JP2006119126A - 血液凝固因子の不活化方法及び血液凝固因子不活化試料 - Google Patents
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Abstract
【効果】 特定のイオン交換樹脂との接触処理だけで第V因子及び第VIII因子を不活化しているだけなので、短時間で処理でき、しかもVWF等の他の因子への影響がない血液試料を得ることができる。
【選択図】 図1
Description
(1)前記測定試薬がプロトロンビン時間測定試薬であって、前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する方法;
(2)前記検体処理用血漿は、さらに活性型に変化可能な第VIII因子を含み、前記測定試薬がプロトロンビン時間測定試薬であり、前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する方法;
(3)前記検体処理用血漿は、さらに活性型に変化可能な第V因子を含み、前記測定試薬が、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬であり、前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する方法;
(4)前記検体処理用血漿は、さらに活性型に変化可能な第VIII因子を含み、前記測定試薬が活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬であり、前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する方法が挙げられる。
本発明の血液凝固因子の不活化方法は、試料をイミノジ酢酸基(−N(CH2COOR)2、Rが水素又は金属イオンを示す)を有する化合物と接触させて、該試料中の第V因子及び第VIII因子の少なくともいずれか一方を、不活化型に変化させる工程を含む。
本発明の血液凝固因子不活化試料は、上記本発明の不活化方法を利用して得られるもので、第V因子及び第VIII因子の少なくともいずれか一方が不活化型の試料である。
本発明の血液凝固因子不活化方法を正常血漿に適用して得られる、第V因子及び第VIII因子の双方とも不活化された本発明の血液凝固因子不活化血漿を用いて、血液検体に含まれる血液凝固因子の活性を測定することができる。
すなわち、本発明の血液凝固因子活性の測定方法は、不活化型の第V因子及び不活化型の第VIII因子を含有する血液凝固因子不活化血漿を含む検体処理用血漿を用いて、血液検体に含まれる血液凝固因子の活性を測定する方法であって、血液検体、凝固時間を測定するための測定試薬及び検体処理用血漿を混合して測定用試料を調製する工程;前記測定用試料における凝固時間を測定する工程;及び前記凝固時間に基づいて血液凝固因子の活性を算出する工程を含む。
a)検体処理用血漿として、不活化型の第V因子及び不活化型の第VIII因子を含有する血液凝固因子不活化血漿(第V&VIII不活化血漿)を使用し、前記測定試薬としてPT測定試薬を用いて、第V因子の活性を測定する。
具体的には、第V&VIII不活化型血漿と正常血漿を混合し、この混合液に測定用試薬であるPT測定試薬を添加し、凝固時間を測定する。この混合液において段階的に希釈した正常血漿を用いて、因子活性と凝固時間の関係を示す検量線を作成する。一方、被検血漿と前記第V&VIII不活化血漿とを混合してなる混合液(被検血漿含有混合液)に、PT測定試薬を添加し、凝固時間を測定する。先に作成した検量線と前記混合液の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる第V因子の活性を算出することができる。
第V&VIII不活化血漿に、活性型に変化可能な凝固第VIII因子を添加してなる検体処理用血漿は、第V因子不活化型で、第VIII因子は活性型に変化可能な血漿である。この検体処理用血漿と被検血漿とを混合してなる混合液(被検血漿含有混合液)に、PT測定試薬を添加し、凝固時間を測定する。段階的に希釈した正常血漿を用いて作成した検量線及び被検血漿含有混合液の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる第V因子の活性を算出することができる。
すなわち、第V&VIII不活化血漿に、活性型に変化可能な第V因子を添加してなる検体処理用血漿は、第VIII因子が不活化型で、第V因子は活性型に変化可能な血漿である。この検体処理用血漿と被検血漿とを混合してなる混合液(被検血漿含有混合液)に、APPT測定試薬を添加し、凝固時間を測定する。段階的に希釈した正常血漿を用いて作成した検量線及び被検血漿含有混合液の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる第V因子の活性を算出することができる。
