FI101194B - Menetelmä stabiloidun, gonadotropiinia sisältävän lyofilisaatin valmis tamiseksi - Google Patents

Description

, 101194

Menetelmä stabiloidun, gonadotropiinia sisältävän lyofi-lisaatin valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä stabiloidun gonado-5 tropiinia sisältävän lyofilisaatin valmistamiseksi.

Kaupallisesti on saatavissa suhteellisen puhtaita gonadotropiinivalmisteita. Esimerkiksi koostumuksia, jotka sisältävät luonnosta johdettua ihmisen menopausaalista gonadotropiinia ("HMG") ja luonnosta johdettua ihmisen 10 koriongonadotropiinia ("HCG"), on saatavissa pakastuskui-vattuina valmisteina vastaavasti tavaramerkeillä "Humegon" ja "Pregnyl", toimittaja Organon International, bv of Oss, NL. Kantavan tamman gonadotropiinia on myös saatavissa pakastuskuivatussa muodossa samalta yhtymältä.

15 Näihin valmisteisiin lisätään tilavuutta lisäävää ainetta, esim. mannitolia, ennen lyofilisointia. Niihin ei tarvitse lisätä stabilisaattoria riittävän käyttöajan takaamiseksi. Väistämättömästi mitkä tahansa luonnolliset epäpuhtaudet, jotka jäävät jäljelle puhdistusprosessin 20 jälkeen, stabiloivat pakastuskuivatussa muodossa olevia valmisteita.

· i '·’ * Kun viime aikoina on kehitetty tehokkaampia tuotan- *...· to- ja puhdistusmenetelmiä, tiettyjen hyvin puhtaiden go-

• I I

: nadotropiinien valmisteet eivät kuitenkaan ole riittävän 25 stabiileja. Ne hajoavat suhteellisen lyhyessä ajassa me-·;··· nettäen aktiivisuuttaan. Tämän hajoamisen estämiseksi tai hidastamiseksi valmisteita on yritetty pakastuskuivata (lyofilisoida). Lyofilisointi on kuitenkin onnistunut vain osittain.

• · · I.* 30 On olemassa tarve aikaansaada gonadotropiinia si- • · · • sältävä farmaseuttinen valmiste, joka on stabiili riit- • · ’·,'·· tävän pitkän ajan tuotteen valmistamiseksi, kuljettamisek- : : si ja varastoimiseksi ennen käyttöä. Tämä tarve on erityi- <·’·< sen suuri stabiilin, useampaa kuin yhtä gonadotropiinia i 35 sisältävän valmisteen suhteen.

' Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että sekoitetaan yksi paino-osa gonadotropiinia; ja 2 101194 200 - 10 000 paino-osaa dikarboksyylihapposuola-stabilisaattoria, joka on yhdistetty mainitun gona-dotropiinin kanssa, haluttaessa liuotetaan ei-pelkistävää sokeria seok-5 seen määrä, joka on 3 - 50-kertainen painon mukaan laskettuna dikarboksyylihapposuolan määrään nähden, ja seos pakastuskuivataan yli -35 °C:n lämpötilassa, jolloin saadaan stabiloitu gonadotropiinilyofilisaatti.

"Dikarboksyyli-happo" tarkoittaa tässä käytettynä 10 orgaanista happoa, jossa on kaksi tai useampia karboksyylihapporyhmiä (esim. HOOC-R-COOH). Gonadotropiini on seoksena lyofilisoiduissa systeemeissä kulloinkin olevan stabilisaattorin kanssa, ja tämä stabilisaattori pystyy stabiloimaan gonadotropiinin ainakin osittain. Val-15 miste sisältää riittävän määrän dikarboksyylihapposuolaa gonadotropiinin stabilisoimiseksi pakastuskuivatussa muodossaan halutuksi ajaksi halutussa lämpötilassa.

Tyypillisiä dikarboksyylihapposuoloja ovat sitruunahapon, viinihapon, asparagiinihapon tai näiden happojen 20 seosten suolat. Gonadotropiini tai gonadotropiinijohdannaiset (tässä käytettynä "gonadotropiinit") ovat tavalli-’·' ' sesti proteiineja, kuten follikkelia stimuloiva hormoni (FSH) , kilpirauhasta stimuloiva hormoni (TSH) , ihmisen • V koriongonadotropiini (HCG) tai luteinisoiva hormoni (LH).

