WO2022075785A1 - 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법 - Google Patents

보툴리눔 독소의 진공 건조 방법 Download PDF

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WO2022075785A1
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botulinum toxin
drying
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temperature
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김학군
안진희
권슬기
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주식회사 프로톡스
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a drying process during the manufacturing process of a botulinum toxin preparation, and more particularly, to a vacuum drying method in which botulinum toxin is dried through vacuum drying rather than freeze-drying, and the yield, stability and manufacturing efficiency are improved compared to the conventional method. it's about
  • Botulinum toxin (Botulinum Toxin) is a neurotoxic protein produced by Clostridium botulinum and related species, and has an effect of blocking the release of acetylcholine, a neurotransmitter secreted from the axon terminal of a neuromuscular junction it is known
  • botulinum toxin is known to have a fatal effect on the human body as a whole, although there are 8 types of serologically related natural botulinum toxin from type A to type H, and the effects on the human body vary depending on the type.
  • botulinum toxin type H if only 1/2 billion of a gram is injected into the body, it can cause death, and botulinum toxin types A and B can cause disease.
  • botulinum toxin type A it has been used for strabismus correction since 1978 as safety and efficacy have been proven. I was interested as a possibility.
  • botulinum toxin types A and B are pharmaceuticals and injected intramuscularly to treat muscle spasms and diseases caused by muscle overactivity. Guidelines for the approval of botulinum toxin have been prepared.
  • Korean Patent Registration No. 10-1087017 discloses a method for preparing a liquid composition using polysorbate 20, methionine and/or isoleucine.
  • botulinum toxin preparations are distributed in powder form after freeze-drying or vacuum drying to prevent decomposition of botulinum toxin preparations, facilitate handling of botulinum toxin preparations, and reduce transportation costs, etc. can be reconstituted using a liquid carrier of
  • the present invention is to solve the problems in terms of production efficiency that the botulinum toxin is dried over a long period of time, and the yield problem after drying of the botulinum toxin, when the botulinum toxin is produced by the conventional method of drying the botulinum toxin by freeze-drying, through vacuum drying.
  • An object of the present invention is to provide a vacuum drying method for botulinum toxin with significantly improved yield, stability, manufacturing efficiency, and productability.
  • the present invention comprises the steps of: a) primary drying a solution containing botulinum toxin at a temperature of 5 to 30° C. and a pressure of 0.01 to 2 mmHg; b) secondary drying the primary dried product obtained in step a) at a temperature of 5 to 20 °C and a pressure of 0.01 to 1 mmHg; and c) tertiary drying of the secondary dried product obtained in step b) at a temperature of 5 to 30° C. and a pressure of 0.01 to 0.5 mmHg.
  • step a) may be an initial temperature of 5 °C or more, the temperature is raised to 0.1 to 2 °C / min, and the primary drying may be.
  • the upper pressure limit in step a), may be 1.7 mmHg. In addition, in a specific aspect of the present invention, in step b), the upper pressure limit may be 0.8 mmHg. In addition, in a specific aspect of the present invention, in step c), the upper limit of the pressure may be 0.4 mmHg. In a more specific aspect of the present invention, in step c), the upper pressure limit may be 0.2 mmHg.
  • the drying time in the upper step a), b) and c) may be 30 minutes to 120 minutes, respectively.
  • the total drying time may be 6 hours or less, more specifically, the total drying time may be 5 hours or less, and the total drying time may be 4 hours or less.
  • the titer recovery rate in the vacuum drying method of the botulinum toxin, may be 80% or more, and more specifically, the titer recovery rate may be 85% or more, 90% or more.
  • the botulinum toxin in step a) is at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C1, C2, D, E, F, G and botulinum serotype.
  • the solution comprising the botulinum toxin of step a) comprises i) an excipient, a stabilizer, a preservative, a buffer, a thickening agent, a suspending agent, an emulsifier, a flavoring agent, a coloring agent and a solubilizing agent; ii) sodium chloride, calcium chloride, sodium phosphate, calcium phosphate, sodium acetate, ethanol, propylene glycol, polyethylene glycol and aqueous solutions thereof; And iii) it may include at least one selected from the group consisting of albumin, gelatin, sugar, and sugar alcohol.
  • the present invention relates to a vacuum drying method for botulinum toxin, which is produced through vacuum drying, so that there is no need to adjust the temperature to below zero, drying is possible in a short time compared to the prior art, and the overall yield is improved due to a high titer recovery rate There is an advantage.
  • the botulinum toxin preparation prepared including the drying method of the present invention has advantages in that it is thin and hard, so that it has strong impact resistance and excellent properties of the product.
  • 1 is a view showing the results of measuring the titer recovery according to the drying method of botulinum toxin.
  • FIG. 2 is a diagram showing the formulation of a finished product prepared through vacuum drying of botulinum toxin.
  • FIG. 3 is a diagram showing the formulation of a finished product prepared through freeze-drying of botulinum toxin.
  • the present invention comprises the steps of: a) primary drying a solution containing botulinum toxin at a temperature of 5 to 30 °C and a pressure of 0.01 to 2 mmHg; b) secondary drying the primary dried product obtained in step a) at a temperature of 5 to 20 °C and a pressure of 0.01 to 1 mmHg; and c) final drying of the secondary dried product obtained in step b) at a temperature of 5 to 30° C. and a pressure of 0.01 to 0.5 mmHg.
  • the present invention comprises the steps of: a) primary drying a solution containing botulinum toxin at a temperature of 5 to 30 °C and a pressure of 0.01 to 2 mmHg; b) secondary drying the primary dried product obtained in step a) at a temperature of 5 to 20 °C and a pressure of 0.01 to 1 mmHg; and c) final drying of the secondary dried product obtained in step b) at a temperature of 5 to 30° C. and a pressure of 0.01 to 0.5 mmHg.
  • the botulinum toxin is a neurotoxic polypeptide produced by Clostridium botulinum and related species, as well as a material originally produced in the Clostridium genus, as well as a material produced by modification, recombination, etc. includes all
  • botulinum toxin includes all substances recognized by those skilled in the art, and includes, but is not limited to, botulinum toxin types A, B, C1, C2, D, E, etc. .
  • the botulinum toxin may be obtained by any known method or may be obtained commercially, and the method for obtaining is not particularly limited.
  • the botulinum toxin in step a) is at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C1, C2, D, E, F, G and botulinum serotype.
  • the solution comprising the botulinum toxin of step a) comprises i) an excipient, a stabilizer, a preservative, a buffer, a thickening agent, a suspending agent, an emulsifier, a flavoring agent, a coloring agent and a solubilizing agent; ii) sodium chloride, calcium chloride, sodium phosphate, calcium phosphate, sodium acetate, ethanol, propylene glycol, polyethylene glycol and aqueous solutions thereof; And iii) it may include at least one selected from the group consisting of albumin, gelatin, sugar, and sugar alcohol.
  • an additive is a substance other than a pharmacologically active ingredient contained in a formulation.
  • An additive to increase usefulness such as improving the stability and bioavailability of a pharmaceutical composition, an additive to maintain formulation quality such as preservation or use of a pharmaceutical composition, and physical properties of the pharmaceutical composition It is used for additional purposes other than pharmacological activity, such as an additive for controlling the properties, and the additive can be used in a range that does not directly affect the pharmacological action.
  • an excipient may be included to increase stability, and sodium hydrogen carbonate, sodium chloride, calcium phosphate, dextrin, and the like may be included as the excipient.
  • the liquid phase may contain a solubilizing agent to increase the solubility of the substance, and may include sodium salicylate, urea, monoethylacetamide, propylene glycol, dimethyl acetamide, hexamine, urethane, sodium acetate, etc. as the solubilizing agent.
  • a solubilizing agent to increase the solubility of the substance, and may include sodium salicylate, urea, monoethylacetamide, propylene glycol, dimethyl acetamide, hexamine, urethane, sodium acetate, etc. as the solubilizing agent.
  • the stabilizer may contain a stabilizer to prevent decomposition by acid, moisture, pipe, etc., as the stabilizer, nitrogen gas, carbon dioxide, sugar, sugar alcohol, human serum albumin, weak acids and salts thereof, weak bases and salts thereof , proteins, and the like.
