CN113164387A - 稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有提高肉毒杆菌毒素的稳定性的作用的稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，其制备方法以及包含该稳定化液体组合物并具有改善的肉毒杆菌毒素的稳定性的药物组合物。根据本发明，由于即使在室温下也能长时间维持液体肉毒杆菌毒素的活性，因此具有优异的存储稳定性和保存稳定性以及易于施用的优点。

Description

稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物
技术领域
本发明涉及具有提高肉毒杆菌毒素的稳定性的作用的稳定化液体组合物，其制备方法以及用于改善肉毒杆菌毒素的稳定性的药物组合物，其包含稳定化液体组合物。
本申请要求于2018年11月30日提交的韩国专利申请No.10-2018-0151983和2019年8月20日提交的韩国专利申请No.10-2019-0101723的优先权和权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
梭状芽胞杆菌属按形态和功能分类有127种以上。厌氧革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)会产生有效的多肽神经毒素，例如肉毒杆菌毒素(下文中，所使用的“毒素”在本文中也可与其互换使用)，其引起人类和动物中称为肉毒杆菌中毒的神经麻痹性疾病。肉毒杆菌毒素中毒的症状可能包括步态异常、吞咽困难、言语障碍和可能导致死亡的呼吸肌麻痹。
肉毒杆菌毒素的一个单位当腹膜内注射到体重约18至20g的雌性Swiss Webster小鼠中时被定义为LD50。肉毒杆菌毒素的一个单位是杀死一组Swiss Webster小鼠中的50％的肉毒杆菌毒素的量。
七种免疫学上不同的肉毒杆菌神经毒素(例如血清型A、B、C、D、E、F和G肉毒杆菌神经毒素)的特征通过被类型特异性抗体中和来区分。根据肉毒杆菌毒素的血清型的不同，受其影响的动物种类以及由其引起了麻痹的严重程度和持续时间也有所不同。肉毒杆菌毒素显然以高亲和力结合胆碱能运动神经元，重新定位到神经元，并阻断乙酰胆碱的突触前释放。
肉毒杆菌毒素已在临床环境中用于治疗以骨骼肌过度活跃为特征的神经肌肉疾病。美国食品药品监督管理局(FDA)批准A型肉毒杆菌毒素用于12岁以上患者的原发性眼睑痉挛、斜视和面肌痉挛，还批准用于治疗宫颈肌张力障碍、睑板皱纹和多汗症。FDA还批准了B型肉毒杆菌毒素可用于治疗颈肌张力障碍、睑板(面部)皱纹。
已知A型肉毒杆菌毒素可溶于pH为4至6.8的稀水溶液中。在大约7或更高的pH值下，稳定化无毒蛋白质与神经毒素分离，导致毒性逐渐丧失，尤其是当pH值和温度升高时。与酶常见的一样，肉毒杆菌毒素(其是一种细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于其三维形态。稀释至每毫升毫克至纳克毒素的溶液具有相当大的难度，例如，由于毒素附着在表面上而导致可利用的毒素数量减少的趋势。另外，含毒素的药物组合物有时在制备后数月或数年使用，在这种情况下，由于蛋白质的性质，该毒素容易被氧化或分解成小片段。因此，有必要用稳定剂稳定毒素。
常规地，为了解决该问题，在肉毒杆菌毒素蛋白的制药过程中，白蛋白、蔗糖、海藻糖和/或明胶主要用作稳定剂。
例如，如下所述，对于含肉毒杆菌毒素的药物组合物，白蛋白用作稳定剂。
市售的含肉毒杆菌毒素的药物组合物是由Allergan公司(Irvine,CA)以商品名
Figure BDA0003092215340000021
(A型肉毒杆菌毒素，纯化的神经毒素复合物)商品化的。每瓶100单位的
Figure BDA0003092215340000022
由约5ng纯化的A型肉毒毒素复合物、0.5mg人血清白蛋白和0.9mg氯化钠组成，呈真空干燥形式，并准备通过不含防腐剂的无菌生理盐水恢复(注射0.9％氯化钠)。其他市售的含肉毒杆菌毒素的药物组合物可以包括
Figure BDA0003092215340000023
