KR20100102135A - 재조합적으로 변형된 플라스민 - Google Patents

Abstract

재조합적으로 변형된 플라스민(플라스미노겐) 분자에 관한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 제공된다. 이러한 플라스민(플라스미노겐) 분자는 외래 서열이 존재하지 않도록 조합된, 천연 인간 플라스미노겐 분자 내에 존재하는 활성화 부위에 대해 N-말단인 단일 크링글(kringle) 도메인을 갖고, 천연 효소와 관련된 라이신-결합 및 현저한 효소 특성을 나타낸다.

Description

재조합적으로 변형된 플라스민{RECOMBINANTLY MODIFIED PLASMIN}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 거명에 의해 본원에 포함된 미국 가출원 번호 60/991,148 (2007년 11월 29일 출원)을 35 USC § 119 하에 우선권으로 청구한다.

배경 기술

인간 플라스미노겐은 791개의 아미노산 잔기를 함유하는 단일쇄 단백질이다. 플라스미노겐에서 플라스민으로의 활성화는 효소원(zymogen) 내의 Arg561-Val562 펩티드 결합의 단일 절단으로부터 초래된다. 생성된 플라스민 분자는 트립신-유사 특이성 (Lys 및 Arg 뒤를 절단함)이 있는, 디술피드-연결 2-사슬 프로테아제(protease)이다.

플라스민의 아미노-말단 중쇄 (잔기 1-561, 약 60 kDa)는 5개의 크링글(kringle) 도메인으로 구성되고, 각각의 도메인은 약 80개의 아미노산 잔기를 포함한다. 크링글 도메인은 플라스미노겐의 조절 성질, 예컨대 활성화 억제제, 예를 들어, Cl^-1 이온과의 상호작용; 활성화 자극제, 예를 들어, ε-아미노카프로산과의 상호작용; 포유류 및 박테리아 세포와의 상호작용; 및 기타 단백질, 예컨대 플라스민의 생리학적 기질인 피브린 및 플라스민 억제제인 α2-항플라스민과의 상호작용을 담당한다. 모두 5개의 크링글 중에서, 크링글 1이 가장 다기능성인 것들 중 하나이다; 이의 라이신-결합 활성이 α2-항플라스민 및 피브린과의 플라스민 상호작용을 담당하는 것으로 나타났다. [Wiman, B., et al., Biochim. Biophys. Acta 579:142-154 (1979)]; 및 [Lucas, M.A., et al., J. Biol. Chem. 258:4249-4256 (1983)] 참조.

플라스민의 C-말단 경쇄 (잔기 562-791, 약 25 kDa)는 트립신과 상동성이고 고전적인 세린 프로테아제 촉매 삼합체(triad)인 His603, Asp646 및 Ser741을 함유하는 전형적인 세린 프로테아제이다. 플라스미노겐은 24개의 디술피드 브릿지 및 Asn289 및 Thr346 상의 2개의 글리코실화 부위를 함유한다.

엘라스타제(elastase)에 의한 플라스미노겐의 제한된 단백질분해는 3개의 주요 단편을 초래하는 것으로 나타났다 ([Sottrup-Jensen, L., et al., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3:191-209 (1978)]). 첫번째 단편인 K1-3은 처음 3개의 크링글을 포함하고, Tyr80-Val338 및 Tyr80-Val354의 2가지 버젼으로 단리될 수 있다. 두번째 단편인 K4는 4번째 크링글에 상응하고, 잔기 Val355-Ala440을 포함한다. 마지막의 C-말단 단편 (소위 미니-플라스미노겐)은 잔기 Val443-Asn791을 포함하고, 5번째 크링글 및 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다. 미니-플라스미노겐은 플라스미노겐과 동일한 방식으로 활성화되어, 미니-플라스민을 형성할 수 있다.

전장 플라스미노겐 분자의 복합적인 구조로 인해, 박테리아 발현 시스템이 재조합 플라스미노겐 생산에 유용한 것으로 입증되지 않았다. 플라스미노겐은 불용성 봉입체의 형태로 생산되고, 이러한 상태로부터 리폴딩(refolding)이 가능하지 않다. 또한, 포유류 세포에서의 플라스미노겐의 발현은 플라스미노겐의 플라스민으로의 세포내 활성화 및 결과적인 세포독성에 의해 복잡해진다. 충분히 활성인 플라스미노겐을 곤충 세포를 이용하여 생산하는 것이 가능하지만, 이러한 시스템은 낮은 수율로 인해 대규모 생산에 적절하지 않다. 또한, 임의의 재조합 단백질 계획과 같이, 치료용 재조합 단백질이 제공되는 대상에서 면역원성 문제에 부딪힐 가능성이 존재한다.

면역원성이 특정 재조합 단백질 치료 계획의 효과적이고/이거나 효율적인 활용에 대한 장벽일 수 있다. 면역원성은 외래 물질인 것으로 인식되는 물질 (예를 들어, 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 화학 구조물)에 대한 일련의 복합적인 응답이고, 중화 및 비-중화 항체의 생산, 면역 복합체의 형성, 보체 활성화, 비만 세포 활성화, 염증, 및 아나필락시스를 포함할 수 있다. 면역원성은 여러 방식으로 단백질 치료제의 효능 및 안정성을 제한할 수 있다. 중화 항체의 형성에 의해 효능이 직접적으로 감소될 수 있다. 중화 또는 비-중화 항체에의 결합은 전형적으로 혈청으로부터의 급속한 소거에 이르기 때문에, 효능이 또한 간접적으로 감소될 수 있다. 면역 반응이 생기는 경우 심각한 부작용, 심지어는 사망이 일어날 수 있다. 중화 항체가 내인성 단백질과 교차-반응하고 이의 기능을 차단하는 경우, 한 특수한 클래스의 부작용이 초래된다.

따라서, 플라스민/플라스미노겐의 바람직한 특성 (예를 들어, 천연-유사 화학 구조가 있는 영역)을 지니면서, 특정한 부정적인 특성이 없고, 박테리아 세포가 포함되는 재조합 단백질 발현 시스템에서 상당한 양으로 생산될 수 있는 변형된 재조합 단백질이 바람직하다.

발명의 개요

한 양상에서, 본 발명은

a) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성이고, 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인 단일 N-말단 크링글 도메인; 및

b) 인간 플라스미노겐 내의 상응하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인

을 가지며 고정된 라이신에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또다른 양상에서, 본 발명은

a) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성이고, 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인 단일 N-말단 크링글 도메인; 및

b) 인간 플라스미노겐 내의 상응하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인

을 가지며, 고정된 라이신에 결합하는 폴리펩티드를 제공한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 양상에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 배양된 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 배양된 세포는 원핵생물이다. 한 실시양태에서, 이러한 원핵생물은 대장균이다.

한 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 재조합 플라스민 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법은

a) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성이고, 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인 단일 N-말단 크링글 도메인, 및 인간 플라스미노겐 내의 상응하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인을 가지며, 고정된 라이신에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및

b) 단계 a)에서 제공된 폴리펩티드를 하나 이상의 펩티드 결합이 절단되어 하나 이상의 재조합 플라스민 폴리펩티드를 형성하기에 충분한 조건 하에 프로테아제와 접촉시키는 단계

를 포함한다. 한 실시양태에서, 제공 단계는 서열 1에 제시된 서열 또는 이의 동의성(degenerate) 변이체에 상응하는 서열을 갖는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 적절한 숙주에서 발현시키는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

도면의 간단한 설명
도 1은 단백질분해성 절단에 의한 활성화 후의 천연 플라스민의 개략도이다. K1-K5은 크링글 영역 1-5이고, SP는 세린 프로테아제 도메인이다. "α2-AP"는 크링글 1 상의 α₂-항플라스민 결합 부위이다.
도 2는 도 1에서와 동일한 명명법을 사용한, 본 발명의 플라스미노겐 결실 돌연변이체의 개략도이고, K2-5의 결실을 나타낸다.
도 3은 -19 내지 -1로 번호가 매겨진 19-잔기 리더(leader) 서열, 및 잔기 1-791로 제시된 플라스미노겐 서열 (인간 플라스미노겐에 대한 cDNA 서열인 서열 3, 및 도 3에 제시된 바와 같은 코딩된 아미노산 서열인 서열 4 참조)을 나타내는 인간 플라스미노겐의 아미노산 서열을 나타낸다. 하기의 것들을 포함하여 다수의 특색들이 제시된다: (TAL6003)-플라스미노겐 서열의 한 실시양태 (음영); 크링글 도메인 1-5 (이중 밑줄); 글리코실화 부위 Asn289 및 Thr346 (볼드체); Arg-Val 활성화 부위 (볼드체의 R⁵⁶¹V⁵⁶²); 및 크링글 1 내의 라이신-결합 부위 (밑줄 및 특정 위치 번호매김).
도 4는 천연 인간 플라스민(플라스미노겐)의 5개의 크링글 도메인들 (1-5) 간의 폴리펩티드 서열 비교 (즉, 갭(gap) 정렬)를 나타낸다. 크링글 1 내의 동일한 상대적인 위치의 것과 동일한 아미노산 잔기가 밑줄로 표시된다.
도 5는 혈장-유래 플라스민 (레인 1= 비-환원(NR); 레인 2 = 환원 (R)) 및 (TAL6003)-플라스민 (레인 3 = 비-환원 (NR); 레인 4 = 환원 (R)) 제제의 8-25％ 구배 SDS-PAGE를 나타낸다. 혈장-유래 플라스미노겐 및 (TAL6003)-플라스미노겐의 각각 천연 플라스민 및 재조합 (TAL6003)-플라스민으로의 스트렙토키나제(streptokinase) 활성화는 크링글 및 세린 프로테아제 도메인에 상응하는 2개의 밴드의 형성을 초래한다. 따라서, 전기영동 전에 환원제 디티오트레이톨 (DTT)과 함께 인큐베이션된 후, 비-환원 젤 상에서 단일 밴드인 혈장-유래 플라스민 및 (TAL6003)-플라스민이 동일한 비-환원 젤 내에서 크링글 1 (아래쪽 밴드) 및 세린 프로테아제 도메인 (위쪽 밴드)에 상응하는 2개의 밴드로 환원된다.
도 6은 스트렙토키나제에 의한 (TAL6003)-플라스미노겐의 활성화의 그래프식 표현이다.
도 7은 라이신-세파로스(SEPHAROSE) 4B에 대한 (TAL6003)-플라스미노겐의 결합을 나타내는 크로마토그램이다: 0.5 ㎎의 정제된 (TAL6003)-플라스미노겐을 트리스(Tris)-완충 염수, pH 7.4로 평형화된 라이신-세파로스 4B 칼럼 (1×3 ㎝) 상에 적용하였다. 결합된 단백질이 단일 피크로서 ε-아미노카프로산 (ε-ACA)의 0-20 mM 구배에 의해 칼럼으로부터 용출되었다. 용출 부피의 함수로서의, 280 nm에서의 흡광도 및 ε-ACA의 농도가 그래프 상에서 제시된다.
도 8은 피브린에 대한 (TAL6003)-플라스미노겐의 결합을 나타내고, 이는 이어지는 tPA에 의한 플라스미노겐의 활성화 및 결과적인 혈병 용해로 평가된 것이다,
도 9는 (TAL6003)-플라스민과 혈장-유래 플라스민의 혈전용해 효능의 시험관내 비교를 나타낸다.
도 10은 (TAL6003)-플라스민 (서열 2)의 디술피드 결합 패턴을 도해한다. 도면에서, (X)는 아미노산 서열 RDVVLFEK를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명가들은 천연 플라스미노겐 구조로부터 4개의 크링글이 결실되었음에도 불구하고 천연 플라스미노겐-유사 특색들을 지니는, (TAL6003)-플라스미노겐으로 본원에서 지칭되는 신규 재조합 플라스미노겐 폴리펩티드, 또는 이의 변이체를 발견하였다. 이러한 (TAL6003)-플라스미노겐, 또는 이의 변이체는 효소원의 크링글 도메인과 세린 프로테아제 도메인 사이에 위치한 Arg-Val 펩티드 결합의 단백질분해성 절단을 적어도 수반하는 활성화 이벤트 후 기능성 플라스민 효소 (본원에서 (TAL6003)-플라스민으로 지칭됨)로 활성화될 수 있는 효소원이다.

