WO2017061663A1 - 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조방법 - Google Patents

티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조방법 Download PDF

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WO2017061663A1
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thymosin beta
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inert gas
thymosin
beta
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이시영
강신욱
성지혜
엄태흠
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주식회사 지트리비앤티
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Definitions

  • the present invention relates to a method for the preparation of an ophthalmic eye containing thymosin beta 4.
  • the human eye is a part of the non-renewable body structure that is vulnerable to degenerative diseases such as retina, cornea, conjunctiva and uvea, eye diseases such as glaucoma and cataracts.
  • the cornea is part of the outer envelope that is exposed to the outside, which protects the eye and refracts the wavelengths coming into the eye and delivers it to the retina, but there is no structure that protects the cornea other than the eyelid. Vulnerable to trauma
  • there is no treatment for fatal damage other than the transplantation and even if the transplantation is not possible in vivo adaptation or side effects often occur.
  • eye diseases such as corneal surface damage and dry eye. Since the lens is worn by overlaying the surface of the cornea, oxygen cannot be supplied to the cornea and the tears secreted from the lacrimal glands are blocked to deepen the dryness of the cornea. Therefore, most people who wear lenses often use artificial tears or the like to relieve corneal dryness. If the cornea is intensified, treatment of the damaged cornea is essential to prevent further deepening of other eye diseases. Examples of treatment methods for corneal injury include the application of liquid drops, gels, ointments, and the like directly to the cornea.
  • eye drops of various formulation forms are important to be stably preserved to maintain activity.
  • the stability and pharmacological activity of the eye drops are influenced by the composition and content of the preparation itself, the processing conditions in the manufacturing process and distribution process.
  • the dehumidification and oxidation prevention of the preparation is very important during the manufacturing and distribution process.
  • the product is sterilized in a sealed package or colored in a glass bottle to prevent direct sunlight, and a dehumidifying agent such as silica gel is added to the product. Maintain quality.
  • quality maintenance due to seasonal temperature difference, humidity change, oxidation, etc. cannot be efficiently performed. Accordingly, there is a high demand for a formulation having excellent stability capable of keeping the pharmacological activity of the formulation constant.
  • thymosin beta 4 is the first protein found in the thymus in 1981, and is composed of 41 to 43 amino acids and has an isoelectric point of 5.1. Thymosin beta 4, first identified as an actin-sequestering molecule in animal cells by Leva et al. In 1991, has since been shown to be involved in immune regulation and the neuroendocrine system. Furthermore, thymosin beta 4 acts as a terminal deoxynucleotide transferase in thymocytes, increases macrophage migration and macrophage antigens, and luteinization by hypothalamic explants.
  • thymosin beta 4 having the pharmacological activity as described above for the treatment of eye diseases.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-2008-0033939 is the use of eye drops containing thymosin beta 4 and bactericidal activity preservatives, the composition for the treatment of eye inflammation, eye infections (bacteria, fungi or viruses) and glaucoma
  • the composition has a drawback that thymosin beta 4, which is prepared by a lyophilization method, is vulnerable to temperature change, and may be denatured by temperature change, thereby reducing pharmacological activity.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-2015-0080026 is a non-oxidizing gas after adding a pH buffer and antioxidant to an aqueous solution containing tetrahydrobiopterin (BH4) that can be administered orally, intravenous injection and food Is disclosed, and the aqueous solution is sealed in a container and formulated.
  • aqueous solution containing BH4 is made of a mixed solution containing BH4, pH buffer, antioxidant, etc., exposed to oxygen under normal atmosphere before sealing the container, it is sealed in the container in the presence of non-oxidizing gas, There is a disadvantage in that oxidation and impurities can not be blocked.
  • the present inventors are trying to prevent the denaturation of thymosin beta 4 to enhance the stability of the ophthalmic drug including the same and to maintain the pharmacological activity for a long time, using thymosin beta 4 and the same using an inert gas during ophthalmic preparation and encapsulation.
  • the present invention has been completed by confirming that it can enhance the stability of eye drops by blocking them from contacting oxygen.
  • the present invention provides a method for producing an ophthalmic ophthalmic containing thymosin beta 4 comprising the step of encapsulating a composition comprising thymosin beta 4 in a container in the presence of an inert gas.
  • the present invention provides an ophthalmic product prepared according to the above production method.
  • the preparation method of the present invention prepares eye drops containing thymosin beta 4 in the presence of an inert gas, thereby blocking the contact of thymosin beta 4 with oxygen so that thymosin beta 4 remains active without being oxidized by oxygen.
