KR20090005963A - 보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물 - Google Patents

보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물에 관한 것으로서, 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 액상 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 메티오닌, 및 이소루신을 포함하는 약제학적 액상 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 액상 조성물은 보툴리눔 독소의 안정화제로 동물 유래의 단백질인 알부민 또는 젤라틴 대신 아미노산으로서 메티오닌 또는 메티오닌과 이소루신의 조합 및 계면활성제로서 폴리솔베이트 20을 사용하여, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물을 투여받는 환자가 혈액 유래 병원균 또는 전염성 미생물에 감염되는 잠재적인 위험성을 줄일 수 있고 인체에 대한 안전성을 증대시킬 수 있다. 또한 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 환자에게 투여해야 하는 경우 액상 형태이기 때문에 사용자가 편리하게 사용할 수 있다. 더불어 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 계면활성제 또는 아미노산만을 단독으로 사용하는 경우보다 액상 상태에서의 보관 안정성이 월등하고 냉장 조건뿐만 아니라 25~37℃의 상온에서도 장기간 보툴리눔 독소의 활성이 유지되므로, 냉장 조건을 유지할 수 없는 비상시에도 보존 안정성을 가질 수 있는 장점이 있다.
클로스트리디움, 보툴리눔 독소, 계면활성제, 폴리솔베이트, 아미노산, 메티오닌, 이소루신, 알부민, 안정화제

Description

보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물{Stable liquid composition of Botulinum Toxin}
본 발명은 보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 액상 조성물 또는 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 메티오닌, 및 이소루신을 포함하는 약제학적 액상 조성물에 관한 것이다.
보툴리눔 독소는 혐기성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 폴리펩티드 생성물이다. 이 독소는 신경근 접합부에서 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 시냅스 전(前) 방출을 차단함으로써 포유류에게서 근육 마비를 야기시킨다. 이 독소는 최근에 사시, 특발성 안검경련, 및 반측안면 경련뿐만 아니라 사경(斜頸), 구하악골 근긴장 이상, 경련성 발성 장애, 및 근긴장을 포함하는 어떤 불수의근 운동 장애를 치료하는 데 있어서 치료학적으로 사용되고 있다. 또한, 이 독소는 안면 상의 주름살을 비외과적으로 감소시키는 것과 같은 다양한 미용학적 분야와, 다한증(과다 발한)을 치료하는 데 있어 이용되고 있다.
현재 보툴리눔 독소 단백질 중 세로타입(Serotype) A와 B는 안검경련, 사경, 다한증 치료뿐만 아니라 얼굴의 주름제거를 위한 용도로 약제화가 이루어져 있는데, 이러한 보툴리눔 독소와 같은 단백질 제제의 경우 약제화 과정에 많은 문제점이 발생한다. 이는 단백질의 불안정성에 기인하며 보툴리눔 독소와 같이 극히 낮은 농도로 약제화가 이루어지는 단백질 제제의 경우 그 문제가 심각하다.
보툴리눔 독소 단백질은 고체 표면에 접착하는 특성을 가지므로 용기에 주입되는 경우 단백질의 일부가 용기 내벽에 접착하여 활성성분의 손실을 가져온다. 또한 단백질은 쉽게 산화되거나 작은 단편으로 분해될 수 있으므로 이를 방지할 수 있는 물질로서 안정화제를 첨가할 필요가 있다.
상기의 문제를 해결하기 위하여 보툴리눔 독소 단백질의 약제화 과정에서 안정화제로 주로 알부민이 많이 이용된다. 알부민은 약제학적 조성물에서 단백질 활성성분을 안정화할 수 있을 뿐만 아니라, 사람환자에게 주사되는 경우 면역원성이 무시할 수 있을 정도라는 장점이 있다. 그러나 알부민과 같은 혈액 제품은 환자가 혈액 유래 병원균 또는 전염성 미생물에 감염되는 잠재적인 위험성을 초래할 수 있고, 특히 바이러스의 감염이나 단백질에 의해 전달되어지는 크로이츠펠트-야곱 병과 같은 질병의 매개를 완전히 배제할 수 없다.