  • a stabilizer nitrogen gas, carbon dioxide, sugar, sugar alcohol, human serum albumin, weak acids and salts thereof, weak bases and salts thereof , proteins, and the like.
  • this is illustrative and not limited thereto.
  • a stable formulation can be formed without destroying the active ingredient of the botulinum toxin.
  • step a) may be an initial temperature of 5° C. or higher, and primary drying may be performed by raising the temperature at 0.1 to 2° C./min.
  • the initial temperature may be included in the above range.
  • the step a) can be classified into a maximum of 14 steps by changing the pressure conditions along with the temperature rise.
  • Primary drying can be performed by varying the temperature and pressure as well as the holding time at each stage.
  • step a) proceeds in up to 14 steps while changing the temperature, pressure and time, each step is raised from a temperature of 5 to 30 ° C. to 0.1 to 2 ° C./min, a pressure of 0.01 to 2 mmHg and time may be selected from the range of 0.1 to 40 minutes and primary drying. More specifically, step a) may be performed in steps 6 to 14, steps 7 to 14, steps 8 to 14, steps 9 to 14, and steps 10 to 14 while changing the temperature, pressure and time. In each step, the set temperature may be increased sequentially. However, the pressure and time do not necessarily increase or decrease sequentially.
  • the primary drying is performed in up to 14 steps, and by controlling the temperature, pressure and time in each step, the active ingredient of the botulinum toxin can be not destroyed as much as possible.
  • the pressure and temperature are constant at 4 steps or less during the primary drying, different internal and external states are formed in the final botulinum toxin solution, so that the active ingredient of the botulinum toxin is relatively low.
  • step a) when step a) proceeds in 10 steps, steps 1 to 10 are sequentially performed, and step 1 is an initial set temperature of 5 ° C, a temperature increase rate of 0.1 to 1 ° C/min, a pressure of 0.01 to Drying is possible under the conditions of 2 mmHg, 5 minutes, and the second stage is a set temperature of 10 °C, a temperature increase rate of 0.5 °C/min, and a pressure of 0.01 ⁇ 1.5 mmHg, 5 minutes, and the third stage is the set temperature.
  • step 5 can be dried under the conditions of a set temperature of 15 °C, a temperature increase rate of 0.75 °C/min, a pressure of 0.01 to 1.0 mmHg, and 10 minutes, and steps 6, 7, 8, 9 and 10 are 5 Compared with the step, each condition (temperature, temperature increase rate, and pressure) may be performed with the same or lower values. However, this is illustrative and not limited thereto.
  • step a) proceeds in 10 to 14 steps while changing the temperature, pressure and time, each step is raised from a temperature of 5 to 30 ° C. to 0.1 to 1 ° C./min, a pressure of 0.01 to It may be selected from the range of 2 mmHg and time 0.1 to 30 minutes and primary drying.
  • the step a) proceeds in 10 to 14 steps while changing the temperature, pressure and time, each step is a temperature increase from 5 to 30 ° C. to 0.1 to 0.8 ° C./min. , a pressure of 0.01 to 2 mmHg and a time of 0.1 to 30 minutes may be selected from the range of primary drying.
  • step a) proceeds in steps 10 to 14, and in steps 1 to 4, the temperature is raised from 5 to 10 ° C. to 0.1 to 1 ° C./min, pressure is selected from 0.01 to 2 mmHg and 5 to 20 minutes. and each of the remaining steps may be selected from a temperature rise of 0.1 to 1 °C/min at a temperature of 5 to 30 °C, a pressure of 0.01 to 1.7 mmHg and 5 to 20 minutes, and primary drying.
  • step a) proceeds in steps 10 to 14, steps 1 to 3 are at a temperature of 0.1 to 0.5 °C/min at a temperature of 5 to 20 °C, a pressure of 0.01 to 2 mmHg and 5 to 20 minutes in the range. are selected, steps 4 to 7 are selected from a temperature increase of 0.1 to 0.5° C./min at a temperature of 5 to 20° C., a pressure of 0.01 to 1 mmHg and 5 to 20 minutes, and steps 8 to 14 are 0.1 at a temperature of 5 to 20° C. to 0.8 ° C./min., the pressure may be 0.01 to 0.5 mmHg, and primary drying in the range of 5 to 20 minutes.
  • step b) proceeds in two steps while changing the temperature, pressure and time, and each step is a secondary at a temperature of 5 to 30 °C, a pressure of 0.01 to 1 mmHg, and a time of 0.1 to 80 minutes. It may be dry.
  • step b) proceeds in two steps while changing the temperature, pressure and time, each step is at a temperature of 20 to 30° C., a pressure of 0.05 to 1 mmHg, and a time in the range of 20 to 50 minutes. It may be secondary drying in
  • the secondary drying may be performed in two steps, thereby exhibiting the same effect as that of the primary drying.
  • the lower limit of pressure in each step in steps a), b), and c) may be 0.01 to 0.5 mmHg.
  • the lower limit of pressure in each step may be 0.01, 0.05, 0.09, 0.13, 0.17, 0.20, 0.25, 0.30 mmHg.
  • the upper limit of the pressure in step a), may be 1.7 mmHg. In a specific example of the present invention, the upper pressure limit of step a) may be 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.05, or 1.0 mmHg.
  • the upper pressure limit value may be 0.6 to 2.0 mmHg.
  • the upper pressure limit of step b) may be 2.0, 1.5, 1.0, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6 mmHg.
  • the upper limit of the pressure in step c), may be 0.4 mmHg.
  • the upper pressure limit of step c) may be 0.48, 0.45, 0.42, 0.40, 0.38, 0.35, 0.32, 0.30, 0.28, 0.25, 0.22, 0.20, 0.10 mmHg.
  • the purity of the botulinum toxin is not reduced, and a higher purity of the botulinum toxin can be provided.
  • botulinum toxin is administered by a method such as a procedure administered to the human body, it is generally maintained for about 3 months and requires repeated administration.
  • high purity may be achieved by vacuum drying within the above pressure range, and an effective effect may be exhibited even with a low capacity.
  • the botulinum toxin preparation when vacuum drying is performed in the above pressure range, may have a thin and hard appearance to exhibit impact resistance.
  • the drying time in steps a), b) and c) may be 30 minutes to 120 minutes, respectively.
  • the drying time of step b) may be 50 to 80 minutes.
  • the drying time of step c) may be 40 to 100 minutes.
  • the total drying time may be 6 hours or less. In a specific example of the present invention, in the vacuum drying method of the botulinum toxin, the total drying time may be 5 hours, 4.8 hours, 4.5 hours, 4.2 hours, or 4 hours or less.
  • the specific drying time may be adjusted in consideration of minimizing the loss of botulinum toxin, forming a stable formulation, and manufacturing efficiency in the above temperature and pressure range.
  • the present invention exhibits an excellent effect in terms of manufacturing efficiency as it is significantly shortened compared to the minimum of 18 hours, which is the drying time according to the conventional freeze-drying method of botulinum toxin.
  • the total drying time means the entire drying time including the primary drying of step a), the secondary drying of step b), and the final drying time of step c), It is not meant to refer to the total time taken for the preparation of the botulinum toxin formulation.
  • the total drying time can be shortened, thereby increasing the production efficiency of the botulinum toxin preparation.
  • the botulinum toxin drying method may have a titer recovery rate of 80% or more.
  • a specific titer recovery rate may be 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more.
  • the potency recovery rate is expressed as the recovery rate by calculating the titer of the final undiluted solution and the vacuum-dried finished product and the freeze-dried finished product, and comparing the titer of the final undiluted solution to the vacuum-dried finished product and the freeze-dried finished product with 100% of the potency of the final undiluted solution.
  • the present invention has a high titer recovery rate and thus a small loss of botulinum toxin protein during the preparation of a botulinum toxin preparation, so that even when administered at a low dose, the therapeutic or cosmetic effect of the botulinum toxin active ingredient can be effectively exhibited.
