KR20110013348A - 통증 치료를 위한 라놀라진의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사실상 기계적, 내장의, 및/또는 염증성일 수 있는 신경병증 또는 통각수용성 통증을 겪고 있는 환자에게 치료학적 유효량의 라놀라진을 투여하는 것을 포함하는 상기 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

통증 치료를 위한 라놀라진의 용도 {USE OF RANOLAZINE FOR TREATING PAIN}

본 출원은 전문이 참조로서 본원에 인용되어 있는, 2008 년 2 월 6 일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제 61/026,699 호 및 2008 년 5 월 30 일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제 61/057,437 호의 우선권을 주장한다.

기술 분야

본 발명은 사실상 기계적, 내장의 및/또는 염증성일 수 있는 신경병증 또는 통각수용성 통증을 겪고 있는 환자에게 치료학적 유효량의 라놀라진을 투여하는 것을 포함하는 상기 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

전문이 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제 4,567,264 호에는 라놀라진, 즉 (±)-N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)-프로필]-1-피페라진아세타미드 및 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 부정맥, 이형 및 운동-유도 협심증 및 심근 경색증을 비롯한 심혈관 질환의 치료에서의 이들의 용도가 기재되어 있다. 디히드로클로라이드 염 형태에서, 라놀라진은 하기 화학식으로 표시된다:

또한 상기 특허는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 400, Tween 80 및 0.9% 식염수를 추가로 포함하는 디히드로클로라이드 라놀라진의 정맥내 (IV) 제형에 관한 것이다.

전문이 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제 5,506,229 호에는 심장마비, 심장근 또는 골격근 또는 뇌 조직에 대한 저산소 또는 재관류 손상을 비롯한 물리적 또는 화학적 상해를 경험한 조직의 치료를 위한, 및 이식에서의 사용을 위한 라놀라진 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스테르의 용도가 기재되어 있다. 방출 제어형 제형을 비롯한 경구 및 비경구 제형이 기재되어 있다. 특히, 미국 특허 제 5,506,229 호의 실시예 7D 에는 방출 제어형 중합체로 코팅된 라놀라진 및 미세결정성 셀룰로오스의 미세구를 포함하는 캡슐 형태의 방출 제어형 제형이 기재되어 있다. 또한 상기 특허에는 최하로는, 약 5 중량% 덱스트로오스를 함유하는 IV 용액 1 ㎖ 당 5 mg 라놀라진을 포함하는 IV 라놀라진 제형이 기재되어 있다. 최상으로는, 약 4 중량% 덱스트로오스를 함유하는 IV 용액 1 ㎖ 당 200 mg 라놀라진을 포함하는 IV 용액이 기재되어 있다.

라놀라진 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 에스테르에 대한 현재 바람직한 투여 경로는 경구이다. 전형적인 경구 투여량 형태는 압착 정제, 분말 믹스 또는 과립으로 충전된 경질 젤라틴 캡슐, 또는 용액 또는 현탁액으로 충전된 연질 젤라틴 캡슐 (소프트겔 (softgel)) 이다. 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제 5,472,707 호에는 경질 젤라틴 캡슐 또는 소프트겔용 충전 용액으로서 과냉각된 액체 라놀라진을 이용하는 고-투여량 경구 제형이 기재되어 있다.

전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제 6,503,911 호에는 제형이 위에서의 산성 환경 및 소장을 통한 보다 염기성 환경 모두를 거치는 동안 라놀라진의 만족스러운 혈장 수준을 산출하는 것에 대한 문제점을 극복하는 서방출 제형이 기재되어 있으며, 이는 협심증 및 기타 심혈관 질환의 치료를 위해 필요한 혈장 수준을 제공하는 데 있어서 매우 효과적이라는 것이 증명되었다.

전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제 6,852,724 호에는 부정맥 이형 및 운동-유도 협심증 및 심근 경색증을 비롯한 심혈관 질환의 치료 방법이 기재되어 있다.

전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 출원 공개 번호 제 2006/0177502 호에는 라놀라진이 35-50%, 바람직하게는 40-45% 라놀라진으로 존재하는 경구 서방출 투여량 형태가 기재되어 있다. 하나의 구현예에서 본 발명의 라놀라진 서방출 제형은 pH 의존적 결합제; pH 독립적 결합제; 및 1 종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 적합한 pH 의존적 결합제는 약 1-20%, 예를 들어 약 3-6% 의 범위로 메타크릴산 공중합체를 중화시키기에 충분한 양의 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화암모늄과 같은 강염기로 부분적으로 중화된 메타크릴산 공중합체, 예를 들어 Eudragit® (Eudragit® L100-55, Eudragit® L100-55 의 슈도라텍스 (pseudolatex) 등) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 pH 독립적 결합제는 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC), 예를 들어 Methocel® E10M Premium CR 등급 HPMC 또는 Methocel® E4M Premium HPMC 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제는 마그네슘 스테아레이트 및 미세결정성 셀룰로오스 (Avicel® pH101) 를 포함한다.

배경 기술

신체적 통증은 많은 방식으로 정의될 수 있으나 일반적으로 2 가지 분류, 통각수용성 및 신경병증으로 나뉜다. 통각수용성 통증은 피부, 각막, 점막, 근육 및 관절과 같은 다양한 조직에서 신체 전반에 걸쳐 위치하는 통각수용기라고 불리는 감각 수용 신경 말단의 자극에 의해 야기되는 통증이다. 통각수용기의 필수적인 기능에는 유해한 자극을 활동 전위를 촉발시키는 탈분극으로 전달하는 것, 1 차 감각 부위로부터의 활동 전위를 중추 신경계 내 시냅스로 전도시키는 것, 및 활동 전위를 전시냅스 말단에서 신경전달물질 방출로 전환시키는 것이 포함된다. 통각수용성 통증은 전형적으로, 염좌, 골절, 화상, 타박상, 멍 및 염증 (감염 또는 관절염 장애로부터의), 즉, 통각수용기의 활성화를 야기하는 조직에 대한 임의의 손상의 결과로서 경험한다.

통각수용기의 수 및 유형은 체내의 위치에 따라 매우 다르다. 피부에 위치하는 피부의 통각수용기는 고도로 집중되어 있고 잘 정의된 국부적 통증을 야기한다. 신체의 인대, 연결 조직 및 뼈 내의 체성 통각수용기는 장기간 경험할 수 있는 국부화되지 않은 쓰린 통증을 훨씬 적게 야기한다. 심지어 신체의 기관 및 내장 내에 위치하는 내장의 통각수용기는 그 수가 더 적다. 따라서, 내장 통증의 기원은 종종 확인하기가 매우 어렵다.

반대로, 신경병증 통증은 신경계 그 자체의 일차 병변 또는 기능 장애에 의해 개시 또는 야기되는 통증이다. 신경병증 통증은 통상적으로 지속되는 화끈거림 및/또는 "핀과 바늘" 및/또는 "전기적 쇼크" 와 같은 감각 및/또는 간지러움으로서 인지된다. 그 차이는 "본래" 통증이 오직 통증 신경 만을 자극하지만, 신경병증은 종종 동일한 영역에서 통증 및 비-통증 (촉감, 온감, 냉감) 감각 신경의 점화를 야기한다는 사실 때문에, 척수 및 뇌가 정상적으로는 수용할 것으로 예상되지 않는 신호를 발생시킨다는 것이다. 신경병증 통증은 또한 통각수용기 그 자체의 과활성에 의해 야기될 수 있다. 상기 과활성은 세포막 이온 채널 그 자체의 수, 위치 또는 기능의 증가 또는 감소의 결과일 수 있다.

신경 손상의 4 가지 주요 유형은 다발신경병증, 자율 신경병증, 단발신경병증 및 다발성 홑신경염이다. 이러한 유형의 통증은 많은 징후 및 원인을 가지며, 급성 또는 만성 (고질적) 일 수 있고, 만성 유형은 가장 종종 임상에서 관찰된다. 하나의 추정치로는, 신경병증 통증은 높은 유병률을 가진 신경병증 등 및 다리 통증 및 당뇨병성 신경병증을 앓는 미국 인구의 1.5% 이상에 영향을 준다. 당뇨병 환자의 8-50% 가 당뇨병성 신경병증 증상을 갖는 것으로 추정되고 등 통증 환자의 10-19% 가 신경병증 통증을 갖는 것으로 추정된다 (참조, Taylor RS (2006) Pain Practice; 6: 22-26)

많은 이유로 신경병증 통증의 진정한 유병률은 알아내기가 어렵다. 예를 들어 얼마나 많은 통상의 요통의 예가 신경병증 기원인지 명확하지가 않다. 그 어려움은 신경병증 통증이 종종 증상이거나 또는 또다른 기초 만성 질환의 결과라는 사실에 의해 혼재되어 있다. 전형적으로는, 주치의는 일차 질환의 진단 및 치료에 중점을 두므로 종종 신경병증 통증은 불충분하게 진단되고 불충분하게 치료된다.

현행의 통증 치료에는 아세트아미노펜과 같은 진통제 및 글루코코르티코이드스테로이드 예컨대 히드로코르티손, 프레드니손 및 덱사메타존, 및 비-스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID) 예컨대 이부프로펜, 아스피린, 나프록센 및 셀레콕시브 (Celebrex) 를 비롯한 항-염증성 약물이 포함된다. 보다 강한 의약에는 오피오이드 모르핀, 코데인, 옥시코돈, 헤로인, 펜타닐 및 히드로콘이 포함된다. 신경병증 통증에 대한 기타 치료에는 트리시클릭 항우울제, 예컨대 아미트리프탈린 (Elavil®), 항경련제 예컨대 발프로에이트, 카르바마제핀 (Tegretol®) 및 캅사이신이 포함된다.

불행히도 상기 언급된 각각의 약물 계통은 그들의 유용성 및 효능에 제한을 주는 여러 단점을 가지고 있다. 진통제는 제한된 효능을 갖는다. 글루코코르티코이드스테로이드는 면역계에 대한 변화, 상처 회복 지연, 뼈 형성 억제 및 칼슘 흡수 저해를 일으키는 반면, NSAID 는 위장 부작용 뿐 아니라 심혈관 효과와 관련되는 기타 우려가 있다. 오피오이드는 악명높은 중독성이 있고, 메스꺼움, 구토, 호흡 저하 및 변비와 같은 기타 부작용을 갖는다. 트리시클릭 항우울제 및 항경련제도 또한 유의한 단점을 갖는다. 명백하게는 보다 안전하고 보다 효과적인 의약에 대한 필요성이 있다.

