KR20090004027A - 인공혈관용 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드 및 그의제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인공혈관용 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 1) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시키고 포로젠을 혼합하여 고분자/포로젠 혼합액을 제조하는 단계; 2) 원통형 샤프트를 상기 고분자/포로젠 혼합액으로 코팅하여 다공성 코팅층 내막을 형성하는 단계; 3) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 겔을 제조하는 단계; 4) 단계 3)에서 다공성 코팅층 내막이 형성된 원통형 샤프트를 비용매 응고조에 담그고 회전시키면서 상기 생분해성 고분자 겔을 낙하 방사하여 형성된 겔 상태의 섬유를 상기 샤프트의 다공성 코팅층 내막에 감기게 하여 고분자 섬유층 외막을 형성하는 단계; 5) 상기 샤프트에 형성된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드를 분리하고 이로부터 유기용매 및 포로젠을 제거하는 단계를 포함하는 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드의 제조방법 및 이로부터 제조된 생분해성 및 생체적합성 인공혈관용 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 다공성 스캐폴드는 미세한 기공을 갖는 다공성 코팅층 내막과 방사된 겔 상태의 고분자 섬유층 외막을 갖는 이중막 구조를 가지고 있어 기공간의 상호연결성과 기계적 강도가 우수하여 혈액의 누출을 효과적으로 방지할 수 있을 뿐만 아니라 세포의 주입 및 증식 효율이 높아 조직공학적 인공혈관으로 유용하게 사용될 수 있다.
인공혈관, 다공성 스캐폴드, 겔 방사 성형법, 생분해성 고분자, 조직재생, 다공성 이중막, 누혈 억제
Description
본 발명은 생분해성 고분자와 포로젠의 혼합액으로 원통형 샤프트를 코팅하여 다공성 코팅층 내막을 형성하고, 이를 비용매 응고조에 담가 회전시키면서 생분해성 고분자 겔을 상기 응고조에 직접 낙하 방사하여 형성된 겔 상태의 고분자 섬유가 회전하는 샤프트의 다공성 코팅층 내막에 감기게 하여 겔 상태의 고분자 섬유층 외막을 형성하고 이들이 서로 접착되면서 기공의 크기가 다른 이중막 구조의 다공성 스캐폴드를 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 인공혈관용 이중막 구조의 다공성 스캐폴드에 관한 것이다.
조직공학 기술을 이용한 인공혈관의 초기 연구는 콜라겐이나 천연고분자 또는 PGA와 같은 생분해성 고분자를 튜브 형태로 제작하고 그 위에 혈관 조직을 구성하는 평활근세포 혹은 내피세포를 파종한 후 일정기간 동안 생체 외에서 배양하여 어느 정도의 기계적 강도를 가지게 한 다음에 생체 내에 이식하는 연구가 주를 이루었다. 최근에는 줄기세포에 대한 연구의 발달로 튜브형 다공성 지지체에 줄기세포를 파종한 후 생체 외에서 배양 없이 즉시 이식하는 방법이 보고되었다(Narutoshi Hibino 등, J. Thoracic and Cardiovascular Surgery 129: 1064-1670, 2005). 이 방법은 줄기세포가 파종된 다공성 지지체를 생체 외에서 배양하는 과정을 거치지 않고 바로 이식하기 때문에 스캐폴드 자체가 생체 내의 물리적인 환경에 견딜 수 있는 강도를 가져야만 한다. 즉, 인공혈관은 생체 내에서 손상된 혈관을 제거하고 혈액의 흐름을 연결하는데 사용되는 인공장기로서 혈액의 압력을 견딜 수 있는 파열 강도를 유지해야만 하고, 실제 혈관과 같이 맥박 혈류에 따라 팽창/수축이 가능한 고탄성 재료를 사용하여 제조해야만 한다. 아울러, 이식 초기에 발생할 수 있는 혈액의 누출은 인공혈관의 이식 성공율을 높이는데 중요한 요인이 되고 있다.
상기 조건을 만족하는 의료용 인공혈관으로 비분해성 재료인 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 또는 연신 폴리테트라플루오르에틸렌(ePTFE)으로 제조된 것 등이 있지만, 이들은 생체 내에서 분해되지 않기 때문에 생체조직의 재생을 유도하는 조직공학용 인공혈관으로는 사용될 수가 없다. 현재 줄기세포를 이용한 조직공학 기술로서 임상적으로 응용 가능한 인공혈관은 상대적으로 생체 내에서 혈압이 낮은 대정맥계 및 폐동맥계로만 제한되어 왔고, 동맥계와 같은 고혈압의 조건에서 견딜 수 있는 조직공학적 인공혈관은 아직까지 개발되지 않았다.
