KR20100028122A

KR20100028122A - 신규한 항응고제 화합물, 혈전성 질환을 치료하기 위한 이러한 화합물을 기초로 한 약제 조성물, 및 혈액희석의 응고항진증을 치료하기 위한 혈장-대체 용액

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Publication number: KR20100028122A
Application number: KR1020107002061A
Authority: KR
Inventors: 엘레나 이바노브 시나우리드제; 파조일 이노야토비치 아타울라크하노프; 안드레이 알렉산드로비치 부티린; 블라디미르 보리소비치 설리모프.; 알렉세이 니콜라예비치 로마노프; 알렉세이 알렉스비치 보골류보프; 유리 블라디미로비치 쿠즈네쵸프; 이리나 블라디미로브나 그리브코프; 알렉산더 세르게예비치 고르바텐코; 올가 아나톨리예프나 콘다코프
Original assignee: 오브스체스트보 에스 오그라니체노이 오트베트스트베노스트쥬 ‘비오니카’
Priority date: 2007-06-28
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2010-03-11
Also published as: US8426433B2; AU2008269258A8; EA020915B1; AU2008269258A1; RU2353619C2; CA2692363A1; AU2008269258B2; RU2007124202A; JP2010531353A; CN101848894B; EA201000064A1; WO2009002229A2; UA98969C2; EP2178839A2; WO2009002229A3; CN101848894A; US20110003826A1

Abstract

본 발명은 신규한 화학적 화합물, 항응고제로서의 이러한 화합물의 적용, 이를 기초로 한 혈장-대체 용액에 관한 것으로서, 심근경색증, 뇌졸중 및 심정맥 또는 폐동맥의 혈전증과 같은 질환의 혈전색전성 합병증을 치료하고; 손상, 수술, 패혈증, 다양한 산과 병리학, 재해, 의학, 소생술 등의 결과로서 응고항진증을 예방하기 위해 사용될 수 있다.

Description

신규한 항응고제 화합물, 혈전성 질환을 치료하기 위한 이러한 화합물을 기초로 한 약제 조성물, 및 혈액희석의 응고항진증을 치료하기 위한 혈장-대체 용액 {NEW ANTICOAGULANT COMPOUNDS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS ON THEIR BASIS TO TREAT THROMBOTIC CONDITIONS, AND PLASMA-SUBSTITUTING SOLUTION TO CORRECT HYPERCOAGULATION DEFECTS OF HEMODILUTION}

본 발명은 신규한 화학적 화합물, 이러한 화합물의 항응고제로서의 적용, 및 이를 기초로 한 혈장-대체 용액에 관한 것으로서, 심근경색증, 뇌졸중, 심정맥 또는 폐동맥의 혈전증과 같은 질환에서의 혈전색전성 합병증을 치료하고; 손상, 수술, 패혈증, 다양한 산과 병리(obstetric pathology), 재해 의학, 소생술 등의 결과로서 응고항진증의 발달을 예방하기 위해 사용될 수 있다.

유기체에서 엄청난 수의 다양한 병리는 지혈 시스템에서의 질병에 의해 야기된다. 심근경색증, 뇌졸중, 심정맥 또는 폐동맥의 혈전증과 같은 질환으로부터 발달하는 혈전색전성 합병증은 세계 각국에서 사망의 주요 원인 중 하나이다. 효과적이고 안전한 임상 약물로서 제공될 수 있는 약제를 개발하기 위해 수년 동안 집중적으로 노력되고 있다는 것은 거의 놀라운 일이 아니다. 무엇 보다도, 이러한 것들로는 항응고 성질을 나타내는 항혈전 제제가 있다.

트롬빈은 가용성 혈장 단백질인 피브리노겐을 불용성 섬유소 응괴로 전환시키는 혈액 응고 시스템의 주요 효소이고, 동시에 상기 시스템에서 대부분의 양성 및 음성 피드백을 유발시키고, 혈전구(혈소판), 인자 V, VIII, 및 XIII 및 단백질 C를 활성화시킨다. 트롬빈은 또한 내피 세포의 증식, 플라스미노센 활성제의 배출 등을 포함하는 다양한 세포 반응 및 혈관 반응을 개시한다. 트롬빈이 다수의 중요한 생물조절 사건(bioregulatory event)에서 수반되는 것을 고려하여, 이의 활성 중심에서의 트롬빈 억제는 많은 병리생리학적 질병을 조절함에 있어서 매우 효과적이고 많은 가능성을 제시함에 틀림이 없다.

요망되지 않는 혈전증을 예방하기 위해 지혈 시스템에 영향을 미치게 하는 3가지 주요 방법이 존재한다 - 응고 시리즈(clotting series)에서 세린 프로테아제의 직접 및 간접 억제제의 사용 (첫째로, 트롬빈 및 인자 Xa); 혈전구의 응집 성질을 감소시키고, 이에 따라 추가의 응고를 예방하는 항혈전 제조물의 이용 (길항제 GPIIb/IIIa, 아스피린, 트롬빈 수용체 길항제, 등); 및 간에서 응고 인자 전구체의 합성을 감소시키는 비타민 K 길항제의 사용.

3가지 주요 항혈전 제조물, 즉 미분획 헤파린; 경구 항응고제 와파린 (비타민 K 길항제), 및 혈전구 응집 억제제로서의 아스피린은 오늘날 임상에서 사용되고 있다. 그러나, 이러한 제조물들 각각은 사용에 있어 제한되고, 요망되지 않는 부작용을 형성시킨다.

미분획 헤파린 (UFH)은 우론산 (L-이두론산 및/또는 D-글루쿠론산) 잔기 및 D-글루코사민의 잔기로 구성된 반복 이당류 단위로부터 구성된 상이한 길이의 다당류 사슬의 혼합물인 천연 음이온 다당류이다. 이의 분자량은 상이한 공급원에 따라 3,000-5,000 내지 30,000-40,000 달톤이며, 12,000 내지 15,000 달톤에서 정점을 이룬다.

미분획 헤파린 및 이의 가벼운 유사체 (저분자량 헤파린, 또는 LMWH)는 간접 항응고제이다. 이러한 것들은 그 자체로 트롬빈을 억제하지 못하지만, 천연 혈장 응고 억제제 항트롬빈 III (ATIII)의 효과를 향상시킨다. 이에 따라, 환자의 혈장 중의 ATIII의 함량이 여러 이유로 매우 낮은 경우, 헤파린은 약한 항응고 효과를 나타낸다.

임상 실습에서 사용되는 경우, 미분획 헤파린은 여러 결점을 갖는다:

1. 미분획 헤파린은 약제의 투여 중지 후에 매우 빠르게 사라지는 일시적인 효과를 가지며, UFH는 반복되는 혈전성 사건의 위험을 낮출 수 없다.

2. 헤파린은 이의 항혈전 효과를 간접적으로 나타내며, 적어도 이를 나타내기 위하여, 시스템에서 항트롬빈의 존재하에 사용되어야 한다.

3. 헤파린은 단지 순환하는 트롬빈에 대해서 활성적이고, 응괴 상에 흡수된 트롬빈을 거의 억제하지 못한다.

4. 동일한 용량의 헤파린은 혈장 중 ATIII의 수준, 개개의 제조물 주입 속도, 상이한 혈장 단백질 및 활성화된 혈전구(혈전성 인자 3, 헤파리나제 등)의 효과하에서 헤파린의 결합 및 중화를 포함한 수많은 이유로 상이한 환자들에서 예측치 못한 반응을 갖는다. 이는 빈번한 간격으로 응고 시스템의 상태를 모니터링함을 요구한다.

5. 출혈성 합병증의 위험 및 저혈소판증의 가능성.

6. 골다공증은 장기적인 헤파린 치료요법 (6 개월 이상) 및 충분히 높은 헤라핀 용량 (> 15000 단위) 이후에 합병증으로서 발달하기 쉽다.

7. 헤파린은 병원 조건에서 단지 정맥내로 주사되어야 한다.

비타민 K 길항제 (와파리 타입)는 또한 간접 응고 억제제이다. 이러한 제조물이 응고 시스템에서 나타내는 효과의 메카니즘은 간에서 비타민 K-의존성 응고 인자의 합성을 효과적으로 차단하기 위한 이들의 능력에 기인한 것이다. 미래 인자(future factor)의 N 말단 단부의 번역후 γ-카르복실화는 인자 분자를 합성하기 위해 필수적이다. 카르복실화는 활성화된 혈전구의 음으로 하전된 인지질 표면에 응고하는 동안 인자 분자가 (Ca²⁺ 이온을 통해) 결합되고 이들의 기능을 달성하기 위해 절대적으로 요구된다. 비타민 K는 중요한 카르복실화 보조 인자이다. 반응 동안에, 이는 실제로 카르복실화 반응에서 포함되는 히드록시-퀴논 형태와 이의 산화된 에폭시 형태를 교대로 갖는다. 비타민 K 환원 효소의 효과 하에서, 에폭시 형태는 환원되어 다시 카르복실화 반응으로 다시 제공될 수 있다. 코우마린 기에서의 제조는 환원을 차단한다.