  • Clostridium botulinum Toxin Type A Clostridium botulinum Toxin Type A , sodium chloride as an excipient, and human serum albumin as a stabilizer were used.
  • the specific composition is as shown in Table 1.
  • the final undiluted solution was prepared at 500 ml, and in consideration of the loss, the final undiluted solution preparation target was 100 ⁇ 120 units / 0.1 mL.
  • a finished product was prepared through vacuum drying of the final botulinum toxin solution of ⁇ Example 1>.
  • the botulinum toxin final undiluted solution of ⁇ Example 1> was filled in a vial and inverted with a rubber stopper, and the vial filled with the botulinum toxin final undiluted solution was loaded in a freeze dryer.
  • drying preparation steps were performed for drying, and the temperature and pressure were varied in each stage.
  • the temperature and pressure ranges of each step are as follows.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was maintained in the range of 5 to 30 ° C. for 0 to 10 minutes or more. After that, drying was started at a shelf temperature of the freeze dryer at a temperature of 5 to 30 °C and a minimum pressure in the chamber in the range of 0.01 to 2 mmHg.
  • the secondary drying was carried out by dividing it into at least two stages, and the chamber pressure was 0.01 ⁇ 1 mmHg, and the shelf temperature was 5 ⁇ 20 °C, and it was dried while maintaining it for 0 ⁇ 80 minutes at each stage.
  • the final tertiary drying was carried out in step 1, and was dried for at least 30 minutes at a chamber pressure of 0.01 ⁇ 0.5 mmHg and a shelf temperature of 5 ⁇ 30 °C, followed by final drying.
  • a finished product was prepared through vacuum drying of the final botulinum toxin solution of ⁇ Example 1>.
  • the botulinum toxin final stock solution of ⁇ Example 1> was filled into a vial and half-inserted with a rubber stopper. After loading the vial filled with the final stock solution of botulinum toxin in the freeze dryer, for drying, the shelf temperature of the freeze dryer was set at 5 ⁇ 10 °C and maintained for 10 minutes. After that, the shelf temperature of the freeze dryer was maintained at 5 ⁇ 10 °C, and the pressure in the chamber was set to 0.1 mmHg to start drying.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 10 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 2 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.5 °C/min 0.1 mmHg 10 minutes 2 5 °C 0.3 °C/min 0.5 mmHg 15 minutes 3 5 °C 0.3 °C/min 0.7 mmHg 15 minutes 4 5 °C 0.4 °C/min 0.7 mmHg 10 minutes 5 15 °C 0.4 °C/min 0.1 mmHg 10 minutes 6 15 °C 0.4 °C/min 0.2 mmHg 5 minutes 7 15 °C 0.8 °C/min 0.2 mmHg 5 minutes 8 15 °C 0.8 °C/min 0.3 mmHg 5 minutes 9 15 °C 0.8 °C/min 0.3 mmHg 10 minutes 10 20 °C 0.3 °C/min 0.4 mmHg 10 minutes
  • Secondary drying was carried out in two stages, i) set chamber pressure at 0.5 mmHg, shelf temperature at 20 °C, and hold for 25 minutes, ii) chamber pressure at 0.3 mmHg, shelf temperature at 20 °C, and hold for 25 minutes and secondary drying.
  • the tertiary drying was completed by drying over 40 minutes by setting the chamber pressure at 0.01 mmHg and the shelf temperature at 30 °C.
  • the vacuum was released after wiring the rubber stopper by maintaining -0.3 ⁇ -0.7 bar using N 2 gas, and the dried vial was discharged from the freeze dryer shelf, sealed through aluminum cap sealing, and stored in refrigeration conditions. .
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 13 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 3 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.5 °C/min 0.1 mmHg 5 minutes 2 5 °C 0.3 °C/min 1.5 mmHg 15 minutes 3 5 °C 0.3 °C/min 1.8 mmHg 10 minutes 4 5 °C 0.5 °C/min 1 mmHg 5 minutes 5 15 °C 0.5 °C/min 0.8 mmHg 5 minutes 6 15 °C 0.5 °C/min 0.7 mmHg 10 minutes 7 15 °C 0.5 °C/min 0.3 mmHg 10 minutes 8 15 °C 0.5 °C/min 0.4 mmHg 10 minutes 9 15 °C 0.5 °C/min 0.5 mmHg 15 minutes 10 20 °C 0.3 °C/min 0.5 mmHg 5 minutes 11 20 °C 0.3 °C/min 0.4 mmHg 5 minutes 12 20 °C 0.3 °C/min 0.3 mmHg 10 minutes 13 20 °C 0.3 °
  • the secondary drying was carried out in two stages, i) set the chamber pressure at 0.5 mmHg, shelf temperature at 10 °C, and hold for 25 minutes, ii) set the chamber pressure at 0.35 mmHg and shelf temperature at 10 °C, and hold for 25 minutes and secondary drying.
  • the third drying was completed by drying for more than 40 minutes by setting the chamber pressure at 0.01 mmHg and the shelf temperature at 25 °C.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 14 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 4 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.5 °C/min 0.1 mmHg 5 minutes 2 5 °C 0.4 °C/min 0.5 mmHg 10 minutes 3 5 °C 0.4 °C/min 1 mmHg 10 minutes 4 5 °C 0.5 °C/min 0.5 mmHg 10 minutes 5 15 °C 0.5 °C/min 0.8 mmHg 5 minutes 6 15 °C 0.5 °C/min 0.9 mmHg 5 minutes 7 15 °C 0.5 °C/min 1 mmHg 5 minutes 8 15 °C 0.5 °C/min 0.3 mmHg 10 minutes 9 15 °C 0.5 °C/min 0.4 mmHg 10 minutes 10 25 °C 0.3 °C/min 0.5 mmHg 5 minutes 11 25 °C 0.3 °C/min 0.2 mmHg 5 minutes 12 25 °C 0.3 °C/min 0.3 mmHg 5 minutes 13 25 °C 0.3 °
  • the tertiary drying was completed by drying for more than 40 minutes at a chamber pressure of 0.01 mmHg and a shelf temperature of 30 °C.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 10 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 5 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.5 °C/min 0.1 mmHg 5 minutes 2 5 °C 0.3 °C/min 0.5 mmHg 5 minutes 3 5 °C 0.3 °C/min 0.6 mmHg 10 minutes 4 5 °C 0.5 °C/min 0.7 mmHg 20 minutes 5 15 °C 0.5 °C/min 0.8 mmHg 10 minutes 6 15 °C 0.5 °C/min 0.9 mmHg 10 minutes 7 15 °C 0.5 °C/min 1 mmHg 10 minutes 8 15 °C 0.5 °C/min 0.3 mmHg 15 minutes 9 20 °C 0.3 °C/min 0.4 mmHg 15 minutes 10 20 °C 0.3 °C/min 0.5 mmHg 5 minutes
  • the tertiary drying was completed by drying for more than 40 minutes at a chamber pressure of 0.01 mmHg and a shelf temperature of 30 °C.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was set to 0 ⁇ 5 °C and maintained for 10 minutes. After that, the shelf temperature of the freeze dryer was maintained at 0 ⁇ 5 °C, and the pressure in the chamber was set to 1.6 mmHg to start drying.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 11 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 6 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.3 °C/min 1.6 mmHg 5 minutes 2 5 °C 0.3 °C/min 1.6 mmHg 5 minutes 3 5 °C 0.3 °C/min 1.4 mmHg 10 minutes 4 5 °C 0.4 °C/min 1.2 mmHg 10 minutes 5 15 °C 0.4 °C/min 1.2 mmHg 5 minutes 6 15 °C 0.4 °C/min 1.0 mmHg 5 minutes 7 15 °C 0.4 °C/min 1.0 mmHg 10 minutes 8 15 °C 0.8 °C/min 0.5 mmHg 15 minutes 9 15 °C 0.8 °C/min 0.4 mmHg 5 minutes 10 20 °C 0.3 °C/min 0.3 mmHg 15 minutes 11 20 °C 0.3 °C/min 0.1 mmHg 20 minutes
