KR20220046507A - 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에 관한 것으로, 상세하게는 a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계; b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 최종 건조하는 단계;를 포함하는 보툴리눔 독소의 건조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래 동결 건조에 의해 보툴리눔 독소를 진공 건조하는 방법에 비해 수율, 안정성 및 제조효율이 향상된다는 이점이 있다.
Description
본 발명은 보툴리눔 독소 제제의 제조공정 중 건조 공정에 관한 것으로, 상세하게는 종래 동결 건조가 아닌 진공 건조를 통해 보툴리눔 독소를 건조하며, 종래 방법에 비하여 수율, 안정성 및 제조효율이 향상된 진공 건조 방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 균 및 관련 종에 의해 생성되는 신경 독성 단백질로서, 신경근 접합부의 축삭돌기 말단으로부터 분비되는 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 방출을 막는 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 보톨리눔 독소는 A형부터 H형까지 혈청학적으로 관련된 8종의 천연 보툴리눔 독소가 존재하고, 종류에 따라 인체에 미치는 영향을 달리하나 전체적으로 인체에 치명적인 영향을 가지는 것으로 알려져 있다. 보툴리눔 독소 H형의 경우, 20억 분의 1 그램만이 인체에 주입되는 경우 죽음에 이를 수도 있으며, 보툴리눔 독소 A형, B형은 질병을 유발시킬 수 있다. 보툴리눔 독소 A형의 경우, 1978년 이후 안전성과 효능이 입증되면서 사시 교정에 이용되었고, 1987년 안검경련 환자의 치료를 위해 독소를 주사한 후 미간부위의 주름이 없어지는 것을 발견하여 미용목적의 사용가능성으로써 관심이 생겼다. 일반적으로 보툴리눔 독소 A형 및 B형은 의약품화하여 주사제로 근육 내에 주사하여 근육 경련 및 근육 과활동으로 생기는 질병들을 치료하기 위해 사용되며, 주입량에 따라 인체에 미치는 영향을 고려하여, 보툴리눔 독소의 사용을 위한 가이드라인, 보툴리눔 독소의 허가를 위한 가이드라인을 마련해두고 있다.
현재, 보툴리눔 독소의 약제화 과정에서 단백질의 불안정성, 활성성분의 손실 등의 문제가 있어 안정화제 등의 별도의 성분을 요구하고 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1087017호의 경우 폴리솔베이트 20, 메티오닌 및/또는 이소루신을 통해 액상 조성물을 제조하는 방법이 개시되어 있다.
시판용 보툴리눔 독소 제제는 보툴리눔 독소 제제의 분해를 방지하고, 보툴리눔 독소 제제의 취급을 보다 용이하게 하며 수송 비용의 절감 등을 위해 동결 건조되거나 진공 건조한 후 분말 형태로 유통되고, 사용 전에 물 또는 염수 용액 등의 액체 캐리어를 사용하여 재구성 될 수 있다.
다만, 종래 일반적으로 사용되는 건조 기술인 동결 건조의 경우 보툴리눔 독소의 불안정성으로 인해 손실되고, 동결 건조에 소요되는 시간이 길다는 단점이 있다. 이에, 본 발명자들은 보툴리눔 독소의 건조 방법을 개선하기 위해 노력한 결과, 특정 단계로 이루어진 본 발명에 따른 진공 건조를 적용함으로써, 활성물질의 손실이 적으며 소요시간이 상당히 단축되면서도 제품의 성상이 우수한 진공 건조 방법을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 종래 동결 건조에 의해 보툴리눔 독소를 건조하는 방법에 의해 보툴리눔 독소를 제조하는 경우, 장시간에 걸쳐 건조된다는 제조효율 측면의 문제점, 보툴리눔 독소의 건조 후의 수율 문제점 등을 해결하고자, 진공 건조를 통해 수율, 안정성, 제조효율 및 제품성이 현저히 향상된 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 문제를 해결하기 위하여, a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계; b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 3차 건조하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 5 ℃ 이상의 초기온도에서, 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온하며 1차 건조하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)에서, 압력 상한값이 1.7 mmHg일 수 있다. 또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)에서, 압력 상한값이 0.8 mmHg일 수 있다. 또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.4 mmHg일 수 있다. 보다 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.2 mmHg일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상계 단계 a), b) 및 c)에서 건조 시간은 각각 30분 내지 120분일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 6시간 이하일 수 있고, 보다 구체적으로 총 건조 시간이 5시간 이하, 총 건조 시간이 4시간 이하일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 80% 이상일 수 있고, 보다 구체적으로 역가 회수율이 85% 이상, 90% 이상일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E, F, G 및 보툴리눔 혈청형(serotype)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 i) 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제 및 용해보조제로 구성된 군; ii) 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 아세트산나트륨, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 수용액으로 구성된 군; 및 iii) 알부민, 젤라틴, 당 및 당 알코올 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에 관한 것으로, 진공 건조를 통해 제조함으로써 영하로 온도를 조절할 필요가 없으며, 종래기술과 비교하여 단시간에 건조가 가능하며, 역가 회수율이 높아 전체적인 수율의 향상이 있다는 이점이 있다. 또한, 본 발명 건조 방법을 포함하여 제조된 보툴리눔 독소 제제는 얇고 단단하여 내충격성이 강하고 제품의 성상이 우수하다는 이점이 있다.