알부민을 대체하기 위하여 젤라틴을 이용하는 경우도 있으나 이 역시 동물에서 얻어지는 단백질이기 때문에 알부민과 마찬가지로 질병을 매개할 수 있고, 약제화 과정에서 사용하지 않는 것이 권고된다.
보툴리눔 독소 단백질의 약제화 과정에서 동물 소스로부터 유래하지 않는 안정화제를 이용하는 기술로서 대한미국 등록특허공보 제10-0799400호에는 효모에서 생산되는 재조합 알부민(rSA)를 약제화에 이용하는 방법이 개시되어 있으나, 재조합 알부민(rSA)의 생산 및 분리 회수 과정에서 새로운 항원성 구조인 네오에피토프 (Neoepitope)가 발생하여 약제의 수용자에게 면역반응을 유발할 가능성을 완전히 배제할 수 없다. 또한 대한민국 등록특허공보 제10-0665469호에는 보툴리눔 독소, 다당류(히드록시에틸 전분 포함), 및 아미노산으로서 리신, 글리신, 히스티딘, 또는 아르기닌을 포함하는 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 그러나 상기 특허의 약제학적 조성물은 동결건조형태의 제형을 위한 조성물이고, 보관조건도 냉동 또는 냉장으로 한정되어 있다. 동결건조형태의 보툴리눔 독소는 사용 직전 동결된 제형을 녹이거나 희석하는 과정이 필요하고, 이 과정에서 오차가 발생할 수 있다. 아울러 동결건조형태의 보툴리눔 독소는 사용상의 불편함이 따르며 프리필드 시린지 형태(pre-filled syringe type)로 개발하는 것이 불가능하다는 문제점이 존재한다.
한편, 보툴리눔 독소를 안정화시키기 위한 조성물과 관련하여 미국공개특허공보 제2007-0134199호에는 폴리솔베이트를 포함한 비이온성 계면활성제, 및 아미노산으로서 글루타민과 글루탐산 또는 아스파라긴과 아스파르트산을 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 상기 특허의 액상 조성물에 보툴리눔 독소를 희석하여 냉장조건인 4℃에서 보관하는 경우 8개월이 지나도 안정하였지만, 상온인 37℃에서 보관하는 경우 1개월 이내에 활성이 감소하는 결과를 보여 상온에서 보툴리눔 독소를 포함하는 약제학적 액상 조성물을 안정화시키기에는 한계가 있다. 이는 액상 조성물에 사용되는 아미노산이 모두 극성을 띄고 있고, 특히 글루탐산과 아스파르트산은 산성을 띄고 있기 때문인 것으로 판단된다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 냉장조건에서뿐만 아니라 상온에서도 장시간 보관시 보툴리눔 독소의 활성을 유지하고, 동시에 사용상의 불편함을 해소하기 위한 제제 형태로서 동결건조형태가 아닌 액상형태의 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.
특히 본 발명은 보툴리눔 독소의 안정화제로 알부민이나 젤라틴 같은 동물 유래의 단백질을 사용하지 않고, 글루타민, 글루탐산, 아스파라긴, 아스파르트산과 같은 극성 또는 산성의 아미노산을 포함하지 않으면서도 냉장 및 상온의 보관 조건에서 보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 보툴리눔 독소의 안정화제 후보의 선별 및 그들을 조합하여 보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 안정성 실험을 수행하였고, 그 결과 계면활성제 중 폴리솔베이트 20 및 아미노산 중 메티오닌 또는 메티오닌과 이소루신을 동시에 포함하는 액상 조성물이 보툴리눔 독소의 안정성을 개선시키는 데 뛰어난 효과가 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 상기 목적은 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 액상 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 목적은 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 메티오닌, 및 이소루신을 포함하는 약제학적 액상 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 약제학적 액상 조성물은 메티오닌의 함량이 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.5 내지 100 mmol인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 메티오닌의 농도가 0.5~100 mM이고, 더 바람직하게는 메티오닌의 농도가 25~75 mM인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 폴리솔베이트 20의 함량이 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.01 내지 50 mg인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 폴리솔베이트 20의 농도가 0.01~50 mg/mL이고 더 바람직하게는 폴리솔베이트 20의 농도는 0.1~2.5 mg/mL인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 보툴리눔 독소가 보툴리눔 세로타입(Serotype) A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하여, 복합체화 단백질을 함유하지 않는 형태 또는 복합체화 단백질을 함유하는 복합체 형태를 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 pH가 5.5~7.0인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약제학적 액상 조성물은 보툴리눔의 안정화제로 동물 유래의 단백질인 알부민 또는 젤라틴 대신 아미노산으로서 메티오닌 또는 메티오닌과 이소루신의 조합 및 계면활성제로서 폴리솔베이트 20을 사용하여, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물을 투여받는 환자가 혈액 유래 병원균 또는 전염성 미생물에 감염되는 잠재적인 위험성을 줄일 수 있고 인체에 대한 안전성을 증대시킬 수 있다.