  • the ophthalmic product prepared by the preparation method of the present invention can stably maintain the pharmacological activity of thymosin beta 4 for a long time.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for preparing an eye drop containing thymosin beta 4.
  • a method for preparing an ophthalmic eye comprising thymosin beta 4 which comprises the step of encapsulating a composition comprising thymosin beta 4 in a container in the presence of an inert gas.
  • thymosin beta 4" as used herein is a protein, also referred to as Thymosin beta-4 or Tbeta 4, isolated from the original thymus and consisting of 43 amino acids of 4.9 kDa identified in various tissues. to be.
  • the protein is a protein that is up-regulated during endothelial cell migration and differentiation in vitro, with many thymosin beta 4 iso forms identified, about 70%, or about 75%, with the known amino acid sequence of thymosin beta 4 Or, at least about 80% homology.
  • the thymosin beta 4 of the present invention can be applied to the N-terminal variant of wild type thymosin beta 4, and the C-terminal variant of Tbeta 4. Specifically, it means a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • composition comprising thymosin beta 4 may be encapsulated in a container in the presence of nitrogen or argon, specifically, nitrogen gas, and may be encapsulated together by filling an inert gas so that oxygen is not enclosed in the container.
  • nitrogen or argon specifically, nitrogen gas
  • inert gas helium, neon, etc.
  • nitrogen and argon relatively inexpensive nitrogen or argon is used in consideration of cost, and nitrogen is used in detail.
  • the inert gas is more stable than oxygen or hydrogen molecules, when the composition containing the thymosin beta 4 is enclosed in the presence of an inert gas, the thymosin beta 4 is oxidized by blocking contact between the composition and oxygen in the general atmosphere. It can prevent. In addition, since the inert gas is filled together so that oxygen is not present in the container, oxidation of thymosin beta 4 can be continuously prevented and pharmacological activity can be stably maintained.
  • the container may be a conventional material used for encapsulating a medicine, and in detail, a glass container, a polypropylene container, a low density polyethylene container, or the like may be used, and more specifically, a low density polyethylene container may be used.
  • the preparation method of the eye drops of the present invention can be carried out according to the following specific process.
  • composition comprising thymosin beta 4 is prepared by mixing a solvent and thymosin beta 4 in the presence of an inert gas.
  • thymosin beta 4 is mixed with a solvent from which impurities such as purified water, pure water and sterile water for injection are removed in the presence of an inert gas such as nitrogen or argon. Specifically, thymosin beta 4 is mixed while bubbling nitrogen to the solvent at a rate of 100 mL / min to 140 mL / min to remove oxygen dissolved in the solvent.
  • the thymosin beta 4 in the mixed composition may be 0.05% (w / v) to 0.5% (w / v) based on the total composition, and may be administered in a total dose of 0.08 mL to 2.0 mL per day.
  • the composition may be administered once or several times daily, and in detail, may be administered twice to five times daily.
  • the excipient may be a conventional one that can be added in the manufacture of a pharmaceutical, and in detail, may be sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride hydrate, magnesium chloride hexahydrate, sodium acetate hydrate, sodium citrate hydrate and the like.
  • composition obtained above is adjusted to pH from 6.8 to 7.2 using acid and base.
  • the acid may be any one selected from hydrochloric acid, acetic acid, phosphoric acid, and the like, and specifically, hydrochloric acid.
  • the base may be any one base selected from sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydrogen carbonate and the like, and specifically, may be sodium hydroxide.
  • the pH adjusted composition is filtered through a filter.
  • the composition is filtered using a filter, specifically, a sterile filter having pores of 1.0 mu m or less, and more particularly, a sterile filter having pores of 0.2 mu m or less, thereby removing impurities, bacteria, and the like.
  • An eye drop containing the composition comprising thymosin beta 4 prepared by the above production method is enclosed in a pouch in the presence of an inert gas.
  • the encapsulation can be carried out in the presence of nitrogen gas so that oxygen is not enclosed together during encapsulation.
  • FIG. 1 The detailed method of preparing eye drops including thymosin beta 4 as described above is shown in FIG. 1, and all steps can be performed in the presence of an inert gas to prevent contact of thymosin beta 4 with oxygen.
  • the present invention provides an ophthalmic product comprising thymosin beta 4 prepared by the above method.
  • the preparation of the ophthalmic drug containing thymosin beta 4 by performing the whole process in the presence of an inert gas to prevent the generation of oxides or incorporation of other substances in the eye drops to maintain a constant physical and chemical properties for a long time
  • the ophthalmic product of the present invention can maintain the pharmacological activity of thymosin beta 4 for a long time in a stable state.