25 Valmiste voi edelleen sisältää ei-pelkistävää disak-·;·*: karidia, kuten sakkaroosia tai trehaloosia.

.*j*; Keksinnön mukaisesti oleellisen puhdas gonadotro- piini stabiloidaan lyofilisoidussa muodossa sekoittamalla gonadotropiini liuoksessa riittävän määrän kanssa dikar- • · · Γ.Ι 30 boksyylihapposuolaa proteiinin stabiloimiseksi lyofilisoi-* * * dussa muodossa, ja sen jälkeen saatu liuos pakastuskui- • · ί/.ί vataann gonadotropiinin stabiloidun lyofilisaatin muodos- tamiseksi.

Tästä lyof ilisaatista voidaan valmistaa käyttö-I", 35 muotoon saatettu injektoitava valmiste. Injektoitava val miste koostuu oleellisesti vesiliuoksesta, jonka muodostavat injektointia varten tarkoitettu vesi, gonado- 3 101194 tropiini, ei-pelkistävä sokeri, antiadsorptioaine ja di-karboksyylihapposuola.

Piirustuksissa:

Kuvio 1 on graafinen esitys, jossa kuvataan ioni-5 vahvuuden (x 1000) ja jäljellä olevan rekombinantti-FSH-aktiivisuuden välinen korrelaatio, kun valmisteita on pidetty 1 kuukausi 60 °C:ssa käyttäen erilaisia stabilisaat-toreita. Kuvio 2 on graafinen esitys, jossa kuvataan sitraatti/proteiinisuhteen (paino/paino) vaikutus jäljellä 10 olevaan HCG-aktiivisuuteen.

A. Gonadotropiinit

Edullisia gonadotropiineja ovat FSH, TSH, HCG, LH ja niiden johdannaiset ja seokset muiden proteiiniaine-osien kanssa tai niitä ilman. Follikkelia stimuloiva hor-15 moni, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, ihmisen koriongo- nadotropiini ja luteinisoiva hormoni ovat kaikki kemiallisesti läheisiä proteiineja, jotka koostuvat a- ja β-ala-yksiköistä. Näiden proteiinien α-alayksiköt ovat identtisiä tai lähes identtisiä.

20 Follikkelia stimuloiva hormoni on tavalliseen tuot tavaan toimintaan vaaditun anteriorisen aivolisäkkeen hor- • » ► ’·' * moniglykoproteiini. Follikkelia stimuloivaa hormonia on käytetty munarakkuloiden kehittymisen stimulointiin in • V vitro -hedelmöityksen aikaansaamiseksi, ja sitä on käy- *"*: 25 tetty myös kliinisesti follikkelin kypsymisen stimuloin- *:··· tiin anovulatorisissa naisissa, joilla on krooninen anovu- latorinen oireyhtymä tai keltarauhasvaihevajavuus. Follik-keliä stimuloiva hormoni voidaan ainakin osittain eristää • · luonnollisista lähteistä, kuten ihmisen virtsasta. Rekom- ti» · • · · ’.I 3 0 binantti follikkelia stimuloiva hormoni ja/tai LH voidaan • · · • · · valmistaa kuten on kuvattu julkaisussa Keene et ai "Expre- • · ϊ.*·· ssion of Biologically Active Human Follitropin in Chinese

Hamster Ovary Cells", The Journal of Biological Chemistry,

Vol. 264, s. 4769 - 4775 (maaliskuun 25. 1989), jonka jul-35 kaisun sisältö sisällytetään tähän viittauksella. Tässä ' ' käytettynä gonadotropiini, esimerkiksi follikkelia stimu loiva hormoni (FSH), käsittää yhdisteen analogit ja sen 4 101194 rekombinantit, luonnolliset, deglykosyloidut, glykolysoi-mattomat, modifioidut glykosyloidut ja muut muodot.

