KR20100016123A

KR20100016123A - 톨페리손 조성물

Info

Publication number: KR20100016123A
Application number: KR1020097022857A
Authority: KR
Inventors: 페데리코 가에타; 클라우스 게르데스; 스테판 벨치히; 베아테 캇츠; 얀 로텐부르크; 요제프 궁글
Original assignee: 아비젠, 인크.; 자노케미아 파마조이티카 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2007-04-26
Filing date: 2008-04-24
Publication date: 2010-02-12
Also published as: CA2683634A1; US20160367540A1; EP2150540B1; US8372979B2; RU2009143670A; KR20100031095A; US9675598B2; WO2008133937A3; WO2008131469A3; EP2150540A2; JP2010525060A; WO2008131469A2; AT505225A1; ES2587369T3; MX2009011544A; US20170239228A1; US9315480B2; WO2008133937A2; CA2685268A1; CA2685268C

Abstract

본 발명은 매우 낮은 4-MMPPO(2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논) 농도를 함유하는 톨페리손의 제공방법뿐만 아니라 이와 관련된 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 다른 특징중에서 피검체에 허용가능한 농도의 4-MMPPO 노출을 제한하는 조건하에서 톨페리손으로 피검체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

톨페리손, 4-MMPPO, 재결정화, 유전자 독성

Description

톨페리손 조성물{COMPOSITIONS OF TOLPERISONE}

본 출원은 2007년 4월 26일자로 출원된 오스트리아 특허출원 제W5-234000PAT 및 2008년 1월 25일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/023,799호를 우선권으로 주장하며, 이들의 내용은 본원에 참고문헌으로 포함되었다.

본 발명은 매우 낮은 농도의 4-MMPPO (2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논)를 갖는 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-3-(피페리디닐)-1-프로파논인 톨페리손 및 이의 제조방법뿐만 아니라 이와 관련된 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 다른 특징 중에서 피검체에 허용가능한 농도의 4-MMPPO 노출을 제한하는 조건하에서 톨페리손으로 피검체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

톨페리손은 마비 및 근육 경련과 같은 증상 치료에 사용된 중추신경 작용(centrally-acting) 근육이완제이다(Martindale, The Extra Pharmacopoeia, 30^th., p. 1211). 또한, 톨페리손은 생리통, 갱년기 호소, 파상품 및 neurolatyrism을 포함하는 질병치료에 사용되어 왔다.

톨페리손의 화학구조식은 하기와 같다:

상기 구조식에서 알 수 있듯이, 톨페리손은 키랄중심(chiral center, 별표(*)로 표시한 부분)을 함유한다. 라세믹 톨페리손은 염산염으로 상업적으로 이용가능하며, Mydeton^®, Mydocalm^®, Midocalm^® 및 Muscalm^®라는 상표명으로 시판중이다.

R(-) 및 S(+) 이성질체로의 톨페리손의 키랄분리가 기술되어 있다.(참조: JP-A-53-40779).

톨페리손은 중추신경계 및 말초신경계에서 멤브레인-안정 효과를 나타낸다(Ono et al., J. Pharmacobio. Dynam. 1984, 7, 171-178). 톨페리손 및 그 염은 경련성 마비와 연관된 다른 증세뿐만 아니라 경추 척수증(Cervical Syndrome), 관절염 및 요통과 같은 질병이나 질환으로 생기는 근긴장(muscle tone)의 개선에 사용되었다. 최근에 신경성 통증 및 여러 신경계 질환과 관련된 통증의 치료에 톨페리손의 사용이 기술된바 있다(참조, 미국 특허출원 제 2006/0004050호).

요약

톨페리손은 많은 별개의 합성 방법으로 제조가능하다. 본 발명자가 인지하 듯이, 출발물질에 존재하거나 톨페리손의 합성공정에서 생성되거나 제형의 유통기한중에 생성되는 부반응 및 화학적 불순물의 결과로, 현재의 톨페리손의 생산방법은 극히 소량으로 존재한다 하더라도 톨페리손의 치료과정 중 환자에게 독성이 될 수 있는 불순물 농도를 함유하는 최종 생성물의 제조에 결점이 되었다.

하나의 관점에서, 본 발명은 유전자 독성제인 4-MMPPO와 같은 불순물을 무시할정도의 농도로 함유하는 개선된 톨페리손의 제공방법의 필요성에 초점을 맞추었다. 다른 관점에서, 본 발명은 다른 것 중에서 톨페리손-함유 약학적 조성물 중에 4-MMPPO와 같은 유전자 독성제에 대한 노출을 최소화하는 톨페리손을 투여하여 피검체를 치료하는 방법을 제공한다.

특히, 적어도 하나의 관점에서 본 발명은 약 10ppm 이하의 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-MMPPO)을 포함하는 톨페리손 그 조성물에 관한 것이다.

하나의 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 톨페리손은 약 7ppm 이하의 4-MMPPO를 포함한다.

다른 실시양태에서, 톨페리손은 약 3ppm 이하의 4-MMPPO를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 약 1.5 내지 10ppm의 4-MPPO를 포함하는 톨페리손이 제공된다.

추가로, 이전에 기술한 톨페리손 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

상술한 일 실시양태에서, 상기 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제는 산을 포함한다.

또 다른 관점에서, 정제된 톨페리손 조성물의 제조방법이 제공된다. 상기 방법은 (i) 10ppm 이상의 4-MMPPO 초기농도, 및 선택적으로 부가 불순물을 포함하는 톨페리손을 제공하는 단계, 및 (ii) 약 10ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 갖는 정제된 톨페리손을 생성하기 위해 톨페리손을 정제하는 단계를 포함한다.

전술한 방법의 일 실시양태에서, 정제단계는 초기농도보다 5배 이상 4-MMPPO 농도를 감소시키는데 효과적이다.

다른 실시양태에서, 상기 방법으로 제조된 톨페리손은 예를 들어 상술한 순도를 갖는 약 7ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 갖는다.

또한 상기 방법은 톨페리손을 제공하기 전에, 톨페리손중에 오염물질인 4-MMPPO의 존재 여부를 확인하고, 톨페리손중의 4-MMPPO 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법의 추가적인 실시양태에서, 상기 정제단계는 단일 용매 또는 용매 결합물로 재결정하여 재결정화된 톨페리손을 제공하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 다른 실시양태에서, 재결정화는 단일 또는 다중 재결정화 단계를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 재결정화는 혼합 유기용매 중에서 실시된다. 구체적인 실시양태에서, 용매계는 저급 케톤 및 저급 알콜을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 용매계는 2-부타논(메틸 에틸 케톤) 및 이소프로판올을 포함한다.

다른 실시양태에서, 재결정화는 톨페리손을 산성화된 용매중에서, 선택적으로(임의로) 가열하에 용해시켜 톨페리손 용액을 생성하고 톨페리손 용액으로부터 톨페리손 결정을 생성하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 또 다른 대안적인 실시태양에서, 정제단계는 건조단계를 포함한다. 건조단계는 대기압 또는 감압하에 실시된다. 건조단계는 대기온도 또는 30℃ 내지 약 60℃의 상승온도에서 실시될 수 있다.

또 다른 관점에서, 톨페리손의 개선된 제조방법이 제공되며, 상기 개선방법은 촉매학적 함량의 산을 첨가하여 4-MMPPO의 생성을 최소화하는 것을 포함한다.

전술한 개선방법의 구체적인 실시양태에서, 산은 무수 염화수소 가스이다.

또한, 전술한 방법 및 모든, 및 특정의 실시양태에 의해 제조되는 정제된 톨페리손 및 그 조성물이 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 톨페리손을 필요로하는 피검체에 톨페리손을 투여하는 개선방법이 제공되며, 상기 개선방법은 약 10ppm 이하의 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-MMPPO), 예를 들어 약 1.5 내지 약 10ppm의 4-MMPPO를 포함하는 톨페리손 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

전술한 구체적인 실시양태에서, 투여의 결과로, 4-MMPPO의 존재와 연관된 조성물의 유전자 독성 효과가 최소화된다.

다른 관점에서, 적당한 용기에 건조제와 결합하여 포장한 약 10ppm 이하의 4-MMPPO를 포함하는 톨페리손이 제공된다.

추가적인 다른 관점에서, 톨페리손을 포함하는 조성물 중의 4-MMPPO의 농도를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 검출방법은

(a) 톨페리손 및 선택적으로 하나이상의 부형제를 포함하는 조성물을 제공하 는 단계,

(b) 부가적인 4-MMPPO의 생성을 막기 위해 산성화된 알콜에 상기 조성물을 용해하여 산성화된 톨페리손 용액을 생성하는 단계,

(c) 유기용매로 추출하여 존재하는 상기 하나 이상의 부형제를 상기 톨페리손과 분리하여 산성화된 톨페리손 추출액을 제공하는 단계,

(d) 4-MMPPO의 함량을 정량하기 위해 내부 표준액(internal standard)에 상기 (b) 또는 (c)용액을 첨가하여 샘플 용액을 제공하는 단계, 및

(e) 액체 크로마토그래피/질량 크로마토그래피에 의해 상기 샘플 용액중의 4-MMPPO 농도를 분석하는 단계(여기서, 상기 액체 크로마토그래피에 도입된 하나 이상의 용출액은 산성화되어, 상기 샘플 중에 500ppm 이하로 존재하는 4-MMPPO 농도가 검출된다)를 포함한다.

전술한 검출방법의 일 실시양태에서, 산성화된 알콜은 염산으로 산성화된다. 구체적인 실시양태에서, 산성화된 알콜은 메탄올성 염산이다.

검출방법의 다른 실시양태에서, 유기용매는 디이소프로필 에테르이다.

다른 실시양태에서, 내부 표준액은 중수소화된 4-MMPPO이다.

본 발명의 방법, 조성물 등의 추가적인 실시양태는 다음의 발명의 상세한 설명, 실시예, 및 청구범위에 의해 명확해질 것이다. 상술하는 내용 및 후술하는 상세한 설명으로부터 이해할 수 있듯이, 본원에 기술된 각각 및 모든 특징, 2개 이상의 이러한 특징을 갖는 각각 및 모든 결합은 이러한 결합에 포함된 특징들이 서로 일치하는 한 본원의 범주에 포함된다. 더욱이, 어떠한 특징 및 특징들의 결합은 본 발명의 어떤 실시예로부터 구체적으로 제외될 수 있다. 본 발명의 부가적인 관점 및 장점은 첨부된 실시예 및 도면과 결합하여 다음의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서 설명되어 진다.

지금부터 본 발명을 보다 상세히 기술하고자 한다.

그러나 많은 다른 형태로 구체화된 본 발명은 본원에 설명한 실시양태로 한정하는 것은 아니며, 이들 실시양태는 해당 기술분야의 전문가에게 본 발명의 범위를 충분히 전달하고자 발명의 설명이 완전하고 완벽해지도록 제공된 것이다.

본원에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 전부 참고문헌으로 본원에 포함되었다.

정의

본 명세서에서 사용된 단수 형태인 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 명확히 달리 지정하지 않는 한 복수를 의미한다.

본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서 다음의 용어는 이하에 기술하는 정의에 따라 사용된다.