본 발명의 (TAL6003)-플라스미노겐, 또는 이의 변이체는 천연 인간 플라스미노겐의 피브린- 및 항플라스민-결합 성질, 뿐만 아니라 활성화 성질을 지닌다. 또한, (TAL6003)-플라스미노겐에는 재조합 생산에서의 높은 수준의 발현 및 천연 발생 형태의 인간 혈장-유래 플라스미노겐과 동일하거나 매우 유사한 특정 단백질 화학 구조가 포함되는 다수의 신규하고 바람직한 특색들이 있다.

본 발명에 따른 (TAL6003)-플라스민(플라스미노겐)은 적어도 하기에 의해 특성화될 수 있다:

i) (TAL6003)-플라스미노겐의 활성화 후에 생성된 (TAL6003)-플라스민의 더 낮은 분자량 (예를 들어, 한 실시양태에서, 약 36,911 내지 약 37,039 Da)이 증가된 특이 활성 (단백질 1 ㎎ 당)을 초래한다;

ii) 천연 단백질에서 발견되는 2개 이상의 글리코실화 부위 (도 3 참조, 즉, N²⁸⁹ 및 T³⁴⁶)의 결여가, 비교적 낮은 분자량과 조합되어, 비교적 저렴한 박테리아 및 효모 발현 시스템을 사용하는 이러한 단백질의 재조합 생산을 용이하게 한다;

iii) (TAL6003)-플라스미노겐이 플라스미노겐 활성화제 tPA, 유로키나제(urokinase), 및 스트렙토키나제에 의해 활성화될 수 있다;

iv) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성인 단일 N-말단 크링글 도메인의 존재가 혈전용해 효능에 중요한 플라스민의 피브린-결합 성질을 유지시킨다;

v) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성인 단일 N-말단 크링글 도메인 상의 α2-항플라스민-결합 부위의 존재가 플라스민의 이러한 생리학적 억제제에 의해 (TAL6003)-플라스민이 신속하게 억제되도록 한다 (출혈을 방지할 수 있는 특색);

vi) (TAL6003)-플라스민의 더 작은 크기가 α₂-마크로글로불린에 의한 이의 억제를 용이하게 할 수 있어, 천연 플라스민에 비해 출혈 합병증의 기회를 추가로 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 소화되지 않은 무손상 피브린(피브리노겐)에 대한 주요 결합 부위를 보유하는 크링글 5의 부재는 순환 중인 피브리노겐의 고갈이 감소되면서 (TAL6003)-플라스민을 사용하는 것을 허용할 수 있다;

vii) 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인, 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성인 단일 N-말단 크링글 도메인의 존재는 세린 프로테아제 도메인에 대한 천연-유사 결합 (즉, 인간 플라스미노겐의 크링글 5 도메인과 세린 프로테아제 도메인 간의 천연 발생 도메인 접합부와 유사한 결합)을 제공한다;

viii) 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐의 발현 후, 이의 N-말단이 다시 절단되어 (예를 들어, 활성화 동안 다시 절단되어), 천연-유사 N-말단을 제공할 수 있다.

일반적으로, 본 발명은 미니-플라스민(플라스미노겐)에 비해 특정 장점이 있는, 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인에 대해 N-말단인 단일 크링글 영역이 있는 재조합 (TAL6003)-플라스민(플라스미노겐) 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 (TAL6003)-플라스미노겐에는 활성화 부위에 대해 N-말단인 1개의 크링글 도메인만이 그 자체로 있지만, 일부 실시양태는 활성화 부위에 대해 N-말단인 추가적인 서열을 포함한다. 추가적인 N-말단 서열은 플라스미노겐의 천연 크링글 영역의 것들로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 N-말단 크링글 도메인은 천연 플라스민(플라스미노겐) 및 이의 기능성 등가물의 크링글 1 및 4의 크링글 서열을 포함한다. 특히, 라이신-결합에 참여하거나 영향을 미치는 잔기의 보존이 포함되는 폴리펩티드 변이체에서의 기능 보존에 관한 지침을 제공하는 하기의 논의를 참조한다.

추가로, 본 발명의 폴리펩티드의 특정 실시양태는 천연-유사 구조물에 의해 감소된 면역원성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 재조합 플라스미노겐에는 인간 혈장-유래 플라스미노겐의 천연 발생 형태들 중 하나의 것과 동일한 N-말단이 있고, 이는 스트렙토키나제에 의한 활성화 시 천연-유사 N-말단을 포함하는 플라스민 폴리펩티드를 생산한다. 추가적으로, 본 발명의 신규 폴리펩티드에는 크링글 도메인과 세린 프로테아제 도메인 사이에 천연-발생 인간 플라스민 내의 크링글 5와 SP 도메인 사이의 접합부와 유사한 서열이 있다.

정의

폴리펩티드의 "도메인" 및 "영역"이라는 용어는, 달리 그렇지 않은 것으로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용될 때 일반적으로 동의어이다. 잘 알려진 구조적 또는 기능적 명칭 예컨대 "크링글" 또는 "세린 프로테아제" 등과 함께 인용되는 경우, 이같은 용어는 이같은 명칭에 상응하는 폴리펩티드 구조와 연관되는 것으로 통상적으로 인식 및 이해되는 적어도 일부의 특성(들)에 관한 폴리펩티드 특색을 도입할 것이다.

본원에서 사용된 "배양된 숙주 세포"는 임의의 수단, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주입, 형질전환, 바이러스 감염 등에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 함유하는 진핵생물 또는 원핵생물 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 "이종성"은 "천연 기원이 상이함" 또는 비-천연 상태를 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 배양된 숙주 세포가 또다른 생물로부터, 특히 또다른 종으로부터 유래된 DNA 또는 유전자로 형질전환되면, 이러한 유전자는 이러한 배양된 숙주 세포에 관하여, 그리고 또한 이러한 유전자를 보유하는 배양된 숙주 세포의 자손에 관하여 이종성이다. 유사하게, "이종성"은 동일한 천연의 원래의 세포 유형으로부터 유래되고 이러한 세포 유형 내로 도입되었지만 비-천연 상태, 예를 들어, 상이한 카피 수로 또는 상이한 조절 요소의 제어 하에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 또한, 핵산 또는 아미노산 서열의 문맥에서 사용되는 경우, 용어 "이종성"은 동일한 서열의 또다른 영역과 천연 기원이 상이한 서열의 임의의 영역을 또한 지칭할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질이 아포지방단백질(a)로부터 유래된 크링글 도메인 및 플라스미노겐으로부터 유래된 세린-프로테아제 도메인을 포함하는 경우, 크링글 도메인 및 세린 프로테아제 도메인은 서로에 대해 "이종성"이고, 각각의 도메인이 상이한 종 또는 생물로부터 유래된 경우 특히 그러하다.

"벡터" 분자는 이종성 핵산이 내부로 도입될 수 있고, 그후 적합한 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 핵산 분자이다. 바람직하게는 벡터에는 하나 이상의 복제 기원, 및 재조합 DNA가 내부로 도입될 수 있는 하나 이상의 부위가 있다. 벡터는 벡터가 있는 세포가 벡터가 없는 세포로부터 선택될 수 있는 편리한 수단을 종종 지니고, 예를 들어, 약물 저항성 유전자를 코딩한다. 통상적인 벡터에는 플라스미드, 바이러스 게놈, 및 (주로 효모 및 박테리아 내의) "인공 염색체"가 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "전사 제어 서열"은 자신이 작동가능하게 연결된 단백질 코딩 핵산 서열의 전사를 유도하거나, 억제하거나, 또는 다른 방식으로 제어하는 핵산 서열, 예컨대 개시자 서열, 인핸서 서열 및 프로모터 서열을 지칭한다.

용어 "폴리펩티드"는 본원에서 용어 "펩티드" 및 "단백질"과 상호교환가능하게 사용된다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 문맥에 의해 지시되는 목적에 필요한 정보를 함유하는 임의의 핵산을 지칭할 수 있다. 즉, 중합체가 적합한 정보, 예를 들어, 코딩된 펩티드와 관련된 정보를 나타낼 수 있는 한, 핵산은 DNA 또는 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 기타 핵산일 수 있고, 상보적인 서열, 예를 들어, 핵산 중합체의 센스 가닥 및 안티-센스 가닥을 포함할 수 있다.

폴리펩티드의 "변이체"라는 용어는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경된 아미노산을 지칭한다. 변이체에는 치환된 아미노산이 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 지니는 "보존적" 변화, 예를 들어, 류신의 이소류신으로의 교체가 있을 수 있다. 별법적으로, 변이체에 "비-보존적" 변화, 예를 들어, 글리신의 트립토판으로의 교체가 있을 수 있다. 유사한 사소한 변이에는 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 양쪽 모두가 포함될 수 있다. "변이체" 폴리펩티드의 특정 형태는 "기능적으로 등가인" 폴리펩티드, 즉 하기에 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드의 예와 실질적으로 유사한 생체내 또는 시험관내 활성을 나타내는 폴리펩티드이다. 어떠한 아미노산 잔기가 생물학적 또는 면역학적 활성을 제거하지 않으면서 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 것에서의 지침을 당업계에 주지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, DNASTAR 소프트웨어 (DNASTAR, Inc. (Madison, WI))를 사용하여 확인할 수 있다. 또한, 거명에 의해 본원에 전체적으로 포함된 인용된 참조문헌 내에 제공된 것들을 포함하여, 구체적인 지침들이 하기에서 제공된다.