Edullisin gonadotropiini on FSH, jota valmistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikalla (rFSH) joko sellaisenaan tai 5 lyofilisaattina LH:n tai HCG:n kanssa. Luonnollisista lähteistä puhdistettu FSH on yleensä vain osittain puhdistettua. Epäpuhtaudet näyttävät jollakin tavoin stabiloivan sitä. rFSH:ssa ei kuitenkaan ole läsnä epäpuhtauksia, ja siten FSH on alttiimpi nopealle hajoamiselle ja pakastus-10 kuivaushäviöille. FSH-annokset ovat välillä 60 - 1500, erityisesti 75 - 225 IU lyofilisaattiampullia kohti.

Kyseessä olevaa käytettävää gonadotropiinia on lyo-filisaattivalmisteissa riittävä määrä proteiinin terapeuttisesti käyttökelpoisen pitoisuuden aikaansaamiseksi lai-15 mennuksen jälkeen, yleensä parenteraalista (esim. ihonalaisesti tai laskimonsisäisesti) antamista varten, ja vesipitoista liuosta (esim. tislattua vettä injektointia varten tai steriiliä tavallista suolaliuosta) on määrätty määrä käyttöön aiotun valmisteen tilavuuden aikaansaami-20 seksi. Tässä käytettynä vesipitoinen liuos on liuos, joka sisältää vettä ensisijaisesti, mutta ei välttämättä pel-'·' * kästään, liuottimena. Esimerkiksi FSH:a sisältävä säiliö « i · voi sisältää 1 - 1000 mikrogrammaa (pg) FSH:a (esim. 75 • V kansainvälistä yksikköä pidetään terapeuttisena määränä).

25 Säiliössä on edullisesti suurin hyväksyttävä määrä prote-·;·· iinia, koska mitä suurempi määrä on proteiinia, sitä sta- biilimpi valmiste yleensä on. Lääketieteen harjoittajat • tietävät käyttökelpoiset gonadotropiiniannokset, ja annok- φ.#.# seen sisältyvä määrä riippuu yleensä sairaustilasta ja • · · 30 hoidettavasta kyseessä olevasta potilaasta.

• * * *. Esimerkiksi niinkin suuria määriä kuin 10 000 kan- • · !.’·· sainvälistä yksikköä ja niinkin pieniä määriä kuin 15 kan- : sainvälistä yksikköä HCG:a on annettu. Injektioita, jotka ovat välillä 20 - 225 kansainvälistä yksikköä LH:a, on !'*. 35 käytetty.

• * · • « · • · 5 101194

Yhdessä edullisessa toteutusmuodossa FSH:n ja LH:n tai FSH:n ja HCG:n yhdistelmä lyofilisoidaan yhdessä, jolloin muodostuu valmiste, jossa on terapeuttiset määrät kumpaakin valittua gonadotropiinia.

5 B. Stabilisaattorit "Stabiloida" on tässä käytettynä suhteellinen termi. Stabilointi stabiloivalla aineella tai yhdisteellä merkitsee kykyä estää tai viivyttää proteiinin aktiivisuuden vähenemistä stabilisoivalla aineella. Valmistetta esi-10 merkiksi pidetään "stabiloituna", jos stabiloivan yhdisteen ("stabilisaattorin") kanssa hajoaminen kesti kauemmin (esim. 2 viikkoa 1 viikon sijasta) säätölämpötilassa, jolloin valmisteesta hävisi jonkin verran sen in vivo- tai in vitro -aktiivisuudesta, verrattuna valmisteeseen, jossa ei 15 ollut stabilisaattoria.

Proteiinin aktiivisuus voidaan määrittää tunnetuilla menetelmillä, jotka koskevat kyseessä olevaa proteiinia. Eräs aktiivisuusmittaus voidaan suorittaa mittaamalla tiettynä aikana muodostuneiden oligomeerien (inaktiivis-20 ten) määrä. Oligomeerin muodostus näytteessä voidaan mää rittää HPSEC:n avulla.

