KR20100044885A

KR20100044885A - Ｆｏｘｍ１ 펩티드 및 이를 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20100044885A
Application number: KR1020107005389A
Authority: KR
Inventors: 야스하루 니시무라; 카즈노리 요코미네; 타쿠야 쯔노다; 유스케 나카무라
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-08-20
Filing date: 2008-08-12
Publication date: 2010-04-30
Also published as: AU2008290049A1; JPWO2009025196A1; EP2189471B1; CN101835792A; CN104774261A; KR101543624B1; MX2010002002A; CN108117584B; BRPI0815577A2; EP4032899A1; CA2696597C; US20150265689A1; SG183717A1; US20110195081A1; CN101835792B; EP2189471A1; US9415096B2; RU2487886C2; EP3263585A2; CN104774261B

Abstract

본 발명의 목적은 HLA-A2에 결합함으로써 암 세포-손상 인간 킬러 T 세포를 활성화 하는 FOXM1-파생된 펩티드를 확인함으로써, 일본인 중에서 포크헤드 박스(forkhead box M1, FOXM1)을 높게 발현하는 대략 30% 정도의 다양한 암 환자를 표적으로 하는 암 면역 치료법의 수단을 제시하는 것이다. 본 발명은 하기의 (A) 또는 (B)의 펩티드를 제공한다:
(A) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;
(B) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가되고, 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 상기 펩티드.

Description

ＦＯＸＭ１ 펩티드 및 이를 포함하는 약학적 조성물{FOXM１ peptide and medicinal agent comprising the same}

본 발명은 포크헤드 박스 엠1(forkhead box M1, FOXM1)이 과발현되는 담관암, 폐암 및 췌장암과 같은 암에 대한 효과적인 백신으로 유용한 신규한 펩티드, 및 암 치료 및 예방을 위한 상기 펩티드를 포함하는 약물에 관한 것이다.

담도암(담낭암 및 담관암) 사망 수는 일본에서 증가하고 있으며, 2005년에 16,586명이 사망하였다. 대부분의 담관암 사례에서, 초기 단계에서 자가 증상이 존재하지 않는다. 위암 및 대장암과 같은 소화관 내부에 형성되는 암과 비교하면, 담관암의 정확한 가시화 및 진단학적 이미지화는 어렵다. 그러므로, 담관암의 초기 감지가 어려우며, 발견하였을 때, 암은 종종 이미 진행되어있으며, 제거할 수 없다. 수술 치료 이외에, 방사선 치료 및 화학 치료가 담관암 치료를 위해서 수행되고 있으나, 이들은 치료학적으로 효과적이지 않으므로, 새로운 치료학적 방법의 수립이 시급히 필요하다.

또한, 폐암 사망이 일본에서 증가하고 있으며, 2005년에 62,063명이 상기 암으로 사망하였다. 현재, 폐암의 일본에서 19.0%의 암 사망률을 차지하고, 2000년 이후로, 암 사망의 주요 원인이 되었다. 흡연은 폐암 발병의 주요 원인으로 알려져 있다. 흡연 이외에, 석면 또는 라돈(radon) 가스의 흡입 또한 폐암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 금연이 권장되고 있으며, 건강 검진이 폐암을 예방하기 위한 수단으로 수행되고 있다. 그러나, 비록 흡연이 감소하고 있으나, 여전히 흡연 인구는 일본에서 2005년에 약 3천만 명에 달한다. 더욱이, 근래, 건강검진 중에 널리 수행되고 있는 간단한 흉부 X-ray 촬영 및 가래검사는 폐암의 조기 진단에 유용하지 않으며, 이에 따라 이런 방법이 암 사망의 감소를 이끌어내지 못하고 있다. 상기를 고려하면, 폐암 사망의 수는 미래에 꾸준히 증가할 것으로 예측된다.

폐암의 증상은 기침, 혈액 가래, 숨가빠짐 및 흉부 통증이 포함되나, 대부분의 경우, 증상은 초기 단계에 나타나지 않는다. 증상이 나타났을 때, 암은 대부분의 경우 이미 진행되어있다. 그러므로, 과반수 이상의 환자는 암을 처음 발견하였을 때, 수술할 수 없으며, 그래서 다루기 힘든 암의 하나로 여겨지고 있다. 수술 후의 회복률은 다른 암과 달리 좋지 않으며, 수술 후 전체적으로 5년 생존율은 거의 50%가 못된다. 최근 몇 년간, 초기 단계 폐암의 5년 생존율은 비록 방사선치료, 화학 치료 및 이와 동반된 주 치료로서 수술 절제와 같은 다양한 치료방법의 발전의 결과로 증가하였다; 그러나, 말기 폐암을 위한 치료학적 효과의 발전은 미비하고, 새로운 치료학적 전략의 수립이 시급히 필요하다.

또한, 췌장암 사망의 수가 일본에서 증가하고 있으며, 2005년에 22,927명이 상기 암으로 죽었다. 현재, 췌장암은 일본에서 암 사망의 7%를 차지하며, 폐암, 위암, 대장암 및 간암을 이어서 5번째 순위이다. 췌장암 특이적인 증상은 없으며, 대부분의 경우 증상이 나타났을 때, 상기 암은 이미 진행되어있다. 심지어 오늘날 진단학적 이미징(imaging)의 발전이 있으나, 대략 총 일본 췌장암 환자의 40%는 진행된 전이가 있는 후기 사례이며, 많은 환자들이 국소적으로 진행된 제거할 수 없는 암을 가진 것으로 발견된다. 그러므로, 환자의 총 5년 생존율은 5% 또는 그 이하이고, 수술 후의 예후가 매우 좋지 않다. 진단학적인 어려움 때문에, 암 사망의 원인으로서 췌장암의 발병은 점차 특정 선진국에서 증가하고 있다. 비록 방사선 치료, 화학 치료 및 이와 동반된 주 치료로서 수술 절제와 같은 다양한 치료방법이 현재 수행되고 있으나, 상기 치료효과에 있어서 현저한 회복은 없으며, 새로운 치료학적 전략의 수립이 시급히 필요하다. 흡연, 비만, 식이, 알코올 음용 및 커피 음용과 같은 생활 습관뿐만 아니라 만성췌장염, 당뇨병, 유전적 요소 등을 포함하는 다양한 요소들이 췌장암 발병을 일으키는데 관여하는 것으로 제시되었다.

반면, 분자 생물학 및 암 면역학에 있어서 근래의 발전은 세포독성(킬러) 세포 및 헬퍼 T 세포가 암 세포에서 특이적으로 과발현되는 단백질의 분해에 의해서 생성하는 펩티드를 인식하고, HLA 분자를 통해서 암 세포 또는 항원 제시 세포의 표면에서 제시되고, 면역반응을 일으켜 암 세포를 파괴한다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 암을 공격하는 이러한 면역반응을 자극하는 상당수의 암 항원 단백질 및 이로부터 파생된 펩티드가 동정 되었고, 항원 특이적 암 면역치료법이 임상학적으로 적용되고 있다.

HLA 클래스 Ⅰ분자는 신체의 모든 유핵세포의 표면에서 발현한다. 이는 세포질 또는 핵에서 생성되는 단백질의 세포 내 분해에 의하여 생성되는 펩티드와 결합하고, 상기 세포의 표면에 상기 펩티드를 발현시킨다. 정상 세포의 표면에서는, 정상 자가조직 단백질에서 파생된 펩티드가 HLA 클래스 Ⅰ분자와 결합하고, 면역체계의 T 세포에 의해서 인식되지 않고, 파괴되지 않는다. 반면, 암의 발병과정에서, 암 세포는 간혹 정상세포에서 거의 또는 전혀 발현되지 않는 단백질들을 대량 발현한다. HLA 클래스 Ⅰ 분자가 암 세포에 특이적이며 과발현되는 단백질의 세포 분해로 인해서 생성된 펩티드와 결합하고, 상기 펩티드를 암 세포의 표면에 발현시키면, 킬러 T 세포는 오직 상기 암 세포만을 인식하고 파괴한다. 이러한 암 특이적 항원 또는 펩티드를 개체에 투여함으로써, 암 세포는 파괴될 수 있으며, 암 성장은 정상세포에 해를 끼치지 않고 억제될 수 있다. 이를 암 특이적 항체를 이용한 암 면역치료법이라고 부른다. HLA 클래스 Ⅱ 분자는 주로 항원제시 세포의 표면에 발현한다. 상기 분자는 상기 세포 밖에서 항원 제시 세포로 유입된 암 특이적 항원의 세포 내 분해에 의해서 생성된 암 특이적 항원으로부터 파생된 펩티드와 결합하고, 상기 세포의 표면에 상기 펩티드를 발현시킨다. 이들을 인식하는 헬퍼(helper) T 세포는 활성화되고, 다른 면역적격 세포를 활성화하는 다양한 사이토카인(cytokine)을 생성함으로써, 암에 대한 면역 반응을 유도 또는 강화한다.

이에 따라, 만약 암에서 특이적이고 과발현되는 항원을 표적으로 하는 면역치료법이 개발된다면, 이러한 치료법은 정상 자가 기관에 아무런 해도 끼치지 않으면서 암 세포만을 효과적으로 제거할 수 있을 것이다. 이는 또한 상기 치료법이 다른 치료를 더 이상 적용할 수 없는 말기 암 환자에게 적용될 수 있을 것이라고 예상된다. 게다가, 암 특이적 항원 및 펩티드를 암 발달의 높은 위험을 가진 개체에게 백신으로서 미리 투여됨으로써, 암의 발전을 막을 수 있을 것이다.