또한 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 환자에게 투여해야 하는 경우 액상 형태이기 때문에 사용자가 편리하게 사용할 수 있다. 더불어 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 계면활성제 또는 아미노산만을 단독으로 사용하는 경우보다 액상 상태에서의 보관 안정성이 월등하고 냉장 조건뿐만 아니라 25~37℃의 상온에서도 장기간 보툴리눔 독소의 활성이 유지되므로, 냉장 조건을 유지할 수 없는 비상시에도 보존 안정성을 가질 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 계면활성제와 아미노산의 조성을 이용하여 보툴리눔 독소를 안정화시키므로 동결건조과정 없이 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명은 보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 액상 조성물 또는 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 메티오닌, 및 이소루신을 포함하는 약제학적 액상 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물은 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 및 메티오닌을 포함하여 구성되거나, 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 메티오닌, 및 이소루신을 포함하여 구성된다.
본 발명에서는 보툴리눔 독소의 안정화제로 알부민 또는 젤라틴과 같은 동물 유래 단백질을 사용하지 않고 폴리솔베이트 20, 메티오닌, 또는 이소루신을 사용하기 때문에 보툴리눔 독소 약제학적 조성물을 투여받는 환자가 혈액 유래 병원균 또는 전염성 미생물에 감염되는 잠재적인 위험성을 줄일 수 있고 인체에 대한 안전성을 증대시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 보툴리눔 독소의 안정화제로 폴리솔베이트 20 및 메티오닌의 조합, 또는 폴리솔베이트 20, 메티오닌, 및 이소루신의 조합을 사용하기 때문에 계면활성제 또는 아미노산만을 단독으로 사용하는 경우보다 25~27℃의 상온 조건에서 보툴리눔 독소의 활성을 보다 안정적으로 유지시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 액상 조성물의 일 구성요소인 보툴리눔 독소는 보툴리눔 세로타입(Serotype) A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성된 그룹에서 임의로 선택될 수 있다. 보툴리눔 독소는 면역학적인 구별법을 통하여 세로타입(Serotype) A, B, C, D, E, F, G로 구별되어 질 수 있고, 각각의 세로타입에 따라 작용하는 동물 종 및 마비의 정도, 지속시간 등이 달라질 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 모든 세로타입의 보툴리눔 독소는 신경근 접합부에서 신호전달물질인 아세틸콜린의 분비를 저해함으로써 신경마비효과를 발생하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 액상 조성물의 일 구성요소인 보툴리눔 독소는 복합체화 단백질을 함유하지 않는 형태 또는 복합체화 단백질을 함유하는 복합체 형태를 모두 포함할 수 있다. 자연적으로 형성하는 복합체화 단백질을 함유하지 않으며 A, B, C, D, E, F 또는 G형 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 유래되는 보툴리 눔 독소 단백질의 분자량은 대략 150 KDa이다. 하지만 클로스토리디움 보툴리눔 박테리아에 의해서 독소 단백질이 생산되어질 때 보툴리눔 독소 단백질은 보툴리눔 독소 단백질의 작용을 보조 및 보호하는 여러가지 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 단백질 및 비헤마글루티닌 단백질과 다양한 복합체를 형성하여 생산된다. 자연적으로 형성하는 복합체화 단백질을 함유하는 보툴리눔 독소 세로타입 A는 대략 900kDa, 500kDa, 또는 300kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이고, 세로타입 B와 C는 대략 500kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이고, 세로타입 D는 대략 300kDa, 또는 500kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이며, 세로타입 E와 F는 대략 300kDa의 분자량을 가진 복합체 형태이다.