이제 치료 약물 농도의 라놀라진이 hNav1.7 을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 및 rNav1.8 을 안정적으로 발현하는 ND-7-23 세포에서 Nav1.7 및 Nav1.8 나트륨 전류 (I_Na) 모두를 차단한다는 것을 발견하였다. 라놀라진이 피크 및 윈도우 Nav1.7 및 Nav1.8 전류의 비교적 선별 차단제라는 예비적인 발견과, 인간에서 입증된 약물의 안정성은, 통각수용성 통증 및 신경병증 통증의 치료를 위한 라놀라진의 용도를 강하게 지지한다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 라놀라진, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적 유효량, 또는 예방학적 유효량을 통증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 통증의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일부 양상에서, 라놀라진은 신경병증 또는 통각수용성 통증의 치료 또는 예방을 위해 투여된다. 통각수용성 통증이 치료되는 경우 통증은 사실상 기계적, 화학적 및/또는 염증성일 수 있다. 라놀라진은 신경병증 통증의 치료 또는 예방을 위해 투여되고, 통증은 나트륨 채널병증, 다발신경병증, 자율 신경병증, 단발신경병증 및/또는 다발성 홑신경염과 관련될 수 있다. 치료가능한 채널병에는 홍색사지통증 및 발작성 극심 통증 장애가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 나트륨 채널병 관련 치료가능한 상태에는 근긴장증 및 근육 마비가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양상에서, 통증은 만성, 내장의, 기계적, 염증성 및/또는 신경병증 통증 증후군의 결과일 수 있다. 또한 통증은 외상 신경 손상, 신경 압박 또는 포착, 대상포진후 신경통, 삼차 신경통, 당뇨병성 신경병증, 암 및 화학요법으로부터 기인하는, 또는 이와 관련된 통증일 수 있다. 본 발명의 방법이 적합한 부가적인 징후에는 만성 요통, HIV- 및 HIV 치료-유도 신경병증, 암 치료-유도, 즉, 화학요법-유도 신경병증, 만성 골반 통증, 신경종 통증, 복합 부위 통증 증후군, 만성 관절염 통증 및 관련 신경통이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1 은 실시예 1 에 기재되는 바와 같은 라놀라진, R-라놀라진 및 S-라놀라진에 의한 Nav1.7 피크 I_Na 의 농도-의존적 차단을 나타낸다. 데이터를 Hill 방정식에 대입하였다.
도 2 는 실시예 1 에 기재되는 바와 같은 100 μM 라놀라진의 부재 (비워진 기호) 및 존재 (채워진 기호) 하에서 제 1 탈분극 단계에 대한 반응으로 기록된 값에 대해 표준화된 2, 5, 20 및 200 msec 의 지속기간으로 반복 벌스로의 피크 I_Na 값의 그래프를 나타낸다. 차단은 2 msec 정도로 짧은 펄스 지속기간과 동일한 수준에 도달한다.
도 3A, 3B 및 3C 는 실시예 2 에서 논의되는 바와 같은 hNav1.7+β1 서브유닛을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 (A) 및 미트랜스펙션된 ND7-23 세포 (B) 또는 ND7-23/rNav1.8 Na⁺ 채널 (C) 에서 I_Na 를 감소시키는 300 nM TTX 의 효과를 나타낸다. 전체-세포 전류를 10 sec 간격으로 -20 (hNav1.7 또는 미트랜스펙션된 ND7-23 세포) 또는 +20 (rNav1.8) mV 까지 50-msec 시험 펄스 동안 기록하였다. 300 nM TTX 의 첨가는 hNav1.7 I_Na (A) 를 완전히 차단하였다. 그러나, 300 nM TTX 는 rNav1.8 I_Na (C) 의 최소 차단을 야기하였고, 상기 채널 이소형의 TTX 에 대한 보고된 저항성이 증명 및 확인되었다.
도 4A 는 실시예 2 에서 논의되는 바와 같은 hNav1.7+β1 서브유닛을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 및 rNav1.8 Na⁺ 채널을 안정적으로 발현하는 ND7-23 세포로부터 30 μM 라놀라진의 존재 및 부재하에서 기록된 I_Na 의 대표적인 기록을 나타낸다. 전체-세포 전류를 10 sec 간격으로 -120 에서 -20 까지 (hNav1.7) 또는 -100 mV 에서 +20 (rNav1.8) mV 까지 50-msec 시험 펄스 동안 기록하였다. 도 4B 는 hNav1.7 (■, n=4-6 세포, 각각) 및 rNav1.8 (●, n=4-6 세포, 각각) Na⁺ 채널의 I_Na 을 감소시키는 라놀라진에 대한 농도-반응 관계를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM 으로 나타낸다. 비활성 상태에서의 hNav1.7 또는 rNav1.8 Na⁺ 채널의 라놀라진에 대한 감수성을 hNav1.7 (□, n=4 세포, 각각) 의 경우 -70 mV 또는 rNav1.8 의 경우 -40 mV (○, n=3-5 세포, 각각) 까지 5-sec 예비펄스에 이어, 유지 전위 (-120 또는 -100 mV) 까지 20-msec 단계 후 -20 또는 +20 mV 까지 50-msec 탈분극 단계를 사용하여 측정하였다. 차단된 채널로부터 최소 약물 해리가 있는 비활성화로부터의 채널 회복을 가능하게 하기 위해 20-msec 단계를 짧게 선택하였다.
도 5 는 실시예 2 에서 논의되는 바와 같은 hNav1.7 및 rNav1.8 Na⁺ 채널 전류의 활성화 및 비활성화에 대한 라놀라진의 효과를 위한 전류-전압 관계를 보여준다. 도 5A 에서는 hNav1.7+β1 서브유닛을 발현하는 HEK293 세포, 및 rNav1.8 Na⁺ 채널을 발현하는 ND7-23 세포로부터의 대표적인 I_Na 기록을 제시한다. 도 5B 는 10 μM 라놀라진의 부재 (■,●) 및 존재 (□,○) 하에서의 hNav1.7+β1 서브유닛 및 rNav1.8 Na⁺ 채널에 대한 활성화 곡선을 나타낸다. 매끈한 곡선은 표 5 에 제시되는 중간점 (V_½) 및 기울기 인수 (k) 로의 Boltzmann 그래프이다. 도 5C 는 단일 지수 방정식에 대입한 10 μM 라놀라진의 부재 및 존재 하에서의 전압 (도 3B 에서 기재되는 전류) 대 작성된 hNav1.7 (좌측 패널) 및 rNav1.8 (우측 패널) I_Na 의 비활성화 시간 상수를 보여준다. 데이터는 평균±SEM 으로 나타낸다.
도 6A-C 는 실시예 3 에 기재되는 바와 같은 10 μM 라놀라진의 부재 (채워진 기호) 및 존재 (비워진 기호) 하에서의 hNav1.7 (좌측 패널) 및 rNav1.8 (우측 패널) Na⁺ 채널 전류에 대한 안정-상태 비활성화의 전압 의존성을 나타낸다. 100 msec (도 6A), 1 sec (도 6B) 및 10 sec (도 6C) 의 조건화 예비펄스를 사용하였다. 삽입도: 전압-클램프 프로토콜. 도 6A: 라놀라진 10 μM 은 hNav1.7 (n=4 세포) 및 rNav1.8 (n=4 세포) 의 안정-상태 급속 비활성화의 기울기 인수 (k) 에 영향을 주지 않고 중간점 (V_½) 을 최소로 이동시켰다. hNav1.7 에 대한 라놀라진의 부재 (■) 및 존재 (□) 하에서의 추정되는 V_½ 및 k 값은 각각 -74.49±2.79; 6.01±0.3 및 -86.15±3.62 (p<0.05); 7.55±0.82 (p=0.14) 이고, rNav1.8 에 대한 라놀라진의 부재 (●) 및 존재 (○) 하에서의 추정되는 V_½ 및 k 값은 각각 -33.12±1.10; 9.69±1.10 및 -40.66±3.23 (p=0.15); 11.45±1.21 (p<0.02) 이다. 도 6B: 라놀라진은 hNal.7 및 rNav1.8 모두에 대한 k 값에 영향을 주지 않고 안정-상태 중속 비활성화의 V_½ 를 농도-의존적 (1-30 μM) 으로 이동시켰다 (표 5). 도 6C: 라놀라진 (10 μM) 은 hNav1.7 (n=4 세포) 및 rNav1.8 (n=6 세포) 의 k 값에 영향을 주지 않고 안정-상태 저속 비활성화의 V_½ 를 유의하게 좌측으로 이동시켰다. hNav1.7 에 대한 라놀라진의 부재 (■) 및 존재 (□) 하에서의 추정되는 V_½ 및 k 값은 각각 -37.22±4.21; 13.52±0.93 및 -61.39±3.54 (p<0.05); 14.22±2.14 (p=0.80) 이고, rNav1.8 에 대한 라놀라진의 부재 (●) 및 존재 (○) 하에서의 추정되는 V_½ 및 k 값은 각각 -37.13±2.42; 7.31±0.81 및 -54.57±3.69 (p<0.05); 8.38±0.76 (p=0.23) 이다. 데이터는 평균±SEM 으로 나타낸다.
도 7 은 30 μM 라놀라진의 부재 및 존재하에서의 저속 비활성화의 전개를 도식화한다 (삽입도: 전압-클램프 프로토콜). 데이터는 평균±SEM 으로 나타낸다. 매끈한 곡선은 2 개 (도 7A; hNav1.7, n=3-5 세포, 각각) 또는 3 개 (도 7B; rNav1.8, n=3-5 세포, 각각) 성분 지수 방정식 (개별 파라미터의 값에 대해서는 표 6 을 참조함) 으로의 데이터의 그래프이다. 도 7C 및 도 7D 는 30 μM 라놀라진의 부재 및 존재하에서의 비활성화로부터의 회복 그래프이다 (삽입도: 전압-클램프 프로토콜). 데이터는 평균±SEM 으로 나타낸다. 매끈한 곡선은 2 개 (도 7C; hNav1.7, n=5 세포, 각각) 또는 3 개 (도 7D; rNav1.8, n=5 세포, 각각) 성분 지수 방정식 (개별 파라미터의 값에 대해서는 표 6 을 참조함) 으로의 데이터의 그래프이다.
도 8 은 실시예 2 에서 논의되는 바와 같은 30 μM 라놀라진에 의한 hNav1.7 (도 8A), rNav1.8 (도 8B) 및 TTX-S I_Na (C) 의 사용-의존적 차단을 도식화한다. 각 프로토콜에는 30 μM 라놀라진의 부재 (대조군; 채워진 기호) 또는 존재 (비워진 기호) 하에서의 1, 5 및 10 Hz 의 주파수에서의 -120 에서 -20 mV 까지의 (Nav1.7+β1 또는 내생 TTX-S I_Na) 또는 -100 에서 +50 mV 까지의 (rNav1.8) 연속 40 회 펄스가 포함된다. n 번째 임펄스 (40 번째) 에 의해 유발되는 전류의 진폭을 첫번째 펄스에 의해 유발되는 전류에 대해 표준화하였고, 각 펄스 횟수에 대해 도식화하였다.
도 9 는 실시예 2 에서 논의되는 바와 같은 rNav1.8 I_Na 의 라놀라진 차단의 용도 의존성에 대한 증가된 펄스 지속기간의 효과를 보여준다. 연속 기록된 rNav1.8 I_Na 를 100 μM 라놀라진의 존재하에서 추적한다. 5 (도 9A) 또는 200 ms (도 9B) 의 지속기간으로 +50 mV 까지 총 40 펄스 (p) 를 5 Hz 의 주파수에서 적용하였고; 펄스 횟수를 나타낸다. 도 9C 는 100 μM 라놀라진의 존재하에서 3 (▽), 5 (△), 20 (○) 또는 200 (□) msec 지속기간의 펄스를 사용하는 +50 mV 에서 측정된 rNav1.8 I_Na 의 플롯을 나타낸다. 각 펄스로부터 도출된 전류 진폭을 첫번째 펄스 (1P) 에 의해 유발되는 전류의 피크 진폭에 대해 표준화하였다.
도 10 은 실시예 3 에서 논의되는 바와 같은 복강내 투여 후 CFA-유도 열적 및 기계적 통각과민의 라놀라진 치료 결과를 묘사한다. 도 10A 는 열적 자극으로부터의 발 철회에 대한 유의한 치료 효과가 없음을 묘사한다. 대조적으로, 도 1OB 는 기계적 무해자극통증에서의 투여량 의존적 감소를 묘사한다.
도 11 은 경구 투여 후 CFA-유도 열적 및 기계적 통각과민의 라놀라진 치료 결과를 묘사한다. 도 10A 에서와 같이, 도 11A 는 열적 자극으로부터의 발 철회에 대한 유의한 치료 효과가 없음을 묘사한다. 그러나 도 11B 은 기계적 무해자극통증에서의 투여량 의존적 감소를 묘사한다. 최적 경구 투여량은 50 mg/kg 에서 달성되었다. 더 높은 투여량에서도 추가적인 장점은 관찰되지 않았다.

발명의 상세한 설명

정의

본 명세서 및 하기 특허청구범위에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의될 많은 용어들을 참조할 것이다.

Ranexa® 로서 불리는 경우 "라놀라진" 은 화합물 (±)-N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)프로필]-1-피페라진-아세타미드이다. 라놀라진은 또한 그의 거울상이성질체(R)-(+)-N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)-프로필]-1-피페라진아세타미드 (또한 R-라놀라진으로서 불림) 및 (S)-(-)-N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)-프로필]-1-피페라진아세타미드 (또한 S-라놀라진으로서 불림) 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이의 혼합물로서 존재할 수 있다. 다르게 언급되지 않는다면, 본 명세서 및 실시예에서 사용되는 라놀라진 혈장 농도는 라놀라진 자유 염기를 말한다. 약 pH 4 의, 염화수소로 적정된 수용액에서, 라놀라진은 그의 디히드로클로라이드 염으로서 대부분 존재할 것이다.

"생리학적으로 허용가능한 pH" 는 인간 환자 내로 전달하기에 상용성인 정맥내 용액의 pH 를 말한다. 바람직하게는, 생리학적으로 허용가능한 pH 의 범위는 약 4 내지 약 8.5, 바람직하게는 약 4 내지 7 이다. 임의의 이론에 제한됨 없이, 약 4 내지 6 의 pH 를 갖는 정맥내 용액을 사용하는 것이, 체내의 큰 부피를 차지하는 혈액이 이들 정맥내 용액에 효과적으로 완충작용을 하므로 생리학적으로 허용가능한 것으로 간주된다.

"심혈관 질환" 또는 "심혈관 증상" 은 예를 들어, 울혈성 심부전, 급성 심부전, 허혈, 재발 허혈, 심근 경색증, STEMI 및 NSTEMI 등을 비롯한 심부전, 부정맥, 운동-유도 협심증, 이형 협심증, 안정 협심증, 불안정 협심증, 급성 관상동맥 증후군, NSTEACS 등을 비롯한 협심증, 당뇨병 및 간헐성 파행에 의해 나타나는 질환 또는 증상을 말한다. 이러한 질환 상태의 치료는 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제 6,503,911 호 및 제 6,528,511 호, 미국 특허 출원 제 2003/0220344 호 및 제 2004/0063717 호를 비롯하여 다양한 미국 특허 및 특허 출원에 기재되어 있다.

"억제제" 는 기질의 대사작용을 "늦추는" 화합물을 말한다. 억제제는 강한, 중간 및 약한 카테고리로 분류될 수 있다. 예를 들어 부프로피온, 플루오세틴, 파로세틴 및 퀴니딘을 비롯한 강한 억제제는, 혈장 AUC 값의 5 배 초과 증가 또는 제거율 80% 초과 감소를 일으킬 수 있다. 예를 들어 두이옥세틴 및 테르비나핀을 비롯한 중간 억제제는 혈장 AUC 값의 2 배 초과 증가 또는 제거율 50-80% 감소를 일으킬 수 있다. 예를 들어 아미오다론 및 시메티딘을 비롯한 약한 억제제는 혈장 AUC 값의 1.25 배 초과 그러나 2 배 미만 증가 또는 제거율 20-50% 감소를 일으킬 수 있다.

"임의의" 및 "임의로" 는 후속하여 기재되는 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수도 있고, 설명이 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않은 예를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "임의의 약학 부형제" 는 그렇게 기재된 제형이 존재한다고 구체적으로 언급된 것 외에 약학 부형제를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있고, 그렇게 기재된 제형이 임의의 부형제가 존재하는 예 및 존재하지 않는 예를 포함하는 것을 나타낸다.

"치료하기" 및 "치료" 는 환자에서의 질환의 임의의 치료를 말하고 다음을 포함한다: 질환에 잘 걸릴 수 있으나 아직 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; 질환을 억제하는 것, 즉, 추가의 발달을 저지하는 것; 질환의 증상을 억제하는 것; 질환을 경감시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것, 또는 질환의 증상을 경감시키는 것. "환자" 는 포유류, 바람직하게는 인간이다.

"치료학적 유효량" 이라는 용어는 하기 정의되는 바와 같이, 이러한 치료를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 경우, 치료를 달성하기에 충분한 화학식 I 의 화합물의 양을 말한다. 치료학적 유효량은 사용되는 치료제의 특이적 활성 및 환자의 연령, 신체적 상태, 기타 질환 상태의 존재 및 영양상태에 따라 다를 것이다. 부가적으로, 환자가 수여받을 수 있는 기타 약물은 투여자에 대한 치료제의 치료학적 유효량의 결정에 영향을 미칠 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같은, "약학적으로 허용가능한 담체" 에는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제 등장성 작용제 및 흡수지연제 등이 포함된다. 약학적으로 활성인 성분에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 치료적 조성물에서의 그의 용도가 고려된다.또한 보충 활성 성분을 조성물 내에 혼입할 수 있다.

N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)프로필]-1-피페라진아세타미드 {또한 1-[3-(2-메톡시페녹시)-2-히드록시프로필]-4-[(2,6-디메틸페닐)-아미노카르보닐메틸]-피페라진으로서 알려져 있음} 라는 명칭을 갖는 라놀라진은, 라세믹 혼합물, 또는 이의 거울상이성질체, 또는 이의 거울상이성질체의 혼합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서 존재할 수 있다. 라놀라진은 명세서가 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제 4,567,264 호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

"즉시 방출" ("IR") 은 시험관 내에서 신속하게 용해되는 제형 또는 투여량 단위를 나타내며, 위 또는 상부 위장관에 완전히 용해 및 흡수되는 것으로 의도된다. 통상적으로, 상기 제형은 투여 30 분 내에 활성 성분의 90% 이상을 방출한다.

"서방출" ("SR") 은 약 6 시간 이상의 기간에 걸쳐 위 및 위장관에서 서서히 및 연속적으로 용해 및 흡수되는 본원에서 사용되는 제형 또는 투여량 단위를 나타낸다. 바람직한 서방출 제형은 하기 기재되는 바와 같이 투여량 당 2 개 이하의 정제로 1 일 2 회 이하로 투여하는데 적합한 라놀라진의 혈장 농도를 나타내는 제형이다.

"이성질체" 는 동일한 분자식을 갖는 상이한 화합물이다.

"입체이성질체" 는 원자가 공간 상에 배열된 방식만이 다른 이성질체이다.

"거울상이성질체" 는 서로 포개지지 않는 거울 이미지로 존재하는 한 쌍의 입체이성질체이다. 한 쌍의 거울상이성질체의 1:1 혼합물은 "라세믹" 혼합물이다. "(±)" 라는 용어는 적합한 라세믹 혼합물을 나타내기 위해 사용된다.

"부분입체이성질체" 는 2 개 이상의 비대칭 원자를 갖지만, 이들이 서로의 거울-이미지가 아닌 입체이성질체이다.

절대 입체화학은 Cahn-Ingold-Prelog R-S 시스템에 따라 명시된다. 화합물이 순수 거울상이성질체인 경우 각 키랄 탄소에서의 입체화학은 R 또는 S 에 의해 명시될 수 있다. 절대 배열이 알려지지 않은 분해 화합물은 나트륨 D 선의 파장에서 편광판을 회전하는 방향 (우선성 또는 좌선성) 에 따라 (+) 또는 (-) 로 지칭된다.

"다발신경병증" 은 신체 전반의 많은 말초 신경이 동시에 기능하는 경우 발생하는 신경계 장애로서 정의된다. 이것은 급성 또는 만성일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 "자율 신경병증" 은 혈압, 심박수, 배변 및 배뇨, 소화 및 기타 신체 기능을 조절하는 신경에 대한 손상에 의해 야기되는 증상 군을 말한다.