  • Step 1 Preparation of an Eye Drop Composition Comprising Thymosin Beta 4
  • 630 g of sterile water for injection is placed in a pressurized stainless steel agitator and cooled to 5 ° C while bubbling nitrogen at a rate of about 120 mL / min through a sparger submerged in the liquid to remove oxygen dissolved in the liquid. It was. To the cooled solution, 4.89 g of sodium chloride, 573 mg of calcium chloride, 366.72 mg of calcium chloride hydrate, 229 mg of magnesium chloride hexahydrate, 2.98 g of sodium acetate hydrate, and 1.30 g of sodium citrate hydrate were added and dissolved by stirring while maintaining 3 to 7 ° C.
  • thymosin beta 4 acetate (Bachem, USA, SEQ ID NO: 1) (purity and corrected amount of peptide) were added, and stirred at 3 ° C. to 7 ° C. to dissolve all of them. Nitrogen dosing was continued during the dissolution of each component and thymosin beta 4 to prevent contact with oxygen. Sodium hydroxide and hydrochloric acid were added to the obtained solution to adjust the pH to 7.0, and then 82 g of sterile injectable water was added to adjust the concentration of thymosin beta 4 to 1 mg / mL. The resulting mixture was subjected to sterile filtration using a 0.2 ⁇ m polyethersulfone (PES) sterile filter (product number: MCY4440EKVPH4, Pall) under nitrogen pressure to obtain a filtered solution.
  • PES polyethersulfone
  • the sterile filtration solution obtained in step 1 was placed in low density polyethylene vials of 0.27 ml each and filled with nitrogen gas. The vials were then enclosed in aluminum pouches under nitrogen backflush to prepare eye drops. The prepared eye drops were refrigerated at 2 ° C to 8 ° C.
  • Eye drops were prepared in the same manner as in Example 1, except that the steps 1 and 2 of Example 1 were carried out under a general atmosphere (with O 2 ) without using an inert gas.
  • Eye drops were prepared in the same manner as in Example 1, except that the step 1 of Example 1 was carried out under a general atmosphere (with O 2 ) without using an inert gas.
  • Test Example 1 Confirmation of the stability of the composition containing thymosin beta 4
  • thymosin beta 4 sulfoxide was synthesized with reference to the method of Eur . J. Biochem . 223, 345-350 (1994), Nature Medicine 5 (12), 1424 (1999).
  • the thymosin beta 4 sulfoxide is a substance that is oxidized and denatured by thymosin beta 4, and when the thymosin beta 4 sulfoxide is denatured, pharmacological activity changes.
  • Synthesized thymosin beta 4 sulfoxide was determined by mass spectrometry (LC / MS) using a MALDI-TOF MS instrument to confirm molecular weight.
  • the analyzed molecular weight was 4,978.5, which is consistent with the literature value of 4,980 ⁇ 2.
  • Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 The ophthalmic preparations prepared in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 and the synthesized thymosin beta 4 sulfoxide were analyzed under the same conditions by HPLC and LC / MS, and the retention time and the mass spectrometry were confirmed to be the same. It was confirmed that the single maximal impurities detected were thymosin beta 4 sulfoxide (see FIG. 2).
  • the eye drops of the examples prepared under inert gas filling maintain a higher purity than the eye drops of Comparative Examples 1 and 2 prepared by excluding inert gas in all processes and some processes. It was found to be very low.
  • the eye drops of the embodiment prepared under nitrogen filling can maintain high purity and maintain impurities similar to the original quality by blocking the generation of impurities.
  • Example 1 Comparative Example 1 Comparative Example 2 Analysis item water(%) Thymosin beta 4 sulfoxide (%) water(%) Thymosin beta4 sulfoxide (%) water(%) Thymosin beta4 sulfoxide (%) Initial value 99.10 0.29 96.30 2.90 97.90 0.70 1 month 99.43 0.57 94.76 3.30 97.20 1.20 2 months 99.35 0.65 95.56 4.00 99.00 0.90 3 months 99.39 0.61 91.81 5.90 99.00 0.80 6 months 99.28 0.72 95.18 4.00 98.10 0.90 9 months 99.27 0.65 90.30 6.40 98.80 0.90 12 months 99.09 0.81 94.43 3.90 98.30 0.90
  • the eye drops of the examples prepared under inert gas filling showed high purity and low impurity content immediately after preparation, under the conditions of 5 ⁇ 3 ° C and 25 ° C and 40% relative humidity.
  • the purity and impurity content was not large, and it was confirmed that even after 12 months, high purity and low impurity content were shown.
  • the eye drops of the comparative examples showed lower purity and higher impurity content immediately after preparation than the eye drops of the examples under conditions of 5 ⁇ 3 ° C. and 25 ° C. and a relative humidity of 40%. I could see that.