와파린 역시 여러 한계 및 단점들을 가지고 있다. 첫째, 이는 치료 요법에 대해 느린 반응을 나타낸다. 이는 투여 후에 24 시간에 최초로 관찰되고, 수일내에 전체 강도에 이른다. 또한 제조물은 다양한 식품 성분들에 강력하게 결합하고, 많은 약제에 의해 상당히 중첩된다. 이는 또한 와파린 대사 효소의 활성에서 상당한 유전적 변이성을 가지고 있다. 이는 와파린에 대한 상당한 개개의 변이성을 설명하는 것으로서, 특정의 식이 제한 및 전신 모니터링이 와파린 수용체에 대해 요구됨을 제안한다.

본 출원인이 상기에서 설명한 바와 같이, 항혈전 제조물 (아스피린, GPIIb/IIIa 길항제 등)은 혈전구의 완전한 활성 및 트롬빈의 계속적인 생산을 제한하는 응고 반응을 향상시키기 위한 이의 기여를 방해한다. 그러나, 이러한 것들은 이미 형성된 트롬빈의 성능에 영향을 미치지 못한다.

요약하면, 상기 각각 조사된 모든 표준 항응고제는 단점들을 가지고 있다. 이들 중 일부는 필수적인 응고 인자 (와파린 등)의 합성의 억제를 달성하거나 이러한 합성을 단지 느리게 달성하게 하기 위해 혈장 중에 항트롬빈 III (UFH 또는 LMWH)이 존재하는 것을 요구하는 직접 트롬빈 억제제가 아니며, 나머지 (항응고제)는 이미 형성된 트롬빈에 영향을 미치지 못한다. 이는 표준 제조물의 많은 단점들이 존재하지 않으면서 거의 같은 효능의 "이상적인" 억제제를 위해 여러 해 동안 집중적인 탐색을 지속하는 이유이다.

이러한 측면에서 항응고제로서 작용하는 작은 합성 트롬빈 억제제를 개발하는 전략에 큰 흥미를 갖는다. 이러한 억제제는 혈액 중에 존재하는 트롬빈에 빠르고 직접적인 효과를 가지며, 이는 혈장 중에 ATIII 결핍에도 불구하고 급성 혈전성 합병증을 조절에 있어 효과적일 것을 시사하는 것이다.

응고 시스템에서 신규한 직접 합성 세린 프로테아제 억제제에 대한 전략적인 탐색은 이러한 억제제가 만족할 것으로 예상되는 하기 요건들을 충족하는데 초점을 맞춘다:

● 타겟 효소에 대한 높은 친화력 (즉, 높은 억제 효능),

● 다른 관련 세린 프로테아제와 비교하여 타겟 효소에 대한 높은 선택성,

● 화학적 및 대사 안정성,

● 무독성,

● 약한 (또는 매우 강력하지 않은) 혈장 단백질에 대한 결합,

● 구강을 통해 투여되었을 때 높은 생체이용률,

● 경구로 투여되는 경우, 혈장 중의 치료학적 수준을 일일에 1 또는 2개의 제조물 섭취로 충분할 수 있는 수준으로 유지되게 하는, 제조물의 비교적 긴 반감기,

● 제조물 수준의 간단한 모니터링의 가능성.

저분자량 트롬빈 억제제의 개발에 기울여진 수많은 조사들이 이의 작성 시점에 공개되었다 [Shafer J. A., Cardiovascular Chemotherapy: Anticoagulants, Curr. Opin. Chem. Biol., 1998, 2:458-465; Steinmetzer T., Hauptmann J., Sturzebecher J., Advances in the Development of Thrombin Inhibitors, Exp. Opin. Invest. Drugs, 2001, 10(5):845-864; Edmunds JJ, Rapundalo ST, Siddiqui MA, Thrombin and Factor Xa Inhibition, Ann. Rep. Med. Chem., 1996, 31:51-60; Wiley M.R., Fisher M. J., Small Molecule Direct Thrombin Inhibitors, Expert Opin. Ther. Patents, 1997, 7:1265-1282; Hauptmann J, Sturzebecher J., Synthetic Inhibitors of Thrombin and Factor Xa: from Bench to Bedside, Thromb. Res., 1999, 93(5):203-241; Vacca JP., New Advances in the Discovery of Thrombin and Factor Xa Inhibitors, Curr. Opin. Chem. Biol., 2000, 4(4): 394-400)].

그러나, 신규한 화학적 화합물을 기초로 한 약제의 개발은 이들의 가능한 약제학적 효과를 평가하는 것 이외에, 제조물의 독성학적 성질 및 유전적 형질에 대한 이들의 가능한 효과의 조심스러운 시험, 및 이들의 적용의 다른 희박한 결과를 확인함을 요구한다.

이러한 과제는 완충 수용액 중에서 트롬빈 활성을 감소시키는 각 억제제가 유기체에서 혈액 응고를 조절하기 위한 실제 항응고제로서 제공될 수 있다는 것과는 거리가 멀다는 사실에 의해 복잡하여진다. 이는 예를 들어 억제 메카니즘과 관련될 수 있다. 특히, 억제제가 경쟁적이지 않은 경우에, 효소 활성은 혈장 트롬빈의 활성 중심 100%가 이러한 억제제에 결합되는 경우에도 완전히 억제되지 않을 것이다. 잔류 트롬빈 활성은 충분히 낮을 수 있지만, 특정 경우에 천연 트롬빈 억제제 - ATIII에 의해 혈장에서 전부 억제될 수 없다. 이는 이러한 억제제가 결합될 때 트롬빈 분자 형태의 특정 개질로 인해 발생하며, 이는 활성 트롬빈 중심에 접근하는 것으로부터 ATIII를 방해한다. 결론적으로, 혈액은 오랜 시간 동안 잔류 트롬빈 활성에 지속적으로 노출되며, 통합 응고 반응은 떨어지지 않고 심지어 유기체 중에 이러한 화합물의 존재로 인하여 궁긍적으로 증가할 수 있다. 예상되는 트롬빈 억제제가 응고 시스템의 다른 성분들 (인자 또는 응고 억제제)과 반응하는 경우, 이러한 시스템의 최종적인 반응을 미리 예측하는 것은 불가능하다. 억제제와 다양한 혈장 단백질 간의 강력한 결합은 요망되는 항응고 효과를 달성하기 위해 유기체에 투여되어야 하는 용량을 크게 증가시킬 수 있다.

상기 기술을 고려하여, 현재 트로빈을 억제할 수 있는 많은 수의 합성된 화합물이 이용가능하지만, 일본에서 합성된 트롬빈 억제제인 아르가트로반 단 하나가 모든 필수적인 시험을 통과하였고 임상 실습에서 효과적인 것으로 인정받은 이유가 분명해진다 [미국특허 5,214,052, 1993; Schwarz R.P., The Preclinical and Clinical Pharmacology of Novastan (Argatroban), In: "New Anticoagulants for the Cardiovascular Patient," Pifarre R., editor, Hanley and Belfus, Inc., Philadelphia, PA, U.S., 1997, pp. 231-249; Okamoto S, Hijikata A, Kikumoto R, Tonomura S, Hara H, Ninomiya K, Maruyama A, Sugano M, Tamao Y., Potent Inhibition of Thrombin by the Newly Synthesized Arginine Derivative No. 805. The Importance of Stereo-Structure of its Hydrophobic Carboxamide Portion, Biochem. Biophys. Res. Cornmun. 1981, 101(2):440-446].

합성 저분자량 트롬빈 억제제 중 신규한 항응고제에 대한 탐색은 지속적으로 도전적인 과제로 존재한다.

이러한 억제제들은 여러 병리학의 결과로 유기체에서 발달하는 급성 혈전성 질병을 직접적으로 치료하기 위한 항응고제로서 사용될 수 있다.

또한, 이러한 것들은 또한 응고항진(hypercoagulability)을 미리 방지하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 표준 혈장-대체 용액에 첨가되게 하기 위해, 혈장에서 항응고 활성을 나타내는 합성 저분자량 트롬빈 억제제를 사용하는 것을 제안한다.

임상에서 나타나는 빈번한 상황은 많은 양의 손실된 혈액을 인공 혈장-대체 용액 (PSS)로 신속히 대체되는 것을 요구한다. 혈액 손실은 손상, 수술, 패혈증, 다양한 산과 병리학, 재해 의학, 소생 등에 의해 야기된다.

본 발명은 하기 주요 목적들을 추구한다:

1. 동맥압 및 심박출량을 유지하여 혈관 허탈을 방지하고 혈액의 정상적인 유동학적 특징 및 기관과 조직의 정상 관류를 유지시키기 위해 순환 혈액량 (VCB)를 대체시킴.

2. 혈장의 교질 삼투압 및 이의 산-염기 평형 상태를 유지시킴.

3. 혈액의 산소-이송 기능 및 응고 시스템 기능을 유지시킴.

위에서부터 두개의 목적을 달성하기 위하여, 다양한 혈장-대체 용액 및 알부민 용액을 수혈하는 것이 일반적인 관행이다. 산소-이송 기능은 적혈구, 개질된 헤모글로빈 또는 퍼플루오란(perfluoran)의 산소-허용 용액(oxygen-enduring solution)의 수혈에 의해 충족되며, 응고 시스템 기능은 신선 동결 혈장 (FFP), 혈전구 농축물, 농축된 프로트롬빈 복합물 인자, 또는 개개의 응고 인자를 수혈함으로써 유지된다.