(在肉毒杆菌毒素药物组合物中的具有乳糖和人血清白蛋白的A型肉毒梭菌-血凝素复合物，可从Ipsen Limited,Berkshire,UK商购，其为粉末，在使用前先使用0.9％的氯化钠恢复)和MyoBlocTM(可注射溶液，其包含B型肉毒杆菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠，pH约5.6，可从SolsticeNeurosciences，San Diego，CA商购)。神经毒素组分(150kDa毒素分子)和肉毒杆菌毒素复合物(300kDa至900kDa)可以从例如List Biological Laboratories,Inc(Campbell,CA)；the Centre for Applied Microbiology and Research(Porton Down,UK)；以及Wako(Osaka,Japan)获得，并且还可以从Sigma Chemicals(Saint Louis,MI)获得。
如上所述，主要使用白蛋白的原因是白蛋白不仅可以稳定药物组合物中的蛋白质活性成分，而且当注射到人类患者中时可以具有免疫原性可忽略不计的优点。然而，诸如白蛋白之类的血液制品可能具有通过血液来源的病原体或传染性微生物感染患者的潜在风险，并且特别地，由病毒感染或病毒蛋白传播的诸如克雅氏病之类的疾病的介导可能并非完全消除，并且还可能存在通过迄今未知的病原体感染患者的风险。因此，当将上述白蛋白用作稳定剂时，在制备过程中进行供体或供体部位的选择，并且应当进行感染性物质的去除和/或失活处理以降低感染性材料传播的风险。
另外，有时使用明胶。但是，由于它也是从动物获得的蛋白质，因此类似白蛋白，其可能引起疾病，因此不建议在制药过程中使用。
作为在肉毒杆菌毒素蛋白的制药过程中使用不来源于动物的稳定剂的技术，在韩国注册专利No.10-0799400中公开了一种利用在酵母中产生的重组白蛋白(rSA)的药物制剂的方法。然而，由于在重组白蛋白(rSA)的产生、分离和回收中产生了新的抗原结构(新表位)，所以不能完全消除在药物受体中引起免疫应答的可能性。
另外，在韩国注册专利No.10-0665469中，公开了一种药物组合物，其包含肉毒杆菌毒素，多糖(包括羟乙基淀粉)和作为氨基酸的赖氨酸、甘氨酸、组氨酸或精氨酸。然而，本发明的药物组合物是用于冷冻干燥制剂的组合物，并且其储存条件限于冷冻或冷藏。冷冻干燥的肉毒杆菌毒素需要在使用前立即融化或稀释冷冻制剂的过程，并且在此过程中可能会产生错误。而且，冻干的肉毒杆菌毒素使用不方便，并且存在无法以预填充注射器类型发展的问题。
关于用于稳定肉毒杆菌毒素的组合物，在美国未审查专利申请公开No.2007-0134199中，公开了一种组合物，其包含含有聚山梨酸酯的非离子表面活性剂，以及作为氨基酸的谷氨酰胺和谷氨酸或天冬酰胺和天冬氨酸。当肉毒杆菌毒素在本发明的液体组合物中稀释并在4℃的冷藏条件下储存时，它在8个月内稳定，但是当肉毒杆菌毒素在室温下(例如37℃)储存时，其活性为在一个月内下降，因此在室温下稳定含有肉毒杆菌毒素的药物液体组合物是有限制的。
发明内容
[技术问题]
本发明涉及提供一种稳定的液体组合物，该组合物因为其不是来源于动物源的，因此对人是安全的，并且提高了肉毒杆菌毒素溶液的稳定性以在室温下维持肉毒杆菌毒素的活性，以及具有改善的稳定性的肉毒杆菌毒素溶液。
然而，本发明中要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域普通技术人员将根据以下描述充分理解本文中未描述的其他问题。
[技术方案]
为了达到上述目的，
本发明提供了一种用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，其包含聚山梨酯80和丝氨酸作为活性成分。
在本发明的一实施方案中，在所述组合物中，聚山梨酯80：丝氨酸的组成比为1(mg/mL)：5(mM)以上。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物还包含蛋氨酸。
在本发明的另一实施方案中，在所述组合物中，聚山梨酯80、丝氨酸和蛋氨酸的组成比为1(mg/mL)：5至50(mM)：0.2(mM)。
另外，本发明提供了一种液体制剂中的药物组合物，其包含用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物和作为活性成分的肉毒杆菌毒素。
在本发明的一实施方案中，所述聚山梨酯80的浓度为0.001mg以上/40单位的肉毒杆菌毒素。
在本发明的一实施方案中，丝氨酸的浓度为5mM以上/40单位的肉毒杆菌毒素。