용어 "N-말단" 및 "C-말단"은 이들이 적용되는 임의의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드 도메인 또는 구조의 상대적인 위치를 명시하도록 본원에서 사용된다. 상대적인 위치결정은 문맥으로부터 명백할 것이다. 즉, "N-말단" 특색은 동일한 문맥에서 논의되는 또다른 특색 (제1 특색에 대해 "C-말단"으로 가능하게 지칭되는 다른 특색)보다 폴리펩티드 분자의 N-말단에 적어도 더 가깝게 위치할 것이다. 유사하게, 용어 "5'-" 및 "3'-"은 폴리뉴클레오티드의 특색들의 상대적인 위치를 명시하도록 본원에서 사용된다.

"천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성인" N-말단 도메인이 있는 것으로 본원에서 지칭되는 폴리펩티드는 플라스미노겐의 천연 크링글 도메인과 유사한 구조적 및 기능적 특성을 나타낸다. 또한, "크링글 1과 상동성인" N-말단 도메인이 있는 것으로 본원에서 지칭되는 폴리펩티드는, 적어도 이러한 폴리펩티드가 크링글 5보다 더 높은 ω-아미노카르복실산 (및 기능성 상동체 예컨대 고리형 산인 트랜스-4-아미노메틸시클로헥산-1-카르복실산)에 대한 친화도를 가질 수 있는 정도로, 천연 크링글 1과 유사한 특성을 나타낸다. 예를 들어, 5-아미노펜탄산 (5-APnA); 6-아미노헥산산 (6-AHxA) (ε-아미노카프로산 (εACA)으로 또한 공지됨); 7-아미노헵탄산 (7-AHpA); 및 트랜스-4-아미노메틸시클로헥산-1-카르복실산 (t-AMCHA)에 대한 단리된 크링글 도메인 폴리펩티드의 결합의 비교를 위한 조건 및 프로토콜에 대해, 거명에 의해 본원에 포함된 [Chang, Y., et al., Biochemistry 37:3258-3271 (1998)]을 참조한다.

"크링글 4와 상동성인" 크링글 도메인에 대한 언급은 "크링글 1과 상동성인" 구절에 관하여 상기 기록된 것과 유사하게 정의된다. 즉, 이는 상기 논의된 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 4와 유사한 기능적 특성을 나타낸다. 이러한 폴리펩티드 또한 상기 기술된 바와 같이 고정된 라이신에 결합한다.

본 발명의 폴리펩티드는 고정된 라이신에 결합한다. 본원에서 사용된 "고정된 라이신에의 결합"이라는 구절은 이렇게 특성화된 폴리펩티드가 라이신-세파로스를 크로마토그래피 매질로 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 적용되는 경우 미니-플라스미노겐에 비해 진행이 지연된다는 것을 의미한다. 전형적으로, 특이적 리간드, 예를 들어, εACA를 함유하는 용액을 용출제로 사용하여 이같은 크로마토그래피 매질 (라이신 친화성 수지)로부터 본 발명의 폴리펩티드가 용출될 수 있다.

추가로, [Chang et al., 상기 문헌]에 더하여, 어떠한 잔기가 본 발명의 범주 내의 결실 돌연변이체가 산출되도록 보존적 또는 비-보본적 치환, 결실 또는 부가에 의해 변할 수 있는지를 결정하기 위해 당업자는 또다른 참고문헌들을 참고할 수 있다. 예를 들어, 하기의 참고문헌들이 ω 아미노카르복실산의 결합에 중요할 수 있는 천연 크링글 도메인의 특정 잔기에 관한 정보를 제공한다: 미국 특허 번호 6,538,103 (Ji 등); 미국 특허 번호 6,218,517 (Suzuki); [Douglas, J.T., et al., Biochemistry 41 (10):3302-10 (2002)]; [Zajicek, J., et al., J. Mol. Biol., 301 (2):333-47 (2000)]; [Lee, H., et al., Arch Biochem Biophys., 375(2):359-63 (2000)]; [Castellino, F. and S. McCance, Ciba Found Symp. 212:46-60 (1997)]; [McCance, S., et al., J. Biol. Chem., 269:32405-32410 (1994)]; [Rejante, M.R. and M. Llinas, Eur. J. Biochem., 221(3):939-49 (1994)]; [Wu, T.P., et al., Blood Coagul. Fibrinolysis, 5(2):157-66 (1994)]; [Hoover, C.J., et al., Biochemistry, 32(41):10936-43 (1993)]; [Menhart, N., et al., Biochemistry, 32:8799-8806 (1993)]; [Thewes, T., et al., J. Biol. Chem., 265 (7):3906-3915 (1990)]; [Novokhatny, V., et al., Thromb Res., 53(3):243-52 (1989)]; [Motta, A., et al., Biochemistry, 26(13):3827-36 (1987)]; [Novokhatny, V., et al., J. Mol. Biol., 179:215-232 (1984)]; [Lerch, P.G., et al., Eur. J. Biochem., 107(1):7-13 (1980)]; [Sottrup-Jensen, L., et al., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3:191-209 (1978)]; 및 [Wiman, B. and D. Collen, Nature 272, 549-545 (1978)] (모두 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함됨).

유리한 기능적 특성 (본원에 기술된 바와 같이 고정된 라이신의 결합에 대해 테스트함으로써 부분적으로 평가될 수 있음)이 있는 단일 N-말단 크링글 도메인이 있는 유용한 단순화된 플라스민(플라스미노겐) 분자가 제조될 수 있다는 것을 본 발명가들이 인지하였기 때문에, 본 발명은 활성화 부위에 대해 N-말단인 또다른 피브린-결합 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 플라스민의 세린 프로테아제 도메인이 인간 플라스미노겐의 크링글 4, tPA의 크링글 2, 또는 아포지방단백질 (a)의 크링글을 포함하지만 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택된 피브린-결합 크링글에 부착된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 플라스민의 세린 프로테아제 도메인이 임의의 또다른 공지된 피브린-결합 모듈, 예컨대 tPA 또는 피브로넥틴의 "핑거" 도메인, 또는 피브린-특이적 IgG의 FAB 단편에 부착된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

일부 양상에서, 본 발명의 폴리펩티드는 천연 발생 형태의 인간 혈장-유래 플라스민(플라스미노겐)에서 발견되는 화학 구조와 동일한 단백질 화학 구조 (예를 들어, 천연-유사 N-말단, 및 크링글 도메인과 세린 프로테아제 도메인 사이의 천연-유사 접합부)를 지닐 수 있다. 특정 이론에 제한되지 않으면서, 아미노산 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 단백질의 특정 양상들이 이의 면역원성에 기여할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 천연 인간 플라스미노겐 서열과 유사한 아미노산 서열의 혼입을 통해 (TAL6003)-플라스미노겐의 잠재적인 면역원성을 우선적으로 감소시킴으로써 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐을 기초로 하는 효과적인 단백질 치료제를 제공한다.

한 양상에서, 본 발명의 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드는 a) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성이고, 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인 단일 N-말단 크링글 도메인; 및 b) 인간 플라스미노겐 내의 상응하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인을 포함하고, 이때 상기 폴리펩티드는 고정된 라이신에 결합한다. 한 실시양태에서, 단일 N-말단 크링글 도메인은 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4와 상동성이다. 일부 실시양태에서, 고정된 라이신은 라이신-아가로스, 라이신-하이드로겔, 라이신-가교 아가로스로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 지지체 매트릭스에 결합된 라이신이다. 또다른 실시양태에서, 고정된 라이신은 라이신-가교 아가로스이다.

본 발명의 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드는 (TAL6003)-플라스민 폴리펩티드를 제공하도록 당업자에 의해 활성화될 수 있다. 한 실시양태에서, (TAL6003)-플라스민 폴리펩티드는 α₂-항플라스민에 의한 미니-플라스민의 피브린용해 활성의 억제 속도보다 약 5배 이상 더 빠른 억제 속도로 α₂-항플라스민에 의해 억제되는 피브린용해 활성을 나타낸다. 또다른 실시양태에서, 억제 속도는 미니-플라스민의 억제 속도보다 약 10배, 20배, 30배, 또는 40배 이상 더 빠르다.

한 실시양태에서, 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드는 서열 2에 제시된 서열에 대해 90％ 또는 95％, 또는 98％ 이상 동일하다. 또다른 실시양태에서, 단일 N-말단 크링글 도메인은 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4 도메인에 대해 90％ 이상 동일하고; C-말단 도메인은 인간 플라스미노겐의 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인에 대해 90％ 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 2에 제시된 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환물을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 2에 제시된 아미노산 서열의 위치 85의 것과 유사한 상대적인 위치에 아르기닌 잔기를 갖는다.

추가적인 실시양태에서, 단일 N-말단 크링글 도메인의 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4와의 아미노산 서열 동일성은 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 5와의 서열 동일성 보다 1개 이상의 잔기만큼 더 크고, 이때 인간 플라스미노겐의 크링글 1 및 4의 천연 서열과 비교하여 단일 N-말단 크링글 도메인의 보존적 치환은 크링글 5와의 동일성 비교 목적을 위해 천연 서열과 상이한 것으로 간주되지 않는다.

예를 들어, 본 발명에 기술된 (TAL6003)-플라스미노겐은 단일 크링글 도메인과 세린 프로테아제 도메인을 연결하는 접합 영역에 대한 아미노산 잔기 변형을 이용한다. 따라서, 2개의 도메인 사이의 이러한 접합부는 인간 플라스미노겐의 크링글 5 도메인과 세린 프로테아제 도메인 사이의 천연 발생 접합부와 더욱 밀접하게 유사하다.

또다른 실시양태에서, 본 발명에 기술된 (TAL6003)-플라스미노겐은 천연-유사 N-말단 서열을 추가로 포함한다. 재조합적으로 생산된 (TAL6003)-플라스미노겐은 천연-유사 N-말단을 또한 지니는 재조합 (TAL6003)-플라스민 폴리펩티드를 제공하도록 활성화 시 절단될 수 있다.