인공 혈장-대체 용액은 두개의 부류로 나누어진다: 결정상 및 콜로이드상. 첫번째 부류는 염 용액 (예를 들어, 0.9% NaCl 용액, 생리학적 염수)이며, 두번째 부류는 고분자량 폴리머 (덱스트란, 히드록시에틸 전분, 젤라틴 유도체 등)의 첨가제를 함유한다.

표준 PSS의 대량 주입은 이러한 용액과 혈액 희석을 초래한다(hemodilution). 오늘날 사용되는 표준 혈장-대체 용액이 응고 인자 및 억제제를 함유하지 않기 때문에, 혈액 희석은 혈액 중의 응고 시스템 성분의 농도를 낮춘다. 다량의 표준 PSS 수혈을 통해 발달하는 혈액 희석이 응고 시스템의 균형을 깨뜨리고 응고를 증대시키는 것이 이미 알려져 있다. 이는 중간정도의 희석이 응고 속도에 대해 임의의 상당한 효과를 갖도록 이들의 농도의 감소를 야기시키지 않는다는 점에서, 희석이 응고 시스템을 응고 인자의 전응고제 전구체가 혈장 중에 상당히 과도한 양으로 존재함에도 불구하고 응고 억제제의 농도의 감소에 대해 매우 민감하기 때문에 발생한다. 대량 PSS 수혈에 의해 야기되는 가능한 응고항진증을 치료하기 위하여, 본 발명자들은 천연 트롬빈 억제제, 항트롬빈 III을 포함하는 신규한 PSS를 개발하였다 (2005년 12월 27일에 오피스 액션(Office Action)에 의해 출원번호 2005140841호로 발행된 러시아 특허). 청구된 해법은 대량 PSS 수혈에 의해 야기된 응고항진증을 일부 치료할 수 있는 신세대 혈장-대체 용액의 선구자이다. 이러한 해법은 항트롬빈 III이 인간 혈장으로부터 추출된 천연 단백질이기 때문에 결코 최고의 선택이 아니다. 이와 같이, 이는 덜 고가이고, 제조물이 바이러스 (HIV, 간염 등)에 의해 감염될 가능성을 배제하지 않을 것이다. 합성 저분자량 트롬빈 억제제인 항응고제는 항트롬빈 III에 대한 양호한 대체물일 수 있다.

항응고제 역할에서의 실질적인 적용의 측면에서 눈에 뜨이는, 즉 혈액 응고를 늦추고/거나 방지할 수 있는 화합물은 하기 기준을 기초로 하여 선택되었다:

1. 상기 물질은 피브리노겐 분자가 파괴되는 트롬빈-촉매 비색 반응을 방지할 수 있는 트롬빈 억제제이어야 한다.

2. 상기 물질은 혈장 중에 결합되지 않는 상태의 충분한 농도로 존재하기 위해 허용되는 물리화학적 특징 (친유성 및 친수성)을 가져야 하며, 다시 말해서 이는 다른 혈장 단백질 (알부민, 글로불린 등)에 중간정도로 결합되어야 한다.

3. 상기 물질은 이의 고유의 치료학적 효과를 나타내기 위하여 혈장 중에 충분히 긴 수명을 가져야 한다.

첫번째 기준에 따른 선택은 2 단계로 이루어졌다. 먼저, 구조식 (I)로 기술된 구조를 중심으로 한 가상 라이브러리가 세워지고, 얻어진 구조들은 트롬빈 분자의 활성 중심으로 도킹된다. 가장 가능성 있는 예상 ("가상 히트"), 즉 적어도 -5.0 kcal/mole 정도로 양호한 스코어링 함수 판독(scoring function reading) (도킹 공정 동안 측정됨)을 기록하는 분자는 제 1 단계의 마지막에 선택된다. 제 2의 선택 단계는 수성 완충용액에서 트롬빈 활성에 대한 상기와 같이 선택된 화합물의 직접 억제 효과를 측정함을 포함하며, 여기서 트롬빈은 특이적 발색성 (또는 형광성) 기질을 파괴한다. 기질 파괴 반응 속도는 억제제의 존재에서 느려진다. 충분히 작은 농도 (<1 mM)로 사용되는 경우에도, 완충용액에서 트롬빈 활성을 60% 초과까지 억제하는 화학식 (I)의 화합물은 혈액에서 신규한 화합물의 항응고 효과의 후속 시험을 위해 선택된다.

유기체에서 효과적인 항응고제일 수 있는 신규한 트롬빈 억제제의 분자는 유익한 약물동력학에 기여하는 억제제 분자 허용가능한 물리화학적 성질을 제공하기 위해 친수성 링커를 선택함으로써 전체적으로 화학식 (I) 억제제 분자의 소수성 특성의 균형을 어느 정도 깨뜨리는 것이 바람직한 방식으로 구성된다. 또한, 동일한 목적으로, 트롬빈 분자의 포켓 S3에 증착된 친수성 분절을 포켓에서 용매에 노출된 측면에 증착된 친수성 잔기와 함께 개질시키는 것이 가능하다.

혈장에서의 충분한 수명은 화학적 또는 생화학적 공정에서 용이하게 파괴되는 불안정한 화학적 기가 없는 억제제 구조를 유지시킴으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 에스테르기는 이러한 원치않는 기의 일예이다.

결론적으로, 이러한 기준을 최적으로 충족시키는 분자 (심지어 이따금 모순되는 경우에도)는 화학적 합성 및 항응고제로서의 후속 실험적 시험을 위해 선택될 수 있다.

합성을 시작하기 위한 최종 결정은 이의 가능한 복잡성에 대해 고려하면서 이루어졌다.

달리 명시되지 않는 한, 하기 정의들이 본 명세서에서 사용된다:

활성 암은 생화학적 반응에서 중요한 역할을 하는 단백질 거대분자의 영역이다.

단백질은 단백질 거대분자를 의미한다.

타겟 단백질은 결합 공정에서 수반되는 단백질 거대분자를 의미한다.

리간드는 저분자량 화학 구조물의 집합을 의미한다.

결합 공정은 리간드와 타겟 단백질의 활성 암의 반 데르 발스(Van der Waals) 또는 공유 복합물의 형성을 의미한다.

스크리닝(screening)은 단백질 거대분자의 특정 영역과 선택적으로 반응하는 화학 구조물의 집합에서 화합물의 세트를 확인하는 것을 의미한다.

정확한 포지셔닝(Correct positioning)은 리간드-단백질 복합물의 최소 자유 에너지에 해당하는 위치에 리간드를 배치시키기 위한 포지셔닝을 의미한다.

선택적 리간드는 특정 방식으로 특정 타겟 단백질에 결합되는 리간드를 의미한다.

기준 단백질은 실험 데이타에 따라 또는 작동 시스템을 확인하는 동안에 모델 계산의 스코어의 파라미터를 조절하거나 특정 억제제의 결합 특이성을 평가하기 위해 사용되는 단백질을 의미한다.

확인(Validation)은 작동에 있어 이러한 시스템의 특질 및 제공된 타겟 단백질에 신뢰성 있게 결합되는 무작위 세트의 리간드들로부터 리간드를 선택함에 있어 이의 효율을 평가하기 위한 일련의 계산 및 비교 방법을 의미한다.

특이적으로 결합한 리간드는 특정 단백질에만 결합되고 임의의 다른 단백질에 결합되지 않는 리간드를 의미한다.

억제제는 특정 타겟 단백질의 활성 암에 결합되고 일반 과정의 생화학 반응을 차단하는 리간드를 의미한다.

도킹(Docking)은 단백질의 활성 암에서 리간드의 포지셔닝을 의미한다.

스코어링(Scoring)은 단백질에 리간드를 결합시키는데 필요로 하는 자유 에너지를 평가하기 위한 계산을 의미한다.

ΔG 결합은 타겟 단백질에 리간드를 결합시키는데 필요로 하는 얻어진 자유 에너지 계산 증가를 의미한다 (SOL 소프트웨어 사용).

C_1-6 알킬은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 비분지되거나 분지된 탄화수소 사슬을 포함하는 알킬기, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 3차-부틸 등을 의미한다.

C_1-6 알콕시는 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 비분지되거나 분지된 탄화수소 사슬을 함유한 알콕시기, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 등을 의미한다.

할로겐은 염소, 브롬, 요오드, 또는 불소를 의미한다.

약제학적으로 허용되는 염은 독성을 가지고 있지 않거나 활성 화합물의 흡수 및 약리학적 효과를 억제하지 않는 경우의, 화학식 (I)의 활성 화합물에 의해 생성된 임의의 염을 의미한다. 이러한 염은 화학식 (I)의 화합물과, 유기 염기 또는 무기 염기, 예를 들어 소듐 히드록사이드, 칼륨 히드록사이드, 암모늄 히드록사이드, 메틸아민, 에틸아민 등과의 반응에 의해 생성될 수 있다.

용매화물은 결정상 격자가 화학식 (I)의 활성 화합물을 결정화시키는 물 또는 다른 용매의 분자를 함유하는 화학식 (I)의 활성 화합물의 결정상 형태를 의미한다.

약제학적으로 허용되는 담체는 조성물 중의 다른 성분들과 양립가능하고 수용체에게 해롭지 않는, 즉 사용되는 용량 및 농도에서 세포 또는 포유동물에 비독성이어야 하는 담체를 의미한다. 종종, 약제학적으로 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 또는 유기산의 다른 염을 기초로 한 용액; 아스코르브산, 저분자량 (10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드를 포함한 항산화제; 단백질, 예를 들어 혈장 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함한, 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 및 당 알코올, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨을 포함한다.