도 1은 보툴리눔 독소의 건조 방법에 따른 역가 회수율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 보툴리눔 독소의 진공 건조를 통해 제조된 완제품의 제형을 나타낸 도이다.
도 3은 보툴리눔 독소의 동결 건조를 통해 제조된 완제품의 제형을 나타낸 도이다.
도 2는 보툴리눔 독소의 진공 건조를 통해 제조된 완제품의 제형을 나타낸 도이다.
도 3은 보툴리눔 독소의 동결 건조를 통해 제조된 완제품의 제형을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계; b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 최종 건조하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서 “상한 값”, “하한 값” “X 내지 Y” 등의 수치는 해당 수치 값을 제외하는 것이 아니라 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 보툴리눔 독소는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 균 및 관련 종에 의해 생성되는 신경 독성 폴리펩타이드로서, 클로스트리디움 속 균에 원천적으로 생성된 물질 뿐만 아니라 변형, 재조합 등에 의하여 생성된 물질을 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서 보툴리눔 독소는 특별히 정의를 내리지 않는 한 통상의 기술자가 인식가능한 물질 모두를 포함하는 것으로, 이에 제한되는 것은 아니나 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E 등을 포함한다. 보툴리눔 독소는 임의의 공지된 방법에 의해 수득되거나 상업적으로 수득한 것일 수 있으며, 수득방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E, F, G 및 보툴리눔 혈청형(serotype)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 i) 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제 및 용해보조제로 구성된 군; ii) 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 아세트산나트륨, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 수용액으로 구성된 군; 및 iii) 알부민, 젤라틴, 당 및 당 알코올 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 첨가제로서 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제, 용해보조제, 용제, 가용화제, 분산제, 붕해제, 가소제, 활택제, 무통화제, 희석제, 차폐제 등을 포함할 수 있다. 첨가제는 제제에 함유된 약리학적 유효성분 이외의 물질로, 의약 조성물의 안정성 및 생체이용률 향상 등 유용성을 높이기 위한 첨가제, 의약 조성물의 보존 또는 사용 등의 제제 품질 유지를 위한 첨가제, 의약 조성물의 물리적인 성상을 조절하기 위한 첨가제 등의 약리활성 이외의 부가적인 목적을 위해 사용되며, 첨가제는 통상적으로 약리작용에 직접적인 영향을 미치지 않는 범위에서 사용할 수 있다.
예를 들면, 안정성을 증가시키기 위하여 부형제를 포함할 수 있고, 부형제로써 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 인산칼슘, 덱스트린 등을 포함할 수 있다.
또한, 액상으로서 물질의 용해도를 증가시키기 위한 용해보조제를 포함할 수 있고, 용해보조제로써 살리실산나트륨, 요소, 모노에틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜, 디메틸 아세트아미드, 헥사민, 우레탄, 아세트산나트륨 등을 포함할 수 있다.