  • the eye drops of the embodiment prepared under nitrogen filling can maintain high purity for a long time by blocking the generation of impurities, and thus have excellent storage stability.

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Abstract

본 발명은 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조 방법에 따르면 불활성 기체의 존재 하에서 티모신 베타 4를 포함하는 안약을 제조함으로써, 티모신 베타 4와 산소와의 접촉을 차단해 티모신 베타 4가 산소에 의해 변성되지 않고 오랫동안 활성을 유지할 수 있도록 하므로, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 안약 제품은 티모신 베타 4의 약리적 활성을 장기간 안정적으로 유지할 수 있다.

Description

티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조방법
본 발명은 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조방법에 관한 것이다.
사람의 눈은 재생이 불가능한 신체 구조의 일부로 망막, 각막, 결막, 포도막 등에서 발생하는 변성질환, 녹내장, 백내장 등의 안질환에 취약하다. 특히, 각막은 외부로 노출되어 있는 안구 외막의 일부로서 안구를 보호하고 눈으로 들어오는 파장을 굴절시켜 망막에 전달하는 역할을 하는 중요한 구조이나, 눈꺼풀 외에는 각막을 보호하는 구조가 없어 긁힘, 충격 등의 외상에 취약하다. 또한, 치명적인 손상에는 이식 외에는 별다른 치료법이 존재하지 않고 이식을 하더라도 생체 적응이 불가능하거나 부작용을 일으키는 경우가 많다.
최근에는 시력 교정 또는 패션을 위해 렌즈를 착용하는 사람들이 늘어나면서 각막 표면 손상, 안구 건조증 등의 안질환을 겪는 사람들이 늘어나고 있다. 렌즈는 각막의 표면에 덧씌우는 방식으로 착용하기 때문에 각막에 산소 공급이 불가하며 눈물샘으로부터의 분비된 눈물이 차단되어 각막의 건조함을 심화시킨다. 따라서, 렌즈를 착용하는 사람들 대부분은 인공 눈물 등을 수시로 사용하여 각막의 건조함을 해소하려 한다. 각막의 건조함이 심화되면 이로부터 촉발되는 타 안질환으로의 심화를 예방하기 위해 손상된 각막의 치료가 필수적이다. 각막 손상 시 치료법의 예로는 액상제제, 겔제, 연고 등의 안약을 각막에 직접 도포하는 방법을 들 수 있다.
다양한 제제 형태의 안약은 우수한 약리적 활성을 갖는 것 외에도 안정적으로 보존되어 활성이 유지되는 것이 중요하다. 상기 안약의 안정성 및 약리적 활성은 제제 자체의 구성 및 함량, 제조과정, 유통 과정에서의 처리 조건에 영향을 받는다. 특히, 제조 및 유통 전 과정에서 제제의 제습, 산화 방지 등은 매우 중요한데, 이를 위해 멸균 후 밀봉 포장을 하거나 유리병에 색깔을 넣어 직사 광선을 막고, 실리카겔과 같은 제습제를 넣는 등의 방법으로 제품의 품질을 유지하고 있다. 그러나, 상기 다양한 방법으로도 계절적 온도 차이, 습도 변화, 산화 등에 따른 품질 유지는 효율적으로 이루어지지 못한다. 이에, 제제의 약리적 활성을 일정하게 유지할 수 있는 우수한 안정성을 갖는 제제에 대한 요구가 높아지고 있다.
한편, 티모신 베타 4는 1981년에 흉선에서 처음으로 발견된 단백질로서, 41 ~ 43 개의 아미노산으로 이루어져 있고, 등전점(isoelectric point)이 5.1인 단백질이다. 1991년 리바 등에 의해 동물 세포에서 액틴-격리 분자(actin-sequestering molecule)로 처음 밝혀진 티모신 베타 4는, 이후 면역 조절(immune regulation), 및 신경내분비계(neuroendocrine system)에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. 나아가, 티모신 베타 4는 흉선 세포(thymocytes)에서 말단전달효소(terminal deoxynucleotide transferase)로서 작용할 뿐만 아니라, 대식 세포의 이동 및 대식 세포의 항원을 증가시키고, 시상하부 이식편(hypothalamic explants)에 의한 황체화 호르몬(luteinizing hormone)의 분비를 증가시키는 것으로도 알려져 있으며, 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside)의 독성을 제거하고, 내피(endothelium)의 부착과 이동을 증가시키기 위하여 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cells)의 세포 주기(cell cycle)를 억제하는 것으로도 알려져 있다.