치료학적 유효량은 포유동물 유기체에서 요망되는 치료학적 효과 (즉, 요망되는 범위의 혈전증 억제)를 달성하기 위해 필요로 하는 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 의미에서의 포유동물은 영장류 (예를 들어, 인간, 유인원 원숭이(anthropoid apes), 비-유인원 원숭이(non-anthropoid apes), 및 저급의 몽키), 육식 동물 (예를 들어, 고양이, 개, 및 곰), 설치 동물 (예를 들어, 마우스, 랫트, 및 다람쥐), 식충 동물 (예를 들어, 뒤쥐(shrew) 및 두더지) 등을 포함한다.

본 출원인에 의해 정해진 실제 과제는 높은 항응고 활성을 나타내는 신규한 저분자량 화합물을 개발함으로써 달성된다.

본 출원은 높은 항응고 활성을 나타내는 일련의 신규한 저분자량 화합물, 특히 하기 화학식 (I)의 화합물, 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 기술한다:

A-B-C (I)

상기 식에서, C는 하기 구조를 포함하는 군으로부터 선택되며:

여기서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 서로 독립적으로 수소 또는 C_1-6 알킬이며;

B는 -(CH₂)_n-이며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이며;

A는 하기 구조를 포함하는 군으로부터 선택되며:

여기서, R₅는 수소, C_1-6 알콕시, CH₂NR₁₀R₁₁, 및 CH(CH₃)NR₁₀R₁₁을 포함하는 군으로부터 선택되며;

여기서, R₆ 및 R₇은 독립적으로 수소, C_1-6 알킬; C_1-6 알콕시; 및 할로겐이며;

R₈은 수소 또는 C_1-6 알킬이며;

R₉는 하기 구조를 포함하는 군으로부터 선택되며:

R₁₀ 및 R₁₂는 서로 독립적으로 수소, C_1-6 알킬; (CH₂)_mCOOR₁₃, 및 (CH₂)_mCON(R₁₃)₂,

를 포함하는 군으로부터 선택되며;

여기서, m은 1 내지 4의 정수이며;

R₁₃은 수소 또는 C_1-6 알킬이며;

R₁₁은 C_1-6 알킬 또는 Ar이며;

Ar은 수소, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 할로겐, N(R₁₃)₂, OH, NO₂, CN, COOR₁₃, CON(R₁₃)₂, 및 SO₂R₁₃의 군으로부터 선택된 1개 내지 5개의 치환기를 갖는 페닐, 피리딜, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 푸라닐, 피리미디닐, 피리다조닐, 피라지닐, 인돌릴, 벤조푸라닐, 또는 벤조티오페닐이며;

단, 하기 구조는 제외된다.

이러한 리스트로부터 배제된 화합물들은 이미 공지된 것으로서, 특히 4-아미노-1-[3-[(2-메틸페닐)아미노]-3-옥소프로필]피리디늄 클로라이드는 문헌 [the Journal of Medicinal Chemistry, 17(7), 739-744, 1974, in "Carbocyclic Derivatives Related to Indoramin"]에 기술되어 있으며, 4-아미노-1-(2-페녹시에틸)-피리디늄 브로마이드는 문헌[the Journal of Organic Chemistry, 26, 2740-7, 1961, in "Application of Sodium Borohydride Reduction to Synthesis of Substituted Aminopiperidines, Aminopiperazines, Aminopyridines And Hydrazines"]에 기술되어 있다. 그렇지만, 이러한 문헌들에서 기술된 화합물들이 트롬빈 억제제로서 사용될 가능성에 대해 언급되어 있지 않음에 주목할 가치가 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 청구항 제1항의 하기 화합물, 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 기술한다:

상기 식에서, Y는 수소, 할로겐, COOR₁₃, CON(R₁₃)₂, 및 SO₂R₁₃으로 구성된 군으로부터 선택되며; r은 2 내지 5의 정수이다.

본 출원은 또한 다양한 혈전성 질병을 치료하고 예방하기 위한 항응고제로서 화학식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 용매화물의 투여, 및 치료학적 유효량의 청구항 제1항에 청구된 화합물, 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및/또는 용매화물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 혈전성 질병을 치료하기 위한 약제 조성물을 기술한다.

본 출원은 항응고제로서의 화학식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 함유한 신규한 혈장-대체 용액 (PSS)을 기술한다. 상기 용액은 표준 혈장-대체 용액에 화학식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 첨가함으로써 제조된다. 첨가되는 항응고제의 농도는 이의 억제능에 따르고, 상이한 화합물에 대해 넓은 범위(0.01 nM 내지 1 mM)내에서 변경될 수 있다. 항응고제 함유 용액은 응고 인자, 및 더욱 중요하게 응고 억제제를 함유하지 않는 표준 혈장-대체 용액의 대량 수혈의 결과로 유기체에서 발달하는 응고항진증을 일부 치료할 수 있다. 인공의 합성 저분자량 항응고제를 함유한 신규한 PSS는 유리하게 천연 트롬빈 억제제 ATIII를 함유한 유사한 용액에 비해 우수한데, 이는 고가의 천연 단백질 (ATIII) 대신에 보다 저렴한 표준 억제제를 함유하고 PSS 주입 동안 바이러스 감염의 위험을 지니지 않기 때문이다.

본 발명의 화합물은 혈액 중에 이들의 생물 축적을 초래하는 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 이는 정맥내, 근육내, 피부내, 피하, 및 복막내 주사를 포함한 비경구 투여 방법에 의해 달성될 수 있다. 다른 투여 방법, 예를 들어 적절한 조성물의 경구 적용에 의해 위장관을 통한 흡수가 또한 이용될 수 있다. 경구 적용이 용이한 사용으로 인해 바람직하다. 대안적으로, 약제는 질 및 직장 근육 조직을 통해 투여될 수 있으며, 또한 본 발명의 화합물은 피부를 통해 주입될 수 있거나(예를 들어, 경피로), 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이해할 수 있게, 바람직한 투여 방법은 환자의 상태, 나이, 및 감수성(susceptibility)에 따른다.

경구 적용을 위하여, 약제 조성물은 예를 들어 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어 결합제 (예를 들어, 교질로 용액화된(peptized) 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리디논 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로즈), 충전제 (예를 들어, 락토즈, 미정질 셀룰로즈, 칼슘 히드로포스페이트; 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리콘 옥사이드: 감자 전분 또는 녹말질의 소듐 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예를 들어, 소듐 라우릴설페이트)와 함께 정제 또는 캡슐로 포장될 수 있다. 정제가 코팅될 수 있다. 액체 경구 조성물은 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태로 제조될 수 있다. 이러한 액체 제조물은 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어 현탁화제 (예를 들어, 셀룰로즈 유도체); 유화제 (예를 들어, 레시틴), 희석제 (정제된 식물성 오일); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-n-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)을 이용하여 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 조성물은 또한 적절한 완충염, 착향제, 안료 및 감미제를 함유할 수 있다.

이러한 트롬빈 억제제의 독성은 LD₅₀ (집단의 50%에 대한 치사량)을 측정하기 위해 실험 동물에서 표준 약제학적 절차를 이용하여 측정되었다. 본 발명의 바람직한 화합물에 대해, LD₅₀ 용량은 367 mg/kg을 초과하였으며, 이는 LD₅₀ = 475 mg/kg을 갖는 임상 시험 후의 아르고트로반의 치사량과 일치하는 것이다.

본 발명의 대상을 보다 이해하기 위하여, 신규한 화합물 및 이러한 화합물의 항응고 활성을 연구하기 위해 사용되는 방법 및 이러한 연구 결과를 기술한 여러 실시예가 하기에 기술된다. 본 실시예는 일예로서, 본 발명의 사상을 하기에 제공된 실시예의 범위로 제한하지 않는다.

실시예 1

3-(3-클로로프로폭시)-5-메틸페놀의 중간 생성물의 합성

3.8 g (27 mmol)의 오르신(orcin) 수화물, 4.8 g (30 mmol)의 1-브로모-3-클로로프로판, 및 4.0 g (29 mmol)의 칼륨 카르보네이트의 혼합물을 30 ml의 아세토니트릴 중에서 교반시키면서 36 시간 동안 비등시켰다. 이후 상기 반응 혼합물을 증발시키고, 30 ml의 에테르 중에 용해시키고, 15 ml의 칼륨 카르보네이트의 포화 용액으로 2회 세척하고, 수층을 폐기하고, 에테르층을 15 ml의 10% 소듐 히드록사이드 용액으로 3 차례 추출하였다. 상기 에테르층을 폐기하고, 수층을 진한 HCl로 조심스럽게 산성화시키고, 이후 15 ml의 에스테르로 3 차례 추출하였다. 에테르 추출물을 합치고, 소량의 소듐 히드로카르보네이트 포화 용액으로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조시키고, 대략 1/3 부피부의 헥산으로 희석시키고, 실리카겔의 층을 통해 여과하였다. 이를 증발시켜 1.7 g의 황색 오일의, 약 70% 오르신 (Rf 0.10) 및 약 30% 3-(2-클로로프로폭시)-5-메틸페놀 (Rf 0.26, 수율: 약 1.2 g (순수한 물질에 대해 22%))의 혼합물을 수득하였다.