또한, 산, 수분, 관 등에 의하여 분해되는 것을 방지하기 위해 안정화제를 포함할 수 있고, 안정화제로써, 질소가스, 이산화탄소, 당, 당 알코올, 인간혈청알부민, 약산 및 이의 염, 약염기 및 이의 염, 단백질 등을 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 단계의 온도가 상한값 이하인 경우, 보툴리눔 독소의 활성 성분을 파괴하지 않으면서 안정적인 제제를 형성할 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 5 ℃ 이상의 초기온도에서, 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온하며 1차 건조하는 것일 수 있다. 여기에서 초기온도는 상기 범위에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 a)는 승온과 함께 압력 조건을 변화시켜 최대 14단계로 분류될 수 있다. 각 단계에서 온도, 압력 뿐 아니라 유지시간을 달리하여 1차 건조를 할 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 최대 14 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 시간 0.1 내지 40분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것일 수 있다. 보다 더 구체적으로, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시켜가며 6 내지 14단계, 7 내지 14단계, 8 내지 14단계, 9 내지 14단계, 10 내지 14단계로 진행될 수 있다. 각 단계에서, 설정 온도는 순차적으로 상승할 수 있다. 다만, 압력 및 시간은 반드시 순차적으로 상승하거나 하락하는 것은 아니다.
본 발명에서 1차 건조는 최대 14 단계로 진행되어 각 단계에서 온도, 압력 및 시간을 조절함으로써, 보툴리눔 독소의 활성 성분을 최대한 파괴하지 않을 수 있다. 1차 건조 시 4단계 이하로 압력 및 온도를 일정하게 하는 경우, 보툴리눔 독소 최종원액에서 내외부가 상이한 상태를 형성하여, 보툴리눔 독소의 활성 성분이 비교적으로 낮아진다.
구체적인 예를 들면, 상기 단계 a)가 10단계로 진행되는 경우, 1단계에서 10단계는 순차적으로 진행되며, 1단계는 초기 설정온도 5 ℃, 0.1~1 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~2 mmHg, 5분의 조건으로 건조할 수 있고, 2단계는 설정온도 10 ℃, 0.5 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.5 mmHg, 5분의 조건으로 건조할 수 있으며, 3단계는 설정온도 5 ℃, 0.5 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.0 mmHg, 10분의 조건으로 건조할 수 있고, 4단계는 설정온도 5 ℃, 0.75 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.0 mmHg, 20분의 조건으로 건조할 수 있다. 또한, 5단계는 설정온도 15 ℃, 0.75 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.0 mmHg, 10분의 조건으로 건조할 수 있고, 6단계, 7단계, 8단계, 9단계 및 10 단계는 5단계와 비교하여 각 조건(온도, 승온속도 및 압력)이 동일하거나 그 이하 값으로 수행될 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 10 내지 14 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 1 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 시간 0.1 내지 30분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 10 내지 14 단계로 진행되며, 각 단계는 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 0.8 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 시간 0.1 내지 30분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 단계 a)는 10 내지 14단계로 진행되며, 1 내지 4단계 온도 5 내지 10 ℃에서 0.1 내지 1 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되며, 나머지 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 1 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 1.7 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것 일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 단계 a)는 10 내지 14단계로 진행되며, 1 내지 3단계는 온도 5 내지 20 ℃에서 0.1 내지 0.5 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되며, 4 내지 7단계는 온도 5 내지 20 ℃에서 0.1 내지 0.5 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 1 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되고, 8 내지 14단계는 온도 5 내지 20 ℃에서 0.1 내지 0.8 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 0.5 mmHg 및 5 내지 20분 범위 1차 건조하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 2 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃, 압력 0.01 내지 1 mmHg 및 시간 0.1 내지 80분 범위에서 2차 건조하는 것일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 2 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 20 내지 30 ℃, 압력 0.05 내지 1 mmHg의 압력 및 시간 20 내지 50분 범위에서 2차 건조하는 것일 수 있다.
본 발명에서 2차 건조는 2단계로 진행되어, 1차 건조에 따른 효과와 동일한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a), b), c)에서 각 단계의 압력 하한 값은 0.01 내지 0.5 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 각 단계의 압력 하한 값은 0.01, 0.05, 0.09, 0.13, 0.17, 0.20, 0.25, 0.30 mmHg일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)에서, 압력 상한값이 1.7 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 예에서, 상기 단계 a)의 압력 상한 값은 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.05, 1.0 mmHg일 수 있다.
또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)에서, 압력 상한 값은 0.6 내지 2.0 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)의 압력 상한 값은 2.0, 1.5, 1.0, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6 mmHg일 수 있다.
또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.4 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 예에서, 상기 단계 c)의 압력 상한 값은 0.48, 0.45, 0.42, 0.40, 0.38, 0.35, 0.32, 0.30, 0.28, 0.25, 0.22, 0.20, 0.10 mmHg일 수 있다.