"단발신경병증" 은 단일 말초 또는 뇌 신경에만 영향을 미치는 신경병증 유형으로서 정의된다. 단발신경병증의 통상의 유형에는 흉곽 출구 증후군, 손목 터널 증후군, 방사 신경병증, 날개견갑골증, 이상 지각성 대퇴신경통, 발목 터널 증후군, 동안 신경 마비, 제 4 신경 마비, 제 6 신경 마비 및 벨 마비가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

"다발성 홑신경염" 은 2 개 이상의 분리된 신경 영역에 대한 손상을 포함하는 신경계 장애로서 정의된다. 이것은 말초 신경병증 (뇌 및 척수 외부 신경에 대한 손상) 의 형태이다. 통상적인 원인에는 혈류 감소 또는 혈관의 염증에 의해 야기되는 산소 결핍이 포함된다. 약 1/3 의 경우에 있어 원인이 밝혀지지 않았다. 다발성 홑신경염의 다른 통상적인 원인에는 인슐린의존 당뇨병, 혈관 질환 예컨대 결절성 다발동맥염 및 결합조직 질환 예컨대 류마티스 관절염 또는 전신 홍반 루푸스가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

"채널병" 은 이온 채널 기형과 연관된 질환 또는 상태를 말한다. 나트륨 채널병의 예에는 홍색사지통증 및 발작성 극심 통증 장애가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

라놀라진은 아미노기 및/또는 카르복실기 또는 이와 유사한 기의 존재로 인해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염" 이라는 용어는 라놀라진의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 생물학적으로 또는 그밖의 바람직한 염을 말한다. 약학적으로 허용가능한 염기 첨가 염은 무기 및 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염에는, 예를 들어, 오직 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염만이 포함된다. 유기 염기로부터 유도된 염에는 1 차, 2 차 및 3 차 아민, 예컨대 알킬 아민, 디알킬 아민, 트리알킬 아민, 치환 알킬 아민, 이(치환 알킬)아민, 삼(치환 알킬)아민, 알케닐 아민, 디알케닐 아민, 트리알케닐 아민, 치환 알케닐 아민, 이(치환 알케닐)아민, 삼(치환 알케닐)아민, 시클로알킬 아민, 디(시클로알킬)아민, 트리(시클로알킬)아민, 치환 시클로알킬 아민, 이치환 시클로알킬 아민, 삼치환 시클로알킬 아민, 시클로알케닐 아민, 디(시클로알케닐)아민, 트리(시클로알케닐)아민, 치환 시클로알케닐 아민, 이치환 시클로알케닐 아민, 삼치환 시클로알케닐 아민, 아릴 아민, 디아릴 아민, 트리아릴 아민, 헤테로아릴 아민, 디헤테로아릴 아민, 트리헤테로아릴 아민, 헤테로시클릭 아민, 디헤테로시클릭 아민, 트리헤테로시클릭 아민, 혼합 디- 및 트리-아민 (아민 상의 치환기 중 2 가지 이상은 상이하고, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릭으로 이루어지는 군으로부터 선택됨) 등의 염이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 포함되는 것은 2 또는 3 개의 치환기가 아미노 질소와 함께 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴기를 형성하는 아민이다.

적합한 아민의 구체적인 예에는 예를 들어, 오직 이소프로필아민, 트리메틸 아민, 디에틸 아민, 트리(이소-프로필)아민, 트리(n-프로필)아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, 모르폴린, N-에틸피페리딘 등이 포함된다.

약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 무기 및 유기산으로부터 제조될 수 있다. 무기산으로부터 유도되는 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등이 포함된다. 유기산으로부터 유도되는 염에는 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔-술폰산, 살리실산 등이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "약학적으로 허용가능한 담체" 에는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제 등장성제 및 흡수지연제 등이 포함된다. 약학적으로 활성인 성분용의 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 비상용성인 경우만 제외한다면, 치료 조성물에서의 용도가 고려된다. 보조적 활성 성분이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다.

본 발명의 방법

본 발명의 방법은 라놀라진이 치료적 약물 농도에서 Nav1.7 및 Nav1.8 전류를 모두 차단한다는 놀라운 발견에 근거한 것이다. 라놀라진은 피크 및 "윈도우" Nav1.7 및 Nav1.8 전류 모두를 억제한다. 반면, 라놀라진은 피크 Nav1.5 전류에 비례하여 후반부를 선택적으로 억제하고, 치료적 농도에서 Nav1.1, 1.4 또는 1.6 피크 전류를 차단하는 것으로는 보이지 않는다. 라놀라진이 피크 및 윈도우 Nav1.7 및 Nav1.8 전류의 비교적 선택적인 차단제이고, 인간에서 약물 안정성이 입증되었다는 발견은, 유전적 또는 후천적 나트륨 채널병에 의해 발생되는 신경병증 통증의 치료 및 통각수용성 통증의 치료를 위한 라놀라진의 용도를 강하게 지지한다.

신경병증 통증의 병태생리학 매카니즘은 동물 모델에서의 실험 연구로부터, 통증 자극에 대한 변경된 감수성의 유전 원인에 대한 설명으로부터 제안되었다. 척수의 후각에 투영된 일차 구심성 통각수용기인 작은 후근절 (DRG) 세포의 연구는 특히 유용하였다. 척수 후근절은 혈액-뇌 장벽에 의해 보호되지 않고, 전신 약물 요법에 접근이 가능하다. 이러한 세포들은 전압-게이트 나트륨 채널의 알파 (공극-형성) 서브유닛의 여러 이소형 (예를 들어, Nav 1.3, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9) 을 발현한다.

이들 다양한 Na⁺ 채널 이소형은 상이한 특성을 갖고 있고 DRG 기능에 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Na⁺ 채널 이소형 Nav1.7 은 DRG 신경에서 고도로 발현되고, 발현은 스트렙토조토신의 투여에 의해 당뇨병에 걸린 래트로부터의 DRG 뉴런에서 추가로 증가된다 (Hong et al. (2004) J Biol Chem 279: 29341-29350 참조). 래트 DRG 뉴런에서의 Nav1.7 의 발현 증가는 Na⁺ 전류 밀도 증가 및 통각과민 (정상적으로 통증이 있는 자극에 대한 반응 증가) 및 무해자극통증 (정상적으로 통증을 일으키지 않는 자극에 의해 도출된 통증) 의 전개 증가와 관련이 있다 (Hong et al. (2004)).

인간 연구로부터의 증거는 또한 통증 자각에서 Nav1.7 이 연루됨을 보여준다. 선천성 무감각증은 Nav1.7 을 인코딩하는 유전자에 무감각 "기능 상실" 돌연변이를 갖는 사람에게 존재하고 (Cox et al (2006) Nature AAA: 894-898 참조) 및 만성 통증 및 통각과민은 Nav1.7 에서 "기능 획득" 과오 돌연변이를 갖는 사람에게 존재하며, 홍색사지통증을 일으키는 것들이 있다 (Cummings et al, (2007) Pain 131:243-257). 이러한 발견은 Na⁺ 채널의 특정 이소형 (예를 들어, Nav1.7) 의 기능을 변경하는 약물을 사용하는 신경병증 통증의 치료에 대한 기계적 접근법이 합리적인 치료 계획임을 제시한다.

Nav1.8 은 DRG 세포 및 작은 통각수용성 C-유형 통증 섬유에서 발견된 저속-비활성화 TTX-R Na⁺ 채널이다 (Akopian et al, 1996;Sangameswaran et al, 1996). 유전자 SCN10A 는 Nav1.8 의 알파 폴리펩티드를 코딩한다 (Akopian et al, 1996;Sangameswaran et al., 1996).

통증을 치료하기 위한 새로운 약물에 대한 필요성이 크다 (Markman and Dworkin, 2006;Flugsrud-Breckenridge et al, 2007). Nav1.7 및 Nav1.8 모두가 말초 통증 감지에 중요한 역할을 한다는 것이 많은 연구로부터의 증거에서 제시되기 때문에, 상기 Na⁺ 채널 이소형을 모두 또는 이 중 하나를 차단하는 것은 통증 경감을 위한 잠재적으로 중요한 치료이다. Na⁺ 채널 차단제 리도카인 (국부 마취제) 및 멕실레틴 (리도카인 유사체) 은 신경병증 통증의 동물 모델 및 인간에서 통각과민을 약화시키는 것으로 보인다 (Jarvis and Coukell, 1998;Jett et al., 1997). 최근, 라놀라진이 신경 Nav1.7 Na⁺ 전류 (I_Na) 를 상태 및 사용-의존적 방식으로 차단하였다는 것이 보고되었다 (Wang et al., 2008). 라놀라진은 심장에서 잔류 (후반부) Na⁺ 전류 (후반부 I_Na) 를 감소시키고 (Belardinelli et al, 2006), 약물은 만성 협심증의 감소에 승인되었고, 안전한 것으로 나타났다 (Scirica et al., 2007).

나트륨 채널 차단제로서 작용하는 여러 계열의 약물이 신경병증 통증을 치료하기 위해 사용된다. 상기 약물은 국부 마취제 (예를 들어, 리도카인), 항-부정맥 (예를 들어, 멕실레틴) 및 항-간질 (예를 들어, 페니토인, 카르바마제핀) 약물을 포함한다. 이들 약물 중 어느 것도 Nav1.7 의 또는 임의의 기타 Na⁺ 채널 서브유형의 선별 차단제가 아니다. 이들은 Na⁺ 채널의 비활성화 상태를 안정화시키고 채널 활성의 사용-의존적 차단을 야기하도록 작용할 수 있어, 이에 의해 신경원 점화 (neuronal firing) 의 최대 속도를 감소시킨다. 이들의 보고된 효과는 오직 부분적이고 (Drenth et al. (2007) J Clin Invest, 117:3603-3609), 이들의 용도는 CNS (예를 들어, 떨림, 발작) 또는 심장 (부정맥) 독성과 연관되어 있다. Na⁺ 채널 서브유형-선별 차단제가 현재 치료법의 초점이 되고 있다.

유용성 시험 및 투여

일반적인 유용성

본 발명의 방법은 다양한 원인에 의해 발생되는 통증을 치료하는데 유용하다. 이론에 얽매이지 않으면서, 통증 줄기를 치료하는 라놀라진의 능력이 피크 및 윈도우 Nav1.7 및 Nav1.8 전류의 선별 차단제로서 작용하는 놀라운 역량의 결과인 것으로 여겨진다.

약학 조성물 및 투여

라놀라진은 통상 약학 조성물의 형태로 투여된다. 그러므로 본 발명은, 활성 성분으로서 라놀라진, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 및 1 종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 비활성 고체 희석제 및 충전제를 비롯한 담체, 멸균 수용액 및 다양한 유기 용매를 비롯한 희석제, 가용화제 및 아쥬반트를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 라놀라진은 단독으로 또는 기타 치료제와 조합으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약학 업계에 잘 알려진 방식에 의해 제조된다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17th Ed. (1985) 및 "Modern Pharmaceutics", Marcel Dekker, Inc. 3rd Ed. (G.S. Banker & CT. Rhodes, Eds.) 참조).

라놀라진은, 예를 들어 참조로서 인용된 이들 특허 및 특허 출원에서 기재된 바와 같이, 직장, 구강, 비내 및 경피 경로, 동맥내 주사, 정맥내, 복강내, 비경구, 근육내, 피하, 경구, 국소를 비롯하여, 흡입제로서, 또는 스텐트, 예를 들어, 또는 동맥-삽입 원통형 중합체와 같은 함침 또는 코팅된 장치를 통해, 유사한 유용성을 갖는 작용제의 임의의 허용되는 투여 방식에 의해 단일 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다.

적합한 부형제의 일부 예에는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸스, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 멸균수, 시럽 및 메틸 셀룰로오스가 포함된다. 제형은 부가적으로, 윤활제, 예컨대 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광유; 습윤제; 유화제 및 현탁화제; 보존제, 예컨대 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트; 감미제; 및 풍미제를 포함할 수 있다.

경구 투여는 라놀라진의 바람직한 투여 경로이다. 캡슐 또는 장용 코팅정 등을 통해 투여될 수 있다. 라놀라진을 포함하는 약학 조성물의 제조시, 활성 성분은 통상적으로 부형제에 의해 희석되고/거나 캡슐, 사켓, 종이 또는 기타 용기의 형태일 수 있는 담체 내에 동봉된다. 부형제가 희석제인 경우, 활성 성분에 대한 비히클, 담체 또는 매질로서 작용하는 고체, 반고체, 또는 액체 물질 (상기와 같음) 일 수 있다. 그러므로, 조성물은 정제, 알약, 분말, 마름모꼴 정제, 사켓, 카세제, 엘릭시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸 (고체로서 또는 액체 매질 내), 예를 들어, 50 중량% 이하의 활성 화합물을 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액 및 멸균 패키지 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 환자에게 투여한 후 활성 성분의 신속한 방출, 서방출 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 경구 투여용 조절 방출 약물 전달 시스템에는 중합체-코팅 저장소 또는 약물-중합체 매트릭스 제형을 함유하는 삼투 펌프 시스템 및 용해 시스템이 포함된다. 조절 방출 시스템의 예는 미국 특허 제 3,845,770 호; 제 4,326,525 호; 제 4,902,514 호; 및 제 5,616,345 호에 제시된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 또다른 제형은 경피 전달 장치 ("패치") 를 사용한다. 이러한 경피 패치는 본 발명의 화합물의 연속 또는 불연속 주입을 조절된 양으로 제공하기 위해 사용될 수 있다. 약제 전달용의 경피 패치의 제작 및 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,023,252 호, 제 4,992,445 호 및 제 5,001,139 호를 참조한다. 이러한 패치는 연속의, 박동에 대해, 또는 약제의 요구 전달에 대해 제작될 수 있다.

라놀라진은 광범위한 투여량에 걸쳐 효과적이고, 일반적으로는 약학적 유효양으로 투여된다. 전형적으로는, 경구 투여의 경우, 각 투여량 단위는 1 mg 내지 2 g 의 라놀라진, 더욱 통상적으로는 1 내지 700 mg, 비경구 투여의 경우, 1 내지 700 mg 의 라놀라진, 더욱 통상적으로는 약 2 내지 200 mg 을 함유한다. 그러나, 실제로 투여되는 라놀라진의 양은, 치료할 상태, 투여 경로 선택, 투여되는 실제 화합물 및 관련 활성, 각 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자의 증상의 심각도 등을 비롯한 관련 상황에 비추어, 담당의가 결정하게 될 것으로 이해될 것이다.

정제와 같은 고체 조성물의 제조를 위해, 주요 활성 성분을 약학 부형제와 혼합하여 본 발명의 화합물의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성한다. 이러한 예비제형 조성물이 균질한 것으로 언급되는 경우, 활성 성분이 조성물 전체에 균등하게 분산되어 조성물이 정제, 알약 및 캡슐과 같은 동일하게 효과적인 단위 투여량 형태로 쉽게 나누어질 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 정제 또는 알약은 코팅되거나 다르게는 장기간 작용하는 장점을 제공하는 투여 형태를 제공하거나 위의 산 조건으로부터 보호하기 위해 혼합될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있고, 외부 투여 성분은 내부 투여 성분에 대한 피막 형태이다. 2 가지 성분은 위에서의 붕해를 방지하고 내부 성분이 십이지장 내로 온전하게 통과하거나 방출을 지연시키도록 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있으며, 이러한 물질에는 다수의 중합체 산 및 쉘락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질과 중합체 산의 혼합물이 포함된다.

흡입법 또는 통기법을 위한 조성물에는 약학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매 내의 용액 및 현탁액, 또는 이의 혼합물 및 분말이 포함된다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 기재된 바와 같은 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 바람직하게는 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 용매 내의 조성물은 비활성 기체를 사용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치를 통해 직접 흡입될 수 있고, 또는 분무 장치가 얼굴 마스크 텐트, 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액, 또는 분말 조성물은, 적합한 방식으로 제형을 전달하는 장치를 통해 바람직하게는 경구 또는 비강으로 투여될 수 있다.