유사한 방법을 이용하여 오르신 수화물 및 1-브로모-2-클로로에탄으로부터 3-(2-클로로에톡시)-5-메틸페놀 (Rf 0.26, 수율: 약 1.1 g (순수한 물질에 대해 20%))을 수득하고, 오르신 수화물 및 1-브로모-4-클로로부탄으로부터 3-(4-클로로부톡시)-5-메틸 페놀을 수득하였다.

실시예 2

2-플루오로벤젠 설폰산의 3-(3-클로로프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르의 중간 생성물의 합성

2.05 g (10 mmol)의 플루오로벤젠 설포클로라이드 및 1.1 g (11 mmol)의 트리에틸아민을 30 ml의 무수 테트라히드로푸란 (THF) 중의 1.3 g의 상기 실시예 1A의 혼합물의 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 6 시간 동안 교반하고, 트리에틸암모늄 히드로클로라이드의 침전물을 여과하고 증발시켰다. 얻어진 오일을 20 ml의 에테르 중에 용해시키고, 10 ml의 10-12% 암모니아 수용액 중에서 수차례 세척하여 과량의 미반응된 벤젠 설포클로라이드 (박막 크로마토그래피 (TLC)에 의해 조절)를 분리한 후에, 10 ml의 대략 20% 염산으로 세척하였다. 무수 소듐 설페이트로 건조시키고, 증발시켜 2.4 g의, 타겟 생성물 및 디벤젠-설포닐화된 오르신의 대략 2:1 비의 혼합물인 엷은 황색 오일을 수득하였으며, 순수한 타겟 생성물에 관한 수율은 1.6 g(반응으로부터 97%)이었다 (Merk plate 60의 TLC, 헥산-에틸아세테이트 2:1, Rf 0.35 - 생성물, Rf 0.25 - 디벤젠 에스테르 불순물).

유사하게, 3-(2-클로로에톡시)-5-메틸페놀, 3-(3-클로로프로폭시)-5-메틸페놀, 및 3-(4-클로로부톡시)-5-메틸페놀 및 적절한 아릴설포클로라이드를 수득하였다:

2-클로로벤젠 설폰산의 3-(3-클로로프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르 (순수한 물질에 대해 77%)

벤젠 설폰산의 3-(3-클로로프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르 (60%)

2-카르보메톡시 벤젠 설폰산의 3-(3-클로로프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르 (56%)

벤젠 설폰산의 3-(2-클로로에톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (72%)

2-클로로벤젠 설폰산의 3-(2-클로로에톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (35%)

2-플루오로벤젠 설폰산의 3-(2-클로로에톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (34%)

2-카르보메톡시 벤젠 설폰산의 3-(2-클로로에톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (37%)

벤젠 설폰산의 3-(4-클로로부톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (45%)

2-클로로벤젠 설폰산의 3-(4-클로로부톡시)-5-메틸페닐 에스테르(27%)

2-플루오로벤젠 설폰산의 3-(4-클로로부톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (32%)

2-카르보메톡시 벤젠 설폰산의 3-(4-클로로부톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (21%).

실시예 3

2-플루오로벤젠 설폰산의 3-(3-아이오도프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르의 중간 생성물의 합성

2 g (13 mmol)의 하소된 소듐 아이오다이드를 30 ml의 무수 아세톤 중 2.4 g의 상기 실시예 (2A)의 혼합물에 첨가하고, 27 시간 동안 비등시켰다. 상기 반응 혼합물을 이후 10 ml의 헥산으로 희석시키고, 여과하고, 증발시켰다. 얻어진 진한 황색 오일을 20 ml의 에테르-헥산 혼합물 (2.3 g) 중에 용해시키고, 실리카겔 층(2 cm, Lancaster)을 통해 여과시키고, 증발시켰다. 상기 결과물은 2.4 g의, 2-플루오로벤젠 설폰산의 3-(2-아이오도에톡시)-5-메틸페닐 에스테르 (Rf 0.35) 및 각각의 오르신의 디벤조일 설폰산 에스테르 (Rf 0.25)를 함유한 황색 오일이었다.

유사한 기술을 이용하여 적절한 염화물을 하기 화합물로 처리하였다:

벤젠 설폰산의 3-(3-아이오도프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르

2-클로로벤젠 설폰산의 3-(3-아이오도프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르

2-카르보메톡시 벤젠 설폰산의 3-(3-아이오도프로폭시)-5-메틸페닐 에스테르

벤젠 설폰산의 3-(2-아이오도에톡시)-5-메틸페닐 에스테르

2-클로로벤젠 설폰산의 3-(2-아이오도에톡시)-5-메틸페닐 에스테르

2-플루오로벤젠 설폰산의 3-(2-아이오도에톡시)-5-메틸페닐 에스테르

2-카르보메톡시 벤젠 설폰산의 3-(2-아이오도에톡시)-5-메틸페닐 에스테르

벤젠 설폰산의 3-(4-아이오도부톡시)-5-메틸페닐 에스테르

2-클로로벤젠 설폰산의 3-(4-아이오도부톡시)-5-메틸페닐 에스테르

2-플루오로벤젠 설폰산의 3-(4-아이오도부톡시)-5-메틸페닐 에스테르

2-카르보메톡시 벤젠 설폰산의 3-(4-아이오도부톡시)-5-메틸페닐 에스테르

실시예 4

4-아미노-1-(3-(3-메틸-5-(2-플루오로벤젠 설포닐옥시)페녹시)프로필)-피리디늄 아이오다이드 (HC_029s_IOC)의 합성

10 ml의 무수 디옥산 중의 0.65 g의 "미정제 아이오다이드" (상기 실시예 3A로부터) (70%의 활성 물질에 대해 계산됨) 및 0.09 g (0.95 mmol)의 4-아미노피리딘의 혼합물을 20 시간 동안 비등시켰다. 상기 혼합물을 냉각시킨 후에, 상기 용액을 증발시키고, 얻어진 오일을 고체로 변할 때까지 일부분의 에테르로 빻았다. 상기 고체 침전물을 여과하고, 디옥산과 아세토니트릴의 혼합물(5:1)로부터 2회 재결정화하고, 상기 염 침전물을 여과하고, 에테르로 세척하였다. 진공 중에서 건조하여 약 4-5%의 확인되지 않는 불순물을 함유한 0.4 g (72%)의 엷은 베이지색 염을 수득하였다. 상기 물질을 동일한 시스템으로부터 다시 재결정화하여 불순물을 제거하고, 0.25 g의 엷은 칼라의 분말을 수득하였다.

유사한 기술을 이용하여 적절한 아이오다이드 및 헤테로사이클 화합물, 티오우레아, 및 티오우레아 유도체를 하기 화합물로 처리하였다:

4-아미노-1-(3-(3-메틸-5-(벤젠 설포닐옥시)페녹시)프로필)-피리디늄 아이오다이드 (HC_016s_IOC)

2-아미노-1-(3-(3-메틸-5-(벤젠 설포닐옥시)페녹시)프로필)-티아졸리윰 아이오다이드 (HC_017s_IOC)

3-(3-메틸-5-(벤젠 설포닐옥시)페녹시)프로필-이소티오우로늄 아이오다이드 (HC_018s_IOC)

4-아미노-1-(2-(3-메틸-5-(벤젠 설포닐옥시)페녹시)에틸)-피리디늄 아이오다이드 (HC_019s_IOC)

2-(3-메틸-5-(벤젠 설포닐옥시)페녹시)에틸-이소티오우로늄 아이오다이드 (HC_020s_IOC)

2-(3-메틸-5-(2-클로로벤젠 설포닐옥시)페녹시)에틸-이소티오우로늄 아이오다이드 (HC_024s_IOC).

3-(3-메틸-5-(2-클로로벤젠 설포닐옥시)페녹시)프로필-이소티오우로늄 아이오다이드 (HC_026s_IOC)

4-아미노-1-(2-(3-메틸-5-(2-클로로벤젠 설포닐옥시)페녹시)에틸)-피리디늄 아이오다이드 (HC_025s_IOC).

유사한 방식으로, 실시예 1-4에 기술된 기술을 이용하여, 화합물을 다양한 아릴 설포닐 클로라이드 및 헤테로사이클 설포닐 클로라이드로부터 합성하였다. 합성된 화합물의 화학식, 질량 분석 파라미터, 및 컴퓨터처리 스코어링 함수는 하기 표 1에 나타내었다. 상기 화합물들은 아이오다이드, 브로마이드, 클로라이드, 또는 다른 염의 형태로 수득될 수 있다.

실시예 5

하기 화합물들의 합성

1. 4-클로로-3-니트로벤젠-1-설포닐 클로라이드

o-니트로클로로아닐린 (15 g)을 교반하면서 30 ml의 클로로설폰산에 첨가하고, 100℃에서 2 시간 동안 가열한 후에, 110℃에서 2 시간 및 127℃에서 5 시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 분쇄된 얼음 (140 g)에 부었다. 침전물을 여과하고, 필터 케이크(filter cake)를 얼음물로 세정하고, 공기 중에서 건조시켰다. 결과물은 15 g의 4 클로로-3-니트로벤젠-1 설포닐 클로라이드이었다.

