CN108139383A - 用于检测fviii抑制剂的新型自动筛选方法的研究 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于确定患者中凝血抑制剂的存在的方法。生成与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线和与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，并比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值。Ps/Cs平行度比值小于预定比值表示患者样本中存在凝血抑制剂。

Description

用于检测FVIII抑制剂的新型自动筛选方法的研究

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年5月6日提交的美国临时申请No.62/157,709的权益。

技术领域

本公开总体涉及血液凝固领域，更具体地涉及患者样本中凝血抑制剂的鉴定。

背景技术

通过以下方式确定因子VIII(FVIII)活性：直接测量患者血浆样本的活化部分凝血活酶时间(APTT)，并且通过凝血时间(以秒为单位)的半对数级相对于在几个特定稀释点的标准已知活性百分比绘制标准曲线，由该曲线确定活性百分比。然后将患者血浆与等量的缺乏待测因子的血浆混合以进行稀释，并进行患者样本的因子VIII活性测量，并且由标准曲线计算患者血浆中的因子百分比，其中该标准曲线是通过对于患者样本的特定稀释液而观察到的凝血时间绘制的。在本公开之前，为了最大程度地将少报活性水平或者遗漏抑制剂的存在的可能性降至最低，对患者曲线与标准曲线相比的平行度进行主观评估。在没有抑制剂的情况下，标准曲线和患者曲线彼此平行，患者曲线的斜率(Ps)与标准曲线的斜率(Cs)相似。在具有抑制剂的患者中，凝血时间延长。此外，随着每次随后的稀释，抑制剂的量被稀释，导致随后的稀释液的凝血时间更短。实际上，这使得患者曲线斜率(Ps)小于标准曲线斜率(Cs)，因此它们是非平行线。平行度测定目前是一个主观评估，其导致报告错误增加，并导致潜在的抑制剂评估遗漏和潜在的不必要的抑制剂测试。

发明内容

本文公开了解决本领域的缺点的方法，并且可以提供众多的额外或替代优点，例如提供评价平行度的主观的自动化工具，以作为增加的因子VIII抑制剂存在评价的筛选工具。

本发明的某些实施方案包括确定患者样本中是否存在因子VIII抑制剂的方法。该方法包括以下步骤：生成与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线；生成与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，并比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值，其中小于0.45的Ps/Cs平行度比值表明患者样本中存在因子VIII抑制剂。该方法还包括通过绘制患者样本和对照样本的一系列稀释液的凝血时间点与FVIII凝血活性的曲线，从而生成Ps曲线和Cs曲线。利用与凝血检测机进行电子通信的微处理器确定Ps/Cs平行度比值。在某些实施方案中，该方法进一步包括确定Ps/Cs平行度比值小于0.45，并向患者施用用于治疗与因子VIII抑制剂的存在相关的病症的至少一种药剂。在某些实施方案中，该病症是血友病A。在某些实施方案中，该病症是自身免疫性疾病。在某些实施方案中，该药剂是以下药剂中的一种或多种：人因子VIII、猪因子VIII和FVIII旁路剂。在某些实施方案中，该方法还包括由微处理器产生输出，该输出能够由人类用户通过视觉或听觉感知，或者该输出能够为计算机可读的数字信息，其中输出包括指标Ps/Cs比。

本发明的某些实施方案包括确定患者体液中凝血抑制剂的存在的方法。该方法包括以下步骤：通过生成与患者样本相关并且具有患者斜率(Ps)的患者曲线、并生成与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，从而检测患者样本中是否存在凝血抑制剂(CS)。Ps曲线和Cs曲线是通过绘制患者样本和对照样本的一系列稀释液的多个凝血时间点与凝血活性的活性而生成的。该方法包括比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值的步骤，其中Ps/Cs平行度比值小于预定比值表明患者样本中存在凝血抑制剂。在某些实施方案中，预定比值为约0.45。在某些实施方案中，凝血抑制剂是达比加群。在某些实施方案中，凝血抑制剂是因子VIII抑制剂。在某些实施方案中，凝血剂是哺乳动物因子VIII。