용어 톨페리손 뿐만 아니라 본원의 다른 화학 화합물은 디아스테레오머(diastereomer) 및 에난티오머(enantiomer), 염, 솔베이트, 및 동질이상 (Polymorph), 특정 결정성 형태뿐만 아니라 라세믹 혼합물 및 본원에 기술된 화합물의 순수한 이성체를 포함하는 약학적으로 허용가능한 형태의 화합물을 포함하는 것을 의미한다.

"약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체"는 본 발명의 조성물에 임의적으로 포함되어 환자에 투여시 커다란 독성 부작용 효과를 유발하지 않는 부형제를 의미한다.

"약학적으로 허용가능한 염"은 아미노산염, 클로라이드, 설페이트, 포스페이트, 디포스페이트, 브로마이드 및 나이트레이트 염과 같은 무기산으로 제조된 염, 히드로클로라이드와 같은 어떤 형태의 댕응 무기산으로부터 제조된 염, 또는 말레이트(malate), 말리이트(maleate), 푸마레이트, 타트레이트(tartrate, 주석산염), 석시네이트, 에틸석시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄설폰에이트, 벤조에이트, 아스코베이트, 파라-톨루엔설포네이트, 팔모에이트, 살리시레이트 및 스테아레이트와 같은 유기산으로 제조된 염 뿐만 아니라 에스토레이트, 글루셉테이트 및 락토비오네이트 염을 포함하나 이에 한정하지 않는다. "약학적으로 허용가능한 양이온"을 함유하는 유사한 염으로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄(치환된 암모늄 포함)을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

용어 "알킬"이란 전형적으로 길이가 약 1 내지 20개의 원자로 구성되는 탄화수소 사슬을 의미한다. 이러한 탄화수소 사슬은 반드시 필요하지 않지만 바람직하게는 포화되고 전형적으로 직쇄가 바람직하지만 측쇄 떠는 직쇄가 바람직하다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등이 있다. 본원에서 사용된 "알킬"은 3개 이상의 탄소원자가 언급될 때 시클로알킬을 포함한다.

특정 기능기에 대해 "저급"이란 1-16개의 탄소원자를 갖는 기를 의미한다.

예를 들어 "저급 알킬'이란 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 1-에틸프로필, 1,2-디메틸프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, t-부틸등에 의해 직쇄 또는 측쇄일 수 있다.

"선택적 또는 선택적으로"란 이후에 기술되는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있는 것을 의미하며, 상황이 일어나고 실예가 일어나지 않는 경우를 포함한다.

일부 특징 또는 실체에 대해 "실질적으로 결여" 또는 "실질적으로 없는"이란 거의 전부 또는 완전히 그러한 특징 또는 실체가 없는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 톨페리손 생성은 약 10ppm 이하의 4-MMPPO를 함유하는 4-MMPPO가 실질적으로 없다.

"건조 조건"으로 저장되는 톨페리손 조성물은 습도조건(5-25% 상대습도) 및 약 18-25℃의 온도로 제어된 상태로 저장되는 것이다.

톨페리손 조성물은 활성 약학적 성분(API), 또는 톨페리손 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물(분말 등), 또는 캡슐, 정제와 같은 가공된 제품일 수 있다. 병, 블리스터(blister), 파우치 또는 그 결합물과 같은 밀봉용기에 함유된다. 조성물은 또한 전형적으로 수분증발을 흡수하는데 적합한 팩으로 포장된 실리카와 같은 건조제의 존재하에 저장된다.

"무수"란 실질적으로 물이 없는 물질을 의미한다.

본원에서 교대로 사용되는 용어 "피검체", "개인", 또는 환자"란 척추동물로 바람직하게는 포유동물이다. 사람을 포함하며, 이에 한정하지는 않는다.

본원에서 제공된 톨페리손 조성물의 "약학적으로 효과적인 함량" 또는 "치료학적으로 효과적인 함량"이란 경련성 마비와 관련된 증세를 개선하거나 신경성 통증 및 여러 신경계 질환과 연관된 통증의 치료와 같은 소망하는 응답을 제공하는데 필요한 비독성이면서, 충분한 함량의 조성물 또는 약을 의미한다. 필요로 하는 정확한 함량은 피검체마다 다르며, 종(species), 연령 및 피검체의 일반적인 조건 치료받을 조건의 가혹도, 피검체가 섭취하는 추가 약품, 투여방식 등에 따라 달라진다. 어느 개인의 경우에 적절한 "효과적"인 함량은 이전에 지공된 정보에 기초하여 일상의 실험을 사용하여 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 측정이 가능하다.

용어 "약"이란 주어지 함량에 관하여 플러스(+) 또는 마이너스(-) 5%의 편차를 포함한다.

추가적인 정의는 이하의 섹션에서 설명된다.

발명의 개요

상술하였듯이, 본 발명은 톨페리손의 4-MMPPO의 농도가 상업용 제형, 또는 이전에 기술된 제형에서 발견되는 농도보다 상당히 및 바람직하게는 일관되게 감소하는 톨페리손 제형을 제공할 필요성에 대하여 초점을 맞추었다.

톨페리손 조성물의 제조 및 분석방법, 구체적으로 톨페리손 제형중의 4-MMPPO의 낮은 농도를 검출하는데 극히 민감한 분석법을 고안함으로써 본 발명가들은 유전자 독성제인 4-MMPPO에 대해 특히 개선된 순도를 갖는 톨페리손 제형를 제공할 필요성을 인식하였다. 그 결과, 본원에서 제형을 톨페레손 치료에 반응하는 질환의 치료를 위해 피검체에 투여하는 것으로, 투여 결과로, 상기 톨페리손에 4-MMPPO의 존재와 연관된 유전자독성 영향이 최소화된다. 본 발명의 이들 및 다른 관점은 하기에서 보다 상세히 기술될 것이다.

방법의 특징

톨페리손 및 관련된 불순물

2-메틸-1-(4-메틸페닐)-3-(피페리디닐)-1-프로파논으로 칭하는 톨페리손은 하기에 나타낸 화학구조식을 갖는다.

톨페리손은 키랄중심(상기 구조식에서 별표(*)로 표시한 부분)을 함유한다. 라세믹 톨페리손은 염산염으로 상업적으로 이용가능하며, Mydeton^®, Mydocalm^®, Midocalm^® 및 Muscalm^®라는 상표명으로 시판중이다. 본원에서 언급한 톨페리손은 라세믹 톨페리손, 각각의 그 에난티오머(enantiomer), 특정 비율의 혼합물뿐만 아니라 약학적으로 허용가능한 염, 여러 가지 결정형태 및 그 수화물을 포함한다.

상업적으로 얻어지는 것 이외에, 톨페리손은 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 합성이 가능하다. 미국특허출원 공개 제2006/0041141호; Ditriech et al.(1999) J. Labeled Cpd. Radiopharm, 42:1125-1134; 일본특허 제 54032480호(19790309); 일본특허 제 54036274(19790316; 일본특허 제 54030178호(19790306), 일본특허 제 54027571호(19790301); Kazuharu et al.(1994) Chem. Pharm. Bulletin 42(8) 1676; 일본특허 제 20,390(1965) 및 헝가리특허 제 144,997(1956)를 참고하고, 각각의 특허는 본원에 전부 참고로 포함하였다.

톨페리손은 예를 들어, 다음의 단일 단계 합성공정으로 제조될 수 있다.

상기 식에서, 4-메틸프로피오페논은 출발물질로서 사용된다. 상기 예시적인 반응에서, 1,2-디옥솔란은 반응제 및 용매로서 작용한다. 포름알데히드 대신에 1,2-디옥솔란의 사용 및 톨페리손 원생성물의 직접 분리 후의 고수율은 다른 이유 중에서 산업적 규모로 생산시 비용절감 효과때문에 특히 유리한 단일-단계 반응을 가능케 한다. 미국특허 제2006/0041141호 참조.

R(-) 및 S(+) 에난티오머(광학이성질체)와 같은 특정 에난티오머가 소망되는 경우, JP-A-53-40779에 기술된 바와 같이 키랄 분리가 실행된다. 키랄 분리는 또한 Velmurugan, et al., Chromatorgraphia, 56(3-4), Aug. 2002, 229-232에 기술된 대로 실행된다. Velmurugan은 각각의 에난티오머 내로 톨페리손의 가격상-HPLC 분리를 기술하였다.

사용되는 합성 전략에 따라 달라 지지만, 톨페리손 조성물은 다음 불순물중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 피페리딘 히드로클로라이드, 2-메틸-1-(3-메틸페닐)-3-(1-피페리디닐)-프로파논 히드로클로라이드(3-톨페리손 히드로클로라이드), 1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-메틸프로피오페논), 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로페논 (4-MMPPO), 및 2-메틸-1-(2-메틸페닐)-3-(1-피페리디닐)-프로파논 히드로클로라이드(2-톨페리손 히드로클로라이드). 미국 특허출원 제US 2006/0041141호는 기존의 제형보다 실질적으로 개선한 이들 이성체에 대해 최종 순도를 갖는 톨페리손을 생성하기 위한 4-톨페리손의 제조시 이성체인 2-톨페리손과 3-톨페리손의 함량을 크게 감소시킨 합성방법에 관해 기술하고 있다. 그러나, 지금까지 발명자들의 지식은 본원에서 기술한 것과 같은 제형 즉, 4-MMPPO가 거의 없고, 분해제인 4-MMPPO의 생성에 대해 안정한 제형을 제공하지 못했으며, 신뢰할만하고 일관성 있는 형태로 제공하지 못하였다. 더욱이 본원에서 제공된 것과 같은 제형의 중요성을 이전에는 인식하지 못하였다. 본 발명의 제형은 4-MMPPO와 연관된 유전자 독성 영향 때문에 엄격한 농도 이하로 유지되어야 하는 톨페리손으로 치료를 받는 피검체에 4-MMPPO에 생체내 노출시 투여에 매우 유리하다.

이론에 구속됨이 없이, 화합물 4-MMPPO는 도 1에서 기계론적으로 입증된 바와 같이 β-제거 반응을 통해 생성된다. 합성 조건에 따라 달라지지만, 4-MMPPO는 또한 도 2에 도시한 알돌-축합반응으로부터 생성된 잠재적 부생성물인 γ-히드록시케톤으로부터 물의 β-제거를 통해 생성한다. 4-MMPPO의 구조는 하기와 같다.

2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로페논 (4-MMPPO)

그래서, 4-MMPPO 톨페리손의 합성과정에서 부생성물로서 생성되거나, 단독(즉, 활성제 자체, 통상 "API" 또는 "활성 약학적 성분"으로 칭함) 또는 약학적 제형의 부분(즉, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 결합된 상태)으로 저장시 톨페리손의 저장중에 생성될 수 있다. 추가적으로, 4-MMPPO는 API를 정제하기 위해 도입되는 재결정 절차의 용해 또는 가열단계 중에 생성될 수 있다. 전형적으로, 재결정된 톨페리손과 연관된 상태로 소량이 남아 있다 하여도 생성된 대부분의 이러한 4-MMPPO는 모액으로 남아 있는다. 재결정된 톨페리손의 회수 후에 4-MMPPO의 생성을 촉진하기 위해 상승된 온도에서 건조단계가 추가로 실행된다.