2. 4-클로로-N-메틸-3-니트로-N-페닐벤젠 설폰아미드

4-클로로-3-니트로벤젠-1-설포닐 클로라이드 (10.6 g, 0.041 mol)를 톨루엔 (50 ml) 중에 용해시키고; 트리에틸아민 (4.14 g, 0.041 mol)을 첨가하였다. 얻어진 용액에, N-메틸아닐린 (4.4 g, 0.041 mol)을 교반하에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 70-80℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 이를 냉각시켰다. 냉각된 용액을 30 ml의 물로 2차례 세척하고, 진공하에서 농축시켰다. 상기 잔류물을 에탄올로부터 재결정화하였다. 4-클로로-N-메틸-3-니트로-N-페닐벤젠 설폰아미드의 수율은 9.4 g (61%)이었다.

3. N-메틸-4-(메틸아미노)-3-니트로-N-페닐벤젠 설폰아미드

에탄올 (50 ml) 중의 4-클로로-N-메틸-3-니트로-N-페닐벤조일 설폰아미드 (9.4 g, 0.029 mol)의 용액을 25 ml의, 40% 메틸아민의 수용액과 합쳤다. 상기 반응 혼합물을 70℃로 가열하고, 상기 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 냉각 및 여과 후에, 필터 케이크를 에탄올로 세척하고, 60℃에서 건조시켰다. N-메틸-4-(메틸아미노)-3-니트로-N-페닐벤조일 설폰아미드의 수율은 9.0 g (97%)이었다.

4. 3-아미노-N-메틸-4-(메틸아미노)-N-페닐벤젠 설폰아미드

N-메틸-4-(메틸아미노)-3-니트로-N-페닐벤조일 설폰아미드 (9 g, 0.028 mol)를 이소프로판올 (90 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액에, 히드라진 수화물 (11 ml), 활성탄 (2 g), 및 FeCl₃·6H₂O (10 ml 에탄올 중 0.5 g)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 8 시간 동안 비등시켰다. 상기 활성탄을 여과로 제거하였다. 여과물을 건조상태로 증발시켰다. 3-아미노-N-메틸-4-(메틸아미노)-N-페닐벤젠 설폰아미드의 수율은 8.1 g (99%)이었다.

5. 3-클로로-N-(5-(N-메틸-N-페닐 설파모일)-2-(메틸아미노)페닐)프로판아미드

얼음 (~5℃)으로 냉각된 디메틸포름아미드 (16 ml) 중의 3-아미노-N-메틸-4-(메틸아미노)-N-페닐벤젠 설폰아미드 (5.4 g, 0.018 mol) 및 트리에틸아민 (1.81 g, 0.018 mol)의 용액에, 클로로프로피오닐 클로라이드 (2.32 g, 0.018 mol)를 첨가하였다. 상기 반응물을 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 이후에, 물 (14 ml) 및 아세토니트릴 (5 ml)을 5 시간 동안 첨가하였다. 형성된 침전물을 여과하였다. 3-클로로-N-(5-(N-메틸-N-페닐설파모일)-2-(메틸아미노)페닐)프로판아미드의 수율은 3.1 g (45%)이었다.

6. 4-아미노-1-(3-(5-(N-메틸-N-페닐설파모일)-2-(메틸아미노)페닐아미노)-3 -옥소프로필)피리디늄 클로라이드

3-클로로-N-(5-(N-메틸-N-페닐설파모일)-2-(메틸아미노)페닐)프로판아미드 (1 g, 0.0026 mol) 및 4-아미노피리디늄 (0,73 g, 0.0078 mol)을 무수 아세톤 (50 ml) 중에서 50 시간 동안 비등시켰다. 잔류물을 여과하고, 아세토니트릴과 에탄올의 10:1 혼합물로부터 결정화하였다.

4-아미노-1-(3-(5-(N-메틸-N-페닐설파모일)-2-(메틸아미노)페닐아미노)-3-옥소프로필)피리디늄 클로라이드의 수율은 0.54 g (43%)이었다.

7. 4-아미노-1-(2-(1-메틸-5-(N-메틸-N-페닐설파모일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)에틸)피리디늄 클로라이드.

아세토니트릴 (8 ml) 중의 4-아미노-1-(3-(5-(N-메틸-N-페닐설파모일)-2-(메틸아미노)페닐아미노)-3-옥소프로필)피리디늄 클로라이드 (0.2 g, 0.00042 mol)의 현탁액에, 티오닐 클로라이드 (0.2 ml)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 10 분 동안 비등시킨 후에, 이를 실온에서 24 시간 동안 정치시키고, 이후 디에틸 에테르 (8 ml)로 희석시켰다. 형성된 침전물을 여과로 수집하고, 아세토니트릴과 탈수화된 에탄올의 10:1 혼합물로부터 결정화하였다. 4-아미노-1-(2-(1-메틸-5-(N-메틸-N-페닐설파모일)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)에틸) 피리디늄 클로라이드의 수율은 0.055 g (26%)이었다.

유사한 방식으로, 실시예 5에 기술된 기술에 의해, 여러 화합물들을 합성하였으며, 화학식, 질량 분석 파라미터, 및 컴퓨터처리된 스코어링 함수는 표 2에 나타내었다. 상기 화합물들은 아이오다이드, 브로마이드, 클로라이드 또는 다른 염의 형태로 수득될 수 있다.

실시예 6

지혈에 대한 합성된 화합물의 효과 평가

본 연구에서 신규하게 합성된 화합물의 존재하에 응고 시스템의 상태를 트롬빈 응고 시간 (TT)을 측정하기 위한 표준 응고 시험 및 공간에서 트롬빈 발생 및 응괴 성장의 2개의 최신 시험관내 시험을 이용하여 평가하였다. 내부 또는 외부 경로 각각에 대해 최대 응고 활성화의 백그라운드에 대해 수행되고, 이러한 이유로 연구된 시스템에서 응고항진증을 검출할 수 없는 응고 시간을 측정하기 위한 표준 시험과는 별도로, 이러한 실험을 유기체에서 존재하는 것과 밀접한 매우 낮은 초기 활성화에서 수행하였다. 이는 이러한 것들을 연구된 혈장 샘플에서 저- 및 과다응고 둘 모두에 대해 민감하다.

트롬빈 시간 측정

트롬빈 응고 시간 시험은 일련의 응고 반응, 즉 혈장 피브리노겐을 시스템에 첨가된 트롬빈 효과 하에서 불용성 섬유소 응괴로의 변환이 완료되는 시간이다. 표준 활성화 수준에서 고정된 양의 트롬빈을 3.8% 소듐 시트레이트 (pH = 5.5에서)에서 제조된 혈액 (혈액 대 시트레이트 비 = 9:1)을 원심분리 (1,300 g에서 15분)하여 얻어진 혈소판-불량 혈장(pletelet-poor plasma (PPP))에 첨가하였다. 이러한 시험에서 측정된 응고 시간은 혈액 중에 존재하는 트롬빈 억제제의 수에 따른다. 이는 강력한 트롬빈 억제제가 시스템에 존재하는 경우 증가하였으며, 이는 첨가된 효소의 활성을 감소시키고, 이러한 방식으로 응고를 지연시킨다.

트롬빈 시간을 표준 방법 [Z.S. Barkagan, A.P. Momot, "Diagnostics and Controlled Therapy of Hemostatic Disorders," Newdiamed, Moscow, 2001, pp. 87-89]으로 측정하였다. 특히, 37℃의 수욕에서 3 분 동안 가열된 90 마이크로리터의 PPP를 바이올라 엘티디(Biola Ltd.; Russia)로부터의 응집기의 큐벳에 배치시킨 후에, 10 마이크로리터의, 시험 물질과 완충제 (큐벳에서 상이한 화합물에 대해 0.005 mM 내지 5 mM로 변경되는 최종 농도를 달성하기 위함)의 혼합물 및 100 마이크로리터의 트롬빈 용액 (정상 혈장 대조군의 활성에 따라 표준화됨)을 첨가하였다. 응고 시간을 측정하고, 그 결과를 3회의 개개의 실험으로부터 평균내었다.

내인성 트롬빈 전위(endogenous thrombin potential)의 측정 (트롬빈 발생 시험)

이러한 방법은 많은 논문에서 상세히 기술되어 있다 [Hemker HC, Giesen PL, Ramjee M, Wagenvoord R, Beguin S. The thrombogram: monitoring thrombin g eneration in platelet-rich plasma. Thromb. Haemost, 2000; 83(4): 589-591; Hemker HC, AlDieri R, Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr. Opin. Hematol., 2004, 11(3):170-175; Hemker HC, Giesen P, AlDieri R, Regnault V, de Smed E, Wagenvoord R, Lecompte T, Beguin S. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol. Haemost. Thromb., 2002, 32(5-6):249-253)]. 이러한 시험을 이용하여 혈장 샘플 중에서 발생된 활성 트롬빈의 동력학 및 전체 양을 샘플 중 표준 응고 활성화 수준에서 특정된 시간에 따라 측정하였다. 이러한 출원인의 방법은 느린-작동 형광 기질 (slow-action fluorogenic substrate; BOC-Ile-Gly-Arg-AMC)을 이용하여 트롬빈 농도를 측정하기에 적합하며, 이러한 기질은 트롬빈이 파괴될 때 고도의 형광 생성물, 7-아미노-4-메틸코우마린 (AMC)을 제공한다. 발색성 기질 보다 형광 기질의 사용은 샘플 중 형광 수준이 계량하는 세포에서 형성된 고체 섬유소 응괴에 의해 실제로 영향을 받지 않지만 이는 발색성 기질의 적용을 제한하는 조건이라는 사실에 의해 지시되는 것이다. [Hemker HC, Giesen P, AlDieri R, Regnault V, de Smed E, Wagenvoord R, Lecompte T, Beguin S. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol. Haemost. Thromb., 2002, 32(5-6) :249-253]. 다른 한편으로, 샘플 중의 트롬빈의 벌크 (약95%)가 제 1 응괴가 이미 형성된 후에 발생된다는 것은 주지의 사실이다 [Hemker HC, AlDieri R, Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr. Opin. Hematol., 2004, ll(3):170-175].