すなわち、第V&VIII不活化型血漿に、活性型に変化可能な第VIII因子を添加してなる検体処理用血漿は、第V因子が不活型で、第VIII因子は活性型に変化可能な血漿である。この検体処理用血漿と被検血漿とを混合してなる混合液(被検血漿含有混合液)に、APPT測定試薬を添加し、凝固時間を測定する。段階的に希釈した正常血漿を用いて作成した検量線及び被検血漿含有混合液の凝固時間に基づいて、被検血漿に含まれる第V因子の活性を算出することができる。
本発明の測定方法で検体処理用血漿として使用する血液凝固因子不活化血漿又は検体処理用血漿の調製に使用する血液凝固因子不活化血漿においては、上述のように、第V因子、第VIII因子が不活化型となっているが、第VIII因子におけるVWF結合部位に関する実質的影響が少ない、ないしはほとんどないためか、VWFが残存し、しかもRco活性を有している。従って、従来の凝固因子欠乏血漿を用いた活性測定方法と比べて、以下のような有利な点がある。
(1)第V因子の活性(%)測定
測定試料5μl及びオーレンベロナール緩衝液45μlをキュベットにとり、これに、第V因子欠乏血漿(シスメックス社、神戸)を50μl添加混合して、37℃で1分間加温した。
測定試料10μl及びオーレンベロナール緩衝液40μlをキュベットにとり、これに、第VIII因子欠乏血漿(シスメックス社、神戸)50μlを添加混合して、37℃、1分間加温した。
第VIII因子の存在有無の確認は、British Journal of Haematology,1994,86,106−111に記載された方法に従って行った。ここに記載されている方法では、第VIII因子に対するポリクローナル抗体を用いたELIZA法により、測定サンプル中の第VIII因子を検出する。
測定試料10μlをキュベットにとり37℃で3分加温した後、VWF試薬緩衝液(RI)(Dade−Behring社、ドイツ)を200μl添加し、37℃、5分加温した。次いで、VWF試薬ラテック液(R2)(Dade−Behring社、ドイツ)を100μl添加して得られた混合液の吸光度700nmをコアグレックス800(島津製作所、京都)で測定した。
測定試料100μlをスライド判定板に採取し、これにVWFリストセチンコファクター活性測定用試薬(Dade−Behring社、ドイツ)200μlを滴下した。スライド判定板を3分間撹拌し、凝集を認めたときに陽性(活性有り)と判定する。
表1に示すような陽イオン交換樹脂を用いた。
ヒト新鮮血漿100mlと、イミノジ酢酸型イオン交換樹脂(ムロマック A−1)を、イオン交換樹脂濃度0w/v%、2.5w/v%、5.0w/v%、7.5w/v%、10.0w/v%となるように混合し、処理前、接触処理時間を0.5時間、1.0時間、1.5時間、2.0時間とした場合の、第VIII因子の活性、第V因子の活性を調べた。第VIII因子の活性、第V因子の活性は、接触処理していない標準品(シスメックス社製のコアグトロールN)を測定した場合に得られる凝固活性を100%として算出した。それぞれ測定結果を図2及び図3に示す。図中、縦軸は活性(%)、横軸は接触処理時間を示す。
先天的に第V因子のみ欠乏した血漿中の第VIII因子、先天的に第VIII因子のみ欠乏の血漿中の第V因子が、イミノジ酢酸型陽イオン交換樹脂との接触処理により直接的に不活化されるかどうかを検討した。
従って、本発明のイミノジ酢酸型陽イオン交換樹脂との接触処理による方法では、第V因子、第VIII因子を独立的に不活化型に変化することがわかった。
純品の第VIII因子(Kogenate FS:バイエル薬品:250U/ml)を生理活性食塩水に溶解させてなる溶液(25000%)、及びこの生理活性食塩水溶液を20%イミノジ酢酸型陽イオン交換樹脂で4時間、接触処理した溶液(処理済溶液)を、還元下及び非還元下の条件でSDS電気泳動にかけた。
写真において、レーン1は分子量マーカー、レーン2は接触処理前の第VIII因子(Kogenate FS)を含む溶液、レーン3及びレーン4は第VIII因子含有溶液の処理済溶液、レーン5は接触処理前のヒト第V因子を含む溶液、レーン6はヒト第V因子溶液の処理済溶液である。
生理食塩水に、第VIII因子とVWF複合体である化血研のCofactor F(100U/ml)を溶解させた第VIII因子複合体溶液(10000%、1U/mlが100%に相当)を、イミノジ酢酸型イオン交換樹脂20%と4時間接触させた。処理済溶液について、第VIII因子の活性測定、第VIII因子の検出、VWFの検出、Rco活性の測定を、上記測定方法に従って行なった。
血液試料として、健常のビーグル犬より採血した血漿を用いた。
このイヌ正常血漿を、イミノジ酢酸型陽イオン交換樹脂(ムロマック A−1)(20w/v%)と4.5時間接触処理させた。
以上のことから、ヒトの血漿に限らず、イヌの血漿においても、接触処理によって第VIII因子や第V因子が不活化型に変化することがわかった。