* « · *' ' Muita menetelmiä esimerkiksi rFSH:n jäljellä olevan • · · aktiivisuuden määrittämiseksi ovat mm. entsyymin immunoak-

• · I

: .· tiivisuuskoe ("EIA"), joka on kuvattu US-patenttijulkai- 25 sussa (Reissue) 32 696, Schuurs et ai; kitti, joka on saa- *:·*: tavissa tavaramerkillä "FSHEIA" yhtiöltä bioMörieux of :*·*; Marcy 1'Etoile 69260 Charbonniöres-les-Bains, France, FSH:n määritykseen; ja sekä FSH;n että LH:n in vitro -bio-analyysi, joka on kuvattu julkaisussa Mannaerts et ai, • » » l.l 30 "Applications of in vitro Bioassays for Gonadotropins", • · ·

Neuroendocrinology of Reproduction, s. 49 - 58 (Elsevier • · ·.*♦♦ Science Publishers bv, Amsterdam, NL 1987).

• · «

Edullisia valmisteissa käytettäviä stabilisaatto-.···. reita ovat dikarboksyylihappojen, kuten sitruunahapon, 35 viinihapon, asparagiinihapon ja niiden seosten suolat.

• * · • « 6 101194

Edullisia suoloja ovat tällaisten dikarboksyylihappojen natrium-, kalium-, litium- ja ammoniumsuolat, erityisesti natrium- ja kaliumsuolat. Toinen dikarboksyylihapposuola on natriumglutamaatti. Dikarboksyylihapposuolastabilisaat-5 torin läsnäolon vaikutuksesta entsymaattiset seokset stabiloituvat erityisesti suhteellisen korkeissa lämpötiloissa pidempinä aikoina.

Kun aspartaatti- ja glutamaattisuoloja käytettiin stabilisaattoreina, niillä saatiin parempi aktiivisuus-10 saanto kuin sitraatti-, isositraatti- tai tartraattisuo-loilla.

Kun stabilisaattoriksi valitaan sitraattisuola, sitraatin suhde gonadotropiiniin on edullisesti välillä 200 - 400 (mg/mg), jolloin aikaansaadaan paras stabilointi 15 ja saanto, kun läsnä on jonkin verran sokeria. Erityisen edullinen proteiini natriumsitraatin kanssa käytettäväksi on rFSH, koska yhdisteellä on kyky stabiloitua stabilisaattorin kanssa.

FSH-koostumuksissa, jotka sisältävät 0,1 - 1000 pg 20 FSH:a, dikarboksyylihapposuolastabilisaattorin pitoisuudet, jotka riittävät liuoksen muodostamiseen, jonka ioni- • « « '·’ ' vahvuus on yli 0,050, ovat edullisia. Erityisen edullisia • ovat liuokset, joiden ionivahvuus on välillä 0,250 - 0,350 : V ja joilla yleensä stabiloidaan esimerkiksi rFSH, jota on 25 varastoitu kuukauden ajan 60 °C:ssa, jolloin saadaan *:·*: 75 %:n rFSH-saanto. Alan ammattimiehet tuntevat hyvin io- nivahvuuden laskemisen, katso esimerkiksi julkaisu Chase • et ai, Remington's Pharmaceutical Sciences, s. 223 - 224, 228 ja 233 (16. painos, 1980, Mack Pubi. Co. of Easton, • · · M 30 PA, U.S.A.).

« » « * ' • · · *. Pitoisuudet, jotka ovat 2,5 - 17,5 milligrammaa • · ·.*·· natriumsitraattia millilitrassa liuosta (mg/ml), riittävät * · · yleensä tässä kuvattujen määrien lyofilisoitua rFSH:a sta-.···. biloimiseen.

• i « 7 101194

Myös kuten kuviossa 2 on kuvattu, sitraattia pitäisi olla koostumuksessa esimerkiksi HCG:n kanssa määrä, joka on alle 10 000 kertaa painon mukaan HCG:n määrästä, jotta saavutettaisiin suurempi stabiilisuus.