이에, 상술한 바와 같은 약리적 활성을 갖는 티모신 베타 4를 안질환 치료에 사용하기 위한 연구가 진행되었다. 일례로 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0033939호는 티모신 베타 4와 살균 활성 보존제를 포함하는 점안액의 용도로서 눈의 염증, 눈의 감염증(세균, 진균 또는 바이러스) 및 녹내장의 치료용 조성물이 개시되어 있으나, 상기 조성물은 동결 건조 방식으로 제조되어 온도 변화에 취약한 티모신 베타 4가 온도 변화에 의해 변성되어 약리적 활성이 감소할 수 있다는 단점이 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2015-0080026호는 경구투여, 정맥주사 및 음식과 함께 투여될 수 있는 테트라하이드로바이오프테린(BH4)을 포함하는 수용액에 pH 버퍼 및 항산화제를 부가한 후 비산화성 가스를 살포하고, 상기 수용액을 용기에 밀봉하여 제제화시키는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 BH4를 포함하는 수용액은 용기 밀봉 전 일반 대기 하에서 산소에 노출된 채 BH4, pH 버퍼, 항산화제 등을 포함하는 혼합액으로 제조된 후 비산화성 가스 존재 하에 용기에 밀봉되므로, 이전 혼합 단계에서의 산화 및 불순물 혼입 등을 차단할 수 없다는 단점이 있다.
이에 본 발명자는 티모신 베타 4의 변성을 막아 이를 포함하는 안약의 안정성을 증진시키고 약리적 활성을 장기간 일정하게 유지시키기 위해 노력하던 중, 안약 제조 및 봉입 시 불활성 기체를 사용하여 티모신 베타 4 및 이를 포함하는 안약이 산소와 접촉하지 못하도록 차단함으로써 안약의 안정성을 증진시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 안정성이 증진된 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 티모신 베타 4 를 포함하는 조성물을 불활성 기체의 존재 하에서 용기에 봉입하는 단계를 포함하는, 티모신 베타 4 를 포함하는 안약의 제조 방법을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 제조 방법에 따라 제조된 안약 제품을 제공한다.
본 발명의 제조 방법은 불활성 기체의 존재 하에서 티모신 베타 4를 포함하는 안약을 제조함으로써, 티모신 베타 4와 산소와의 접촉을 차단해 티모신 베타 4가 산소에 의해 산화되지 않고 오랫동안 활성을 유지할 수 있도록 하므로, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 안약 제품은 티모신 베타 4의 약리적 활성을 장기간 안정적으로 유지할 수 있다.
도 1은 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 티모신 베타 4 술폭사이드의 질량분석 그래프이다.
본 발명에서는, 티모신 베타 4를 포함하는 조성물을 불활성 기체의 존재 하에서 용기에 봉입하는 단계를 포함하는, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어인 "티모신 베타 4"는 Thymosin beta-4 또는 T베타 4로 지칭되기도 하는 단백질로서, 최초 흉선으로부터 단리되었고, 여러 조직들에서 식별된 4.9 kDa의 43개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다. 상기 단백질은 시험관 내 내피 세포 이동 및 분화 중에 상향-조절되는 단백질로서, 많은 티모신 베타 4 이소(iso) 형태들이 확인되었으며, 티모신 베타 4의 공지된 아미노산 서열과 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80% 이상의 상동성을 갖는다. 본 발명의 티모신 베타 4는 야생형의 티모신 베타 4의 N-말단 변종, 및 T베타 4의 C-말단 변종에 적용될 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다.
상기 티모신 베타 4를 포함하는 조성물은 질소 또는 아르곤, 자세하게는 질소 기체의 존재 하에서 용기에 봉입될 수 있으며, 봉입 시 용기에 산소가 봉입되지 않도록 불활성 기체를 충전하여 함께 봉입될 수도 있다. 상기 불활성 기체로는 질소, 아르곤 외에도 헬륨, 네온 등도 사용할 수 있으나, 비용 측면을 고려하여 상대적으로 저렴한 질소 또는 아르곤이 많이 사용되고, 자세하게는 질소가 많이 사용된다.
상기 불활성 기체는 산소나 수소 분자에 비해 안정적이므로 불활성 기체 존재 하에서 상기 티모신 베타 4를 포함하는 조성물을 봉입할 경우, 상기 조성물과 일반 대기 중의 산소의 접촉을 차단해 티모신 베타 4가 산화되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 봉입 시 불활성 기체가 함께 충전되어 용기 내에 산소가 존재하지 않게 되므로, 티모신 베타 4의 산화가 지속적으로 방지되고 약리적 활성이 안정적으로 지속될 수 있다.