본 발명자들은 우선 게놈-범주 유전자 발현 분석을 27,648명의 인간 유전자에 cDNA 마이크로에레이를 이용하여, 25건의 간내 담관암 사례 및 배아 시기를 포함하는 다양한 정상조직에서 이러한 유전자의 발현 패턴을 조사하였다. 그 결과, 본 발명자들은 포크헤드 박스 엠1(Forkhead box m1, FOXM1)(GenBank Accession No. NM_202003)이 상당수의 간내 담관암에서 과발현되고 있음을 발견하였다. 간내 남관암사례에 추가적이며 유사하게, FOXM1은 대부분의 폐암, 방광암 및 췌장암의 대부분의 사례에서 과발현되고 있음이 발견되었다. 더욱이, FOXM1의 과발현은 자궁 경부암, 난소암, 악성 림프종, 유방암, 위암, 식도암, 전립선암, 간암, 대장암 및 만성 골수성 백혈병과 같은 다양한 암의 40% 또는 그 이상에서 발견되었다. 이러한 사실은 FOXM1이 암 특이적 항원으로 다양한 암에서 역할을 수행할 수 있음을 제공한다. FOXM1은 배아의 간 및 정상 성인 기관에서 발현되며, 위, 소장 및 대장과 같은 소화관, 흉선 및 정소에서는 소량 발현한다; 그러나, 발현 수준은 암이 있는 부분에 비해서는 확연히 낮다.

FOXM1이 암의 시작과 관련되고 세포의 증식에 관련된다는 것을 지시하는 문헌의 예는 비특허 문헌 1에서 10에 포함되어있다. 그러나, 상기 문헌에서 FOXM1을 암에 대한 백신으로 이용한 것을 기술한 것은 없다.

Yoshida Y, Wang I-C, Yoder HM, Davidson NO, Costa RH.: The forkhead box M1 transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer. Gastroenterology 132: 1420-1431, 2007. Gusarcova GA, Wang I-C, Major ML, Kalinichenko VV, Ackerson T, Petrovi V, Costa RH.: A cell-penetrating ARF peptide inhibitor of FOXM1 in mouse hepatocellular carcinoma treatment. J. Clin. Invest. 117: 99-111, 2007. Radhakrishnan SK, Bhat UG, Hughes DE, Wang I-C, Costa RH, Gartel AL.: Identification of a chemical inhibitor of the oncogenic transcription factor forkhead box M1. Cancer Res. 66: 9731-9735, 2006. Takahashi K, Furukawa C, Takano A, Ishikawa N, Kato T, Hamaya S, Suzuki C, Yasui W, Inai K, Sone S, Ito T, Nishimura H, Tsuchiya E, Nakamura Y, Daigo Y.: The neuromedin U-growth hormone secretagogue receptor 1b/neurotensin receptor 1 oncogenic signaling pathway as a therapeutic target for lung cancer. Cancer Res. 66: 9408-9419, 2006. Kim I-M, Ackerson T, Ramakrishna S, Tretiakova M, Wang I-C, Kalin TV, Major ML, Gusarova GA, Yoder HM, Costa RH, Kalinichenko VV.: The forkhead box m1 transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer. Cancer Res. 66: 2153-2161, 2006. Wonsey DR, Folletie M.: Loss of the forkhead transcription factor FoxM1 causes centrosome amplification and mitotic catastrophe. Cancer Res. 65: 5181-5189, 2005. Obama K, Ura K, Li M, Katagiri T, Tsunoda T, Nomura A, Satoh S, Nakamura Y, Furukawa Y: Genome-wide analysis of gene expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology 41: 1339-1348, 2005. Laoukili J, Kooistra MRH, Bras A, Kauw J, Kerkhoven RM, Morrison A, Clevers H, Medema RH.: Foxm1 is required for execution of the mitotic programme and chromosome stability. Nature Cell Biol. 7: 126-136, 2005. Kalinichenko VV, Major M, Wang X, Petrovic V, Kuechle J, Yoder HM, Shin B, Datta A, Raychaudhuri P, Costa RH.: Foxm1b transcription factor is essential for development of hepatocellular carcinomas and is negatively regulated by the p19ARF tumor suppressor. Genes Dev. 18: 830-850, 2004. Wang X, Kiyokawa H, Dennewitz MB, Costa RH.: The forkhead box m1b transcription factor is essential for hepatocyte DNA replication and mitosis during mouse liver regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16881-16886, 2002.

본 발명의 목적은 담관암, 폐암, 췌장암 등을 위한 치료학적 방법으로 수행되는 수술 치료, 화학 치료 및 방사선 치료 등에 의해서 치료되기 어려운 전이성 또는 불응성 암을 위한 새로운 치료학적 방법으로서 암 환자의 항암 면역력을 높임으로써 암 성장을 억제하는 면역 치료를 수행할 수 있는 수단을 개발하는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 암 특이적이고 과발현되는 단백질로부터 파생되고, 환자에게 부작용을 유발하지 않으면서 상기 언급한 암에 대한 강력한 면역 반응을 유도하는 펩티드를 확인하고, 이러한 펩티드들을 암 면역치료법에 적용하는 데에 있다. 본 발명은 상기 언급한 암에서 특이적이고 과발현되는 단백질로부터 파생되고 HLA-A2에 의해서 킬러 T 세포로 제시되는 펩티드를 동정함으로써, 상기 언급한 암을 가진 대략 30%의 일본인을 위한 면역 치료를 가능하게 한다.

본 명세서에서, 본 발명자들은 인간 CD8 양성 킬러 T 세포를 HLA-A2 결합 모티프(motif)를 가진 인간 FOXM1 펩티드로 자극된 인간 말초 혈액 단핵 백혈구로부터 유래된 수지상 세포와 공동 배양함으로써 시험관 내에서 자극함으로써 FOXM1 펩티드에 특이적인 킬러 T 세포를 유도하였다. 각각의 FOXM1 펩티드에 대해서 특이적으로 킬러 T 세포를 유도하는지의 여부를 ELISPOT 분석를 이용하여, HLA-A2에 의해서 제시되는 상기 펩티드를 인식하여 활성화되는 킬러 T 세포에 의해서 생성되는 감마-인터페론(γ-interferon, IFN-γ)을 감지함으로써 측정하였다. 그 결과, 면역치료법으로 활용가능한 강력한 후보 표적 항원인 새로운 FOXM1 펩티드가 동정되었다. 더욱이, 상기 언급한 펩티드를 이용하여 유도된 FOXM1-반응성 CTLs가 내인성 FOXM1 및 HLA-A2 분자를 발현하는 암세포에 대해서 특이적인 세포독성이 있으며, CTLs는 HLA 클래스 Ⅰ에 제한적인 방식으로 표적 세포를 인식한다는 것을 밝혔다.

더욱 구체적으로, 본 발명은 하기를 제공한다:

[1] 하기의 (A) 또는 (B)의 펩티드

(A) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;

(B) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하고, 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 펩티드;

[2] 상기 [1]의 펩티드에서, N 말단에서 두 번째 아미노산은 루신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)이다;

[3] 상기 [1]의 펩티드에서, C-말단 아미노산이 발린(valine) 또는 루신이다;

[4] 하나 또는 다수의 [1]의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암에 대한 면역 유도제;

[5] 하나 또는 다수의 [1]의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 치료 및/또는 예방을 위한 유도제;

[6] 하나 또는 다수의 [1]의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도제;

[7] [1]의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도제;

[8] 하나 또는 다수의 [1]의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 세포독성(킬러) T 세포 유도제;

[9] [1]의 펩티드에 대한 항체;

[10] [1]의 펩티드를 이용하여 유도된 세포독성(킬러) T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군;

[11] [1]의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 항원 제시 세포;

[12] 상기 [11]의 항원 제시 세포는 [6] 또는 [7]의 약제에 의해서 유도된다;

[13] [1]의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 엑소솜(exosome);

[14] [13]의 엑소솜에 있어서, HLA 항원은 HLA-A2 (HLA-A*0201)인 것을 특징으로 하는 엑소솜;

[15] 항원 제시 세포를 [1]의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포를 유도하는 방법;

[16] [1]의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원 제시 세포에 도입하는 단계를 포함하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포를 유도하는 방법;

[17] T 세포를 [1]의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 방법;

또한, 본 발명은 하기를 제공한다:

[18] [1]의 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암에 대한 면역 유도 방법;

[19] [1]의 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 예방 방법;

[20] 암에 대한 면역 유도제의 제조를 위한 [1]의 펩티드의 용도;

[21] 암 치료 및/또는 예방제 제조를 위한 [1]의 펩티드의 용도;

[22] 암에 대한 면역 유도용 [1]의 펩티드;

[23] 암 치료 및/또는 예방용 [1]의 펩티드.

도 1은 ELISPOT 분석 및 세포독성 검사 결과는 나타낸다. CD8 양성 T 세포는 HLA-A2 양성 건강한 개체 및 유방암 환자의 말초 혈액으로부터 분리되었다. 각각의 FOXM1 펩티드로 자극된 단핵 백혈구 유래된 수지상 세포로 자극되어 얻어진 킬러 T 세포를 ELISPOT 분석을 이용하여 이들이 상기 FOXM1 펩티드에 특이적으로 반응하며, IFN-γ 생성하는지를 확인하기 위하여 실험하였다. 더욱이, FOXM-1 발현하는 세포가 특이적으로 HLA-A2 제한적 방식으로 손상되는지의 여부를 세포독성 검사로 측정하였다. T2-A2 세포를 ELISPOT 분석에서 표적 세포로서 이용하였다. T2-A2 세포는 TAP 유전자 발현이 결손된 마우스 T2 세포주에 상기 HLA-A2 유전자를 도입시켜 생성된 세포주이다. T2-A2 세포에서 TAP의 결손으로 인해서 HLA-A2 분자 및 외인성으로 첨가된 펩티드로 형성된 복합체가 세포의 표면에 상기 펩티드가 오직 HLA-A2 분자에 대한 결합 능력을 가질 때에만 발현한다. HLA-A2 양성 및 FOXM1을 발현하는 Panc-1 세포와 HLA-A2 음성 및 FOXM1 양성인 PK-8 세포를 세포독성 활성을 측정하기 위하여 사용하였다. 그 결과, FOXM1 362-370, 373-382, 및 640-649 펩티드를 이용하여 두 명의 건강한 개체로부터 유도된 킬러 T 세포는 HLA-A2에 결합된 FOXM1 362-370, 373-382, 및 640-649 펩티드를 인식함으로써 생성되는 IFN-γ를 생성하고, T2-A2 세포에 발현시켰다. 더욱이, 상기 언급한 펩티드를 이용하여 유도된 유방암 환자의 킬러 T 세포는 panc-1 세포에 대하여 강력한 세포 독성 활성을 보이며, PK-8 세포에 대해서는 세포독성 활성을 보이지 않았다. 그러므로, 상기 유도된 킬러 T 세포는 HLA-A2 제한적인 방식으로 특이적으로 FOXM1을 인식함으로써 암 세포주에 대하여 강력한 세포독성 활성을 나타냄을 알아냈다. 상기로부터, FOXM1 362-370, 373-382 및 640-649 펩티드는 FOXM1-특이적 인간 킬러 T 세포를 HLA-A2 제한적 방식으로 유도할 수 있으며, 이러한 킬러 T 세포가 FOXM1-발현 암 세포에 손상을 줄 수 있다는 것을 밝혔다.