5 C. Ei-pelkistävät sokerit

Pakastuskuivattavat koostumukset sisältävät edullisesti ei-pelkistävää sokeria kuten sakkaroosia tai tre-haloosia. Tällaisen sokerin, esim. sakkaroosin, yhdistäminen korottaa "luhistumislämpötilaa" (tai "kutistumisläm-10 pötilaa"), jossa liuoksen lyofilisointi tapahtuu. Tämä lämpötilan korotus yksinkertaistaa koko pakastuskuivaus-prosessia. Erityisen edullinen ei-pelkistävä sokeri tähän käyttöön on sakkaroosi amorfisessa tilassaan.

Lyofilisoitavassa liuoksessa olevan ei-pelkistävän 15 sokerin määrä riippuu yleensä dikarboksyylihapposuolasta-bilisaattorin määrästä. Ei-pelkistävän sokerin painosuhde dikarboksyylihapposuolaan esimerkiksi vaihtelee yleensä välillä 50:1 - 10:3 edullisen pitoisuuden ollessa noin 3,3:1, kun kyseessä on sakkaroosin suhde natriumsitraat-20 tiin. Erityisen edullinen on liuos, joka sisältää 50 mg/ml fit sakkaroosia ja 14,7 mg/ml natriumsitraattia, jolloin saa- • « « *·* ' daan myös optimilyofilisaatti fysikaalisten ominaisuuksien < mukaan.

: Tällä hetkellä edullisimmissa toteutusmuodoissa 25 sakkaroosin määrä riittää korottamaan luhistumislämpötilan *:*·; -38 °C:sta noin -25 °C:seen määritettynä differentiaali- sella skannaus kalorimetrillä. Saatu "lyofilisaattikakku" pysyy amorfisena ja stabiilina suhteellisen pitkiä aikoja.

D. Antiabsorptioaineet • · 6 30 Antiadsorptioaineita lisätään edullisesti lyofili- • « · soituun koostumukseen proteiinin kiinnittymisen estämi- • · *.*·· seksi säiliön seinämiin, jossa säiliössä koostumus on, • · · jolloin estetään mahdollinen pitoisuuden pieneneminen.

.···. Tietyt antiadsorptioaineet (esim. polysorbaatit) toimivat • « • · « » · • » · • · · 8 101194 myös "kylmäsuojausaineina" suojaten proteiinia lyofili-sointiprosessin aikana.

Edullisia antiadsorptioaineita ovat ei-ioniset pin-ta-aktiiviset aineet kuten Polysorbate 20, NF (Tween 20, 5 toimittaja Atlas Chemical Company), Polysorbate 80, NF (Tween 80, toimittaja Atlas Chemical Company), Brij 35 (toimittaja ICI Pharmaceuticals, Iso-Britannia) ja Plu-ronic F123 (toimittaja BASF, Ludwigshafen, Saksa). Polysorbate 20, NF on erityisen edullinen.

10 Polysorbaatin ymmärretään edullisesti tarkoittavan polysorbaattia, joka vastaa USP/NF XXII:n määritelmää, joka on esitetty julkaisussa "The National Formylary", Official from 1 Jan. 1990 (22. painos, U.S. Pharmacopeial Convention, Inc. 1989), s. 1763 ja 1967.

15 Antiadsorptioainetta tai antiadsorptioaineita on läsnä sellaiset määrät, että proteiinin kiinnittyminen säiliön seinämiin tai astioiden seinämiin prosessin aikana vähenee. Esimerkiksi Polysorbate 20:n määrät, jotka riittävät 0,1 - 0,2 mg/ml:n pitoisuuden muodostamiseen lopul-20 lisessa liuoksessa, ovat edullisia. Tätä suuremmilla pitoisuuksilla on taipumus johtaa oligomeerien muodostukseen, ja siten ne vähentävät aktiivisuutta.

E. Farmaseuttiset koostumukset Tämän keksinnön mukainen stabiili lyofilisoitu val-25 miste voidaan valmistaa sekoittamalla valittua proteiinia *:·*: vesipitoisessa liuoksessa riittävän määrän kanssa dikar- :*♦*; boksyylihapposuolastabilisaattoria proteiinin stabiloimi- seksi ja riittävän määrän kanssa ei-pelkistävää sokeria luhistumislämpötilan korottamiseksi -38 °C:sta yli • · · .*.! 30 -25 eC:seen. Yli -35 °C:n lämpötilat ovat edullisia. Mah- I t i • · · *. dollisesti voidaan myös lisätä valittua antiadsorptio- • · ainetta. Sen jälkeen liuos suodatetaan, laitetaan säiliöi- : hin (esim. yhden ml:n lasiampulleihin) ja sitten pakastus- <·*·> kuivataan stabiloidun lyofilisaatin muodostamiseksi. Alan * » 35 ammattimiehet tuntevat pakastuskuivausmenetelmät hyvin.