하나의 투여 방식은 비경구, 특히 주사에 의해서이다. 본 발명의 신규 조성물이 주사에 의한 투여에 도입될 수 있는 형태에는 참깨유, 옥수수유, 면화씨유, 또는 땅콩유 뿐 아니라 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로오스, 또는 멸균 수용액으로의 수성 또는 유성 현탁액, 또는 에멀젼 및 유사한 약학 비히클이 포함된다. 식염수 중의 수용액이 또한 주사에 통상적으로 사용되지만, 본 발명의 문맥에서는 덜 바람직하다. 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등 (및 이의 적합한 혼합물), 시클로덱스트린 유도체 및 식물성유가 또한 사용될 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다.

멸균 주사 용액은 본 발명의 화합물을 필요한 대로 상기 언급된 바와 같은 다양한 기타 성분을 함유하는 적합한 용매 내에 필요한 양으로 도입시킨 후, 여과 및 멸균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 언급된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사용액 제제 용의 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이의 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말 및 임의의 부가적인 요망 성분을 산출하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.

라놀라진의 정맥내 제형은 하기와 같은 무균 충전 공정을 통해 제조된다. 적합한 용기에, 필요한 양의 덱스트로오스 모노히드레이트를 대략 78% 의 최종 배치 중량으로 주사용수 (WFI) 에 용해한다. 계속 교반하면서, 필요한 양의 라놀라진 자유 염기를 덱스트로오스 용액에 첨가한다. 라놀라진의 분산을 용이하게 하기 위해, 0.1N 또는 1N 염산 용액으로 용액 pH 를 3.88-3.92 의 목표값으로 조정한다. 부가적으로는, 0.1N HCl 또는 1.0N NaOH 를 이용하여 목표값 pH 3.88-3.92 로 용액을 최종 조정할 수 있다. 라놀라진을 용해한 후, 배치를 WFI 의 최종 중량으로 조정한다. 공정 내 상세사항이 만족되는 것을 확인 시, 라놀라진 벌크 용액을 2 개의 0.2 ㎛ 멸균 여과기를 통해 멸균 여과에 의해 여과한다. 그 후, 멸균 라놀라진 벌크 용액을 멸균 유리 바이알 내로 무균 충전시키고, 멸균 마개로 무균으로 마개를 끼운다. 그 다음 마개를 끼운 바이알을 깨끗한 플립-탑 알루미늄 씰로 밀봉한다.

라놀라진은 예를 들어 확산에 의해 스텐트 내로 함침되거나, 본 명세서의 견지에서 당업자에게 알려진 절차를 사용하여 예를 들어 젤 형태와 같이 스텐트 상에 코팅될 수 있다.

조성물은 바람직하게는 단위 투여량 형태로 제형화된다. "단위 투여량 형태" 라는 용어는 인간 대상 및 기타 포유류에게 단일한 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 말하고, 각 단위는 적합한 약학 부형제 (예를 들어, 정제, 캡슐, 앰플) 와 함께, 원하는 치료 효과를 산출하기 위해 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다. 라놀라진은 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이고 일반적으로는 약학적 유효양으로 투여된다. 바람직하게는, 경구 투여의 경우, 각 투여량 단위는 10 mg 내지 2 g 의 화합물 라놀라진, 더욱 바람직하게는 10 내지 1500 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1000 mg, 더욱 바람직하게는 500 내지 1000 mg 을 함유한다. 그러나, 실제로 투여되는 라놀라진의 양은 치료할 상태, 투여 경로 선택, 투여되는 실제 화합물 및 그의 관련 활성, 각 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자의 증상의 심각도 등을 비롯한 관련 상황에 비추어, 담당의가 결정하게 될 것으로 이해될 것이다.

하나의 구현예에서, 라놀라진은 환자에게 투여 후 활성 성분의 신속한 방출, 서방출 또는 지연 방출, 특히 서방출 제형을 제공하도록 제형화된다. 다르게 언급되지 않는 경우, 본 명세서 및 실시예에서 사용되는 라놀라진 혈장 농도는 라놀라진 자유 염기를 말한다.

본 발명의 바람직한 서방출 제형은 바람직하게는 위 내 pH (전형적으로 대략 2) 및 장 내 pH (전형적으로 대략 5.5) 의 범위에 걸쳐 수성 매질 중의 분산액의 비율을 조절하는 일부 중화된 pH-의존성 결합제 및 화합물의 잘 혼련된 혼합물을 포함하는 압착 정제의 형태이다. 서방출 제형의 예는, 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제 6,303,607 호; 제 6,479,496 호; 제 6,369,062 호; 및 제 6,525,057 호에 기재되어 있다.

라놀라진의 서방출을 제공하기 위해, 1 종 이상의 pH-의존성 결합제는, 제형이 위 및 위장관을 통해 통과하도록 제형이 약물을 천천히 그리고 지속적으로 방출시키도록 화합물의 분산액 프로파일을 조절하도록 선택된다. 일일 2 회 투여에 충분한 화합물을 함유하는 서방성 제형은 화합물이 너무 빠르게 방출되는 경우 ("투여량-덤핑") 뜻밖의 부작용을 야기할 수 있기 때문에, pH-의존성 결합제(들) 의 분산액 조절 능력은 서방성 제형에서 특히 중요하다.

따라서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 pH-의존성 결합제는 위 (pH 는 약 4.5 미만임) 내 잔류 동안 정제로부터 약물의 급속 방출을 억제하는 결합체 및 하부 위장관 (pH 는 일반적으로는 약 4.5 초과임) 에서 투여량 형태로부터 치료량의 화합물 방출을 촉진하는 결합제이다. "장용" 결합제 및 코팅제로서 약학 업계에 공지된 많은 물질은 바람직한 pH 분산액 특성을 갖는다. 이들은 프탈산 유도체, 예컨대 비닐 중합체 및 공중합체의 프탈산 유도체, 히드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 히드록시알킬셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 에테르, 알킬셀룰로오스 아세테이트 및 이의 부분적 에스테르, 및 저급 알킬 아크릴산 및 저급 알킬 아크릴레이트의 중합체 및 공중합체 및 이의 부분적 에스테르를 포함한다.

서방성 제형을 제조하기 위해 화합물과 함께 사용될 수 있는 바람직한 pH-의존성 결합제 물질은 메타크릴산 공중합체이다. 메타크릴산 공중합체는 에틸 아크릴레이트 또는 메틸 메타크릴레이트와 같은 중성 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 에스테르와 메타크릴산의 공중합체이다. 가장 바람직한 공중합체는 메타크릴산 공중합체, 유형 C, USP (이것은 46.0% 내지 50.6% 메타크릴산 단위를 갖는 메타크릴산과 에틸 아크릴레이트의 공중합체임) 이다. 이러한 공중합체는 Eudragit® L 100-55 (분말로서) 또는 L30D-55 (수중 30% 분산액으로서) 로서 Rohm Pharma 에서 시판된다. 단독으로 또는 서방성 제형 투여량 형태와 조합으로 사용될 수 있는 기타 pH-의존성 결합제 물질은 히드록시프로필 셀룰로오스 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐피롤리돈 프탈레이트 등을 포함한다.

1 종 이상의 pH-독립적 결합제는 경구 투여량 형태의 서방성 제형에 사용될 수 있다. 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 중성 폴리(메트)아크릴레이트 에스테르 등과 같은 pH-의존성 결합제 및 점도 향상제가, 스스로 확인된 pH-의존성 결합제에 의해 제공되는 필요한 분산액 조절을 제공할 수 없다는 것이 주목된다. pH-독립적 결합제는 본 발명의 제형 내에 약 1 내지 약 10 중량% 의 범위의 양, 바람직하게는 약 1 내지 약 3 중량% 의 범위의 양, 가장 바람직하게는 약 2.0 중량% 의 양으로 존재할 수 있다.

표 1 에서 제시되는 바와 같이, 라놀라진은 pH 가 약 6.5 을 초과하는 수용액에서 비교적 불용성인 반면, 용해도는 약 pH 6 미만에서 현저하게 증가하기 시작한다.

표 1

제형 내 pH-의존성 결합제 함량 증가는, 위 내에서 발견되는 pH 의 전형적인 4.5 미만인 pH 에서 제형으로부터 화합물의 서방출 형태의 방출 속도를 감소시킨다. 결합제에 의해 형성되는 장용 코팅은 덜 용해되고 화합물의 용해도가 저하되는 pH 4.5 초과에서 상대 방출 속도를 증가시킨다. pH-의존성 결합제의 적합한 선택은 pH 4.5 초과에서 제형물로부터 화합물의 빠른 방출 속도를 허용하는 반면, 낮은 pH 에서 방출 속도에는 크게 영향을 미친다. 결합제의 부분적인 중화는 결합제를 각각의 과립 주변에 형성되는 라텍스 유사 필름으로의 전환을 용이하게 한다. 따라서, pH-의존성 결합제의 유형 및 품질 및 부분적인 중화 조성물의 양은 제형으로부터 화합물의 분산액 비율을 밀접하게 조절하도록 선택된다.

본 발명의 투여량 형태는 그로부터 서방출 제형을 생성하기에 충분한 pH-의존성 결합제의 양을 가져야만 하고, 화합물의 방출 속도는 저 pH (약 4.5 미만) 에서 분산액 비율이 현저히 감소되는 식으로 조절된다. 메타크릴산 공중합체, 유형 C, USP (Eudragit® L 100-55) 의 경우에서, pH-의존성 결합제의 적합한 양은 5% 내지 15% 이다. pH 의존성 결합제는 전형적으로 약 1 내지 약 20% 의 결합제 메타크릴산 카르복실기가 중화되게 할 것이다. 그러나, 중화도가 약 3 내지 6% 의 범위인 것이 바람직하다. 서방출 제형은 또한 화합물 및 pH-의존성 결합제와 잘 혼련된 약학 부형제를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제에는 예를 들어, pH-독립적 결합제 또는 막-형성제, 예컨대 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 중성 폴리(메트)아크릴레이트 에스테르 (예를 들어, Rohm Pharma 에서 상표명 Eudragit® NE 로 시판되는 메틸 메타크릴레이트/에틸 아크릴레이트 공중합체), 전분, 젤라틴, 당 카르복시메틸 셀룰로오스 등이 포함될 수 있다. 기타 유용한 약학 부형제에는 희석제, 예컨대 락토오스, 만니톨, 건조 전분, 미세결정성 셀룰로오스 등; 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 소르비탄 에스테르 등; 및 착색제 및 풍미제가 포함된다. 윤활제 (예컨대 탈크 및 마그네슘 스테아레이트) 및 기타 정제화 보조제가 또한 임의로 존재한다.

본 발명의 서방출 제형의 활성 화합물 함량은 약 50 중량% 초과 내지 약 95 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 약 70 중량% 내지 약 90 중량%, 가장 바람직하게는 약 70 중량% 내지 약 80 중량%; pH-의존성 결합제 함량은 5% 내지 40%, 바람직하게는 5% 내지 25%, 더욱 바람직하게는 5% 내지 15% 이고; 투여량 형태의 나머지는 pH-독립적 결합제, 충전제 및 기타 임의의 부형제를 포함한다.

본 발명의 하나의 특히 바람직한 서방출 제형은 하기 표 2 에 제시되어 있다.

표 2

본 발명의 서방출 제형은 다음과 같이 제조된다: 화합물 및 pH-의존성 결합제 및 임의의 임의의 부형제를 잘 혼합한다 (건조-혼련한다). 그 다음 건조-혼련된 혼합물을 혼련된 분말 내로 분사되는 강염기 수용액의 존재하에 과립화한다. 상기 과립을 건조하고, 스크리닝하고, 임의의 윤활제 (예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트) 와 혼합하고, 정제로 압착한다. 강염기의 바람직한 수용액은 알칼리 금속 히드록시드의 용액, 예컨대 수 중 수산화나트륨 또는 수산화칼륨, 바람직하게는 수산화나트륨 (임의로 25% 이하의 수-혼화성 용매를 함유함, 예컨대 저급 알코올) 이다.

수득되는 정제는 확인용, 맛-차폐 목적 및 삼킴 용이성 향상을 위해, 임의의 막-형성제로 코팅될 수 있다. 막-형성제는 전형적으로 정제 중량의 2% 내지 4% 범위의 양으로 존재할 것이다. 적합한 막-형성제는 당업계에 잘 알려져 있고, 히드록시프로필. 메틸셀룰로오스, 양이온성 메타크릴레이트 공중합체 (디메틸아미노에틸 메타크릴레이트/ 메틸-부틸 메타크릴레이트 공중합체 - Eudragit® E - Rohm. Pharma) 등을 포함한다. 이러한 막-형성제는 임의로 착색제, 가소제 및 기타 보충 성분을 함유할 수 있다.

압착 정제는 바람직하게는 8 Kp 압축력을 견디어낼 정도로 충분한 경도를 갖는다. 정제 크기는 일차적으로 정제 내 화합물의 양에 따라 다를 것이다. 정제는 300 내지 1100 mg 의 화합물 자유 염기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 정제는 400-600 mg, 650-850 mg 및 900-1100 mg 의 범위의 화합물 자유 염기의 양을 포함할 것이다.

분산액 비율에 영향을 주기 위해서, 분말 함유 화합물을 습식 혼합하는 동안의 시간을 조절한다. 바람직하게는 총 분말 혼합 시간, 즉 분말이 수산화나트륨 용액에 노출되는 동안의 시간은 1 내지 10 분, 바람직하게는 2 내지 5 분의 범위일 것이다. 과립화 후, 과립화기로부터 입자를 제거하고, 약 60℃ 에서 건조하기 위해 유동층 건조기에 둔다.

화합물이 이의 더욱 약학적으로 통상적인 디히드로클로라이드 염 또는 또다른 염 또는 에스테르보다는 그의 유리 염기로서 사용되는 경우, 상기 방법으로 투여 후 12 시간까지 화합물의 낮은 피크 혈장 수준 및 더욱 유효한 혈장 농도를 제공하는 서방출 제형을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 유리 염기의 사용은 하나 이상의 장점을 제공한다: 유리 염기의 분자량은 디히드로클로라이드의 분자량의 오직 85% 이므로, 정제 내 화합물의 비율이 증가될 수 있다. 본 방식으로, 투여량 단위의 물리적 크기를 제한하면서 유효량의 화합물의 전달이 달성된다.

본 발명의 경구 서방성 라놀라진 투여량 제형은, 혈장 라놀라진 수준을 역치 치료 수준 초과 및 최대 용인 수준 미만으로 유지하기 위해 (바람직하게는 환자 내 혈장 수준이 약 550 내지 7500 ng 염기/mL 임) 24 시간 기간 내 1 회, 2 회 또는 3 회 투여된다. 바람직한 구현예에서, 라놀라진의 혈장 수준은 약 1500-3500 ng 염기/mL 의 범위이다.

바람직한 혈장 라놀라진 수준을 달성하기 위해, 본원에서 기재된 경구 라놀라진 투여량 형태가 1 일 1 회 또는 2 회 투여되는 것이 바람직하다. 투여량 형태가 1 일 2 회 투여되는 경우, 경구 라놀라진 투여량 형태는 약 12 시간 간격으로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 라놀라진은 국소 투여를 위해 약학 제형 내에 혼입될 수 있다. 상기 유형의 제형은 전형적으로는 일반적으로 국소 약물 투여에 적합하고 당업계에 공지된 임의의 이러한 물질을 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 적합한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있고, 담체의 선택은 의도되는 약학 제형의 형태, 예를 들어, 연고, 로션, 크림, 포말, 마이크로에멀젼, 젤, 오일, 용액, 스프레이, 연고 등에 따라 다를 것이며, 자연 발생적 또는 합성 물질을 포함할 수 있다. 선택된 담체가 라놀라진 또는 약학 제형의 기타 성분에 부작용을 주지 않아야만 하는 것으로 이해된다.

이러한 유형의 제형에 적합한 담체에는 Shephard's™ Cream, Aquaphor™ 및 Cetaphil™ 로션을 비롯한 비히클이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 기타 바람직한 담체에는 연고 기재, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜-1000 (PEG-1000), 시판 크림, 예컨대 HEB 크림, 젤 뿐 아니라 바셀린 등이 포함된다.