본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술의 일반적인 기술의 하나로 통상적으로 이해될 수 있는 의미를 지닌다.

본 발명의 펩티드는 일본인과 백인의 인구집단에서 종종 발견되는 HLA 대립 형질인 HLA-A2에 제한적인 에피토프(epitope)이다. HLA-A2에 대한 결합 친화성을 지표로서 이용하여, FOXM1으로부터 파생된 후보 HLA-A2 결합 펩티드가 선택되었다. 두 명의 건강한 개체에서 FOXM1 362-370, 373-382, 및 640-649 펩티드를 이용하여 유도된 킬러 T 세포는 HLA-A2에 결합된 FOXM1 362-370(YLVPIQFPV (서열 번호: 1)), FOXM1-373-382(SLVLQPSVKV (서열 번호: 2)), 및 FOXM1-640-649(GLMDLSTTPL (서열 번호: 3)) 펩티드를 인식함으로써 IFN-γ를 생성하고, T2-A2 세포에서 발현하였다. 실시예 언급한 펩티드로 유도된 유방암 환자의 킬러의 T 세포는 panc-1에 대하여 강력한 세포독성을 보였으나, PK-8 세포에 대해서는 세포독성 활성을 보이지 않는다. 따라서, 실시예 유도된 킬러 T 세포는 HLA-A 제한적 방식으로 FOXM1을 특이적으로 인식하는 것을 나타냈으며, 암 세포주에 대하여 강력한 세포독성 활성을 나타낸다. 이에 따라, FOXM1-362-370 (YLVPIQFPV (서열 번호: 1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (서열 번호: 2)), 및 FOXM1-640-649 (GLMDLSTTPL (서열 번호: 3))중 어느 하나인 펩티드는 FOXM1 특이적 인간 킬러 T 세포를 HLA-A2 특이적인 방식으로 유도할 수 있으며, 이러한 킬러 T 세포는 FOXM1-발현하는 암 세포에 손상을 줄 수 있다는 것을 밝혔다. FOXM1이 폐암, 담관암 및 췌장암과 아울러 간내 담관암의 대부분에서 과발현되는 것이 밝혀졌다. 더욱이, FOXM1은 자궁 경부암, 난소암, 악성 림프종, 유방암, 위암, 식도암, 전립선암, 간암, 대장암 및 만성 골수성 백혈병과 같은 다양한 암의 40% 또는 그 이상에서 과발현하였다. 이러한 사실은 FOXM1이 다양한 암의 면역치료를 위한 표적으로서 유용함을 보여주고 있다.

(1) 본 발명의 펩티드 및, 이를 포함한 항암 면역 유도제.

본 발명의 펩티드는 하기 (A)에서 (D)중 어느 하나이다:

(A) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;

(B) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나인 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또한 첨가된 펩티드 및 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 펩티드;

(C) N 말단에서 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌인 (B)의 펩티드; 및

(D) C-말단 아미노산이 발린 또는 루신인 (B)의 펩티드.

여기에서, "킬러 T 세포를 유도하는 활성을 보이는 펩티드"란 " 킬러 T 세포 (세포독성 T 세포/CTLs)를 자극하는 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드"를 의미한다.

본 발명의 펩티드는 약 40개 이하의 아미노산을 갖는 에피토프 펩티드로, 바람직하게는 20개 이하이고, 더욱 바람직하게는 15개의 이하이며, 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 킬러 T 세포의 활성을 보인다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드(에피토프 펩티드들)는 킬러 T 세포를 유도하는 능력이 유지되는 한, 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가되는 펩티드를 포함한다. 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가되는 잔기(residue)의 수는 일반적으로 5개 또는 그 이하이며, 바람직하게는 4개 또는 그 이하이고, 더욱 바람직하게는 3개 또는 그 이하, 이보다 더 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산이다.

변형 펩티드들(즉, 원래의 아미노산 서열에 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기들을 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가로 변형되어 얻어진 아미노산 서열을 포함하는 펩티드들)은 원래의 생물학적 활성을 유지한다고 알려져 있다(Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al . (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). 실시예 아미노산 변형은 바람직하게는 원래의 아미노산 서열의 측쇄의 성질은 유지된다. 아미노산 측쇄의 성질의 예는 하기에 나타난다: 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V); 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T); 및 다음의 기능적 그룹 또는 성질을 공통으로 갖는 측쇄: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 수산기를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M); 카르복실산 및 아미드 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기-포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족 고리를 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 괄호 안의 문자들은 아미노산의 한 문자 코드를 나타낸다.

바람직한 실시예에서, 본 발병의 펩티드들(면역원성 펩티드)은 노나펩티드 (nonapeptides)(9-머(mer)) 또는 데카펩티드(10-머)이다.

높은 결합 친화성 및 킬러 T 세포 유도 활성을 가진 펩티드를 얻기 위해서, 천연적으로 생긴 FOXM1의 부분적인 펩티드의 아미노산 서열은 하나, 둘 또는 다수의 아미노산을 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가하여 변형될 수 있다. 여기에서 "다수"란 용어는 5개 또는 그 이하의 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 3개 또는 그 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 2개 또는 그 이하의 아미노산이다. 더욱이, HLA 항원에 대해 높은 친화력이 있는 펩티드 서열의 규칙성이 알려져 있기 때문에(Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), 본 발명의 펩티드들(에피토프 펩티드들)은 HLA 항원들에 대한 친화성을 증가시키기 위해서 규칙성의 근거하여 변형될 수 있다. 예를 들어, HLA-A2에 대한 결합 친화성이 높은 펩티드는 N 말단에서 두 번째 아미노산을 루신 또는 메티오닌으로 치환하여 얻을 수 있다. 유사하게, HLA-A2에 대한 결합 친화성이 높은 펩티드는 C-말단의 아미노산을 발린 또는 루신으로 치환하여 얻을 수 있다.

실시예 에피토프 펩티드의 서열이 다른 기능을 갖는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 일부와 동일할 때, 특정 물질에 대한 자가면역 이상 또는 알레르기 증상과 같은 부작용이 유발될 수 있다. 이러한 부작용을 피하기 위해서, 변형된 에피토프 펩티드는 실시예 알려진 단백질의 아미노산 서열과 일치하면 안 된다. 이러한 목적을 위해서 가능한 데이터베이스를 이용하여 실시예 변형된 에피토프와 100% 상동성을 보이는 다른 기능을 갖는 내인성 또는 외인성 단백질이 없는지 확인하는 상동성 검색을 수행해야할 필요가 있다. 이러한 과정을 수행함으로써, HLA 항원에 대한 결합 친화성을 높이기 및/또는 킬러 T 세포 유도 활성 상승을 위해서 실시예 언급한 아미노산 서열의 변형으로 위험들을 피할 수 있다.

비록 HLA 항원들에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 실시예 언급한 펩티드들이 암 백신으로 매우 유용할 것으로 예측되나, 높은 결합 친화성을 지표로 이용하여 후보 펩티드들을 선택하여 이 펩티드들이 킬러 T 세포 유도 활성을 실제로 하는지 검사할 필요가 있다. 실시예 킬러 T 세포 유도 활성은 다음에 의해서 확인될 수 있다: 인간 MHC 항원(예를 들어, B 림프구, 대식세포 및 수지상 세포)을 갖는 항원 제시 세포를 유도함, 및 더욱 구체적으로 인간 말초혈액 단핵 백혈구에서 유래한 수지상 세포를 유도함; 관심 있는 펩티드로 세포들을 자극함; 그 뒤 CD8 양성 세포들과 혼합함; 및 표적 세포를 향한 세포독성을 측정함. 반응성 체계로서, 인간 HLA 항원(예를 들어, BenMohamed L, et al. (2000) Hum. Immunol. 61(8):764-79, Related Articles, Books, and Linkout에 기재됨)을 발현하는 형질전환 동물들이 사용되었다. 예를 들어, 표적 세포는 ⁵¹Cr 또는 그 외로 방사성 표지를 할 수 있으며, 세포독성은 실시예 표적 세포로부터 방출된 방사능으로 측정될 수 있다. 대안적으로, 표적세포는 측정될 수 있다: 고정된 펩티드를 갖는 항원 제시 세포의 존재하에 킬러 T 세포에 의해서 생성되고 방출되는 IFN-γ를 측정함; 및 안티-IFN-γ 단일클론 항체를 이용하여 배양 배지에 있는 실시예 IFN-γ 생성 부위를 가시화한다.

실시예에 나와있듯이, 펩티드의 실시예 킬러 T 세포 유도 활성를 측정한 결과 HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성이 있는 펩티드가 반드시 킬러 T 세포 유도 활성을 갖지는 않았다. 그러나, FOXM1-362-370 (YLVPIQFPV (서열 번호: 1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (서열 번호: 2)), 및 FOXM1 640-649 (GLMDLSTTPL (서열 번호: 3))의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 노나펩티드들은 특히 높은 킬러 T 세포 유도 활성을 보였다.