本发明的某些实施方案包括确定患者的体液中抗凝化合物的存在，并对该患者进行治疗的方法。该方法包括获得患者体液样本的步骤；检测患者样本中是否存在抗凝化合物；并且当Ps/Cs平行度比值小于预定比值时，向患者施用有效量的凝血剂。Ps/Cs平行度比值通过以下方式确定：生成与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线；生成与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，其中Ps和Cs曲线是通过绘制患者样本和对照样本的一系列稀释液的多个凝血时间点与凝血活性的曲线而生成的；并且比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值。在某些实施方案中，预定比值为约0.45。在某些实施方案中，抗凝化合物是因子VIII抑制剂。在某些实施方案中，凝血剂是哺乳动物因子VIII。在某些实施方案中，抗凝化合物是达比加群。在某些实施方案中，抗凝化合物是利伐沙班。

从下面结合附图的详细描述可以清楚本公开的许多其他方面、特征和益处。本文所述的检测和治疗方法可以包括取决于所需预防和治疗目的的本文所述的化合物、其他组分或成分。应当进一步理解，上述一般描述和以下详细描述都是示例性和说明性的，并且旨在提供对所要求保护的本发明的进一步说明。

附图说明

通过参考以下附图来更好地理解本公开，这些附图说明了本公开内容的某些原理。

图1是通过对从没有抑制剂的患者得到的生物样本进行分析而获得的具有平行曲线的平行度曲线的实例。

图2是通过对从具有抑制剂的患者得到的生物样本进行分析而获得的具有非平行曲线的平行度曲线的实例。

图3是根据实施方案生成的钟形曲线的实例。

具体实施方式

现在将参考附图中所示的示例性实施方案，并且本文中将使用具体语言来描述这些示例性实施方案。然而，应当理解，在此不意图限制本发明的范围。本文所示的发明特征的变化和进一步的修改以及本文中所示的本发明的原理的另外的应用被认为是在本发明的范围内的，并且这些原理和应用对于相关领域的技术人员是显而易见的。为了解释本说明书，以下定义将适用，并且适当时，单数使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。如果以下列出的任何定义与通过引用并入本文的任何文献相冲突，以下列定义为准。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，提及“一种蛋白质”或“一种抗体”分别包括多种蛋白质或多种抗体；提及“一个细胞”时包括细胞的混合物等。

样本是指来自患者或健康个体的体液或作为本文公开方法的对照物的液体样本。样本的非限制性实例包括血液、血浆、血清、血液提取物或其他血液制品。

预定比值是指针对本发明的特定实施方案标准化的平行度比值，并且在许多情况下通过标准化试剂、反应条件和仪器来评估样本从而确定。

本文的公开内容涉及用于鉴定患者样本中的凝血抑制剂的改进的自动化方法，所述凝血抑制剂特别为因子VIII(FVIII)抑制剂。因此，本公开提供了用于确定患者样本是否含有FVIII抑制剂的方法和系统，并且因此可用于诊断、或辅助诊断与FVIII抑制相关的个体的疾病或其他状况。

简而言之，因子VIII是众所周知的具有约0.0007μmol/L的非常低的正常血浆浓度的凝血因子。它以大量不同的片段种类在与血管性血友病因子(von Willebrand factor)紧密相关的复合物中作为无活性血浆蛋白循环。血液中的因子VIII的激活通常发生在对血管损伤的应答时。激活包括FVIII在其A1区和A2区之间断裂，产生不稳定的异源三聚体因子VIIIa分子。因子VIIIa与因子IX相互作用，后续的充分表征的一系列反应导致血块形成。