한편, 튜브형 스캐폴드는 생분해성 재료로서 폴리글리콜산(PGA) 부직포 또 는 폴리-L-락트산(PLLA) 직포를 원통형 샤프트에 감아서 생체 혈관의 모양과 같이 튜브 형태로 유지한 채 봉합사로 봉합하여 제조되거나, PGA 혹은 PLLA 메쉬를 이들과는 전혀 다른 용해성질을 나타내는 폴리-L-락트산-co-카프로락톤(PLCL)과 같은 고분자를 녹인 용액에 담갔다가 꺼낸 후 동결건조하여 제조되고 있다. 이와 같이 PLCL을 이용한 동결건조에 의해 기공을 형성하는 방법이 이용되고는 있지만, PGA나 PLLA는 탄성력이 PLCL에 비해 현저히 낮고 분해 속도를 조절하는 것이 어렵다는 등의 문제점을 가지고 있다. 또한, 기공의 크기 등 스캐폴드의 구조가 고혈압의 조건 하에서 혈액의 누출 없이 인공혈관의 역할을 수행하는 데에도 한계가 있다. 그 외 PLCL 단독으로 제조된 인공혈관은 주로 동결건조, 캐스팅, 압출 등의 방법에 의해 제조되는데, 이들은 세포의 파종 효율이 저조하고, 기계적 강도가 약하다는 단점을 가지고 있다.
따라서, 고 탄성의 우수한 기계적 강도를 가진 조직공학적 인공혈관용 다공성 스캐폴드의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 생분해성 고분자와 포로젠의 혼합액으로 원통형 샤프트를 코팅하여 다공성 코팅층 내막을 형성하고, 이를 비용매 응고조에 담가 회전시키면서 생분해성 고분자 겔을 상기 응고조에 직접 낙하 방사하여 형성된 겔 상태의 고분자 섬유가 회전하는 샤프트의 다공성 코팅층 내막에 감기게 하여 외막을 형성하고 이들이 서로 접착되면서 기공의 크기가 다른 이중막 구조의 다공성 스캐폴드를 제조하는 방법을 개발하고 이 방법에 의해 제조된 다공성 스캐폴드가 이중막 구조 의 튜브 형태를 가져 기공간의 상호연결성과 기계적 강도가 우수하여 혈액의 누출을 효과적으로 방지할 수 있을 뿐만 아니라 세포 주입 및 증식 효율이 뛰어나 인공혈관으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 기공간 상호연결성, 기계적 안정성, 세포 주입 및 증식 효율이 우수하고, 동맥과 같은 고혈압 상태에서의 누혈을 방지할 수 있는 인공혈관용 다공성 스캐폴드 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시키고 포로젠을 혼합하여 고분자/포로젠 혼합액을 제조하는 단계;
2) 원통형 샤프트를 상기 고분자/포로젠 혼합액으로 코팅하여 다공성 코팅층 내막을 형성하는 단계;
3) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 겔을 제조하는 단계;
4) 단계 3)에서 다공성 코팅층 내막이 형성된 원통형 샤프트를 비용매 응고조에 담그고 회전시키면서 상기 생분해성 고분자 겔을 낙하 방사하여 형성된 겔 상태의 섬유를 상기 샤프트의 다공성 코팅층 내막에 감기게 하여 고분자 섬유층 외막을 형성하는 단계;
5) 상기 샤프트에 형성된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드를 분리하고 이로부터 유기용매 및 포로젠을 제거하는 단계를 포함하는, 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 생분해성 및 생체적합성 인공혈관용 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드를 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법의 특징은 기존에 겔 방사(gel spinning) 성형법으로 단일막 구조의 다공성 스캐폴드를 제조하는 것과는 달리 혈액의 누수를 예방할 수 있는 미세한 기공을 갖는 다공성 코팅층 내막을 먼저 성형하고 그 위에 겔 상태의 고분자 섬유를 감기게 하여 외막을 성형한 후 다공성 코팅층 내막과 고분자 섬유층 외막이 서로 접착되면서 기공의 크기가 서로 다른 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드를 제조한다는 것이다.
일반적으로 겔 방사 성형법에 의해 제조되는 스캐폴드는 기공의 크기가 크고 기공간 상호연결성이 너무 뛰어나 생체 내 혈압과 유사한 압력 하에서는 적혈구의 누출이 일어날 수 있다. 이에 본 발명은 이러한 겔 방사 성형법의 단점을 보완하기 위하여 겔 방사 성형법에 사용되는 원통형 샤프트를 생분해성 고분자와 포로젠의 혼합액으로 먼저 코팅하여 미세 기공을 갖는 다공성 코팅층 내막을 형성한 후 그 위에 겔 상태의 고분자 섬유층 외막을 형성하여 접착시킴으로써 이중막 구조로 다공성 스캐폴드를 제조하는 방법을 개발한 것이다.