상기 기재하였듯이, 본 발명은 킬러 T 세포 유도 활성을 보이는 펩티드, 보다 구체적으로 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나 및 그 변형물들(예를 들어, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열)을 포함하는 펩티드를 제공한다. 바람직하게는 서열 번호: 1 내지 3중 9개 아미노산 및 그 변형물들을 포함하는 상기 펩티드는 다른 내인성 단백질의 아미노산과 일치하지 않는다. 특히, 높은 HLA-A2 결합 친화성을 갖는 펩티드는 N 말단에서 두 번째 아미노산을 루신 또는 메티오닌으로 치환 및/또는 C-말단 아미노산을 발린 또는 루신으로 치환하여 얻을 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 킬러 T 세포 유도 활성을 잃지 않는 한, 당쇄화 (glycosylation), 측쇄 산화 및 인산화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 다른 변형은 예를 들어, 상기 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는데 사용되는 D-아미노산 및 다른 아미노산 유사체를 포함한다.

본 발명의 펩티드를 얻고 생성하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 이들은 화학적으로 합성된 펩티드 또는 유전자 재조합 방법으로 생산된 재조합 펩티드일 수 있다.

화학적으로 합성된 본 발명의 펩티드는 플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법(fluorenylmethyloxycarbonyl method) 및 t-부틸옥시카르보닐 방법(t-butyloxycarbonyl method)등과 같은 화학 합성 방법에 따라 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 다양한 상업적으로 이용가능한 펩티드 합성기를 활용하여 합성될 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 상기 펩티드 또는 이의 변형물 또는 상동물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA들을 얻고, 이 DNA들을 적합한 발현 시스템에 도입하여 재조합 단백질을 생성할 수 있다.

바람직하게 사용되는 발현 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있거나 또는 숙주 세포의 염색체에 들어갈 수 있고, 펩티드-암호화 유전자의 발현이 이루어지는 적절한 위치에 자리 잡은 프로모터를 포함한다. 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 가진 형질전환체는 상기 언급한 발현 벡터를 숙주에 도입함으로써 생성할 수 있다. 상기 숙주는 박테리아, 효모균, 동물 세포 및 곤충 세포의 어느 하나일 수 있으며, 숙주에 따라 알려진 방법을 이용하여 발현 벡터를 숙주에 도입할 수 있다.

본 발명에서, 상기 재조합 펩티드들은 상기 기재된 바와 같이 제조된 형질전환체를 배양하고, 상기 배양에서 상기 펩티드를 생산 및 축적하고, 상기 배양으로부터 상기 펩티드를 수집함으로써 분리될 수 있다.

상기 형질전환체가 E. coli와 같은 원핵생물 또는 효모와 같은 진핵생물일 때, 이러한 미생물을 위한 배양 배지는 미생물들이 이용할 수 있고, 형질전환체가 효과적으로 배양될 수 있는 탄소원, 질소원, 미네랄 등이 포함되어 있는 한, 천연 또는 합성 배지일 수 있다. 상기 배양 조건은 상기 미생물을 배양하는데 사용되는 통상적으로 이용되는 조건들일 수 있다. 배양 후, 본 발명의 펩티드들은 종래의 펩티드를 분리 및 정제하는 방법을 이용하여 상기 형질전환체의 배양액으로부터 분리되고 정제될 수 있다.

서열번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 서열번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 뉴클레오티드 정보에 기반하여 당업자에 의해서 적절히 생성되고 얻어질 수 있다. 특히, 서열번호: 1 내지 3중 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하고, 킬러 T 세포 유도 활성을 보이는 유전자는 화학 합성, 유전 공학 기법 및 돌연변이 생성과 같은 분야의 당업자에게 알려진 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 유전 공학 기술의 하나인 위치-지정 돌연변이 생성 방법은 특정 돌연변이를 특정 위치에 도입할 수 있기 때문에 유용하다. 위치-지정 돌연변이 생성 방법은 Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2^ndEd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989(이하에서는 Molecular Cloning의 2번째 판을 의미함)및 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement1-38, JohnWiley&Sons(1987-1997)(이하에서는 Current Protocols in Molecular Biology를 의미함) 등에 기재된 방법에 따라서 수행될 수 있다.

상기 기재된 본 발명의 펩티드들은 하기 실시예에 나와있듯이, 암에 대한 면역력을 유도할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 포함하는 암에 대한 면역 유도제를 제공한다.

본 발명의 면역 유도제는 둘 또는 그 이상의 에피토프 펩티드들이 혼합된 제형으로 제조될 수 있다. 다양한 종류의 펩티드가 혼합되어 제조된 면역 유도제는 칵테일이거나 또는 표준 기술을 이용하여 상호 결합될 수 있다. 상기 혼합된 에피토프 펩티드들은 동일한 유전자에서 파생된 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 상이한 유전자에서 파생된 아미노산 서열의 펩티드일 수 있다. 본 발명의 펩티드가 투여되었을 때, 상기 투여된 펩티드들은 항원 제시 세포의 HLA 항원에 높은 밀도로 제시되고, 그 뒤에, 상기 투여한 펩티드와 상기 HLA 항원 사이에 형성된 복합체와 특이적으로 반응하는 킬러 T 세포가 유도된다. 대안적으로, 개체로부터 채취된 수지상 세포(또는 본 발명의 펩티드로 자극된 개체에서 모은 자극된 수지상 세포들)를 본 발명의 펩티드와 접촉시킴으로써, 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 항원 제시 세포를 획득할 수 있다. 이러한 항원 제시 세포를 거꾸로 개체에 투여하여, 킬러 T 세포가 상기 개체의 신체에서 유도될 수 있고, 그 결과, 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대한 면역 반응이 강화될 수 있다.

시험관 내 또는 생체 내로 사용될 때, 바람직하게는 시험관 내로 사용될 때, 본 발명의 암에 대한 면역 유도제는 헬퍼(helper) T 세포, 킬러 T 세포 또는 이러한 세포들을 포함하는 면역세포군을 유도하여, 암에 대한 면역력을 유도할 수 있다.

(2) 본 발명(암 백신)의 암 치료 및/또는 예방제(암 백신)

실시예에서 보인 바와 같이, 본 발명의 펩티드들은 암 세포 특이적 킬러 T 세포를 생체 내에서 유도할 수 있다. 반면, 선행발명에서는 FOXM1이 폐암, 담관 세포암, 방광암, 신세포암, 전립선암, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 자궁 경부암, 골육종, 유방암, 연부 조직 육종 및 대장암 등의 대부분에서 과발현된다는 것이 보고된 바 있다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 면역 유도제가 암 치료 및/또는 예방제로 유용할 것으로 예상된다. 즉, 암을 공격하는 킬러 T 세포의 유도 및 활성은 본 발명의 펩티드가 적합한 보조제와 함께 신체에 투여되거나, 또는 수지상 세포와 같은 자극된 항원 제시 세포를 펩티드로 자극하고, 자극된 항원 제시 세포를 신체에 투여함으로써 예상된다. 따라서, 그 결과로 항암 효과가 기대된다. 더욱이, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자는 적합한 벡터에 삽입될 수 있다. 인간 항원 제시 세포(수지상 세포 등) 및 재조합 DNA와 함께 형질 전환된 BCG 결핵군과 같은 박테리아, 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 DNA를 자신의 게놈(genome)에 삽입하는 우두 바이러스와 같은 바이러스는 인간 암 치료 및/또는 예방을 위한 살아있는 백신으로 유용하게 사용될 수 있다. 암 백신의 투여량과 투여 방법은 종래의 천연두 및 BCG 백신과 동일하다.

본 발명에서, 용어 "백신"(소위 면역력 조성물이라고 함)은 동물에게 주사하였을 때, 항암 면역력을 유도하고, 다양한 암을 억제하는 물질을 일컫는다. 본 발명에서, 서열번호:1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드는 FOXM1 제시 세포에 대하여 강하고, 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A2 제한적 에피토프이다. 따라서, 본 발명은 또한 서열번호:1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호:1 내지 3의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 또는 삽입된 이의 변이를 포함하는 펩티드를 이용하여 항암 면역력을 유도하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 항암 면역력은 다음의 면역반응을 포함한다:

(1) FOXM1-발현 세포를 포함하는 암에 대한 킬러 T 세포를 유도,

(2) FOXM1-발현 세포를 포함하는 암을 인식하는 항체를 유도, 및

(3) 항암 사이토카인 생성을 유도.

특정 펩티드가 동물에게 주사하여 이러한 면역 반응들 중 어느 하나가 유도되면, 상기 펩티드는 항암 면역 유도 효과가 있다고 결론내릴 수 있다. 상기 펩티드로 인해서 항암 면역 유도는 상기 펩티드를 넣은 뒤, 숙주의 면역 반응을 시험관 내 또는 생체 내로 관찰하여 발견할 수 있다.

예를 들어, 상기 킬러 T 세포가 유도되는 것을 감지하는 방법은 잘 알려져 있다. 살아있는 개체에 침입한 외부 물질이 T 세포 및 B 세포에 항체 제시 세포(APCs)에 의해서 제시된다. 항원 특이적 방식으로 항원 제시 세포에 의해 제시된 항원에 반응하는 T 세포는 항원에 의한 자극을 통해 킬러 T 세포(소위 세포 독성 T 림프구 또는 CTLs라고 함)로 분화하며, 그 뒤 증식한다. 여기에서, 이러한 과정을 T 세포의 "활성"이라고 부른다. 특정 펩티드에 의해서 킬러 T 세포가 유도되는 것은 펩티드-자극된 항원 제시 세포를 이용하여 T 세포에 상기 펩티드가 제시되고, 킬러 T 세포가 유도됨을 감지하여 측정될 수 있다. 더욱이, 항원 제시 세포는 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, 대식세포, 호산 백혈구 및 NK 세포를 활성화하는 효과가 있다. CD4⁺ T 세포는 항암 면역력에 있어서 중요하기 때문에, 상기 펩티드의 항암 면역 유도 작용은 이러한 세포를 활성화하는 효과를 지표로 이용하여 평가할 수 있다.