在本发明的一实施方案中，蛋氨酸的浓度为小于0.5mM/40单位的肉毒杆菌毒素。
在本发明的一实施方案中，所述肉毒杆菌毒素选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒杆菌。
优选地，所述肉毒杆菌毒素是不包含复合蛋白的形式或者是包含复合蛋白的复合形式。
另外，本发明提供了一种稳定肉毒杆菌毒素的方法，其包括：将包含聚山梨酯80和丝氨酸的液体组合物与肉毒杆菌毒素混合。
另外，本发明提供了包含聚山梨酯80和丝氨酸的液体组合物用于稳定肉毒杆菌毒素的用途。
另外，本发明提供了聚山梨酯80和丝氨酸在生产用于稳定肉毒杆菌毒素的药物中的用途。
[有益效果]
本发明使用了不是来源于动物源的稳定剂，因此，服用肉毒杆菌毒素药物组合物的患者可以确保安全，免于被血液来源的病原体或传染性微生物感染的潜在风险。另外，由于肉毒杆菌毒素的活性在室温下长时间保持，因此本发明可以确保储存和分配稳定性。另外，由于不需要冷冻干燥工艺，因此本发明在制备中具有改进的便利性。
附图说明
图1是示出根据聚山梨酯80的浓度变化施用肉毒杆菌毒素溶液时死亡率的变化的图。
图2是示出根据丝氨酸的浓度变化施用肉毒杆菌毒素溶液时死亡率变化的图。
图3是示出由于添加了蛋氨酸，根据丝氨酸的浓度变化施用肉毒杆菌毒素溶液时的死亡率变化的图。
具体实施方式
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性示例。然而，提供以下示例仅是为了更容易理解本发明，而不是限制本发明。
本发明涉及用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，其包含聚山梨酯80和丝氨酸作为活性成分；以及液体制剂中的药物组合物，其包含用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物和作为活性成分的肉毒杆菌毒素。
另外，本发明涉及使用聚山梨酯80和丝氨酸来提高肉毒杆菌毒素的稳定性的方法。
作为由蛋氨酸和聚山梨酯20的组合组成的对用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物的替代物，本发明人进行了确保稳定剂安全的实验，因为该实验不使用动物来源的蛋白，并且该稳定剂在室温下甚至储存在冰箱中均具有长期稳定性。结果，证实了丝氨酸和聚山梨酯80的组合具有在室温下长时间保持肉毒杆菌毒素活性的优异效果，从而完成了本发明。
在本发明中，“稳定或稳定性”是指肉毒杆菌毒素的活性被维持，例如，与在实验之前或在特定条件下相比，肉毒杆菌毒素的活性维持为10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，或100％，优选50％以上，最优选100％。例如，与注射肉毒杆菌毒素的受试者的数量相比，将(注射肉毒杆菌毒素的受试者中的死亡受试者的数量/注射肉毒杆菌毒素的受试者的数量)×100获得的值保持为10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，或100％，优选50％以上，最优选100％。肉毒杆菌毒素的活性可以根据本领域已知的各种方法来测量，例如，参照PearceL.B.et al 1994.Measurement of Botulinum Toxin Activity:Evaluation of the Lethality Assay.Toxicology and Applied Pharmacology'128:69-77'中描述的致死性测定方法来测量。根据本发明的实验例，将0.1mL(3或4单位/0.1mL/小鼠)制备的肉毒杆菌毒素液体组合物腹膜内注射到5或10个4周龄的ICR(美国癌症研究所)雌性小鼠中，然后观察72小时以确认死亡率。另外，“稳定或稳定性”的条件可以指在室温下的储存或分配稳定性，但是本发明不限于此。根据具体的实施方案，稳定性或稳定化条件可以是35至45℃/50至80％RH的条件，并且优选地是40℃/70％RH的条件。
根据本发明的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物包含聚山梨酯80和丝氨酸作为活性成分。
另外，根据本发明的液体制剂中的药物组合物包括用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物和作为活性成分的肉毒杆菌毒素。即，液体制剂中的药物组合物包括聚山梨酯80和丝氨酸；和作为活性成分的肉毒杆菌毒素。
