KR20100039935A

KR20100039935A - 마늘 알렉시바이러스의 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100039935A
Application number: KR1020080098926A
Authority: KR
Inventors: 이수헌; 이영훈; 최홍수; 이준성; 김정수
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2008-10-09
Filing date: 2008-10-09
Publication date: 2010-04-19
Also published as: KR101093239B1

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 알렉시바이러스 속 진단용 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 알렉시바이러스를 속 특이적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 진단법은 지금까지 사용된 진단 방법에서 불가능하던 마늘에 발생하는 알렉시바이러스를 가장 경제적이고 간편한 방법으로 진단하며, 동시에 최고의 검출한계를 가지고 있다. 이 진단법은 마늘 바이러스 무병주 생산에 사용될 수 있다.

마늘, 바이러스, 진단법, RT-PCR, 알렉시바이러스, GVA, GVB, GVC, GVD, GVE, GVX, GMbMV, GMbFV, SVX

Description

마늘 알렉시바이러스의 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도{Specific primers for detection of Allexivirus in garlic, and uses thereof}

본 발명은 마늘에 발생하는 바이러스인 알렉시바이러스(Allexivirus)를 진단할 수 있는 속(genus) 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알렉시바이러스(Allexivirus: GVA, GVB, GVC, GVD, GVE, GVX, GMbMV, GMbFV, SVX)를 속(genus) 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머와 이들의 조합으로 이루어진 프라이머 세트에 관한 것이다.

마늘 바이러스의 진단법으로는 과거 전자현미경과 혈청학적 방법(ELISA)이 주로 이용되었다. 그러나 마늘에 존재하는 사상형 바이러스는 형태적으로 구분이 어려운 많은 종이 존재하기 때문에 전자현미경 방법으로는 종의 진단은 불가능하였다.

한편, 혈청학적 방법은 마늘 바이러스의 진단에 유용하게 사용되어 왔으나, 마늘은 자연상태에서 많은 바이러스에 복합 감염되어 있어 하나 또는 몇 가지의 항혈청으로는 마늘 바이러스를 정확히 진단하기 어렵다. 또한 바이러스 항혈청 제작은 순수분리된 마늘 바이러스와 바이러스에 감염되지 않은 마늘의 확보가 매우 어 려운 문제점이 있다. 그리고 마늘에 발생하는 일부 바이러스는 분류학적으로 유사성으로 인한 비특이적 반응이 존재하여 혈청학적 방법으로 종을 구분하기 힘들며, 검출한계 또한 분자생물학적 방법에 비해 1000배 가량 떨어진다.

분자생물학적 진단법 중에서 가장 일반적으로 사용되고 있는 RT-PCR 방법은 종 특이적 프라이머의 사용이 가장 중요하다. 그러나 논문에 발표된 상당수의 프라이머들은 분류학적 체계가 확립되지 않은 상태에서 선발된 프라이머이기 때문에 모든 알렉시바이러스 계통들의 진단에 사용하기는 어렵다. 바이러스의 속 특이적 진단을 위해서는 속 내 존재하는 많은 변이주들을 모두 검출할 수 있어야 한다. 일반적으로 이질성 프라이머(degenerated primer)을 이용하여 이러한 문제점을 해결하고 있으나 알렉시바이러스(Allexivirus) 속의 경우 변이의 폭이 매우 크기 때문에 한 종류의 이질성 프라이머로는 모든 변이종을 진단하기 불가능하다. (Tsuneyoshi et al., 1998. Arch Virol 143: 1093-1107; Chen et al., 2001. Arch Virol 146: 1841-1853; Chen et al. 2004. Arch Virol 149:435-445).