수지상 세포(DCs)를 항원 제시 세포로 이용한 상기 킬러 T 세포를 유도 효과를 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원 제시 세포 중, DCs는 가장 강력한 T 세포를 유도 효과를 갖고 있다. 이 방법에 있어서, 우선, 시험용 펩티드를 DCs와 접촉시키고, 그 뒤에 DCs는 T 세포와 접촉시킨다. 표적 세포에 대한 세포 독성 효과를 갖는 T 세포를 DCs와 접촉한 T 세포 중에서 검출한다. 만약 T 세포가 상기 표적 세포에 대해서 세포 독성 효과를 보인다면, 이는 상기 시험용 펩티드가 세포 독성 T 세포를 유도하는 효과를 지니고 있음을 의미한다. 암과 같은 표적 세포에 대한 킬러 T 세포의 활성은 예를 들어 ⁵¹Cr-표지된 암 세포의 용해를 표지로 이용하여 검출할 수 있다. 대안적으로, ³H-티미딘(thymidine) 흡수 활성 또는 LDH(락토오스 디하이드로제나제) 방출을 지표로 암세포의 손상 정도를 측정할 수 있다.

이러한 방법으로 확인된 킬러 T 세포 유도 활성을 갖는 상기 시험용 펩티드는 DC 활성 효과 및 이로 인한 킬러 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드이다. 그러므로 암 세포에 대한 킬러 T 세포 유도 활성을 보이는 상기 펩티드는 FOXM1을 제시하는 암에 대한 백신으로 유용하다. 더욱이, 상기 펩티드와 접촉을 통해서 암에 대하여 킬러 T 세포 유도 활성을 갖게된 항원 제시 세포는 암에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 더욱이, 항원 제시 세포에 의해서 상기 펩티드 제시의 결과로서 얻은 세포독성을 갖는 킬러 T 세포는 또한 FOXM1을 제시하는 암에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 항원 제시 세포 및 킬러 T 세포에 의한 항암 면역력을 이용한 암 치료 방법들을 세포면역치료방법이라고 부른다.

일반적으로, 세포면역치료방법에 펩티드를 이용할 때, 킬러 T 세포를 유도 효율은 상이한 구조를 갖는 다양한 펩티드들을 혼합함으로써 높일 수 있다. 그러므로, 단백질 단편들로 DCs를 자극할 때, 다양한 종류의 펩티드 단편들을 혼합하여 사용하는 것이 유리하다.

펩티드에 의안 항암 면역 유도는 암에 대한 항체 생성 유도를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 실험 동물에게 상기 펩티드로 면역화시킴으로써, 펩티드에 대한 항체가 유도되고, 이 항체가 암 세포의 성장, 분열, 및/또는 전이를 억제한다면, 상기 펩티드는 항암 면역력을 유도한다고 결론지을 수 있다.

항암 면역력은 본 발명의 백신을 투여함으로써 유도될 수 있으며, 상기 항암 면역 유도는 암 치료 및/또는 예방을 가능하게 한다. 암 치료 및/또는 암 발달의 예방의 효과는 암 세포 성장의 저해, 암 세포의 퇴행 및 암 세포 발달의 억제를 포함한다. 암 유발자의 사망률 감소, 혈액 내 암 표지자의 감소 및 암과 관련된 감지할 수 있는 증상의 감소 역시 암 치료 및/또는 예방의 효과에 포함된다. 암에 대한 백신의 치료학적 및/또는 예방 효과는 바람직하게는 백신을 투여받지 않은 대조군의 효과에 비해서 통계적으로 유의하다. 예를 들어, 상기 효과는 바람직하게는 5% 또는 그 이하의 유의적인 차이가 관찰된다. Student t-test, Mann-Whitney U test 및 ANOVA와 같은 통계학적 방법이 통계적인 유의성을 결정짓는데 사용될 수 있다.

본 발명에서, 개체는 바람직하게는 포유류이다. 포유류의 예는 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 및 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 펩티드는 개체에 생체 내 또는 엑스 비보(ex vivo)로 투여할 수 있다. 더욱이, 암 치료 및/또는 예방용 면역원성 조성물을 생성하기 위해서, 본 발명의 면역원성 펩티드, 즉 서열 번호:1 내지 3의 아미노산 서열로부터 선택된 노나펩티드 및 이의 변형 펩티드를 사용할 수 있다.

더욱 구체적으로는, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함한 암 치료용 또는 암의 성장, 전이 등을 예방용 약제를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 특히 구체적으로 췌장암, 담관암, 위암, 대장암, 비소 세포 폐암, 고환함, 자궁 경부암, 골육종 및 연부 조직 육종과 같은 암 치료에 유용하다.

본 발명의 펩티드는 보편적인 제형 방법으로 제형화된 약제로 개체에 직접 투여할 수 있다. 이러한 제형은 본 발명의 펩티드뿐만 아니라 필요할 경우 약학적으로 허용가능한 담체, 참가제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제는 다양한 암 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

더욱이, 세포의 면역력을 효과적으로 확립하기 위해서, 보조제는 하나 혹은 다수의 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 치료 및/또는 예방용 약제에 혼합될 수 있다. 상기 약제는 항암제와 같은 다른 유효성분과 공동 투여될 수 있다. 또한, 적합한 제형은 과립을 포함한다. 적합한 보조제는 문헌(Johnson AG. (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7:277-89)에 기재되어 있다. 보조제의 예로는 Freund's incomplete 보조제, BCG, 트레할로스 디미콜레이트(trehalose dimycolate, TDM), 지질다당체(LPS), 황산알루미늄칼륨 보조제, 실리카 보조제, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄 및 명반을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더욱이 리포솜 제형, 약제가 수 마이크로미터의 직경을 갖고 있는 비드에 결합된 과립 제형, 및 지질이 상기 언급한 펩티드에 결합된 제형이 편리하게 사용될 수 있다. 투여방법은 경구투여, 피내 주사, 피하 주사, 정맥 주사 등이 될 수 있으며, 표적 암 근처의 국소 투여 및 전신 투여를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩티드의 투여량은 치료할 병, 환자의 나이 및 몸무게, 투여방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 상기 투여량은 보통 0.001 ㎎ ~ 1000 ㎎이고, 바람직하게는 0.01 ㎎ ~ 100 ㎎이며, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎎ ~10 ㎎이다. 바람직하게, 투여는 수일에서 수개월에 한 번씩 시행되나, 당업자가 적절한 투여량 및 투여방법을 손쉽게 결정할 수 있고, 이러한 기준의 선택과 최적화가 종래의 기술 범위 안에서 이루어진다. 상기 제형의 형태는 특별히 한정되지 않으며, 동결 건조될 수 있으며, 또는 당과 같은 첨가제를 첨가하여 과립화 될 수 있다.

킬러 T 세포의 유도 활성을 증가시키는 본 발명의 약제에 첨가될 수 있는 보조제에는 BCG 박테리아의 구성요소 및 무라밀 디펩티드(MDP), Nature, vol. 344, p873 (1990)에 기재되어 있는 ISCOM, J. Immunol. vol. 148, p1438 (1992)에 기재되어 있는 사포닌 계열의 QS-21, 리포솜, 및 수산화 알루미늄과 같은 물질을 포함한다. 더욱이, 렌티난(lentinan), 시조피란(sizofiran) 및 피시바닐(picibanil)과 같은 면역 자극제를 보조제로서 사용할 수 있다. T 세포의 성장과 분화를 증진시키는 사이토카인인 IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6, 및 암괴사인자(Tumor necrosis factor,TNF)뿐만 아니라, NK T 세포를 활성화하는 알파-갈락토실세라마이드(α-galactosylceramide) 및 톨유사수용체(Toll-like receptors)에 결합하여 천연적인 면역 체계를 활성화하는 CpG 및 지질다당체(lipopolysaccharides, LPS) 등 또한 보조제로 사용될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 킬러 T 세포에 대비하는 구성요소를 포함한다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에 대항하는 물질로 동정되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기는 라이신(lysine) 잔기의 ε-아미노군 및 α-아미노군에 결합하고, 본 발명의 면역원성 펩티드에 연결될 수 있다. 지질이 첨가된 펩티드는 교질입자 또는 입자에 포함되어 투여되거나, 리포솜에 캡슐화되거나, 또는 보조제에 유화되어 직접 투여될 수 있다. 다른 지질 대비의 예는 적절한 펩티드에 공유 결합할 때, E. coli를 트리팔미토일-황-글리세릴-시스테이닐세릴-세린(tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteinylseryl-serine, P3CSS)과 같은 지단백으로 대비하는 것이 있다(Deres K., et al ., (1989) Nature 342:561-4).

본 발명의 면역원성 펩티드는 바이러스 벡터 또는 박테리아 벡터에 의해서 발현할 수 있다. 적절한 발현 벡터의 예는 우두 및 계두와 같은 비악성 바이러스 숙주가 포함된다. 예를 들어, 우두 바이러스는 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현하는 벡터로서 사용될 수 있다. 상기 재조합 우두 바이러스를 숙주 세포에 도입함으로써, 면역원성 펩티드가 발현되고, 면역 반응을 이끌어낸다. 우두 바이러스를 이용한 면역반응은 예를 들어, 미국 특허 번호 4,722,848에 기재되어 있다. 또한, 바실 칼메트-게랭(Bacille Calmette-Guerine, BCG)가 사용될 수 있다. BCG 벡터는 Stover CK, et al ., (1991) Nature 31:456-60에 기재되어 있다. 아데노 바이러스 벡터(adenovirus vectors) 및, 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vectors), 레트로바이러스 벡터(retroviral vectors), 장티푸스균(Salmonellar typhi) 벡터 및 무독화시킨 탄저병 독소 벡터를 포함하는 치료학적 투여 또는 면역화를 위한 다양한 벡터가 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Shata MT, et al ., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; and Hipp JD, et al ., (2000) In Vivo 14:571-85.에 나와 있다.

환자에게서 채취한 세포 또는 몇몇의 HLA 대립 형질(동종 이계의 세포)를 공유한 다른 개인에게서 채취한 세포에서 시험관 내로 항원 펩티드를 첨가하고, 항원을 제시하고, 상기 세포를 상기 환자에게 정맥, 암 국소적으로 투여하여 상기 환자의 신체에서 킬러 T 세포를 효율적으로 유도할 수 있다. 대안적으로, 환자의 말초 혈액 림프구에 펩티드를 첨가하여 시험관 내에서 킬러 T 세포를 유도하여, 이들을 시험관 내에서 배양한 후, 환자에게 정맥을 통해서, 암 국소적으로 그 세포를 투여할 수 있다. 이러한 세포 전이 치료는 암 치료로서 이미 사용되고 있으며, 당업자에게 잘 알려진 방법이다.