在本发明中，“丝氨酸”是由化学式HO2CCH(NH2)CH2OH表示的化合物，并且包括其立体异构体。“丝氨酸”可以通过本领域已知的各种方法获得，该各种方法包括化学合成方法，分离在动物体内合成的丝氨酸的方法或获得市售化合物的方法，例如，丝氨酸可以是通过以下方法制备：从由3-磷酸羟基丙酮酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)形成的3-磷酸甘油酸酯的氧化开始，通过与谷氨酸的氨基转移反应，除去3-磷酸丝氨酸和磷酸基，但本发明不限于此。在本发明中，液体制剂中的药物组合物中包含的丝氨酸浓度可以是每40单位肉毒杆菌毒素5mM或更高，优选每40单位肉毒杆菌毒素5-100mM，更优选地每40单位肉毒杆菌毒素15-100mM，最优选每40单位肉毒杆菌毒素15至50mM。在每40单位肉毒杆菌毒素低于5mM的浓度时，由丝氨酸引起的肉毒杆菌毒素的稳定性在长期存储中可能会低于预定水平，而在每40单位肉毒杆菌毒素大于100mM的浓度下，由丝氨酸过量引起的协同作用可能不再显示，并且可能不经济。
在本发明中，“聚山梨酯80”是由化学式C64H124O26表示的化合物，是非离子表面活性剂并且是可溶的。聚山梨酯80被称为单油酸聚氧乙烯脱水山梨糖醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、emazole 4130、Tween 80或Tween 79，并且用作食品或化妆品添加剂，例如用于增塑剂、胶凝剂、表面活性剂、基质(base)、糖衣制剂、防水剂、抗粘剂、赋形剂、分散剂、崩解剂、湿润剂、稳定剂、软化剂、缓冲剂、溶剂、增溶剂、乳化剂、肠溶包衣剂、包衣剂、漂白剂、悬浮剂或润滑剂。聚山梨酯80可以通过本领域已知的各种方法制备，并且可以自然分离或化学合成。在本发明中，液体制剂中的药物组合物中包含的聚山梨酯80的浓度可以是每40单位肉毒杆菌毒素为0.001mg以上，优选每40单位肉毒杆菌毒素为0.1至5mg，更优选每40单位肉毒杆菌毒素为0.1至2mg，最优选每40单位肉毒杆菌毒素为0.5至2mg。在每40单位肉毒杆菌毒素中少于0.001mg的情况下，在长期存储中聚山梨酯80对肉毒杆菌毒素的稳定作用可表现出低于预定水平，而在每40单位肉毒杆菌毒素中超过5mg的情况下，则由过量的聚山梨酯80引起的协同效果可能不再显示出来，并且可能不经济。
在本发明的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物中，每20单位肉毒杆菌毒素的聚山梨酯80：丝氨酸的组成比可以为1(mg/mL)：5(mM)或更高，优选为1(mg/mL)：5至50(mM)，更优选1(mg/mL)：15至50(mM)。当聚山梨酯80：丝氨酸的组成比为1(mg/mL)：小于5(mM)时，在长期储存中肉毒杆菌毒素的稳定性可以显示为小于预定水平。
在本发明中，“肉毒杆菌毒素”可以随机地选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒杆菌，优选A型肉毒杆菌。肉毒杆菌毒素可以包括以下两种形式：不包含复合蛋白的形式和包含复合蛋白的复合形式。来自A、B、C、D、E、F或G型肉毒梭菌的肉毒杆菌毒素蛋白的分子量约为150KDa，该蛋白不包含天然存在的复合蛋白。然而，当肉毒梭菌产生毒素蛋白时，肉毒杆菌毒素蛋白是通过其与若干血凝素蛋白和非血凝素蛋白形成各种复合物而产生的，所述血凝素蛋白有助于并保护肉毒杆菌毒素蛋白的作用。包含天然存在的复合蛋白的A型肉毒杆菌毒素是分子量为约900kDa、500kDa或300kDa的复合物，B型和C型肉毒杆菌毒素是分子量为约500kDa的复合物，D型肉毒杆菌毒素是具有约300kDa或500kDa的分子量的复合物，而E型和F型肉毒杆菌毒素是具有约300kDa的分子量的复合物。在本发明中，肉毒杆菌毒素的1单位可以定义为LD50，其中由腹膜内注射到体重为18至20g的雌性Swiss Webster小鼠中引起的死亡率为50％。
作为根据本发明的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物的活性成分，除了丝氨酸和聚山梨酯80之外，还可包括蛋氨酸。
在本发明中，液体制剂中的药物组合物中包含的蛋氨酸的浓度可以为每40单位肉毒杆菌毒素小于0.5mM，并且更优选地，每40单位肉毒杆菌毒素0.2至0.4mM，但是本发明不受限于此。