한국특허등록 제10-0578000호에는 마늘의 양파 황색 위축 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 양파 황색 위축 바이러스 진단방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 프라이머 세트와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 자연상태의 대부분의 마늘은 형태적으로 구분하기 어려운 사상형 바이러스들에 복합감염되어 있기 때문에 전자현미경과 혈청학적 방법으로는 감염된 모든 바이러스를 진단하기는 불가능하다. 또한, 마늘에 발생하는 바이러스는 분류학적으로 많은 이명이 존재하기 때문에 분자생물학적 방법에 의한 명확한 종의 구분이 이루어져야 정확히 진단할 수 있다. 한편, 종 또는 속내 분리주(isolate) 사이에는 상당한 변이가 존재하기 때문에 이러한 변이를 극복할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 알렉시바이러스 속 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 알렉시바이러스를 속 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 알렉시바이러스(Allexivirus) 속 진단용 특이 프라이머를 사용한 RT-PCR 진단은 지금까지 알려진 알렉시바이러스(Allexivirus) 모든 계통들 과 반응할 수 있으며, 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상 검출한계를 가지고 있다. 또한, 식물바이러스 RT-PCR 진단 키트의 산업화와 마늘 무병주 생산을 통한 차별화된 품질의 마늘 생산으로 새로운 마늘 시장을 개척할 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2와 3의 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 4와 5의 프라이머 세트; 및 서열번호 1 및 서열번호 6의 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2와 3의 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 4와 5의 프라이머 세트; 및 서열번호 1 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

3개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 알렉시바이러스 속을 더욱 정확하게 진단할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 진단할 수 있는 알렉시바이러스 속은 Garlic virus X(GVX), Garlic virus A(GVA), Garlic virus B(GVB), Garlic virus C(GVC), Garlic virus D(GVD), Garlic virus E(GVE), Shallot virus X(SHX), Garlic mite-borne mosaic virus(GMbMV) 및 Garlic mite-borne filamentous virus(GMbFV)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트는 상기 9개 바이러스를 동시에 진단할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2와 3의 프라이머 세트에서, 정방향 프라이머는 서열번호 1의 프라이머이며, 역방향 프라이머는 서열번호 2와 3의 프라이머 혼합물이다. 알렉시바이러스 속을 진단하기 위해서는 역방향 프라이머로서 서열번호 2 또는 서열번호 3의 프라이머를 각각 이용하는 것보다는 서열번호 2와 3의 프라이머 혼합물을 이용하는 것이 바람직하다.

마찬가지로, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 4와 5의 프라이머 세트에서, 정방향 프라이머는 서열번호 1의 프라이머이며, 역방향 프라이머는 서열번호 4와 5의 프라이머 혼합물이다. 알렉시바이러스 속을 진단하기 위해서는 역방향 프라이머로서 서열번호 4 또는 서열번호 5의 프라이머를 각각 이용하는 것보다는 서열번호 4와 5의 프라이머 혼합물을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머 (23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21 개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서는 마늘에 발생하는 바이러스들에 대한 모든 유전정보를 수집하여 외피단백질 유전자의 염기서열을 이용하여 분류체계를 확립하였다. 이 분류체계를 기초로 국내 마늘에 발생하고 있는 알렉시바이러스 속(9종: GarV-A, Gar-B, GarV-C, GarV-D, GarV-E, GarMbMV, GarMbFV, ShV-X 그리고 GarV-X)에 대하여 속 특이적 진단용 프라이머를 개발하였다.

마늘에 발생하는 식물 바이러스에 대한 많은 연구가 수행되었으나 이들 바이러스들의 분류학적 체계가 정립되어 있지 않아서 바이러스를 진단하는데 어려움이 있다. 이를 위해서 이들의 외피단백질 염기서열 분석을 통해 계통분석(도 1)하여 마늘에 발생하는 주요 바이러스의 분류체계를 확립하고, 이들 바이러스의 진단체계를 확립하고자 하였다. 알렉시바이러스 속의 경우 아직까지 종에 대한 분류학적 체계가 명확하기 않기 때문에 알렉시바이러스 속을 한번에 진단할 수 있는 속 특이적 프라이머를 설계하였다. 그 방법으로는 보고된 모든 알렉시바이러스 속 분리주들의 염기서열을 분류하여 두개의 분류군으로 나누어, 같은 위치에서 두 분류군에 대한 이질성 프라이머를 선발하여 혼합함으로서 기존에 보고된 속 특이적 프라이머 보다도 더욱 정밀한 진단이 가능하도록 하였다.

바이러스 종(species) 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통 또는 분리주들이 존재한다. 그리하여 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있다. 다시 말해서 바이러스 진단용 프라이머는 바이러 스 각각에 대하여 종 특이적으로 작동하여야 한다. 본 발명에서의 프라이머는 속 특이적으로 작동하도록 설계하였다. 즉, 속 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 그리고 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 속 특이적 서열을 선발하였다. 이러한 속 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 속 특이적 프라이머로 설계하였다. 설계한 프라이머들은 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하였다.