본 발명에서 암의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 구체적인 예는 식도암, 유방암, 갑상선암, 대장암, 췌장암, 악성 흑생종(멜라노마), 악성 림프종, 골육종, 크롬 친화성 세포종, 두경부암, 자궁암, 난소암, 뇌종양, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 신장암, 전립선암, 폐암, 위암, 간암, 담낭암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 유종 등을 포함한다. 본 발명의 활용이 적합한 암의 종류는 담관암, 폐암, 췌장암 및 방광암이 포함된다.

(3) 본 발명의 항체들

또한, 본 발명은 상기 언급한 에피토프(항원)로서 본 발명의 펩티드 전체 또는 부분을 인식하는 항체와 관련되고, 상기 단백질 또는 펩티드를 이용하여 시험관 내에서 자극으로 유도된 킬러 T 세포와 관련된다. 일반적으로, 상기 킬러 T 세포는 상기 항체보다 강력한 항암 효과를 보인다.

더욱이, 본 발명의 펩티드와 유사하게, 본 발명의 항체들은 FOXM1 암 항원의 활성을 억제할 수 있는 한, FOXM1 항원을 발현하는 암에 대하여 예방제 및/또는 치료제로 유용하다. 실제 사용에 있어서, 본 발명의 상기 펩티드 또는 항체는 그 자체 또는 필요한 보조제와 함께 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이러한 투여는 스프레이 방법 등을 이용하여 점막을 통한 경피 흡수를 통해 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 여기에서, 인간 혈청 알부민(albumin)은 담체의 한 종류이고; 인산 완충 용액(Phosphate buffered saline, PBS), 증류수 등이 희석제의 예이다.

본 발명의 항체는 다클론성 항체 또는 단일 클론성 항체일 수 있으며, 당업자에게 알려진 방법으로 생산될 수 있다.

예를 들어, 다클론성 항체는 본 발명의 펩티드를 항원으로 이용하여 포유류 또는 조류를 면역화된 후, 상기 포유류 또는 조류로부터 혈액을 채취한 다음, 상기 채취한 혈액으로부터 항체를 분리하고 정제하여 얻을 수 있다. 예를 들어 마우스, 햄스터, 기니아 피그, 닭, 랫트, 토끼, 개, 염소, 양 및 소와 같은 포유류 또는 조류가 면역화될 수 있다. 면역화 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 상기 항원은 예를 들어, 7일에서 30일의 간격에 두 번 또는 세 번 투여될 수 있다. 예를 들어 상기 투여량은 투여당 0.05 ㎎ ~ 2 ㎎ 항원이 될 수 있다. 상기 투여의 경로는 특별히 제한적이지 않으며, 피하 투여, 피내 투여, 복강 투여, 정맥 투여 및 근육 투여에서 적절히 선택될 수 있다. 더욱이, 적절한 버퍼, 예를 들어, Freund's complete 보조제 및 수산화 알루미늄과 같은 종래의 보조제를 포함하는 버퍼에 항원을 용해한 뒤 사용될 수 있다.

상기 면역화된 포유류 또는 조류는 일정 시간 동안 사육되고, 상기 항체의 농도가 증가할 때, 예를 들면, 추가적으로 100 ㎍ ~ 1000 ㎍의 상기 항원으로 면역화될 수 있다. 마지막으로 펩티드를 투여한 후 1달에서 2달 후 상기 면역화된 포유류 또는 조류로부터 혈액을 모으고, 상기 혈액은 원심분리, 황산암모늄(ammonium sulfate) 또는 폴리에딜렌 글리콜(polyethylene glycol)을 이용한 침전, 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography), 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography) 및 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)와 같은 크로마토그래피 등의 종래의 방법으로 분리 및 정제될 수 있다.

반면, 단일 클론성 항체는 하이브리도마(hybridomas)를 제조하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마는 골수종세포주의 항체 생성 세포를 융합하여 획득될 수 있다. 본 발명의 단일 항체를 생성하는 하이브리도마는 하기에 기재된 방법으로 세포융합을 하여 얻을 수 있다.

비장 세포, 림프절 세포, B 림프구 및 면역화된 동물로부터 얻은 세포들은 항체 생성 세포로 이용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 항원으로서 사용된다. 마우스 및 랫트와 같은 동물은 면역화된 동물로서 사용될 수 있으며, 이러한 동물들에게 항원의 투여는 종래의 방법으로 수행된다. 예를 들어, 동물은 Freund's complete 보조제 및 Freund's incomplete 보조제와 함께 본 발명의 펩티드를 항원으로서 본 발명의 펩티드의 상층액 또는 유화액을 Freund's complete 보조제 및 Freund's incomplete 보조제와 함께 여러 번 정맥, 피하, 피내, 복강 등의 방법으로 상기 동물에게 투여하여 면역력을 갖추게 할 수 있다. 비장과 같은 항체 생성 세포는 상기 면역화된 동물로부터 얻을 수 있으며, 알려진 방법(G. Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975))에 의해서 골육종세포와 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있다.

마우스에서, 세포 융합을 위한 골육종세포주는 예를 들어 P3X63Ag8, P3U1 및 Sp2/0주 등이 있다. 폴리에틸렌 글리콜 및 센다이 바이러스(Sendai virus)와 같은 융합-촉진제가 세포 융합에 이용될 수 있으며, 하이폭산틴/아미노프테린/티미딘(hypoxanthine/aminopterin/thymidine, HAT) 배지를 세포 융합 후 종래의 기술을 이용하여 하이브리도마를 선택하는데 이용할 수 있다. 세포 융합으로 얻은 하이브리도마는 한계 희석 방법 등으로 복제될 수 있다. 필요에 따라서는, 본 발명의 펩티드를 특이적으로 인식하는 단일 클론성 항체를 생성하는 세포주는 본 발명의 펩티드를 효소 면역 분석 방법에 이용한 스크리닝에서 얻을 수 있다.

상기 언급한 방법들 이외에도, 면역화된 세포는 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 발현하는 세포 또는 그 용해물을 이용하여 시험관 내에서 EB 바이러스 감염된 림프구와 같은 인간 림프구를 자극하여 조절될 수 있다. 본 발명의 펩티드와 결합하는 인간 항체들은 U266(일본 특허 출원 Kokai Publication No. (JP-A) S63-17688 (심사되지 않음, 공개된 일본 특허 출원))과 같은 인간 유래된 골수 세포와 면역화된 림프구를 융합하여 얻을 수 있다.

하이브리도마에서 관심 있는 단일 클론성의 항체를 얻기 위해서, 상기 하이브리도마는 종래의 방법 또는 복수 형성 방법으로 배양될 수 있고, 단일 클론성 항체는 배양 상층액 또는 복수에서 정제될 수 있다. 배양 상층액 또는 복수에서 단일 항체의 정제는 종래의 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 황산 암모늄 분획, 겔 정제(gel filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피등을 적합하게 혼합하여 사용될 수 있다.

인간 항체 유전자의 그룹을 갖는 형질전환 동물은 본 발명의 펩티드, 이 펩티드를 발현하는 세포 또는 그 용해물을 이용하여 면역화될 수 있다. 항체 생성 세포는 상기 면역화된 형질전환 동물에서 얻을 수 있고, 하이브리도마를 얻기 위해서 상기 기재된 골육종세포주와 융합될 수 있다. 따라서, 관심 있는 단일 클론성 항체는 상기 하이브리도마(WO92/03918; WO94/02602; WO94/25585; WO94/33735; WO96/34096)로부터 생성될 수 있다.

더욱이, 면역화된 림프구와 같은 항체 생성 면역 세포는 암 유전자를 이용하여 불사화될 수 있으며, 단일 클론성 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.

이와 같이 얻어진 단일 클론성 항체는 유전자 조작 기술(Borrbaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies)을 이용하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체는 하이브리도마 및 면역화된 림프구와 같은 항체 생성 세포로부터 유래한 항체를 암호화하는 DNA를 복제하고, 이를 적절한 벡터에 삽입한 다음, 숙주세포에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드와 결합하는 한, 항체 단편 또는 변환된 항체일 수 있다. 항체 단편들은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 H와 L 사슬에서 유래된 Fv 단편들이 적합한 링커(linker)(Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83)로 연결되어 있는 단일 사슬 Fv(scFV)일 수 있다. 더욱 구체적으로, 항체 단편들은 항체를 파파인(papain) 및 펩신(pepsin)과 같은 효소로 처리하여 제조될 수 있다(Co et al., (1994) J Immunol 152:2968-76; Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178:497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121:652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121:663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9:132-7).

본 발명의 항체들은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 다양한 분자에 항체가 결합하여 얻은 변형된 항체를 포함한다. 상기 항체는 당업계에 알려진 종래의 화학 변형방법으로 변형될 수 있다.

본 발명의 항체는 비-인간 항체에서 유래한 가변 부위 및 인간 항체에서 유래한 불변 부위를 포함하는 키메릭(chimeric) 항체, 비-인간 항체에서 유래한 상보성 결정 부위(CDR), 인간 항체에서 유래한 구조형성 지역(FR) 및 인간 항체에서 유래한 불변 지역을 포함하는 인간화 항체를 포함한다. 이러한 항체들은 당업계에 알려진 종래의 방법으로 제조될 수 있다. 인간화 항체는 인간 항체의 CDR 서열 부위를 원하는 결합 활성이 있는 설치류의 CDR 부위로 치환함으로써 얻을 수 있다(Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-6). 이에 따라, 키메릭 항체와 비교하면, 인간화 항체들은 인간 항체의 작은 부위가 비-인간 종의 상응하는 부위로 치환된 항체이다.