트롬빈 발생의 동력학 및 응고 활성화 후에 혈장 중의 최종적인 손실은 도 1에 도시되어 있으며, 이는 혈장 샘플 중의 활성 트롬빈의 농도와 시간 간의 관계를 나타낸 것이다. 트롬빈 발생 시간 곡선 아래의 면적 (본 발명에서, 0 내지 50분의 인큐베이션)은 내인성 트롬빈 전위 (ETP)라 불리워진다. 상기 곡선은 또한 t_max, 샘플 중 트롬빈이 최대 농도에 도달하는 시간, A_max, 시스템에서의 최대 트롬빈 농도, 및 t_lag, 통상적으로 트롬빈이 5 nM의 농도에 도달할 때의 시간인 응고 개시 전의 시간에 의해 특정된다.

명확하게, 중요한 응고 정보는 시간 곡선에 대한 트롬빈 농도의 형태, 및 통합 ETP 수준의 형태에 포함되어 있다. 특히, 낮은 인자의 백그라운드 및 응고 억제제 농도에 대해, 전체 ETP가 전혀 변하지 않아도 최대의 트롬빈 농도는 더욱 낮아질 수 있고, 또한 넓어질 수 있다. 혈장 중 추가 트롬빈 억제제의 존재는 ETP 및 최대 달성가능한 트롬빈 농도를 감소시키며 응고 지연(clotting lag) 및 최대 농도를 달성하기 위해 트롬빈에 요구되는 시간을 증가시킨다.

하기와 같이 측정을 수행하였다: 90 마이크로리터의 정상 도너(donor) 혈장 (PPP), 0 내지 20 마이크로리터의 시험 물질 용액, 및 20 내지 0 마이크로리터의 완충용액 (20 mM의 HEPES, 140 mM의 NaCl, pH 7.5)을 96 홀보드의 홀에 침적시켜 첨가된 물질 및 완충제의 전체 부피가 항상 20 마이크로리터가 되도록 하였다. 이후, 20 마이크로리터의 형광 기질 용액 (5 mM 초기 농도)을 상기 보드 홀의 각각에 첨가하고, 혈장을 37℃에서 3 내지 5분 동안 가열하였다. 이후, 25 마이크로리터의 응고 활성제 용액을 모든 홀에 (다중채널 피펫을 이용하여) 동시에 첨가하였다. 프로트롬빈 시간 (PT) (RENAM, Russia)을 측정하기 위한 80 mM의 CaCl₂를 추가로 함유한 동일한 완충제에 의해 본래 농도의 1/250으로 희석된 표준 트롬보플라스틴 제제로부터 제조된 트롬보플라스틴 용액을 활성제로서 사용하였다. 활성제가 첨가될 때의 시작을 카운트다운 시간의 개시로 하였다. 형광 반응 생성물 축적 (AMC)의 동력학을 60 분 동안 기록하였다. 각 시점에서의 생성물 축적 시간은 그 시점에서 혈장 중에 존재하는 트롬빈 농도에 비례한다. AMC 축적 곡선을 미분함으로써,시간에 대한 시스템 중의 트롬빈 농도의 비율을 측정하고, 그 결과 곡선의 특징으로 나타내는 파라미터를 측정하는 것이 가능하다. 통상적인 형광 단위를 각 샘플에 대해 이러한 혈장 샘플 중 공지된 AMC 농도의 신호에 따라 신호를 조정함으로써 절대 AMC 농도로 변형시켰다. 방법의 선형성을 넓은 범위의 AMC 농도내에서 미리 시험하였다.

공간에서 응괴 성장 속도의 측정

공간에서의 응괴 성장 속도는 응고의 역학을 기술하는 것으로서, 이는 시간 및 공간을 따라 발달되는 공정이다. 이러한 방법은 응고가 개시된 직후 상이한 시간에 응괴의 크기를 결정하기 위해 광산란을 측정한다. 응고는 시스템에서 교반없이 공간에서 정확하게 국소화된 활성제에 의해 활성화된다. 활성제로는 대안적으로 내부 경로 상에서 접촉 활성을 야기시키기 위하여 하부 모서리를 갖는 단순한 유리판 또는 외부 경로 상에서 응고를 활성화시키기 위해 조직 인자를 갖는 표면 상에 제공된 섬유아세포-코팅된 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막이 있다. 응고가 외부 경로 상에서 활성화되는 경우, 옥수수 트립신 억제제를 200 mkg/ml의 농도로 초기 혈장에 첨가하여 시스템에서 접촉 응고 활성을 방지하였다. 혈소판-부재 혈장 (PFP)에서 측정하였으며, 이는 10,000 g에서 10 분 동안 추가 PPP 원심분리에 의해 수득되었다.

마이크로-카메라를 35 mm 폴리스티렌 페트리 디시에 탑재시켰다. 응고를 외부 경로 상에서 활성화시켰을 때, 1 mm 두께의 유리판의 단부를 폴리에틸렌 테레프탈레이트 막으로 둘러싸고, 그 위에서 섬유아세포를 성장시켰다. 상기 판을 이후 상기 디시의 하부에 양면 스카치 테이프(Scotch tape)를 이용하여 고정시켰다. 유리판 단부는 활성제로 코팅된 마이크로-카메라의 측면 모서리로서 제공되었다. 유사하게, 바깥면이 검정색 페인트로 덥혀지고 유리판의 모서리를 넘어 연장하는 폴리스티렌판을 마이크로-카메라의 상부 표면을 규정하기 위해 유리판의 상부 표면 상에 붙였다. 예상되는 트롬빈 억제제를 지니거나 지니지 않은 재석회화된 혈소판-부재 혈장 (20 mM 최종 농도이 첨가된 CaCl₂)을 응고-활성화 측벽과 이의 접촉을 방지하기 위하여 상부 판 및 카메라 하부 사이의 공간에 조심스럽게 부었다. 활성제와 접촉으로 들어간 순간 플라즈마는 t=0으로서 마킹되었다. 상기 디시를 견고하게 밀봉하고, 투명한 하부를 갖는 온도조절식 37℃ 큐벳에 배치시키고, 이를 통해 디시 중의 플라즈마를 적색 다이오드광 (λ=660 nm)으로 발광시켰다. 영구적인 마이크로-카메라 영역 (7.2 × 5.4 mm)의 이미지를 이미지 캡쳐 플레이트 EZ98 (Lifeview Inc., USA)에 연결된 비디오 카메라 OS-75D (Mintron Enterprise, Taiwan)로 30초 마다 기록하여 이를 디지털처리하고 비디오 카메라에서 이미지 컴퓨터의 메모리로 들어가게 하였다.

실험 개시로부터 상이한 시간에 상응하는 광산란 프로파일을 일련의 기록된 이미지를 처리하여 수득하였다. 이들이 성장함에 따라, 응괴는 활성제 표면에서 혈장으로 추가로 퍼져나갔다. 각 프레임에서의 응괴 크기를 광산란이 최대 수치의 절반을 갖는 지점인 것으로 추정되는 활성제와 응괴 모서리의 거리로서 측정하였다. 응괴 성장 속도는 이후 시간에 대한 응괴 크기의 직선의 경사 각도의 탄젠트값으로서 확인되었다. 이러한 방법은 하기 논문에서 보다 상세히 기술되어 있다 [Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1572(l):45-57; Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov FI. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb. Haemost, 2003, 89(2):235-242].

도 2는 정상 혈장에서 성장하는 응괴의 연속 사진을 도시한 것이다 (왼쪽의 밴드는 유리 활성제이며, 섬유소는 밝은 영역에 의해 나타내어진다). 제 1 프레임은 활성제에 대해 정상인 밴드를 나타내며, 그 위에 광산란 프로파일이 계산되었다.

성장하는 응괴의 광산란 프로파일은 도 3에서 응고의 개시로부터의 상이한 시점에서 나타난다.

최종 산출 처리 단계(last output processing stage)는 얻어진 광산란 프로파일을 기초로 하여 응괴 성장 속도를 계산하였다. 응괴 크기를 활성제로부터의 개개의 광산란 프로파일의 거리로서 각 시점에서 평가하였다 (최대 프로파일 높이의 절반인 지점에서). 도 4는 계산된 시간에 대한 응괴 크기의 비율을 도시한 것이다. 응괴의 준-정체 성장 속도를 곡선의 선형부의 경사 각도로부터 계산하였다.

착수된 시험은 본 출원에서 청구된 신규하게 합성된 화합물이 항응고 성질을 가지며, 즉 이러한 것들이 혈장 응고를 늦추는 것으로 나타났다.