在本发明的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物中，每20单位肉毒杆菌毒素的聚山梨酯80∶丝氨酸：蛋氨酸的组成比可以为1(mg/mL)：2.5至50(mM)：0.2(mM)，优选1(mg/mL)：5至50(mM)：0.2(mM)，更优选1(mg/mL)：7.5至30(mM)：0.2(mM)，并且还更优选1(mg/mL)：7.5至25(mM)：0.2(mM)。当聚山梨酯80：丝氨酸：蛋氨酸的组成比为1(mg/mL)：小于2.5或大于50(mM)：0.2(mM)时，肉毒杆菌毒素的稳定度在长期存储中可表现出低于预定水平。
根据本发明，用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物和/或包括该液体组合物的液体制剂中的药物组合物除了活性成分之外还可以包含药学上可接受的载体。在此，药学上可接受的载体通常用于制备中，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但本发明不受限于此。另外，除了上述成分之外，本发明的液体制剂中用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物和/或药物组合物还可包含润滑剂，润湿剂，甜味剂，调味剂，乳化剂，悬浮剂或防腐剂。
本发明的药物组合物可以通过所期望的方法经口服或胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)施用，并且剂量可以由本领域普通技术人员根据患者的状况和体重、疾病的严重程度、剂型、施用途径和持续时间适当地选择。
根据本发明的组合物以药学上有效的量施用。在本发明中，本文所使用的“药物有效量”是指足以以适用于医疗的合理的受益/风险比来治疗疾病的量，并且有效剂量可以通过包括患者疾病的类型、严重性、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗持续时间和同时使用的药物在内的参数以及医学领域众所周知的其他参数来确定。
本发明的药物组合物可以单独施用或与其他治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂顺序或同时施用，或以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述参数，重要的是以最小的剂量实现最大的效果而没有副作用，并且本领域普通技术人员可以容易地确定这种剂量。共同施用的制剂不受限制，例如，第二组合物可以是基于氨基糖苷的抗生素或干扰肌肉和神经传递的药物(基于图库巴林(tubocuraline-based)的肌肉松弛剂)。
另外，本发明提供了稳定肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括将包含聚山梨酯80和丝氨酸的液体组合物与肉毒杆菌毒素混合。
另外，本发明提供了包含聚山梨酯80和丝氨酸的液体组合物用于稳定肉毒杆菌毒素的用途，以及聚山梨酯80和丝氨酸用于生产用于稳定肉毒杆菌毒素的药物的用途。
另外，本文所使用的“受试者”是指需要施用肉毒杆菌毒素的靶，并且更具体地，包括哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。
本文所使用的“施用”是指通过合适的方法提供包括聚山梨酯80和丝氨酸的液体组合物；以及肉毒杆菌毒素给受试者
通过混合丝氨酸和聚山梨酸酯80来制备根据本发明的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物。
另外，通过以下步骤来制备根据本发明的液体制剂中的药物组合物：通过混合丝氨酸和聚山梨酸酯80来制备用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物；以及将用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物和肉毒杆菌毒素混合。
根据需要，除了上述步骤之外，还可以包括一个或多个步骤，并且顺序无关紧要。例如，用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物可以包括在混合丝氨酸和聚山梨酸酯80的步骤中另外混合蛋氨酸。