상기 용기로는 의약품 봉입 시 사용되는 통상적인 소재의 것을 사용할 수 있으며, 자세하게는 유리 용기, 폴리프로필렌 용기, 저밀도 폴리에틸렌 용기 등을 사용할 수 있고, 보다 자세하게는 저밀도 폴리에틸렌 용기를 사용할 수 있다.
본 발명의 안약의 제조 방법은 다음과 같은 구체적인 공정에 따라 수행될 수 있다.
먼저, 불활성 기체의 존재 하에서 용매와 티모신 베타 4를 혼합하여 티모신 베타 4를 포함하는 조성물을 제조한다.
먼저, 질소 또는 아르곤 등의 불활성 기체의 존재 하에서 정제수, 순수, 멸균 주사용수 등의 불순물을 제거한 용매와 티모신 베타 4를 혼합한다. 구체적으로, 상기 용매에 100 mL/min 내지 140 mL/min의 속도로 질소를 투입(bubbling)하여 용매 내에 용해된 산소를 제거하면서 티모신 베타 4를 혼합한다. 상기 혼합된 조성물 내의 티모신 베타 4는 총 조성물 기준으로 0.05 %(w/v) 내지 0.5 %(w/v)일 수 있고, 일일 총 0.08 mL 내지 2.0 mL의 용량으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 일일 1회 또는 수회에 나누어 투여될 수 있으며, 자세하게는 일일 2회 내지 5회에 걸쳐 투여될 수 있다.
상기 혼합물에는 약학적으로 허용되는 부형제를 첨가할 수 있다. 상기 부형제는 의약품 제조 시 첨가될 수 있는 통상적인 것일 수 있으며, 자세하게는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘수화물, 염화마그네슘육수화물, 아세트산나트륨수화물, 시트르산나트륨수화물 등일 수 있다.
또한, 상기에서 얻어진 조성물을 산 및 염기를 이용하여 pH를 6.8 내지 7.2로 조절한다. 상기 산은 염산, 아세트산, 인산 등에서 선택된 어느 하나의 산일 수 있으며, 자세하게는 염산일 수 있다. 상기 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산수소나트륨 등에서 선택된 어느 하나의 염기일 수 있으며, 자세하게는 수산화나트륨일 수 있다.
다음으로, 상기 pH 조절된 조성물을 필터를 통해 여과한다. 상기 조성물을 필터, 자세하게는 1.0 ㎛ 이하의 공극을 갖는 무균 필터, 보다 자세하게는 0.2 ㎛ 이하의 공극을 갖는 무균 필터를 사용하여 여과함으로써 불순물, 세균 등을 제거할 수 있다.
상기 제조 방법에 의해 제조된 티모신 베타 4를 포함하는 조성물이 봉입된 안약을 불활성 기체의 존재 하에서 파우치에 봉입한다. 봉입 시 산소가 함께 봉입되지 않도록, 질소 기체의 존재 하에서 봉입을 수행할 수 있다.
상술한 바와 같은 티모신 베타 4를 포함하는 안약 제조의 세부적인 방법은 도 1에 나타낸 바와 같으며, 모든 단계를 불활성 기체의 존재 하에서 수행하여 티모신 베타 4와 산소의 접촉을 방지할 수 있다.
본 발명에서는 상기 제조 방법에 의해 제조된 티모신 베타 4를 포함하는 안약 제품을 제공한다. 이 때, 상기 티모신 베타 4를 함유하는 안약의 제조 시 전 과정을 불활성 기체의 존재 하에서 수행함으로써 안약 내 산화물 발생 또는 타 이물질의 혼입을 방지하여 물리·화학적 성질을 장기간 일정하게 유지할 수 있게 되므로, 본 발명의 안약 제품은 안정한 상태로 장기간 티모신 베타 4의 약리적 활성을 유지할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예 등을 들어 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 : 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조
단계 1 : 티모신 베타 4를 포함한 안약 조성물의 제조
멸균 주사용수 630g을 가압이 가능한 스테인리스스틸 교반조에 넣고 5℃로 냉각하면서 액 중에 잠긴 스파저(sparger)를 통해 질소를 약 120 mL/min의 속도로 투입(bubbling)하여 액에 용해된 산소를 제거하였다. 냉각된 액에 염화나트륨 4.89g, 염화칼슘 573mg, 염화칼슘수화물 366.72mg, 염화마그네슘육수화물 229mg, 아세트산나트륨수화물 2.98g, 및 시트르산나트륨수화물 1.30g을 첨가하고 3 내지 7℃를 유지하면서 교반하여 용해시켰다. 얻어진 용액에 티모신 베타 4 초산염(Bachem 사, 미국, 서열번호 1) 764 mg(순도 및 펩타이드 보정한 양)을 첨가하고 3℃ 내지 7℃에서 교반하여 모두 용해시켰다. 각 성분들 및 티모신 베타 4의 용해 과정 중 질소 투입을 계속하여 산소와의 접촉을 방지하였다. 얻어진 용액에 수산화나트륨 및 염산을 넣어 pH를 7.0으로 조정한 후, 멸균 주사용수 82g을 투입하여 티모신 베타 4의 농도가 1 mg/mL이 되도록 조정하였다. 얻어진 혼합물을 질소 가압 하에 0.2 ㎛ 폴리에테르설폰(PES) 무균필터(제품번호: MCY4440EKVPH4, Pall 사)를 이용하여 무균여과(sterile filtration)를 수행하여 여과된 용액을 수득하였다.