이하 본 발명을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
단계 1)은 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시킨 후 포로젠을 혼합하여 분산시켜 이후의 단계에서 원통형 샤프트의 코팅을 위한 고분자/포로젠 혼합액을 제조하는 단계이다.
이 단계에서 사용되는 생분해성 고분자는 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸린카보네이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL) 등의 공중합체 및 이들의 유도체를 포함한다. 상기 생분해성 고분자는 분자량에 상관없이 사용할 수 있으나, 분자량이 5,000 달톤 이상, 바람직하게는 5,000 내지 1,000,000 달톤인 것을 사용하는 것이 본 발명에 따른 다공성 스캐폴드의 제조 시 바람직한 효과를 얻을 수 있다． 또한, 생분해성 고분자는 유기용매에 무게/부피 비로 1 내지 20%의 양으로 용해된다.
상기 생분해성 고분자를 용해시키기 위한 유기용매로는 클로로폼, 메틸렌클로라이드, 아세트산, 에틸아세테이트, 다이메틸카보네이트, 테트라하이드로퓨란 등이 사용될 수 있다.
상기와 같이 준비된 생분해성 고분자 용액에 혼합되는 포로젠은 이후 단계에서 원통형 샤프트에 다공성 코팅층 내막의 제조 시 미세한 기공을 형성하기 위한 것으로, 포로젠의 크기, 종류 및 첨가량을 달리하여 기공의 크기 및 형태를 조절할 수 있으며, 이는 다공성 스캐폴드의 누혈 억제에 중요한 작용을 한다.
본 발명에 유용한 포로젠은 당분야에서 기공을 발생시키기 위해 통상적으로 사용되는 것들을 포함하는데, 바람직하게는 소금, 이탄산나트륨, 이탄산암모늄, 파라핀, 폴리에틸렌글리콜 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상 기 포로젠은 생분해성 고분자 용액 중에 생분해성 고분자와 중량비로 9:1 내지 1:2 범위로 혼합되는 것이 바람직하다. 만약, 생분해성 고분자와 포로젠의 혼합비율이 1:2을 초과하는 경우에는 기공의 수가 많아져서 혈액 누수의 문제점이 발생할 수 있고, 9:1 미만인 경우에는 생체이식 시 영양분의 공급 및 혈관신생이 저해되는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 혼합되는 포로젠은 40 마이크론 이하의 직경을 갖는 것이 바람직한데, 포로젠의 직경이 40 마이크론을 초과하면 큰 기공에 의해 혈액 누수의 문제점이 발생할 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, 목적하는 기공의 형태와 크기에 따라 포로젠의 크기, 종류 및 첨가량을 달리할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
단계 2)는 단계 1)에서 준비된 고분자/포로젠 혼합액으로 원통형 샤프트를 코팅하여 미세 기공을 갖는 다공성 코팅층 내막을 형성하는 단계로, 이와 같이 형성된 미세한 기공은 혈액의 누수를 방지하는데 매우 중요한 역할을 담당한다.
상기 단계에서 원통형 샤프트에 다공성 코팅층 내막을 형성하는 방법으로는 압출성형법, 함침법, 전기방사법, 동결건조법, 상-분리법, 입자침출법, 가스-형성법(gas-foaming), 탄화수소 주형법(hydrocarbon templating), 용융 주조법(melt molding) 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 함침법에 따라 고분자/포로젠 혼합액에 원통형 샤프트를 충분히 잠길 정도로 함침시키고 4 내지 25℃에서 5 내지 20분간 코팅을 수행하여 다공성 코팅층 내막을 형성한다. 이때, 다공성 코팅층 내막에 형성된 기공은 40 마이크론 이하의 크기를 갖는 것이 바람직하다.
