ES2288118B1 - Procedimiento para sintetizar timosinas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables mediante la síntesis en fase sólida sobre soportes poliméricos que comprende las etapas de sintetizar linealmente los péptidos derivados de timus en fase sólida, incorporar al menos una Thr o Ser en forma de dipéptido de pseudoprolina en la secuencia, obtener las timosinas mediante el tratamiento de peptidil-resina con ácido trifluoroacético, y purificar las timosinas por RP-HPLC. La presente invención protege también el compuesto aislado y/o purificado obtenido por dicho procedimiento así como el uso del mismo en la preparación de un medicamento.
Description
Procedimiento para sintetizar timosinas.
Esta invención está dentro del campo de la
química biomédica. En particular, la invención se refiere a un
nuevo procedimiento de síntesis química de timosinas mediante
síntesis de péptidos en fase sólida con un rendimiento y pureza
elevados. El procedimiento se basa en la incorporación de derivados
de pseudoprolina en posiciones clave de las secuencias de las
timosinas. El ciclo oxazolidina de la pseudoprolina impide la
estructuración de la cadena peptídica creciente anclada a la
resina, evitando la agregación de la peptidil resina y el colapso de
la síntesis durante la elongación de la secuencia peptídica.
Las timosinas son una familia de polipéptidos
bioquímica y funcionalmente diferentes con importantes funciones
fisiológicas. Descritas por primera vez en 1966 y originariamente
aisladas en el timo, han sido identificadas posteriormente en
diversos tejidos y células [Goldstein, A.L., Slater, F.D.,
White, A., Preparation and partial purification of a thymic
lymphocytopoietic factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1966, 56 (3),
1010-1017].
Existen diferentes familias de timosinas que
desempeñan funciones distintas, por ejemplo las
\alpha-timosinas, que tienen localización nuclear
y están implicadas en replicación y/o transcripción de DNA y las
\beta-timosinas, que se localizan en el
citoplasma y muestran una gran afinidad por G-actina
en procesos implicados en motilidad celular. Las \alpha- y
\beta-timosinas juegan un importante papel en la
regulación de la respuesta inmune, biología vascular y patogénesis
del cáncer, presentando un gran potencial terapéutico además de su
aplicación en diagnóstico como marcadores moleculares [Goldstein
Al.; Badamchian M., Thymosins: chemistry and biological properties
in health and disease, Expert Opin. Biol. Therapy, 4 (4),
559-573].
La subfamilia de las
\alpha-timosinas está compuesta por
\alpha-paratimosina,
\alpha-protimosina,
\alpha1-timosina y
\alpha11-timosina. La más importante es la
\alpha1-timosina o timalfasina, originariamente
aislada de tejido tímico, es un péptido de 28 aminoácidos, acilado
en posición N-terminal y con un grupo ácido en su
extremo C-terminal, derivado del precursor
\alpha1-protimosina con 111 aminoácidos. Debido a
sus propiedades inmunoreguladoras,
\alpha1-timosina ha sido utilizada para el
tratamiento de enfermedades en las que el sistema inmunitario está
afectado; principalmente en hepatitis B, C y carcinoma hepático. La
hepatitis B crónica es una enfermedad relacionada con una
disfunción del sistema inmune, conlleva un alto riesgo de padecer
cirrosis y carcinoma hepatocelular. La
\alpha1-timosina actúa como modulador del sistema
inmunitario activando la producción de células NK en varios modelos
animales y humanos e incrementado la producción de células CD3, CD4
y CD8 en enfermos con hepatitis crónica B y cáncer. Activa también
la producción de citoquinas Th1, relacionadas con una fuerte
respuesta inmune antiviral.
Numerosos modelos celulares in vitro
avalan el potencial terapéutico de la
\alpha1-timosina. El tratamiento con
\alpha1-timosina reduce la replicación del
VIH-1 y del virus parainfluenza en cultivos
celulares primarios [Colledge, D., Wang, Y. Tuthill C.;
Locarnini, S. Antiviral effects of thymosin alpha 1 versus
leukocytic interferon in primary cultures of duck hepatocytes
persistently infected with duck HBV in vitro, Second
international conference on therapies for viral hepatitis, 1997;
Kona, Hawai; Palamara, A. Bue M., Savini, P., Thymosin alpha 1
inhibits Sendai virus replication: involvement of intracellular
redox state, 6^{th} International Expert Forum of Immunotherapy
and Gene Therapy; May 1998, Florence, Italy]. Además reduce el
estrés oxidativo aumentando los niveles de glutación intracelular
cuya baja concentración en pacientes con el VIH está relacionada
con un bajo índice de supervivencia [Giuliani, C., Napolitano,
G., Mastino, A., Thymosin alpha-1 regulates MHC
class I expression in FRTL-5 cells at
transcriptional level, Eur. J. Immunol. 2000, 30,
778-786]. La \alpha1-timosina
aumenta los niveles de expresión de MHC clase 1 en cultivos
celulares, manteniendo la capacidad del sistema inmune para
responder a agentes infecciosos [Herzenberg, L.A.; De Rosa, S.
C.; Dubs, J.G., Glutathione deficiency is associated with impaired
survival in HIV disease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94,
1967-1972].
En modelos animales de infección, el potencial
terapéutico de \alpha1-timosina ha sido puesto de
manifiesto en ratones infectados con varios patógenos (Listeria
monocitogenes, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa y Serratia
marcescens) y en ratones inmunodeprimidos con
5-fluorouracilo [Ishitsuka, H; Umeda, Y.
Nakamura, J. Yagi, Y. Protective activity of thymosin against
opportunistic infections in animal models. Cancer Immunol.
Immunother. 1983, 14, 145-150]. Así, en estudios
con modelos animales de hepatitis B crónica (woodchuck hepatitis
virus) en los que los animales siguieron un tratamiento con
\alpha1-timosina, la concentración del virus en
suero fue reducida en un 99% [Gerin, J.L., Korba, B.E., Cote
P.J., Tennant, B.C., A preliminary report of a controlled study of
thymosin alpha 1 in the woodchuck model of hepanavirus infection.
In: Block T., ed. Innovations in antiviral development and the
detection of virus infection. Philadelphia, Pa: Jefferson Medical;
1992,121-123; Tennant, B.V., Korba, B.E., Baldwin
B.H., Goddard, L.A., Hornbuckle W. E., Cote, P.J., Treatment of
chronic woodchuck hepatitis virus infection with thymosin
alpha-1 (TA1). Antiviral Res. 1993; 20 (suppl 1),
1634], disminuyendo dicho tratamiento el riesgo de muerte por
carcinoma hepatocelular. Asimismo \alpha1-timosina
aumenta la supervivencia de animales adultos o inmunodeprimidos
infectados con el virus herpes simple, el virus influenza o
Candida albicans [Effros, R.B., Casillas, A., Wadlford, R.L., The
effect of thymosin alpha 1 on immunity to influenza in aged mice.
Aging: immunology and infectious disease. Vol 1. New York, N.Y:
Mary Ann Liebert, Inc; 1988; 31-40; Bistoni, F.,
Marconi, P., Frati, L., Bonmassar, E., Garaci, E. Increase of mouse
resistance to candida albicans infection by thymosin alpha1.
Infect. Immun. 1982, 36, 609-614].