본 발명의 약제학적 액상 조성물의 일 구성요소인 메티오닌은 그 함량이 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.5 내지 100 mmol인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 메티오닌의 농도가 0.5~100 mM이고, 더 바람직하게는 메티오닌의 농도가 25~75 mM인 것을 특징으로 한다. 보툴리눔 독소 1 유닛(Unit)은 체중이 18~20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스 (Swiss Webster Mice)에 복강내 주사를 통한 사망률이 50%인 LD50으로 정의할 수 있다. 마우스에서 보툴리눔 독소 타입 A의 LD50은 약 50 피코그램이다. 본 발명의 약제학적 액상 조성물에서 메티오닌 함량이 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.5 mmol 미만이면 상온에서 장기간 보관시 메티오닌에 의한 보툴리눔 독소의 안정화 효과가 일정 수준 이하로 나타날 수 있고, 100 mmol을 초과하는 경우에는 초과에 따른 상승 효과가 더 이상 나타나지 않을 수 있으며, 메티오닌의 과다 사용으로 인해 경제성에 어려움을 줄 수 있다. 본 발명의 약제학적 액상 조성물에서 보툴리눔 독소의 농도가 100 유닛/mL 일 때, 메티오닌의 적정 농도는 0.5~100 mM 이고 폴리솔베이트 20의 농도 범위를 동시에 고려하는 경우 메티오닌의 적정 농도는 25~75 mM이다. 본 발명의 약제학적 액상 조성물에서 메티오닌의 농도가 25 mM 미만이면 상온에서 장기간 보관시 폴리솔베이트 20의 특정 농도 범위에서 메티오닌에 의한 보툴리눔 독소의 안정화 효과가 일정 수준 이하로 나타날 수 있고 메티오닌의 농도가 75 mM을 초과하는 경우에는 초과에 따른 상승 효과가 더 이상 나타나지 않을 수 있다.
본 발명의 약제학적 액상 조성물의 일 구성요소인 폴리솔베이트 20은 그 함량이 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.01 내지 50 mg인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 폴리솔베이트 20의 농도가 0.01~50 mg/mL이고 더 바람직하게는 폴리솔베이트 20의 농도는 0.1~2.5 mg/mL인 것을 특징으로 한다. 폴리솔베이트(Polysorbate)는 비이온성 계면활성제로서 제약 또는 식품분야에서 유화제로 주로 사용되고, 특히 화장품 분야에서 에센셜 오일을 물속에 유화시키는 수중유적(oil-in-water)의 제품에 주로 사용된다. 폴리솔베이트의 종류로는 옥시에틸렌 그룹의 전체 수를 기준으로 폴리솔베이트 20, 40, 60, 또는 80이 있으며, 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 이 중 폴리솔베이트 20(상품명은 트윈 20, Tween 20)을 보툴리눔 독소의 안정화제로 사용한다. 본 발명의 약제학적 액상 조성물에서 폴리솔베이트 20 함량이 보 툴리눔 독소 100 유닛당 0.01 mg 미만이면 상온에서 장기간 보관시 폴리솔베이트 20에 의한 보툴리눔 독소의 안정화 효과가 일정 수준 이하로 나타날 수 있고, 50 mg을 초과하는 경우에는 메티오닌의 특정 농도 범위에서 폴리솔베이트 20에 의한 보툴리눔 독소의 안정화 효과가 일정 수준 이하로 나타날 수 있으며, 폴리솔베이트 20의 과다 사용으로 인해 경제성에 어려움을 줄 수 있다. 본 발명의 약제학적 액상 조성물에서 보툴리눔 독소의 농도가 100 유닛/mL 일 때, 폴리솔베이트 20의 적정 농도는 0.01~50 mg/mL 이고 메티오닌의 농도 범위를 동시에 고려하는 경우 폴리솔베이트 20의 적정 농도는 0.1~2.5 mg/mL이다. 본 발명의 약제학적 액상 조성물에서 폴리솔베이트의 농도가 0.1 mg/mL 미만이면 상온에서 장기간 보관시 메티오닌의 특정 농도 범위에서 폴리솔베이트 20에 의한 보툴리눔 독소의 안정화 효과가 일정 수준 이하로 나타날 수 있고 폴리솔베이트 20의 농도가 2.5 mg/mL를 초과하는 경우에는 초과에 따른 상승 효과가 더 이상 나타나지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 pH가 5.5~7.0인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 약제학적 액상 조성물은 pH가 5.5~7.0인 경우 상온(특히 40℃의 온도)에서 장기간 보관시 보툴리눔 독소의 활성이 안정적으로 유지된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 실험방법
(1) 보툴리눔 독소 액상 조성물의 제조
적정 농도로 조정된 안정화제 용액을 이용하여 보툴리눔 독소액을 희석하고 최종적으로 보툴리눔 독소액의 농도를 100 유닛/mL가 되도록 보툴리눔 독소 액상 조성물을 제조하였다.