특정 실시양태에서, (TAL6003)-플라스미노겐의 단일 N-말단 크링글 도메인의 특정 위치의 잔기들이 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1에 관하여 보존된다. 이는 디술피드 연결 및 라이신 결합과 관련된 위치에서의 잔기일 수 있고, Cys84, Cys105, Cys133, Cys145, Cys157 및 Cys162, 및 Pro136-Pro140, Pro143-Tyr146, 및 Arg153-Tyr156을 각각 포함한다 (위치들은 도 3에 제시된 바와 같이 번호가 매겨짐). 추가적으로, 본 발명의 특정 실시양태는 도메인 조성은 유사하지만 (즉, 크링글-세린 프로테아제 (K-SP)) ([Sottrup-Jensen, L., et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, (Eds: J. F. Davidson, et al.) Raven Press, New York (1978)] 참조), 특히 서열 2에 제시된 아미노산 서열의 위치 85의 것과 유사한 상대적인 위치에 아르기닌 (Arg)이 없는 미니-플라스민(플라스미노겐)과 화학적으로 대조적으로 특성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 (TAL6003)-플라스미노겐은 서열 2에 제시된 아미노산 서열의 위치 85의 것과 유사한 상대적인 위치에 Arg 잔기를 포함하는 단일 N-말단 크링글 도메인을 포함한다. 서열 2에 제시된 아미노산 서열의 위치 85의 것과 유사한 상대적인 위치의 비제한적인 예로는 서열 4에 제시된 아미노산 서열의 Arg(153), Arg(234), Arg(324), 및 Arg(426) 위치가 포함된다.

또다른 실시양태에서, 구조적으로 및 기능적으로 유사한 위치 (즉 N-말단 도메인의 크링글 구조에 관하여; 상기 논의된 [Chang, Y., et al.] 참조)에서 폴리펩티드 내에 여전히 존재하는 한편 지명된 잔기의 특정 위치가 다소 다를 수 있다. 일부 실시양태에서, (TAL6003)-플라스민(플라스미노겐) 폴리펩티드의 단일 N-말단 크링글 도메인의 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4와의 동일성 백분율은 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 5와의 동일성 백분율보다 1개 이상의 잔기만큼 더 크다.

또한, 본 발명의 특정 실시양태는 미니-플라스민(플라스미노겐)과 기능적으로 대조적으로 특성화될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 (TAL6003)-플라스민은 α₂-항플라스민에 의한 억제 속도 증가, 예를 들어, 미니-플라스민의 억제 속도보다 약 10배 내지 100배 더 빠른 속도를 나타낸다. 또한, 특정 실시양태에서, (TAL6003)-플라스민은 고정된 라이신 (예를 들어, 라이신-세파로스)에 결합한다.

(TAL6003)-플라스미노겐의 단일 N-말단 크링글 도메인의 "N-말단"으로서의 특성화는 단지 이러한 도메인이 활성화 부위에 대해 N-말단에 존재한다는 것을 의미하고, 이러한 도메인 자체에 대해 N-말단인 추가적인 아미노산 잔기가 존재하지 않는다는 것을 의미하지 않는다. 또한, 단일 N-말단 크링글 도메인의 가장 C-말단의 시스테인 잔기 (즉, 도 4에 제시된 가장 C-말단의 Cys 잔기)와 플라스미노겐의 활성화 부위 사이에 개재된 잔기의 개수 및 신원이 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 변할 수 있다. 당업자는 본원의 개시 내용 및 크링글 1 기능 및 구조에 관한 지침을 위해 본원에서 인용된 참조문헌을 기초로 과도한 실험 없이 본 발명의 이점 (결실 돌연변이체의 크기에서의 실질적인 증가 또는 잠재적으로 문제가 되는 글리코실화 부위의 도입 없이, ω 아미노카르복실산의 크링글 1-유사 결합)을 달성하는 이러한 변이를 결정할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 폴리펩티드를 생산하기 위한 재조합 방법, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현 시스템, 및 이같은 발현 시스템을 포함하는 배양된 숙주 세포에 관한 것이다.

언급된 바와 같이, 한 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 이의 보존적 아미노산 치환이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. "보존적" 아미노산 치환의 선택에 관한 지침이 하기에 더욱 상세하게 제공된다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.

또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함하는 벡터의 제조 방법에 관한 것이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 벡터에 관한 것이다.

또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 배양된 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 배양된 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 배양된 숙주 세포에 관한 것이다.

또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 배양된 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (b) 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 본 발명의 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 숙주 세포를 벡터가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

또다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 4부터 1032까지를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

폴리뉴클레오티드

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드를 수반할 수 있는 치환, 결실 및/또는 부가가 있는 변이체를 포함한다. 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 양쪽 모두에서 변경될 수 있다. 코딩 영역에서의 변경은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 일으킬 수 있다. (TAL6003)-플라스민(플라스미노겐) 단백질 또는 이의 일부분의 성질 및 활성을 변경시키지 않는 침묵성 치환, 부가 및 결실이 특히 바람직하다. 보존적 치환 (하기 참조)이 이와 관련하여 또한 특히 바람직하다.

본 발명의 추가적인 실시양태는 (a) 서열 2 내의 전체 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) 서열 2 내의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)에서의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상 동일한, 더욱 바람직하게는 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 동의성 변이체를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

(TAL6003)-플라스미노겐을 코딩하는 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 예를 들어 95％ 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오드 서열이 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드를 코딩하는 기준 뉴클레오티드 서열의 각각 100개의 뉴클레오티드 당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 바꿔 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 95％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 뉴클레오티드의 5％ 이하가 결실될 수 있거나, 또다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 기준 서열 내의 전체 뉴클레오티드의 5％ 이하의 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 돌연변이는 기준 서열 내의 뉴클레오티드들 사이에 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 군 내에 산재되어, 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이러한 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 2개 이상의 폴리뉴클레오드 서열을 이들의 동일성 백분율을 결정함으로써 비교할 수 있다. 마찬가지로 2개 이상의 아미노산 서열을 이들의 동일성 백분율을 결정함으로써 비교할 수 있다. 2개의 서열 (핵산 또는 펩티드 서열)의 동일성 백분율은 2개의 정렬된 서열 간의 정확한 매치의 개수 ÷ 더 짧은 서열의 길이 × 100으로 일반적으로 기술된다. 핵산 서열들에 대한 대략적인 정렬은 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소적인 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고 [Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 표준화된 측정 행렬(scoring matrix)을 사용하여 펩티드 서열과 함께 사용하도록 확장될 수 있다. <Genetics Computer Group (Madison, Wis.)>이 이의 BESTFIT 유틸리티 애플리케이션에서 핵산 및 펩티드 서열에 대한 이러한 알고리즘의 실행을 제공한다. 이러한 방법에 대한 디폴트(default) 파라메터가 [Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)] (Genetics Computer Group (Madison, Wis.)으로부터 입수가능)에 기술되어 있다.

예를 들어, 유전자 코드의 동의성으로 인해, 당업자는 서열 1에 제시된 핵산 서열에 대해 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상 동일한 서열을 갖는 다수의 핵산 분자가 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드를 코딩할 것임을 즉각적으로 인식할 것이다. 실제로, 이러한 뉴클레오티드 서열들의 동의성 변이체들 모두가 동일한 폴리펩티드를 코딩하기 때문에, 이는 본원에 기술된 임의의 기능 분석법 또는 측정법을 수행하지 않고도 당업자에게 명백할 것이다. 동의성 변이체가 아닌 핵산 분자에 대해서, 상당수가 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드 활성이 있는 폴리펩티드를 또한 코딩할 것으로 당업계에서 추가로 인식될 것이다. 이는 단백질 기능에 현저하게 영향을 미칠 가능성이 낮거나 없을 아미노산 치환 (예를 들어, 한 지방족 아미노산의 제2의 지방족 아미노산으로의 교체)을 당업자가 충분히 인지하고 있기 때문이다.

최근, 더 긴 폴리뉴클레오티드 서열의 합성 생산에서의 진전으로 전통적인 클로닝 기술을 사용하지 않으면서 상당히 더 긴 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 합성에 의해 생산하는 것이 가능해졌다. 이같은 서비스의 시판원에는 블루 헤론 인코포레이티드 (Blue Heron, Inc. (Bothell, WA)) (http://www.blueheronbio.com)가 포함된다. 블루 헤론 인코포레이티드가 활용하는 기술이 미국 특허 번호 6,664,112; 6,623,928; 6,613,508; 6,444,422; 6,312,893; 4,652,639; 미국 특허 출원 공개 번호 20020119456A1; 20020077471A1; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO03054232A3; WO0194366A1; WO9727331A2; 및 WO9905322A1 (모두 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.

물론, 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 핵산의 전통적인 기술이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 또한 사용될 수 있다. 이러한 기술은 주지되어 있고, 예를 들어, [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausebel, ed., Vols. I, II and III (1997)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]; [DNA Cloning: A Practical Approach, D. N. Glover, ed., Vols. I and II (1985)]; [Oligonucleotide Synthesis, M. L. Gait, ed. (1984)]; [Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, eds. (1985)]; [Transcription and Translation, Hames and Higgins, eds. (1984)]; [Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986)]; [Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986)]; [Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"]; (연재물) [Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987)]; 및 [Methods in Enzymology, Wu and Grossman and Wu, eds., Vols. 154 and 155] (모두 거명에 의해 본원에 포함됨)에 설명되어 있다.

벡터 및 배양된 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이러한 재조합 벡터로 유전자 조작된 배양된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 (TAL6003)-플라스민(플라스미노겐) 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다.

감염, 형질도입, 형질감염, 트랜스벡션(transvection), 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 사용하여 재조합 구축물이 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 파지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 적격성 또는 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우에, 배양된 숙주 세포의 보완 시에만 바이러스 증식이 일어날 것이다.

배양된 숙주에서의 증식에 대한 선별성 마커를 함유하는 벡터에 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예컨대 인산칼슘 침전물에서 또는 전하를 띠는 지질과의 복합체에서 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 적합한 패키징 세포주를 사용하여 이를 시험관 내에서 도입한 후, 배양된 숙주 세포 내로 형질도입할 수 있다.

관심 폴리뉴클레오티드에 대한 시스(cis)-작용 제어 영역을 포함하는 벡터가 바람직하다. 적합한 트랜스(trans)-작용 인자가 배양된 숙주에 의해 공급될 수 있거나, 보완 벡터에 의해 공급될 수 있거나, 또는 배양된 숙주 내로의 도입 시 벡터 자체에 의해 공급될 수 있다.

이와 관련된 특정 실시양태에서, 벡터는 유도성 및/또는 세포-유형 특이적일 수 있는 특이적 발현을 제공한다. 조작하기 쉬운 환경 인자, 예컨대 온도 및 영양소 첨가물에 의해 유도가능한 것들이 이같은 벡터들 중에서 특히 바람직하다.

본 발명에서 유용한 발현 벡터에는 염색체-, 에피솜- 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 요소, 바이러스 예컨대 배큘로바이러스, 파포바 바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 거짓광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합물로부터 유래된 벡터, 예컨대 코스미드 및 파지미드가 포함된다.

DNA 삽입물은 적합한 프로모터, 예컨대 몇몇 예를 들자면 파지 람다 PL 프로모터, 대장균 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 기타 적절한 프로모터들이 당업자에게 공지될 것이다. 발현 구축물은 전사 개시, 종결, 및 번역되는 영역의 경우의 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 구축물에 의해 발현되는 성숙형 전사물의 코딩 부분은 시작부의 번역 개시 코돈, 및 번역될 폴리펩티드의 끝부분에 적합하게 위치하는 종결 코돈 (UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 수 있다.