El efecto sinérgico de
\alpha1-timosina con otras citoquinas en el
tratamiento de la hepatitis C ha sido puesto de manifiesto en
ensayos con ratones infectados con el virus influenza A tratados
con una combinación de \alpha1-timosina,
interferón IFN\alpha/\beta y el antiviral amantadina. La
combinación de los tres compuestos mejora sustancialmente el
porcentaje de supervivencia [D'Agostini C., Palamara, A. T.,
Favalli, C. Efficacy of combination therapy with amantadine,
thymosin alpha 1 and alpha/beta interferon in mice infected with
influenza A virus. Int. J. Immunopharmacol. 1996, 16,
95-102].
Un estudio en el que se estudió comparativamente
el efecto del tratamiento con \alpha1-timosina o
interferón IFN\alpha-2b en pacientes difíciles de
tratar con un mutante del virus de la hepatitis B muestra casi el
doble de eficacia en eliminación del virus con
\alpha1-timosina. En contraposición al
IFN\alpha-2b, la
\alpha1-timosina es mejor tolerada y además no
presenta efectos secundarios significativos en personas
inmunodeprimidas [Andreone, P., Cursaro, C., Gramenzi, A., A
randomized controlled trial of thymosin alpha 1 versus interferon
alpha treatment in patients with hepatitis B antigen antibody and
hepatitis B virus DNA, positive chronic hepatitis B, Hepatology,
1996, 24, 774-777]. Mientras interferón produce
una rápida respuesta durante el tratamiento, cepas resistentes del
virus provocan la recaída del paciente, la
\alpha1-timosina tiene un efecto más retardado,
relacionado con una mejora del sistema inmunitario a largo plazo
[Garaci, E., Milanese, G., Vella, S., A randomized controlled
study for the evaluation of the activity of a triple combination of
zidovudine, thymosin alpha 1 and interferon alpha in
HIV-infected individuals with CD4 counts between 200
and 500 cells/mm^{3}, Antiviral Therapy, 1998, 3,
103-11].
En modelos animales de cáncer, la
\alpha-timosina ha demostrado su eficacia en la
prevención de cáncer intestinal [Moody, T.W., Layton, J., Zia,
F., Tuthill, C., Badamchian, M. Goldstein, Al., Thymosin alpha1 is
chemopreventive for lung adenoma formation in A/J mice, Cancer
Lett. 2000, 155, 121-127], cáncer de mama,
reduciendo la incidencia de desarrollo del cáncer como resultado de
la estimulación del sistema immunitario en ratas [Moody, T.W.,
Tuthill, C., Badamchian, M., Goldstein, Al., Thymosin alpha1
inhibits mammary carcinogenesis in Fisher rats, Peptides, 2002, 23
(5), 1011-1014] y glioblastoma [Patente
WO03049697, Thymosin-alpha1 is used as an adjuvant
in combination with carmustine (BCNU) as an effective treatment for
malignant glioblastoma, Wands, J.R. De la Monte S., Rhode Island
Hospital (US), 30-06-2005]. La
terapia combinada de interferón IFN\alpha-2b,
\alpha1-timosina y ciclofosfamida ha dado buenos
resultados, reduciendo el tamaño del melanoma en ratones [Pica,
F., Fraschetti, M., Matteucci, C., Tuthill, C., Rasi, G., High
doses of thymosin alpha 1 enhance the anti-tumor
efficacy of combination chemo-immunotherapy for
murine B16 melanoma, Anticancer Res. 1998, 18,
3571-3578].
Otros dos péptidos relacionados con
\alpha1-timosina y tan potentes como ella en
infecciones de Candida albicans han sido aislados de preparaciones
de fracción 5 de timosina:
des-(25-28)-\alpha1-timosina
y \alpha11-timosina [Thymosin \alpha11: a
peptide related to thymosin \alpha1 isolated from calf thymosin
fraction 5, Calderella, J., Goodall, G.J., Felix, A. M., Heimer,
E.P., Salvin, S.B., Horecker, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80,
7424-742].
La segunda subfamilia de timosinas son las
\beta-timosinas que constituyen una familia de
proteínas (\beta-4, \beta-8,
\beta-9, \beta-10,
\beta-11, \beta-12,
\beta-15 timosinas) con una alta homología en su
secuencia peptídica (ver Tabla 1).
La tabla 1 muestra las secuencias de las
timosinas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La \beta4-timosina contiene 43
aminoácidos y se expresa en fases del desarrollo embrionario
correspondientes con el desarrollo del corazón. Este descubrimiento,
llevado a cabo en estudios preclínicos con animales, ha puesto en
relieve el potencial de \beta4-timosina para el
tratamiento de pacientes que hayan sufrido un infarto de miocardio.
En estudios preclínicos con ratones a los que se inducían ataques
cardíacos, el tratamiento con la proteína
\beta4-timosina promovía la diferenciación de las
células endoteliales y estimulaba la migración de las células
cardíacas, mejorando la capacidad de supervivencia de dichas
células [Bock-Marquette, I., Saxena, A., White,
M.D., DiMaio, J.M., Srivastava, D., Thymosin \beta4 activates
integrin-linked kinase and promotes cardiac cell
migration, survival and cardiac repair, Nature, 2004, 432,
466-472].
La \beta4-timosina regula
además una serie de citoquinas y quimioquinas inflamatorias,
controla la función de la proteína actina, uniéndose a ella, e
induce la producción de laminina-5, una proteína
necesaria para la correcta adhesión de algunos tipos de células de
mamíferos y un importante componente del proceso de reparación de
heridas, facilitando así la reepitelización e induciendo la
deposición de colágeno [Bubb, M.R., Thymosin beta 4
interactions, Vitam. Horm. 2003, 66,
297-316].
Otras posibles aplicaciones terapéuticas de la
\beta4-timosina incluyen el aumento del
crecimiento del cabello activando células madre de folículos
pilosos, denominadas "hair follicle stem cells" [Patente
WO/063775 A2, Methods and compositions for the promotion of hair
growth utilizing actin binding peptides]. También para el
tratamiento diversos tipos de indicaciones dermatológicas crónicas
como úlceras venosas crónicas "chronic venous stasis ulcers",
úlceras por presión crónicas "chronic pressure ulcers",
epidermolisis bullosa, un grupo de desórdenes hereditarios
caracterizados por la formación de ampollas en respuesta a un
trauma mecánico y tratamiento de heridas de córnea. El fragmento
LKKTETQ de la \beta4-timosina, el dominio de unión
a actina, facilita la curación de heridas dérmicas en animales
adultos [Philp D., Huff, D., Song Gho, Y; Hannappel, E.,
Kleinman, T., The actin binding site on thymosin \beta4 promotes
angiogenesis, FASEB J., 17, 2103-2105].
La \beta15-timosina es un
péptido de 44 aminoácidos sobreexpresado en cáncer de próstata,
donde favorece la diseminación del tumor fuera de la glándula
prostática. Este péptido está siendo desarrollado como biomarcador
para el diagnóstico de dicho cáncer, para la discriminación entre
los tumores benignos y malignos prostáticos y para su adecuado
tratamiento [Hutchinson, L.M., Chang, E.L., Becker, C.M.,
Ushiyama, N., Behonick, D., Shih, M. C., De Wolf, W.C., Gaston, S.
M., Zetter, B.R., Development of a sensitive and specific
enzyme-linked immunoassay for thymosin beta 15, a
urinary biomarker of human prostate cancer, Clin. Biochem. 2005, 38
(6), 558-571]. La
\beta15-timosina también ha sido patentada para su
utilización en regeneración y cicatrización de heridas pudiendo ser
aplicada para esta indicación en un futuro próximo [Patente
CN1579539, Thymic hormone beta 15 to promote wound healing and
generation of blood, Gan Chunyu (CN)].