• · · • <> « • · 9 101194

Lisätietoa varten voidaan viitata useisiin teksteihin, joihin kuuluu mm. julkaisu Goldblith et ai, Freeze Drying and Advanced Food Technology (Academic Press, Inc., London, GB 1975). Edullinen jäljelle jäävä vesipitoisuus lyo-5 filisaattikakuissa on 1 - 5 %. Kaikkialla menettelyssä pitäisi käyttää aseptisia menetelmiä. Pakastuskuivauslait-teita on saatavissa valmistajilta kuten Leybold tai Edwards. Tällaista menettelyä tai sen modifikaatioita käyttämällä voidaan valmistaa useita erilaisia koostumuk-10 siä.

Erityisen edullinen koostumus sisältää FSH:a seoksena stabilisaattorin kanssa, joka on dikarboksyylihapon suola, jossa dikarboksyylihappo valitaan ryhmästä, jonka muodostavat sitruunahappo, viinihappo, asparagiinihappo ja 15 näiden happojen seokset.

Toinen edullinen lyofilisoitu valmiste sisältää seoksena dikarboksyylihapposuolastabilisaattoria, gonado-tropiinia, jonka valmisteessa läsnä oleva stabilisaattori-määrä pystyy stabiloimaan, ja trehaloosia. Tämä valmiste 20 käsittää edelleen natriumbifosfaattia seoksena stabili- ... saattorin, proteiinin ja ei-pelkistävän sokerin kanssa.

* 1 « ‘ Erityisen edullisia suoloja tällaisia valmisteita varten * < '...· ovat natriumaspartaatti, natriumsitraatti ja natrium- « 4 i tartraatti.

25 Vielä eräs edullinen stabiili lyofilisoitu valmiste *:·1: sisältää seoksena stabilisaattoria, kuten viini- tai aspa- :1·1: ragiinihapon suolaa, gonadotropiinia, jonka valmisteessa läsnä oleva stabilisaattorimäärä pystyy stabiloimaan, ja ei-pelkistävää sokeria. Valmiste voi edelleen käsittää • » c 30 dinatriumbifosfaattia seoksena stabilisaattorin, proteii- • · · nin ja ei-pelkistävän sokerin kanssa. Erityisen edullisia * · ei-pelkistäviä sokereita ovat trehaloosi ja sakkaroosi.

11 r

Erityisen edullinen stabilisaattori tällaisissa valmisteissa on natriumaspartaatti.

• I « I 4 10 101194

Vielä eräs erittäin edullinen stabiloitu lyofili-saatti koostuu oleellisesti proteiinista; riittävästä määrästä dikarboksyylihapposuolastabilisaattoria proteiinin stabiloimiseksi pakastuskuivatussa muodossa; disakkaridi-5 sesta ei-pelkistävästä sokerista; antiadsorptioaineesta, joka estää mainitun proteiinin kiinnittymisen lyofilisaat-tia sisältävään säiliöön; ja loppuosana alle 5 % vettä. Tällaisessa lyofilisaatissa proteiini on FSH; dikarboksyy-lihapposuolastabilisaattori valitaan ryhmästä, jonka muo-10 dostavat sitruunahapon, viinihapon ja asparagiinihapon suolat; disakkaridinen ei-pelkistävä sokeri on joko sakkaroosi tai trehaloosi; ja antiadsorptioaine valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Tween 20, Tween 80, Brij ja plu-ronihappo. Tämä lyofilisaatti on erityisen edullinen, kos-15 ka mm. on todettu, että muiden "stabilisaattorien", kuten mannitolin, maltoosin tai näistä kummankin, lisääminen itse asiassa destabiloi lyofilisaattia aktiivisuuden mukaan.