지시된 바와 같이, 바람직하게는 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 이같은 마커에는 진핵생물 세포 배양에 대한 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 저항성, 및 대장균 및 기타 박테리아에서의 배양에 대한 테트라사이클린 또는 앰피실린 저항성 유전자가 포함된다. 적합한 배양된 숙주의 대표적인 예로는 박테리아 세포, 예컨대 대장균, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예컨대 효모 세포; 곤충 세포 예컨대 초파리 S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포 예컨대 CHO, COS 및 보웨스(Bowes) 흑색종 세포; 및 식물 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 기술된 배양된 숙주 세포들에 대한 적합한 배양 배지 및 조건이 당업계에 공지되어 있다.

박테리아에서 사용하기에 바람직한 벡터에는, 예를 들어, pET24b 또는 pET22b (Novagen (Madison, WI)에서 판매) (pET-24b(+) 및 pET-22b(+) = 각각 pET 발현 시스템 24b (카탈로그 번호 69750) 및 22b (카탈로그 번호 70765) (EMD Biosciences, Inc., Novagen Brand (Madison, WI)); 벡터에 관한 상세사항에 대해 http://www.emdbiosciences.com의 pET-24b 및 pET-22b에 관한 제품 정보 섹션을 참조한다), pQE70, pQE60 및 pQE-9 (Qiagen Inc. (Valencia, CA)에서 판매); pBS 벡터, 파지스크립트(PHAGESCRIPT) 벡터, 블루스크립트(BLUESCRIPT) 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene (LaJolla, CA)에서 판매); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia (현재 Pfizer, Inc.) (New York, NY)에서 판매)가 포함된다. 바람직한 진핵생물 벡터는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG (Stratagene 판매); 및 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (Pharmacia 판매)이다. 기타 적절한 벡터들이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.

본 발명에서 사용하기에 적절한 박테리아 프로모터에는 대장균 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터, 및 trp 프로모터가 포함된다. 적절한 진핵생물 프로모터에는 CMV 극초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 예컨대 라우스(Rous) 육종 바이러스 (RSV)의 것들, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터가 포함된다.

배양된 숙주 세포 내로의 벡터 구축물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염, 또는 기타 방법에 의해 실행될 수 있다. 이같은 방법들은 다수의 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 [Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology, 2nd Edition (1995)]에 기술되어 있다.

고급 진핵생물에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사가 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 주어진 배양된 숙주 세포 유형에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키도록 작용하는, 일반적으로 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 인핸서의 예로는 bp 100 내지 270의 복제 기원의 후방부 상에 위치하는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후방부 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다.

번역된 단백질이 소포체의 내강, 원형질막 주위공간, 또는 세포외 환경 내로분비되도록 하기 위해, 발현된 폴리펩티드 내로 적합한 분비 신호가 혼입될 수 있다. 신호는 폴리펩티드에 대해 내인성일 수 있거나, 또는 이종성 신호일 수 있다.

폴리펩티드는 변형된 형태, 예컨대 융합 단백질로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가적인 이종성 기능 영역을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 정제 동안, 또는 후속 취급 또는 보관 동안, 배양된 숙주 세포 내에서의 안전성 및 지속을 개선하기 위해 추가적인 아미노산들, 특히 전하를 띠는 아미노산들의 영역이 폴리펩티드의 N-말단에 예를 들어 부가될 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위해 펩티드 모이어티(moiety)가 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 이같은 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 특히, 분비 또는 배출이 일어나도록, 안정성을 개선하도록, 그리고 정제를 용이하게 하도록 폴리펩티드에 펩티드 모이어티를 부가하는 것은 당업계에서 친숙하고 일상적인 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 단백질을 가용화시키는데 유용한 면역글로불린으로부터의 이종성 영역을 포함한다. 예를 들어, EP 0 464 533 A1 (캐나다 대응 특허 2,045,869)에 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분을 또다른 인간 단백질 또는 이의 일부분과 함께 포함하는 융합 단백질이 개시되어 있다. 많은 경우에, 융합 단백질 내의 Fc 부분은 치료법 및 진단에서 사용하기에 전적으로 유리하고, 따라서 개선된 약동학적 성질이 예를 들어 초래된다. 다른 한편으로는, 일부 용도에 대해, 기술된 유리한 방식으로 융합 단백질이 발현, 검출 및 정제된 후 Fc 부분을 결실시킬 수 있는 것이 바람직할 것이다. 이는 Fc 부분이 치료법 및 진단에서 사용하는데 방해물인 것으로 입증된 경우, 예를 들어, 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로서 사용되는 경우이다. 예를 들어 약물 발견에서, 인간 단백질이 고-처리량 스크리닝 분석법의 목적을 위해 Fc 부분과 융합되었다 (예컨대, hIL-5의 길항제를 확인하기 위한 hIL5-수용체). [Bennett, D., et al., J. Molecular Recognition, 8:52-58(1995)] 및 [Johanson, K. et al., J. Biol.Chem., 270(16):9459-9471 (1995)] 참조.

본원의 실시예에 구체적으로 기술된 것들이 포함되는 주지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 (TAL6003)-플라스미노겐을 회수 및 정제할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연 정제 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 배양된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 (예를 들어, 박테리아, 효모, 고급 식물, 곤충 및 포유류 세포 포함)로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 추가적으로, 숙주-매개 프로세스의 결과로서 일부 경우에, 본 발명의 폴리펩티드는 초기 변형 메티오닌 잔기를 또한 포함할 수 있다.

폴리펩티드

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드의 변이체 및 특정 예를 코딩하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 표현형 면에서 침묵성인 아미노산 치환을 제조하는 방법에 관한 지침이 [Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990)]에서 제공되고, 상기 문헌에서 저자는 단백질이 아미노산 치환에 대해 놀랄만큼 내성이라는 것을 나타내고 있다. 본 발명의 범주 내의 임의의 개수의 치환이 이같은 일반적인 원리를 적용하여 수득될 수 있지만, 치환에 관한 특정 지침에 대해, 당업자는 크링글 1 도메인의 구조 및 기능에 관한 본원에서 인용된 참조문헌들을 참고할 수 있다.

사용된 기준에 따라, (TAL6003)-플라스미노겐의 크링글, 활성화 부위, 및 세린 프로테아제 도메인의 정확한 "위치" 또는 서열이 본 발명의 범주 내의 특정 변이에서 약간 상이할 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 활성화 부위와 관련된 크링글 도메인의 정확한 위치가 약간 다를 수 있고/있거나 크링글 도메인에 대해 N-말단인 서열의 길이가 변할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드 활성을 나타내는 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드의 이같은 변이를 포함한다. 이같은 변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 치환을 포함한다. 상기 지시된 바와 같이, 어떠한 아미노산 변화가 표현형 면에서 침묵성일 것인지에 관한 지침을 [Bowie, J. U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990)]에서 확인할 수 있다.

따라서, 서열 2의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 아미노산 잔기들 중 하나 이상 (예를 들어, 3개, 5개, 8개, 10개, 15개 또는 20개의 잔기)이 보존 또는 비-보존 아미노산 잔기 (바람직하게는, 보존 아미노산 잔기)로 치환된 것 (이같은 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되는 것일 수 있거나 유전자 코드에 의해 코딩되는 것이 아닐 수 있다), 또는 (ii) 아미노산 잔기들 중 하나 이상 (예를 들어, 3개, 5개, 8개, 10개, 15개 또는 20개)이 치환기를 포함하는 것, 또는 (iii) 성숙형 폴리펩티드가 또다른 화합물, 예컨대 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합된 것, 또는 (iv) 추가적인 아미노산, 예컨대 IgG Fc 융합 영역 펩티드 또는 리더 또는 분비 서열 또는 성숙형 폴리펩티드 또는 프로단백질(proprotein) 서열의 정제에 사용되는 서열이 성숙형 폴리펩티드에 융합된 것일 수 있다. 이같은 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 교시로부터 당업자의 범주 내인 것으로 간주된다.

지시된 바와 같이, 바람직하게는 변화는 사소한 성질의 변화, 예컨대 단백질의 폴딩(folding) 또는 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환이다. 물론, 당업자에 의해 이루어질 아미노산 치환의 개수는 상기 기술된 것들을 포함하는 다수의 인자들에 좌우된다. 일반적으로, 임의의 소정의 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드에 대한 치환 개수는 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 또는 3을 초과하지 않을 것이다.

기능에 필수적인 본 발명의 (TAL6003)-플라스미노겐 내의 아미노산을 당업계에 공지된 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발 ([Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)])에 의해 확인할 수 있다. 후자의 절차는 분자 내의 잔기마다 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그후, 예를 들어, 본원에서 제공된 실시예에 제시된 바와 같이, 생성된 돌연변이체 분자를 생물학적 활성에 대해 테스트한다. 리간드 결합에 결정적인 부위를 구조 분석 예컨대 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지 ([Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:399-904 (1992)] 및 [de Vos, et al. Science 255:306-312 (1992)])에 의해 또한 결정할 수 있다. 단백질의 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산의 결실로 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능의 변형 또는 상실이 초래되더라도, 또다른 생물학적 활성은 여전히 유지될 수 있다.

본 발명의 "단리된 폴리펩티드"의 생산에 유용한 폴리펩티드가 고체 상 합성 방법에 의해 생산될 수 있는 것로 또한 생각된다. [Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985)]; 및 미국 특허 번호 4,631,211 (Houghten 등, 1986) 참조.

본 발명의 폴리펩티드는 단리된 형태로 제공될 수 있다. "단리된 폴리펩티드"는 이의 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 배양된 재조합 숙주 세포 내에서 생산되고/되거나 이러한 세포 내에 함유된 폴리펩티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. "단리된 폴리펩티드"는 배양된 재조합 숙주로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 또한 의미한다.

(TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열에 대해 지시된 동일성 백분율의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 폴리뉴클레오티드에 관하여 상기 지시된 컴퓨터-보조 방법이 포함되는 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 상기의 논의에서의 뉴클레오티드 서열들처럼 폴리펩티드 아미노산 서열들을 시험하고 비교한다. 당업자는 폴리뉴클레오티드에 대해 논의된 분자 종점과 같은 개념들이 폴리펩티드 분석을 위한 이같은 방법 및 프로그램의 상응하는 사용을 고려할 때 직접적인 유사점들이 있을 것임을 인식할 것이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 관하여 논의된 수동 수정은 핵산의 5' 및 3' 종점을 지칭하지만, 동일한 논의가 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 적용가능한 것으로 인식될 것이다.