La \beta10-timosina está
constituida por 43 aminoácidos y se sobreexpresa en células
embrionarias y tumorales como adenocarcinomas de cólon [Vasile,
E., Tomita, Y., Brown, L.F., Kocher, O., Dvorak, H.F., Differential
expression of thymosin \beta-10 by early passage
and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF:
evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of
atherosclerosis, FASEB J., 2001, 15, 458-466].
La \beta10-timosina presenta una gran homología
con la \beta4-timosina ya que ambas se unen a la
actina e inhiben su polimerización [Yu, F.X., Lin, S.C.,
Morrison-Bogorad, M., Atkinson, M.A., Yin, H.L.,
Thymosin beta 10 and thymosin beta 4 are both actin monomer
sequestering proteins, J. Biol. Chem., 1993, 268 (1),
502-509]. Recientes resultados relacionados con
la unión de la \beta10-timosina a la actina y
activación del proceso apoptótico en células de cáncer de ovario
están demostrando el potencial de la
\beta10-timosina y sus derivados en una nueva
terapia para el tratamiento del cáncer de ovarios [Rho, S.B.,
Lee, K.W., Chun, T., Lee, S-H., Park, K., Lee,
J-H., The identification of
apoptosis-related residues in human thymosin
\beta-10 by mutational analysis and computational
modelling, J. Biol. Chem., 280 (40),
34003-34007].
Ninguna de las \beta-timosinas
con potencial terapéutico ha llegado por el momento a fases
clínicas, aunque la utilización de la
\beta4-timosina y la
\beta15-timosina para el tratamiento de pacientes
que hayan sufrido un infarto de miocardio en la regeneración del
tejido dañado será próximamente presentada a la FDA para su
aplicación en fase clínica 1.
Entre las distintas
\beta-timosinas (ver Tabla 1) la
\beta4-timosina, la
\beta9-timosina y la
\beta10-timosina se encuentran en mamíferos y en
cambio la \beta4^{Xen}-timosina ha sido
identificada en anfibios (Xenopus) [Voelter, W, Kaiser, T.,
Hannappel, E., Echner, H., Synthesis of thymosin \beta4^{Xen}
and its comparison with the natural tritetraconpeptide, J. Prakt.
Chem., 1999, 341(1), 47-51] y la
\beta11- y la \beta12- en trucha (Salmo gairdneri)
[Yialouiris, P.P., Coles, B., Tsitsiloni, O., Schmid, B., Howell,
S., Aitken, A., Voelter, VV., Haritos, A.A., The complete sequences
of trout (Salmo gairdneri) thymosin \beta11 and its homologue
thymosin \beta12, Biochem. J., 1992, 283,
385-389].
La \beta8-timosina contiene 39
aminoácidos y un alto grado de homología (79%) con la
\beta4-timosina. La
\beta9-timosina tiene 41 aminoácidos y se
diferencia de la \beta9-timosina en un dipéptido
adicional en la región C-terminal, presentando un
82% de homología con la \beta4-timosina. La
\beta11-timosina con 42 aminoácidos, presenta un
78% de homología respecto a la \beta4-timosina.
La \beta12-timosina con 43 aminoácidos es 79%
homóloga a la \beta4-timosina y 84% a la
\beta11-timosina (ver Tabla 1).
El primer procedimiento sintético patentado de
timosina fue para la obtención de la \alpha1- timosina. Este
procedimiento proponía la síntesis convergente en solución de dos
fragmentos de quince (15) y trece aminoácidos (13), que previamente
habían sido sintetizados en fase sólida con la estrategia Boc/Bzl
[Patente US4148788, Synthesis of thymosin alpha 1, Hoffmann La
Roche, 1979]. Este procedimiento fue posteriormente
implementado en una estrategia realizada en solución en la que se
utilizaban siete (7) fragmentos [Patente US4504415,
Intermediates for thymosin alpha 1 and desacetyl thymosin alpha 1,
Hoffmann La Roche, 1985].
En estos procedimientos anteriormente descritos,
la estrategia utilizada para la síntesis de fragmentos en fase
sólida fue Boc/Bzl. Otra opción también utilizada fue el empleo de
un grupo protector temporal de la posición
N-terminal, el denominado Ddz [Nguyen, T.H.,
Heinzel, W, Birr, C., Ddz, a highly efficient protecting group in
large scale syntheses of thymosin-\alpha1 related
peptides, Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 19^{th}, 1987].
Otro procedimiento que también ha sido descrito
es el de la síntesis total de la \alpha1-timosina
según una estrategia lineal Boc/Bzl en fase sólida sobre una resina
MBHA, con la utilización de HBr y posteriormente
bromotrimetilsilano para escindir el péptido de la resina [Wang,
S., Wang, B.S.H., Hughes, J.L., Leopold, E.J., Wu, C.R., Tam, P.,
Cleavage and deprotection of peptides on MBHA-resin
with hydrogen bromide, Int. J. Pept. Prot. Res., 1992,
40(3-4), 344-349; Hughes,
J.L., Leopold, E.J., Cleavage and deprotection of peptides from
MBHA-resin with bromotrimethylsilane, Tetrahedron
Lett., 1993, 34(48), 7713-7716].
Por otro lado, también existe otro procedimiento
patentado de síntesis convergente en solución de fragmentos
previamente obtenidos en fase sólida que utiliza la protección
temporal Moz en lugar de Boc mejorando los rendimientos y la pureza
del producto final [Patente US5856440, Solid phase process for
synthesizing thymosin alpha1, Alpha 1 Biomedicals Inc.,
1999].
Sin embargo, el procedimiento que emplea la
estrategia ortogonal Fmoc/tBu es actualmente la más popularmente
aceptada debido a la eliminación de las etapas de trabajo con TFA
para eliminar el grupo protector temporal N-terminal
y HF para escindir el péptido de la resina. Con la estrategia
Fmoc/tBu un método propuesto de síntesis de la
\alpha1-timosina incluye el uso de cadenas
laterales protegidas y acoplamiento en solución de dos fragmentos
(1-10) y (11-28) con DCC/HOBT con un
rendimiento para las 4 últimas etapas del 30%. [Felix, A.M.,
Heimer, E.P., Wang, C.T., Lambros, T.J., Swistok, J., Roszkowski,
M., Ahmad, M., Confalone, D., Scott, J.W., Synthesis of thymosin
\alpha1 by fragment condensation using tert-butyl
side chain protection, Int. J. Pept. Prot. Res., 1985, 26 (2),
130-148]. La etapa de acoplamiento
anteriormente descrita ha sido optimizada hasta obtener un
rendimiento del 44% en TFE. Aunque el rendimiento de acoplamiento
en CHCl_{3} es del 49%, la pureza del crudo obtenido en este
último es peor [Felix, A. M., Wang, C.T., Lambros, T.J.,
Coupling of large protected peptide fragments in trifluoroethanol:
synthesis of thymosin \alpha1 Pept.: Struct. Funct., Proc. Am.
Pept. Symp., 9^{th}, 1985]. La estrategia lineal paso a paso
en fase sólida con protectores Fmoc/tBu también ha sido descrita
utilizando una resina p-benziloxicarbonilo
[Echner, H., Voelter, W., A new synthesis of thymosin \alpha1,
Liebigs Annalen der Chimie, 1988, 11,
1095-1097].