本公开部分涉及抑制剂的检测，该抑制剂限制了FVIII参与到最终实现血液凝结的这一系列事件中的能力。在某些实施方案中，本文使用的FVIII抑制剂可以指先天性FVIII缺陷或获得性FVIII缺陷。这样的抑制剂包括但不一定限于与FVIII和/或FVIIa上存在的至少一个表位特异性结合的抗体。在一些实施方案中，抑制剂包含抗FVIII的同种异体抗体，例如由于接受来自不同个体的血液或其他含FVIII的组合物时，个体产生对FVIII的抗体应答，例如，这在一些先天性血友病A患者中出现。在一个实施方案中，例如在具有或有发展中的获得性血友病的个体中，抑制剂可以包含FVIII的自身抗体。这样的个体可能在出生后、并且往往在生命的后期发展自身抗体和血友病状态。因此，应当认识到，本公开适用于确定具有使FVIII失活的同种异体抗体的个体中的FVIII抑制剂，其发生通常直接与其浓度成比例(一级动力学)，或者适用于确定获得性抑制剂/自身抗体，其通常显示非线性失活模式(II型或二级动力学)。该技术的其他应用可识别和分类狼疮抗凝剂，并能够对样本中的特异性抗凝血剂进行快速分类。在本公开之前，此测试通常需要数天至数周时间，并需要额外的分专业测试和专业知识。

使用基于凝块的方法测定FVIII抑制剂的现有技术是本领域公知的。例如，参见Ellinor等人，Laboratory Assessment of Factor VIII Inhibitor Titer，Am J ClinPathol(2009)；Vol.131:552-558。所谓的基于贝塞斯达凝血的测定法是用于定量患者血浆中FVIII抗体的最常用的实验室测试。典型的贝塞斯达方法能够对在患者的血浆或患者血浆的连续稀释与提供功能性FVIII的等量对照血浆(例如正常混合血浆(NPP))混合后所存在的FVIII活性进行量化。使用NPP制备用于控制FVIII不稳定性的阳性对照混合物。用于与患者血浆制成1:1混合物的缓冲正常混合血浆的原液可商购。混合物通常在37℃下孵育约120分钟，在此期间，如果抑制剂存在于患者样本中，则其使FVIII失效。将来自患者样本和阳性样本的结果进行比较。贝塞斯达方法的改良版本，即所谓的“奈梅亨(Nijmegen)”改良法，其通过利用咪唑对患者和对照混合物的pH进行缓冲，并且使用FVIII缺陷型血浆，在对照混合物和患者稀释液中提高了低滴度FVIII抑制剂测定中的特异性。

如本领域技术人员将认识到的，贝塞斯达单位(BU)定义为在37℃下孵育120分钟后，血浆样本中使正常血浆中1单位因子VIII:C的50％失活的抗体或其他抑制剂的量。更详细地说，使用在含咪唑的缓冲液中双倍稀释的患者血浆(范围为1:2至1:1024)，并与等体积的NPP一起孵育，从而计算BU。在典型情况下，NPP将包含约100IU/dl(1IU/ml或100％)的因子VIII。使用含有与缓冲液混合的等体积的正常血浆的对照来确定100％的值，或者如上文针对奈梅亨改良法所讨论的，使用免疫缺陷因子VIII缺陷血浆来确定100％的值。在2小时加热孵育期结束时，测定残留的因子VIII的活性。这通常使用标准的单阶段活化部分凝血活酶时间(APTT)测定，以100％标准作为对照来进行。APTT在本领域中也被称为高岭土脑磷脂凝血时间(KCCT)和具有高岭土的部分凝血致活时间(PTTK)。这些测定法是本领域公知的。通常，通过将磷脂(脑磷脂)和接触激活剂(例如高岭土、微粉化二氧化硅或鞣花酸)加入到血小板不良血浆中，然后加入引发凝血的钙来进行APTT，这是启动凝血的时间点。APTT是从添加钙到形成纤维蛋白凝块所需的时间。大多数实验室采用自动化方法来确定APTT，其中当混合物的光密度已经超过某一阈值时，认为已经发生凝胶形成。然后从构建为显示残留因子VIII活性与抑制剂单位的关系的图计算抑制剂浓度。