본원에서 사용하기에 적합한 담체의 예에는 물, 알코올 및 기타 무독성 유기 용매, 글리세린, 광유, 실리콘, 바셀린, 라놀린, 지방산, 식물성 오일, 파라벤, 왁스 등이 포함된다. 본원에서 특히 바람직한 제형은 무색, 무취 연고, 로션, 크림, 마이크로에멀젼 및 젤이다.

연고는 전형적으로 바셀린 또는 기타 석유 유도체 기재의 반고체 제제이다. 당업자에게 인지되는 바와 같은 사용되는 구체적인 연고 기재는, 최적 약물 전달을 제공할 기재, 바람직하게는 또한 기타 바람직한 특성, 예를 들어, 피부 연화 등을 제공할 기재이다. 기타 담체 또는 비히클로서, 연고 기재는 비활성의, 안정한, 비자극성 및 비감작성이어야만 한다. [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Ed. (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 2000)] 에 설명되는 바와 같이, 연고 기재는 하기 4 가지 계통: 유성 기재; 유화성 기재; 에멀젼 기재; 및 수용성 기재로 그룹화될 수 있다. 유성 연고 기재에는 예를 들어, 식물성 오일, 동물로부터 수득되는 지방 및 석유로부터 수득되는 반고체 탄화수소가 포함된다. 또한 흡수성 연고 기재로서 알려져 있는 유화성 연고 기재는 물을 거의 또는 전혀 함유하지 않고, 예를 들어, 히드록시스테아린 술페이트, 무수 라놀린 및 친수성 바셀린을 포함한다. 에멀젼 연고 기재는 유중수 (W/O) 에멀젼 또는 수중유 (O/W) 에멀젼이고, 예를 들어, 세틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린 및 스테아르산을 포함한다. 바람직한 수용성 연고 기재는 분자량이 상이한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 로부터 제조되고; 추가 정보를 위해서는 상기 [Remington's] 문헌을 다시 참조할 수 있다.

로션은 마찰 없이 피부 표면에 적용되게 되는 제제이고, 전형적으로는, 활성제를 비롯한 고체 입자가 물 또는 알코올 기재 내에 존재하는 액체 또는 반액체 제제이다. 로션은 통상적으로는 고체의 현탁액이고, 바람직하게는, 본 발명의 목적을 위해 수중유 유형의 액체 유성 에멀젼을 포함한다. 로션은 보다 유체인 조성물을 적용하는 용이함 때문에, 넓은 신체 영역을 처리하기에 본원에서 바람직한 제형이다. 일반적으로는 로션 중의 불용성 물질이 미분되어 있는 것이 필요하다. 로션은 전형적으로 피부와 접촉하는 활성제의 국부화 및 유지에 유용한 화합물 뿐 아니라 양호한 분산액을 제조하기 위한 현탁화제, 예를 들어, 메틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 등을 함유할 것이다. 본 발명과 함께 사용하기에 특히 바람직한 로션 제형은 Beiersdorf, Inc. (Norwalk, Conn.) 사의 상표명 Aquaphor™ 으로 수득될 수 있는 것과 같은 친수성 바셀린과 혼합된 프로필렌 글리콜을 함유한다.

활성제를 함유하는 크림은, 당업계에 알려져 있는 바와 같이 수중유 또는 유중수의 점성 액체 또는 반고체 에멀젼이다. 크림 기재는 물로 세척가능하고, 유상, 유화제 및 수상을 함유한다. 유상은 일반적으로는 바셀린 및 지방 알코올, 예컨대 세틸 또는 스테아릴 알코올을 포함하고; 수상은 통상적으로, 그러나 필수적이지는 않고 부피로 유상을 초과하고, 일반적으로는 휴멕턴트를 함유한다. 상기 [Remington's] 문헌에 설명되는 바와 같이 크림 제형 내의 유화제는 일반적으로는 비이온성, 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽이온성 계면활성제이다.

마이크로에멀젼은, 계면활성제 분자의 계면 막에 의해 안정화된 2 가지 비혼련성 액체, 예컨대 오일 및 물의 열역학적으로 안정한 등방성의 맑은 분산액이다 (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volume 9). 마이크로에멀젼의 제조를 위해, 계면활성제 (유화제), 조-계면활성제 (조-유화제), 유상 및 수상이 필요하다. 적합한 계면활성제에는 에멀젼 제조에 유용한 임의의 계면활성제, 예를 들어, 크림 제조에 전형적으로 사용되는 유화제가 포함된다. 조-계면활성제 (또는 "조-유화제") 는 일반적으로는 폴리글리세롤 유도체, 글리세롤 유도체 및 지방 알코올의 군으로부터 선택된다. 바람직한 유화제/조-유화제 조합은 일반적으로는 글리세릴 모노스테아레이트 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 폴리에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트; 및 카프릴 및 카프르 트리글리세라이드 및 올레오일 마크로골글리세라이드로 이루어진 군으로부터 선택되나 반드시 그럴 필요는 없다. 수상에는 물 뿐 아니라 전형적으로는 또한 완충제, 글루코오스, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 저급 분자량 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 300 및 PEG 400) 및/또는 글리세롤 등도 포함되고, 유상은 일반적으로는 예를 들어, 지방산 에스테르, 개질 식물성 오일, 실리콘 오일, 모노- 디- 및 트리글리세라이드의 혼합물, PEG 의 모노- 및 디-에스테르 (예를 들어, 올레오일 마크로골 글리세라이드) 등을 포함할 것이다.

젤 제형은 담체 액체 (단일상 젤) 를 통해 실질적으로 균일하게 분포된 작은 무기 입자 현탁액 (2 상 시스템) 또는 큰 유기 분자로 이루어지는 반고체 시스템이다. 단일상 젤은 예를 들어, 활성제, 담체 액체 및 적합한 겔화제, 예컨대 트라가칸스 (2-5%), 나트륨 알기네이트 (2-10%), 젤라틴 (2-15%), 메틸셀룰로오스 (3-5%), 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 (2-5%), 카르보머 (0.3-5%) 또는 폴리비닐 알코올 (10-20%) 을 함께 조합하고, 특징적인 반고체 생성물이 제조될 때까지 혼합함으로써 제조될 수 있다. 기타 적합한 겔화제에는 메틸히드록시셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌, 히드록시에틸셀룰로오스 및 젤라틴이 포함된다. 통상적으로 젤은 담체 수성액을 사용하지만, 담체 액체로서 알코올 및 오일이 사용될 수도 있다.

당업자에게 알려진 다양한 첨가제가 본 발명의 국소 제형에 포함될 수 있다. 첨가제의 예에는 가용화제, 피부 투과 향상제, 불투명제, 방부제 (예를 들어, 항산화제), 겔화제, 완충제, 계면활성제 (특히 비이온성 및 양쪽이온성 계면활성제), 유화제, 연화제, 증점제, 안정화제, 휴멕턴트, 착색제, 향 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 가용화제 및/또는 피부 투과 향상제의 혼입은 유화제, 연화제 및 방부제와 함께 특히 바람직하다.

가용화제의 예에는 친수성 에테르, 예컨대 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (에톡시디글리콜, Transcutol™ 으로서 시판됨) 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 올레에이트 (Softcutol™ 으로서 시판됨); 폴리에틸렌 피마자유 유도체, 예컨대 폴리옥시 35 피마자유, 폴리옥시 40 수소화 피마자유 등; 폴리에틸렌 글리콜, 특히 저급 분자량 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 300 및 PEG 400 및 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 예컨대 PEG-8 카프릴/카프르 글리세라이드 (Labrasol™ 으로서 시판됨); 알킬 메틸 술폭시드, 예컨대 DMSO; 피롤리돈, 예컨대 2-피롤리돈 및 N-메틸-2-피롤리돈; 및 DMA 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 많은 가용화제는 또한 흡수 향상제로서 작용할 수 있다. 단일 가용화제가 제형 내에 혼입될 수 있거나, 가용화제의 혼합물이 그 안에 혼입될 수 있다.

적합한 유화제 및 조-유화제에는 마이크로에멀젼 제형과 관련하여 기재되는 유화제 및 조-유화제가 제한 없이 포함된다.

연화제에는 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 이소프로필 미리스테이트, 폴리프로필렌 글리콜-2 (PPG-2) 미리스틸 에테르 프로피오네이트 등이 포함된다.

또한 기타 활성제, 예를 들어, 항-염증제, 기타 진통제, 항미생물제, 항진균제, 항생제, 비타민, 항산화제 및, 안트라닐레이트, 벤조페논 (특히 벤조페논-3), 캄포르 유도체, 신나메이트 (예를 들어, 옥틸 메톡시신나메이트), 디벤조일 메탄 (예를 들어, 부틸 메톡시디벤조일 메탄), p-아미노벤조산 (PABA) 및 이의 유도체 및 살리실레이트 (예를 들어, 옥틸 살리실레이트) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 썬스크린 제형에서 통상 발견되는 선블럭제가 제형에 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 국소 제형에서, 라놀라진은 제형의 대략 0.25 중량% 내지 75 중량% 의 범위의 양, 바람직하게는 제형의 대략 0.25 중량% 내지 30 중량% 의 범위의 양, 더욱 바람직하게는 제형의 대략 0.5 중량% 내지 15 중량% 의 범위의 양, 가장 바람직하게는 제형의 대략 1.0 중량% 내지 10 중량% 의 범위의 양으로 존재한다.

또한, 약학 제형은 보조제, 예를 들어, 방부제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 삼투압에 영향을 주는 염 등으로 멸균되거나 이들과 혼합될 수 있다.

멸균 주사 용액은 라놀라진을 필요한 대로 상기 언급된 바와 같은 다양한 기타 성분을 함유하는 적합한 용매 내에 필요한 양으로 도입시킨 후, 여과 멸균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 언급된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사용액 제제 용의 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이의 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말 및 임의의 부가적인 요망 성분을 산출하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 증명하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 기재되는 기술이 본 발명자에 의해 발견된 기술이 본 발명의 실시에 잘 작용하여, 실시를 위해 바람직한 방식을 성립하고자 고려될 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 그러나, 당업자는 본 명세서의 견지에서 기재된 구체적인 구현예에 많은 변화가 이루어질 수 있어 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 이와 같은 또는 유사한 결과를 수득하는 것임을 인식해야만 한다.

실시예 1

Nav1 .7 이온 채널의 라놀라진 차단

재료 및 방법

이종 발현: DNA 구축물 및 트랜스펙션 SCN9A Na ⁺ 채널.

SCN9A Na⁺ 채널의 α- 및 β1 서브유닛을 인코딩하는 cDNA 로 안정적으로 트랜스펙션된 인간 배아 신장 (HEK293) 세포를 [Scottish Biomedical, Glasgow, United Kingdom] 로부터 구입하였다. HEK293 세포를 10% 우태 혈청 및 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 에서 배양하였다.

패치-클램프 기록 기술

전체-세포 패치 클램프 기술 (18±1℃) 을 사용하여 막 전류를 기록하였다. pCLAMP 10.0 소프트웨어 (Axon Instruments, Sunnyvale, CA) 를 사용하여 전압 클램프 프로토콜을 발생시키고, 습득 데이터를 pCLAMP 10.0 및 Microcal Origin (MicroCal, Northampton, MA) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. Nav1.7 피크 나트륨 전류 (I_Na) 의 기록 동안, 세포외 배쓰 용액 성분은 다음과 같았다 (mM): NaCl 140, KCl 4, CaCl₂ 1.8, MgCl₂ 0.75, HEPES 5 (NaOH 로 적정 후 pH 7.4). 세포내 피펫 용액 성분은 다음과 같았다 (mM): CsF 120, CsCl 20, EGTA 2, HEPES 5 (CsOH 로 적정 후 pH 7.4). Axopatch-200B 패치 클램프 증폭기 (Axon Instruments Inc., Sunnyvale, CA) 를 사용하여 I_Na 를 기록하고, 세포 정전용량을 측정하였다. 데이터를 20 kHz 에서 샘플링하고, 5 kHz 에서 필터링하였다 (8-pole Bessel). 직렬 저항 (R_s) 보상은 70-80% 였고, 누출 공제는 사용하지 않았다.

약물 공급원 및 투여

연구 등급 라놀라진 (라세믹 혼합물), R-라놀라진 및 S-라놀라진은 [Department of Bio-Organic Chemistry at CV Therapeutics, Inc (Palo Alto, CA)] 에서 합성되었고, 0.1 N HCl 에 용해시켜 10 mM 농도의 저장액을 산출하였다. 실험 일에 Tyrode 용액에서 추가의 희석액을 신선하게 제조하였다.

통계 분석

데이터는 평균 ± SEM 으로 나타낸다. Hill 방정식, I_약물/I_대조군 = 1/[1+(D/IC₅₀)^nH] (식 중 I_약물/I_대조군 은 비율 블록이고, D 는 약물 농도이고, IC₅₀ 는 50% 차단을 야기하는 약물 농도이고, n_H 는 Hill 계수임) 을 사용하여 농도-반응 관계식을 작성하였다. 스튜던트 (Student) 쌍 t-검정을 사용하여 차이의 통계학적 유의성을 측정하였고, <0.05 의 p 값을 유의한 것으로 고려하였다.

결과

Nav1 .7 I _Na 를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에서의 나트륨 채널 정전용량의 특징분석

Na⁺ 전류는 TTX 에 대한 상이한 감수성을 기준으로 분리된다. Nav1.7 피크 IN_a 는 ~3 nM 의 IC₅₀ 값으로 TTX 에 대해 감수성 있는 것으로 보고된다 (Zhou et al, JPET, 306: 498-504). 본 실험실에서는 TTX 에 대한 감수성 Nav1.7 피크 I_Na 를 증명하기 위해, 세포를 50 msec 동안 -100 mV 내지 0 mV 의 유지 전위로부터 매 10 초 (0.1 Hz) 탈분극시켰다. 연구된 각 세포에서, 약물의 부재하에서 기록된 기준선 전류를 수득한 후, 300 nM TTX 를 함유하는 Tyrode 용액으로 실험 챔버의 관류를 계속하였다. TTX 에 노출 동안 Nav1.7 피크 I_Na 는 완전히 차단되었다. 유사한 효과를 3 가지 상이한 세포에서 관찰하였다 (데이터는 제시되지 않음).

라놀라진 ( 라세믹 혼합물) 및 그의 거울상이성질체 (R- 및 S- 라놀라진 ) 에 의한 Nav1 .7 피크 I _Na 의 차단

Nav1.7 피크 I_Na 를 억제하는 라놀라진의 농도-반응 관계를 측정하기 위해, SCN9A (Nav1.7) 유전자를 발현하는 개별 세포를 50 msec 의 기간 동안 -100 mV 내지 0 mV 의 유지 전위로부터 매 10 초 (0.1 Hz) 탈분극시켰다. 증가하는 농도의 라놀라진 (■, 1 내지 30 μM) 또는 R-라놀라진 (▲, 1 내지 100 μM) 및 S-라놀라진 (●, 1 내지 100 μM) 의 존재하에서 피크 I_Na 의 크기를 약물의 부재하에서의 각 대조군 값에 표준화시켰고, 상대 전류로서 그래프로 나타내었다 (도 1). 라놀라진, R-라놀라진 및 S-라놀라진에 의한 Nav1.7 피크 I_Na 의 차단에 대한 IC₅₀ 및 n_H 값이 표 3 에 제시되어 있다.