국내 재배되고 있는 마늘에는 4종, 1속의 바이러스(GLV, LYSV, GCLV, OYDV 및 Allexivirus)가 대부분의 병을 일으키고 있다. 이들 중 알렉시바이러스(Allexivirus)에 대하여 속 특이적 진단 프라이머를 개발하였다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 세트; 및 RT-PCR 에 필요한 시약을 포함하는, 알렉시바이러스 속 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 RT-PCR 에 필요한 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 역전사효소, 리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등일 수 있으며, 반응 완충액은 역전사 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하며, 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있으며, 역전사효소는 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사효소 (Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 알렉시바이러스를 속 특이적으로 진단하는 방법을 제공한다.

마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이 용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머의 설계와 선발 및 특이성 확인

알렉시바이러스 속(genus)에 속한 9개 바이러스(Garlic virus X(GVX), Garlic virus A(GVA), Garlic virus B(GVB), Garlic virus C(GVC), Garlic virus D(GVD), Garlic virus E(GVE), Shallot virus X(SHX), Garlic mite-borne mosaic virus(GMbMV), Garlic mite-borne filamentous virus(GMbFV))의 동시 진단을 위하여 속 특이적 프라이머를 설계하였다.

알렉시바이러스 공통 염기서열 탐색은 지금까지 알려진 81가지 알렉시바이러스 속 분리주의 염기서열(표 1)을 다중 비교하여 이루어졌다.

표 1. 공통 염기서열 분석에 사용한 알렉시바이러스 속 분리주 염기서열

분리주명	유전자 출처	유전자 크기(bp)
GVA-CFH	AJ551467	755
GVA	AB010300	8660
GVA	AF478197	1573
GVA-LA	AJ551473	755
GVA=BT	AJ551468	755
GVA-CFL	AJ551469	755
GVA-CS1	AJ551470	755
GVA-CS2	AJ551471	755
GVA-HK	AJ551472	755
GVA	NC003375	8660
GVA-LZ	AJ551474	755
GVA-SS	AJ551475	755
GVA-WH	AJ551476	755
GVA-YY1	AJ551477	755
GVA-YY2	AJ551478	755
GVB-YC	AJ551482	772
GVB	AB010301	5077
GVB-EN-373	AJ543829	272
GVB-TS1-1	AJ551479	772
GVB-TS1-2	AJ551480	772
GVB-TS2	AJ551481	772
GVC	AB010302	8405
GVC	AY170322	591
GVC	NC003376	8405
GVD-AB	AJ551483	755
GVD	AB010303	4497
GVD	AF519572	1544
GVD-LZ	AJ551489	755
GVD-CFH	AJ551484	755
GVD-CFL	AJ551485	755
GVD-DL	AJ551486	755
GVD-HK	AJ551487	755
GVD-LA	AJ551488	755
GVD-YY1	AJ551495	755
GVD-SS	AJ551490	755
GVD-TM	AJ551491	755
GVD-WH	AJ551492	752
GVD-XA	AJ551493	755
GVD-XX	AJ551494	755
GVD-YY2	AJ551496	755
GVD-ZHaZ	AJ551497	755

분리주명	유전자 출처	유전자 크기(bp)
GVE-TS1	AJ551500	752
GVE-YH	AJ292230	8451
GVE-CFH	AJ551498	755
GVE-CS2	AJ551499	752
GVE-TS2	AJ551501	752
GVE-YC	AJ551502	752
GVE	NC004012	8451
GVX-AB2	AJ551504	765
GVX-YH	AJ292229	8319
GVX-AB1	AJ551503	767
GVX-CS2-1	AJ551510	741
GVX--BD	AJ551505	767
GVX-BT	AJ551506	766
GVX-CQ	AJ551507	767
GVX-CS1-1	AJ551508	765
GVX-CS1-2	AJ551509	769
GVX-LZ	AJ551516	765
GVX-CS2-2	AJ551511	769
GVX-DL	AJ551512	767
GVX-GY	AJ551513	767
GVX-JX	AJ551514	765
GVX-LA	AJ551515	767
GVX-XA	AJ551522	766
GVX-NJ	AJ551517	767
GVX-TM	AJ551518	766
GVX-TP	AJ551519	767
GVX-TS1	AJ551520	766
GVX-TS2	AJ551521	766
GVX	U89243	8106
GVX-XX	AJ551523	767
GVX-YC	AJ551524	766
GVX-ZHaZ	AJ551525	767
GVX-ZHaZ	AJ551526	767
GVX	NC001800	8106
SVX	NC003795	8832
SVX	L76292	2452
SVX	M97264	8832
GMbFV	AY390254	723
GMbFV	X98991	762
GMbMV	D49443	2518

이러한 속 특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 부분에서 13가지의 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머를 설계하였다(표 2).