通过直接测量患者血浆样本的活化部分凝血活酶时间，并且通过绘制所测量的凝血时间(秒)的半对数与在若干特定稀释点的已知的标准活性百分比的标准曲线，并由该曲线确定活性百分比，从而确定因子VIII活性。这相应地提供了具有特定斜率的直线。将对照线(Cs)与患者线(Ps)进行比较，以确定两条线之间的平行度。如在实施例中进一步描述的，在本公开内容之前，平行度确定是主观判断的，没有用于分开患者的特异性截止参数，这产生了错误解释和结果报告的巨大风险。这个问题已经通过下面实施例中进一步描述的本发明的实施方案得到解决。简而言之，我们比较了不具有可检测的抑制剂(代表无病态)的患者稀释液所产生的曲线的斜率以及具有已知抑制剂(代表疾病状态)的患者稀释液所产生的曲线的斜率与标准曲线的斜率之间的比值。我们通过使用奈梅亨改良的贝塞斯达测定法确认每个患者样本中均存在抑制剂。通过使用由具有和不具有抑制剂的获得的Ps/Cs比值的参数模拟产生的钟形曲线，我们确定0.45的Ps/Cs比值为100％敏感的截止值，并且对于抑制剂的检测具有80％的特异性。因此，本公开基于可获得的统计数据证明，如果Ps/Cs曲线的比值<0.45，则样本中存在抑制剂的几率为100％。因此，在某些实施方案中，Ps/Cs曲线的比值<0.45表示获得样本的个体需要进行与存在FVIII抑制剂相关的病症的治疗。如果需要，可以进一步表征抑制剂的类型。在一些实施方案中，可进行进一步测试以确定肝素污染和/或狼疮抗凝血剂的存在。额外的抑制剂鉴定分类和抗凝药物分类将在同一过程中进行，并利用斜率的比值从而对是否存在药物以及所存在的试剂类型进行分类。本发明的某些实施方案可用于区分非特异性凝血抑制剂(例如狼疮抗凝剂)或特异性凝血因子抑制剂(例如特异性口服抗凝剂)。

在一些实施方案中，本公开包括确定个体的Ps/Cs曲线的比值<0.45，并且向个体施用至少一种用于治疗个体中与抑制剂存在相关的病症或病症的试剂。在一些实施方案中，确定Ps/Cs曲线的比值<0.45被用于诊断或帮助医师对病症进行诊断。在一些实施方案中，疾病包括先天性疾病，例如先天性血友病A，或获得性因子VIII抑制剂的发展，例如获得性血友病A，

在一些实施方案中，本公开包括确定Ps/Cs曲线的比值<0.45，诊断该患者患有与存在至少一种因子VIII抑制剂相关的病症，以及向该个体施用至少一种用于治疗该病症的外源性试剂。在一些实施方案中，所述个体被诊断患有血友病A，并且被施用治疗血友病A的试剂。

在一些实施方案中，根据本公开测试来自个体的样本并且确定Ps/Cs曲线的比值<0.45，并且诊断该患者患有与存在至少一种因子VIII抑制剂相关的病症，随后向该个体施用至少一种用于治疗该病症的外源性试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自1-脱氨基-8-d-精氨酸加压素、人或猪因子VIII浸剂、FVIII旁路试剂(例如活化的凝血酶原复合物浓缩物)、Xa或VIIa，包括其重组形式，或者使所述个体施用用于抑制剂消除、或用于免疫抑制的试剂。在一些实施方案中，使用体外方法来(例如)将FVIII的自身抗体除去，例如用血浆置换法或免疫吸附法。在一些实施方案中，对于出血患者，或预定将进行外科手术的患者，以及具有高滴度抑制剂和/或未能对旁路试剂作出反应的患者，施用抑制剂减少或消除。在某些方法中，在减少或消除抑制剂的体外方法之后，给予个体FVIII替代物，例如可有效实现止血的量的FVIII。

在某些实施方案中，根据本公开内容测试来自个体的样本，并确定Ps/Cs曲线的比值<0.45，并且诊断患者患有与存在至少一种因子VIII抑制剂相关的病症，然后向个体施用至少一种免疫抑制剂，例如泼尼松龙。在一些实施方案中，免疫抑制剂可以与旨在增强其效果的另一种试剂组合，例如环磷酰胺、硫唑嘌呤、长春新碱、麦考酚酸莫酯、2-氯脱氧腺苷、环孢霉素A以及它们的组合。