인간 가변 부위뿐만 아니라 구조형성 및 불변 영역을 갖고 있는 완전한 인간 항체 역시 생성될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 방법으로 인간 항체 단편들을 나타내는 박테리오파지(bacteriophage)의 재조합 라이브러리를 이용하여 스크리닝을 수행할 수 있다(Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227:381-8). 유사하게, 인간 면역글로불린(immunoglobulin) 유전자좌를 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적 또는 완전히 비활성화된 형질전환 마우스에 도입됨으로써, 인간 항체가 생성될 수 있다(미국 특허 번호. 6,150,584, 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, and 5,661,016).

상기 기재된 방법으로 획득한 항체는 당업계의 종래 기술을 이용하여 동종성에 따라 정제될 수 있다. 예를 들어, 단백질 분리 및 정제의 일반적인 방법들이 이용될 수 있다. 상기 항체는 친화성 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동, 등전점초점(isoelectric focusing) 등에 의해서 분리되고 정제될 수 있다; 그러나, 분리 및 정제 방법은 이에 한정되지 않는다(Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼으로 사용될 수 있다. 단백질 A 컬럼 의 예는 HyperD, POROS 및 Sepharose F.F(Pharmacia)가 포함된다.

친화성 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피의 예에는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피(reverse-phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 등이 포함된다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). HPLC 및 FPLC와 같은 지질 크로마토그래피를 크로마토그래피로 사용할 수 있다.

본 발명의 항체의 항원 결합 친화성은 예를 들어 흡광도 측정, 효소결합면역흡착검정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 효소면역검사(enzyme immunoassay, EIA), 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA), 면역형광법(immunofluorescence assay)을 이용하여 측정될 수 있다; 그러나, 상기 방법은 이에 한정되지 않는다. 효소결합면역흡착검정법에서, 본 발명의 항체는 플레이트(plate)에 고정되고, 본 발명의 펩티드가 첨가된 후, 항체 생성 세포의 배양 상층액 또는 정제된 항체를 포함한 샘플을 첨가한다. 그 후, 항원 결합 친화성을 측정하고자하는 항체를 인식하고, 검출할 수 있는 표지된 2차 항체를 첨가한다. 상기 플레이트를 세척한 후, 상기 2차 항체를 검출할 수 있는 시약을 첨가하고, 흡광도 등을 측정한다. 예를 들어, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 효소가 2차 항체를 표지하는데 사용될 수 있으며, 피-니트로페닐-포스파타아제(p-nitrophenyl phosphate)와 같은 효소 기질을 검출하는 시약으로 사용될 수 있다. BIAcore(Pharmacia)를 상기 항체의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 샘플에 포함된 본 발명의 펩티드를 검출할 수 있다. 구체적으로, 암 조직에 있는 본 발명의 펩티드는 예를 들어, 암 세포 생체검사에서 본 발명의 펩티드와 접촉시킴으로써 확인될 수 있다.

본 발명의 펩티드를 암 치료 및/또는 예방에 이용하기 전에, 치료하기 전에 본 발명의 항체를 이용하여 치료할 암에서 본 발명의 펩티드의 발현을 평가하여 치료 대상에게 효과가 있을지를 예상할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 항체는 다양한 암 세포에서 과발현되는 FOXM1 펩티드 단편들을 인식하기 때문에, 이의 활용이 진단뿐만 아니라 치료에도 적용 가능할 것으로 예상된다.

(4) 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포

또한, 본 발명은 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 자극하여 유도된 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포뿐만 아니라 킬러 T 세포, 헬퍼 T 세포를 포함하는 면역 세포군과 관련된다. 예를 들어, 암 반응 활성화된 T 세포는 말초혈액 단핵 림프구 또는 암 침투성 림프구가 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 자극될 때 유도되며, 이렇게 활성화된 T 세포는 상기 세포를 암 환자에게 정맥, 암 국소적 등으로 투여하는 양자 면역 치료법으로써 효과적으로 이용될 수 있다. 대안적으로, 강력한 항원 제시 세포인 수지상 세포는 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 펩티드로 자극되거나, 시험관 내 또는 생체 내에서 상기 수지상 세포를 이용하여 T 세포 자극으로 항암 면역 반응을 유도할 수 있다.

바람직하게, 킬러 T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군은 생체내 또는 시험관 내에서 본 발명의 펩티드 및 보조제로 자극되어 유도될 수 있다. 본 명세서에 사용된 보조제의 예는 미네랄 기름, 알루미늄 하이드록사이드, 결핵(Mycobacterium tuberculosis) 제형, 용혈성 스트렙토코커스(hemolytic streptococcus ) 제형, 구멍장이 버섯과(Polyporaceae) 제형, 다른 보조제, 세포 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.

이렇게 얻어진 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군을 암 등에 국소적, 혈관 등으로 주입함으로써, 종양이 억제되고, 암이 예방 및/또는 치료될 수 있다.

상기 기재된 암을 억제할 수 있는 킬러 T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군은 본 발명의 펩티드를 이용하여 생성될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다. 암을 억제할 수 있는 킬러 T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군은 이 세포 배양 배지를 이용하여 만들 수 있다. 더욱이, 본 발명은 상기 기재된 세포 배양 배지 및 킬러 T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군을 생성하기 위한 세포 배양 혈관을 포함하는 세포 배양 키트(kit)를 제공한다.

(5) 항원 제시 엑소솜(exosome)

본 발명은 더 나아가 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원으로 형성된 복합체의 표면에 제시되는 "엑소솜"이라고 불리는 내포낭 (endocytic vesicle)을 제공한다. 엑소솜은 예를 들어, 일본 특허 공개 Kohyo Publication No. (JP-A) H11-510507(국제 공개되지 않은, 심사되지 않은 일본 국내 단계 공개) 및 JP-A (Kohyo) 2000-512161의 일본 번역문에 자세하게 기재되어 있는 방법으로 제조할 수 있다. 바람직하게, 엑소솜은 치료 및/또는 예방을 받은 개체에서 얻은 항원 제시 세포를 이용하여 제조된다. 본 발명의 엑소솜은 암 백신으로서 본 발명의 펩티드와 유사한 방식으로 주입될 수 있다.

본 발명에 사용된 HLA 항원의 종류는 치료 및/또는 예방이 필요한 개체의 HLA 항원의 종류와 반드시 일치해야 한다. 예를 들어, HLA 항원의 종류는 HLA-A2이고, 바람직하게는 HLA-A2(HLA-A*0201)이다. "HLA-A2"는 단백질을 의미하며, 현재 상기 단백질의 부분을 표현하는 용어가 부족하므로, "HLA-A*0201"는 상기 단백질의 부분에 해당하는 유전자를 의미한다.

(6) 항원 제시 세포 및 킬러 T 세포를 유도하는 방법들

본 발명은 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 이용하여 항원 제시 세포를 유도하는 방법을 제공한다. 항원 제시 세포는 말초혈액 단핵에서 유도된 수지상 세포를 상기 수지상 세포를 자극하는 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드와 접촉시켜 유도될 수 있다. 본 발명의 펩티드가 개체에 투여되었을 때, 본 발명의 펩티드를 그 세포 표면에서 제시하는 항원 제시 세포가 상기 개체의 체내에서 유도될 수 있다.

대안적으로, 항원 제시 세포를 본 발명의 펩티드와 접촉시킨 뒤, 개체에 상기 세포를 백신으로서 투여하는 생체 밖 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 생체 밖 투여는 하기의 단계들을 포함할 수 있다:

(1) 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하기; 및

(2) 단계 (1)의 항원 제시 세포와 본 발명의 펩티드와 접촉하기(또는 단계 (1)의 항원 제시 세포를 본 발명의 펩티드로 자극하기).

상기 단계 (2)에서 얻은 항원 제시 세포는 개체에 백신으로 투여될 수 있다.

본 발명은 또한 높은 수준의 킬러 T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포를 유도하는 방법을 제공한다. 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 시험관 내 방법으로 항원 제시 세포에 형질감염(transfection)시키는 단계를 포함한다. 형질감염시키는 유전자는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 형질감염을 위해서, 당업계에서 종래에 사용된 다양한 방법, 예를 들어 리포펙션(lipofection), 전기 천공법(electroporation) 및 인산칼슘(calcium phosphate) 방법이 적절히 이용될 수 있으나, 상기 방법은 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적으로, 형질감염은 Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; 및 WO99/08521의 공개된 일본 번역문에 기재된 방법으로 수행될 수 있다. 항원 제시 세포에 상기 유전자가 형질감염 되었을 때, 유전자들은 상기 세포 내에서 전사되고(transcribed), 번역된다(translated). 그 결과 생성된 단백질은 다음에 MHC class I 및 class II 전달회로를 통해서 처리되고, 항원 제시 전달회로를 통해서 부분적인 펩티드로 항원 제시 세포의 표면에 제시된다.

또한, 본 발명은 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 이용하여 킬러 T 세포를 유도하는 방법을 제공한다. 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 개체에 투여함으로써, 킬러 T 세포는 상기 개체의 몸안에서 유도되고, 따라서, 암 조직에서 FOXM1을 제시하는 암세포를 표적으로 하는 면역 체계가 강화된다. 대안적으로, 활성화된 킬러 T 세포는 항원 제시 세포 및 상기 개체의 CD8 양성 세포를 시험관 내에서 본 발명의 하나 또는 다수의 펩티드와 접촉하여 유도될 수 있으며, 말초 혈액 단핵 백혈구와 상기 세포를 시험관 내에서 자극하는 항원 제시 세포를 접촉하여 유도할 수 있다. 생체 밖 치료학적 방법에서, 개체의 암 조직에서 FOXM1을 제시하는 암세포를 표적으로 하는 상기 면역 체계는 상기 개체의 몸으로 활성화된 T 세포를 돌려보냄으로써 강화될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 단계들을 포함한다:

(1) 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하기;

(2) 상기 단계 (1)의 항원 제시 세포와 본 발명의 펩티드(단계 (1)의 항원 제시 세포를 자극한 본 발명의 펩티드)를 접촉시키기;

(3) 상기 단계 (2)의 항원 제시 세포와 CD8⁺T 세포를 혼합하고, 공동 배양하여 세포 독성 T 세포를 유도하기; 및

(4) 상기 단계 (3)의 CD8⁺T 세포를 수집하기.