표 2. 설계한 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머

프라이머	염기서열 ^a	길이	위치 ^b
Al-N10	TGGRCNTGCTACCACAAYGG (서열번호 7)	20	337-356
Al-N20	TTYKCNGSHTTYGAYTTCTT (서열번호 8)	20	553-572
Al-N30	CAYTCHATGAAYGCBAARATGTC (서열번호 1)	23	652-674
Al-C40	GGYTGYTCATGKATYTGTTG (서열번호 9)	20	736-755
Al-C40	GGHGSTTCRTGRATYTGYTG (서열번호 10)	20	736-755
Al-C30	GGCTTATTYTGWCTAGYYTTACG (서열번호 2)	23	910-932
Al-C30	GGYTTATTKTSTTRTRATYTACG (서열번호 3)	23	910-932
Al-C21	TCRAARCAYCTRTTGTARCCYTT (서열번호 11)	23	973-995
Al-C21	TCAAARCAYCTGYYATARCGTTT (서열번호 12)	23	973-995
Al-C20(2)	CAKTCRAARCAYCTRTTGTARCG (서열번호 4)	23	976-998
Al-C20(2)	CARTCAAARCAYCTGYYATARCG (서열번호 5)	23	976-998
Al-C20(1)	CARTCRAARCAYCKRTYRTARCG (서열번호 6)	23	976-998
Al-C10	CCYTTCAGCATATAGCTTAGC (서열번호 13)	21	1087-1107

^aD: Degenerated primer

^b 프라이머 위치는 GMbMV(D49443)를 기준으로 함

설계한 프라이머의 위치는 도 2와 같다. 설계한 알렉시바이러스 속 프라이머들은 17가지로 조합하여 (표 3), RT-PCR을 수행하였다 (도 3).

표 3. 알렉시바이러스 프라이머 조합과 RT-PCR 산물

조합	프라이머		산물 크기(bp)
1	Al-N10	Al-C40	419
2	Al-N10	Al-C30	596
3	Al-N10	Al-C21	659
4	Al-N10	Al-C20(2)	662
5	Al-N10	Al-C20(1)	662
6	Al-N10	Al-C10	771
7	Al-N20	Al-C40	203
8	Al-N20	Al-C30	380
9	Al-N20	Al-C21	443
10	Al-N20	Al-C20(2)	446
11	Al-N20	Al-C20(1)	446
12	Al-N20	Al-C10	555
13	Al-N30	Al-C30	281
14	Al-N30	Al-C21	344
15	Al-N30	Al-C20(2)	347
16	Al-N30	Al-C20(1)	347
17	Al-N30	Al-C10	456

속 특이적 프라이머 선발에 사용한 알렉시바이러스는 자연 감염된 마늘에서 모자이크 병징을 나타내는 잎을 채취하여 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR 주형(template)으로 사용하였다. 본 발명에서 사용한 전체 RNA 분리 및 RT-PCR 방법은 다음과 같다.

전체 RNA 분리: 전체 RNA는 페놀을 이용하여 바이러스 감염된 잎 조직 50 ㎎에서 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 최종적으로 75% 에탄올로 3회 세척한 후 건조한 다음 증류수 50 ㎕에 녹인 다음 RT-PCR 분석에 사용하였다.

RT-PCR: 역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5 ㎕, 12.5 pmole 역방향 프라이머(reverse primer), 5배 역전사 완충액(250 mM Tris-HCl, 150 mM KCl, 40 mM MgCl₂, 5 mM DTT, pH 8.5) 1 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, 10 U RNase 저해제, 그리고 2 U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5 ㎕를 42℃에서 1 시간 항온 처리하여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사 반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 정방향 프라이머(forward primer), 1.25 U Taq DNA 중합효소, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, pH 8.3) 2 ㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 95℃ 45 초, 50℃ 60 초, 72℃ 60 초로 40회 증폭시켰으며, 마지막에는 72℃에서 7 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5X TBE 완충액과 1.5 % 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 확인하였다.