(2) 보툴리눔 독소의 안정성 실험
제조된 보툴리눔 독소 액상 조성물 1mL를 특정 온도에서 보관하면서 일정기간 마다 샘플링을 하였다. 샘플링된 액상 조성물 1mL에 주사용수 9mL를 넣어 10배로 희석하고, 희석된 샘플을 4주령 ICR(Institute of Cancer Research, USA) 암컷 마우스 5마리에 복강 주사하였다(1마리당 0.3 mL씩, 즉 3 유닛/마우스). 복강 주사 후 3일 동안 관찰하면서 사망한 마우스의 수 및 그에 따른 사망률을 확인하였다. 마우스의 사망률이 50% 이상이면 보툴리눔 독소의 활성이 유지되는 것으로 평가될 수 있다.
본 실험은 살아있는 마우스를 대상으로 하였는바, 그 특성상 동일 조성의 보툴리눔 독소 액상 조성물을 가지고 안정성 실험을 진행하는 경우에도 마우스의 상태에 따라 다른 결과를 보일 수 있다.
2. 보툴리눔 독소 안정화제의 선별
보툴리툼 독소 안정화제의 선별 실험에 따른 실시예, 비교예 및 25℃에서의 안정성 실험결과를 표 1에 나타내었다. 또한 보툴리툼 독소 안정화제의 선별 실험에 따른 실시예, 비교예 및 37℃에서의 안정성 실험결과를 표 2에 나타내었다. 표 1 및 표 2에서 HSA는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin)을 의미하고 PEG 8000은 폴리에틸렌글리콜 8000을 의미한다.
구분 보툴리눔 독소 액상 조성물의 조성 사망률(%)
특정 안정화제 (농도) 폴리솔베이트 20 (mg/mL) 보툴리눔 독소 (유닛/mL) 0일 6일 14일 23일 35일
실시예 1 L-Methione(20mM) 2.0 100 100 100 100 100 100
비교예 1 - 2.0 100 0 - - -
비교예 2 HSA (5mg/mL) - 100 100 0 - -
비교예 3 HSA (5mg/mL) 2.0 100 100 100 100 100
비교예 4 L-Arginine (50mM) 100 0 - - -
비교예 5 L-Isoleucine (50mM) 100 80 100 60 80
비교예 6 L-Glutamic acid (50mM) 100 100 0 - -
비교예 7 Histidine (10mM) 100 0 - - -
비교예 8 Glutamine (8mg/ml) 100 100 60 0 -
비교예 9 Glycine (2mg/ml) 100 0 - - -
비교예 10 Sodium glutamate (10mM) 100 100 0 - -
비교예 11 Hydroxyethyl starch (10mg/ml) 100 100 80 80 60
비교예 12 Mannitol (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 13 Sorbitol (50mg/ml) 100 60 0 - -
비교예 14 C8-Glucose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 15 C8-Trehalose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 16 Sucrose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 17 Lactose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 18 PEG 8000 (100mg/ml) 100 0 - - -
비교예 19 Hyaluronic acid (10mg/ml) 100 0 - - -
구분 보툴리눔 독소 액상 조성물의 조성 사망률(%)
특정 안정화제 (농도) 폴리솔베이트 20 (mg/mL) 보툴리눔 독소 (유닛/mL) 0일 6일 14일 23일 35일
실시예 1 L-Methione(20mM) 2.0 100 100 100 100 100 100
비교예 1 - 2.0 100 0 - - -
비교예 2 HSA (5mg/mL) - 100 100 0 - -
비교예 3 HSA (5mg/mL) 2.0 100 100 80 100 100
비교예 4 L-Arginine (50mM) 100 0 - - -
비교예 5 L-Isoleucine (50mM) 100 0 - - -
비교예 6 L-Glutamic acid (50mM) 100 0 - - -