본 발명에서, 각 단계에서 상기 압력 범위 내에서 진공 건조를 수행하는 경우, 보툴리눔 독소의 순도를 저하시키지 않아, 보다 높은 순도의 보툴리눔 독소를 제공할 수 있다. 보툴리눔 독소는 인체에 투여되는 시술 등의 방법으로 투여되는 경우, 일반적으로 약 3개월 동안 유지되어 반복적 투여가 필요하며 그에 따라 체내 항체 형성에 따른 내성 문제, 고용량 투여에 따른 안정성 문제가 발생할 수 있으나, 본 발명에 따른 진공 건조 방법에 의한 경우, 상기 압력 범위로 진공 건조함으로써 높은 순도를 달성하여, 저용량으로도 유효한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서, 상기 압력 범위에서 진공 건조를 수행하는 경우, 보툴리눔 독소 제제 제조시 성상이 얇고 단단한 형태로 나타나 내충격성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a), b) 및 c)에서 건조 시간은 각각 30분 내지 120분일 수 있다.
보다 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)의 건조 시간은 50 내지 80분일 수 있다.
보다 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)의 건조 시간은 40 내지 100분일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 6시간 이하일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 예에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 5시간, 4.8 시간, 4.5시간, 4.2시간, 4시간 이하일 수 있다.
본 발명에서, 구체적인 건조 시간은 상기 온도 및 압력 범위에서 보툴리눔 독소의 손실 최소화, 안정적인 제제 형성, 제조효율을 고려하여 조절될 수 있다. 또한, 본 발명은 종래 보툴리눔 독소의 동결 건조 방법에 따른 건조 시간인 최소 18시간과 비교하여, 매우 단축되어 제조효율 측면에서 우수한 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에서 총 건조시간은 단계 a)의 1차 건조, 단계 b)의 2차 건조 및 단계 c)의 최종 건조 시간을 포함한 건조에 소요되는 시간 전체를 의미하며, 보툴리눔 독소 제제의 제조 전체에 걸리는 시간을 의미하는 것은 아니다. 본 발명에서 진공 건조 방식을 이용함으로써, 총 건조시간이 단축되어 보툴리눔 독소 제제의 제조효율 상승을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 건조 방법은 역가 회수율이 80% 이상일 수 있다. 구체적인 역가 회수율은 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88%이상, 89% 이상, 90%이상일 수 있다. 본 발명에서 역가 회수율은 최종원액과 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 산출하고 최종원액의 역가를 100%로 보고 최종원액 대비 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 비교하여 회수율로 표현된다.
- 동결건조 완제품 역가 회수율(%) = 동결건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
- 진공건조 완제품 역가 회수율(%) = 진공건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
본 발명은 역가 회수율이 높아 보툴리눔 독소 제제의 제조시 보툴리눔 독소 단백질의 손실이 적어 저용량 투여하더라도 보툴리눔 독소 활성 성분의 치료적 또는 미용적 효과가 유효하게 나타날 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 보툴리눔 독소 최종원액
보툴리눔 독소 최종원액은 클로스트리디움 보툴리눔 독소 A형(Clostridium botulinum Toxin Type A), 및 부형제로 염화나트륨(Sodium Chloride), 안정화제로 사람혈청알부민(Human Serum Albumin)을 사용하였다. 구체적인 조성은 표 1에 나타난 바와 같다. 최종원액은 500 ml로 조제하였고, 손실량을 감안하여 최종원액 조제 목표는 100~120 units / 0.1 mL로 하였다.
| 원료명 | 바이알 당 기준량 | 사용량 (500 ml 기준) |
| 보툴리눔 독소 원액 | 100 units | 100~120 units / 0.1 mL |
| Sodium Chloride | 0.9 mg | 4.5 g |
| Human Serum Albumin | 0.5 mg | 2.5 g |
<실시예 2> 보툴리눔 독소 진공 건조 방법
<실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액 진공 건조를 통해 완제품을 제조하였다. <실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액을 바이알에 충전 및 고무마개로 반타전하고, 보툴리눔 독소 최종원액이 충전된 바이알을 동결 건조기에 적재하였다.
그 후, 건조를 위하여 건조준비단계, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조를 진행하였으며, 각 단계에서 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다. 각 단계의 온도 및 압력의 범위는 하기와 같다.