상기 단계 (4)에서 얻은 세포독성을 갖는 CD8⁺T 세포는 개체에 백신으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드를 이용하여 유도된 분리된 킬러 T 세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해서 유도된 킬러 T 세포는 치료 및/또는 예방을 받은 개체로부터 유래 된다. 상기 세포는 항원 제시 세포를 함유하는 다른 약제와의 조합으로 투여될 수 있거나, 또는 본 발명의 하나 또는 다수의 펩티드를 제시하는 엑소솜과 함께 투여될 수 있다. 상기 획득된 상기 T 세포는 유도를 위해서 사용된 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포 특이적이다. 표적 세포는 FOXM1을 내인성으로 발현하거나, 또는 FOXM1 유전자를 형질감염시킨 세포이다. 본 발명의 펩티드로 자극함으로써, 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 세포, 예를 들어 췌장암, 담관 세포암, 위암, 대장암, 비소 세포 폐암, 고환암, 자궁 경부암, 골육종 및 연부 조직 육종 등의 암 세포는 공격의 표적이 될 수 있다.

또한, 본 발명은 HLA 항원 및 본 발명의 하나 또는 다수의 펩티드로 형성된 복합체를 제시하는 항원 제시 세포를 제공한다. 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드 또는 이러한 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현하는 상기 항원 제시 세포는 바람직하게 상기 치료 및/또는 예방을 받은 개체로부터 모을 수 있다. 상기 펩티드, 엑소솜 또는 활성화된 킬러 T 세포를 제시하는 본 발명의 펩티드, 항원 제시 세포는 다른 약물과 조합하여 백신으로서 투여될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예를 참조로 하여 상세히 설명될 것이다; 그러나 이에 한정되는 것으로 이해되지 않는다.

본 명세서에 인용된 모든 선행 문헌은 본 명세서에 참조로 통합된다.

실시예들

[실시예 1]

(1) HLA-A2 친화성을 보이는 FOXM1 펩티드의 선별

인간 FOXM1의 아미노산 서열은 BIMAS 시스템을 이용하여 분석하였고, 20개 혹은 이상의 HLA-A2에 대하여 친화성이 있는 것으로 예측된 23 종류가 선별되었다.

[실시예 2]

HLA-A2 결합 FOXM1 펩티드에 의한 인간 킬러 T 세포의 유도

(1) 채혈

혈액 샘플(50㎖)은 건강한 개인 및 쿠마모토 의과대학 병원(Kumamoto University Medical School Hospital)에서 치료받고 있는 HLA-A2 양성 유방암 환자들로부터 고지에 입각한 동의를 얻은 후 모았다. 그 뒤, 말초 혈액 단핵구 세포는 이전의 발표된 방법에 따라, Ficoll-Conray 밀도 기울기 원심법을 이용하여 분리하였다(Nakatsura, T. et al ., Eur. J. Immunol. 32, 826-836, 2002).

(2) 말초 혈액 단핵 세포로부터 CD8 양성 세포 분리 및 킬러 T 세포의 유도

FOXM1 펩티드-특이적 킬러 T 세포는 상기 분리된 말초 혈액 단핵 세포로부터 유도되었다. 킬러 T 세포는 Komori, H. et al . (Komori, H. et al ., Clin. Cancer. Res. 12: 2689-2697, 2006)의 방법에 따라서 유도되었다. 우선, 상기 말초 혈액 단핵 세포 중 CD8 양성 세포를 MACS를 이용하여 분리하였다. CD8 음성 세포는 수지상 세포로 분화시키기 위해서 4일 동안 GM-CSF (100 ng/㎖) 및 IL-4 (20 ng/㎖)이 있는 상태에서 배양하였다. 그 이후, OK-432 (0.1 KE/㎖)를 상기 수지상 세포의 성숙을 위해서 첨가되었다. 7일째 되는 날, 각각의 FOXM1 펩티드(10 um)이 첨가되었고, 그 뒤에 상기 수지상 세포를 IL-7 (10 ng/㎖)이 있는 상태에서 CD8 양성 세포와 공동 배양하였다. 상기 CD8 양성 세포와 공동 배양 2일 후, IL-2(20 IU/㎖)를 첨가하였다. 자가 조직의 CD8 음성 세포에서 유래된 상기 수지상 세포의 항원 자극을 펩티드-특이적 킬러 T 세포를 유도하기 위해서 일주일 간격으로 3회 반복하였다.

(3) ELISPOT 분석에 의한 FOXM1 특이적 킬러 T-세포 활성의 측정

ELISPOT 분석은 상기 FOXM1 펩티드에 의해서 유도된 킬러 T 세포가 IFN-γ를 이러한 FOXM1 유래된 펩티드에 대하여 특이적이고 실제로 반응하여 생성하는지의 여부를 측정하는데 사용하였다. ELISOPT 분석은 이전에 발표된 방법에 의해서 수행되었다(Komori, H. et al ., Clin. Cancer. Res. 12: 2689-2697, 2006). 그 결과, FOXM1 펩티드 특이적 킬러 T 세포 활성은 FOXM1 362-370, 373-382, 및 640-649 펩티드로 유도된 킬러 T 세포에서 관찰되었다(도 1). 도 1은 FOXM1 펩티드 유도된 킬러 T 세포의 분석의 대표적인 결과를 나타낸다.

(4) 세포독성 검사에 의한 킬러 T 세포의 세포독성 측정

FOXM1에 의해서 펩티드 특이적으로 유도된 킬러 T 세포의 세포독성은 HLA-A2 양성 및 FOXM1 발현 세포주 panc-1 및 HLA-A2 음성 및 FOXM1 발현 췌장암 세포주 PK-8을 자극기 세포로 이용한 세포독성 검사를 통해서 측정되었다. 킬러 T 세포는 크롬 방출 분석을 통한 세포독성 검사를 이용하여 세포독성 활성을 측정하였다. 크롬 방출 분석은 이전에 발표된 방법(Monji, M. et al ., Clin. Cancer. Res. 10: 6047-6057, 2004)을 이용하여 수행하였다. 그 결과, HLA-A2 제한적이고, FOXM1 특이적 세포독성 활성이 FOXM1 362-370, 373-382, 및 640-649 펩티드로 유도된 킬러 T 세포에서 관찰되었다(도 1).

산업상 이용가능성

본 발명에 있어서, 담관암, 폐암 및 췌장암 및 FOXM1을 과발현하는 암을 가진 일본 암 환자의 약 30%를 표적으로 하는 암 펩티드 백신은 HLA-A2에 결합하고, 암 세포-손상 킬러 T 세포를 활성화시키는 FOXM1 펩티드를 동정함으로써 개발되었다. 만약 HLA-A2에 의해 킬러 T 세포에 제시되는 상기 FOXM1 펩티드의 유효성을 병진의학에서 보일 수 있으면, 백인에 대한 임상 적용의 가능성이 커질 것이다. 높은 빈도로 백인에게 양성인 HLA-A2에 의해서 킬러 T 세포에 제시되는 펩티드를 동정함으로써, 상기 펩티드는 FOXM1 과발현되는 암을 갖는 약 30%의 일본인 환자뿐만 아니라, 대다수의 백인 환자에게도 활용가능하게 되었다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> FOXM1 PEPTIDE AND MEDICINAL AGENT COMPRISING THE SAME <130> 10fpi-02-05 <150> JP 2007-214001 <151> 2007-08-20 <160> 23 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide vaccine <400> 1 Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide vaccine <400> 2 Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide vaccine <400> 3 Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys Glu Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 6 Arg Met Thr Leu Lys Asp Ile Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 7 Asn Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 8 Ser Leu His Asp Met Phe Val Arg Glu Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 9 Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 10 Leu Leu Pro Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 11 Ile Gln Phe Pro Val Asn Gln Ser Leu Val 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 12 Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 13 Leu Leu Ala Glu Glu Gly Ile Ala Pro Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 14 Leu Leu Phe Gly Glu Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 15 Leu Leu Phe Ser Glu Gly Pro Ser Thr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 16 Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gln Glu Val 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 17 Lys Val Gly Gly Ile Asp Phe Ser Pro Val 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 18 Arg Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 19 Leu Leu Ser Ser Glu Pro Leu Asp Leu 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 20 Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 21 Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 22 Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 23 Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu 1 5

Claims

하기의 (A) 또는 (B)의 펩티드:
(A) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;
(B) 서열 번호: 1 내지 3중 어느 하나의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하고, 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 펩티드.
제 1항에 있어서, N 말단에서 두 번째 아미노산이 루신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, C-말단 아미노산이 발린(valine) 또는 루신인 것을 특징으로 하는 펩티드.
하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암에 대한 면역 유도제.
하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 치료 및/또는 예방을 위한 유도제.
하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도제.
제 1항의 펩티드를 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도제.
하나 또는 다수의 제 1항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 세포독성(킬러) T 세포 유도제.
제 1항의 펩티드에 대한 항체.
제 1항의 펩티드를 이용하여 유도된 세포독성(킬러) T 세포, 헬퍼 T 세포 또는 이들을 포함하는 면역세포군.
제 1항의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 항원 제시 세포.
제 11항에 있어서, 제 6항 또는 7항의 약제에 의해서 유도되는 것을 특징으로 하는 항원 제시 세포.
제 1항의 펩티드 및 HLA 항원을 포함하는 복합체를 제시하는 엑소솜(exosome).
제 13항에 있어서, 상기 HLA 항원은 HLA-A2 (HLA-A*0201)인 것을 특징으로 하는 엑소솜.
항원 제시 세포를 제 1항의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포를 유도하는 방법.
제 1항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원 제시 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 활성을 보이는 항원 제시 세포 유도 방법.
T 세포를 제 1항의 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포독성(킬러) T 세포 유도 방법.
제 1항의 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암에 대한 면역 유도 방법.
제 1항의 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 예방 방법.
암에 대한 면역 유도제의 제조를 위한 제 1항의 펩티드의 용도.
암 치료 및/또는 예방제 제조를 위한 제 1항의 펩티드의 용도.
암에 대한 면역 유도용 제 1항의 펩티드.
암 치료 및/예방용 제 1항의 펩티드.