  • the tertiary drying was completed by drying over 40 minutes at a chamber pressure of 0.01 mmHg and a shelf temperature of 30 °C.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was set to 0 ⁇ 5 °C and maintained for 10 minutes. After that, the shelf temperature of the freeze dryer was maintained at 0 ⁇ 5 °C, and the pressure in the chamber was set to 1.6 mmHg to start drying.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 14 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 7 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.4 °C/min 1.6 mmHg 5 minutes 2 5 °C 0.4 °C/min 1.0 mmHg 5 minutes 3 5 °C 0.5 °C/min 0.8 mmHg 10 minutes 4 5 °C 0.5 °C/min 0.5 mmHg 20 minutes 5 10 °C 0.4 °C/min 1 mmHg 5 minutes 6 10 °C 0.4 °C/min 0.9 mmHg 5 minutes 7 10 °C 0.5 °C/min 0.8 mmHg 5 minutes 8 10 °C 0.5 °C/min 0.5 mmHg 10 minutes 9 15 °C 0.3 °C/min 0.5 mmHg 5 minutes 10 15 °C 0.3 °C/min 0.4 mmHg 5 minutes 11 15 °C 0.3 °C/min 0.5 mmHg 5 minutes 10 15 °C 0.3 °C/min 0.4 mmHg 5 minutes 11 15 °C 0.3
  • the tertiary drying was completed by drying over 40 minutes at a chamber pressure of 0.01 mmHg and a shelf temperature of 30 °C.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was set to 0 ⁇ 5 °C and maintained for 10 minutes. After that, the shelf temperature of the freeze dryer was maintained at 0 ⁇ 5 °C, and the pressure in the chamber was set to 1.6 mmHg to start drying.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 10 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 8 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.5 °C/min 1.6 mmHg 5 minutes 2 5 °C 0.3 °C/min 1.5 mmHg 5 minutes 3 5 °C 0.3 °C/min 1 mmHg 10 minutes 4 5 °C 0.3 °C/min 0.9 mmHg 15 minutes 5 10 °C 0.5 °C/min 0.8 mmHg 5 minutes 6 10 °C 0.5 °C/min 0.7 mmHg 10 minutes 7 10 °C 0.5 °C/min 0.6 mmHg 10 minutes 8 10 °C 0.5 °C/min 0.5 mmHg 10 minutes 9 15 °C 0.5 °C/min 0.4 mmHg 15 minutes 10 15 °C 0.5 °C/min 0.1 mmHg 20 minutes
  • the tertiary drying was completed by drying for more than 40 minutes at a chamber pressure of 0.01 mmHg and a shelf temperature of 25 °C.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was set to 0 ⁇ 5 °C and maintained for 10 minutes. After that, the shelf temperature of the freeze dryer was maintained at 0 ⁇ 5 °C, and the pressure in the chamber was set to 1.6 mmHg to start drying.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 12 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 9 below.
  • step temperature temperature rise rate enter time One 5 °C 0.3 °C/min 1.6 mmHg 5 minutes 2 5 °C 0.3 °C/min 1.5 mmHg 5 minutes 3 5 °C 0.3 °C/min 1.0 mmHg 10 minutes 4 5 °C 0.3 °C/min 1.0 mmHg 5 minutes 5 10 °C 0.3 °C/min 0.9 mmHg 5 minutes 6 10 °C 0.5 °C/min 0.8 mmHg 10 minutes 7 10 °C 0.5 °C/min 0.5 mmHg 10 minutes 8 15 °C 0.8 °C/min 0.5 mmHg 5 minutes 9 15 °C 0.8 °C/min 0.4 mmHg 5 minutes 10 20 °C 0.3 °C/min 0.3 mmHg 10 minutes 11 20 °C 0.3 °C/min 0.2 mmHg 10 minutes 12 20 °C 0.3 °C/min 0.1 mmHg 15 minutes
  • the tertiary drying was completed by drying for more than 40 minutes at a chamber pressure of 0.01 mmHg and a shelf temperature of 25 °C.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was set to 0 ⁇ 5 °C and maintained for 10 minutes. After that, the shelf temperature of the freeze dryer was maintained at 0 ⁇ 5 °C, and the pressure in the chamber was set to 1.6 mmHg to start drying.
  • the primary drying was carried out by dividing the temperature and pressure into 14 steps, and primary drying was performed according to the conditions in Table 10 below.
  • the tertiary drying was completed by drying for more than 40 minutes at a chamber pressure of 0.05 mmHg and a shelf temperature of 25 °C.
  • the final botulinum stock solution of ⁇ Example 1> was freeze-dried to prepare a finished product.
  • the botulinum toxin final stock solution of ⁇ Example 1> was filled into a vial and half-inserted with a rubber stopper.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was set to 0 ⁇ 5 °C
  • the vial filled with the final stock solution of botulinum toxin was loaded in the freeze dryer, and the shelf temperature of the freeze dryer was set to about -45 °C and maintained for about 30 minutes.
  • the shelf temperature of the freeze dryer was maintained at about -45° C., and the pressure in the chamber was set to about 0.1 mmHg to start drying.
  • the primary drying was performed while maintaining the chamber pressure at about 10 mmHg and the shelf temperature at about -45°C (rising rate: 1°C/4 minutes) and maintaining it for about 60 minutes.
  • Secondary drying was performed while maintaining the chamber pressure at about 10 mmHg and shelf temperature at about -10°C (rising rate: 1°C/4 minutes) for about 30 minutes. Thereafter, drying was completed by drying the chamber at a pressure of about 10 mmHg and a shelf temperature of about 30°C (rising rate: at least 1°C/4 minutes) for at least 10 hours.
  • the shape of the manufactured finished product is as shown in FIG. 3 .
  • the potency recovery method calculates the potency of the final stock solution, vacuum-dried finished product, and freeze-dried finished product.
  • the potency of the final stock solution is regarded as 100%, and the potency of the vacuum-dried finished product and freeze-dried finished product is compared to the final stock solution, and the recovery rate is expressed in %.
  • freeze-dried product titer it was confirmed that the recovery rate of the final undiluted product titer (average value) compared to the final undiluted solution titer (average value) was about 72%, and the recovery rate of the final undiluted product titer (average value) compared to the final undiluted solution titer (average value) was 93%. did
  • Table 11 shows the results of the animal potency test performed three times on the final stock solution of ⁇ Example 1>, the vacuum-dried finished product of ⁇ Example 2>, and the freeze-dried finished product of ⁇ Comparative Example 1>.
  • the preparation target 100 is the minimum of 113 units/0.1 ml, the maximum of 132 units/0.1 ml, and the average of 122 units/0.1 ml. It was confirmed that there was no abnormality in the manufacturing process as units/0.1 mL ⁇ 10% (100-120 units / 0.1 mL).
  • the results of the animal potency test of the freeze-dried finished product were a minimum of 83 units/vial, a maximum of 94 units/vial, and an average of 86 units/vial, and the recovery rate compared to the titer of the final stock solution was only 72%.
  • the animal potency test results of vacuum-dried finished products were at least 108 units/vial, max. 123 units/vial, and averaged 114 units/vial, confirming that the recovery rate compared to the titer of the final stock solution was 93%.
  • the titer recovery rate of the finished product prepared by vacuum drying was about 21% higher than that of the finished product prepared by freeze drying, confirming that the loss of botulinum toxin protein was small.
  • the properties of the finished product are thin and hard, and the impact resistance is strengthened, and thus the stability is high.
  • vacuum drying is advantageous in terms of efficiency because the required time is very short.
  • the present invention relates to the production of botulinum toxin, and can be usefully used in the fields of medicine, cosmetics, and the like.

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에 관한 것으로, 상세하게는 a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계; b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 최종 건조하는 단계;를 포함하는 보툴리눔 독소의 건조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래 동결 건조에 의해 보툴리눔 독소를 진공 건조하는 방법에 비해 수율, 안정성 및 제조효율이 향상된다는 이점이 있다.