분석

본원에서 제공된 톨페리손 제형을 얻은 후, 본 발명자들은 매우 낮은 농도의 4-MMPPO를 검출할 수 있는 최적의 분석방법을 안출하였으며, 상기 방법은 약 0.05중량%(500ppm) 이하의 4-MMPPO를 검출할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 약 400ppm 또는 300ppm 이하의 농도까지 검출이 가능하다. 보다 바람직하게는 상기 방법은 약 200ppm 또는 100ppm 이하의 농도까지 검출이 가능하다. 본원에서 제공된 방법들은 매우 낮은 농도의 4-MMPPO, 예를 들어 약 50ppm 또는 250ppm 이하의 농도 및 더욱 바람직하게는 약 10ppm의 4-MMPPO까지 검출이 가능하다. 본원에 제공된 실시예에서, 약 9ppm 이하의 농도, 약 8ppm 이하의 농도, 약 7ppm 이하의 농도, 약 6ppm 이하의 농도, 약 5ppm 이하의 농도, 약 4ppm 이하의 농도, 약 3ppm 이하의 농도, 약 2ppm 이하의 농도, 약 1.5ppm 이하의 농도, 또는 약 1ppm 이하의 농도까지 검출이 가능하다. 본 발명은 약 0.5ppm 이하의 4-MMPPO 농도까지 검출할 수 있는 것으로 생각된다.

도입된 방법은 액상 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)의 결합에 기초한다. 본 방법은 약 500ppm 이하의 농도에서 4-MMPPO를 검출할 수 없는 종래의 방법이 지닌 결점을 극복하였다. 4-MMPPO는 유전자 독성제이기 때문에, 500ppm 이하의 농도도 검출하는 것은 매우 중요하므로, 톨페리손의 생산자는 약학제형중의 4-MMPPO와 같은 잠재적 유전자 독성제의 함량을 정량화할 수 있어야 할 뿐 아니라 무시할만한 함량의 유전자 독성제를 함유하는 조성물의 투여시 유전자 독성 위험성이 없다는 것을 입증하여야 한다.

일반적으로, 본 방법은 톨페리손 조성물을 제공하는 것을 포함한다. 톨페리손은 합성반응 과정 중에 생성된 원료(crude) 톨페리손이거나, 하나 이상의 정제단계로 보내진 정제된 톨페리손이거나, 상업용 소스 또는 제조업체로부터 얻은 톨페리손, 또는 정제(예, Mydeton^®, Mydocalm^®, Midocalm^® 및 Muscalm^®) 또는 다른 전달형태와 같은 약학적 제형으로부터 추출된 톨페리손일 수 있다. 정제와 같은 약학 제형의 경우, 샘플은 전형적으로 처음에 정제 제형을 분쇄하기 위해 적당한 용매로 균질화한 후 단일 용액 또는 제형 성분의 현탁액으로 제공되어 톨페리손(및 연관된 4-MMPPO)의 추출을 보다 용이하게 한다. 균질화에 적당한 용매는 약 1% HCl 가스 또는 약 1% 무수 트리플루오로아세트산(TFA)로 산성화시킨 무수 이소프로판올을 포함한다.

톨페리손은 산성화된 알콜과 같은 적당한 용매에 용해된다. 이러한 용매의 예로는 메탄올, 이소프로판올, 부탄올, 및 기타 저급 알콜이 있다. 용매를 산성화하는데 사용될 수 있는 산으로는 다른 산 중에서 염산, 브롬화수소산, 구연산, 개미산, 아세트산, 메탄설폰산, 트리플루오로아세트산이 있다. 본 발명자들은 여러가지 분석을 시도한 결과 산성화된 조건이 4-MMPPO의 부가적 염기-결정화 생성을 막고, 분석기간 중 톨페리손을 안정화하여 샘플중의 4-MMPPO 함량을 보다 정확히 반영한다는 것을 인식하였다. 바람직하게는 샘플을 용해/현탁시키는데 사용되는 용매는 무수상태인데 이는 소량의 물이 존재하여도 4-MMPPO의 생성이 증가되기 때문이다. 하나의 바람직한 산성화된 알콜 용액은 메탄올성 HCl이다. 알콜중의 산 농도는 전형적으로 약 10 mM 내지 약 100 mM이며, 4-MMPPO의 추가적인 분해에 대해 톨페리손을 안정화시키는데 효과적이다. 톨페리손이 정제와 같은 약학적 제형의 일부분인 경우, 톨페리손은 바인더, 충전제(fillers), 부형제, 및 유기 용매로 추출에 의해 제형중에 함유될 수 있는 것으로부터 추출될 수 있다. 사용될 수 있는 용매는 에테르 또는 친유성 에스테르와 같은 다른 용매가 사용될 수 있으나 바람직하게는 상술한 것과 같은 산성화된 알콜성 용매이다. 구체적인 용매로는 디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 아밀 아세테이트, 및 디옥산이 있다.

분석에 앞서 전형적으로, 내부 기준이 샘플에 추가된다. 본 방법에 있어서, 바람직한 기준은 중수소화된 4-MMPPO로 샘플중에 함유된 4-MMPPO과 쉽게 구별된다. 사용된 내부기준은 물론 사용된 검출방법에 따라 달라진다. 바람직하게는, 산성 용액을 유지하기 위해 분석하려는 용액에 완충액이 첨가된다. 완충액의 예로는 시트레이트, 포스테이트 및 아세테이트가 있다. 바람직하게는, 용액의 pH는 5.5 이하이며 더욱 바람직하게는 4 이하이다. 분석에 적합한 용액의 pH는 5.5 또는 5 이하, 4.5 또는 4 이하 또는 3.5 또는 3 이하, 2.5 또는 2 이하, 1.5 또는 1.0 이하이다.

이어서 샘플의 4-MMPPO 함량에 대해 분석한다. 비록 많은 분석 기술, 예를 들어 핵자기공명(NMR), 가스 크로마토그래피(GC), 질량분석법(MS) 및 LC(액체 크로마토그래피)/MS, GC/MS, 음성 화학 이온화에 의한 GC/MS, GS/MS/MS, MS/MS/LIT(linear ion trap), 고성능 액체크로마토그래피(HPLC), HPLC/MS/MS, FT/IR(fourier transform infrared) 등과 같은 결합형태가 분석에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법은 액체크로마토그래피/질량분석법/질량분석법(LC.MS/MS)이며 구체적으로는 HPLC/MS/MS이다.

타임-오브-플라이트(time-of-flight, TOF), 4중극자(quadrupole), 이온 트랩(ion trap), 자기섹터(magnetic Sector), 및 이들의 결합을 포함한 질량 스펙트럼을 얻기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 잡음비에 대한 높은 신호 때문에 탄뎀(tandem) 질량분석법(MS/MS)이 바람직하다. 본원에 기술된 방법, 예를 들어, 실시예 1에서 사용된 방법은 500 ppm 이하에서 약 0.2 ppm의 낮은 농도까지 검출할 수가 있다.

HPLC를 도입한 분석방법의 경우, 용출제로 적합한 용매로는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴 및 이들의 결합물과 같은 알콜을 포함한다. 바람직하게는, 이동 상으로 사용된 하나 이상의 용매는 분석중 추가적인 4-MMPPO의 생성을 최소화하기 위해 산성화된다. 적당한 산으로는 개미산, 염산, 인산, 트리플루오로아세트산 등이 있다. HPLC 칼럼은 많은 상업용 공급업체들 예를 들어, PerkinElmer, EMScience, Phenomenex등으로부터 구입이 가능하다. 예를 들어, Shiseido, Shodex, Agilent(ZORBAX), 및 LUNA에 의해 제조된 칼럼들은 고체 담체로 사용될 수 있다. 정상 또는 가역상 칼럼을 사용할 수 있으며 바람직한 고체 담체는 실리카겔이다. 성분의 분리조건 및 4-MMPPO와 같은 오염물질의 정량화 조건은 기술분야의 당업자에 의해 측정이 가능하다.

실시예 1은 4-MMPPO의 함량(표 1 및 2)을 측정하기 위해 톨페리손-함유 제형의 분석을 위한 예시적인 실험조건을 제공한다. 본원에 기술된 분석법은 종래방법에 의해 측정이 불가능한 농도까지 4-MMPPO의 정량화를 가능케 한다. 표 3에 제공된 수치에서 알 수 있듯이, 여러 가지 대표적인 제형(API 및 상업용 약학 제형)중의 4-MMPPO 값은 약 15ppm 내지 400 ppm을 넘는 범위에 있다. 상업용 제형인 Mydeton^®과 Mydocalm^®의 4-MMPPO 농도는 모두 100 ppm을 초과하였다. 4-MMPPO와 연관된 유전자 독성 부작용 때문에, 본 발명자들은 표 3에 제형에서 검출된 농도보다 실질적으로 낮은 농도 예를 들어 약 10 ppm 이하의 농도를 갖는 제형을 제공할 필요성을 인식하였다.

본 발명자들은 이전에 제조된 것보다, 바람직하게는 일관된 방법으로 4-MMPPO에 대해 높은 순도를 갖는 톨페리손 조성물을 제공할 필요성을 인식하였다. 이러한 관점에서, 약 10 ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 함유하는 톨페리손 제형을 얻기 위한 다양한 접근방법이 연구되었다.

본원에 기술된 방법들은 약 10 ppm 이하, 의 4-MMPPO 농도를 함유하는 톨페리손을 제공할 수 있다. 그래서, 본원에 제공된 톨페리손 제형은 약 10 ppm 이하 , 약 9ppm 이하, 약 8ppm 이하, 약 7ppm 이하, 약 6ppm 이하, 약 5ppm 이하, 약 4ppm 이하, 약 3ppm 이, 약 2ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 함유할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 톨페리손은 약 1.5 ppm 내지 약 10 ppm의 4-MMPPO를 함유한다.

재결정화- 단일 단계

전형적으로, 정제를 위한 "불순수한" 톨페리손 조성물은 약 10 ppm 이상의 4-MMPPO를 함유한다. 미량의 4-MMPPO를 제거하는데 특히 유용한 방법은 재결정화이다. 실시예 2는 톨페리손을 정제하기 위한 종래의 재결정화 접근방법에 관해 기술하고 있다. 알 수 있듯이, 유기 용매 혼합물중의 톨페리손의 용해(환류를 위해 가열이 수반) 이후에 여액(filtrate)의 고온 여과 및 냉각은 결정성 톨페리손의 생성을 가져온다. 재결정화된 생성물에 대한 4-MMPPO 함량 분석결과 약 0.14중량% 톨페리손(1400 ppm)으로, 이는 뒤이은 재결정화 배치에 의해 약 500 ppm 또는 그 이하로 감소되었다. 그러나 4-MMPPO의 농도는 톨페리손의 약학적 제형으로 사용하기에 부적당하다.

그러나, 이후에 기술하는 섹션에서 상세히 기술된 바와 같이 4-MMPPO의 생성을 최소화하거나 억제하기 위해 하나 이상의 추가적인 방법을 결합하면, 단일 단계 재결정화가 본원에서 기술된 순도를 갖는 톨페리손을 제공하는데 적합할 수 있다.

대안적인 재결정화 방법의 연구결과 정제된 톨페리손을 제공하는데 다음의 접근법이 실질적으로 4-MMPPO가 없는 것으로 나타났다.