단계 2 : 안약 조성물의 봉입단계
단계 1에서 수득한 무균여과 용액을 저밀도 폴리에틸렌 바이알(vial)에 0.27 ml씩 넣고, 질소 가스를 충전하여 봉입하였다. 그 후, 바이알을 질소 백플러쉬 하에서 알루미늄 파우치에 봉입하여 안약을 제조하였다. 상기 제조된 안약은 2℃ 내지 8℃에서 냉장보관하였다.
비교예 1 : 불활성 기체를 배제한 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 - (1)
실시예 1의 단계 1 및 2에서 불활성 기체를 사용하지 않고 일반 대기 하(O2 존재)에서 진행한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 안약을 제조하였다.
비교예 2 : 불활성 기체를 배제한 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 - (2)
실시예 1의 단계 1에서 불활성 기체를 사용하지 않고 일반 대기 하(O2 존재)에서 진행한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 안약을 제조하였다.
시험예 1. 티모신 베타 4를 포함한 조성물의 안정성 확인
(1) 순도 분석
상기 실시예 및 비교예에서 제조된 안약에 대해 제조 직후부터 12개월 경과한 시점까지의 약물의 순도 변화를 하기 표 1 및 2와 같은 조건 하에서 고속액체크로마토그래피(HPLC) Agilent 1200 기기를 사용하여 HPLC로 측정하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
HPLC운용조건 칼럼 Waters Delta-Pak C18 5㎛(3.9 X 150 mm)
이동상 A : 0.1부피% 트리플루오로 아세트산(TFA)을 포함하는 물,B : 0.1부피% 트리플루오로 아세트산(TFA)을 포함하는 아세토니트릴
이동상유량 1.0 mL/min
검출 UV 205 nm
칼럼온도 상온
주입량 순도시험 10μL, 불순물시험 100μL
시간에 따른 농도구배(분) A(부피%) B(부피%)
0.0 85 15
15.0 75 25
15.1 20 80
17.0 20 80
17.1 85 15
(2) 불순물 분석
상기 실시예 및 비교예에서 제조된 안약의 불순물의 함량을 다음과 같이 측정하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구체적으로, 문헌(Eur . J. Biochem. 223, 345-350 (1994), Nature Medicine 5(12), 1424 (1999))의 방법을 참고하여 티모신 베타 4 술폭사이드를 합성하였다. 티모신 베타 4 술폭사이드는 티모신 베타 4가 산화되어 변성된 물질로, 티모신 베타 4 술폭사이드로 변성되면 약리적 활성에 변화가 생긴다.
합성된 티모신 베타 4 술폭사이드는 MALDI-TOF MS 기기를 사용해 질량분석(LC/MS)하여 분자량을 확인하였다. 분석된 분자량은 4,978.5로 문헌의 값 4,980±2와 부합하였다.
실시예 1과 비교예 1 및 2에서 제조한 안약과 합성된 티모신 베타 4 술폭사이드를 HPLC와 LC/MS로 동일한 조건에서 분석하고, 머무름 시간(retention time)과 질량분석 값이 동일함을 확인하여 검출된 단일최대불순물이 티모신 베타 4 술폭사이드임을 확인하였다(도 2 참조).
티모신베타 4(원료) 실시예1 비교예1 비교예2
분석항목 순도(%) 단일최대불순물(%) 순도(%) 단일최대불순물(%) 순도(%) 단일최대불순물(%) 순도(%) 단일최대불순물(%)
99.3 불검출 99.1 0.29 96.3 2.9 97.9 0.7
상기 표 3의 결과로부터, 불활성 기체 충전 하에 제조된 실시예의 안약은 제조 전 과정 및 일부 과정에서 불활성 기체를 배제하고 제조된 비교예 1 및 2의 안약보다 높은 순도를 유지하고 있으며, 불순물의 함량이 매우 낮은 것을 확인하였다. 이에, 질소 충전 하에 제조된 실시예의 안약은 높은 순도를 유지하며 불순물의 발생을 차단해 원래의 품질과 유사한 품질을 유지할 수 있음을 알 수 있다.