Description

보툴리눔 독소의 진공 건조 방법
본 발명은 보툴리눔 독소 제제의 제조공정 중 건조 공정에 관한 것으로, 상세하게는 종래 동결 건조가 아닌 진공 건조를 통해 보툴리눔 독소를 건조하며, 종래 방법에 비하여 수율, 안정성 및 제조효율이 향상된 진공 건조 방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소(Botulinum Toxin)는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 균 및 관련 종에 의해 생성되는 신경 독성 단백질로서, 신경근 접합부의 축삭돌기 말단으로부터 분비되는 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 방출을 막는 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 보톨리눔 독소는 A형부터 H형까지 혈청학적으로 관련된 8종의 천연 보툴리눔 독소가 존재하고, 종류에 따라 인체에 미치는 영향을 달리하나 전체적으로 인체에 치명적인 영향을 가지는 것으로 알려져 있다. 보툴리눔 독소 H형의 경우, 20억 분의 1 그램만이 인체에 주입되는 경우 죽음에 이를 수도 있으며, 보툴리눔 독소 A형, B형은 질병을 유발시킬 수 있다. 보툴리눔 독소 A형의 경우, 1978년 이후 안전성과 효능이 입증되면서 사시 교정에 이용되었고, 1987년 안검경련 환자의 치료를 위해 독소를 주사한 후 미간부위의 주름이 없어지는 것을 발견하여 미용목적의 사용가능성으로써 관심이 생겼다. 일반적으로 보툴리눔 독소 A형 및 B형은 의약품화하여 주사제로 근육 내에 주사하여 근육 경련 및 근육 과활동으로 생기는 질병들을 치료하기 위해 사용되며, 주입량에 따라 인체에 미치는 영향을 고려하여, 보툴리눔 독소의 사용을 위한 가이드라인, 보툴리눔 독소의 허가를 위한 가이드라인을 마련해두고 있다.
현재, 보툴리눔 독소의 약제화 과정에서 단백질의 불안정성, 활성성분의 손실 등의 문제가 있어 안정화제 등의 별도의 성분을 요구하고 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1087017호의 경우 폴리솔베이트 20, 메티오닌 및/또는 이소루신을 통해 액상 조성물을 제조하는 방법이 개시되어 있다.
시판용 보툴리눔 독소 제제는 보툴리눔 독소 제제의 분해를 방지하고, 보툴리눔 독소 제제의 취급을 보다 용이하게 하며 수송 비용의 절감 등을 위해 동결 건조되거나 진공 건조한 후 분말 형태로 유통되고, 사용 전에 물 또는 염수 용액 등의 액체 캐리어를 사용하여 재구성 될 수 있다.
다만, 종래 일반적으로 사용되는 건조 기술인 동결 건조의 경우 보툴리눔 독소의 불안정성으로 인해 손실되고, 동결 건조에 소요되는 시간이 길다는 단점이 있다. 이에, 본 발명자들은 보툴리눔 독소의 건조 방법을 개선하기 위해 노력한 결과, 특정 단계로 이루어진 본 발명에 따른 진공 건조를 적용함으로써, 활성물질의 손실이 적으며 소요시간이 상당히 단축되면서도 제품의 성상이 우수한 진공 건조 방법을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 종래 동결 건조에 의해 보툴리눔 독소를 건조하는 방법에 의해 보툴리눔 독소를 제조하는 경우, 장시간에 걸쳐 건조된다는 제조효율 측면의 문제점, 보툴리눔 독소의 건조 후의 수율 문제점 등을 해결하고자, 진공 건조를 통해 수율, 안정성, 제조효율 및 제품성이 현저히 향상된 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 문제를 해결하기 위하여, a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계; b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 3차 건조하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 5 ℃ 이상의 초기온도에서, 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온하며 1차 건조하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)에서, 압력 상한값이 1.7 mmHg일 수 있다. 또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)에서, 압력 상한값이 0.8 mmHg일 수 있다. 또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.4 mmHg일 수 있다. 보다 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.2 mmHg일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상계 단계 a), b) 및 c)에서 건조 시간은 각각 30분 내지 120분일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 6시간 이하일 수 있고, 보다 구체적으로 총 건조 시간이 5시간 이하, 총 건조 시간이 4시간 이하일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 80% 이상일 수 있고, 보다 구체적으로 역가 회수율이 85% 이상, 90% 이상일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E, F, G 및 보툴리눔 혈청형(serotype)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 i) 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제 및 용해보조제로 구성된 군; ii) 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 아세트산나트륨, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 수용액으로 구성된 군; 및 iii) 알부민, 젤라틴, 당 및 당 알코올 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에 관한 것으로, 진공 건조를 통해 제조함으로써 영하로 온도를 조절할 필요가 없으며, 종래기술과 비교하여 단시간에 건조가 가능하며, 역가 회수율이 높아 전체적인 수율의 향상이 있다는 이점이 있다. 또한, 본 발명 건조 방법을 포함하여 제조된 보툴리눔 독소 제제는 얇고 단단하여 내충격성이 강하고 제품의 성상이 우수하다는 이점이 있다.
도 1은 보툴리눔 독소의 건조 방법에 따른 역가 회수율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 보툴리눔 독소의 진공 건조를 통해 제조된 완제품의 제형을 나타낸 도이다.
도 3은 보툴리눔 독소의 동결 건조를 통해 제조된 완제품의 제형을 나타낸 도이다.
본 발명은 a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계; b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 최종 건조하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계; b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 최종 건조하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서 “상한 값”, “하한 값” “X 내지 Y” 등의 수치는 해당 수치 값을 제외하는 것이 아니라 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 보툴리눔 독소는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 균 및 관련 종에 의해 생성되는 신경 독성 폴리펩타이드로서, 클로스트리디움 속 균에 원천적으로 생성된 물질 뿐만 아니라 변형, 재조합 등에 의하여 생성된 물질을 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서 보툴리눔 독소는 특별히 정의를 내리지 않는 한 통상의 기술자가 인식가능한 물질 모두를 포함하는 것으로, 이에 제한되는 것은 아니나 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E 등을 포함한다. 보툴리눔 독소는 임의의 공지된 방법에 의해 수득되거나 상업적으로 수득한 것일 수 있으며, 수득방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E, F, G 및 보툴리눔 혈청형(serotype)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)의 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 i) 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제 및 용해보조제로 구성된 군; ii) 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 아세트산나트륨, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 수용액으로 구성된 군; 및 iii) 알부민, 젤라틴, 당 및 당 알코올 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 첨가제로서 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제, 용해보조제, 용제, 가용화제, 분산제, 붕해제, 가소제, 활택제, 무통화제, 희석제, 차폐제 등을 포함할 수 있다. 첨가제는 제제에 함유된 약리학적 유효성분 이외의 물질로, 의약 조성물의 안정성 및 생체이용률 향상 등 유용성을 높이기 위한 첨가제, 의약 조성물의 보존 또는 사용 등의 제제 품질 유지를 위한 첨가제, 의약 조성물의 물리적인 성상을 조절하기 위한 첨가제 등의 약리활성 이외의 부가적인 목적을 위해 사용되며, 첨가제는 통상적으로 약리작용에 직접적인 영향을 미치지 않는 범위에서 사용할 수 있다.
예를 들면, 안정성을 증가시키기 위하여 부형제를 포함할 수 있고, 부형제로써 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 인산칼슘, 덱스트린 등을 포함할 수 있다.
또한, 액상으로서 물질의 용해도를 증가시키기 위한 용해보조제를 포함할 수 있고, 용해보조제로써 살리실산나트륨, 요소, 모노에틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜, 디메틸 아세트아미드, 헥사민, 우레탄, 아세트산나트륨 등을 포함할 수 있다.
또한, 산, 수분, 관 등에 의하여 분해되는 것을 방지하기 위해 안정화제를 포함할 수 있고, 안정화제로써, 질소가스, 이산화탄소, 당, 당 알코올, 인간혈청알부민, 약산 및 이의 염, 약염기 및 이의 염, 단백질 등을 포함할 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 단계의 온도가 상한값 이하인 경우, 보툴리눔 독소의 활성 성분을 파괴하지 않으면서 안정적인 제제를 형성할 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 5 ℃ 이상의 초기온도에서, 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온하며 1차 건조하는 것일 수 있다. 여기에서 초기온도는 상기 범위에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 a)는 승온과 함께 압력 조건을 변화시켜 최대 14단계로 분류될 수 있다. 각 단계에서 온도, 압력 뿐 아니라 유지시간을 달리하여 1차 건조를 할 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 최대 14 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 시간 0.1 내지 40분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것일 수 있다. 보다 더 구체적으로, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시켜가며 6 내지 14단계, 7 내지 14단계, 8 내지 14단계, 9 내지 14단계, 10 내지 14단계로 진행될 수 있다. 각 단계에서, 설정 온도는 순차적으로 상승할 수 있다. 다만, 압력 및 시간은 반드시 순차적으로 상승하거나 하락하는 것은 아니다.