건조 준비는 동결 건조기 선반온도를 5 ~ 30 ℃의 범위에서 0 ~ 10분 이상 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 온도 5 ~ 30 ℃, 챔버 내 최소압력을 0.01 ~ 2 mmHg의 범위에서, 건조를 시작하였다.
1차 건조는 최대 14단계로 나누어 진행하였으며, 챔버 내 압력 0.01 ~ 2 mmHg, 선반온도 5 ~ 30 ℃(상승속도: 최소 0.1 ~ 0.5 ℃/분)의 범위에서, 각 단계별 0 ~ 40분간 유지하면서 건조하였다.
2차 건조는 최소 2단계로 나누어 진행하였으며, 챔버 내 압력 0.01 ~ 1 mmHg, 선반온도 5 ~ 20 ℃의 범위에서, 각 단계별 0 ~ 80분간 유지하면서 건조하였다.
최종 3차 건조는 1단계로 진행하였으며, 챔버 내 압력 0.01 ~ 0.5 mmHg, 선반온도 5 ~ 30 ℃의 범위에서, 최소 30분 이상 건조하여, 최종 건조하였다.
건조 완료 후, N2 가스를 이용하여 -0.3 ~ -0.7 bar를 유지하여 고무마개 타전 후 진공해제하고 동결 건조기 선반에서 건조 완료된 바이알을 배출하여 알루미늄 캡실링을 통해 밀봉한 후, 냉장조건에서 보관하였다. <실시예 2>에 따라 제조된 완제품의 형태는 도 2에 나타난 바와 같다.
<실시예 2-1> 보툴리눔 독소 진공 건조 (1)
<실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액 진공 건조를 통해 완제품을 제조하였다. <실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액을 바이알에 충전 및 고무마개로 반타전하였다. 보툴리눔 독소 최종원액이 충전된 바이알을 동결 건조기에 적재한 후, 건조를 위하여, 동결 건조기 선반온도를 5 ~ 10 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 5 ~ 10 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 0.1 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 10단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 2의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 10 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 15 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.7 mmHg | 15 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 0.7 mmHg | 10 분 |
| 5 | 15 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 10 분 |
| 6 | 15 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 5 분 |
| 7 | 15 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 5 분 |
| 8 | 15 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 5 분 |
| 9 | 15 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
| 10 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 10 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 20 ℃로 설정하여, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.3 mmHg, 선반온도 20 ℃로 설정하여, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 설정하여 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
건조 완료 후, N2 가스를 이용하여 -0.3 ~ -0.7 bar를 유지하여 고무마개 타전 후 진공해제하고 동결 건조기 선반에서 건조 완료된 바이알을 배출하여 알루미늄 캡실링을 통해 밀봉한 후, 냉장조건에서 보관하였다.
<실시예 2-2> 보툴리눔 독소 진공 건조 (2)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 13단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 3의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 5 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.5 mmHg | 15 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.8 mmHg | 10 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 1 mmHg | 5 분 |
| 5 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 5 분 |
| 6 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.7 mmHg | 10 분 |
| 7 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
| 8 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 10 분 |
| 9 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 15 분 |
| 10 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 5 분 |
| 11 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 5 분 |
| 12 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
| 13 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 10 ℃로 설정하여, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.35 mmHg, 선반온도 10 ℃로 설정하여, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 25 ℃로 설정하여 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-3> 보툴리눔 독소 진공 건조 (3)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 14단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 4의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 5 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 10 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1 mmHg | 10 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 10 분 |
| 5 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 5 분 |
| 6 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.9 mmHg | 5 분 |
| 7 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 1 mmHg | 5 분 |
| 8 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
| 9 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 10 분 |
| 10 | 25 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 5 분 |
| 11 | 25 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 5 분 |
| 12 | 25 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 5 분 |
| 13 | 25 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 10 분 |
| 14 | 25 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 10 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.35 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-4> 보툴리눔 독소 진공 건조 (4)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 10단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 5의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 5 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 5 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.6 mmHg | 10 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.7 mmHg | 20 분 |
| 5 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 10 분 |
| 6 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.9 mmHg | 10 분 |
| 7 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 1 mmHg | 10 분 |
| 8 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 15 분 |
| 9 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 15 분 |
| 10 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 5 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-5> 보툴리눔 독소 진공 건조 (5)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 11단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 6의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.6 mmHg | 5 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.6 mmHg | 5 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.4 mmHg | 10 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1.2 mmHg | 10 분 |