본 발명은, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 항체 분자 또는 기타 세포 리간드에의 연결 등에 의해, 번역 동안 또는 번역 후에 차별적으로 변형된 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 수많은 화학적 변형이 시아노겐 브로마이드, 트립신, 카이모트립신, 파파인, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) V8 프로테아제, NaBH₄에 의한 특이적 화학적 절단; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 튜니카마이신의 존재 하에서의 대사 합성 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 포함되는 추가적인 번역후 변형에는, 예를 들어, 예를 들어, N-연결 또는 O-연결 탄수화물 사슬, N-말단 또는 C-말단 끝부분의 프로세싱, 아미노산 골격에의 화학적 모이어티의 부착, N-연결 또는 O-연결 탄수화물 사슬의 화학적 변형, 및 배양된 원핵생물 숙주 세포에서의 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드의 발현에 대해 개조된 벡터 및 구축물의 결과로서의 N-말단 메티오닌 잔기의 부가가 포함된다. 단백질의 검출 및 단리를 허용하도록 폴리펩티드가 검출가능한 표지, 예컨대 효소, 형광, 동위원소 또는 친화성 표지로 또한 변형될 수 있다.

제약 조성물 및 치료 방법

(TAL6003)-플라스민(플라스미노겐)은 미국 특허 출원 번호 10/143,112; 및 [Novokhatny, V., et al., J. Thromb. Haemost. 1(5):1043-41 (2003)] (양쪽 모두 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 방법 및 조성물에 따라 치료 용도용으로 제형될 수 있다. 예를 들어, 저-pH (약 2.5 내지 약 4), 저-완충능 완충제가 (TAL6003)-플라스민의 제형에 사용될 수 있다. 추가적으로, 플라스민, 미니-플라스민, 및/또는 마이크로-플라스민에 대해 실행된, 당업자에게 공지된 또다른 방법 및 제형이 치료적 투여를 위해 본 발명의 (TAL6003)-플라스민을 제형하는데 사용될 수 있다.

(TAL6003)-플라스민(플라스미노겐)은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,355,243, 6,964,764, 및 6,969,515 (모두 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같은 방법에 따라, 다양한 혈전성 질환 또는 용태를 치료하는데 사용될 수 있다. 또다시, (TAL6003)-플라스민에 적용가능한 가능한 제약 제형에 관하여, (TAL6003)-플라스민은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 플라스민, 미니-플라스민, 및/또는 마이크로-플라스민에 대해 현재 실행될 수 있는 것들에 의해 치료적으로 또한 투여될 수 있다.

실시예

발현 벡터 디자인

(TAL6003)-플라스미노겐에 대한 아미노산 서열이 서열 2에서 제시된다. (TAL6003)-플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 대장균 발현 및 mRNA 안정성에 대해 코돈-최적화시켜, 서열 1에 제시된 바와 같은 DNA 서열을 제공하였다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 세포질 단백질을 생산하도록 대장균 발현 벡터 pET24b(+) (Novagen (Madison, WI))의 NdeI 및 BamH1 부위 내로 클로닝하였다.

표 1에 설명된 바와 같이, 박테리아 (예를 들어, 대장균)에서의 발현으로 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐 폴리펩티드 (즉, 서열 4에 제시된 천연 인간 플라스미노겐 아미노산 서열의 위치 70의 아르기닌 (즉, R⁷⁰)에 상응하는 아르기닌 아미노산 잔기 (즉, R²) 바로 앞의 N-말단 메티오닌 (즉, M¹)이 있는 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐)가 제공되었다 (예를 들어, 도 3을 또한 참조). 이같은 재조합 생성물은 천연 인간 플라스미노겐의 위치 78의 라이신 (즉, K⁷⁸) 또는 위치 79의 발린 (즉, V⁷⁹)에 각각 상응하는 N-말단 라이신 (즉, K¹⁰) 또는 발린 (즉, V¹¹)이 있는 단백질이 포함되는, 상이한 N-말단을 갖는 추가적인 단백질들을 산출하기 위한 추가적인 절단에 대해 감수성이었다.

( TAL6003 )- 플라스미노겐 발현 및 정제

(TAL6003)-플라스미노겐을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 BL21(DE3) RIL (Stratagene (La Jolla, CA)), BL21(DE3) (유전자형: F^- ompT hsdS_B (r_B ^-m_B ^-) gal dcm (DE3)) (EMB Biosciences, Inc. (San Diego, CA)), 및 BLR(DE3) (유전자형: F^- ompT hsdS_B (r_B ^-m_B ^-) gal dcm (DE3) Δ( srl - recA )306::Tn10(Tet^R))이 포함되는 다양한 세포 내로 형질전환시키고, 1 mM IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)에 의한 유도 후의 단백질 과발현을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 발현 추정치는 진탕 플라스크 내의 세포 배양물 1 ℓ 당 약 250 ㎎ 이상이었다.

세포 유형 BL21(DE3) RIL는 Arg, Ile, 및 Leu를 코딩하는 희귀 대장균 tRNA를 발현하도록 조작된 것이다. 또한, BL21(DE3) 및 BLR(DE3) 양쪽 모두는 균력 및 콜로니형성 인자의 부재를 기초로 인간 및 동물에게 비-병원성인 것으로 분류된 B 계통 대장균이다. BLR(DE3) 세포에는 DNA 재조합을 위한 recA 유전자가 없고, 이러한 세포로는 람다 파지의 유도가 보고되지 않았다. BLR(DE3) 세포 내의 (TAL6003)-플라스미노겐 구축물의 리서치 세포 은행(research cell bank)이 생산되었고, 순도, 신원 및 박테리오파지의 유도에 대해 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories) (Malvern, PA)에서 테스트되었다. 테스트에서, 리서치 세포 은행의 신원 및 순도가 입증되었고, 파지가 관찰되지 않으면서 세포가 파지 유도 테스트를 통과하였다 (데이터는 제시되지 않음).

(TAL6003)-플라스미노겐 (즉, 서열 2를 기초로 함)의 생산이 대규모 발현에서 입증되었고, 이때 세포가 용해되었고, 가용성 단백질 및 정제된 봉입체 양쪽 모두가 SDS-PAGE에 의해 시험되었다.

하기의 전형적인 프로토콜이 (TAL6003)-플라스미노겐의 발현에 사용되었다:

(TAL6003)-플라스미노겐 벡터를 함유하는 대장균 세포 (예를 들어, BL21(DE3) RIL, BL21(DE3), 또는 BLR(DE3))의 단일 콜로니를 사용하여 5 ㎖의 LB/카나마이신 (30 ㎍/㎖)에 접종하고, 진탕기 상에서 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 신선한 배지에서의 추가 성장을 위해 50 ㎕ 분취량을 배양된 박테리아 현탁액으로부터 취하였다. 이러한 절차를 16시간 후에 6 ㎖의 박테리아 배양물 및 250 ㎖의 배지로 반복하였다. 배양물을 진탕하면서 37℃에서 약 1.0의 OD600 nm으로 성장시키고, IPTG를 1 mM 최종 농도로 첨가하였다. 배양물을 추가로 5시간 동안 성장시켰다. 5,000×g에서의 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 세포 펠렛을 20 mM EDTA를 함유하는 20 mM 트리스 (pH 8.0)에 용해시키고, -80℃에서 동결시켰다.

(TAL6003)-플라스미노겐을 정제하기 위해, 세포 펠렛을 해동하고, 용액 부피가 원래의 세포 배양물 부피의 약 1/20일 때까지 완충제를 첨가하였다. 그후, 라이소자임을 0.5 ㎎/㎖의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 4℃에서 10-15분 동안 빠르게 교반하였다. 그후, 트리톤(Triton) X-100을 1％ 최종 농도로 첨가하고, 다시 10분 동안 계속 교반하였다. DNAse I (0.05 ㎎/㎖) 및 MgCl₂ (2.5 mM)를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 또는 용액이 더 이상 점성이 아닐 때까지 계속 교반하였다. 최종 용액을 4℃에서 30분 동안 15,000×g에서 원심분리하고, 상등액을 따라버렸다.

세포 펠렛을 세정 용액 (10 mM EDTA, 1％ 트리톤-X-100 및 0.5 M 요소를 함유하는 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4)으로 3회 세정하고, 최종 펠렛을 40 ㎖의 추출 완충제 (10 mM EDTA, 20 mM DTT, 및 6 M 구아니딘-HCl을 함유하는 PBS, pH 7.4)에 용해시키고, 4℃에서 하룻밤 동안 보관하였다. 16시간 후, 용액을 30분 동안 15,000×g에서 원심분리하여 고체를 제거하고, 4℃에서 교반하면서 상등액을 리폴딩 용액 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 3.5 M 구아니딘 HCl, 0.5 M 아르기닌 HCl, 10 mM EDTA, 3 mM GSH, 0.3 mM GSSG)에 천천히 첨가하였다. 리폴딩 절차를 약 0.29 g/L의 단백질 농도에서 수행하였다.

리폴딩 용액을 교란시키지 않으면서 4℃에서 2일 동안 유지시킨 후, 완충제 용액을 자주 교환하면서 8-10 시간에 걸쳐 10 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.15 M 아르기닌-HCl을 함유하는 8배 부피의 0.1 M 트리스-HCl pH 8.0에 대해 투석하였다.

그후, 단백질 용액을 투석으로부터 제거하고, 막 차단값이 10 kDa인 아미콘(AMICON) 필터를 사용하여 약 10-20 ㎖로 농축하고, 10 mM EDTA, 0.15 M NaCl을 함유하는 100배 부피의 0.1 M 트리스 pH 8.0에 대해 하룻밤 동안 투석하였다. 이러한 물질을 원심분리하여 입상물질을 제거한 후, 라이신 친화성 수지 (라이신-세파로스 4B; Amersham Biosciences (Piscataway, NJ))에 통과시켰다. 0.2 M 엡실론 아미노카프로산 (εACA)을 함유하는 트리스-완충 염수, pH 8.0을 사용하여 (TAL6003)-플라스미노겐을 수지로부터 용출시켰다.

전형적으로, 80 ㎎의 봉입체가 1 리터의 세포 배양물로부터 단리될 수 있었고, 40 ㎎이 라이신-세파로스 크로마토그래피 단계에서 용출될 수 있었다.

( TAL6003 )- 플라스미노겐의 성질

정제된 (TAL6003)-플라스미노겐은 환원 (디티오트레이톨-처리) 및 비-환원 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 35-40 kDa 영역의 밴드로 나타났다. MALDI 질량-분광법에 의해 결정된 이의 분자량은 예상값에 근접하는 약 38,140 Da이었다.