표 3. Nav1 .7 피크 I _Na 에 대한 라놀라진의 효과

라놀라진에 의한 Nav1 . 7 의 개방 상태 차단

라놀라진이 Nav1.7 I_Na 의 개방 또는 불활성 상태에 우선적으로 결합하는지를 이해하기 위해, 개개의 HEK293 세포를 매 200 msec 적용되는 동일한 펄스로 (즉, 5 Hz 의 속도로) 2, 5, 20, 또는 200 msec (단계 지속기간) 의 기간 동안 -100 mV 내지 0 mV 의 유지 전위로부터 연속 40 회 펄스로 탈분극시켰다. 100 μM 라놀라진의 부재 (대조군) 또는 존재 하에서의 피크 I_Na 의 크기를 제 1 탈분극 단계 (펄스 1) 에 반응하여 기록된 피크 I_Na 값에 표준화시켰다. 약물 없이, 반복적인 펄스는 피크 전류를 거의 감소시키지 않는 (~1 내지 8%) 또는 전혀 감소시키지 않는다 (도 2, 비워진 기호). 라놀라진이 개방 상태에 우선적으로 결합하는 경우, 피크 I_Na 의 유의한 차단은 탈분극 단계의 지속기간 (2, 5, 20 또는 200 msec) 과는 관계없이 관찰될 것이다. 지속기간 내 2 또는 5 msec 의 탈분극 전압 단계는 개방 상태를 비활성 상태로 채널을 이동하게 하기에는 너무 짧은 반면, 200-msec 지속기간의 탈분극 전압 단계는 개방 상태를 비활성 상태로 채널을 이동하게 할 것이다.

도 2 에서 제시되는 바와 같이 (채워진 기호), 100 μM 라놀라진의 존재하에서 2, 5, 20 또는 200 msec 의 기간 동안 0 mV 까지 Nav1.7 을 발현하는 HEK293 세포를 탈분극시키면 연속 펄스의 종결시 피크 I_Na 의 유의한 차단 (~82.72±0.71%) 을 야기하였다 (도 2, 채워진 기호; 펄스 40). 100 μM 라놀라진에 의한 피크 I_Na 의 차단% 는 탈분극 단계의 지속기간 (2, 5, 20 또는 200 msec) 에 독립적이었다. 100 μM 라놀라진에 의한 피크 I_Na 의 감소가 탈분극 단계의 지속기간에 독립적이었다는 발견은 상기 약물이 Na⁺ 채널 Nav1.7 의 개방 상태와 상호작용한다는 것을 나타낸다.

실시예 2

Nav1 .7 및 Nav1 .8 나트륨 전류의 라놀라진 차단

본 연구에서는, 라놀라진이 Nav1.7 및 Nav1.8 Na⁺ 채널을 억제한다는 것을 보여준다. 이들 채널은 말초 통증-감지 뉴런에 존재하고, 신경병증 통증의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 라놀라진은 Nav1.7 및 Nav1.8 Na⁺ 채널을 전압- 및 사용 (주파수)-의존적인 방식으로 억제하였다. 라놀라진은 Nav1.7 또는 Nav1.8 I_Na 의 활성화 전압 범위, 또는 전류의 최대-절반 활성화 (V_½) 가 발생하는 전압을 변경하지 않았다. 그러나, 라놀라진은 두 전류의 비활성화 전압의 농도-의존적 과분극 이동을 야기하였다.

방법

나트륨 채널의 발현

인간 β1 서브유닛과 함께 hNav1.7 (α-서브유닛) 을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 [Scottish-Biomedical, Glasgow, UK] 에서 구입하였다. 10% 열 비활성화 우태 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 600 ㎍/mL 게네티신 (Gibco-Invitrogen), 2 ㎍/mL 블라스토시딘 (Calbiochem, NJ, USA) 이 보충된 MEM (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 사용하여 세포를 계속 유지하였고, 공기 중 5% CO₂ 의 분위기하 37℃ 에서 인큐베이션하였다.

이종 발현 시스템 내에서의 Nav1.8 I_Na 의 일시적 또는 안정적 발현은 문제가 있는 것으로 보여졌다 (John et al, 2004a). 그러므로, 본 연구에서는 rNav1.8 을 안정적으로 발현하는 재조합 ND7-23 (래트 DRG/마우스 신경모세포종 잡종) 세포를 [Millipore (UK) limited, Cambridge, UK] 로부터 구입하였다. ND7-23 세포가 또한 빠른 동역학을 갖는 TTX-S I_Na 를 발현하지만, 이러한 Na⁺ 채널의 분자 정체는 아직 명확하지 않다고 보고되어 있다 (Dunn et al, 1991; John et al, 2004b). 10% 우태혈청, 1% L-글루타민, 1% 비-필수 아미노산, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 400 ㎍/mL 게네티신 (Gibco-Invitrogen) 이 보충된 DMEM (Gibco-Invitrogen) 을 사용하여 세포를 유지하였고, 공기 중 5% CO₂ 의 분위기하 37℃ 에서 인큐베이션하였다.

용액 및 화학약품

hNav1.7 I_Na 의 기록을 위해, HEK293 세포를 140 NaCl, 3 KCl, 10 HEPES, 10 글루코오스, 1 MgCl₂, 1 CaCl₂, pH 7.4 (NaOH 로 적정됨) (mM) 를 함유하는 세포외 용액으로 과냉각시켰다. 패치 파이펫을 140 CsF, 10 NaCl, 1 EGTA, 10 HEPES, pH 7.3 (CsOH 로 적정됨) (mM) 를 함유하는 내부 용액으로 채웠다. ND7-23 세포 또는 rNav1.8 I_Na 에서의 내생 I_Na 의 기록을 위해, 세포를 140 NaCl, 5 HEPES-Na, 1.3 MgCl₂, 1 CaCl₂, 11 글루코오스, 4.7 KCl, pH 7.4 (mM) 를 함유하는 세포외 용액으로 과냉각시켰다. 패치 파이펫을 120 CsF, 10 HEPES, 10 EGTA, 15 NaCl, pH 7.25 (mM) 를 함유하는 내부 용액으로 채웠다. rNav1.8 의 약물 차단의 용도-의존성을 측정하기 위해, +50 mV (이 때 Na⁺ 전류가 외부로 흐름) 의 시험 전위 및 65 NaCl, 85 클로린 Cl, 2 CaCl₂, 10 HEPES, pH 7.4 (테트라메틸암모늄 히드록시드로 적정됨) (mM) 를 함유하는 세포외 용액을 사용하여 실험을 수행하였다. 패치 파이펫을 100 NaF, 30 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, pH 7.2 (CsOH 로 적정됨) (mM) 를 함유하는 내부 용액으로 채웠다. 역 Na⁺ 구배를 사용하여, 내부로 흐르는 I_Na 흐름보다 외부로 흐르는 것이 덜 심각한 직렬 저항 인공구조물을 최소화하였다.

다르게 언급되지 않으면, 내생 TTX-S I_Na 를 차단하기 위해 300 nM TTX 의 연속 존재하에서 ND7-23 세포를 사용하는 패치-클램프 연구를 수행하였다 (Ogata and Tatebayashi, 1993;Roy and Narahashi, 1992). 연구 등급 라놀라진을 [Department of Bio-Organic Chemistry at CV Therapeutics, Inc (Palo Alto, CA)] 에서 합성하였고, TTX 를 [Sigma (St. Louis, MO)] 로부터 구입하였다. 라놀라진을 0.1 N HCl 에 용해시켜 10 mM 의 저장 용액을 산출하고, 실험 일에 Tyrode 용액에서 추가의 희석액을 신선하게 제조하였다. TTX 를 증류수에 용해시켰다.

전기생리학적 기술 및 데이터 습득

전체-세포 I_Na 를 Axopatch 200B 증폭기 (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) 를 사용하여 (Hamill et al., 1981) 에 의해 기재된 바와 같이 기록하였다. 신호는 5 kHz 에서 필터링하고, 20 kHz 에서 샘플링하였다. 패치 파이펫은 마이크로피펫 풀러 (Dagan Corporation, Minneapolis, USA) 를 사용하는 보로 실리케이트 유리 (World Precision Instruments, Sarasota, USA) 로부터 형성되었다. 파이펫을 세포에 부착하기 전에 오프셋 전위는 0 이었고, 전압을 액체 접점 전위에 대해서 교정하지 않았다. 모든 기록에서, 75-80% 의 직렬 저항 보상이 달성되었으므로, ~5 mV 의 최대 전압 오류가 산출되고 누출 전류는 P/-4 뺄셈에 의해 취소되었다. pCLAMP 10.0 소프트웨어 (Molecular Devices) 를 전압 클램프 프로토콜을 발생시키고 데이터를 습득하는데 사용하였다. 패치 파열 후 처음 수 분 내로 Na⁺ 채널 게이팅시 시간-의존적 이동을 피하기 위해, 세포를 -100 또는 -120 mV 의 막 전위로 유지하고 전류를 기록하기 전 5-7 분 동안 파이펫 용액으로 투석하였다. 모든 실험에서, 실험 용액의 온도를 CL-100 양극성 온도 조절기 (Warner Instruments, Hamden, USA) 를 사용하여 20±1℃ 에서 유지하였다.

[Clampfit and Microcal Origin (MicroCal, Northampton, USA)] 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 결과는 평균±SEM 으로 나타내고, n 은 세포수를 말한다. 모든 실험을 2 회 이상의 상이한 실험일에 기록하였다. 약물의 부재 및 존재하에서의 세포의 반응 사이의 차이의 통계적 유의성은 스튜던트 (Student) t-검정을 사용하여 측정하였고, P<0.05 은 통계적 유의성을 나타낸다.

농도-반응 관계식은 Hill 방정식을 사용하여 작성하였다:

I_약물/I_대조군 = 1/[1+(D/IC₅₀)ⁿH]

(식 중 I_약물/I_대조군 은 비율 블록이고, D 는 약물 농도이고, IC₅₀ 는 50% 차단을 야기하는 약물 농도이고, n_H 는 Hill 계수임).

-120 또는 -100 mV 의 유지 전위로부터 5 mV 증분으로, -80 내지 +40 mV 의 범위의 시험 전위까지 50-msec 탈분극 펄스를 사용하여 활성화의 전압 의존성을 측정하였다. 채널 활성화의 전압 의존성을 측정하기 위해, 하기 방정식을 사용하여 피크 전류 (I _Na) 로부터 Na⁺ 전도도 (G _Na) 를 계산하였다:

G _Na=I _Na/(V-Vrev)

(식 중, V 는 시험 펄스 전위이고, Vrev 는 계산된 역 전위임). 표준화된 Na⁺ 전도도를 시험 펄스 전위에 대해 그래프로 나타내고, Boltzmann 방정식에 대입하였다:

G/G _최대=1/[1+exp(V _½-V/k)]

(식 중, G 는 측정된 전도도이고, G _최대 는 최대 전도도이고, V _½ 는 최대-절반 채널 개방 가능성이 일어나는 막 전위이고, k 는 곡선의 기울기임). 안정-상태 비활성화의 전압 의존성을 평가하기 위해, -120 내지 0 mV (hNav1.7 I_Na 의 경우) 또는 -100 내지 +20 mV (rNav1.8 I_Na 의 경우) 범위의 예비펄스를 1 초의 기간 동안 적용한 후, 0 mV (hNav1.7 I_Na 의 경우) 또는 +20 mV (rNav1.8 I_Na 의 경우) 까지 50-msec 탈분극 단계에 적용하였다.

피크 전류 (I) 를 -100 또는 -120 mV 의 유지 전위 (V _h) 에서 수득되는 최대값 (I _최대) 에 대해 표준화하였고, 조건화 펄스 전위에 대해 도식으로 나타내었다. 데이터를 Boltzmann 방정식에 대입하였다:

I/I _최대=1/[1+exp(V-V _½/k)]

(식 중 V 는 예비펄스 동안의 막 전위이고, V _½ 은 최대-절반 채널 비활성화가 일어나는 전위이고, k 는 기울기 인수임). 안정-상태 저속 비활성화의 전압 의존성을 평가하기 위해, -120 내지 -10 mV (hNav1.7 I_Na 의 경우) 또는 -100 내지 -10 mV (rNav1.8 I_Na 의 경우) 범위의 예비펄스를 10 msec 의 기간 동안 적용한 후, -160 (hNav1.7 의 경우) 또는 -140 mV (rNav1.8 의 경우) 까지 100-msec 과분극 단계에 적용한 다음, 50-msec 의 기간 동안 0 (hNav1.7 I_Na 의 경우) 또는 +20 mV (rNav1.8 I_Na 의 경우) 로 이동시켜, 이용가능한 전류를 측정하였다. 간략한 100-msec 과분극 단계를 사용하여 채널 (결합된 약물 유무 상태 모두) 을 급속-비활성화로부터 (그러나 저속-비활성화는 아님) 회복시켰다. 안정-상태 저속 비활성화의 전압 의존성으로부터의 데이터를 변형된 Boltzmann 방정식에 대입하였다 (Carr et al. (2003). Neuron; 39:793-806 and Vilin et al. (2001) Cell Biochem Biophys, 35:171-190.):

I/I _최대=(1-I _resid)/[1+exp(-(V-V _½)/k)]

(식 중, I _resid 는 전류의 잔류 (비-비활성화) 분획임).

라놀라진에 의한 비활성화 채널의 차단 범위를 추정하기 위해, 안정-상태 비활성화 곡선의 이동의 농도-의존성에 근거한 간접적인 접근법이 사용되었다 ((Bean et al, 1983), 하기 방정식 참조).

ΔV_½ = k In[(1+(D/IC_50R))/(1+([D/K _l))]

(식 중 ΔV_½ 은 안정-상태 비활성화 곡선의 중간점 이동이고, k 는 Boltzmann 그래프로부터 유도된 안정-상태 비활성화 곡선의 기울기 인수이고, [D] 는 적용된 라놀라진의 농도이고, IC_50R 은 휴지 채널에 대한 IC₅₀ 값이고, K _l 은 라놀라진에 의한 비활성화 채널의 차단에 대한 해리 상수임).

비활성화로부터의 회복은 2 개 펄스 사이의 (유지 전위 = -100 mV; 시험 전위 = -20 mV (hNav1.7 INa) 또는 +20 mV (rNav1.8 INa)) 1 msec 내지 8 sec 의 증분 시간 지연을 둔 지속기간 내 50 msec 의 표준 2 개-펄스 프로토콜로 측정되었다. 제 2 펄스 (I) 에 의해 도출된 피크 전류를 제 1 펄스 (I ₀) 에 의해 도출된 전류에 대해 표준화하였다. 이중 펄스 프로토콜의 매 사이클의 지속기간은 20 sec 였다. I/I ₀ 은 2 개의 펄스 사이의 시간 지연에 대해 그래프로 작성되었고, 이중 또는 삼중 외삽 함수에 대입하였다:

I/I ₀ = [A_F * exp(-t/τ_F)] + [A_s* exp(-t/τ_s)] + A_∞

(식 중 t = 회복 시간 간격, τ_F 및 τ_s = 급속 및 저속 시간 상수, A_F 및 A_s = 급속 및 저속 회복 성분의 상대 진폭, 및 A_∞ 는 안정-상태 성분의 상대 진폭임), 또는

I/I ₀ = [A_F * exp(-t/τ_F)] + [A_I* exp(-t/τ_I)] + [A_s* exp(-t/τ_s)] + A_∞

(식 중 t = 회복 시간 간격, τ_F, τ_I 및 τ_s = 급속, 중속 및 저속 시간 상수, A_F, A_I 및 A_s = 급속 및 저속 회복 성분의 상대 진폭, 및 A_∞ 는 안정-상태 성분의 상대 진폭임).