본 발명에서 1차 건조는 최대 14 단계로 진행되어 각 단계에서 온도, 압력 및 시간을 조절함으로써, 보툴리눔 독소의 활성 성분을 최대한 파괴하지 않을 수 있다. 1차 건조 시 4단계 이하로 압력 및 온도를 일정하게 하는 경우, 보툴리눔 독소 최종원액에서 내외부가 상이한 상태를 형성하여, 보툴리눔 독소의 활성 성분이 비교적으로 낮아진다.
구체적인 예를 들면, 상기 단계 a)가 10단계로 진행되는 경우, 1단계에서 10단계는 순차적으로 진행되며, 1단계는 초기 설정온도 5 ℃, 0.1~1 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~2 mmHg, 5분의 조건으로 건조할 수 있고, 2단계는 설정온도 10 ℃, 0.5 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.5 mmHg, 5분의 조건으로 건조할 수 있으며, 3단계는 설정온도 5 ℃, 0.5 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.0 mmHg, 10분의 조건으로 건조할 수 있고, 4단계는 설정온도 5 ℃, 0.75 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.0 mmHg, 20분의 조건으로 건조할 수 있다. 또한, 5단계는 설정온도 15 ℃, 0.75 ℃/min의 승온속도, 압력 0.01~1.0 mmHg, 10분의 조건으로 건조할 수 있고, 6단계, 7단계, 8단계, 9단계 및 10 단계는 5단계와 비교하여 각 조건(온도, 승온속도 및 압력)이 동일하거나 그 이하 값으로 수행될 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 10 내지 14 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 1 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 시간 0.1 내지 30분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 10 내지 14 단계로 진행되며, 각 단계는 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 0.8 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 시간 0.1 내지 30분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 단계 a)는 10 내지 14단계로 진행되며, 1 내지 4단계 온도 5 내지 10 ℃에서 0.1 내지 1 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되며, 나머지 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃에서 0.1 내지 1 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 1.7 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되어 1차 건조하는 것 일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 단계 a)는 10 내지 14단계로 진행되며, 1 내지 3단계는 온도 5 내지 20 ℃에서 0.1 내지 0.5 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 2 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되며, 4 내지 7단계는 온도 5 내지 20 ℃에서 0.1 내지 0.5 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 1 mmHg 및 5 내지 20분 범위에서 선택되고, 8 내지 14단계는 온도 5 내지 20 ℃에서 0.1 내지 0.8 ℃/min으로 승온, 압력 0.01 내지 0.5 mmHg 및 5 내지 20분 범위 1차 건조하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 2 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 5 내지 30 ℃, 압력 0.01 내지 1 mmHg 및 시간 0.1 내지 80분 범위에서 2차 건조하는 것일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)는 온도, 압력 및 시간을 변화시키면서 2 단계로 진행되며, 각 단계는 온도 20 내지 30 ℃, 압력 0.05 내지 1 mmHg의 압력 및 시간 20 내지 50분 범위에서 2차 건조하는 것일 수 있다.
본 발명에서 2차 건조는 2단계로 진행되어, 1차 건조에 따른 효과와 동일한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a), b), c)에서 각 단계의 압력 하한 값은 0.01 내지 0.5 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 각 단계의 압력 하한 값은 0.01, 0.05, 0.09, 0.13, 0.17, 0.20, 0.25, 0.30 mmHg일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a)에서, 압력 상한값이 1.7 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 예에서, 상기 단계 a)의 압력 상한 값은 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.05, 1.0 mmHg일 수 있다.
또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)에서, 압력 상한 값은 0.6 내지 2.0 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)의 압력 상한 값은 2.0, 1.5, 1.0, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6 mmHg일 수 있다.
또한, 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.4 mmHg일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 예에서, 상기 단계 c)의 압력 상한 값은 0.48, 0.45, 0.42, 0.40, 0.38, 0.35, 0.32, 0.30, 0.28, 0.25, 0.22, 0.20, 0.10 mmHg일 수 있다.
본 발명에서, 각 단계에서 상기 압력 범위 내에서 진공 건조를 수행하는 경우, 보툴리눔 독소의 순도를 저하시키지 않아, 보다 높은 순도의 보툴리눔 독소를 제공할 수 있다. 보툴리눔 독소는 인체에 투여되는 시술 등의 방법으로 투여되는 경우, 일반적으로 약 3개월 동안 유지되어 반복적 투여가 필요하며 그에 따라 체내 항체 형성에 따른 내성 문제, 고용량 투여에 따른 안정성 문제가 발생할 수 있으나, 본 발명에 따른 진공 건조 방법에 의한 경우, 상기 압력 범위로 진공 건조함으로써 높은 순도를 달성하여, 저용량으로도 유효한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서, 상기 압력 범위에서 진공 건조를 수행하는 경우, 보툴리눔 독소 제제 제조시 성상이 얇고 단단한 형태로 나타나 내충격성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 a), b) 및 c)에서 건조 시간은 각각 30분 내지 120분일 수 있다.
보다 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 b)의 건조 시간은 50 내지 80분일 수 있다.
보다 구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 c)의 건조 시간은 40 내지 100분일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 6시간 이하일 수 있다. 구체적인 본 발명의 일 예에서, 상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 5시간, 4.8 시간, 4.5시간, 4.2시간, 4시간 이하일 수 있다.
본 발명에서, 구체적인 건조 시간은 상기 온도 및 압력 범위에서 보툴리눔 독소의 손실 최소화, 안정적인 제제 형성, 제조효율을 고려하여 조절될 수 있다. 또한, 본 발명은 종래 보툴리눔 독소의 동결 건조 방법에 따른 건조 시간인 최소 18시간과 비교하여, 매우 단축되어 제조효율 측면에서 우수한 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법에서 총 건조시간은 단계 a)의 1차 건조, 단계 b)의 2차 건조 및 단계 c)의 최종 건조 시간을 포함한 건조에 소요되는 시간 전체를 의미하며, 보툴리눔 독소 제제의 제조 전체에 걸리는 시간을 의미하는 것은 아니다. 본 발명에서 진공 건조 방식을 이용함으로써, 총 건조시간이 단축되어 보툴리눔 독소 제제의 제조효율 상승을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 보툴리눔 독소의 건조 방법은 역가 회수율이 80% 이상일 수 있다. 구체적인 역가 회수율은 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88%이상, 89% 이상, 90%이상일 수 있다. 본 발명에서 역가 회수율은 최종원액과 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 산출하고 최종원액의 역가를 100%로 보고 최종원액 대비 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 비교하여 회수율로 표현된다.
- 동결건조 완제품 역가 회수율(%) = 동결건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
- 진공건조 완제품 역가 회수율(%) = 진공건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
본 발명은 역가 회수율이 높아 보툴리눔 독소 제제의 제조시 보툴리눔 독소 단백질의 손실이 적어 저용량 투여하더라도 보툴리눔 독소 활성 성분의 치료적 또는 미용적 효과가 유효하게 나타날 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 보툴리눔 독소 최종원액
보툴리눔 독소 최종원액은 클로스트리디움 보툴리눔 독소 A형(Clostridium botulinum Toxin Type A), 및 부형제로 염화나트륨(Sodium Chloride), 안정화제로 사람혈청알부민(Human Serum Albumin)을 사용하였다. 구체적인 조성은 표 1에 나타난 바와 같다. 최종원액은 500 ml로 조제하였고, 손실량을 감안하여 최종원액 조제 목표는 100~120 units / 0.1 mL로 하였다.