| 5 | 15 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1.2 mmHg | 5 분 |
| 6 | 15 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1.0 mmHg | 5 분 |
| 7 | 15 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1.0 mmHg | 10 분 |
| 8 | 15 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 15 분 |
| 9 | 15 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 5 분 |
| 10 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 15 분 |
| 11 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 20 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.3 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-6> 보툴리눔 독소 진공 건조 (6)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 14 단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 7의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1.6 mmHg | 5 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1.0 mmHg | 5 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 10 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 20 분 |
| 5 | 10 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 1 mmHg | 5 분 |
| 6 | 10 ℃ | 0.4 ℃/ 분 | 0.9 mmHg | 5 분 |
| 7 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 5 분 |
| 8 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 10 분 |
| 9 | 15 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 5 분 |
| 10 | 15 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 5 분 |
| 11 | 15 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
| 12 | 15 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 10 분 |
| 13 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 5 분 |
| 14 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 10 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.35 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-7> 보툴리눔 독소 진공 건조 (7)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 10단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 8의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 1.6 mmHg | 5 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.5 mmHg | 5 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1 mmHg | 10 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.9 mmHg | 15 분 |
| 5 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 5 분 |
| 6 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.7 mmHg | 10 분 |
| 7 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.6 mmHg | 10 분 |
| 8 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 10 분 |
| 9 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 15 분 |
| 10 | 15 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 20 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 25 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-8> 보툴리눔 독소 진공 건조 (8)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 12단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 9의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.6 mmHg | 5 분 |
| 2 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.5 mmHg | 5 분 |
| 3 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.0 mmHg | 10 분 |
| 4 | 5 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 1.0 mmHg | 5 분 |
| 5 | 10 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.9 mmHg | 5 분 |
| 6 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 10 분 |
| 7 | 10 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 10 분 |
| 8 | 15 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.5 mmHg | 5 분 |
| 9 | 15 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 5 분 |
| 10 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
| 11 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 10 분 |
| 12 | 20 ℃ | 0.3 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 15 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 25 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-9> 보툴리눔 독소 진공 건조 (9)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 14단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 10의 조건에 따라 1차 건조하였다.
| 단계 | 온도 | 온도상승속도 | 압력 | 시간 |
| 1 | 10 ℃ | 0.1 ℃/ 분 | 1.0 | 5 분 |
| 2 | 20 ℃ | 0.2 ℃/ 분 | 0.9 mmHg | 5 분 |
| 3 | 20 ℃ | 0.2 ℃/ 분 | 0.8 mmHg | 10 분 |
| 4 | 20 ℃ | 0.2 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 5 분 |
| 5 | 20 ℃ | 0.2 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 5 분 |
| 6 | 20 ℃ | 0.2 ℃/ 분 | 0.3 mmHg | 10 분 |
| 7 | 20 ℃ | 0.2 ℃/ 분 | 0.4 mmHg | 10 분 |
| 8 | 20 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 5 분 |
| 9 | 20 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.15 mmHg | 5 분 |
| 10 | 20 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 10 분 |
| 11 | 25 ℃ | 0.5 ℃/ 분 | 0.1 mmHg | 10 분 |
| 12 | 25 ℃ | 0.6 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 10 분 |
| 13 | 25 ℃ | 0.7 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 10 분 |
| 14 | 25 ℃ | 0.8 ℃/ 분 | 0.2 mmHg | 10 분 |
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.2 mmHg, 선반온도 25 ℃로, 30분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.2 mmHg, 선반온도 25 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.05 mmHg, 선반온도 25 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<비교예 1> 보툴리눔 독소 동결 건조 방법
<실시예 1>의 보툴리눔 최종 원액을 동결 건조를 통해 완제품을 제조하였다. <실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액을 바이알에 충전 및 고무마개로 반타전하였다. 동결 건조기의 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고, 보툴리눔 독소 최종원액이 충전된 바이알을 동결 건조기에 적재한 후, 동결 건조기 선반온도를 약 -45 ℃로 설정하고 약 30분간 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 약 -45 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 약 0.1 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 챔버 내 압력 약 10 mmHg, 선반온도 약 -45 ℃(상승속도: 1℃/4분)으로 설정하여 약 60분간 유지하면서 건조하였다. 2차 건조는 챔버 내 압력 약 10 mmHg, 선반온도 약 -10 ℃(상승속도: 1℃/4분)로 약 30분간 유지하면서 건조하였다. 그 후, 챔버 내 압력 약 10 mmHg, 선반온도 약 30 ℃(상승속도: 최소 1℃/4분)로 최소 10시간 건조하여 건조를 완료하였다.