비교예 7 Histidine (10mM) 100 0 - - -
비교예 8 Glutamine (8mg/ml) 100 0 - - -
비교예 9 Glycine (2mg/ml) 100 0 - - -
비교예 10 Sodium glutamate (10mM) 100 0 - - -
비교예 11 Hydroxyethyl starch (10mg/ml) 100 100 0 - -
비교예 12 Mannitol (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 13 Sorbitol (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 14 C8-Glucose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 15 C8-Trehalose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 16 Sucrose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 17 Lactose (50mg/ml) 100 0 - - -
비교예 18 PEG 8000 (100mg/ml) 100 0 - - -
비교예 19 Hyaluronic acid (10mg/ml) 100 0 - - -
표 1에서 보이는 바와 같이 25℃에서는 L-Methione(20mM)+폴리솔베이트 20(2mg/mL)+보툴리눔 독소(100 유닛/mL), HSA(5mg/mL)+폴리솔베이트 20(2mg/mL)+보툴리눔 독소(100 유닛/mL), L-Isoleucine(50mM)+폴리솔베이트 20(2mg/mL)+보툴리눔 독소(100 유닛/mL), Hydroxyethyl starch(10mg/mL)+폴리솔베이트 20(2mg/mL)+보툴리눔 독소(100 유닛/mL)로 이루어진 액상 조성물에서 보툴리눔 독소의 활성이 장기간 유지되었다. 또한 표 2에서 보이는 바와 같이 37℃에서는 L-Methione(20mM)+폴리솔베이트 20(2mg/mL)+보툴리눔 독소(100 유닛/mL), HSA(5mg/mL)+폴리솔베이트 20(2mg/mL)+보툴리눔 독소(100 유닛/mL)로 이루어진 액상 조성물에서 보툴리눔 독소의 활성이 장기간 유지되었다.
상기의 결과로부터 메티오닌과 폴리솔베이트 20의 조합은 HSA와 폴리솔베이트 20의 조합, 히드록시에틸 전분과 폴리솔베이트 20의 조합을 대체할 수 있는 안정제로 평가된다. 또한 이소루신과 폴리솔베이트 20의 조합도 종래의 안정제를 대체할 수 있는 가능성이 있는 것으로 보인다.
3. 메티오닌의 농도 변화에 따른 보툴리눔 독소의 안정성
보툴리눔 독소의 안정화제로 메티오닌과 폴리솔베이트 20의 조합을 선별하고 메티오닌의 농도 변화에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험을 37℃의 보관조건에서 실시하였다. 표 3에 메티오닌의 농도 변화에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험 결과를 나타내었다.
구분 보툴리눔 독소 액상 조성물의 조성 사망률(%)
메티오닌 (mM) 폴리솔베이트 20 (mg/mL) 보툴리눔 독소 (유닛/mL) 4일 10일 18일 24일 29일 44일 56일 70일
실시예 2 0.5 2.0 100 100 100 100 100 100 100 60 0
실시예 3 1.0 100 100 100 100 100 100 100 100
실시예 4 20 100 100 100 100 100 100 100 0
실시예 5 50 100 100 100 100 100 100 100 100
실시예 6 100 100 100 100 100 100 100 100 100
비교예 20 - 0 - - - - - - -
표 3에서 보이는 바와 같이 메티오닌의 농도가 0.5~20 mM 인 경우 56일까지 보툴리눔 독소의 활성이 유지되었고, 50~100 mM 인 경우 70일까지 보툴리눔 독소의 활성이 유지되었다. 메티오닌을 첨가하지 않고 폴리솔베이트 20만을 보툴리눔 독소의 안정화제로 사용한 경우와 비교해 볼 때 보툴리눔 독소의 안정성이 크게 향상되었음을 알 수 있다.
