적비 X와 기준면적비 Y를 대비하여, Y≤X의 경우에 응고인자 인히비터형으로 판정하고, Y＞X의 경우에 응고인자 결핍형으로 판정하는 것을 특징으로 하는 판정법.
2. 제 1항에 있어서,
   응고인자 인히비터 양성 혈장에 대하여 기준면적비 Y가, 복수의 정상인 혈장의 혈액응고시간에 대하여 통계학적으로 구한 기준 범위의 상한치를 넘고, 또한 이 상한치 ＋50%이내의 혈액응고시간을 나타내는 응고인자 인히비터 양성 혈장에 대하여 구한 것인 판정법.
3. 제 2항에 있어서,
   정상인 혈장의 혈액응고시간에 대한 기준 범위가, 복수의 정상인 혈장의 혈액응고시간을 통계학적으로 처리하여 얻은 값인 판정법.
4. 제 1항에 있어서,
   청구항 1의 공정(2)으로 세로축을 혈액응고시간으로 하는 경우에 상기 면적 A 및 면적 B에 대하여, 정수를 뺀 값을 이용하는 판정법.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 정수가, 상기 절선 그래프를 그렸을 경우의 정상 혈장의 혈액응고시간의 플롯으로부터 가로축으로 평행한 보조선을 그렸을 경우의 이 보조선 아래쪽 면적인 판정법.
6. 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서,
   혈액응고시간이 PT(프로트롬빈 시간), APTT(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간), dPT(희석 PT), dAPTT(희석 APTT), KCT(카올린 응고시간) 및 dRVVT(희석 러셀뱀독시간)으로부터 선택되는 적어도 1종인 판정법.
7. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
   응고인자 인히비터가, 루프스코안티그랜드(LA), 제 Ⅷ인자 인히비터, 제 IX인자 인히비터 및 제 V인자 인히비터로부터 선택되는 적어도 1종인 판정법.

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