건조 완료 후, 고무마개 타전 후 진공해제하고 동결 건조기 선반에서 건조완료된 바이알을 배출하여 알루미늄 캡실링을 통해 밀봉한 후, 냉장조건에서 보관하였다. 제조된 완제품의 형태는 도 3에 나타난 바와 같다.
<실험예 1> 동물 역가 시험
<1-1> 측정 방법
역가의 회수율 측정법은 최종원액과 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 산출하고 최종원액의 역가를 100%로 보고 최종원액 대비 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 비교하여 회수율을 %로 나타냈다. 동결건조 완제품 역가의 경우, 최종원액 역가(평균값) 대비 동결건조 완제품 역가(평균값) 회수율은 약 72%이고, 최종원액 역가(평균값) 대비 진공건조 완제품 역가(평균값) 회수율은 93%에 해당함을 확인하였다.
- 동결건조 완제품 역가 회수율(%) = 동결건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
- 진공건조 완제품 역가 회수율(%) = 진공건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
<1-2> 시험 결과
<실시예 1>의 최종원액, <실시예 2>의 진공 건조 완제품, 및 <비교예 1>의 동결 건조 완제품에 대하여 동물 역가 시험을 3회 실시한 결과는 표 11에 나타난 바와 같다.
| 구분 | 동물 역가 시험 결과 | |||||
| 1회차 | 2회차 | 3회차 | 평균 | |||
| 최종원액 (units/0.1 ml) |
시험자 A | 123 | 129 | 132 | 128 | 122 |
| 시험자 B | 113 | 115 | 119 | 116 | ||
| 진공 건조 완제품 (units/vial) |
시험자 A | 110 | 115 | 123 | 116 | 114 |
| 시험자 B | 108 | 110 | 115 | 111 | ||
| 동결 건조 완제품 (units/vial) |
시험자 A | 88 | 92 | 94 | 91 | 88 |
| 시험자 B | 83 | 83 | 87 | 85 | ||
표 11에 나타난 바와 같이, 최종원액의 동물 역가 시험 결과값이 최소 113 units/0.1 ml, 최대 132 units/0.1 ml, 평균 122 units/0.1 ml로 조제 편차 및 시험 편차를 감안하였을 때, 조제목표 100 units/0.1 mL ± 10%(100~120 units / 0.1 mL)로서 제조 과정에는 이상이 없음을 확인하였다.
동결 건조 완제품의 동물 역가 시험 결과는 최소 83 units/vial, 최대 94 units/vial, 평균 86 units/vial로 최종원액의 역가 대비 회수율은 72%에 불과하였다. 진공 건조 완제품의 동물 역가 시험 결과는 최소 108 units/vial, 최대 123 units/vial, 평균 114 units/vial로 최종원액의 역가 대비 회수율은 93%에 해당함을 확인하였다.
따라서, 진공 건조에 의해 제조된 완제품의 역가 회수율은 동결 건조에 의해 제조된 완제품과 비교하여 약 21% 높은 것을 확인하여 보툴리눔 독소 단백질의 손실(Loss)이 적은 것을 확인하였다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 완제품의 성상이 얇고 단단하여 내충격성이 강화되어 안정성이 높다. 또한, 동결 건조와 비교하여 진공 건조의 경우 소요시간이 매우 짧아 효율적인 측면에서도 유리하다.
Claims (15)
- a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 3차 건조하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 a)는 5 ℃ 이상의 초기온도에서, 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온하며 1차 건조하는 것인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 a)에서, 압력 상한값이 1.7 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 b)에서, 압력 상한값이 0.8 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.4 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.2 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 a), b) 및 c)에서 건조 시간은 각각 30분 내지 120분인 것인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
-
제1항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 6시간 이하인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 5시간 이하인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 4시간 이하인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 80% 이상인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 85% 이상인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 90% 이상인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 a)의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E, F, G 및 보툴리눔 혈청형(serotype)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 a)의 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 i) 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제 및 용해보조제로 구성된 군; ii) 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 아세트산나트륨, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 수용액으로 구성된 군; 및 iii) 알부민, 젤라틴, 당 및 당 알코올 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
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