Para la obtención de
\beta4-timosina en fase sólida se han descrito dos
estrategias lineales: una estrategia Boc/Bzl [Low, T.L.K., Wang,
S.S., Goldstein, A.L., Solid-phase synthesis of
thymosin \beta4: chemical and biological characterization of the
synthetic peptide, Biochemistry, 1983, 22,
733-740] y una estrategia Fmoc/tBu [Zikos, C.,
Livaniou, E., Leondiadis, L., Ferderigos, N., Ithakissios, D.S.,
Evangelatos, G.P., Comparative evaluation of four trityl-.type
amidomethyl polystyrene resins in Fmoc solid phase peptide
synthesis, J. Pept. Sci, 2003, 9(7),
419-429]. En esta última, utilizando resinas
lábiles tipo cloro-tritilo, se obtiene la
\beta4-timosina con un rendimiento del 30%, mejor
que el obtenido con la estrategia Boc/Bzl (5-12%)
pero que puede ser mejorable desde el punto de vista industrial
(ver Tabla 2, en la que se muestra la comparativa de rendimientos
obtenidos en la síntesis de beta-timosinas).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Una variante de la
\beta4-timosina en la cual las posiciones Seri 5,
Ala40 y Ser4l de la \beta4-timosina están
reemplazadas por Ala, Thr y Ser respectivamente, es la
\beta4^{Xen}-timosina que ya ha sido
sintetizada según una estrategia lineal Fmoc/tBu, y de la que se ha
obtenido una pureza del crudo del 48-53%
[Voelter, W, Kaiser, T., Hannapel, E., Echner, H, Synthesis of
thymosin \beta4^{Xen} and its comparison with the natural
tritetraconpeptide, J. Prakt. Chem., 1999, 341, 1,
47-51].
La síntesis de la
\beta10-timosina en fase sólida ya ha sido
descrita siguiendo una estrategia de síntesis lineal, con una
resina bromo-4-cianotritilo. El
procedimiento de síntesis incluye acoplamientos prolongados durante
la noche, reacoplamientos y acetilaciones en varias posiciones
[Leondiadis, L., Vassiliadou, I., Zikos, C., Ferderigos, N.,
Livaniou, E., Ithakissios, D.S., Evangelatos, G.P.,
Solid-phase synthesis of thymosin \beta10 using a
p-cyanotrityl resin. Chemical characterization and
immunochemical control of the synthetic peptide, J. Chem. Soc.,
Perkin Trans. 1, 1996, 971-975]. La síntesis
también descrita de la \beta15-timosina se obtiene
mediante una estrategia similar, es decir, una síntesis lineal
basada en la estrategia Fmoc/tBu. Esta síntesis conduce al producto
\beta15-timosina, pero también supone
acoplamientos largos e incompletos, que incluyen un paso de
acetilación, disminuyendo la pureza del crudo obtenido
[Koutrafouri, V., Leondiadis, L., Ferderigos, N., Avgoustakis,
K., Livaniou, E., Evangelatos, G.P., Ithakissios, D.S. Synthesis
and angiogenetic activity in the chick chorioallantoic membrane
model of thymosin beta-15, Peptides, 2003, 24,
107-115]. Los rendimientos globales obtenidos
no son bajos (40% de la \beta10-timosina) y (45%
de la \beta15-timosina) aunque el procedimiento
de síntesis en previsión de una producción a gran escala necesita
ser optimizado.
En la síntesis de péptidos en fase sólida, las
interacciones hidrofóbicas de la creciente cadena peptídica
protegida dan lugar a bajos rendimientos de acoplamiento,
desprotecciones incompletas y a la obtención de productos
secundarios. El uso de pseudoprolinas introducido recientemente en
síntesis de péptidos largos es una mejora substancial para el
estado de la técnica en péptidos con una gran tendencia a
estructurarse durante la elongación de la cadena.
Las pseudoprolinas son derivados cíclicos de
Ser, Thr o Cys que sirven como grupos protectores de estos
aminoácidos (Formula I) y facilitan la síntesis de secuencias
difíciles, interrumpiendo la estructuración de la cadena peptídica
creciente aún anclada a la resina e impidiendo la agregación de la
peptidil-resina y el colapso de la síntesis
[Wöhr, T., Wahl, F., Nefzi, A., Rohwedder, B., Sato, T., Sun, X.,
Mutter, M., Pseudoprolines as a solubilizing,
structure-disrupting protection technique in peptide
synthesis, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118,
9218-9227]. Las pseudoprolinas introducen codos
en el esqueleto de la cadena peptídica siendo su utilización
especialmente interesante en la síntesis de secuencias hidrofóbicas
o péptidos largos [Abedini, A., Raleigh, D.P., Incorporation of
pseudoproline derivatives allows the facile synthesis of human
IAPP, a highly amyloidogenic and aggregation-prone
polypeptide, Organic Lett., 2005, 7(4),
693-696; White, P., Keyte, J. W., Bailey, K.,
Bloomberg, G., Expediting the Fmoc solid phase synthesis of long
peptides through the application of dimethyloxazolidine dipeptides,
J. Peptide Sci., 2004, 10, 18-26; von
Eggelkraut-Gottanka, R., Machova, Z., Grouzmann, E.,
Beck-Sickinger, A. G., Semisynthesis and
characterization of the first analogues of
pro-neuropeptide Y, ChemBioChem, 2003, 4,
425-433].
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula
I
Una vez acabada la síntesis, la regeneración de
la secuencia y estructura nativa del péptido tiene lugar mediante
el tratamiento ácido final que conlleva la escisión y desprotección
de las cadenas laterales y apertura del ciclo oxazolidina (Esquema
1).
\newpage
Esquema
I
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La tabla 3 muestra las secuencias de las
timosinas; las Ser y Thr que podrían ser sustituidas por
pseudoprolinas aparecen subrayadas.
Como se ha visto en líneas anteriores, aunque ya
se han descrito en el estado de la técnica síntesis de péptidos
largos con pseudoprolinas en el ámbito académico, las
pseudoprolinas no han sido aplicadas ni a escala industrial ni para
sintetizar timosinas, lo cual avala la novedad y la capacidad y
nivel inventivos de la presente invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}
\newpage
La presente invención describe un procedimiento
sintético nuevo para la preparación y obtención industrial de
timosinas (\alpha y \beta) usando dipéptidos pseudoprolina
protegidos en posiciones estratégicas (Ver Tabla 4). Concretamente,
el método de síntesis de timosinas propuesto en la presente
invención describe un procedimiento que consta de las siguientes
etapas:
- a)
- Síntesis lineal de los péptidos en fase sólida sobre resina aplicando la metodología Fmoc/tBu,
- b)
- Utilización de X-Thr o X-Ser, donde X es cualquier aminoácido, en forma de dipéptidos pseudoprolina en posiciones estratégicas de la secuencia según las siguientes pautas:
- b.1)
- La inserción de dipéptidos pseudoprolina no es necesaria en la posición C-terminal ni en la N-terminal,
- b.2)
- Incorporación de al menos un dipéptido pseudoprolina en la secuencia,
- b.3)
- El efecto desestabilizador de estructura de las pseudoprolinas mantiene su influencia en los siguientes 5-6 aminoácidos,
- b.4)
- La separación óptima entre dipéptidos pseudoprolina es de 5-6 aminoácidos.