在某些实施方案中，根据本公开内容测试来自个体的样本，并确定Ps/Cs曲线的比值<0.45，并且诊断该患者患有与存在至少一种因子VIII抑制剂相关的病症，然后向个体静脉注射免疫球蛋白(IVIG)。在一些实施方案中，该个体也可以用靶向生物疗法(例如利妥昔单抗)单独治疗或与其他药物(如泼尼松和/或环磷酰胺)联合治疗。

本公开的方法可以在测定系统或血液分析仪上进行。这样的设备可以执行测定或其他测量，向数据处理设备发送信息，分析信息，以及显示、打印或以其他方式发送在分析期间确定的结果或其他信息。可以执行该方法的机器的实例包括作为非限制性实例的STA-R Evolution(由Diagnostica Stago制造)或凝血分析仪如CA-1500、CA-660、CS-2011i或CS-5100(由Sysmex UK LTD制造)。示例性系统在美国专利No.7,720,880、No.7,085,669中所有描述，它们各自的公开内容全部通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开的方法使用这样的机器进行，其与被编程为产生Ps/Cs曲线比值并且识别在本文所述的0.45阈值的任一侧上分离的样本的微处理器电子连通。在一些实施方案中，本公开包括接收对于至少一个患者样本和至少一个对照样本的数字化数据对应的输入；绘制数字化数据以获得Ps和Cs曲线；从数字化数据计算Ps/Cs比值，并提供Ps/Cs比值这一指标作为用户可识别的输出。在一些实施方案中，用户可识别的输出由选自由视觉显示器、打印机、输出数据端口、RF发射器和数字媒体存储设备构成的组中的设备提供。

在各种实施方案中，本公开包括在有形媒介中确定Ps/Cs曲线的比值。有形介质可以是任何类型的有形介质，例如任何类型的数字媒介，包括但不限于DVD、CD-ROM、便携式闪存设备或打印或数字化报告等，例如电子表格或文字处理文件。本公开包括向医疗保健供应商提供有形媒介，以帮助开发用于个体治疗和/或为个体预后的诊断和/或建议，例如用于治疗血友病或任何其他与FVIII抑制剂的存在相关的病症。

在某些实施方案中，本公开包括在一段时间(例如治疗阶段)内对来自个体的样本进行连续测试，以监测旨在治疗血友病或与存在FVIII抑制剂相关的任何其他病症的治疗方法的进程，和/或确定在任何特定治疗过程中个体中抑制剂的量是否被减少和/或失活。

血友病A治疗最严重的不良并发症之一是产生针对因子VIII的抗体，最常见的是在已知因子VIII缺乏症患者中产生输血因子VIII的同种异体抗体。在高达25％-30％的重度血友病A患者和3％-13％的轻度血友病患者中会产生抑制剂。虽然大多数因子VIII抑制剂出现在患有重度血友病的患者中，但越来越多的担心是近30％的被诊断的新抑制剂出现在轻度血友病患者中，导致出血症状，其是更严重的血友病特征。

重度血友病A患者的大多数抑制剂在最初的50天暴露时间的治疗早期发生，据估计，在严重疾病患者的最初的18天暴露时间内的总体风险为36％。相比之下，大多数患有轻度血友病者的抑制剂在生命的后期发生，通常是在通过用于进行外科手术或创伤的FVIII浓缩物进行密集治疗时发生。

在产生抑制剂的重度血友病患者中，主要临床表现是对输注因子的反应降低。预防性因子输注可能会出现更多的穿透性出血或对急性出血事件的输注反应较少。在轻度血友病患者中，抑制剂的产生也可能导致对内源性因子的反应降低，导致更严重的表型的发展。

当怀疑是抑制剂时，临床实验室必须执行繁琐且耗时的测定以用于确认。传统上，通过贝塞斯达测定法进行确认。该测定法检测抑制剂的复杂程度以及血友病患者中抑制剂发展凸显了这种新研发的自动筛选测定的价值，其可以很容易地应用于基于aPTT的FVIII测定。本文描述的方法可以检测FVIII以及其他凝血因子的内源性和外源性抑制剂的存在。