Parenteraalisten valmisteiden ja laskimonsisäisten 20 seosten valmistusmenetelmiä on esitetty julkaisussa

Remington's Pharmaceutical Sciences, s. 1463 - 1497. Kuitenkin täytyy olla varovainen, koska vaikka stabiloidut koostumukset ovat sekoittumattomia infuusionesteiden kanssa, käytettyjen infuusionesteiden ei tulisi edullisesti 25 sisältää pelkistäviä sokereita. Käytettäväksi tarkoitetun . saadun liuoksen edullisen pH-arvon tulisi olla välillä ... 6-8, erityisesti 7.

• · ♦ *·* * Keksintöä selitetään edelleen viittaamalla seuraa- viin esimerkkeihin;

30 Esimerkki I

• · · V : A. rFSHrn stabilointi käyttäen eri disakkarideja .·. : Valmistetaan vesipitoiset liuokset, jotka sisältä- • ·» !.·[ vät 150 kansainvälistä yksikköä rFSH:a. Liuokset jaetaan • · kolmeen ryhmään, ja ryhmiin sekoitetaan (1) 50 mg/ml mal- ·...· 35 toosia/14,7 mg/ml natriumsitraattia; (2) 50 mg/ml treha- • · · • · · • · 101194 loosia/14,7 mg/ml natriumsitraattia ja (3) 50 mg/ml sak-karoosia/14,7 mg/ml natriumsitraattia. Kaikki kolme liuosta sisälsivät myös 0,2 mg/ml Polysorbate 20, NF:a. Kolme liuosryhmää pakastuskuivattiin, ja saadun lyofili-5 saatin annettiin olla neljä viikkoa 60 °C:ssa. Sen jälkeen tutkittiin lyofilisaattien aktiivisuus (määritettiin EIA:lla), ja saatiin seuraavat tulokset:

Yhdiste: (1) (2) (3)

Aktiivisuus prosentteina: 40 % 89 % 87 % 10 Tämä esimerkki osoittaa, että ei-pelkistävät dis- akkaridit edistävät stabiilisuutta paremmin kuin pelkistävät disakkaridit.

B. rFSH:n stabilointi natriumsitraatilla Valmistetaan kaksi lyofilisoitua näytettä. Ensim-15 mäinen näyte sisältää 75 kansainvälistä yksikköä rFSH:a, 25 mg amorfista sakkaroosia, 7,35 mg natriumsitraattia ja 0,1 mg Polysorbate (Tween) 20:a. Toinen näyte sisältää 75 kansainvälistä yksikköä rFSH:a, 25 mg amorfista sakkaroosia ja 0,2 mg Tween 20:a. Molempien näytteiden pH:t sää-20 dettiin arvoon 7. Ensimmäistä näytettä pidettiin 3 kuukautta 50 °C:ssa, saatettiin käyttömuotoon puhdistetun veden kanssa ja analysoitiin HPSEC:n avulla. Saatu käyrä osoitti vain vähän oligomeerin muodostusta. Toista näytettä, joka ei sisältänyt natriumsitraattia, pidettiin 6 kuu-25 kautta 50 °C:ssa, saatettiin käyttömuotoon puhdistetun . veden kanssa ja analysoitiin HPSEC:n avulla. Saatu käyrä osoitti paljon enemmän oligomeerin muodostusta.

• · c *·* * Ensimmäisen näytteen käyrä ei osoittanut hajoamis tuotteita, kun taas toisen näytteen käyrä osoitti lähes • o 30 pelkästään oligomeerisiä tuotteita.

: : : Esimerkit II - V

.·[ : Muut dikarboksyylihapposuolastabilisaattorit

Kuten kuviossa 1 on kuvattu, rFSH:a ja eri stabi-"* lisaattoreita sisältävät näytteet valmistettiin, lyofili- ·...· 35 soitiin ja niiden aktiivisuus tutkittiin, kun niitä oli 12 101194 varastoitu 1 kuukausi 60 °C:ssa. Kuviossa 1 kuvataan kyseessä olevan stabilisaattorin ionivahvuuden (x 1000) korrelaatio todettuun aktiivisuuteen prosentteina (määritettynä EIA:11a).