원료명 바이알 당 기준량 사용량 (500 ml 기준)
보툴리눔 독소 원액 100 units 100~120 units / 0.1 mL
Sodium Chloride 0.9 mg 4.5 g
Human Serum Albumin 0.5 mg 2.5 g
<실시예 2> 보툴리눔 독소 진공 건조 방법
<실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액 진공 건조를 통해 완제품을 제조하였다. <실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액을 바이알에 충전 및 고무마개로 반타전하고, 보툴리눔 독소 최종원액이 충전된 바이알을 동결 건조기에 적재하였다.
그 후, 건조를 위하여 건조준비단계, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조를 진행하였으며, 각 단계에서 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다. 각 단계의 온도 및 압력의 범위는 하기와 같다.
건조 준비는 동결 건조기 선반온도를 5 ~ 30 ℃의 범위에서 0 ~ 10분 이상 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 온도 5 ~ 30 ℃, 챔버 내 최소압력을 0.01 ~ 2 mmHg의 범위에서, 건조를 시작하였다.
1차 건조는 최대 14단계로 나누어 진행하였으며, 챔버 내 압력 0.01 ~ 2 mmHg, 선반온도 5 ~ 30 ℃(상승속도: 최소 0.1 ~ 0.5 ℃/분)의 범위에서, 각 단계별 0 ~ 40분간 유지하면서 건조하였다.
2차 건조는 최소 2단계로 나누어 진행하였으며, 챔버 내 압력 0.01 ~ 1 mmHg, 선반온도 5 ~ 20 ℃의 범위에서, 각 단계별 0 ~ 80분간 유지하면서 건조하였다.
최종 3차 건조는 1단계로 진행하였으며, 챔버 내 압력 0.01 ~ 0.5 mmHg, 선반온도 5 ~ 30 ℃의 범위에서, 최소 30분 이상 건조하여, 최종 건조하였다.
건조 완료 후, N2 가스를 이용하여 -0.3 ~ -0.7 bar를 유지하여 고무마개 타전 후 진공해제하고 동결 건조기 선반에서 건조 완료된 바이알을 배출하여 알루미늄 캡실링을 통해 밀봉한 후, 냉장조건에서 보관하였다. <실시예 2>에 따라 제조된 완제품의 형태는 도 2에 나타난 바와 같다.
<실시예 2-1> 보툴리눔 독소 진공 건조 (1)
<실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액 진공 건조를 통해 완제품을 제조하였다. <실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액을 바이알에 충전 및 고무마개로 반타전하였다. 보툴리눔 독소 최종원액이 충전된 바이알을 동결 건조기에 적재한 후, 건조를 위하여, 동결 건조기 선반온도를 5 ~ 10 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 5 ~ 10 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 0.1 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 10단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 2의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.1 mmHg 10 분
2 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.5 mmHg 15 분
3 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.7 mmHg 15 분
4 5 ℃ 0.4 ℃/ 분 0.7 mmHg 10 분
5 15 ℃ 0.4 ℃/ 분 0.1 mmHg 10 분
6 15 ℃ 0.4 ℃/ 분 0.2 mmHg 5 분
7 15 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.2 mmHg 5 분
8 15 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.3 mmHg 5 분
9 15 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
10 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.4 mmHg 10 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 20 ℃로 설정하여, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.3 mmHg, 선반온도 20 ℃로 설정하여, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 설정하여 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
건조 완료 후, N2 가스를 이용하여 -0.3 ~ -0.7 bar를 유지하여 고무마개 타전 후 진공해제하고 동결 건조기 선반에서 건조 완료된 바이알을 배출하여 알루미늄 캡실링을 통해 밀봉한 후, 냉장조건에서 보관하였다.
<실시예 2-2> 보툴리눔 독소 진공 건조 (2)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 13단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 3의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.1 mmHg 5 분
2 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.5 mmHg 15 분
3 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.8 mmHg 10 분
4 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 1 mmHg 5 분
5 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.8 mmHg 5 분
6 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.7 mmHg 10 분
7 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
8 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.4 mmHg 10 분
9 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.5 mmHg 15 분
10 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.5 mmHg 5 분
11 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.4 mmHg 5 분
12 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
13 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 10 ℃로 설정하여, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.35 mmHg, 선반온도 10 ℃로 설정하여, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 25 ℃로 설정하여 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-3> 보툴리눔 독소 진공 건조 (3)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 14단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 4의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.1 mmHg 5 분
2 5 ℃ 0.4 ℃/ 분 0.5 mmHg 10 분
3 5 ℃ 0.4 ℃/ 분 1 mmHg 10 분
4 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.5 mmHg 10 분
5 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.8 mmHg 5 분
6 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.9 mmHg 5 분
7 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 1 mmHg 5 분
8 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
9 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.4 mmHg 10 분
10 25 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.5 mmHg 5 분
11 25 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.2 mmHg 5 분
12 25 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.3 mmHg 5 분
13 25 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.4 mmHg 10 분
14 25 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.5 mmHg 10 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.35 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-4> 보툴리눔 독소 진공 건조 (4)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 10단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 5의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.1 mmHg 5 분
2 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.5 mmHg 5 분
3 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.6 mmHg 10 분
4 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.7 mmHg 20 분
5 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.8 mmHg 10 분
6 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.9 mmHg 10 분
7 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 1 mmHg 10 분
8 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.3 mmHg 15 분
9 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.4 mmHg 15 분
10 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.5 mmHg 5 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-5> 보툴리눔 독소 진공 건조 (5)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 11단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 6의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.6 mmHg 5 분
2 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.6 mmHg 5 분
3 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.4 mmHg 10 분
4 5 ℃ 0.4 ℃/ 분 1.2 mmHg 10 분
5 15 ℃ 0.4 ℃/ 분 1.2 mmHg 5 분
6 15 ℃ 0.4 ℃/ 분 1.0 mmHg 5 분
7 15 ℃ 0.4 ℃/ 분 1.0 mmHg 10 분
8 15 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.5 mmHg 15 분
9 15 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.4 mmHg 5 분
10 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.3 mmHg 15 분
11 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.1 mmHg 20 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.3 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-6> 보툴리눔 독소 진공 건조 (6)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 14 단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 7의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.4 ℃/ 분 1.6 mmHg 5 분
2 5 ℃ 0.4 ℃/ 분 1.0 mmHg 5 분
3 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.8 mmHg 10 분
4 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.5 mmHg 20 분
5 10 ℃ 0.4 ℃/ 분 1 mmHg 5 분
6 10 ℃ 0.4 ℃/ 분 0.9 mmHg 5 분
7 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.8 mmHg 5 분
8 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.5 mmHg 10 분
9 15 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.5 mmHg 5 분
10 15 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.4 mmHg 5 분
11 15 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
12 15 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.2 mmHg 10 분
13 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.2 mmHg 5 분
14 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.1 mmHg 10 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.35 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 20 ℃로, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 30 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-7> 보툴리눔 독소 진공 건조 (7)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 10단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 8의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.5 ℃/ 분 1.6 mmHg 5 분
2 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.5 mmHg 5 분
3 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1 mmHg 10 분
4 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.9 mmHg 15 분
5 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.8 mmHg 5 분
6 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.7 mmHg 10 분
7 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.6 mmHg 10 분
8 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.5 mmHg 10 분
9 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.4 mmHg 15 분
10 15 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.1 mmHg 20 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 25분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 25분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 25 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-8> 보툴리눔 독소 진공 건조 (8)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 12단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 9의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.6 mmHg 5 분
2 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.5 mmHg 5 분
3 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.0 mmHg 10 분
4 5 ℃ 0.3 ℃/ 분 1.0 mmHg 5 분
5 10 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.9 mmHg 5 분
6 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.8 mmHg 10 분
7 10 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.5 mmHg 10 분
8 15 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.5 mmHg 5 분
9 15 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.4 mmHg 5 분
10 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
11 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.2 mmHg 10 분
12 20 ℃ 0.3 ℃/ 분 0.1 mmHg 15 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.4 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.5 mmHg, 선반온도 15 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.01 mmHg, 선반온도 25 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<실시예 2-9> 보툴리눔 독소 진공 건조 (9)
<실시예 2-1>과 동일한 방법에 의해 진행하되, 건조 준비, 1차 건조, 2차 건조 및 3차 건조의 온도 및 압력을 달리하여 진행하였다.