生理食塩水に、第VIII因子とVWFの複合体である化血研のConfact F(財団法人化学及血清治療研究所:100U/ml)を溶解させた第VIII因子複合体溶液(10000%、1U/mlが100%に相当)を、イミノジ酢酸基を有するセファロース20%(w/v)と4時間接触処理させた。この接触処理により得られた溶液について、第VIII因子の活性測定、第VIII因子の検出、VWFの検出及びRco活性の測定を、前記測定方法に従って行なった。一方、ヒトの正常血漿について、同様の接触処理を行ない、得られた血漿について第VIII因子の活性測定、第VIII因子の検出、VWFの検出及びRco活性の測定を行なった。
イミノジ酢酸基を有する化合物として、イミノジ酢酸基を有するセファロースであるChelating Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences社)を水酸化ナトリウム溶液で前処理したものを用いて、ヒト正常血漿を接触処理した。
水酸化ナトリウム水溶液の前処理により、セファロースが有するイミノジ酢酸基(−N(CH2COOR)2)のRがHからナトリウムイオンに変わる。
Claims (19)
- 第V因子及び第VIII因子の少なくともいずれか一方を含む試料をイミノジ酢酸基(−N(CH2COOR)2、Rが水素又は金属イオンを示す)を有する化合物と接触させて、該試料中の第V因子及び第VIII因子の少なくともいずれか一方を、不活化型に変化させる工程を含む血液凝固因子の不活化方法。
- 前記イミノジ酢酸基のRが、一価の金属イオンである請求項1に記載の不活化方法。
- 前記一価の金属イオンが、ナトリウムイオンである請求項2に記載の不活化方法。
- 前記イミノジ酢酸基を有する化合物が、前記イミノジ酢酸基を有する担体である請求項1〜3のいずれかに記載の不活化方法。
- 前記イミノジ酢酸基を有する担体が、前記イミノジ酢酸基を有する陽イオン交換樹脂又は前記イミノジ酢酸基を有する顆粒状アガロースゲルである請求項4に記載の不活化方法。
- 前記接触処理は、前記試料に対して、前記担体を5w/v%以上となる割合で行なう請求項4又は5に記載の不活化方法。
- 前記試料が血漿である請求項1〜6のいずれかに記載の不活化方法。
- 不活化型の第V因子及び不活化型の第VIII因子の少なくともいずれか一方を含有する血液凝固因子不活化試料。
- さらに、フォンヴィルブラント(von willebrandt)因子を含有する請求項8に記載の血液凝固因子不活化試料。
- 前記フォンヴィルブラント因子は、リストセチンコファクター活性を有している請求項9に記載の血液凝固因子不活化試料。
- 不活化型の第V因子及び不活化型の第VIII因子の少なくともいずれか一方を含有する血漿である請求項8〜10のいずれかに記載の血液凝固因子不活化試料。
- 検体処理用血漿を用いて、血液検体に含まれる血液凝固因子の活性を測定する方法であって、
血液検体、凝固時間を測定するための測定試薬及び検体処理用血漿を混合して測定用試料を調製する工程;
前記測定用試料における凝固時間を測定する工程;及び
前記凝固時間に基づいて血液凝固因子の活性を算出する工程;
を含み、
前記検体処理用血漿が、不活化型の第V因子及び不活化型の第VIII因子を含有する血液凝固因子不活化血漿を含む血液凝固因子活性の測定方法。 - 前記血液凝固因子不活化血漿が、イミノジ酢酸基(−N(CH2COOR)2、Rは水素又は金属イオンを示す)を有する化合物と血漿を接触させる処理により得られたものである請求項12に記載の測定方法。
- 前記測定試薬がプロトロンビン時間測定試薬であって、
前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する請求項12又は13の測定方法。 - 前記検体処理用血漿は、さらに活性型に変化可能な第VIII因子を含み、
前記測定試薬がプロトロンビン時間測定試薬であり、
前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する請求項12又は13に記載の測定方法。 - 前記検体処理用血漿は、さらに活性型に変化可能な第V因子を含み、
前記測定試薬が、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬であり、
前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する請求項12又は13に記載の測定方法。 - 前記検体処理用血漿は、さらに活性型に変化可能な第VIII因子を含み、
前記測定試薬が、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬であり、
前記血液凝固因子の活性を算出する工程において、第V因子の活性を算出する請求項12又は13に記載の測定方法。 - 前記血液検体が、血漿である請求項12〜18のいずれかに記載の測定方法。
- 不活化型の第V因子及び不活化型の第VIII因子を含有する血液凝固因子不活化血漿に、活性型変換可能な第V因子又は活性型変換可能な第VIII因子が添加されてなる検体処理用血漿。
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