(3) 저장 안정성 평가
상기 실시예 및 비교예에서 제조된 안약에 대하여 5±3℃(냉장보관) 및 25℃, 상대습도 40%에서 각각 12개월 동안 저장한 후, 약물의 순도 및 불순물(티모신 베타 4 술폭사이드) 변화를 시험예 (1) 및 (2)와 같은 방법으로 측정하여 그 결과를 하기 표 4 및 5에 나타내었다.
5±3℃,(냉장보관) 실시예 1 비교예 1 비교예 2
분석항목 순도(%) 티모신 베타4술폭사이드(%) 순도(%) 티모신 베타4 술폭사이드(%) 순도(%) 티모신 베타4 술폭사이드(%)
초기값 99.10 0.29 96.30 2.90 97.90 0.70
1개월 99.43 0.57 94.76 3.30 97.20 1.20
2 개월 99.35 0.65 95.56 4.00 99.00 0.90
3 개월 99.39 0.61 91.81 5.90 99.00 0.80
6 개월 99.28 0.72 95.18 4.00 98.10 0.90
9 개월 99.27 0.65 90.30 6.40 98.80 0.90
12 개월 99.09 0.81 94.43 3.90 98.30 0.90
25℃,상대습도 40% 실시예 1 비교예 1 비교예 2
분석항목 순도(%) 티모신 베타4 술폭사이드(%) 순도(%) 티모신 베타4 술폭사이드(%) 순도(%) 티모신 베타4 술폭사이드(%)
초기값 99.10 0.29 96.30 2.90 97.90 0.70
1개월 97.76 0.77 93.60 5.40 97.70 1.30
2 개월 96.72 0.72 90.10 5.70 95.00 1.70
3 개월 95.75 0.83 87.60 5.70 93.50 1.30
6 개월 94.38 0.99 84.70 4.50 86.30 1.60
9 개월 93.69 1.21 - - 81.60 2.00
12 개월 91.98 1.32 - - - -
상기 표 4 및 5의 결과로부터, 불활성 기체 충전 하에 제조된 실시예의 안약은 5±3℃ 및 25℃, 상대습도 40%의 조건에서 모두, 제조 직후 높은 순도 및 낮은 불순물 함량을 나타내었으며, 시간 경과에 따라 순도 및 불순물 함량의 변화가 크지 않아 12개월 경과 후에도 높은 순도 및 낮은 불순물 함량을 보이고 있음을 확인하였다. 특히, 5±3℃ 조건에서는 12개월이 경과한 후에도 99%이상의 높은 순도 및 1% 미만이 낮은 불순물 함량을 나타내었다. 반면 비교예의 안약은 5±3℃ 및 25℃, 상대습도 40%의 조건에서 모두 실시예의 안약보다 제조 직후 낮은 순도 및 높은 불순물 함량을 보였으며, 시간 경과에 따라 순도가 감소하며 불순물이 증가하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 질소 충전 하에 제조된 실시예의 안약은 불순물의 발생을 차단하여 오랫동안 높은 순도를 유지할 수 있어 저장 안정성이 우수한 것을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 티모신 베타 4를 포함하는 조성물을 불활성 기체의 존재 하에서 용기에 봉입하는 단계를 포함하는, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 불활성 기체가 질소 또는 아르곤인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 티모신 베타 4의 함량이 0.05 %(w/v) 내지 0.5 %(w/v)인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 용기가 유리 용기, 폴리프로필렌 용기 및 저밀도 폴리에틸렌 용기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용기인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 티모신 베타 4를 포함하는 조성물이 불활성 기체의 존재 하에서 용매와 티모신 베타 4를 혼합하여 제조된 것인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 티모신 베타 4를 포함하는 조성물의 pH가 6.8 내지 7.2인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조성물의 pH가 염산, 아세트산 및 인산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 산을 사용하여 조절되는 것인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 조성물의 pH가 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 탄산수소나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기를 사용하여 조절되는 것인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 티모신 베타 4를 포함하는 조성물이 필터를 통과하여 여과되는 단계를 거쳐 수득되는 것인, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 봉입된 용기를 불활성 기체의 존재 하에서 파우치에 봉입하는 단계를 더 포함하는, 티모신 베타 4를 포함하는 안약의 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 안약 제품.
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