동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고 10분 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 1.6 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 온도와 압력을 14단계로 나누어 진행하였으며, 하기의 표 10의 조건에 따라 1차 건조하였다.
단계 온도 온도상승속도 압력 시간
1 10 ℃ 0.1 ℃/ 분 1.0 5 분
2 20 ℃ 0.2 ℃/ 분 0.9 mmHg 5 분
3 20 ℃ 0.2 ℃/ 분 0.8 mmHg 10 분
4 20 ℃ 0.2 ℃/ 분 0.1 mmHg 5 분
5 20 ℃ 0.2 ℃/ 분 0.2 mmHg 5 분
6 20 ℃ 0.2 ℃/ 분 0.3 mmHg 10 분
7 20 ℃ 0.2 ℃/ 분 0.4 mmHg 10 분
8 20 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.1 mmHg 5 분
9 20 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.15 mmHg 5 분
10 20 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.2 mmHg 10 분
11 25 ℃ 0.5 ℃/ 분 0.1 mmHg 10 분
12 25 ℃ 0.6 ℃/ 분 0.2 mmHg 10 분
13 25 ℃ 0.7 ℃/ 분 0.2 mmHg 10 분
14 25 ℃ 0.8 ℃/ 분 0.2 mmHg 10 분
2차 건조는 2단계로 나누어 진행하였으며, i) 챔버 내 압력 0.2 mmHg, 선반온도 25 ℃로, 30분간 유지, ii) 챔버 내 압력 0.2 mmHg, 선반온도 25 ℃로, 30분간 유지하여 2차 건조하였다.
3차 건조는 챔버 내 압력 0.05 mmHg, 선반온도 25 ℃로 40분 이상 건조하여 건조를 완료하였다.
<비교예 1> 보툴리눔 독소 동결 건조 방법
<실시예 1>의 보툴리눔 최종 원액을 동결 건조를 통해 완제품을 제조하였다. <실시예 1>의 보툴리눔 독소 최종원액을 바이알에 충전 및 고무마개로 반타전하였다. 동결 건조기의 선반온도를 0 ~ 5 ℃로 설정하고, 보툴리눔 독소 최종원액이 충전된 바이알을 동결 건조기에 적재한 후, 동결 건조기 선반온도를 약 -45 ℃로 설정하고 약 30분간 유지하였다. 그 후, 동결 건조기 선반온도를 약 -45 ℃로 유지하고, 챔버 내 압력을 약 0.1 mmHg로 설정하여 건조를 시작하였다.
1차 건조는 챔버 내 압력 약 10 mmHg, 선반온도 약 -45 ℃(상승속도: 1℃/4분)으로 설정하여 약 60분간 유지하면서 건조하였다. 2차 건조는 챔버 내 압력 약 10 mmHg, 선반온도 약 -10 ℃(상승속도: 1℃/4분)로 약 30분간 유지하면서 건조하였다. 그 후, 챔버 내 압력 약 10 mmHg, 선반온도 약 30 ℃(상승속도: 최소 1℃/4분)로 최소 10시간 건조하여 건조를 완료하였다.
건조 완료 후, 고무마개 타전 후 진공해제하고 동결 건조기 선반에서 건조완료된 바이알을 배출하여 알루미늄 캡실링을 통해 밀봉한 후, 냉장조건에서 보관하였다. 제조된 완제품의 형태는 도 3에 나타난 바와 같다.
<실험예 1> 동물 역가 시험
<1-1> 측정 방법
역가의 회수율 측정법은 최종원액과 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 산출하고 최종원액의 역가를 100%로 보고 최종원액 대비 진공건조 완제품 및 동결건조 완제품의 역가를 비교하여 회수율을 %로 나타냈다. 동결건조 완제품 역가의 경우, 최종원액 역가(평균값) 대비 동결건조 완제품 역가(평균값) 회수율은 약 72%이고, 최종원액 역가(평균값) 대비 진공건조 완제품 역가(평균값) 회수율은 93%에 해당함을 확인하였다.
- 동결건조 완제품 역가 회수율(%) = 동결건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
- 진공건조 완제품 역가 회수율(%) = 진공건조 완제품 역가의 평균 값 / 최종원액 역가의 평균값 × 100
<1-2> 시험 결과
<실시예 1>의 최종원액, <실시예 2>의 진공 건조 완제품, 및 <비교예 1>의 동결 건조 완제품에 대하여 동물 역가 시험을 3회 실시한 결과는 표 11에 나타난 바와 같다.
구분 동물 역가 시험 결과
1회차 2회차 3회차 평균
최종원액
(units/0.1 ml)		 시험자 A 123 129 132 128 122
시험자 B 113 115 119 116
진공 건조 완제품
(units/vial)		 시험자 A 110 115 123 116 114
시험자 B 108 110 115 111
동결 건조 완제품
(units/vial)		 시험자 A 88 92 94 91 88
시험자 B 83 83 87 85
표 11에 나타난 바와 같이, 최종원액의 동물 역가 시험 결과값이 최소 113 units/0.1 ml, 최대 132 units/0.1 ml, 평균 122 units/0.1 ml로 조제 편차 및 시험 편차를 감안하였을 때, 조제목표 100 units/0.1 mL ± 10%(100~120 units / 0.1 mL)로서 제조 과정에는 이상이 없음을 확인하였다.
동결 건조 완제품의 동물 역가 시험 결과는 최소 83 units/vial, 최대 94 units/vial, 평균 86 units/vial로 최종원액의 역가 대비 회수율은 72%에 불과하였다. 진공 건조 완제품의 동물 역가 시험 결과는 최소 108 units/vial, 최대 123 units/vial, 평균 114 units/vial로 최종원액의 역가 대비 회수율은 93%에 해당함을 확인하였다.
따라서, 진공 건조에 의해 제조된 완제품의 역가 회수율은 동결 건조에 의해 제조된 완제품과 비교하여 약 21% 높은 것을 확인하여 보툴리눔 독소 단백질의 손실(Loss)이 적은 것을 확인하였다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 완제품의 성상이 얇고 단단하여 내충격성이 강화되어 안정성이 높다. 또한, 동결 건조와 비교하여 진공 건조의 경우 소요시간이 매우 짧아 효율적인 측면에서도 유리하다.
본 발명은 보툴리눔 독소의 제조에 관한 것으로, 의학, 화장품 등의 분야에서 유용하게 이용가능하다.

Claims (15)

  1. a) 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 2 mmHg의 압력 조건 하 1차 건조하는 단계;
    b) 단계 a)에서 수득된 1차 건조물을 5 ~ 20 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 1 mmHg의 압력 조건 하 2차 건조하는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 수득된 2차 건조물을 5 ~ 30 ℃ 온도, 및 0.01 ~ 0.5 mmHg의 압력 조건 하 3차 건조하는 단계;를 포함하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a)는 5 ℃ 이상의 초기온도에서, 0.1 내지 2 ℃/min으로 승온하며 1차 건조하는 것인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a)에서, 압력 상한값이 1.7 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 b)에서, 압력 상한값이 0.8 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.4 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 c)에서, 압력 상한값이 0.2 mmHg인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a), b) 및 c)에서 건조 시간은 각각 30분 내지 120분인 것인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 6시간 이하인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 5시간 이하인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 총 건조 시간이 4시간 이하인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 80% 이상인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 85% 이상인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법은 역가 회수율이 90% 이상인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a)의 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C1, C2, D, E, F, G 및 보툴리눔 혈청형(serotype)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a)의 보툴리눔 독소를 포함하는 용액은 i) 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 점증제, 현탁화제, 유화제, 착향제, 착색제 및 용해보조제로 구성된 군; ii) 염화나트륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼슘, 아세트산나트륨, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 수용액으로 구성된 군; 및 iii) 알부민, 젤라틴, 당 및 당 알코올 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 보툴리눔 독소의 진공 건조 방법.
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