결과

도 3 은 hNav1.7+β1 서브유닛을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 (도 3A) 및 비트랜스펙션된 ND7-23 세포 (도 3B) 또는 rNav1.8 Na⁺ 채널을 안정적으로 발현하는 ND7-23 세포 (ND7-23/rNav1.8; 도 3C) 에 대한 300 nM TTX 의 효과를 나타낸다. TTX (300 nM) 는 HEK293 에서 hNav1.7 I_Na 및 ND7-23 세포에서 내생 I_Na 를 완전히 차단하였다. 대조적으로, 300 nM TTX 는 rNav1.8 I_Na 의 최소 차단을 야기하였고, 독소에 대한 rNav1.8 의 저항성에 대한 이전의 보고를 확인시켜주었다 (Ogata and Tatebayashi, 1993;Roy and Narahashi, 1992).

라놀라진은 재조합 인간 및 본래 래트 Na1 .7 및 Nav1 .8 전류를 차단한다.

hNav1.7 을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 또는 rNav1.8 Na⁺ 채널을 안정적으로 발현하는 ND7-23 세포에 30 μM 라놀라진을 적용하면 피크 전류의 유의한 감소를 가져왔고 (도 4A) 비활성화 비율의 상당한 가속을 암시하였다 (개방 상태에서 비활성 상태로의 전이). (30 μM 라놀라진의 부재 및 존재하에서) I_Na 감쇠율의 변화를 정량화하기 위해, 전류 추적 (hNav1.7 및 rNav1.8) 을 단일 지수에 대입하였다. -20 mV 에서, 대조군 조건 및 30 μM 라놀라진의 존재하에서의 hNav1.7 전류의 감쇠는 각각 1.51±0.31 및 0.68±0.15 msec (n = 4 세포, p<0.05) 의 시간 상수를 가졌다. 유사하게는, +20 mV 에서, 대조군 조건 및 30 μM 라놀라진의 존재하에서의 rNav1.8 전류의 감쇠는 각각 3.40±0.13 및 1.60±0.04 msec (n = 4 세포, p<0.05) 의 시간 상수를 가졌다.

라놀라진은 각각 -120 또는 -100 mV 의 유지 전위에서 hNav1.7 및 rNav1.8 의 농도-의존적 차단을 일으켰다 (도 4B, 표 4, V₀). 실험 시 유지 전위를 각 채널 (Nav1.7 의 경우 -70 mV 및 Nav1.8 의 경우 -40 mV) 에 대해 전압-의존성 안정-상태 비활성화 관계의 중간점에 가까운 전압으로 설정하였던 경우 (50% 의 채널이 비활성화되는 전압, V_{0 .5}), I_Na 의 라놀라진 차단에 대한 농도-반응 관계를 좌측으로 이동시켰다 (즉, 좀더 낮은 라놀라진 농도로) (도 4B, 표 V_{0 .5}). 라놀라진은 또한 농도-의존적 방식으로 ND7-23 세포에서 내생 TTX-S I_Na 를 차단하였다 (IC₅₀ 값은 표 4 참조).

표 4. 라놀라진에 의한 hNav1 .7, rNav1 .8 및 TTX - S 의 차단.

V₀, -120 mV (Nav1.7) 또는 -100 mV (Nav1.8) 의 유지 전위

V_{0 .5}, -70 mV (Nav1.7) 또는 - 40 mV (Nav1.8) 의 유지 전위

상기 실험을 위해, 300 nM TTX 의 부재하에서 내생 I_Na 를 기록하였다. 피크 I_Na 의 상대 감소 대 약물 (라놀라진) 농도로서 작성된 데이터의 그래프 (도 4) 로부터 유도된 최대-절반 억제 농도 (IC₅₀ 값) 을 표 4 에 요약한다. 라놀라진 농도와 피크 I_Na 의 감소 사이의 관계의 Hill 계수는 1 에 가까웠으며 (도 4B), 약물 및 Na⁺ 채널 상호작용의 1:1 화학량론을 나타낸다.

라놀라진의 존재하에서 활성화의 전압 의존성

hNav1.7 및 rNav1.8 I_Na 에 대한 전류-전압 (I-V) 관계를, 10 sec 의 중간펄스 간격으로 -120 (hNav1.7 의 경우) 또는 -100 (rNav1.8) mV 의 유지 전위로부터 연속 50-msec 탈분극 단계를 사용하여 10 μM 라놀라진의 부재 및 존재하에서 측정하였다. 도 5A 는 hNav1.7 을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 (좌측 패널) 및 ND7-23/rNav1.8 I_Na (우측 패널, 300 nM TTX 의 존재하에서 기록됨) 각각으로부터 기록된 전압 클램프 프로토콜 및 대표적 전류 추적을 보여준다. 측정된 I_Na 의 피크 진폭으로부터, 나트륨 전도도 (G_Na) 를 계산하였고 (상세한 사항에 대해서는 상기 방법 단락 참조), G_Na 의 전압-의존성은 10 μM 라놀라진의 부재 (■, hNav1.7; ●, rNav1.8, 도 5B) 및 존재 (□, hNav1.7; ○, rNav1.8, 도 5B) 하에서 그래프로 나타내었다.

활성화에 대한 평균 최대-절반 전압 (V_½) 의 값 및 라놀라진의 부재 (대조군) 및 존재 하에서의 관계의 기울기 (k) 인수는 표 5 에 제시되어 있다. 라놀라진은 채널 활성화가 발생하는 전압 범위를 유의하게 이동시키지 않았다 (도 5, 표 5, 활성화). 도 5C 는 단일 지수 방정식에 대입한 10 μM 라놀라진의 부재 (●) 및 존재 (○) 하에서의 hNav1.7 (좌측 패널) 및 rNav1.8 (우측 패널) I_Na (도 5C 에 기재된 바와 같은 전류 추적) 의 감쇠를 나타낸다. 라놀라진은 각각 hNav1.7 의 경우 -40 내지 +5 mV 및 rNav1.8 의 경우 -35 내지 +30 mV 사이의 전압에서 전류 감쇠의 시간 상수를 감소시키는 유의한 효과를 야기하였다 (표 5, 비활성화).

표 5. 10 mM 라놀라진의 부재 (대조군) 및 존재하에서의 hNav1 .7 및 rNav1 . 8 의 비교 활성화 및 비활성화 파라미터.

라놀라진의 존재하에서의 안정-상태 급속, 중속 및 저속 비활성화의 전압 의존성

hNav1.7 (좌측 패널) 및 rNav1.8 (우측 패널) I_Na 의 안정-상태 급속, 중속 및 저속 비활성화의 전압 의존성을 측정하기 위한 실험 결과를 도 6 에 제시하였다. 도 6A 는 10 μM 라놀라진의 존재 (□, hNav1.7; ○, rNav1.8) 및 부재 (■, hNav1.7; ●, rNav1.8) 하에서의 hNav1.7 및 rNav1.8 (100 msec 의 비활성화 예비펄스) 의 안정-상태 급속 비활성화에 대한 실험의 전압-클램프 프로토콜 및 요약 결과를 나타낸다. 라놀라진은 hNav1.7 의 기울기 (k) 인수에 영향을 주지 않고 급속-비활성화의 V_½ 에서의 유의한 (p<0.05) 좌측방향 이동, 및 rNav1.8 I_Na 의 기울기 (k) 인수에 영향을 주지 않고 급속-비활성화의 V_½ 에서의 최소 (p=0.15) 좌측방향 이동을 야기하였다 (값은 도면의 설명을 참조함). 도 6B 는 10 μM 라놀라진의 부재 (■,●) 및 존재 (□,○) 하에서의 hNav1.7 및 rNav1.8 (1 sec 의 비활성화 예비펄스) 의 안정-상태 중속 비활성화에 대한 실험의 전압-클램프 프로토콜 및 요약 결과를 나타낸다.

라놀라진은 hNav1.7 (각 농도에서 n=4 세포) 및 rNav1.8 (각 농도에서 n=4-5 세포) I_Na (표 5, 비활성화) 에 대한 기울기 (k) 인수에 영향을 주지 않고 중속 비활성화의 V_½ 에서의 농도-의존적 (1-30 μM) 좌측방향 이동을 야기하였다. 본 연구에서 대조군 조건 (hNav1.7 및 rNav1.8) 에 대한 활성화 및 안정-상태 비활성화의 중간점에 대한 데이터는 ND7-23/rNav1.8 및 DRG 뉴런 내 본래 TTX-S 및 TTX-R 전류에 대해 이전에 밝혀진 값에 필적하다 [Cummins et al. (1997) J Neurosci, 17:3503-14 and John et al. (2004) Neuropharmacology 46:425-38].

안정-상태 저속 비활성화 과정의 전압 의존성을 시험하기 위해, 도 6C 에 제시된 펄스 프로토콜을 hNav1.7 및 rNav1.8 모두에 대해 사용하였다. 상기 프로토콜을 사용하여, 저속 비활성화 (생리학적) 는 각각 hNav1.7 및 rNav1.8 에 대해 -80 mV 및 -75 mV 의 전위에서 명백하게 되었다. 그러나, 저속-비활성화는 -10 mV 의 최대 조건화 시험 펄스에서 오직 50 및 70% 만 완전하였다. 도 6C 는 10 μM 라놀라진의 부재 (■,●) 및 존재 (□,○) 하에서의 hNav1.7 및 rNav1.8 (10 sec 의 비활성화 예비펄스) 의 안정-상태 저속 비활성화에 대한 실험의 전압-클램프 프로토콜 및 요약 결과를 나타낸다. 라놀라진은 hNav1.7 및 rNav1.8 I_Na 의 기울기 (k) 인수에 영향을 주지 않고 저속 비활성화의 V_½ 에서의 유의한 (p<0.05) 좌측방향 이동을 야기하였다 (값은 도면의 설명을 참조함).

비활성화의 중간점 (V_½) 에서의 라놀라진-유도 이동 (도 6) 및 hNav1.7 및 rNav1.8 의 전압-의존적 차단 (도 4, 표 4, V_½ 유지 전위 IC₅₀ 값에서) 은 라놀라진이 이들 채널의 비활성화 상태와 상호작용할 것이라는 것을 암시한다. 라놀라진에 의한 비활성화 채널의 차단 범위를 추정하기 위해, 안정-상태 비활성화 곡선 ²⁸ 의 이동의 농도-의존성에 근거한 간접 접근법을 사용하였다 (K _dr 및 K _di 값, 상기 방법 단락에 기재된 바와 같이 계산됨). hNav1.7 및 rNav1.8 채널의 휴지 (K _dr) 및 비활성화 (K _di) 상태에 결합하는 라놀라진에 대한 해리 상수의 추정값은 각각 12.12 및 22.84 μM, 및 0.47 및 0.64 μM 인 것으로 밝혀졌다.

라놀라진의 존재하에서의 비활성화의 전개

라놀라진은 Nav1.7 및 1.8 I_Na 유효성의 전압 의존성에서의 과분극 이동을 야기하였고 (도 6, 표 5 및 Bean 방정식을 사용하여 추정된 K _di 값), 상기 약물이 이러한 Na⁺ 채널의 비활성화 상태와 상호작용한다는 것을 암시한다. 라놀라진과 Nav1.7 및 Nav1.8 채널과의 상호작용을 더욱 잘 이해하기 위해, 차단 전개를 가능하게 하는 가변 간격 (0.1 내지 10 sec) 에 대해 -40 및 -20 (hNav1.7) 또는 -20 및 +20 mV 까지 세포를 탈분극시켜 저속 비활성화의 전개 속도를 측정하였다. 20-msec 과분극 단계는 채널 유효성을 평가하기 위해 표준 시험 펄스 전 급속 비활성화로부터 미결합 채널의 회복을 가능하게 하도록 삽입되었다.

30 μM 라놀라진의 부재 (■) 및 존재 (□) 하에서의 hNav1.7 (-20 mV, 도 7 A, n = 4-5 세포) 및 rNav1.8 (+20 mV, 도 7B, n = 4-5 세포) I_Na 의 비활성화 전개의 시간 의존성을 도 7 에 제시된다. 대조군 조건의 경우, 증가하는 조건화 펄스 지속기간을 갖는 전류의 진행형 감쇠는 채널의 비활성화 상태로의 도입을 반영한다. hNav1.7+β1 및 rNav1.8 채널의 저속 비활성화의 전개는 각각 2 중 및 3 중 지수 함수에 대입될 것이다 (표 6 참조, 대조군, 저속 비활성화의 전개).

이전에 제시된 바와 같이, (Vijayaragavan et al (2001) J. Neurosci 21:7909-18) Nav1.8 채널의 저속 비활성화 발생은 Nav1.7 채널과 비교하여 빠르다 (약 4 배, 표 6 참조, 대조군, 각각 Nav1.8 및 Nav1.7 채널에 대해 τ_F = 10.78 및 43.97 msec 임). 저속 비활성화의 전개 속도는 라놀라진 (30 μM) 의 존재하에서 2-5 배 빨랐다 (표 6 참고, 라놀라진, 비활성화의 전개). 30 μM 라놀라진의 부재 및 존재하에서 -40 mV (hNav1.7) 또는 -20 mV (rNav1.8) 까지 탈분극 예비펄스로의 hNav1.7 (n = 4 세포) 및 rNav1.8 (n = 5 세포) I_Na 의 비활성화 전개에 대한 시간 상수를 표 6 에 제시한다. 저속 비활성화의 전개 속도는 라놀라진 (30 μM) 의 존재하에서 4-10 배 빨랐다 (표 6 참조, 라놀라진, 각각 -40 (hNav1.7) 및 -20 mV (rNav1.8) 에서의 비활성화의 전개).

라놀라진 차단으로부터의 회복

hNav1.7 및 rNav1.8 의 비활성화로부터의 회복에 대한 라놀라진의 효과를 상기 방법 단락에 기재된 바와 같은 표준 2 개-펄스 프로토콜로 평가하였다. 30 μM 라놀라진의 부재 (□) 및 존재 (■) 하에서의 hNav1.7 (n = 5 세포) 및 rNav1.8 (n = 5 세포) I_Na 의 비활성화로부터의 회복의 시간 의존성을 도 7 에 제시한다. 대조군 조건의 경우, hNav1.7 I_Na 의 비활성화로부터의 회복 (도 7C, 재분극 전위 = -100 mV) 은 2 중 지수 방정식 (각각 급속 (τ_F) 및 저속 시간 상수 (τ_s)) 에 대입될 것이다. 대조적으로, rNav1.8 I_Na 의 비활성화로부터의 회복은 느렸고 (도 7D), 3 개 지수에 더욱 잘 대입될 것이다. rNav1.8 I_Na 의 비활성화로부터의 회복의 시간 과정은 (도 7D, 재분극 전위 = -100 mV) 급속 (τ_F), 중속 (τ_I) 및 저속 (τ_s) 시간 상수를 가졌다.

표 6 에 요약된 바와 같이 (-100 mV 에서 비활성화로부터의 회복), 비활성화로부터의 hNav1.7 I_Na 회복의 급속 성분 (τ_F) 은 30 μM 라놀라진의 부재 및 존재시 상이하지 않았던 반면, 저속 성분 (τ_s) 은 30 μM 라놀라진의 존재하에서 유의하게 (p<0.05) 느렸다 (표 6 참조, hNav1.7, 비활성화로부터의 회복). 비활성화로부터의 rNav1.8 I_Na 회복의 급속 (τ_F), 중속 (τ_I) 및 저속 (τ_s) 성분은 30 μM 라놀라진의 존재하에서 유의하게 (p<0.05) 느렸다 (표 6 참조, rNav1.8, 비활성화로부터의 회복).

30 μM 라놀라진의 부재 및 존재하에서의 -40 mV (hNav1.7) 또는 -20 mV (rNav1.8) 까지 탈분극 예비펄스로 hNav1.7 (n = 5 세포) 및 rNav1.8 (n = 4 세포) I_Na 의 비활성화로부터의 회복의 시간 의존성을 표 6 에 작성하였다. 표 6 에 요약된 바와 같이 (-80 mV 에서 비활성화로부터의 회복), 비활성화로부터의 hNav1.7 I_Na 회복의 급속 (τ_F) 및 저속 (τ_s) 성분은 30 μM 라놀라진의 존재하에서 유의하게 (p<0.05) 느렸다. 유사하게, 라놀라진 (30 μM) 은 비활성화로부터의 rNav1.8 I_Na 회복의 급속 (τ_F), 중속 (τ_I) 및 저속 (τ_s) 성분의 유의하게 (p<0.05) 느려지게 하였다 (표 6 참조, rNav1.8, -80 mV 에서 비활성화로부터의 회복).