<实施例>
1.制备含有肉毒杆菌毒素的液体组合物
通过使用调整至适当浓度的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物稀释肉毒杆菌毒素溶液并最终将肉毒杆菌毒素溶液的浓度调节至适当浓度来制备含有肉毒杆菌毒素的液体组合物。
<实验实施例>
1.选择用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物的测试
为了选择A型肉毒梭菌毒素的稳定剂，使用各种稳定剂进行了选择用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物的组成的实验。
使用具有如下表1所示组成的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，制备浓度为300单位/mL的肉毒杆菌毒素溶液。
像获得专利的Innotox制剂一样，通过将20mM蛋氨酸和2mg/mL聚山梨酯20溶解在10％盐水中来制备对照。另外，通过各自将20mM稳定剂溶解在生理盐水中以及将2mg/mL的聚山梨酯80溶解在10％盐水中来制备实验组(实施例1至7)。
将制备的肉毒杆菌毒素溶液在包括40℃/70％RH的条件下保存在稳定室内，并定期取样。将9mL的可注射液(生理盐水)添加到1mL的肉毒杆菌毒素采样溶液中，将溶液稀释10倍，并将稀释后的样品以3单位/0.1mL(1单位＝LD50)通过腹膜内注射到5只4周龄的ICR(Institute of Cancer Research，美国)的雌性小鼠中。在腹膜内注射后观察72小时的同时，评估了死亡小鼠的数量及其相应的死亡率
结果，如表1所示，除了实施例1和4以及对照之外，证实了稳定性的显著降低。即，仅在实施例1和4以及对照中，肉毒杆菌毒素的活性被长时间维持。
从以上结果可以看出，丝氨酸和聚山梨酯80的组合是可以代替蛋氨酸和聚山梨酯80的组合的一种稳定剂。
[表格1]
Figure BDA0003092215340000111
然而，稳定性实验是在活的小鼠上进行的，并且由于其特性，即使当使用具有相同组成的肉毒杆菌毒素液体组合物进行稳定性实验时，根据小鼠的状况也可能获得不同的结果。
2.根据聚山梨酯80浓度的变化测试肉毒杆菌毒素的稳定性
作为用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物的组成，选择丝氨酸和聚山梨酯80的组合，并且执行对应于聚山梨酯80的浓度变化的肉毒杆菌毒素稳定性的实验。
使用具有如下表2所述的组成的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，制备具有40单位/mL的浓度的肉毒杆菌毒素溶液。通过将5mM丝氨酸和0.001至2mg/mL的聚山梨酯80溶解在10％的生理盐水中来制备实验组。如实验实施例1所述进行特定的实验方法。但是，该方法使用了10只小鼠，腹膜内注射的浓度为4单位/0.1mL。
表2和图1示出了根据聚山梨酯80的浓度变化进行的肉毒杆菌毒素稳定性的实验的结果。当聚山梨酯80的浓度为0.1mg/mL或更大时，在各浓度下显示出一定程度以上的稳定性。当聚山梨酯80的浓度为0.1mg/mL，0.5mg/mL和2mg/mL时，直到第6周的死亡率为50％以上，并且当聚山梨酯80的浓度为0.5mg/mL或2mg/mL时，直到第10周死亡率为10％。
[表2]
Figure BDA0003092215340000121
3.根据丝氨酸浓度的变化测试肉毒杆菌毒素的稳定性
通过选择丝氨酸和聚山梨酯80的组合作为用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物的组成，执行对应于丝氨酸浓度变化的肉毒杆菌毒素稳定性的实验。
使用具有如下表3所述的组成的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，制备肉毒杆菌毒素溶液，其浓度为40单位/mL。通过将20mM的蛋氨酸和2mg/mL的聚山梨酯20溶解在10％的盐水中来制备对照，就像获得专利的Innotox制剂一样。通过将0.1mg/mL的聚山梨酯80和5至50mM的丝氨酸溶解在10％的生理盐水中来制备实验组。如实验实施例1所述进行特定的实验方法。但是，该方法使用了10只小鼠，腹膜内注射的浓度为4单位/0.1mL。