하나의 재결정화 접근법으로, 단일 단계 재결정화가 실시된다. 특정 예의 경우 소망하는 순도를 갖는 톨페리손은 단일 단계 재결정화에서 얻을 수 있다. 실시예 3 참조.

다른 접근법으로, 다단계 재결정화가 실시된다. 예를 들면, 약 10 ppm 이상의 4-MMPPO 함량을 함유하는 톨페리손을 1회 이상의 재결정화, 바람직하게는 2회 이상의 재결정화로 보내져 실질적으로 4-MMPPO가 없는 톨페리손을 제공한다. 전형적으로 재결정화 횟수는 2, 3, 4, 5, 및 6회로부터 선택된다. 이상적으로는, 바람직한 순도는 2, 3 또는 4회 재결정화 단계에서 얻어진다. 톨페리손 재결정화에 사용하는 용매는 단일 용매뿐만 아니라 혼합 용매계를 포함한다. 혼합 용매계는 2개 용매의 결합물, 3개 용매, 4개 용매, 5개 용매 또는 그 이상의 용매 결합물을 함유하나 바람직하게는 2 내지 4개의 별개의 용매를 함유한다. 이러한 용매는 임의로 산성화될 수 있다. 산성화된 용매의 사용은 반응이 염기-촉매화되기 때문에 베타(β) 제거반응을 억제하는데 효과적이다.

톨페리손 재결정화에 유용한 용매로는 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 아밀 아세테이트와 같은 에스테르류, 에테르류 바람직하게는 디에틸 에테르, 메틸 t-부틸 에테르(MTBE)와 같은 저급 알킬 에테르, 케톤류, 바람직하게는 2-부타논, 메틸 에틸 케톤(MEK), 메틸 이소부틸 케논(MIBK), 메틸 프로필 케논, 아세톤과 같은 저급 알킬 케톤 및 알콜류가 있다. 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올등과 같은 저급 알콜류이다. 전술한 어떤 것들의 혼합물도 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 용매계는 메틸 에틸 케톤 및 이소프로판올과 같은 저급 케톤 및 저급 알콜이다. 전형적으로 톨페리손은 처음에 하나 이상의 재결정화 용매에 용해된다. 특정의 경우 사용되는 용매에 따라 다르지만, 용매계중의 톨페리손을 용해하는데 도움이 되도록 가열할 수 있다. 바람직하게는 용매계는 톨페리손이 약 100 mg/ml 내지 dir 200 mg/ml의 범위로 용해되도록 사용된다. 사용되는 용매의 비점에 따라 달라 지지만, 필요한 경우, 톨페리손 용액은 약 80℃로 가열된다. 용해를 돕기 위해 교반이 사용될 수 있다. 이어서 최종 용액은 가열된 경우, 전형적으로 실온 또는 그 이하의 온도로 냉각된다. 이상적으로, 냉각은 수분 내지 한 시간 이상, 수시간에 걸쳐 서서히 실시된다. 특정의 경우, 톨페리손 용액을 추가로 냉각시키기 위해 얼음조(ice-bath)가 사용될 수 있다. 결정 생성중에, 용액은 선택적으로 교반될 수 있다. 또한 종결정(seed crystal)을 첨가하여 결정 생성을 유도할 수 있다.

결정을 회수한 후, 톨페리손이 불용성이거나 극히 잘녹지 않는 적당한 용매로 세척한다. 적당한 용매는 2-부타논 바람직하게는 냉각된 2-부타논이다.

이어서 결정을 건조시킨다. 바람직한 건조 조건은 "건조"라는 제목으로 하기 섹션에서 기술된다. 건조는 전형적으로, 대기온도 또는 약간 상승된 온도 약 35℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 40℃의 온도에서 실시된다.

이어서, 최종 정제된 톨페리손중의 4-MMPPO 함량을 측정하기 위해 상술한 대로 분석한다. 약 10 ppm 이상의 4-MMPPO 농도를 함유하는 톨페리손 조성물의 경우, 상술한 바와 같이 재결정화가 반복적으로 이루어진다. 실시예 3 참조.

산 처리

4-MMPPO의 생성이 산의 존재시 억제될 수 있음을 인식하였기 때문에, 바람직한 정제방법은 톨페리손을 산으로 처리하는 것을 포함한다. 예를 들어, 재결정화된 톨페리손은 약 10%(v/v) 내지 약 0.5%의 산, 바람직하게는 약 7%(v/v) 내지 약 1%의 산을 함유하는 산용액으로 세척한다.

염산, 히드로브롬산, 및 황산과 같은 무기산과, 개미산, 옥살산, 아세트산, 구연산, 트리플루오로아세트산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌설폰산, 석신산 등과 같은 유기산이 또한 사용될 수 있다. 산용액은 산 수용액 또는 양자택일하여, 톨페리손이 불용성이거나 극히 약간만 녹은 산성화된 용액인 경우 산성화된 알콜과 같은 산성화된 용매일 수 있다. 이러한 용매계의 일 예로는 HCL/이소프로판올이다. 실시예 4 참조. 산(합성중 또는 합성 후)으로 톨페리손을 처리하는 것은 톨페리손 생성물중의 4-MMPPO 농도를 실질적으로 낮추는데 효과적이어서 4-MMPPO가 실질적으로 없는 톨페리손을 수득할 수 있다.

산 세척의 대안으로서, 상술한 재결정화는 산성화된 용매/용매계를 사용하여 실시될 수 있다. 산성화된 용매계를 이용한 톨페리손의 재결정화는 실시예 5 및 6에서 제공된다. 단일 또는 다중 재결정화가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상술한 산중에서 하나의 산이 재결정화 용매/용매계에 첨가될 수 있다. 활성제인 톨페리손을 상당한 범위까지 파괴하지 않으면서 용액을 산성화하는데 효과적인 함량의 산이 사용된다. 바람직하게는, 총w/v%로 약 10% 내지 약 0.5%의 산, 바람직하게는 약 5% 내지 약 1%(w/v) 범위로 재결정화 용액에 첨가된다. 예시적인 산의 함량은 5, 4, 3, 2 및 1%의 산(w/v)을 포함한다. 전형적으로, 사용된 용매계는 약 1%(w/v) 산을 함유한다. 산성화된 조건하에서의 재결정화는 4-MMPPO의 생성을 막아 실질적으로 4-MMPPO가 없는 정제된 톨페리손을 제공한다.

특정의 경우, 톨페리손을 산성화된 용매로부터 산 세척 또는 재결정화하는 경우, 무수 즉, 실질적으로 물이 없는 산성화된 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 무수 HCl 가스를 용매계로 버블링하면 용매는 거의 무수상태가 되어 무수 또는 거의 무수상태인 산성화된 용매계를 제공한다. 추가적인 산은 구연산, 트리플루오로아세트산 및 석신산을 포함한다. 특정의 연구에서, 본 발명자들은 물의 존재로 인해 4-MMPPO의 농도가 증가되는 것을 관찰하였기에, 무수 조건을 이용하는 것이 바람직하다.

건조

실질적으로 4-MMPPO가 없는 톨페리손을 제공하기 위한 또 다른 접근에서, 상술한 대로 정제된 톨페리손은 바람직하게는 1시간 내지 수시간에 걸쳐 건조된다. 전형적인 건조기간은 1시간에서 72시간 는 그 이상의 수시간으로 확장될 수 있다. 건조는 실온 및 대기압에서 실시되며, 오산화인(phosphorous pentoxide)과 같은 건조제상에서 실시된다. 건조는 건조 오븐에서 상승된 온도, 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 40℃ 의 온도에서 일어난다. 또한 건조는 감압하(임의로 상술한 완만한 가열이 수반)에서 예를 들어 저진공(예; 약 100,000 내지 약 3,000 Pascal), 중간진공(약 3,000 내지 약 0.1Pascal) 또는 고진공(약 0.1 내지 약 0.0001 Pascal)하에서 실시된다. 건조공정은 증발(휘발)에 의해 톨페리손으로부터 4-MMPPO를 선택적으로 제거하는데 효과적이다. 톨페리손과 4-MMPPO 사이의 휘발도 차이때문에, 4-MMPPO는 조성물로부터 선택적으로 제거될 수 있다. 휘발에 의한 4-MMPPO의 제거는 진공 오븐, 패들(paddle) 건조기, 유체층 건조기 플래쉬(flash) 건조기, 트래이 건조기, 분무건조기, 또는 기타 유사한 건조기술을 사용하여 다소 상승된 온도 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃ 의 온도에서 실시된다.

상술한 정제방법의 결과로, 특정의 경우, 톨페리손에 함유된 4-MMPPO의 함량에 따라 달라지지만, 제거된 4-MMPPO의 함량은 초기의 농도보다 5배 이상 크게 감소하였다. 예를 들어, 실시예 3은 약 500 ppm 이상의 초기 4-MMPPO 농도를 함유하는 톨페리손 조성물을 정제하여 약 1.0 ppm 내지 약 10 ppm의 4-MMPPO를 함유하는 정제된 톨페리손을 생성한 것을 보여주는데 이는 최초 조성물의 함량보다 약 50배 (50x) 내지 약 300배(300x) 감소한 것이다. 그래서, 초기 4-MMPPO의 함량에 따라 좌우되지만 본원에서 제공된 정제방법은 최종 정제된 조성물 중에 4-MMPPO의 함량을 약 5배(5x) 이상, 또는 약 10배(10x) 이상, 또는 약 20배 이상, 또는 약 30배 이상, 또는 약 50배 이상, 또는 100배 이상 감소시키는데 효과적이다.

합성기간

양자택일하여, 4-MMPPO를 제거하기 위해 상술한 톨페리손을 후-합성 정제하는 것보다, 특정 변형된 반응조건에서 변형된 합성을 실시할 수 있다. 이러한 조건은 산성화된 및/또는 무수 반응조건의 사용을 포함한다.

예를 들어, 상술한 톨페리손 합성은 촉매학적 함량의 산의 존재하에 실시될 수 있다. 이러한 용도에 적합한 산류는 HCl(바람직하게는 가스), 호아산, 및 질산, 개미산, 옥살산, 아세트산(초산) 등이 있다.

무수 조건은 건조제, 또는 분자채상에서 저장된 용매 및 불활성, 무수 대기상태에서 저장된 무수 용매를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 무수 반응조건은 질소 또는 아르곤과 같은 무수 불활성 분위기하에서 합성을 실시하여 촉진될 수 있다.

즉, 톨페리손은 촉매학적 함량의 산 및/또는 무수 조건하에서 톨페리손이 생성되는 개선사항을 제외하고는 본원에서 기술한 어떤 방법이나 종래의 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다.