除了本发明的临床益处之外，本文所描述的测定方法促使常规因子凝血测定提供对于是否存在抑制剂的客观筛选方法，其能够容易地应用于任何凝血系统平台，这凸显了本发明的合理性。本发明的实施方案还可以筛选其他特异性凝血因子或狼疮抗凝剂的抑制剂的检测。本发明的实施方案还可以筛选在施用直接抑制因子Xa和凝血酶的新型口服抗凝剂上存在出血或复发性静脉血栓栓塞的患者中是否存在抑制剂作用。

该方法的某些实施方案包括确定在患者的体液中存在抗凝化合物并治疗该患者。该方法包括以下步骤：获得患者体液样本，并检测患者样本中是否存在抗凝化合物。通过如下方式检测抗凝化合物的存在：生成与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线；生成与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，并比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值。所述Ps和Cs曲线是通过绘制患者样本和对照样本的一系列稀释液的多个凝血时间点与FVIII凝血活性的曲线而产生的。Ps/Cs平行度比值小于预定比值表明患者中存在抗凝化合物。然后向患者施用有效量的凝血剂。该方法的实施方案也可用于筛查新型靶标特异性口服抗凝剂的患者。

以下事实凸显了在美国静脉血栓栓塞的影响：每年有30万至60万例新发病例，在诊断为肺栓塞的1个月内死亡率高达12％。这促使产生了直接靶向凝血酶(达比加群)或因子Xa(利伐沙班、阿哌沙班、埃德昔宾)的靶向特异性口服抗凝剂的市场。最近的研究表明PT和APTT增加，并且因子II、V、VII、VIII、IX、X和XI活性降低。对于达比加群，凝血时间已显示以剂量依赖性方式延长，但是其过度敏感。目前现有的测定法不能快速筛选出任何这些试剂的存在。例如，直接服用口服抗凝血剂的患者需要紧急手术和外科手术，其可能不知道或不能传达他们所使用的抗凝剂和/或最后一次服用的时间。本发明的一个实施方案可以包括自动筛选测定法，该方法能够快速筛选患者样本中任何这些抗凝剂的存在。例如，如果识别出了达比加群并且需要逆转出血，则可以使用特定的凝血剂，例如伊多沙珠单抗(idarucizumab)。根据患者的需要和具体治疗方案，还可以使用激活的凝血酶原复合物浓缩物(FEIBA)。某些情况可能涉及治疗方案，如血液透析，其存在或不存在抗纤维蛋白溶解剂。在另一个实施方案中，如果识别出了利伐沙班、阿哌沙班或艾多昔班(因子Xa抑制剂)，并且需要逆转出血，则可以使用非激活的凝血酶原复合物浓缩物(Kcentra)。根据患者的需要和具体治疗方案，还可以使用抗纤维蛋白溶解剂或靶向抗凝剂，例如Andexanet。

血小板功能的检测和测定对于鉴定患有血小板功能障碍或亢进的患者、以及监测抗血小板治疗而言是重要的。本发明的实施方案还可以用于评估血小板功能以及是否存在抗血小板剂。该方法的某些实施方案包括确定患者的体液中是否存在抗血小板剂。该方法包括以下步骤：获得患者的体液样本并检测患者样本中是否存在抗血小板剂。通过以下方式来检测是否存在抗血小板剂：生成与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线；生成与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，并比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值。Ps和Cs曲线是通过进行血小板功能测试产生的。血小板功能测试可以包括血小板聚集研究(PFT)或血小板功能测定(PFA)中的一种或多种。血小板功能测试的实例包括但不限于以下中的一种或多种：凝血时间测定、粘弹性测定法、出血时间、血小板聚集研究或流式细胞术。