- b.5)
- La separación mínima entre dos dipéptidos pseudoprolina o una pseudoprolina y una prolina es preferentemente de dos residuos,
- b.6)
- El resultado sintético es óptimo si el dipéptido pseudoprolina se encuentra en una región de residuos hidrofóbicos.
- c)
- Rotura del enlace péptido-resina, desprotección de las cadenas laterales, apertura del ciclo de pseudoprolina y obtención de timosinas mediante el tratamiento de la peptidil-resina con ácido trifluoroacético,
- d)
- En caso de existencia del aminoácido Met en la secuencia, tratamiento de destec-butilación del crudo con AcOH previo a la purificación por RP-HPLC.
La diferencia básica con respecto a otros
procedimientos sintéticos ya existentes es la incorporación
adicional en la secuencia de X-Thr y/o
X-Ser en forma de dipéptidos pseudoprolina
protegidos que conduce a la obtención del producto final con muy
buenos rendimientos y elevada pureza (ver Tabla 2), siendo la pureza
del crudo superior al 80%, pureza del producto puro superior al 99%
y rendimiento global superior al 50%.
En la tabla 3 se muestran aquellas secuencias de
las timosinas con todas las posibles posiciones para la
incorporación de dipéptidos pseudoprolina.
El objeto de la presente invención se desarrolló
porque la síntesis de péptidos largos supone un reto debido
fundamentalmente a acoplamientos y desprotecciones poco eficientes,
derivadas de los efectos de agregación también encontrados en
secuencias no muy largas pero especialmente hidrofóbicas o
repetitivas.
La presente invención pretende solucionar este
problema técnico y para ello propone un procedimiento sintético
para la obtención industrial de timosinas basado en la síntesis de
péptidos en fase sólida, que aplican la metodología Fmoc/tBu sobre
una resina tipo 2-clorotritilo, incorporando
X-Ser y X-Thr en posiciones clave
como dipéptidos pseudoprolina.
La síntesis en fase sólida de las timosinas con
una función C-terminal ácido, se lleva cabo a
partir de una resina de cloruro de 2-clorotritilo
[Barlos K., Chatzi, O., Gatos, D., Stavropoulos, G,
2-Chlorotrityl chloride resin, Int. J. Peptide
Protein Res., 1991 (37), 513-520]. Esta resina
facilita la incorporación del primer aminoácido y minimiza la
reacción secundaria de racemización. Esta resina además reduce el
riesgo de formación de dicetopiperacina en el tratamiento básico
con 20% piperidina en DMF posterior a la incorporación del segundo
aminoácido sobre la resina.
Basándose en una estrategia de síntesis lineal
Fmoc/tBu, tal y como se ha comentado en líneas anteriores, la
presente invención se caracteriza porque incorpora aminoácidos Thr
o Ser, según la secuencia peptídica, a través o mediante la adición
de dipéptidos pseudoprolina en posiciones estratégicas de la
secuencia peptídica.
La presente invención por tanto, se caracteriza
porque incorpora aminoácidos Thr o Ser, según la secuencia
peptídica, mediante la adición de dipéptidos pseudoprolina en
posiciones estratégicas de la secuencia peptídica, siguiendo las
siguientes pautas:
- a)
- La inserción de dipéptidos pseudoprolina no es necesaria en la posición C-terminal ni en la N-terminal,
- b)
- La incorporación de al menos un dipéptido pseudoprolina en la secuencia,
- c)
- El efecto desestabilizador de estructura de las pseudoprolinas mantiene su influencia en los siguientes 5-6 aminoácidos,
- d)
- La separación óptima entre dipéptidos pseudoprolina es de 5-6 aminoácidos.
- e)
- La separación mínima entre dos dipéptidos pseudoprolinas o una pseudoprolina y una prolina es preferentemente de dos residuos,
- f)
- El resultado sintético es óptimo si el dipéptido pseudoprolina se encuentra en una región de residuos hidrofóbicos.
La obtención y optimización de un proceso
sintético para la producción de timosinas a nivel industrial ha
supuesto un gran esfuerzo. Nuestro laboratorio ha abordado otras
estrategias sintéticas para la obtención de timosinas sin éxito.
Para obtener un proceso productivo rentable para la producción de
\beta4-timosina, se han estudiado tres estrategias
diferentes:
La síntesis de \beta4-timosina
ha sido abordada en una primera estrategia de síntesis convergente
en fase sólida utilizando dos fragmentos (1-27) y
(28-43)-resina. La etapa de
activación y acoplamiento en fase sólida del fragmento
1-27 protegido sobre la
peptidil-resina
28-43-resina protegida daba lugar a
geles que bloqueaban la reacción. Con esta primera aproximación el
producto final no pudo ser identificado.
Una segunda aproximación, la síntesis lineal en
fase sólida paso a paso de \beta4-timosina daba
lugar a un crudo de síntesis de baja pureza, inviable para un
proceso industrial de producción de
\beta4-timosina dada la dificultad de la etapa de
purificación y el bajo rendimiento global obtenido.
La tercera estrategia ha supuesto la resolución
de un problema, la obtención de timosinas según un proceso
competitivo a escala industrial. En la presente invención, para
obtener un proceso sintético más rentable y competitivo, se ha
incorporado la utilización de pseudoprolinas en la síntesis lineal
en fase sólida con la estrategia Fmoc/tBu. Los resultados obtenidos
en la síntesis comparativa entre la estrategia de síntesis lineal de
la \beta4-timosina y la misma estrategia
incorporando pseudoprolinas pone de manifiesto la gran ventaja que
supone la incorporación de las pseudoprolinas, ya que las
pseudoprolinas son aminoácidos no naturales derivados de Cys, Ser o
Thr con una estructura análoga a la prolina. El anillo cíclico de
oxazolidina impide la estructuración de la cadena peptídica
creciente aún anclada a la resina y bloquea la agregación de la
peptidil-resina y el colapso de la síntesis. El
tratamiento ácido final de la peptidil-resina
regenera la Ser o Thr de la secuencia nativa.
La comparación entre la segunda y la tercera
estrategia en términos de pureza del producto final se presenta en
la Figura 1, en la que se observa el cromatograma de
RP-HPLC del crudo de
\beta4-timosina obtenido siguiendo una estrategia
SPPS lineal (Figura 1A) y siguiendo la misma estrategia Fmoc/tBu
pero con la utilización de pseudoprolinas (Figura 1B). Como se
aprecia en la comparativa de ambos gráficos en la Figura 1A el
rendimiento es mucho menor que en la síntesis objeto de la presente
invención cuyo resultado se muestra en la Figura 1B.
Debemos considerar que para la síntesis lineal
convencional (Figura 1A) fue necesaria la reactivación en las
posiciones Ile (34), Thr (33), Lys (31), Ser (30), Pro (29), Leu
(28), Pro (27), Asn (26), Lys (16) Ser (15), Lys (14), Asp (13),
Phe (12), Lys (11), Glu (10), Ile (9), Glu (8), Ala (7), Met (6),
Asp (5), Pro (4), Ser (1), siendo necesario en algunos casos
reacoplar: Ile (34), Thr (33), Leu (28), Asn (26), Lys (16), Ser
(15), Asp (13), Glu (10), Ile (9), Glu (8), Met (6), Asp (5).
Por el contrario en la síntesis lineal con
pseudoprolinas (Figura 1B) sólo fue necesario reactivar en Ile (34)
y Asn (26) y reacoplar en este último, lo que indica que la adición
de pseudoprolinas en el procedimiento de síntesis mejora de forma
sustancial y sorprendente el rendimiento del procedimiento,
haciéndolo más sencillo, más ventajoso y con un rendimiento muy
superior a los procedimientos ya conocidos de síntesis de
timosinas.