톨페리손의 저장

실시예 7은 정제화된 약학제형을 제조하는데 사용된 약품 로트(lot)에 함유된 4-MMPPO 함량과 2개월 내지 거의 4년간의 기간동안 저장한 후에 정제중에 함유된 4-MMPPO 함량을 비교한 데이터를 제공한다. 조사한 거의 모든 제형에서, 4-MMPPO 함량이 주목할 만큼 증가한 것이 관찰되었다. 정제가 제조된 조건에 대해 적어도 부분적으로 4-MMPPO의 생성탓으로 돌릴 수 있지만, 4-MMPPO는 저장시 저장기간 동안 약학적 제형에서 생성된 것으로 보인다. 4-MMPPO의 생성 기원에 관계없이, 피검체에 투여하는 톨페리손의 약학적 제형은 이상적으로 실시예 7에 기술된 농도보다 훨씬 낮은 농도의 4-MMPPO를 함유하여야 하며, 바람직하게는, 약 10 ppm 이하이 4-MMPPO 농도를 함유하여야 한다. 좀 더 바람직하게는, 톨페리손의 약학적 제형은 약 9 ppm 이하, 약 8 ppm 이하, 약 7 ppm 이하, 약 6 ppm 이하, 약 5 ppm 이하, 약 4 ppm 이하, 약 3 ppm 이하, 약 2 ppm 이하, 약 1.5 ppm의 4-MMPPO를 함유한다.

바람직하게는, 본원에서 기술한 톨페리손 조성물은 건조 조건하에서 저장된다. 본원에서 사용된 건조 조건이란 약 18℃ 내지 23℃의 온도와 5-25%의 상대습도를 말한다. 본 제형은 API 제형, API 이외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물, 또는 병, 블리스터 팩, 파우치 또는 이들의 결합과 같은 밀봉 용기 중에 함유된 투여용 약학적 제형일 수 있다. 또한 조성물은 전형적으로 수분 증기 흡수에 적합한 팩에 싼 실리카 겔과 같은 건조제의 존재하에 저장될 수 있다.

바람직하게는 본원에 제공된 톨페리손 조성물은 산 부가염의 형태의 톨페리손을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본원에 제공된 톨페리손 조성물은 산 부가염의 형태로 톨페리손에 의해 제공된 것보다 더욱 산성인 환경을 만들기 위해 부가적인 함량의 산 부가물 또는 부형제를 포함한다. 이러한 부가제는 아세트산, 석신산, 아디프산, 프로피온산, 구연산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산 등을 포함한다. 바럼직한 산은 이염기산 또는 그 이상(예, 하나 이상의 산성 양자를 갖는 이염기간, 3염기산 등)이다. 바람직하게는 톨페리손 조성물의 안정제로 유용한 산은 약 3 이하의 pKa를 갖는다. 바람직하게는, 산은 무수이다. 특히 바람직한 산은 구연산과 석신산이다.

톨페리손은 유리 기질(glassy matrix)과 결합되며, 유리 생성제는 기술분야에 공지되어 있으며, 4-MMPPO에 의한 톨페리손의 화학적 분해를 방지하는데 효과적이다.

이상적으로, 톨페리손은 제형과 상관없이, 저장중에 건조제와 함께 결합되어, 수분에 대한 노출을 최소화한다.

4-MMPPO의 유전자독성

4-MMPPO는 유전자 독성이 있어 유전자 변이를 일으킬 수 있으며, 잠재적으로 종양의 전이에 기여할 수 있다. 유전자 독성은 일반적으로 특정 화학제의 고유 성질인 것으로 생각된다. 화합물의 화학구조에 기초하여, 상기 화합물은 DNA와 같은 세포 거대분자내의 친핵성 부위와 결합하는 충분한 친전자성을 갖고 있다.

이상적으로, 본원에서 제공된 톨페리손 조성물은, 유전자 독성 연구에서 평가시 톨페리손에 함유된 극히 낮은 농도의 4-MMPPO로 인해 잠재적인 유전자 독성이 없는 것으로 나타났다. 유전자 독성 위험을 평가하는데 적합한 유전자 독성 연구는 다음의 설치류 시험관내 분석을 포함한다: 박테리아 3B에서 유전자 변이 시험, 포유동물 세포를 이용한 염색체 손상의 시험관내 분석 또는 시험관내 마우스 림프종 tk^+/- 분석, 및 설치류 조혈모 세포를 이용한 염색체 손상에 대한 생체내 시험. 발암성(carcinogenicity) 분석을 위한 대안적인 분석모델은 ICH guidance for industry S1B Testing for carcinogenicity of Pharmaceuticals.에서 발견할 수 있다.

시험관내 연구결과 잠재적인 유전자 독성 위험을 가져오는 경우, 잠재적인 유전자독성이 없음을 나타내기 위해 생체내 분석이 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 톨페리손 조성물의 유전자 독성이 없음을 나타내는데 사용될 수 있는 생체내 분석은 다음과 같다. 예를 들어, 마우스에서 반복 투여 독성 연구로 손상된 말초 혈액으로 소핵 유도를 평가한다. 래트(rat) 또는 원숭이의 반복 투여 연구로부터 얻은 말초혈액 임파구를 배양하여, 유사분열의 중기(metaphase) 확산시 염색체 손상을 분석한다. 부가적으로, DNA 손상(예, DNA 부가물 또는 혜성(Comet) 또는 알칼리성 용출분석을 이용한 DNA 나선 손상)은 잠재적 목표 조직(target tissue)으로 분석할 수 있다. 또한, 유전자도입 래트나 마우스는 잠재적 목표 조직에서 돌연변이유발원(mutagenicity)을 분석하는데 사용될 수 있다.

시리안 햄스터(Syrian Hamster) 배아세포(SHE)의 형질전환 분석을 사용할 수 있다. 더욱이, 단기간의 발암성 연수에 p53 단일 불충분한 마우스와 같은 유전자도입 마우스 균주를 사용할 수 있다.

피검체에 약학적으로 허용가능한 복용량을 투여하였을때 약 10 ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 포함하는 톨페리손 조성물과 관련하여 본원에서 제공된 제형에는 유전자 독성 부작용(또는 유전자독성)이 실질적으로 없는 것이 상술한 시험관내 연구중에서 3번 중 1번 이상은 음성으로 나타났다. 바람직하게는 시험관내 분석결과 3번 중 2번은, 보다 바람직하게는 실험관내 분석중 3번 모두 유전자 독성에 대해 음성이었다. 상술한 시험관내 연구의 한번 또는 그 이상에서 유전자독성에 대해 양성 또는 그 이하인 경우, 하나 이상의 상술한 생체내 연구결과 나타난 음성은 유전자 독성이 없음을 증명하였다.

약학적 제형 성분

톨페리손을 포함하는 것 이외에, 본 발명의 제형은 임의로 하나 이상의 부가 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 톨피리손 이외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 수소화 피마자유(HCO), 크레모포(폴리에톡시화 피마자유), 탄수화물, 전분(예, 옥수수 전분), 무기염, 항바이러스제, 항산화제, 바인더/충진제, 계면활성제, 윤활제(예, 스테아린산 칼슘 또는 스테아린산 마그네슘), 활석과 같은 활택제(glidant), 붕해제(disintegrant), 희석제, 완충제, 산, 염기, 필름코팅물, 이들의 결합물 등을 포함하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 조성물은 당(설탕), 알디톨, 알돈산과 같은 유도된 당, 에스테르화 당, 및/또는 당 폴리머와 같은 하나 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 구체적인 탄수화물 부형제는 예를들어, 과당(프럭토스), 맥아당(말토오스), 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소보스등과 같은 모노사카라이드; 락토스, 자당(sucrose), 트레할로스, 셀로비오스(cellobiose)등과 같은 디사카라이드; 라피노스,멜레지토즈(melezitose), 말토덱스트린. 덱스트란, 전분 등과 같은 폴리사카라이드; 및 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨(자일리톨), 솔비톨(글ㄹ시토), 피라노실 솔비톨, 마이요이노시톨(myoinositol) 등과 같은 알디톨(alditols)을 포함한다.

본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 것으로는 소디움 스타치 글리코레이트 및 직접 압착가능한 변성 전분과 같은 포테이토 및 옥수수-주성분의 전분이 있다.

대표적인 부형제로는 구연산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 제1인산나트륨(sodium phosphate monobasic), 제2인산나트륨(sodium phosphate dibasic), 및 이들의 결합물을 포함한다.

쪼한 톨페리손 조성물은 예를 들어 미생물 증식을 방지하거나 늦추는 항바이러스제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 비-제한적인 항바이러스제의 예로는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메솔 및 이들의 결합물이 있다.

본원에 제공된 조성물은 하나 이상의 산화방지제를 함유할 수 있다. 산화방지에 사용되는 산화방지제는 톨페리손 또는 제형의 다른 성분들이 열화(deterioration)되는 것을 방지한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 산화방지제는 아스코빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 하이포스포러스산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 소디움 비설파이트, 소디움 포름알데히드 설폭시레이트, 소디움 메타비설파이트, 및 이들의 결합물을 포함한다.

부가적인 부형제는 폴리솔베이트(예, Tween 20: 및 "Tween 80")와 같은 계면활성제, F68 및 F88(둘다 BASF, Mount Olive, New Jersey에서 구매가능)와 같은 플루로닉(pluronics), 솔비탄 에스테리, 지질(예, 레시틴 및 다른 포스파티딜콜린, 및 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질), 지방산 및 지방 에스테르. 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 및 EDTA, 아연 및 기타 적당한 양이온과 같은 킬레이트제가 있다.

더욱이, 상술하였듯이, 본 발명의 조성물은 임의로 하나 이상의 산을 포함한다. 사용가능한 비-한정적인 산의 예로는 염산, 초산, 인산, 구연산, 석신산, 아디프산, 프로피온산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 말산(malic acid), 유산(젖산), 포름산(개미산), 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 이들의 결합물이 있다.

바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 염기 성분이 없다.

조성물 중의 개별 부형제의 함량은 부형제의 역할, 활성제(즉, 톨페리손)의 투여량 필요조건, 및 조성물의 특정 요구조건에 따라 달라진다. 전형적으로, 개별 부형제의 최적 함량은 일상적인 실험 즉, 부형제의 가변 함량(저함량부터 고함량)을 함유하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 다른 변수들을 조사하고, 중요한 부작용없이 최적의 효능을 달성할 수 있는 범위를 측정함으로써 결정된다.

그러나 일반적으로, 부형제는 조성물 중에 약 1중량% 내지 약 99중량%의 함량으로, 바람직하게는 약 5중량% 내지 약 98중량%로, 보다 바람직하게는 약 15중량% 내지 약 95중량%의 함량으로 존재한다. 일반적으로, 본 발명의 톨페리손 조성물에 존재하는 부형제 함량은 다음의 함량 중에서 선택된다. 적어도 약 2중량%, 5중량%, 10중량%, 15중량%, 20중량%, 25중량%, 30중량%, 35중량%, 40중량%, 45중량%, 50중량%, 55중량%, 60중량%, 65중량%, 70중량%, 75중량%, 80중량%, 85중량%, 90중량%, 95중량%.

투여용 제형의 예로는 현재 시장에서 이용가능한 것으로 Mydeton^®, Mydocalm^®, Midocalm^® 및 Muscalm^®및 이와 유사한 제형이 있다. 경구 투여용 제형은 약 50mg 내지 약 750mg의 톨페리손을 함유하며, 바람직하게는 약 100mg 내지 약 500mg의 톨페리손을 함유한다. 예를 들어, 경구 투여용 제형은 특정의 경우에, 다음 중 하나의 톨페리손을 함유할 수 있다. 100mg, 150mg, 200mg, 250mg, 300mg, 350mg, 400mg, 450mg, 또는 500mg의 톨페리손.