스트렙토키나제에 의한 (TAL6003)-플라스미노겐의 활성화 속도를 결정하기 위해, 1 ㎎/㎖의 재조합 (TAL6003)-플라스미노겐을 1:100 (TAL6003)-플라스미노겐 대 스트렙토키나제 비율로 스트렙토키나제와 혼합하고, 실온에서 pH 7에서 인큐베이션하였다. 다양한 시점에, 샘플을 제거하고, SDS-PAGE 완충제로 켄칭(quenching)하고, 환원된 SDS-PAGE에 이어서 음영계측기 상에서 분석하여, 1-사슬 (TAL6003)-플라스미노겐 분자의 2-사슬 (TAL6003)-플라스민으로의 전환을 결정하였다. 스트렙토키나제에 의한 (TAL6003)-플라스미노겐의 활성화 백분율이 SDS-PAGE에 의해 결정 시 경시적으로 전장 (TAL6003)-플라스미노겐이 상실되는 것으로서 도 6에서 제시된다.

크링글 1의 기능성을 입증하기 위해, 본 발명가들은 라이신-세파로스 4B에 대한 TAL6003-플라스미노겐의 결합을 결정하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, (TAL6003)-플라스미노겐이 라이신-세파로스에 결합하였고, 약 4 mM의 단일 피크로서 0-20 mM εACA 구배에 의해 칼럼으로부터 용출될 수 있었다. 라이신-세파로스에 결합하는 리폴딩된 (TAL6003)-플라스미노겐의 능력은 분자의 크링글 도메인이 정확하게 폴딩되고, 라이신-결합 부위가 충분히 활성이라는 것을 가리킨다.

크링글 1의 기능성을 추가로 입증하기 위해, [Matsuka et al., Eur. J. Biochem., 190:93-97 (1990)] 및 [Douglas et al., J. Biochemistry 41:3302-3310 (2002)] (모두 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이 단백질 형광에서의 관련된 변화를 모니터링함으로써 (TAL6003)-플라스미노겐에 대한εACA의 결합을 측정하였다. (TAL6003)-플라스미노겐의 크링글 1에 대한 εACA의 결합은, 아마도 라이신-결합 부위의 일부인 트립토판 잔기의 켄칭으로 인해, 형광에서의 감소를 초래한다.

이러한 프로세스를 모니터링하기 위해, εACA의 농축 용액의 4 ㎕ 내지 16 ㎕ 분취량을 20 mM NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 완충제 (pH 8.0, 25℃) 내의 5 μM (TAL6003)-플라스미노겐 2 ㎖에 첨가하였다. 플루오로맥스(FLUOROMAX) 형광 분광광도계 (Jobin Yvon, Inc. (Edison, NJ))에서 298 nm의 여기 파장 및 340 nm의 방출 파장에서 형광을 모니터링하였다; 각각의 εACA 첨가 후, 형광에서의 추가적인 변화가 관찰되지 않을 때까지 용액을 평형이 되게 하였다.

생성된 형광 값을 희석에 대해 보정하고, 0 - 50 μM εACA 범위의 εACA의 농도에 대해 플롯팅(plotting)하였다. 데이터를 비-선형 회귀에 의해 피팅(fitting)하여, 약 19 μM의 K_d가 수득되었다.

플라스미노겐의 한 성질은 피브린에 결합하는 능력이다. (TAL6003)-플라스미노겐이 피브린과 상호작용하는 능력을 유지하는지 여부를 결정하기 위해, 이의 피브린-결합 성질을 미량역가 플레이트 분석법에서 테스트하였고, 이러한 분석법에서 피브린에 대한 (TAL6003)-플라스미노겐의 결합이 이어지는 tPA에 의한 플라스미노겐의 활성화 및 결과적인 혈병 용해에 의해 평가되었다. 이러한 목적을 위해, 100 ㎕의 5 mg/㎖ 피브리노겐을 미량역가 플레이트의 각각의 웰 내의 트롬빈으로 중합시켰다. 다양한 농도의 (TAL6003)-플라스미노겐을 피브린 혈병의 상부에 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 철저하게 세정하였고, 이때 피브린 혈병은 여전히 손상되지 않고 웰에 부착되었다. 세정 후, tPA의 0.1 ㎎/㎖ 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 결과적으로, 일부 혈병은 완전히 용해되었고, 일부는 부분적으로 용해된 한편, (TAL6003)-플라스미노겐의 양이 매우 낮은 웰 및 대조군 웰은 사실상 손상되지 않고 남아있었다. 1 M NaOH에서 재구성된 초기 혈병의 잔여물의 280 nm 흡광도를 측정함으로써 피브린용해 정도를 모니터링하였다. 흡광도 값을 (TAL6003)-플라스미노겐 농도의 함수로서 플롯팅하였다.

도 8에 제시된 바와 같이, 피브린에 대한 (TAL6003)-플라스미노겐의 결합은 고전적인 S자형 결합 곡선을 따랐다. 이러한 분석법을 사용하여, (TAL6003)-플라스미노겐이 전장 플라스미노겐의 친화도에 필적하는 친화도로 피브린에 결합하고, 이러한 상호작용의 C₅₀ (약 0.3 μM)이 전장 플라스미노겐의 피브린-결합의 K_d에 필적하는 것으로 발견되었다.

이러한 실험들은 (TAL6003)-플라스미노겐이 피브린에 결합할 수 있다는 것을 가리킨다. 추가로, 적어도 (TAL6003)-플라스미노겐의 라이신-세파로스와의 상호작용, 예상된 Kd로 εACA에 결합하는 이의 능력, 피브린에 결합하는 이의 능력, 및 플라스미노겐 활성화제에 의해 활성화되는 이의 능력 모두가 이러한 분자가 충분히 기능성인 형태로 대장균 시스템에서 생산되었음을 가리켰다.

( TAL6003 )- 플라스민 정제 및 제형

정제된 (TAL6003)-플라스미노겐 용액에 대한 SK의 첨가는 (TAL6003)-플라스미노겐의 (TAL6003)-플라스민으로의 전환을 실행시킨다. 단백질을 2 ㎎/㎖로 농축하고, 50％ 글리세롤로 1:1 희석하여, 25％ 글리세롤 내의 1 mg/㎖ 용액을 생산하였다. 용액을 실온이 되게 하고, 스트렙토키나제를 SK:(TAL6003)-플라스미노겐 몰비가 1:100이도록 첨가하였다. 교반하지 않으면서 실온에서 4.5시간 동안 반응물을 인큐베이션하였다. 그후, 0.5 M 최종 농도로 NaCl을 첨가하여 반응을 감속시켰다. SDS-PAGE에 의한 활성화의 분석은 활성화된 단백질의 90％ 수율을 가리켰다.

활성화된 (TAL6003)-플라스민을 벤즈아미딘 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 벤즈아미딘 친화성 정제의 목적은 활성화되지 않은 (TAL6003)-플라스미노겐, 및 활성 (TAL6003)-플라스민으로부터의 (TAL6003)-플라스민 분해 생성물이 포함되는 불순물의 정제였다. SK 활성화 용액을 평형화된 벤즈아미딘-세파로스 4 패스트 플로우(Fast Flow) 칼럼에 적용하였다. (TAL6003)-플라스민 (클립형(clipped) 및 무손상 양쪽 모두)은 친화성 수지에 의해 포획된 한편, 상기 언급된 불순물들은 칼럼을 통과하여 흘러갔다. 280 nm에서의 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 칼럼을 평형 완충제로 세정하였다. 그후, 결합된 (TAL6003)-플라스민을 저-pH εACA 단계를 사용하여 용출시켜, 모든 잔존하는 단백질을 칼럼으로부터 제거하였다. 발색성 플라스민 효능 분석법으로 측정시 95％ 활성인 단백질로, 전형적인 수율은 75％였다.

(TAL6003)-플라스민이 전장 플라스민과 유사하게 생리학적 pH에서 자가-분해 경향이 있기 때문에, pH 3.6을 최종 제형용으로 선택하였다 (아세트산-염수로 산성화됨). 거명에 의해 포함된 [Novokhatny et al., J Thromb Haemost., 1(5): 1034-41 (2003)]에 의해 플라스민에 대해 기존에 제시되고, (TAL6003)-플라스민으로의 실험에서 입증된 바와 같이, 이러한 저-완충능, 저-pH 제형은 활성 플라스민의 장기간 동안의 안전한 보관을 허용할 뿐만 아니라, 또한 이러한 직접적인 혈전용해제의 비경구 투여와 상용성이다. 혈장 또는 중성 pH 완충제와 혼합되면, (TAL6003)-플라스민이 신속하게 재활성화된다.

( TAL6003 )- 플라스민의 효소 성질

(TAL6003)-플라스민의 아미드분해 활성을 플라스민 기질인 D-Val-Leu-Lys-p-니트로아닐리드 (S-2251) (DiaPharma (West Chester, OH))를 사용하여 시험하였다.

PBS 완충제 내의 pH 7.4, 25℃의 (TAL6003)-플라스민에 대해, S-2251에 대한 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수 (K_M)가 또한 141 μM인 것으로 확인되었다 (표 3). 이러한 제제에 대한 kcat은 약 725 분^-1인 것으로 확인되었다. 4-니트로페닐 4-구아니디노벤조에이트 히드로클로라이드 (pNPGB) 적정을 사용하여 ([Chase, T. and E. Shaw, Methods Enzymol. 197:20-27(1970)]), 기능성 활성 부위의 백분율이 67％인 것으로 확인되었다. 활성 부위 백분율에 대한 kcat을 수정하여, 약 725 분^-1의 kcat이 결정되었다. 이러한 값은 동일한 분석법에서 전장 플라스민에 대해 결정된 값인 820 +/- 23 분^-1, 및 마이크로-플라스민 (크링글 5개 모두가 없음)에 대한 값인 795 +/- 24 분^-1에 매우 근접하였다. 이러한 데이터는 크링글의 존재 또는 부재가 세린 프로테아제 도메인의 촉매 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 가리킨다.

플라스민 및 α₂-항플라스민을 혼합한 후 특정 시점에 S-2251 활성에 대해 분석하는 위만 및 콜렌 [Wiman, B. and D. Collen, Eur. J. Biochem. 84:573-578 (1978)]의 방법을 사용하여 α₂-항플라스민에 의한 (TAL6003)-플라스민의 억제 속도가 1.8 ± 0.06 × 10⁷ M^-1s^-1인 것으로 결정되었다 (표 4). 이러한 값은 플라스민에 대한 보고값인 2.5 × 10⁷ M^-1s^-1 ([Anonick, et al., Thrombosis Res. 59:449 (1990)])에 필적한다.