Una vez completada la síntesis objeto de la
presente invención, con acetilación o no del extremo
N-terminal, según el producto, la
peptidil-resina se somete a un tratamiento final
con ácido trifluoroacético y capturadores de carbocationes para
escindir el péptido de la resina y eliminar los grupos protectores
de las cadenas laterales y la protección pseudoprolina. Finalmente
el crudo resultante se purifica por RP-HPLC y el
conjunto de fracciones puras se juntan y liofilizan, obteniéndose
los productos finales con una pureza de más del 99%, con un
rendimiento global superior al 50%.
La Figura 1 muestra el crudo de
\beta4-timosina aislado según la estrategia 2 y la
estrategia 3.
En la Tabla 2 (expuesta en líneas anteriores)
podemos observar la diferencia en rendimientos en estas estrategias
y otras anteriomente publicadas para la síntesis de
\beta-timosinas. La aproximación de síntesis
lineal en fase sólida siguiendo una estrategia Fmoc/tBu sin la
utilización de las pseudoprolinas da lugar a un crudo difícil de
purificar (Figura 1A), obteniéndose el producto con un rendimiento
muy bajo (Tabla 2). Sin embargo, la utilización de dipéptidos
pseudoprolina en una estrategia lineal Fmoc/tBu mejora notablemente
el rendimiento y la pureza del producto final. Para finalizar, y
como conclusión de lo anteriormente expuesto, el punto clave e
inventivo del procedimiento sintético reivindicado en la presente
invención se fundamenta en la utilización de dipéptidos
pseudoprolina en posiciones clave de la síntesis, siguiendo las
pautas anteriormente mencionadas, evitando secuencias que provocan
la agregación de la cadena creciente sobre la resina y eliminando
así problemas de acoplamientos y desprotecciones incompletas que
conducen a un crudo peptídico de baja calidad y por tanto a un bajo
rendimiento de síntesis, con la consecuente dificultad en el
proceso de purificación.
El éxito del proceso sintético se desarrolla
para la presente invención como un proceso competitivo para la
síntesis de las timosinas a gran escala, ya que resulta ser un
procedimiento poco costoso, rápido y con un rendimiento y pureza
superiores a los descritos en el estado de la técnica.
Las abreviaturas empleadas en la presente
descripción tienen los siguientes significados:
Ac_{2}O: Anhídrido acético.
AcOH: Ácido acético.
Boc: Terc-butoxicarbonilo.
DCM: Diclorometano.
DIEA:
N,N'-diisopropiletilamina.
DIPCDI: Diisopropilcarbodiimida.
DMF: N,N-dimetilformamida.
Fmoc:
9-Fluoroenilmetoxicarbonilo.
HF: Ácido fluorhídrico.
HOBT: N-hidroxibenzotriazol.
HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Presión.
\muL: microlitros.
\mumol: micromoles.
tBu: Terc-butilo.
TFA: Ácido trifluoroacético.
Trt: tritilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ala (A): L-Alanina
Arg (R): L-Arginina
Asn (N): L-Asparagina
Asp (D): L-Aspártico
Gin(Q): L-Glutamina
Glu (E): L-Glutámico
Gly (G): L-Glicina
Ile (I): L-Isoleucina
Leu (L): L-Leucina
Lys (K): L-Lisina
Met (M): L-Metionina
Phe (F): L-Fenilalanina
Pro (P): L-Prolina
Ser (S): L-Serina
Thr (T): L-Treonina
Tyr (Y): L-Tirosina
Val (V): L-Valina
\vskip1.000000\baselineskip
Según un primer aspecto importante, la presente
invención se refiere a un procedimiento para la obtención de
timosinas y/o sus sales farmacéuticamente aceptables mediante
síntesis en fase sólida sobre soportes poliméricos que comprende las
siguientes etapas:
- a.
- Sintetizar linealmente los péptidos derivados de timus en fase sólida sobre una resina aplicando la metodología Fmoc/tBu,
- b.
- Incorporar al menos una X-Thr y/o X-Ser en forma de dipéptidos pseudoprolina en la secuencia,
- c.
- Adicionar de forma intercalada los dipéptidos pseudoprolina con una distancia de al menos 5 aminoácidos,
- d.
- Obtener las timosinas mediante el tratamiento de peptidil-resina con ácido trifluoroacético que provoca de forma simultánea ruptura del enlace péptido-resina, desprotección de las cadenas laterales y apertura del ciclo de pseudoprolina,
- e.
- Purificar las timosinas por RP-HPLC.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables en el que se obtienen
\alpha-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente
aceptables.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables en el que se obtienen
\beta-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente
aceptables.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables en el que la síntesis se realiza sobre
soportes poliméricos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables donde en la etapa a) se utiliza una
resina de tipo cloro-tritilo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables donde en la etapa a) se utiliza una
resina de tipo pMBHA.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables donde en la etapa b) la incorporación
de Ser o Thr se lleva a cabo de forma adicional como dipéptidos
pseudoprolina y/o Ser o Thr modificadas en forma de pseudoprolina
en la peptidil-resina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables donde preferentemente la separación
mínima entre dos dipéptidos pseudoprolina o una pseudoprolina y una
prolina es de dos aminoácidos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables donde preferentemente el dipéptido
pseudoprolina se adiciona en una región de aminoácidos
hidrofóbicos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de timosinas y/o sus sales
farmacéuticamente aceptables en el que si tras la etapa d) aparece
el aminoácido Met en la secuencia se realiza adicionalmente un
tratamiento de destercbutilación del crudo con AcOH.
Según un segundo aspecto importante, la presente
invención se refiere a un compuesto aislado y/o purificado obtenido
por el procedimiento anterior que comprende una secuencia de
aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con las
secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 sobre toda su longitud.
La presente invención se refiere a un compuesto
aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior que
consiste en una secuencia aminoacídica escogida del grupo formado
por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11, por sus secuencias
complementarias y/o por sus secuencias homólogas y/o por sus
secuencias equivalentes funciona-
les.
les.
La presente invención se refiere a un compuesto
aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior que
incluye fragmentos de al menos una secuencia de aminoácidos
escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a
SEQ.ID.N.11, por sus secuencias complementarias, por sus secuencias
homólogas y por sus secuencias equivalentes funcionales.
La presente invención se refiere a un compuesto
aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior en el
que alguno de los aminoácidos comprendidos en las secuencias
SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 se selecciona del grupo formado por
L-aminoácidos, D-aminoácidos,
N-metil aminoácidos, aminoácidos no naturales,
Met-tBu o Met-oxidada.
La presente invención se refiere a un compuesto
aislado y/o purificado obtenido por el procedimiento anterior que
incluye modificaciones en el aminoácido N-terminal
seleccionadas de acilaciones y/o pegilaciones.
Según un tercer aspecto importante la presente
invención se refiere al uso del compuesto obtenido por el
procedimiento anteriormente mencionado en la preparación de un
medicamento.
La presente invención se refiere al uso del
compuesto obtenido por el procedimiento anteriormente mencionado en
la preparación de un medicamento para la regulación de la respuesta
inmune, biología vascular y patogénesis del cáncer.
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la
naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen
solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como
limitaciones a la invención que se reivindica en la presente
memoria.