4. 폴리솔베이트 20의 농도 변화에 따른 보툴리눔 독소의 안정성
보툴리눔 독소의 안정화제로 선별된 메티오닌과 폴리솔베이트 20의 조합에서 폴리솔베이트 20의 농도 변화에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험을 37℃의 보관조건에서 실시하였다. 표 4에 폴리솔베이트 20의 농도 변화에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험 결과를 나타내었다.
구분 보툴리눔 독소 액상 조성물의 조성 사망률(%)
메티오닌 (mM) 폴리솔베이트 20 (mg/mL) 보툴리눔 독소 (유닛/mL) 30일 60일 90일 120일 167일 202일
실시예 7 20 0.01 100 100 100 100 100 80 0
실시예 8 0.5 100 80 100 100 80 100
실시예 9 2.0 100 100 80 100 80 100
실시예 10 10 100 100 80 100 40 0
실시예 11 50 100 0 - - - -
비교예 21 1 - 0 - - - - -
비교예 22 5 - 0 - - - - -
비교예 23 10 - 0 - - - - -
비교예 24 20 - 0 - - - - -
표 4에서 보이는 바와 같이 폴리솔베이트 20의 농도가 0.5~2.0 mg/mL 인 경우 202일까지 보툴리눔 독소의 활성이 유지되었고, 폴리솔베이트 20의 농도가 0.01 mg/mL, 10mg/mL 인 경우 각각 167일, 120일까지 보툴리눔 독소의 활성이 유지되었다. 폴리솔베이트 20을 첨가하지 않고 메티오닌만을 보툴리눔 독소의 안정화제로 사용한 경우와 비교해 볼 때 보툴리눔 독소의 안정성이 크게 향상되었음을 알 수 있다.
5. 메티오닌과 폴리솔베이트 20의 다양한 농도 조건에서의 보툴리눔 독소의 안정성
보툴리눔 독소의 안정화제로 선별된 메티오닌과 폴리솔베이트 20의 조합에서 메티오닌 및 폴리솔베이트 20의 다양한 농도 변화에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험을 37℃의 보관조건에서 실시하였다. 표 5에 30일 보관시 메티오닌 및 폴리솔베이트 20의 다양한 농도 조건(실시예 12)에서의 보툴리눔 독소의 안정성 실험 결과(사망률(%))를 나타내었고 표 6에 60일 보관시 메티오닌 및 폴리솔베이트 20의 다양한 농도 조건(실시예 12)에서의 보툴리눔 독소의 안정성 실험 결과(사망률(%))를 나타내었다. 상기 실험의 보툴리눔 독소 액상 조성물에서 보툴리눔 독소의 농도는 100 유닛/mL이었다.
메티오닌과 폴리솔베이트 20의 농도 조건 메티오닌(mM)
1 5 10 25 50 75 100
폴리솔베이트 20 (mg/mL) 0.1 100 100 80 100 100 100 100
0.5 100 100 80 100 100 100 100
2.5 100 100 100 100 100 100 100
10 100 100 100 100 100 100 100
25 100 100 100 100 100 100 100
50 80 100 100 80 80 100 100
메티오닌과 폴리솔베이트 20의 농도 조건 메티오닌(mM)
1 5 10 25 50 75 100
폴리솔베이트 20 (mg/mL) 0.1 100 100 80 100 100 80 100
0.5 100 100 80 100 100 100 100
2.5 100 100 100 80 100 100 100
10 0 40 0 100 100 100 40
25 0 80 80 100 - 100 60
50 0 0 0 0 80 - 0
표 5와 표 6의 결과를 이용하여 통계분석을 수행한 결과, 25~75 mM의 메티오닌과 0.1~2.5 mg/mL의 폴리솔베이트 20의 조합이 보툴리눔 독소를 가장 안정화시키는 것으로 추정되었다.
6. 보툴리눔 독소 액상 조성물의 pH 에 따른 보툴리눔 독소의 안정성
보툴리눔 독소를 가장 안정화시키는 메티오닌과 폴리솔베이트 20의 농도 범위에서 pH가 5.5~7.0을 가진 보툴리눔 독소 액상 조성물(실시예 13)을 제조하고 보툴리눔 독소의 안정성 실험을 40℃의 보관조건에서 실시하였다. 보툴리눔 독소 액상 조성물의 pH는 염산(HCl) 또는 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 조정하였고, 보툴리눔 독소의 농도는 100 유닛/mL이었다. 표 7에 보툴리눔 독소 액상 조성물의 pH에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험 결과를 나타내었다.