톨페리손은 서방성(sustained-release) 제형으로 제공될 수 있다. 실시예 9 및 국제특허 공개번호 제WO 2005/094825 참조. 제어성 또는 서방성 제형은 전형적으로 리포좀, 에틸렌비닐 아세테이트 및 Hytrel^® 공중합체와 같은 비흡수성 불침투성 중합체, 히드로겔과 같은 팽윤성 중합체, 또는 콜라겐 및 특정 폴리산 또는 흡수성 봉합술에 사용되는 폴리에스테르와 같은 흡수성 중합체와 같은 담체나 매체에 톨페리손을 포함시켜 제조된다.

서방성 제형의 하나의 예로는 Eudragit RS, Eudragit L 및 Eudragit S와 같은 음이온 및 양이온계 중합체의 혼합물을 포함한다. 부가적으로, 톨페리손은 특정 담체에 캡슐화되거나, 흡수될 수 있다. 미립자 담체의 예로는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체뿐만 아니라 폴리(락타이드) 및 PLG로 공지된 폴리(락타이드-코-글리코사이드)로부터 유도된 것을 포함한다. Jeffery et al., Pharm . Res . (1993) 10:362-368; and McGee et al., J. Microencap.(1996) 참조. 정제 또는 캐플릿(caplet)은 또한 수용성 중합체(예, Aquacoat^® 및 Eudragi^®)로 코팅될 수 있다.

전술한 약학적 부형제와 다른 부형제는 "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "physician's Desk Reference", 52^nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ(1998), and Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D. C., 2000에 기술되어 있다.

약학적 제형/전달 형태

본원에 기술된 톨페리손은 투여에 적합한 어떤 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여 형태로는 정제, 마름모형 정제(lozenge), 캡슐, 시럽, 경구 현탁액, 유화액, 과립, 및 펠릿이 있다. 대안적인 제형으로는 에어로졸, 경피부착용 패치, 겔, 크림, 연고, 좌약, 분말 또는 라이포필레이트(lyophilate) 뿐만 아니라 액체를 포함한다. 액상 약학적 조성물의 경우, 용액과 현탁액을 생각할 수 있다. 바람직하게는, 톨페리손은 경우 투여에 적합한 형태로 제공된다.

예를 들어, 정제는 하나 이상의 보조 성문 또는 첨가제와 함께 압착 또는 성형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 압착된 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유 유동성 형태의 활성성분을 선택적으로, 바인더(예, 프로비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제(예, 소디움 스타치 글리코레이트, 가교 프로비돈, 가교 소디움 카복시메틸 셀룰로오스) 및/또는 계면활성제 또는 분산제와 혼합하고 적당한 정제 제조기계로 압착시켜 제조된다.

성형된 정제는 예를 들어, 불활성 액체 희석제와 혼합한 축축한 분말상 혼합물을 적당한 정제 제조기계로 성형하여 제조된다.

정제는 소망하는 방출 프로파일을 제공하기 위해 비율을 달리한 히드록시프로필메틸 셀룰로오스를 이용하여 활성성분의 느린 또는 제어된 방출을 제공할 수 있도록 코팅되고 제형화될 수 있다. 정제는 위 이외의 내장에 부분적으로 방출되도록 박막 필름, 당코팅, 또는 장용(腸溶) 코팅(eneric coating)과 같은 코팅물로 제공될 수 있다. 정제 및 캡슐에 대한 공정, 설비 및 하청 제조업체에 대한 정보는 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 또한 동물에 적용하기에 적합한 형태로 제조가 가능하다.

투여

톨페리손의 치료학적 제형의 투여방법으로는 경구, 동맥내, 경막내, 척수강내, 근육내, 복강내, 정맥내, 비강내 및 흡입 경로가 있으나 이에 한정하지는 않는다. 바람직한 투여경로는 근육내, 정맥내 및 경구투여이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 톨페리손은 경구로 투여된다. 그러나, 톨피레손은 경구, 직장, 비강, 국소(경피, 에어로졸, 구강 및 혀), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내), 척추강 및 폐를 포함하며, 이에 한정하지 않는 어떤 적합한 방법으로 투여가 가능하다. 물론 바람직한 방법은 피검체(환자)의 상태와 나이, 치료받는 특정한 조건, 및 사용되는 약의 특정 결합등에 따라 달라진다.

본 발명은 4-MMPPO의 노출을 최소화하는 조건하에서 피검체를 톨페리손으로 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 4-MMPPO에 대한 노출은 약 10ppm, 바람직하게는 약 7ppm 이하의 함량으로 4-MMPPO를 함유하는 본 발명의 톨페리손 조성물을 투여함으로써 최소화된다. 이러한 조성물은 본원에 기술된 어떠한 방법으로 제조될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 피검체는 약 10ppm 내지 약 1.5ppm의 4-MMPPO을 함유하는 톨페리손 조성물로 치료된다.

치료

톨페리손은 중추신경계에 작용하는 중추성 근육 이완제로, 상승된 근긴장의 치료뿐만아니라 사지(四肢)의 특정 순환계 문제의 치료에 주로 사용된다. 톨페리손은 실험적 과다근육긴장증 및 이성상실 강도를 감소시킬 뿐만 아니라 피질기능에 영향을 주지않고 그물척수 반사 촉진(reticulospinal reflex facilitation)을 억제하는 것으로 밝혀 졌다. 톨페리손은 또한 말초혈액 흐름을 개선한다.(Toperin® packing Insert).

톨페리손은 많은 질병 치료에 유용하다. 예를 들어, 하나 이상의 다음 질환으로 고통받는 피검체에 투여할 수 있다: 근(육)경련, 경련 증후군, 근육통, 근긴장증. 생리불순, 갱년기 호소, 파상풍, 뉴로락티리즘, 골관절염 또는 류머티스성 관절염(비-스테로이드성 항염증제와 결합하여 투여시), 류머티스성 질환, 섬유근육통 증후근, 직업 및 스포츠관련 스트레스, 요통, 신경계 질환으로 야기된 마비, 다발성 경화증, 척수병증, 뇌척수염, 뇌졸증, 근육긴장 항진, 근육 구축(拘縮), 척수 자동성 증세, 폐쇄성 혈관질환(예; 폐쇄성 동맥경화증, 당뇨병성 혈관병증, 폐쇄성 혈관혈전염, 레이노병(Raynaud's disease), 범발성 경피증), 상처난 혈관의 신경감응으로 인한 질환(말단청색증, 간헐적 혈관신경성 부종), 신경병증 통증 및 개인의 경우 혈전후 정맥 및 림프 순환계 질환, 당뇨병성 말초신경병증, 대상포진후 신경통, 대퇴 궤양(Myolax® package insert).

토페리손을 투여받는 피검체는 어린이(3개월에서 18세) 및 성인(18세 이상)을 포함한다.

톨페리손의 함량은 경험적으로 결정될 수 있으며, 치료받고자 한느 피검체의 특정 질환에 따라 달라진다. 실질적인 복용량은 피검체의 나이, 체중 및 일반적인 조건뿐만 아니라 치료받고자 하는 질환의 가혹도, 건강관리 전문가의 판단, 및 투여되는 특정 복용형태에 따라 달라진다.

치료학적으로 효과적인 함량의 톨페리손은 기술분야의 전문가에 의해 결정될 것이며, 각각의 특수한 필요조건에 따라 조절될 것이다. 일반적으로, 성인에 대한 치료학적으로 효과적인 함량의 톨페리손은 일일 총복용량이 약 10mg/day 내지 3,000mg/day, 바람직하게는 50mg/day 내지 1,800mg/day이다. 성인에 대한 전형적인 복용 범위는 일일 총복용량이 약 150m 내지 1,000mg/day, 바람직하게는 약 150mg/day 내지 750mg/day이며, 단일 복용 또는 복수 복용으로 투여된다. 특정의 실시양태에서 하루에 여러 번 나누어서 복용, 예를 들어 일일 권고 복용량을 5회 복용 또는 3회 복용, 또는 2회 복용으로 나누는 것이 바람직하다.

바람직한 복용량은 약 50 mg 내지 450 mg을 일일 두 번 또는 세 번 나누어 복용한다. 즉, 투여량은 50 mg/day부터, 100 mg/day, 150 mg/day, 200 mg/day, 250 mg/day, 300 mg/day, 350 mg/day, 400 mg/day, 450 mg/day, 500 mg/day 또는 그 이상이다.

복용량 및 치료받을 정밀한 조건에 따라 좌우되지만 투여는 하루 내지 수일간, 수주간, 수개월간, 및 수년간, 심지어 환자의 일생동안 일일 1회 또는 2회 또는 3회 투여된다. 예시적인 복용범위는 약 하루 이상, 1주간, 약 1-4주간, 약 1개월 내지 3개월, 1-6개월, 1 내지 50주, 1-12개월 또는 그 이상 지속된다. 어린이의 복용량은 3개월 내지 18세는 약 1-25 mg/kg/day로, 바람직하게는 약 2-15 mg/kg/day로 약 2-4회, 바람직하게는 3회로 나누어 복용한다. 어린이의 예시적인 권고 복용량은 5-10 mg/kg/day 및 2-4 mg/kg/day로 2-3회 나누어 복용한다.

실질적으로 말하면, 본 발명의 조성물 또는 활성제의 단일 투여량은 다양한 복용 일정에 따라 투여되며 임상의 판단, 환자의 필요 등에 따라 달라진다. 구체적인 복용 일정은 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 일상적인 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다.

부가적으로, 피검체에 4-MMPPO의 과다 노출을 방지하기 위해 피검체에 투여되는 톨페리손 조성물의 복용량은 제한받을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 톨페리손 1회 복용당 5㎍ 이하의 4-MMPPO이 피검체에 투여되며, 하루에 135㎍ 이하의 4-MMPPO이 피검체에 투여된다. 톨페리손으로 피검체를 치료하는 기간은 피검체에 허용할 수 있는 범위 이내로 4-MMPPO 농도를 유지하기 위해 또한 비교적 짧게(2주 또는 그 이하) 유지된다.

도 1은 β-제거반응에 의해 톨페리손으로부터 4-MMPPO의 생성에 대한 제안된 화학 메커니즘을 나타낸 도면이다.

도 2는 톨페리손의 γ-히드록시케톤 부산물을 경유한 4-MMPPO의 생성에 대한 제안된 화학 메커니즘을 나타낸 도면이다.

다음 실시예는 본 발명의 특정 관점 및 장점을 설명하지만, 어떤 식이던 이하 기술되는 특정 실시양태로 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

별도로 지시하지 않는 한, 본 발명의 실시는 약학적 제형기술, 분리, 약물학 등을 이용하며, 이들은 본원에서 제공된 지침에 기초하여 기술분야의 당업자의 기술범위에 속한다. Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations , S. K. Niazi(d.), CRC Press, 2004; Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9^th Edition, Hardman, J.G., Gilman, A.G., Limbird, L.E.(eds.), McGraw-Hill, New York, 1995; Basic and Clinical Pharmacological, 18^th Edition, Katzung, B. G. (ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CN, 2001 참조.