표 6. 30 μM 라놀라진의 부재 (대조군) 및 존재하에서의 hNav1 .7 및 rNav1.8 의 저속 비활성화의 전개 및 비활성화 파라미터로부터의 회복.

라놀라진에 의한 사용-의존적 차단

라놀라진에 의한 hNav1.7, rNav1.8 및 TTX-S I_Na 의 사용-의존적 차단을 연구하기 위해, -100 mV 의 유지 전위로부터 -20 mV (hNav1.7 및 TTX-S I_Na 의 경우) 또는 +50 mV (rNav1.8 I_Na 의 경우) 까지의 연속 40 회 짧은 반복 임펄스 (지속기간 10 msec) 를 1, 5 및 10 Hz 의 속도로 적용하였다. 40 번째 임펄스에 의해 유발되는 전류의 진폭을, 첫번째 임펄스에 의해 유발되는 전류의 진폭에 대해 표준화하였다. 10 msec 의 짧은 탈분극 펄스 지속기간은 C 섬유의 체성 활동 전위 지속기간에 대략 가까웠다 (0.6 - 7.4 msec; (Harper and Lawson, 1985). hNav1.7 및 TTX-S I_Na 의 경우 10 Hz 까지의 펄스 주파수는 전류의 진폭에 적은 영향을 주었고 (도 8A 및 8C, 채워진 기호), 이것은 채널이 비활성화로부터 빠르게 회복되며 (τ_s = ~50 msec, 표 6), 이러한 시험된 주파수에서의 개방, 폐쇄 및 비활성화 확인을 통해 빠르게 순환할 것이라는 것을 암시한다 (Hille, 1977;Ragsdale et al, 1994;Roy and Narahashi, 1992;Vijayaragavan et al, 2001).

대조적으로, 대조군 조건하에서의 rNav1.8 은 자극 주파수에 의존적인 진폭의 감소를 보였다 (도 8B, 채워진 기호). I_Na 진폭의 이러한 주파수-의존적 감소는 ND7-23 세포에서의 rNav1.8 Na⁺ 채널이 비활성화로부터 빠르게 회복된다는 것을 암시한다 (τ_s = ~847 msec, 표 6). 라놀라진 (30 μM) 은 hNav1.7, rNav1.8 및 TTX-S I_Na 의 진폭에서의 주파수-의존적 감소 (p<0.05, n=4-5 세포, 각각) 를 일으켰으며, 현저한 사용-의존적 차단을 나타낸다. 최저 자극 주파수 (1 Hz, □) 에서, 약물에 의해 이용가능한 채널의 ~20-40% (채널 이소형에 따라 다름) 가 빠르게 차단되었다. 1 에서 5 (○) 또는 10 Hz (Δ) 까지의 자극 주파수 증가는 채널 차단을 부가적으로 빠르게 평형화시키는 것으로 밝혀졌으나, 차단은 5 및 10 Hz 에서 포화되는 것처럼 보였다 (도 8). 놀랍게도, 라놀라진은 rNav1.8 채널의 사용-의존적 차단을 거의 일으키지 않았다 (1, 5 및 10 Hz 에서의 I_Na 의 차단은 각각 60.20±2.04%, 67.96±4.68% 및 70.16±2.09% 였다 (1 Hz 와 비교시 p<0.05)). 하나의 가능한 설명은 비활성화 rNav1.8 채널로부터의 라놀라진의 해리가, 비활성화 hNav1.7 채널로부터의 라놀라진의 해리보다 훨씬 더 빠르다는 것일 것이다.

라놀라진에 의한 개방 채널 차단

라놀라진에 의해 야기된 hNav1.7 및 rNav1.8 (도 5C, 표 7) 의 비활성화의 중간점 (V_½) 에서의 전압-의존적 차단 (도 3, 표 4, V_{0 .5} 유지 전위 실험) 및 농도-의존적 이동, 및 hNav1.7 및 rNav1.8 의 추정된 (Bean 방정식 사용) K _I 값은, 라놀라진이 이러한 Na⁺ 채널의 비활성화 상태와 상호작용한다는 것을 암시한다. 그러나, 1, 5 및 10 Hz 에서 10 msec 탈분극 펄스로 라놀라진에 의한 hNav1.7 또는 rNav1.8 Na⁺ 채널의 차단이 또한 채널의 비활성화 상태 외에 일시적 개방 상태에도 관련되어 있는지의 여부는 불투명하다. [Wang and colleagues (Wang et al, 2008)] 은 근육 Nav1.4 및 뉴런 Nav1.7 모두가 라놀라진 차단에 동등하게 감수성이 있다는 것을 입증하였고, 이들이 또한 상기 약물이 이러한 Na⁺ 채널의 개방 상태를 우선적으로 차단한다는 것을 입증하였다.

Nav1.7 및 Nav1.8 채널의 개방 상태의 차단을 연구하기 위해, 라놀라진에 의한 사용-의존적 차단의 크기에 대한 펄스 지속기간의 효과를 조사하였다. 도 9 는 100 μM 라놀라진의 존재하에서 5 Hz 의 주파수에서 +50 mV 까지 5 (도 9A) 또는 200 msec (도 9B) 길이의 시험 펄스에 의해 도출된 rNav1.8 전류의 대표적 기록값을 보여준다. 각 펄스에 의해 도출된 피크 전류를 측정하였고, 제 1 펄스의 전류에 대해 표준화하고, 도 9C 에서 펄스 횟수에 대해 그래프를 작성하였다. 그래프는 100 μM 라놀라진의 존재하에서 +50 mV 까지 3 (▽), 5 (△), 20 (○) 또는 200 (□) msec-길이의 시험 펄스에 의해 도출된 rNav1.8 I_Na 의 사용-의존적 차단의 전개는 2.34±0.22 펄스의 시간 상수를 가진 71.69±0.85% (n=4-5 세포, 각각) 의 안정-상태에 도달하였다.

약물의 부재하에서, 반복적인 펄스는 16.89±4.59% (3 msec, n=5 세포) 내지 24.61±3.34% (5 msec, n=4 세포), 27.15±3.18% (20 msec, n=4 세포) 및 30.43±2.55% (200 msec, n=4 세포) 에 의한 3 내지 5 내지 20 내지 200 msec 로부터의 펄스 지속기간의 증가와 함께 증가되는 Nav1.8 I_Na 진폭에서의 적은 감소를 야기하였다.

-20 mV 까지 2 (▽), 5 (△), 20 (○) 또는 200 (□) msec-길이의 시험 펄스에 의해 도출된 hNav1.7 I_Na 의 사용-의존적 차단의 전개를 수행하였다. 100 μM 라놀라진의 존재하에서, hNav1.7 의 사용-의존적 차단은 5.83±0.19 펄스의 시간 상수 (데이터는 제시되지 않음) 로 80.92±1.53% (n=5-6 세포) 의 안정-상태에 도달하였다. 약물의 부재하에서, 반복되는 자극은 I_Na 의 진폭의 약간의 감소를 야기하거나 감소를 야기하지 않았다. 그러므로, 상기 데이터는 라놀라진이 hNav1.7 및 rNav1.8 I_Na 의 개방 상태를 차단하였다는 것을 보여준다.

실시예 3

CFA -유도 통각과민의 라놀라진 -처리

하기 실시예는 라놀라진이 기계적 무해자극통증에 대해 선택적 진통제 효과를 나타내고, 열적 통각과민에는 거의 효과를 나타내지 않는다는 것을 입증한다.

재료 및 방법

모든 실험은 [LSU Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee] 에서 승인되고 모니터링된 프로토콜에 따라 수행하였다. 300-35O g 의 체중을 가진 수컷 Sprague Dawley 래트 (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN) 를 우리에 1 마리 넣고, 12 시간 광/암 주기로, 25℃ 및 60% 습도에서 유지하고, 식음료에 자유롭게 접근하도록 두었다. 래트가 주변환경에 순응하도록 1 시간/일 동안, 시험 장치에 순응하도록 1 주 동안 두었다.

열적 자극에 대한 기준선 역치값을 측정하기 위해, 9 마리 래트 그룹을 유리 플레이트 상의 Plexiglas 챔버에 넣고, 챔버 내에서 자유로운 범위로 활동하게 두었다. 각 뒷발의 털이 없는 표면을 할로겐 광원을 사용하여 유리 플레이트를 통해 연속적으로 자극하였다 (Gould et al., 1997, 1998; Hargreaves et al., 1988). 자극 발생시 발 철회 잠복기를 IITC 통증측정기 (analgesiometer) (IITC Life Science, Inc., Woodland Hills, CA) 를 사용하여 측정하였다. 조직 손상을 피하기 위해 10.7 초 후에 자극을 자동으로 중단하였다. 각 시험 과정 동안 각 뒷발을 4 회 자극하였다.

열적 시험 후, 기계적 자극으로부터의 철회에 대한 역치값을 IITC Model 2290 electro-von Frey 통증측정기 (EVF; HTC Life Sciences, Inc., USA; Lewin et al., 1993, 1994; Gould et al., 2000b) 를 사용하여 기록하였다. 이를 위해, 래트를 느슨하게 제지하고 제약을 두어 수용시키도록 하였다.

그 다음 각 뒷발의 등쪽 표면 상 4 개의 부위에 피부에 수직이 되도록 자극 막대의 팁을 적용하였다. 발 철회 시 발에 적용된 힘을 기록하였다. 4 개의 부위 각각에 적용된 평균 힘을 간격에 대한 대상의 반응 역치값으로 입력하였고, 모든 추가의 계산에 사용하였다. EVF 시험으로부터 조직 손상을 예방하기 위해 힘의 25O g 상한을 도입하였다.

미리 2 개 시점에 열적 및 기계적 자극에 대한 기준선 통증 역치값을 측정하고, 오일:식염수 (1 :1) 에멀젼 (0.5 mg 마이코박테리움/ml 에멀젼) 에 현탁된 0.1 ml 의 CFA (마이코박테리움 투베르큘로시스, Sigma) 의 피하 주사를 하나의 뒷발에, 동량 부피의 멸균 식염수를 맞은편 발에 주사하였다. 이후 2 일 매일 후-CFA 철회 역치값을 기록하였다. CFA 주사 3 일 후에 9 마리의 래트 군에서 철회 역치값을 기록하였고, 이후 복강내 (i.p.) 주사 (0, 10, 20, 및 50 mg/kg) 또는 경구 섭식 (p.o.; 0, 20, 50, 100, 및 200 mg/kg) 에 의해 라놀라진 (등장성 식염수 (0.9%), pH 3.0 에서 재구성됨) 의 랜덤화 및 맹검화 투여량을 수여하였다. 무통증 발생의 최적 투여량 범위를 결정하기 위해, 10 내지 1000 mg/kg 사이의 초기 참조 투여량을 i.p. 주사에 의해 투여하였다.

라놀라진의 i.p. 투여 30 분 후 및 경구 섭식 1 시간 후에 열적 및 기계적 자극에 대한 철회 역치값을 재평가하였다. 행동적 데이터를 철회 잠복기 변화에 대한 통계적 유의성을 결정하기 위해, 실험적으로 조작된 것과 맞은편 발 사이의 차이의 내부 비교를 위해 분산의 반복 측정, 혼합 설계 분석 (ANOVA) 에 적용하였다.

결과

래트 뒷발의 발바닥 표면 내 CFA 의 단일 주사는 열적 및 기계적 자극 모두에 대한 감수성을 크게 그리고 지속적으로 증가시킨다 (Gould et al., 1997, 1998, 2004). 도 10 및 11 에서의 그래프 좌측의 막대는, 동일한 부피의 보통 식염수 주사를 맞은 맞은편 뒷발과 비교하여 하나의 뒷발 내 CFA 의 피하 주사 72 시간 후 래트의 2 개 그룹에서 발 철회를 일으키는데 필요한 열적 및 기계적 자극의 상대 수준을 나타낸다. 비히클-처리된 (0.9% 등장성 식염수; pH 3.0) 래트에서 CFA-주사를 맞은 뒷발의 자극은, 자극의 형태에 대한 반응에서 유의한 차이를 나타내지 않았다.

라놀라진의 첨가는 투여량-의존적 방식으로 기계적 자극에 대한 발 감수성을 명백하게 감소시키나, 발 감수성에 대한 유의한 효과가 열적 자극으로는 관찰되지 않았다. 100 mg/kg 초과의 투여량을 제공한 경우에만 i.p. 투여 후 부작용이 주시되었다. 효과는 투여량이 많아질수록 계속해서 커지는 경향을 보인다. 행동적 부작용에는 운동완만, 자극에 대한 느린 반응 및 로타로드 시험 (Taylor et al., personal communication) 시 수행력 손상에 의해 확연시되는 모터 부진, 근섬유다발수축 및 단일수축, 및 경련이 포함되었다. 100 mg/kg 의 투여량으로 처리한 래트의 50% 가 사망하였다.

기계적 무해자극통증에 특이적인 유사한 진통제 효과는, 라놀라진이 경구 섭식에 의해 투여되는 경우 관찰되었다 (도 11). 그러나, 약물을 i.p. 주사에 의해 투여하는 경우보다 무통증을 야기하기 위해 더 많은 투여량이 필요하였다. i.p. 투여 경로와 달리, 진통제 반응에 대한 정체기는 경구 섭식 후에 주시되었다. 최대 반응은 100 mg/kg 의 투여량에서 달성되었다. 진통제 효과 감소에 대한 비-유의한 경향이 200 mg/kg 투여량에서 관찰되었다.

오직 최고의 p.o. 투여량에서만 라놀라진-처리된 래트에서 약물 투여 대략 1 시간 후 호흡 협착음 (strider) 이라는 부작용이 발생하였다. 폐 부작용은 위관 영양 24 시간 내에 해소되었고, 비히클-처리된 대조군에서는 관찰되지 않았다.

Claims (14)

1. 라놀라진, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적 유효량, 또는 예방학적 유효량을 통증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 통증의 치료 또는 예방 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 라놀라진이 신경병증 또는 통각수용성 통증의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 라놀라진이 통각수용성 통증의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 통각수용성 통증이 기계적, 화학적 및/또는 염증성인 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 통각수용성 통증이 염증성인 방법.
6. 제 2 항에 있어서, 라놀라진이 신경병증 통증의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 신경병증 통증이 나트륨 채널병증, 다발신경병증, 자율 신경병증, 단발신경병증, 또는 다발성 홑신경염의 결과인 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 신경병증 통증이 채널병증의 결과인 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 통증이 홍색사지통증 또는 발작성 극심 통증 장애의 결과인 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 라놀라진이 외상 신경 손상, 신경 압박 또는 포착, 대상포진후 신경통, 삼차 신경통, 당뇨병성 신경병증, 암 및/또는 화학요법으로부터 기인하는, 또는 이와 관련된 통증의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 라놀라진이 만성 요통의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 라놀라진이 HIV- 및 HIV 치료-유도 신경병증, 만성 골반 통증, 신경종 통증, 복합 부위 통증 증후군, 만성 관절염 통증 및 관련 신경통의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 라놀라진이 국소 마취제로서 투여되는 방법.
14. 라놀라진, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 치료학적 유효량, 또는 예방학적 유효량을 뇌졸중 또는 신경 외상에 의해 야기되는 허혈성 상태 하의 신경보호를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중 또는 신경 외상에 의해 야기되는 허혈성 상태 하의 신경보호 방법.

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