La incorporación del residuo
C-terminal
Fmoc-Asn-OH sobre la resina 2
clorotritilo se realiza con un defecto de aminoácido, con la
finalidad de obtener una funcionalización de 0,85 mmol/g después de
la incorporación del primer aminoácido. Sobre 2,5 g de resina (f =
1,6 mmol/g de resina, 4 mmol) se incorporan 0,8 g de aminoácido
(2,13 mmol, 0,5 eq.). Se pesan en recipientes separados la resina y
el aminoácido y se dejan secar a vacío un mínimo de 4 horas. Se
disuelve el aminoácido en 25 mL de DCM seco (sobre tamiz de 4
\ring{A}). Se añade DIEA (0,7 mL, 1,6 mmol, 1 eq.) y se agita
durante 5 min. Se prepara un disolución 1:1 (2,8 ml) de DIEA:DCM
(1,4 mL, 3,2 mmol, 2 eq.) y se añade ala mezcla de reacción. Se
deja bajo agitación durante 40 min más y seguidamente se añaden 4 mL
de MeOH seco y se deja reaccionar 10 min, después de los cuales se
filtra la resina en un reactor de síntesis equipado con una placa
filtrante y una llave y se procede a los siguientes lavados:
| Paso | Reactivo | Repeticiones | Tiempo |
| 1 | DCM | 3 | 1 min |
| 2 | DMF | 5 | 1 min |
| 3 | 5% piperidina en DMF | 1 | 10 min |
| 4 | 20% piperidina en DMF | 1 | 15 min |
| 5 | DMF | 5 | 1 min |
La incorporación de los siguientes aminoácidos
se realiza en todos los casos con un exceso de 2,5 eq de
aminoácido, HOBT y DIPCDI respecto a la funcionalización de la
resina después de la incorporación del primer aminoácido (0,85
mmol/g). Se deja reaccionar durante 40-60 min y
posteriormente se realiza la desprotección del grupo Fmoc con 20% de
piperidina en DMF durante 5 min 2 veces y durante 10 min otras 2
veces.
El dipéptido
Fmoc-Ile-Thr(\Psi^{Me},
^{Me}pro)-OH (correspondiente a los aminoácidos
11-12 de la secuencia de la
\alpha1-timosina) fue incorporado utilizando 2,5
eq. de dipéptido, HOBT y DIPCDI, dejándolo reaccionar durante 1
h.
La eficacia del acoplamiento se controla
mediante el test de ninhidrina. Si es positivo, se reactiva
utilizando 1/3 eq. HOBT y DIPCDI y si después de la reactivación aún
es positivo, se reacopla utilizando ½ eq. de
Fmoc-AA-OH, HOBT y DIPCDI respecto a
los equivalentes utilizados en el primer acoplamiento. Si después
de reactivar, reacoplar y reactivar de nuevo el test de la
ninhidrina sigue siendo positivo, se procede a la acetilación
utilizando 2,5 eq. Ac_{2}O, y DIEA durante 15 min.
Las posiciones en que fue necesario reactivar
y/o reacoplar se detallan a continuación: Ser (1), Ser(2),
Thr(7), dipéptido pseudoprolina (11-12),
Lys(14), Leu(16), Lys(17), Glu(18),
Lys(19).
El rendimiento al final de la síntesis es
cuantitativo en la obtención de
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(\Psi^{Me,Me}pro)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn-resina.
7 g de peptidil-resina se tratan
durante 1h 30 min con 80 mL de la mezcla TFA: H_{2}O 95:5 bajo
agitación. Una vez acabada la reacción, la resina se separa del
producto por filtración y se lava con TFA. Se añade éter dietílico
(560 mL) sobre la solución de TFA y el precipitado blanco se filtra
en una placa P3 y se lava con MeOH y éter dietílico. Rendimiento de
síntesis: 40%.
ESI-MS: M teórica = 3108 g/mol,
M experimental: (m/z): [M+2H]^{+}/2=1555;
[M+3H]^{+}/3=1037, [M+4H]^{+}/4=778,
[M+5H]^{+}/5=623.
RP-HPLC analítico: Gradiente:
5-85% B en 20 min, tr =11.7 min; Isocrático: 19% B
en 30 min, tr =16,5 min (B= 0.07% TFA en acetonitrilo).
La \beta4-timosina se
sintetizó siguiendo una estrategia de síntesis peptídica en fase
sólida utilizando los protectores Fmoc/tBu. Para la incorporación
del primer aminoácido sobre la resina
2-clorotritilo (1 g, 1,6 mmol/g) se utilizaron el
aminoácido N\alpha-Fmoc-protegido
(0,5 eq) y DIEA (3 eq.) en DCM, para conseguir una funcionalización
de 0,85 mmol/g después de la incorporación del primer aminoácido.
Se deja bajo agitación magnética durante 40 min y seguidamente se
añaden 4 mL de MeOH seco y se deja reaccionar 10 min. Se filtra la
resina en un reactor de síntesis equipado con una placa filtrante y
una llave y se procede a los siguientes lavados con DCM y DMF. La
resina se trata con 5% piperidina en DMF 1 x 10 min y 20%
piperidina en DMF 1 x 15 min y se aclara con DMF. El resto de
aminoácidos fueron incorporados utilizando
N\alpha-Fmoc-protegidos (3 eq.),
HOBT (3 eq.) y DIPCDI (3 eq.) en DMF, equivalentes calculados
respecto a la funcionalización de la resina una vez incorporado el
primer aminoácido. Como grupos protectores para las cadenas
laterales se eligieron los siguientes: para Arg,
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil
(Pbf), el tert-butiloxicarbonilo (Boc) para las
cadenas laterales de Lys, Glu y Asp y el tert-butilo
para las cadenas laterales de Thr y Ser. La escisión del grupo
protector temporal Fmoc se llevó a cabo por tratamiento con una
solución de 20% piperidina en DMF (2 veces durante 5 min y 2 veces
más durante 10 min). Los dipéptidos pseudoprolina se incorporaron en
la síntesis como
Fmoc-Lys(Boc)-Ser(\PsiMe,Me
pro)-OH en lugar de los aminoácidos
14-15 y
Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(\PsiMe,Me
pro)-OH en las posiciones de los aminoácidos
21-22 y 32-33. Dichas posiciones se
eligieron entre las posibles por su disposición en la secuencia
peptídica, proximidad óptima a la posición
C-terminal, proximidad óptima a residuos Pro y
distancia óptima entre pseudoprolinas.
La eficacia del acoplamiento se controla con el
test de ninhidrina. Si es positivo, se reactiva utilizando 1/3 eq.
HOBT y DIPCDI y si después de la reactivación aún es positivo, se
reacopla utilizando ½ eq. De
Fmoc-AA-OH, HOBTy DIPCDI respecto al
primer acoplamiento. Si después de reactivar, reacoplar y reactivar
de nuevo, el test de ninhidrina sigue siendo positivo, se procede a
la acetilación utilizando 2,5 eq. Ac_{2}O, y DIEA durante 15
min.
Las posiciones en que fue necesario reactivar
fueron Ile(34) y Asn(26) y en este último también se
reacopló.
El rendimiento al final de la síntesis de
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(\Psi^{Me,Me}pro)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu
(OtBu)-Thr(\Psi^{Me,Me}pro)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(\Psi^{Me,Me}pro)-
Ile-Glu(OtBu)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-resina es cuantitativo.
(OtBu)-Thr(\Psi^{Me,Me}pro)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(\Psi^{Me,Me}pro)-
Ile-Glu(OtBu)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-resina es cuantitativo.