抗血小板药物类别包括不可逆环氧合酶抑制剂、腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、蛋白酶激活受体-1(PAR-1)拮抗剂、糖蛋白IIB/IIIA抑制剂、腺苷再摄取抑制剂和血栓烷抑制剂。不可逆环氧合酶抑制剂的实例包括阿司匹林和三氟醋柳酸(Disgren)。腺苷二磷酸(ADP)受体抑制剂的实例包括氯吡格雷(Plavix)、普拉格雷(Effient)、替卡格雷(Brilinta)和噻氯匹啶(Ticlid)。磷酸二酯酶抑制剂的实例包括西洛他唑(Pletal)。蛋白酶激活受体-1(PAR-1)拮抗剂的实例包括沃拉帕沙(Zontivity)。糖蛋白IIB/IIIA抑制剂(仅用于静脉内使用)的实例包括阿昔单抗(ReoPro)、依替巴肽(Integrilin)和替罗非班(Aggrastat)。腺苷再摄取抑制剂的实例包括双嘧达莫(Persantine)。血栓烷抑制剂的实例包括血栓烷合成酶抑制剂和血栓烷受体拮抗剂(Terutroban)。

提供以下实施例来说明本发明，但不旨在以任何方式进行限制。

实施例1

如上所述，典型的因子VIII测定法由标准曲线确定因子VIII活性(以百分比为单位)。该标准曲线是通过绘制所测量的凝血时间(以秒为单位)与在几个特定稀释点的已知的标准活性百分比曲线而产生的。然后通过以下方式测定患者样本中因子VIII的活性：将患者血浆稀释液与等量已知因子缺乏血浆混合，然后绘制特定患者样本稀释液所观察到的凝血时间从而得到标准曲线，并且由该标准曲线计算患者血浆中是否存在因子。为了最大程度地将少报活性水平或者遗漏抑制剂的存在的可能性降至最低，当以对数进行绘制时，由患者血浆稀释液凝血时间给出的线应平行于系统对照血浆稀释液给出的线。

在没有抑制剂(无疾病状态)的情况下，标准曲线和患者曲线彼此平行，患者的斜率(Ps)类似于标准曲线的斜率(Cs)(图1)。在存在抑制剂(疾病状态)的患者中，凝血时间延长。随着每次随后的稀释，抑制剂的量被稀释，导致随后的稀释液的凝血时间更短。实际上，与标准曲线斜率(Cs)相比，斜率(Ps)更小(图2)。在本公开之前，“平行度”的确定是主观评估，导致报告错误增加，潜在遗漏的抑制剂评估和潜在的不必要的抑制剂测试。

我们对因子VIII缺乏血友病患者的适当稀释液进行了因子VIII测定(使用1:6、1:15和1:30稀释液下的低曲线校准的STA Compact的低因子VIII测定修饰(STA DeficientVIII，STA的用于因子VIII:C测定的免疫缺陷型血浆)。通过将由不具有可检测到的抑制剂(无病态)的患者稀释液产生的曲线的斜率以及由具有已知抑制剂(疾病状态)的患者稀释液产生的曲线的斜率与标准曲线的斜率进行比较，从而检测曲线的平行度。我们通过使用奈梅亨改良的贝塞斯达测定法确认每个患者样本中抑制剂的存在。

从具有和不具有抑制剂的21个样本中筛选获得的Ps/Cs比值的参数模拟产生钟形曲线，通过使用该钟形曲线我们确定0.45的Ps/Cs比值为截止值，其对于抑制剂检测来说是100％敏感并具有80％的特异性(图3)。因此，如果曲线的比值<0.45(参见图3中的垂直条)，样本中存在抑制剂的几率为100％。然而，我们基于这些钟形曲线认识到，较小百分比的具有抑制剂患者可能会错过更大的样本量。因此，为了确认这一截止值的有效性，我们筛选了48个未鉴定样本，该样本具有和不具有从NHLBI生物标本和数据储存库获得的低FVIII抑制剂(贝塞斯达滴度<5)。在这个较大的样本集中，我们得到的对于检测FVIII抑制剂的截止率<0.45为100％敏感，且具有91.6％的特异性，阳性预测值为92.3％，阴性预测值为100％。(表1和表2)。