정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 degenerated primer로 합성하여 사용 하였다.

1차 선발된 프라이머 쌍을 마늘에 발생하는 바이러스들과의 RT-PCR을 수행하여 (도 4), 최종적으로 4가지 진단용 프라이머와 이를 이용한 3가지 프라이머 쌍을 선발하였다 (표 4). 자연 감염된 마늘 시료의 경우 모두 알렉시바이러스에 의해 감염되어 있어 GLV(Garlic latent virus), LYSV(Leek yellow stripe virus), GCLV(Garlic common latent virus), OYDV(Onion yellow dwarf virus)와의 비특이적 반응에 대해서는 확인이 불가능하였다.

표 4. 최종 선발된 알렉시바이러스 속 특이적 프라이머 조합

조합	정방향 프라이머	역방향 프라이머	산물 크기 (bp)
13	Al-N30	Al-C30	281
15	Al-N30	Al-C20(2)	347
16	Al-N30	Al-C20(1)	347

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3종의 프라이머 세트는 알렉시바이러스 속을 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 진단법을 실시할 경우, 마늘 바이러스에 대한 RT-PCR 진단 키트의 산업화가 우선적으로 가능하며, 또한 이 진단법을 이용하여 바이러스에 감염되지 않은 무병마늘을 생산할 수 있어 그 경제적·사회적 파급효과는 매우 클 것으로 예상된다.

도 1은 외피단백질 유전자 염기서열을 이용한 마늘에 발생하는 바이러스들의 분류학적 체계 확립을 보여준다. 붉은색으로 표시된 분리주는 국내 분리주이다.

도 2는 설계한 알렉시바이러스 프라이머 위치를 보여준다.

도 3은 알렉시바이러스와 조합한 17가지 프라이머 쌍의 RT-PCR 결과를 보여준다. 레인 1 내지 17은 표 3에 기재된 알렉시바이러스 프라이머 조합 1 내지 17을 각각 나타낸다.

도 4는 최종 선발된 알렉시바이러스(Allexivirus) 프라이머 조합의 마늘 발생 바이러스와의 RT-PCR 결과를 보여준다.

PepMOV (Pepper mottle virus, 고추모틀바이러스)

TBRV (Tomato black ring virus, 토마토흑색윤점바이러스)

PVY (Potato virus Y, 포테이토바이러스Y)

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific primers for detection of Allexivirus in garlic, and uses thereof <130> PN08151E <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-N30 primer <400> 1 caytchatga aygcbaarat gtc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C30 primer <400> 2 ggcttattyt gwctagyytt acg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C30 primer <400> 3 ggyttattkt sttrtratyt acg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C20(2) primer <400> 4 caktcraarc ayctrttgta rcg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C20(2) primer <400> 5 cartcaaarc ayctgyyata rcg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C20(1) primer <400> 6 cartcraarc ayckrtyrta rcg 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-N10 primer <400> 7 tggrcntgct accacaaygg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-N20 primer <400> 8 ttykcngsht tygayttctt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C40 primer <400> 9 ggytgytcat gkatytgttg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C40 primer <400> 10 gghgsttcrt gratytgytg 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C21 primer <400> 11 tcraarcayc trttgtarcc ytt 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C21 primer <400> 12 tcaaarcayc tgyyatarcg ttt 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Al-C10 primer <400> 13 ccyttcagca tatagcttag c 21

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2와 3의 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 4와 5의 프라이머 세트; 및 서열번호 1 및 서열번호 6의 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 알렉시바이러스 속(Allexivirus genus) 진단용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2와 3의 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 4와 5의 프라이머 세트; 및 서열번호 1 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 알렉시바이러스 속은 Garlic virus X, Garlic virus A, Garlic virus B, Garlic virus C, Garlic virus D, Garlic virus E, Shallot virus X, Garlic mite-borne mosaic virus 및 Garlic mite-borne filamentous virus로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 알렉시바이러스 속 진단용 프라이머 세트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트; 및 RT-PCR 에 필요한 시약을 포함하는, 알렉시바이러스 속 진단용 키트.
마늘 시료에서 전체 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 알렉시바이러스를 속 특이적으로 진단하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.