4,8 g de peptidil-resina se
tratan con 24 mL de la mezcla TFA: H_{2}O 95:5 durante 2 h bajo
agitación. Se filtra la suspensión y el filtrado se precipita con
éter (168 mL). El crudo se filtra en una placa P3, se lava con MeOH
y éter dietílico y se seca a vacío. El péptido se trató con una
disolución de 4% AcOH en H_{2}O durante 1h 30 min a 37°C y
posteriormente se purificó por RP-HPLC preparativo.
El producto final se caracterizó por espectrometría de masas en un
equipo ESI-MS y se analizó según especificaciones.
Pureza: 99%, Rendimiento: 50%.
ESI-MS: M teórica = 4962 g/mol,
M experimental: (m/z): [M+4H]^{+}/4 = 1242; [M+
5H]^{+}/5 = 994; [M+ 6H]^{+}/6 = 828; [M+
7H]^{+}/7 = 710.
RP-HPLC analítico: Gradiente:
5-85% B en 20 min, tr =11,6 min; Isocrático: 20% B
en 30 min, tr =19 min (B= 0.07% TFA en acetonitrilo).
El procedimiento sintético fue similar al
utilizado para la \beta4-timosina. El dipéptido
Fmoc-Lys(Boc)-Ser(\Psi^{Me,
\ Me}
pro)-OH se utilizó en sustitución de los aminoácidos 14-15, Fmoc-Asn(Trt)-Thr(\Psi^{Me, \ Me}pro)-OH en las posiciones de los aminoácidos 21-22 y Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(\Psi^{Me, \ Me}pro)-OH en las posiciones 32-33. Sólo fue necesario un reacoplamiento en la Lys(3).
pro)-OH se utilizó en sustitución de los aminoácidos 14-15, Fmoc-Asn(Trt)-Thr(\Psi^{Me, \ Me}pro)-OH en las posiciones de los aminoácidos 21-22 y Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(\Psi^{Me, \ Me}pro)-OH en las posiciones 32-33. Sólo fue necesario un reacoplamiento en la Lys(3).
La peptidil-resina
Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Thr
(tBu)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(\Psi^{Me,Me}pro)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(\Psi^{Me,Me}
pro)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Thr(tBu)-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(\Psi^{Me,Me}pro)-Ile-Gln-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Asn-Gln-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-resina se obtuvo con un rendimiento cuantitativo.
(tBu)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(\Psi^{Me,Me}pro)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(\Psi^{Me,Me}
pro)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn-Thr(tBu)-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(\Psi^{Me,Me}pro)-Ile-Gln-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Asn-Gln-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-resina se obtuvo con un rendimiento cuantitativo.
El péptido se escindió de la resina haciéndola
reaccionar con una mezcla de TFA:H_{2}O 95:5 durante l h 30 min,
se precipitó con éter dietílico y se liofilizó. El crudo se purificó
en un RP-HPLC semipreparativo y el producto final se
caracterizó por espectrometría de masas en un equipo
ESI-MS. Pureza: 98%. Rendimiento: 50%
ESI-MS: M teórica = 5173 g/mol,
M experimental: (m/z): [M+6H]^{+}/6 = 863,
[M+7H]^{+}/7 = 740, [M+8H]^{+}/8 = 648,
[M+9H]^{+}/9 = 576.
RP-HPLC analítico: Gradiente:
5-85% B en 20 min, tr =11,5 min; Isocrático: 20% B
en 30 min, tr =11.5 min (B= 0.07% TFA en acetonitrilo).
Aunque la presente invención ha sido descrita en
relación con estos casos particulares, muchas otras variaciones y
modificaciones y otros usos están relacionados con aquellos
especificados en la técnica. La presente invención de este modo no
está limitada por la revelación específica en ella misma, sino
solamente por las reivindicaciones.
Claims (17)
1. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables mediante la síntesis en
fase sólida sobre soportes poliméricos caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
- a.
- Sintetizar linealmente los péptidos derivados de timus en fase sólida sobre una resina aplicando la metodología Fmoc/tBu,
- b.
- Incorporar al menos una Thr o Ser en forma de dipéptido de pseudoprolina en la secuencia,
- c.
- Obtener las timosinas mediante el tratamiento de peptidil-resina con ácido trifluoroacético que provoca de forma simultánea la ruptura del enlace péptido-resina, desprotección de las cadenas laterales y apertura del ciclo de pseudoprolina, y;
- d.
- Purificar las timosinas por RP-HPLC.
2. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación
1 caracterizado porque se obtienen
\alpha-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente
aceptables.
3. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación
1 caracterizado porque se obtienen
\beta-timosinas y/o sus sales farmacéuticamente
aceptables.
4. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación
1 caracterizado porque la síntesis se realiza sobre soportes
poliméricos.
5. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación
1 caracterizado porque en la etapa a) se utiliza una resina
de tipo cloro-tritilo de funcionalización
0,1-2 mmol/g.
6. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación
1 caracterizado porque en la etapa a) se utiliza una resina
de tipo pMBHA de funcionalización 0,1-2 mmol/g.
7. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según la reivindicación
1 caracterizado porque en la etapa b) la incorporación de
Ser o Thr se lleva a cabo en forma de dipéptidos pseudoprolina y/o
Ser o Thr modificadas en forma de pseudoprolina en la
peptidil-resina.
8. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque preferentemente
la separación mínima entre dos dipéptidos pseudoprolina o una
pseudoprolina y una prolina es de dos aminoácidos.
9. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque preferentemente
el dipéptido pseudoprolina se adiciona en una región de aminoácidos
hidrofóbicos.
10. Procedimiento para la obtención de timosinas
y/o sus sales farmacéuticamente aceptables según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque si tras la etapa
c) aparece el aminoácido Met en la secuencia se realiza
adicionalmente un tratamiento de destec-butilación
del crudo con AcOH.
11. Compuesto aislado y/o purificado obtenido
por el procedimiento de la reivindicación 1 caracterizado
porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos
un 80% de identidad con las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11
sobre toda su longitud.
12. Compuesto aislado y/o purificado obtenido
por el procedimiento de la reivindicación 1 caracterizado
porque consiste en una secuencia de aminoácidos escogida del grupo
formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11, por sus
secuencias complementarias y/o por sus secuencias homólogas y/o por
sus secuencias equivalentes funcionales.
13. Compuesto aislado y/o purificado obtenido
por el procedimiento de la reivindicación 1 caracterizado
porque incluye fragmentos de al menos una secuencia de aminoácidos
escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a
SEQ.ID.N.11, por sus secuencias complementarias, por sus secuencias
homólogas y por sus secuencias equivalentes funcionales.
14. Compuesto aislado y/o purificado obtenido
por el procedimiento de la reivindicación 1 caracterizado
porque todos o alguno de los aminoácidos comprendidos en las
secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.11 se seleccionan del grupo formado
por L-aminoácidos, D-aminoácidos,
N-metil aminoácidos, aminoácidos no naturales,
Met-tBu o Met-oxidada.
15. Compuesto aislado y/o purificado obtenido
por el procedimiento de la reivindicación 1 caracterizado
porque incluye modificaciones en el aminoácido
N-terminal seleccionadas de acilaciones y/o
pegilaciones.
16. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15 en la preparación de un medicamento.
17. Uso del compuesto según reivindicación 16 en
la preparación de un medicamento para la regulación de la respuesta
inmune, biología vascular y patogénesis del cáncer.
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