단계 3)은 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 겔을 제조하는 단계로, 본 단계에 사용가능한 생분해성 고분자와 유기용매의 종류 및 혼합비율은 상기 단계 1)에서 설명한 것과 동일하다. 단, 상기 생분해성 고분자 겔은 단계 1)의 고분자 용액과는 달리 포로젠을 포함하지 않으며, 생분해성 고분자의 농도는 고분자의 종류에 따라 다르나 대개 4 내지 20 중량%인 것이 바람직하다. 생분해성 고분자의 농도는 상-분리에 의해 형성되는 겔 상태의 고분자 섬유의 두께를 조절하고 이들로 구성된 외층의 기공률 및 기공의 크기를 조절하는데 매우 중요하다. 따라서, 생분해성 고분자 용액의 농도가 20 중량%를 초과하는 경우에는 점도가 너무 높아 시린지로부터 방사되기 어려운 문제점이 발생할 수 있고, 4 중량% 미만인 경우에는 방사 시 겔 상태의 섬유가 쉽게 끊어지는 문제점이 발생하여 스캐폴드의 강도를 약화시킬 수 있다는 문제점이 발생할 수 있다.
단계 4)는 단계 2)에서 다공성 코팅층 내막이 형성된 원통형 샤프트를 비용매(non-solvent) 응고조에 담가 회전시키고 단계 3)에서 준비된 생분해성 고분자 겔을 시린지를 통해 상기 비용매 응고조 내로 낙하 방사하여 상-분리에 의해 형성된 겔 상태의 고분자 섬유가 회전하는 샤프트에 감기게 하는 단계로, 다공성 코팅층 내막을 고분자 섬유가 감싸면서 외막을 형성하면서 접착됨으로써 이중막 구조의 다공성 스캐폴드가 제조된다. 이때, 이중막 구조의 다공성 스캐폴드에서 다공성 코팅층 내막과 고분자 섬유층 외막은 서로 다른 크기의 기공을 갖는데, 외막에 형성된 기공은 10 내지 500 마이크론의 크기를 갖는 것이 바람직하며, 기공의 평균 크기는 100 마이크론인 것이 바람직하다.
이 단계에서 사용되는 비용매는 방사된 생분해성 고분자 겔을 적당한 속도로 응고시키는 작용을 하는데, 단계 3)에서 생분해성 고분자를 용해시키는데 사용된 유기용매와 쉽게 혼합되어 상-분리가 적당한 속도로 일어날 수 있는 비용매를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 비용매로서 물; 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알콜류; 헥산, 헵탄, 시클로헥산 등의 탄화수소류 중에서 선택하거나 또는 이들을 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 방사된 생분해성 고분자가 비용매 응고조 내에서 응고되는 속도는 상-분리에 의해 형성된 겔 상태의 섬유상 고분자가 샤프트에 코팅된 미세 기공의 다공성 내막과 접착하는데 매우 중요하며, 섬유상 고분자와 다공성 내막 사이에 적절한 접착력이 유지되어야 균일하고 상호연결성이 우수한 다공성 스캐폴드를 얻을 수 있다. 이러한 접착은 섬유상 고분자 겔에 잔존하는 용매에 의해 유도되는데, 즉 섬유상 고분자 겔이 다공성 코팅 내막에 감기면서 외막을 형성할 때 잔존하는 용매가 상기 내막의 고분자 층을 녹이면서 동시에 이들 사이의 접착을 유도하게 된다. 비용매 응고조 내에서 생분해성 고분자가 응고되는 속도는 비용매액의 종류와 회전 속도에 따라 조절할 수 있으며, 생분해성 고분자의 응고 속도가 겔 상태의 섬유상 고분자간의 접착 및 상기 섬유상 고분자와 다공성 코팅층 내막과의 접착을 유도할 수 있는 용매를 선택하는 것이 바람직하다. 응고 속도가 너무 빠르면 겔 상태의 섬유상 고분자간의 접착 및 상기 섬유상 고분자와 다공성 코팅층 내막과의 접착이 일어나지 않는 문제점이 발생할 수 있고, 응고 속도가 너무 느리면 겔 상태의 섬유상 고분자가 생성되지 않고 기공도 거의 형성되지 않는 문제점이 발생할 수 있다. 아울러, 비용매 응고조로 방사되어 상-분리에 의해 겔 상태로 형성된 고분자 섬유는 외막 형성 시 기공의 크기 및 기공률을 고려하여 개별적으로 50 내지 150 마이크론의 직경을 갖는 것이 바람직하다.
단계 5)는 단계 4)에서 원통형 샤프트에 성형된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드를 분리하고 이로부터 유기용매 및 포로젠을 제거하는 단계로, 유기용매는 감압 하에서 건조시켜 제거하고 포로젠은 포로젠을 용해시킬 수 있는 용액에 상기 다공성 스캐폴드를 넣어서 포로젠을 용해시켜 제거할 수 있다.