다음의 실시예에서, 사용된 숫자(예, 함량, 온도 등)에 대해 정확성을 보증하려고 많이 노력하였지만, 약간의 실험적 에러와 편차가 있다. 각각의 다음 실시예는 본원에서 기술한 하나 이상의 실시양태를 실시함에 있어 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 설명하기 위한 것이다.

실시예 1

4- MMPPO 함량에 대한 상업용 톨페리손 조성물의 분석

여러 상업용 공급원으로부터 톨페리손을 얻었으며, HPLC-MS/MS로 4-MMPPO 함량을 분석하였다.

분석에서 사용된 모든 샘플은 다음과 같이 분석을 위해 제조하였다. 필요하다면 샘플을 균질화(예, 정제)하고 무게를 달았다. 각각의 톨페리손 샘플에 대해, 약 20 mg의 샘플을 20 mL의 플라스크에 첨가하였다. MeOH 중 20 mL의 50 mM HCl을 플라스크에 첨가하고, 초음파 욕조에 약 5분간 올려놓았다. 플라스크의 내용물을 보텍서(Vortexer)상에서 약 20초간 혼합하였다. 처음에 톨페리손 샘플이 정제 형태인 경우, 용액을 4,000rpm으로 2분간 원심분리하였다. 이어서, 200 ㎕의 샘플을 작은 코니칼 원심분리 유리병(vial)으로 옮겼다. 중수소화된 4-MMPPO를 함유하는 내부 표준 용액 20 ㎕, pH가 1인 200 ㎕의 완충액, 및 0.4 mL의 디이소프로필 에테르(DIPE)를 유리병에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 DVX-2500 다중관(multi-tube) 보텍서(2100 rpm)로 약 2분간(주기: 5초 실행, 1초 정지) 와류시켜 추출하고, 4,000 rpm에서 2분간 원심분리(상분리)하였다. MeOH/DMSO(1/2) 중의 150 ㎕의 50 mM HCl를 비어있는 지정된 코니칼 자동샘플기 (autosampler) 유리병에 첨가하였다. 원심분리후, 100 ㎕의 상등액을 이들 코니칼 자동샘플기 유리병으로 옮겼다. 유리병을 크림프하고, DVX-2500 다중관(multi-tube) 보텍서(2100 rpm)로 약 1분간 와류시켰다. 이어서, 7 ㎕의 제조 샘플을 HPLC-MS/MS 시스템에 즉시 주입하거나 분석할 때까지 샘플을 -20℃ 이하의 온도에 저장하였다. 4-MMPPO 분석을 위해 사용된 크로마토그래피 조건 및 질량 분석기 변수는 각각 하기 표1과 표2에 나타내었다.

표1: 4- MMPPO 분석을 위한 크로마토그래피 조건

이동상 용매A	물중 50 mM 포름산(개미산)
이동상 용매B	MeOH중 50 mM 포름산
기울기	0.0분: switching LC waste, external(50% 메탄올) to MS
	0.0-0.8분 선형: 45%B → 67%
	0.8-1.7분 선형: 67%B → 88% B(LC to MS)
	1.7-2.4 min isocratic: 45% B(LC to MS)
유속	1 mL/min
칼럼	LUNA® HPLC 칼럼(Phenomenex, Germany); C₁₈ 결합 실리카 겔 5μm, C18(2), 2x50 mm
칼럼 온도	50℃
우지시간	약 1.3분: 4-MMPPO 및 D7-4 MMPPO
주입 부피	7㎕

표2: 4- MMPPO 의 MS -검출

MS 검출	포지티브 이온 방식의 대기압 화학 이온화 계면(APCI)
기화기(vaporizer) 온도	450℃
코로나 니들 전류	5 ㎂
가스 1	압력= 60 psi
커튼 가스	압력= 45 psi
측면 위치	약 5 유니트(디폴트)
수직 위치	약 10 유니트
사중극자 분석	유니트 → 유니트
검출방식	MRM
전이	161.1 → 143.1 m/z: 4-MMPPO
	161.1 → 128.1 m/z: 4-MMPPO-qual
	168.1 → 150.1 m/z: D7-4-MMPPO
	168.1 → 132.1 m/z: D7-4-MMPPO

표3: 상업적으로 이용가능한 톨페리손 제형중의 4- MMPPO 함량

샘플	제조업체^*	Lot. No.	복용량	제조일자	제조일로 부터 시간	[4-MMPPO], ppm
					분석
1	A	204406	150 mg	8월 6일	6	68
2	A	204506	150 mg	8월 6일	6	56
3	A	206506	150 mg	8월 6일	6	51
4	A	257506	100 mg	11월 6일	3	40
5	A	167106	150 mg	6월 6일	8	100
6	B	243806	150 mg	10월 6일	4	15
7	B	247106	150 mg	9월 6일	5	14
8	B	247206	150 mg	9월 6일	5	19
9	B	307003	150 mg	7월 3일	43	22
10	C	T66612A	50 mg	6월 6일	8	215
11	C	T6A207A	150 mg	10월 6일	4	107
12	D	506223	50 mg	5월 5일	21	442

^*A= Merc; B= Viatris(현재 Meda AB의 부분, 스웨덴); C= Mydetom^®, D= Mydocalm^®

극히 낮은 농도에도 민감도를 갖는 본 발명자들이 개발한 4-MMPPO의 분석결과, 상기 표에서 알 수 있듯이 조사한 각각의 샘플중의 4-MMPPO는 상당한 함량이 있는 것으로 나타났으며, 본원 및 이하의 실시예에서 기술하는 정제된 톨페리손 제형중에 함유된 농도를 확실히 초과하였다. 가장 주목할만한 샘플은 1, 2, 3, 5 및 10, 11, 12로 각각의 샘플은 상당히 높은 농도 즉, 50 ppm 이상의 4-MMPPO 농도를 함유하였다. 4-MMPPO가 유전자 독성과 관련되기 때문에 본 발명자들은 상기와 같은 현재의 상업용 제형보다 현저히 낮은 4-MMPPO 농도를 갖는 톨페리손 제형의 즉각적인 필요성을 인식하였다.

현재 상업적으로 이용가능한 톨페리손 제형이 갖는 단점을 인식한 본 발명자들은 연구를 통해 상기에서 기술하고 또한 미국 특허출원 제 2006/0041141호에서 기술한 것과 같은 종래기술의 제형에서 발견된 농도보다 현저히 감소한 4-MMPPO 농도를 갖는 순수한 톨페리손 조성물을 제공하는 다양한 접근방법에 도달하였다. 본원에서 제공된 제형은 이들의 낮아진(즉, 최소) 4-MMPPO 농도의 관점에서 종래기술 제형(상기의 예시적인 샘플링으로 나타낸 것과 같은)보다 현격히 감소한 4-MMPPO 관련 유전자 독성 부작용의 장점이 있다.

실시예 2

톨페리손의 표준 재결정화

0.5중량% 이상의 4-MMPPO 농도를 함유하는 것을 제조중에 확인한 톨페리손 샘플을 출발물질(이하 "원료"라 칭함)로서 사용하였다. 원료 톨페리손을 2-부타논(메틸 에틸 케톤)과 이소프로판올 비율이 85:15(v/v)인 혼합물에 환류하에 30분간 용해하였다. 결과의 용액을 80℃로 냉각하고 용액이 뜨거운 상태에서 여과하였다. 여과된 용액을 5℃로 냉각하고 추가로 7시간 교반하였다. 결과의 결정성 침전물을 여과 분리하고, 메틸 에틸 케톤으로 세척하였다. 재결정화된 물질을 45-85℃에서 진공건조하였다.

HPLC-MS/MS 분석에 기초하여, 재결정된 톨페리손은 0.14중량%의 4-MMPPO를 함유하였다, 다음 생산 배치에서 4-MMPPO는 약 0.05%(500ppm) 이하인 것으로 검출되었으나, 원하는 농도인 10 ppm 또는 그 이하에는 미치지 못하였다. 이것은 출발물질에 함유된 톨페리손의 함량이 단일 재결정화에서 실질적으로 제거될 수 있는 함량보다 훨씬 많았거나, 또는 생성물의 가열 건조시 재결정된 생성물중에 잔여 메 틸 에틸 케톤이 존재하여 4-MMPPO 또는 그 결합물의 생성을 촉진하였기 때문일 수 있다.

결과의 재결정화된 톨페리손은 4-MMPPO의 농도와 관련된 유전자 독성 부작용의 잠재성 때문에 피검체에 투여하기에는 만족스럽지 않는 것으로 생각되는 4-MMPPO 농도를 함유하였다.

실시예 3

톨페리손의 다단계 재결정화

다단계(반복) 재결정화가 실시되는 것을 제외하고는 상기 실시예 2에서 이용한 접근방법을 반복하였다.

표4: 반복 재결정화 이후의 4- MMPPO 농도, 비-산성화된 용매

배치	[4-MMPPO], ppm 원료 톨페리손	[4-MMPPO], ppm 1차 재결정 후	[4-MMPPO], ppm 2차 재결정 후	[4-MMPPO], ppm 3차 재결정 후
1	107/51.1 건조전/후	<6.6	8.3	<6.6
2	7/<6.6	7.3	6.2	-

상기 표 4의 결과로부터 알 수 있듯이, 메틸 에틸 케톤과 이소프로판올과 같은 용매/용매계로부터 다단계 재결정화는 4-MMPPO가 실질적으로 없는 톨페리손을 제공하는데 효과적이다.

실시예 4

톨페리손의 재결정화에 이은 산 세척

0.05중량% 이상의 4-MMPPO 함량을 갖는 원료 톨페리손을 2-부타논(MEK)과 이소프로판올 비율이 85:15(v/v)인 혼합물에 환류하에 12시간 용해하였다. 온도를 80℃로 줄이고 뜨거운 상태에서 용액을 여과하였다. 여과된 용액을 5℃로 냉각하고 80℃에서 7시간 교반하였다.

결정성 침전물을 여과 분리하고, 1% HCl/이소프로판올 혼합물로 세척하고, 이어서 45-85℃에서 진공건조하였다.

도 1 및 도 2에서 입증된 바와 같이 톨페리손의 잠재적 부반응에 기초하여, 본 발명자들은 염기의 부존재가 4-MMPPO의 생성하는 톨페리손 또는 상응하는 α-히드록시 케톤 부산물의 β-제거 발생을 최소화하고, 산의 존재하에서 생성물의 재결정 및/또는 세척의 수치를 최소화한다는 이점을 깨달았다.

HPLC-MS/MS 분석에 기초하여, 1.5 내지 10 ppm 범위의 4-MMPPO 함량이 재정 생성물중에서 검출되었으며, 현재 이용가능한 상업용 톨페리손 제형보다 놀랄만하고 현격한 개선을 가져온 것으로 나타났다.

실시예 5

산성화된 용매를 이용한 톨페리손의 재결정화

원료 톨페리손을 2-부타논(MEK)과 이소프로판올 비율이 85:15(v/v)인 혼합물에 용해하고, 1% HCl을 첨가한 후 환류하에 12시간 용해하였다. 온도를 80℃로 줄이고 뜨거운 상태에서 용액을 여과하였다. 여과된 용액을 5℃로 냉각하고 5℃에서 7시간 교반하였다.

결정성 침전물을 여과 분리하고, 이소프로판올로 세척하고, 이어서 45-85℃에서, 바람직하게는 더욱 낮은 건조온도로 진공건조하였다.