표 7에서 보이는 바와 같이 25~75 mM의 메티오닌과 0.25~0.75 mg/mL의 폴리솔베이트 20의 조합 및 pH 5.5~7.0의 범위를 가진 보툴리눔 독소 액상 조성물에서는 40℃의 보관 조건에서 90일간 보툴리눔 독소의 활성이 유지되었다.
보툴리눔 독소 액상 조성물의 조성 사망률(%)
메티오닌 (mM) 폴리솔베이트 20 (mg/mL) pH 7일 15일 30일 60일 90일
25 0.25 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
0.5 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
0.75 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
50 0.25 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
0.5 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
0.75 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
75 0.25 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
0.5 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
0.75 5.5 100 100 100 100 100
6.0 100 100 100 100 100
6.5 100 100 100 100 100
7.0 100 100 100 100 100
7. 메티오닌, 이소루신 및 폴리솔베이트 20의 조합에 따른 보툴리눔 독소의 안정성
보툴리눔 독소의 안정화제를 선별하는 과정에서 메티오닌과 폴리솔베이트 20의 조합뿐만 아니라, 이소루신과 폴리솔베이트 20의 조합도 보툴리눔 독소를 안정화시키는 효과를 가졌는바, 메티오닌, 이소루신 및 폴리솔베이트 20의 조합에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험을 37℃의 보관조건에서 실시하였다. 표 8에 메티오닌, 이소루신 및 폴리솔베이트 20의 조합에 따른 보툴리눔 독소의 안정성 실험 결과를 나타내었다. 상기 실험의 보툴리눔 독소 액상 조성물에서 보툴리눔 독소의 농도는 100 유닛/mL이었다.
구분 보툴리눔 독소 액상 조성물의 조성 사망률(%)
메티오닌 (mM) 이소루신 (mg/mL) 폴리솔베이트 20 (mg/mL) 30일 60일 90일 120일 167일 202일
실시예 14 20 10 0.5 100 100 80 100 100 100
실시예 15 2.0 100 100 80 100 100 0
실시예 16 10 100 100 100 100 100 100
비교예 25 - 10 - 80 0 - - - -
비교예 26 20 10 - 0 - - - - -
비교예 27 - 10 0.5 0 - - - - -
비교예 28 - 1 2.0 0 - - - - -
비교예 29 - 10 0 - - - - -
비교예 30 - 30 0 - - - - -
비교예 31 - 50 0 - - - - -
비교예 32 - 100 0 - - - - -
비교예 33 - 10 10 0 - - - - -
표 8에서 보이는 바와 같이 메티오닌, 이소루신 및 폴리솔베이트 20의 조합에서는 37℃의 보관조건에서 오랜 시간동안(약 200일) 보툴리눔 독소의 활성이 유지되었다. 반면에 이소루신만으로 이루어지거나, 메티오닌과 이소루신의 조합만으로 이루어지거나, 이소루신과 폴리솔베이트 20의 조합만으로 이루어진 경우 보툴리눔 독소의 활성이 30일이 경과 되기 전에 거의 사라짐을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 보툴리눔 독소, 폴리솔베이트 20, 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 액상 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 메티오닌의 함량은 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.5 내지 100 mmol인 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 메티오닌의 농도는 0.5~100 mM인 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 메티오닌의 농도는 25~75 mM인 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리솔베이트 20의 함량은 보툴리눔 독소 100 유닛당 0.01 내지 50 mg인 것을 특징으로 하는 약제학적 액 상 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 폴리솔베이트 20의 농도는 0.01~50 mg/mL인 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 폴리솔베이트 20의 농도는 0.1~2.5 mg/mL인 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 세로타입(Serotype) A, B, C, D, E, F, 및 G로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 복합체화 단백질을 함유하지 않는 형태 또는 복합체화 단백질을 함유하는 복합체 형태인 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 pH는 5.5~7.0인 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 액상 조성물은 이소루신을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 액상 조성물.
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