表1：在48个未鉴定样本中使用患者斜率与对照斜率的比值(Ps/Cs)的平行度曲线的抑制剂筛选结果

表2：验证研究：利用患者斜率与对照斜率比值<0.45的平行度曲线对抑制剂进行筛选的统计分析

因此，从上文将会认识到，本文的公开内容提供了一种经验证的筛选工具，其用于在常规FVIII测定期间检测因子VIII的抑制剂的存在。该方法适用于筛选检测其他特异性凝血因子(如FIX)的抑制剂、狼疮抗凝剂，以及直接抑制因子Xa或凝血酶的新型口服抗凝剂的存在。

为了提供更简明的描述，本文中的一些定量表达被列举为从大约X到大约Y的范围。应当理解，其中列举了一个范围，该范围不限于所述的上限和下限，而是包括从大约X到大约Y的全范围，或其中的任何数量或范围。为了提供更简明的描述，本文给出的一些定量表达式没有加上术语“约”。应当理解，无论是否明确使用术语“约”，本文给出的每一个数量都是指实际的给定值，并且也意指根据本领域的普通技术人员能够合理推断的给定值的近似值，包括由于这种给定值的实验和/或测量条件引起的近似值。在某些情况下，近似语言可能对应于仪器的精度或测量值的测试条件。

虽然已经通过具体实施方案描述了本发明，但是常规修改对于本领域技术人员将是显而易见的，并且这样的修改旨在本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种确定患者样本中因子VIII抑制剂的存在的方法，该方法包括以下步骤：

生成与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线；

生成与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，以及

所述Ps曲线和Cs曲线是通过绘制所述患者样本和所述对照样本的一系列稀释液的多个凝血时间点与FVIII凝血活性的曲线而生成的；

比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值，其中Ps/Cs平行度比值小于0.45表示患者样本中存在因子VIII抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Ps/Cs平行度比值由与凝血检测机进行电子通信的微处理器确定。

3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：确定所述比值<0.45，并且向患者施用至少一种用于治疗与因子VIII抑制剂的存在相关的病症的试剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述病症是血友病A。

5.权利要求3的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病。

6.权利要求3的方法，其中所述试剂是以下中的一种或多种：人因子VIII、猪因子VIII和FVIII旁路试剂。

7.根据权利要求2所述的方法，还包括：

由微处理器产生输出，该输出能够由人类用户通过视觉或听觉方式感知，或者该输出能够作为计算机可读的数字信息，其中所述输出包括指标Ps/Cs比值。

8.一种确定患者样本中凝血抑制剂的存在的方法，所述方法包括：

通过如下方法检测患者样本中凝血抑制剂的存在：

产生与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线；

产生与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，以及

所述Ps曲线和Cs曲线是通过绘制所述患者样本和所述对照样本的一系列稀释液的多个凝血时间点与FVIII凝血活性的曲线而生成的；

比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值，其中Ps/Cs平行度比值小于预定比值表示所述患者样本中存在凝血抑制剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述预定比值为约0.45。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述凝血抑制剂是达比加群。

11.权利要求8的方法，其中所述凝血抑制剂是因子VIII抑制剂。

12.权利要求8的方法，其中所述凝血剂是哺乳动物因子VIII。

13.一种确定患者样本中抗凝化合物的存在并治疗该患者的方法，所述方法包括：

获得患者的体液样本；

通过以下方式检测所述患者样本中是否存在抗凝化合物：

产生与患者样本相关并具有患者斜率(Ps)的患者曲线；

产生与对照样本相关并具有对照斜率(Cs)的标准曲线，以及

所述Ps曲线和Cs曲线是通过绘制所述患者样本和所述对照样本的一系列稀释液的多个凝血时间点与FVIII凝血活性的曲线而生成的；

比较Ps和Cs以获得Ps/Cs平行度比值，

当Ps/Cs平行度比值小于预定比值时，向患者施用有效量的凝血剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述预定比值为约0.45。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗凝化合物是因子VIII抑制剂。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述凝血剂是哺乳动物因子VIII。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗凝化合物是达比加群。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述凝血剂是伊多沙珠单抗。

19.权利要求13的方法，其中所述抗凝化合物是利伐沙班。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述凝血剂是非活化凝血酶原复合物浓缩物。