톨페리손은 산의 존재시 재결정화중에 안정성이 향상되었다. 1%(v/v) 진한 HCl 용액을 재결정 혼합물에 가하자, 최종 재결정화된 톨페리손 생성물 중의 4-MMPPO 농도는 6.6 ppm 이하로 떨어졌다.

실시예 6

산성화된 용매계를 이용한 톨페리손의 다중 재결정화

원료 톨페리손(Lot SPH-3047, 배치 1과 2)를 2-부타논(MEK)과 이소프로판올 비율이 85:15(v/v)인 혼합물에 용해하고, 1% HCl을 첨가한 후 환류하에 12시간 용해하였다. 온도를 80℃로 줄이고 뜨거운 상태에서 용액을 여과하였다. 여과된 용액을 5℃로 냉각하고 5℃에서 7시간 교반하였다.

결정성 침전물을 여과 분리하고, 이소프로판올로 세척하고, 이어서 45-85℃에서, 바람직하게는 더욱 낮은 온도로 진공건조하였다.

상기 재결정 공정을 4회 반복하였다.

표5: 산성화된 용매를 이용한 반복 재결정화 이후의 4- MMPPO 농도

배치	[4-MMPPO], ppm 원료 톨페리손	[4-MMPPO], ppm 1차 재결정 후	[4-MMPPO], ppm 2차 재결정 후	[4-MMPPO], ppm 3차 재결정 후	[4-MMPPO], ppm 3차 재결정 후
1	107/51.1 건조전/후	<6.6	<6.6	<6.6	<6.6
2	7/<6.6	<6.6	<6.6	<6.6	<6.6

산성화된 조건항서 1차 재결정화한 결과 가장 크게 감소한 4-MMPPO와 정제된 톨페리손을 얻었으며, 추가적인 재결정은 또한 최종 의약 생성물중의 4-MMPPO 함량을 추가로 감소시키는데 효과적이었다.

실시예 7

톨페리손 의약 Lot와 제조된 정제중의 4-MMPPO의 농도 조사

표6: 의약 Lot 와 제조된 정제 제형중의 4- MMPPO 의 MS -검출

Lot No. 정제	제조업체	정제의 의약 Lot	[의약 Lot 또는 API중 4-MMPPO],ppm	제조일로부터 분석까지의 시간(mos)	[정제중 4-MMPPO],ppm
27506/040	A	SFO192	21	3	39
204406	A	SD0108, SE0107	14 20	6	66
204506	A	SF0093	-	6	56
206506	A	SF0094 SF0096	-	6	51
167106	A	SD0108 SE0107	14, 20	8	99
243806	B	SF0191	22, 21	4	14
		SF0192
247206	B	SF0097	-	4	18
247106	B	SF0095	-	5	13
307003	B	SB068	39	43	21

^*A= Merc; B= Viatris(현재 Meda AB의 부분, 스웨덴);

제조업체 A 및 B로부터 얻은 톨페리손 Lots는 최종 제조된 정제 제형이었다. 의약 Lots 및 최종 제조된 제형중의 4-MMPPO 농도를 측정하기 위해, 실시예 1에 기술된 대로 분석을 실시하였다. 상기 표 5의 조사에서 알 수 있듯이, 의약 lots(API, 제조된 의약 자체 즉, 첨가제, 안정제, 부형제 등이 없는)와 최종 약학적 제형(이 경우 정제)을 비교해쓸 때 거의 90%의 경우에서 주목할 정도의 4-MMPPO의 농도가 관찰되었다.

본 연구결과로서, 본 발명자들은 의약 lots 뿐만 아니라 최종 약학적 제형에 존재하는 4-MMPPO의 문제점을 인식하였다. 상기 표의 결과에 기초하여, 4-MMPPO는 톨페리손(API)의 제조과정 중, 및/또는 톨페리손의 정제과정 중, 및 또는 제형화 과정(예, 블랜딩)에서 생성될 뿐만 아니라 최종 약학적 제형의 저장기간중(즉, 저장시)에도 분해물(degradant)로 생성되는 것으로 나타났다.

실시예 8

즉시 방출되는 캡슐 제형

무수 구연산, 2-부탄논 및 이소프로필 알콜로 구성된 용액을 제조하였다. 10 ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 함유하는 톨페리손 히드로클로라이드를 먼저 제조한 용액이 들어 있는 과립제조기로 옮겼다. 이 혼합물을 균질화하고 이어서 60℃, 또는 그 이상, 바람직하게는 40℃에서 건조기에서 건조하였다. 생성된 과립을 1.8 mm 스크린을 통해 체질하였다. 이산화 실리콘과 활석(탈크)를 첨가하고 유사하게 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 스테아린산 마그네슘과 추가로 혼합하였다.

8 mm의 직경과 155.8-172.2 g의 중량을 갖는 정제를 제조하였다. 최종 과립을 에탄올/물중의 히프로멜로스/히프로멜로스 프탈레이트, 염료 및 첨가제로 구성된 현탁액으로 55-60℃에서 코팅 탱크 중에서 코팅하였다. 이어서, 코팅된 정제를 실온에서 건조하였다.

실시예 9

서방성 제형

본원에서 기술하였듯이, 10 ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 함유하는 톨페리손은 무수 구연산을 첨가한 부타논중의 Eudragit RS로 구성되는 용액과 함께 교반기중에서 히드로클로라이드 염으로 과립화한다. 이어서, Eudragit S 및 Eudragit L을 균질하게 첨가하고, 그 혼합물을 건조하고 체질하였다. 체질한 과립에 정제용 보조제를 첨가하고, 과립을 정제화하였다. 직경이 8 mm이고, 중량이 190 mg인 정제가 압착되었다.

이어서, 정제를 Eudragit L, 염료, 및 부탄올에 용해되는 갖가지의 보조제로 구성되는 필름 물질로 코팅("필름화")하였다.

표 7

성분 그램(g)

톨페리손 히드로클로라이드 150.00

Eudragit RS 1.88

Eudragit L 14.24

에로실(Aerosil) 1.80

스테아린산 1.80

글리세롤 디비히니트 7.50

산화철 염료 0.08

산화티타늄 4.08

활석 6.03

폴리에틸렌 글리콜 1.02

디메틸폴리실록산 0.05

본 발명은 종래기술의 제형에서 발견된 농도보다 현저히 감소한 약 10ppm 이하의 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-MMPPO)을 포함하는 톨페리손 조성물을 제공하며, 본원에서 제공된 톨페리손 조성물은 경련성 마비와 관련된 증세를 개선하거나 신경성 통증 및 여러 신경계 질환과 연관된 통증의 치료와 같은 소망하는 응답을 제공하는데 필요한 비독성이면서, 충분한 함량의 조성물 또는 약을 제공한다.

Claims

약 10ppm 이하의 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-MMPPO)을 포함하는 톨페리손.
약 7ppm 이하의 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-MMPPO)을 포함하는 청구항 1의 톨페리손.
약 3ppm 이하의 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-MMPPO)을 포함하는 청구항 1의 톨페리손.
청구항 1-3항 중 어느 한 항의 톨페리손과 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물
(i) 10 ppm 이상의 초기농도를 갖는 4-MMPPO, 및 임의의 부가 불순물을 포함하는 톨페리손을 제공하고, 및

(ii) 약 10 ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 갖는 정제된 톨페리손을 생성하기 위하여 상기 톨페리손을 정제하는 단계를 포함하는 정제된 톨페리손 조성물의 제조방법.
제 5항에 이ㅛ어서, 상기 정제는 초기농도보다 5배 이상으로 4-MMPPO의 농도를 감소시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 정제된 톨페리손은 약 7ppm 이하의 4-MMPPO 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 제공단계에 앞서, 상기 톨페리손중에 오염물질로서 4-MMPPO의 존재를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 확인단계에 이외에 상기 톨페리손중의 4-MMPPO 초기농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제단계는 단일 용매 또는 용매들의 결합물로 재결정화하는 것을 포함하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 재결정화는 단일 또는다중 재결정화 단계를 포함하는 방법
제 11항에 있어서, 상기 재결정화는 혼합된 유기용매계에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 용매계는 저급 케톤 및 저급 알콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 용매계는 메틸에틸 케톤 및 이소프로판올을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 재결정화로 얻어진 정제된 톨페리손을 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재결정화는 산성화된 용매에 톨페리손을 용해하고, 선택적으로 가열하에 톨페리손 조성물을 생성하고, 및 상기 톨페리손 용액으로부터 톨페리손 결정을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 정제단계는 건조단계를 포함하는 방법.
톨페리손의 합성 제조시 촉매학적 함량의 산을 첨가하여 4-MMPPO의 생성을 최소화하는 것을 포함하는 개선된 톨페리손의 합성 제조방법.
제 18항에 있어서, 상기 산은 무수 염화수소(HCl) 가스인 방법.
청구항 5 내지 17항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 정제된 톨페리손 조성물.
약 10ppm 이하의 2-메틸-1-(4-메틸페닐)-프로파논(4-MMPPO)을 포함하는 톨페리손 조성물을 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하는 개선된 톨페리손의 투여방법.
제 21항에 있어서, 투여의 결과로소, 상기 피검체에 대한 4-MMPPO의 존재와 관련된 상기 조성물의 유전자 독성 효과가 최소화되는 것을 특징으로 하는 방법.
적당한 용기내에 건조제와 결합되어 포장된 청구항 1내지 3항 중 어느 한항의 톨페리손.
(a) 톨페리손 및 선택적으로 하나이상의 부형제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계,

(b) 부가적인 4-MMPPO의 생성을 막기 위해 산성화된 알콜에 상기 조성물을 용해하여 산성화된 톨페리손 용액을 생성하는 단계,

(c) 유기용매로 추출하여 존재하는 상기 하나 이상의 부형제를 상기 톨페리손과 분리하여 산성화된 톨페리손 추출액을 제공하는 단계,

(d) 4-MMPPO의 함량을 정량하기 위해 내부 표준액(internal standard)에 상기 (b) 또는 (c)용액을 첨가하여 샘플 용액을 제공하는 단계, 및

(e) 액체 크로마토그래피/질량 크로마토그래피에 의해 상기 샘플 용액중의 4-MMPPO 농도를 분석하는 단계(여기서, 상기 액체 크로마토그래피에 도입된 하나 이상의 용출액은 산성화되어, 상기 샘플 중에 500ppm 이하로 존재하는 4-MMPPO 농도가 검출된다)를 포함하는 톨페리손 조성물 중의 4-MMPPO 농도를 검출하는 방법.
제 24항에 있어서, 상기 산성화된 알콜은 염산, 브롬화수소산, 트리플루오로아세트산, 및 메탄 설폰산으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 산성화된 알콜은 메탄올성 염산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c)중의 유기 용매는 에테르 또는 친유성 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
제 27항에 있어서, 상기 용매는 디이소프로필 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 표준액은 중수소화된 4-MMPPO인 것을 특징으로 하는 방법.
상기 톨페리손 조성물을 투여한 피검체에 4-MMPPO의 존재와 관련된 유전자 독성 효과를 최소화하기 위해 청구항 1-3의 어느 한 항의 조성물을 사용하는 방법.