혈장 중 상이한 농도의 화합물 HC-020s-IOC의 존재하에 트롬빈 발생 시험에서 측정된 특정 파라미터의 변경은 하기 실시예에 의해서 알 수 있다 (참조: 표 3). 도 5는 기록기에 의해 직접적으로 기록된 혈장 응고를 초래하는 트롬빈과 형광 기질 간의 파괴 반응에서 형광 생성물의 축적으로 구성된 곡선을 도시한 것이다 (통상적인 형광 단위는 미리 준비된 예비 보정(ready calibration)을 이용하여 절대 AMC 농도로 변환될 수 있다). 도 6은 도 5의 곡선을 미분함으로써 측정된 실험 과정에 대한 트롬빈 농도 변경의 동력학적 프로파일을 도시한 것이다. 트롬빈 전위의 감소 및 시스템 중 억제제 농도의 성장과 함께 트롬빈 발생 곡선 상에서의 최대점에 도달하는데 필요한 시간의 증가는 도 7 및 도 8 각각 도시되어 있다. 이러한 결과는 혈장 응고가 시험 화합물 (HC-020s-IOC)의 농도가 증가함에 따라 현저하게 감소된다. 내인성 트롬빈 전위에서 50% 감소를 야기시키는 화합물의 농도 (IC₅₀)는 0.9 mcM인 것으로 확인되었다. 이에 따라, 이러한 화합물은 강력한 항응고제이다.

다음의 3개의 도면은 화합물 HC-025s-IOC의 존재하에 공간적 응괴 성장 동력의 변화를 도시한 것이다. 도 9 및 도 10은 응고가 초기 정상 혈장에서 및 1 mcM의 이러한 화합물의 존재하에 동일한 혈장 중에서 각각 계속되는 동안 기록된 광산란 프로파일을 도시한 것이다. 도 11은 혈장 대조군 및 1 mcM의 화합물 HC-025s-IOC의 존재하의 혈장에 대한 응괴 크기의 성장 (활성제로부터 응괴가 퍼져나간 거리) 대 시간을 도시한 것이다. 얻어진 곡선들 간의 비교는 또한 혈장 중에 존재하는 화합물 HC-025s-IOC가 응고를 억제함을 나타낸다.

신규하게 합성된 화합물 중 일부의 항응고 효과를 나타낸 실시예는 하기 표 3에 제공되어 있다.

실시예 7

정상 도너 혈액의 결정상 혈장-대체 용액 (NaCl 0.9%)으로의 희석과 함께 응고의 증대 및 상기 대체 용액에 다양한 농도의 트롬빈 활성 억제 화합물 HC-025s-IOC를 첨가함으로써의 이의 보정

혈액 대 시트레이트 (20 ml)의 9:1 비로 3.8% 소듐 시트레이트에서 제조된 도너 혈액을 1,300 g에서 15 분 동안 원심분리하였다. 일부의 혈소판-불량 혈장(PPP)을 10,000 g에서 10 분 동안 원심분리하여 혈소판-부재 혈장 (PFP)을 수득하였다. 이에 따라 형성된 PFP를 내인성 트롬빈 전위를 측정하기 위해 사용하였다.

PFP를 수혈-등급 생리학적 염수 (NaCl 0.9%) 또는 추가적으로 트림빈 억제제 HC-025s-IOC (0.25, 0.5 또는 1 mcM의 농도)를 함유한 동일한 농도로 1.5, 2, 3 및 4의 비율로 희석시켰다. 재석회화후 시험을 통해 일정한 농도의 Ca²⁺를 유지시키기 위하여, 소듐 시트레이트 용액을 모든 혈장 희석액에서 일정하게 유지시켜 초기 비희석된 용액에서의 농도와 동일하게 하였으며, 이러한 목적을 위하여 혈장의 희석시키기 위해 사용된 초기 혈장-대체 용액을 먼저 유사하게 9:1 용액 대 시트레이트 비로 초기 혈액과 함께 3.8% 소듐 시트레이트와 혼합하였다.

상술된 ETP 측정방법에서 사용된 혈장 샘플을 1.5 비율로 전체적으로 희석시켰다. 혈장을 PSS로 희석시키기 위한 실험에서 비희석된 혈장 중의 ETP를 측정하기 위한 기회가 제공되어야 한다. 이에 따라, 측정 동안 실제로 희석시키는 혈장없이 이러한 실험에서 ETP를 측정하기 위한 특별한 방법을 개발하였다. 측정을 수행하기 위하여, 200 마이크로리터의 혈장 샘플 (비희석된 PSS 또는 요망되는 배수로 희석된 PSS)을 측정을 수행하기 위해 96-홀 보드의 셀에 배치시켰다. 이후에, DMSO 중 2 마이크로리터의 형광 기질 용액 (30.75 mM의 출발 농도)을 각 셀에 첨가하였다. 응고가 개시됨에 따라, 3 마이크로리터의 활성제를 각 셀에 첨가하였다. 상기 활성제 용액을 pH 7.5에서 20 mM의 HEPES, 140 mM의 NaCl 및 1.235 M의 CaCl₂를 함유한 완충제로 20배 희석시킨 프로트롬빈 시간 (Renam company, Russia)을 측정하기 위해 사용된 표준 트롬보플라스틴으로부터 제조하였다. 이후 상술된 방법으로 측정을 수행하였다. 내인성 트롬빈 전위를 상이한 농도의 HC-025s-IOC의 존재하에 각각의 희석된 혈장에 대해 측정하였다.

도 12는 상이한 억제제 농도를 함유한 NaCl (0.9%) 용액으로의 일련의 혈장 희석액에서의 ETP 측정 결과를 도시한 것이다. 명확하게, 혈장이 첨가된 억제제의 부재하에 대체 용액으로 점착적으로 희석됨에 따라, 내인성 트롬빈 전위는 현저하게 성장하며, 이는 이러한 상태에서 응고 강화를 나타내는 것이다. 특히, 20% 정도로 감소된 ETP 변경은 혈전증 위험 인자로 고려된다 [Hemker HC, Al Dieri R, Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr. Opin. Hematol. 2004, 11(3):170-175]. 본 실험에서, 1.5 내지 4의 비율로 희석된 초기 혈장과 함께 최대 ETP 증가는 상이한 혈장에 대해 1.5배 내지 4배 이상으로 변경된다. 억제제의 첨가는 혈장 희석 때문에 응고 증대 효과를 전부 중화시키지 못하지만, 이를 현저하게 조절하여 상이한 혈장 희석액에 대해 ETP 기록을 감소시킨다. 또한, 용액 중의 0.25-0.5 mcM의 HC-025s-IOC 농도는 상이한 혈장 희석액에 대한 ETP 기록이 정상에 가장 가까운 곡선을 형성시킨다.

표 1

실시예 1 내지 4에 기술된 방법에 의해 합성된 트롬빈 억제제에 대한 질량분석 파라미터 및 컴퓨터처리된 스코어링 함수

표 2.

실시예 5에 기술된 방법에 의해 합성된 트롬빈 억제제에 대한 질량분석 파라미터 및 컴퓨터처리된 스코어링 함수

표 3

일련의 신규하게 합성된 화합물에 대한 항응고 효과 및 급성 독성 수준 (LD₅₀)을 설명한 실시예

Claims

하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
A-B-C (I)
상기 식에서, C는 하기 구조를 포함하는 군으로부터 선택되며:

여기서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 서로 독립적으로 수소 또는 C_1-6 알킬이며;
B는 -(CH₂)_n-이며, 여기서 n은 1 내지 5의 정수이며;
A는 하기 구조를 포함하는 군으로부터 선택되며:

여기서, R₅는 수소, C_1-6 알콕시, CH₂NR₁₀R₁₁, 및 CH(CH₃)NR₁₀R₁₁을 포함하는 군으로부터 선택되며;

여기서, R₆ 및 R₇은 독립적으로 수소, C_1-6 알킬; C_1-6 알콕시; 및 할로겐이며;
R₈은 수소 또는 C_1-6 알킬이며;
R₉는 하기 구조를 포함하는 군으로부터 선택되며:

R₁₀ 및 R₁₂는 서로 독립적으로 수소, C_1-6 알킬; (CH₂)_mCOOR₁₃, 및 (CH₂)_mCON(R₁₃)₂,

를 포함하는 군으로부터 선택되며;
여기서, m은 1 내지 4의 정수이며;
R₁₃은 수소 또는 C_1-6 알킬이며;
R₁₁은 C_1-6 알킬 또는 Ar이며;
Ar은 수소, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 할로겐, N(R₁₃)₂, OH, NO₂, CN, COOR₁₃, CON(R₁₃)₂, 및 SO₂R₁₃의 군으로부터 선택된 1개 내지 5개의 치환기를 갖는 페닐, 피리딜, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 푸라닐, 피리미디닐, 피리다조닐, 피라지닐, 인돌릴, 벤조푸라닐, 또는 벤조티오페닐이며;
단, 하기 구조는 제외된다.
제 1항에 있어서, 하기 구조의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:

상기 식에서, Y는 수소, 할로겐, COOR₁₃, CON(R₁₃)₂, 및 SO₂R₁₃을 포함하는 군으로부터 선택되며;
r은 2 내지 5의 정수이다.
제 1항에 있어서, 혈장 응고를 늦출 수 있는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
포유동물의 혈전증을 치료하기 위한 항응고제로서의 제 1항의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 적용.
치료학적 유효량의 제 1항의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈전성 질환을 치료하기 위한 약제 조성물.
제 1항의 화합물 및/또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및/또는 용매화물을 함유한, 혈액희석에서 응고항진증을 치료하기 위한 혈장-대체 용액.