5 Tutkitut stabilisaattorit olivat natriumsitraatti, sekä erikseen (II) että 3,0 - 9,1 mg:n kanssa Na2HP04:a ampullia kohti (III); natriumtartraatti (IV); ja natrium-aspartaatti (V). Pitoisuudet määritettiin ionivahvuuster-meinä kuten kuviossa 1 on esitetty.

10 Esimerkki VI

Tutkittiin sitraatin painosuhteen vaikutus gonado-tropiiniaktiivisuuteen (HCG). Tulokset on esitetty kuviossa 2.

Esimerkki VII

15 Valmistettiin lyofilisoitu koostumus ihmisen re- kombinantti-FSH:a varten, joka koostumus sisälsi 75 IU rFSH:a, 14,7 mg natriumsitraattia, 50 mg sakkaroosia ja 0,2 mg Polysorbate 20:a. Valmiste saatetaan käyttömuotoon yhden ml:n kanssa vettä injektointia varten.

20 Esimerkki VIII

Valmistettiin lyofilisoitu koostumus ihmisen re- kombinantti-FSH:a varten, joka koostumus sisälsi 75 IU .··, rFSH:a, 75 IU LH:a, 15 mg natriumsitraattia, 50 mg sak- karoosia ja 0,2 mg Polysorbate 20:a. Koostumus oli stabii- 25 li. Valmiste saatetaan käyttömuotoon yhden ml:n kanssa • · . vettä injektointia varten.

• · • · · • · c • · • « · • · · • · • · · • · « • · · • · ·

Claims (8)

13 101194

1. Menetelmä stabiloidun, gonadotropiinia sisältävän lyofilisaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, 5 että sekoitetaan yksi paino-osa gonadotropiinia; ja 200 - 10 000 paino-osaa dikarboksyylihapposuola-stabilisaattoria, joka on yhdistetty mainitun gona-dotropiinin kanssa, 10 haluttaessa liuotetaan ei-pelkistävää sokeria seokseen määrä, joka on 3 - 50-kertainen painon mukaan laskettuna dikarboksyylihapposuolan määrään nähden, ja seos pakastuskuivataan yli -35 °C:n lämpötilassa, jolloin saadaan stabiloitu gonadotropiinilyofilisaatti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekoitetaan mukaan ei-ionista pinta-aktiivista ainetta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gonadotropiini valitaan ryh- 20 mästä, jonka muodostavat luteinisoiva hormoni, ihmisen koriongonadotropiini, follikkelia stimuloiva hormoni tai ’ niiden seokset.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dikarboksyylihapposuolastabi- 25 lisaattori on sitruuna-, viini- tai asparagiinihapon suo-la. ... 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, • · · • · · * tunnettu siitä, että gonadotropiini on follikkelia stimuloiva hormoni. • · • · · 1

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, • · · tunnettu siitä, että ei-pelkistävää sokeria sekoi-: tetaan mukaan kolminkertainen määrä painon mukaan lasket- .··. tuna dikarboksyylihapposuolastabilisaattorin määrään näh- • den. 14 101194

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekoitetaan mukaan toista go-nadotropiinia, jonka dikarboksyylihapposuolastabilisaat-tori pystyy stabiloimaan.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä sta biloidun gonadotropiinilyofilisaatin valmistamiseksi, joka sisältää stabiloivan määrän dikarboksyylihapposuolaa, tunnettu siitä, että: ainakin yksi gonadotropiini sekoitetaan vesipitoi-10 sessa liuoksessa dikarboksyylihapposuolan kanssa liuoksen ionivahvuuden säätämiseksi välille 0,050 - 0,350, ei-pelkistävää sokeria liuotetaan seokseen määrä, joka on 3 - 50-kertainen painon mukaan laskettuna dikarboksyylihapposuolan määrään nähden, ja 15 seos pakastuskuivataan yli -35 °C:n lämpötilassa, jolloin saadaan stabiloitu gonadotropiinilyofilisaatti. « · m • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · 1 · • · · • · · is 101194 Pa-ten tkrav