마이크로-플라스민으로 수행된 동일한 실험은 2회의 별도의 실험에서 1.8 × 10⁵ M^-1s^-1 및 3.1 × 10⁵ M^-1s^-1의 α₂-항플라스민 억제 속도를 나타냈다. 미니-플라스민 (미니-플라스민 도메인 조성물, K5-SP)의 α₂-항플라스민 억제 속도는 2.4 × 10⁵ M^-1s^-1인 것으로 결정되었다. 이러한 데이터는 마이크로- 및 미니-플라스민에 대한 문헌 값과 합당하게 일치하고, α₂-항플라스민에 의한 (TAL6003)-플라스민의 억제가 마이크로-플라스민 또는 미니-플라스민에 의한 억제보다 40배 더 빠르다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 결과들은 (TAL6003)-플라스민이 이의 구조 내의 크링글 1의 존재로 인해 α₂-항플라스민에 의해 신속하게 억제될 것임을 가리킨다. 전체적으로, 본 섹션에서 제시된 데이터는 (TAL6003)-플라스민의 효소적 및 억제성 성질이 전장 플라스민과 유사하다는 것을 나타낸다.

문헌 값들은 [Anonick, et al., Thrombosis Res. 59:449(1990)]로부터 수득된다. 모든 속도는 [Anonick, et al.]에서 공개된 방법에 따라 측정하였다.

시험관내 피브린용해 효능

(TAL6003)-플라스민의 피브린용해 효능을 하기의 실험 프로토콜을 사용하여 혈병 용해 분석법의 시험관내 모델에서 테스트하였다.

(TAL6003)-플라스민과 혈장-유래 플라스민의 혈전용해 효능의 시험관내 비교. 등몰량의 혈장-유래 플라스민 (0.25 ㎎/㎖) 및 (TAL6003)-플라스민 (0.11 ㎎/㎖)을 시험관 내의 혈병과 혼합하고, 혈병 용해 정도를 혈병으로부터 방출되는 물질의 A₂₈₀ 흡광도에 의해 모니터링하였다.

피브린의 존재 하에 혈장 억제제를 극복하고 혈병 용해를 시작하는데 필요한 플라스민 또는 (TAL6003)-플라스민의 농도가 도 9에서 제시된다.

SEQUENCE LISTING <110> Talecris Biotherapeutics, Inc. Novokhatny, Valery <120> Recombinantly Modified Plasmin <130> T126 1190.PCT <150> US 60/991,148 <151> 2007-11-29 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding a polypeptide having a single N-terminal kringle domain homologous to a kringle domain of a native human plasminogen <400> 1 atgcgtgatg tcgtcttatt cgagaagaaa gtctatttat ctgaatgtaa aacaggcaat 60 ggtaaaaact atcgcggtac catgtccaaa acaaaaaacg gtatcacttg tcaaaaatgg 120 tctagcactt caccccatcg tcctcgtttc tcccctgcga cccatccctc tgaaggcctc 180 gaagaaaact actgccgcaa ccccgataat gatcctcaag gcccatggtg ttatactacc 240 gatcctgaaa aacgttatga ctattgcgat gtcccacaat gcgcagcccc ttcttttgat 300 tgcggcaaac cacaagttga acccaagaaa tgtccaggtc gtgttgtcgg cggttgtgtt 360 gcgcatcccc acagttggcc gtggcaggtc tcattacgta cccggtttgg aatgcacttt 420 tgtggcggca ctctcatctc gcccgaatgg gttcttacag ctgcacactg tttggaaaaa 480 agcccccgtc cttcttctta taaagttatc ctcggcgcac atcaagaagt caatttagaa 540 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Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr 50 55 60 Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr 65 70 75 80 Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro 100 105 110 Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp 115 120 125 Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr 130 135 140 Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys 145 150 155 160 Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu 165 170 175 Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe 180 185 190 Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn 210 215 220 Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu 225 230 235 240 Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro 245 250 255 Val Ile Glu Asn Lys 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ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220 tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280 ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340 ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400 acttggattg agggagtgat gagaaataat 2430 <210> 4 <211> 810 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 1 5 10 15 Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu 35 40 45 Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe 50 55 60 Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg 65 70 75 80 Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys 85 90 95 Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg 100 105 110 Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser 115 120 125 Ser Thr Ser Pro His Arg Pro 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Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln 85 90 95 Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala 100 105 110 His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly 115 120 125 Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr 130 135 140 Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val 145 150 155 160 Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu 165 170 175 Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala 180 185 190 Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro 195 200 205 Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys 210 215 220 Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg 245 250 255 Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly 260 265 270 His Leu Ala Gly Gly 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Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met 115 120 125 His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala 130 135 140 Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile 145 150 155 160 Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile 165 170 175 Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu 180 185 190 Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala 195 200 205 Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe 210 215 220 Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu 225 230 235 240 Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr 245 250 255 Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His 260 265 270 Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 275 280 285 Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp 290 295 300 Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val 305 310 315 320 Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 325 330 <210> 11 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Kringle1 <222> (1)..(79) <400> 11 Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr 1 5 10 15 Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg 20 25 30 Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 50 55 60 Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys 65 70 75 <210> 12 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Kringle2 <222> (1)..(78) <400> 12 Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala 20 25 30 His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr 50 55 60 Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg Cys 65 70 75 <210> 13 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Kringle3 <222> (1)..(78) <400> 13 Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr 1 5 10 15 Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr 20 25 30 His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr 50 55 60 Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys 65 70 75 <210> 14 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Kringle4 <222> (1)..(78) <400> 14 Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg 20 25 30 His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn 35 40 45 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr 50 55 60 Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys 65 70 75 <210> 15 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Kringle5 <222> (1)..(80) <400> 15 Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg 20 25 30 His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys 35 40 45 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr 50 55 60 Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys 65 70 75 80

Claims (27)

1. a) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글(kringle) 도메인과 상동성이고, 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인 단일 N-말단 크링글 도메인; 및
   b) 인간 플라스미노겐 내의 상응하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제(protease) 도메인
   을 가지며 고정된 라이신에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, 단일 N-말단 크링글 도메인이 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4와 상동성인 것인 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 2에 제시된 서열에 대해 90％ 또는 95％, 또는 98％ 이상 동일한 것인 폴리뉴클레오티드.
4. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 2에 제시된 서열에 대해 98％ 이상 동일한 것인 폴리뉴클레오티드.
5. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 2에 제시된 서열인 폴리뉴클레오티드.
6. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 서열 1에 제시된 서열, 또는 이의 동의성(degenerate) 변이체인 폴리뉴클레오티드.
7. 제1항에 있어서, 단일 N-말단 크링글 도메인이 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4 도메인에 대해 90％ 이상 동일하고, C-말단 도메인이 인간 플라스미노겐의 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인에 대해 90％ 이상 동일한 것인 폴리뉴클레오티드.
8. 제1항에 있어서, 고정된 라이신이 라이신-아가로스, 라이신-하이드로겔, 라이신-가교 아가로스로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 지지체 매트릭스에 결합된 라이신인 폴리뉴클레오티드.
9. 제8항에 있어서, 고정된 라이신이 라이신-가교 아가로스인 폴리뉴클레오티드.
10. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 피브리노겐에 대한 미니-플라스민의 결합 친화도보다 더 낮은 피브리노겐에 대한 결합 친화도를 나타내는 것인 폴리뉴클레오티드.
11. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 부분적으로 절단된 피브린에 대한 미니-플라스민의 결합 친화도보다 더 높은 부분적으로 절단된 피브린에 대한 결합 친화도를 나타내는 것인 폴리뉴클레오티드.
12. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 그의 1차 아미노산 서열과 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 기준 폴리펩티드에 비해 감소된 면역원성을 갖고, 단 기준 폴리펩티드의 단일 N-말단 크링글 도메인의 마지막 4개의 아미노산 잔기는 V, P, Q 및 C가 아닌 폴리뉴클레오티드.
13. a) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성이고, 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인 단일 N-말단 크링글 도메인; 및
    b) 인간 플라스미노겐 내의 상응하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인
    을 포함하고, 고정된 라이신에 결합하는 폴리펩티드.
14. 제13항에 있어서, 단일 N-말단 크링글 도메인이 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4와 상동성인 것인 폴리펩티드.
15. 제13항에 있어서, α₂-항플라스민에 의한 미니-플라스민의 피브린용해 활성의 억제 속도보다 약 5배 이상 더 빠른 억제 속도로 α₂-항플라스민에 의해 억제되는 피브린용해 활성을 나타내는 폴리펩티드.
16. 제15항에 있어서, 억제 속도가 미니-플라스민의 억제 속도보다 약 10배, 20배, 30배, 또는 40배 이상 더 빠른 폴리펩티드.
17. 제13항에 있어서, 서열 2에 제시된 서열에 대해 90％ 또는 95％, 또는 98％ 이상 동일한 폴리펩티드.
18. 제13항에 있어서, 단일 N-말단 크링글 도메인이 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4 도메인에 대해 90％ 이상 동일하고, C-말단 도메인이 인간 플라스미노겐의 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인에 대해 90％ 이상 동일한 것인 폴리펩티드.
19. 제13항에 있어서, 단일 N-말단 크링글 도메인의 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 1 또는 크링글 4와의 아미노산 서열 동일성이 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 5와의 아미노산 서열 동일성 보다 1개 이상의 잔기만큼 더 크고, 인간 플라스미노겐의 크링글 1 및 4의 천연 서열과 비교하여 단일 N-말단 크링글 도메인의 보존적 치환은 크링글 5와의 동일성 비교 목적을 위해 천연 서열과 상이한 것으로 간주되지 않는 것인 폴리펩티드.
20. 제13항에 있어서, 서열 2에 제시된 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환물을 갖는 폴리펩티드.
21. 제13항에 있어서, 서열 2에 제시된 아미노산 서열의 위치 85의 것과 유사한 상대적인 위치에 아르기닌 잔기를 갖는 폴리펩티드.
22. 제13항에 있어서, 폴리펩티드의 1차 아미노산과 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 기준 폴리펩티드에 비해 감소된 면역원성을 가지며, 단 기준 폴리펩티드의 단일 N-말단 크링글 도메인의 마지막 4개의 아미노산 잔기는 V, P, Q 및 C가 아닌 폴리펩티드.
23. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
24. 제23항의 발현 벡터를 포함하는 배양된 세포.
25. a) 천연 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인과 상동성이고, 크링글 도메인 내의 마지막 4개의 아미노산 잔기가 V, P, Q 및 C인 단일 N-말단 크링글 도메인, 및 인간 플라스미노겐 내의 상응하는 도메인과 상동성인 C-말단 도메인 활성화 부위 및 세린 프로테아제 도메인을 가지며, 고정된 라이신에 결합하는 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및
    b) 단계 a)에서 제공된 폴리펩티드를 하나 이상의 펩티드 결합이 절단되어 N-말단들이 상이한 하나 이상의 재조합 플라스민 폴리펩티드를 형성하기에 충분한 조건 하에 프로테아제와 접촉시키는 단계
    를 포함하는, N-말단들이 상이한 하나 이상의 재조합 플라스민 폴리펩티드의 제조 방법.
26. 제25항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 제공 단계가 서열 1에 제시된 DNA 서열 또는 이의 동의성(degenerate) 변이체를 대장균에서 발현시키는 것을 포함하는 방법.

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