表3和图2示出了对应于丝氨酸浓度变化的肉毒杆菌毒素稳定性的实验的结果。当丝氨酸浓度为5mM、15mM或50mM时，直到第6周的死亡率为50％或更高，这表明肉毒杆菌毒素的活性得以维持。特别是，当丝氨酸浓度为50mM时，直到第12周的死亡率为50％或更高，这表明与20mM蛋氨酸和2mg/ml的聚山梨酯20的组合相比，肉毒杆菌毒素的稳定性可以长期保持。
[表3]
Figure BDA0003092215340000131
4.根据蛋氨酸的添加来测试肉毒杆菌毒素的稳定性
通过选择丝氨酸和聚山梨酯80的组合作为用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物的组成，执行对应于蛋氨酸的添加的肉毒杆菌毒素的稳定性的实验。
使用具有如下表4所述的组成的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，制备肉毒杆菌毒素溶液，其浓度为40单位/mL。通过将20mM的蛋氨酸和2mg/mL的聚山梨酯20溶解在10％的盐水中来制备对照，就像获得专利的Innotox制剂一样。通过将2mg/mL的聚山梨酯80、5至50mM的丝氨酸和0.4mM的蛋氨酸溶解在10％的生理盐水中来制备实验组。如实验实施例1所述进行特定的实验方法。但是，该方法使用了10只小鼠，腹膜内注射的浓度为4单位/0.1mL。
[表4]
Figure BDA0003092215340000141
结果，如表4和图3所示，可以看出，与对照相比，在所有制剂中通过蛋氨酸、丝氨酸和聚山梨酯80的组合改善了肉毒杆菌毒素溶液的稳定性。
本领域普通技术人员应该理解，本发明的以上描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或基本特征的情况下，本文公开的示例性实施方案可以容易地修改为其他特定形式。因此，上述示例性实施方案应被解释为说明性的，并且在任何方面均不受限制。
[工业适用性]
预期根据本发明的聚山梨酯80和丝氨酸可有效地使用在用于改善液体肉毒杆菌毒素的稳定性和施用简易性的组合物中。

Claims (12)

1.一种用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物，其包含聚山梨酯80和丝氨酸作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，聚山梨酯80：丝氨酸的组成比为1(mg/mL)：5(mM)以上。
3.根据权利要求1所述的组合物，其还包含蛋氨酸。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，聚山梨酯80：丝氨酸：蛋氨酸的组成比为1(mg/mL)：5至50(mM)：0.2(mM)。
5.一种液体制剂中的药物组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的用于稳定肉毒杆菌毒素的液体组合物；和作为活性成分的肉毒杆菌毒素。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述聚山梨酯80的浓度为0.001mg以上/40单位的所述肉毒杆菌毒素。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，丝氨酸的浓度为5mM以上/40单位的所述肉毒杆菌毒素。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，蛋氨酸的浓度为小于0.5mM/40单位的所述肉毒杆菌毒素。
9.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述肉毒杆菌毒素选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒杆菌。
10.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素是不包含复合蛋白的形式或包含复合蛋白的复合形式。
11.一种用于稳定肉毒杆菌毒素的方法，其包括：
将包含聚山梨酯80和丝氨酸的液体组合物与肉毒杆菌毒素混合。
12.包含聚山梨酯80和丝氨酸的液体组合物用于稳定肉毒杆菌毒素的用途。
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