상기한 바와 같은 방법에 의해 제조된 다공성 스캐폴드는 미세한 기공의 다공성 코팅층 내막과 이를 방사된 섬유상 고분자로 구성된 외막이 감싸고 있는 이중막 구조의 튜브 형태를 가지고 있는데, 미세 기공을 갖는 다공성 코팅층 내막은 생체이식 시 혈액의 누출을 막는 역할을 하고, 고분자 섬유층 외막은 기공간 상호연결성과 기계적 강도를 증가시켜 생체 내 고 압력 하에서도 파열을 방지하는 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드는 생분해성 및 생체적합성 조직공학용 인공혈관으로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드는 기존의 다공성 스캐폴드와는 달리 기공사이의 상호연결성이 우수하여 효과적으로 세포 주 입과 증식을 유도할 수 있어 3차원적 생체조직 재생 시 매우 유리하게 사용될 수 있고, 특히 생체 외 배양을 거치지 않은 혈관이식 시에도 우수한 기계적 강도와 내막의 미세한 기공 구조로 인해 초기 파열과 혈액의 누출을 효과적으로 방지할 수 있으므로 생분해성 및 생체적합성 조직공학용 인공혈관으로서 유용하게 사용될 수 있다．
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드의 제조
분자량이 450,000 Da인 PLCL(단량체의 조성 5:5)을 클로로폼 용액에 7.0 %(w/v)의 농도로 용해시켰다. 직경이 20 마이크론 이하인 소금만을 체(seive)로 분리한 후 PLCL에 대한 소금의 혼합비를 1:1, 2:1 및 9:1로 하여 상기 PLCL 용액에 혼합하였다. 지름이 6.5 ㎜인 원통형 샤프트를 PLCL/소금 혼합액에 10 ㎝ 정도 깊이까지 담그고 25℃에서 15분간 함침시켜 원통형 샤프트의 표면에 미세 기공을 갖는 다공성 코팅층 내막을 형성하였다.
다공성 코팅층 내막이 형성된 원통형 샤프트를 메탄올이 들어 있는 응고조에 담그고 300 rpm의 속도로 회전시켰다. 상기와 동일한 분자량의 PLCL을 클로로폼 용액에 7.5 %(w/v)의 농도로 용해시키고, 겔 방사 장치의 주사기에 이 용액을 주입한 후 시린지 펌프를 이용하여 상기 응고조 내로 낙하 방사하였다. 이때, 방사된 생분해성 고분자 겔은 비용매 응고조 내에서 상-분리에 의해 겔 상태의 고분자 섬유로 형성된다. 이 겔 상태의 고분자 섬유를 용기 내에서 회전하고 있는 원통형 샤프트의 다공성 코팅층 내막에 감기게 하여 외막을 형성시키고, 이때 내막에 감기는 고분자 섬유 젤에 잔존하는 용매에 의해 다공성 코팅층 내막과 고분자 섬유층 외막간의 접착을 유도함으로써 이중막 구조의 다공성 스캐폴드를 성형하였다. 이 원통형 샤프트를 진공건조기에서 건조시킨 후 원통형 샤프트를 분리하여 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드를 수득하였다.
도 1은 상기 방법에 따라 인공혈관용 이중막 구조의 튜브형 다공성 생분해성스캐폴드를 제조하는 공정도를 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명에 따라 비용매 응고조 내로 생분해성 고분자 겔을 방사하기 위한 겔 방사 장치의 모식도를 나타낸 것이다.
상기 과정에 의해 제조된 다공성 스캐폴드는 다공성 코팅층 내막과 고분자 섬유층 외막이 서로 접착되어 형성된 이중막 구조의 튜브 형태로서 상기 내막과 외막은 서로 다른 기공을 갖는다. 구체적으로, 제조된 튜브형 다공성 스캐폴드의 내경은 6.5 ㎜이고 두께는 1.0 ㎜이며, 스캐폴드의 외막을 구성하는 개별 섬유의 직경은 30 내지 100 마이크론이었다. 또한, 다공성 스캐폴드의 기공(pore)의 평균 크기는 다공성 코팅층 내막은 15 마이크론 크기의 기공을 갖고, 고분자 섬유층 외막은 50 내지 150 마이크론 크기의 기공을 갖는다. 또한, 수은 주입 기공측정기로 측정한 내막과 외막의 기공률(porosity)은 60% 이상이었고, 복원력은 본래 길이의 400%까지 당겼을 때 98% 이상으로 유지되었다.
주사전자현미경(Scanning electron microscope)으로 분석한 결과, 다공성 스캐폴드의 외부 표면(도 3a)은 섬유 구조를 나타내었고, 내부 표면(도 3c)은 공극이 거의 없는 막 구조를 나타내었다. 또한, 다공성 스캐폴드의 내부 단면(도 3b)을 보면, 겔 상태의 고분자 섬유층 외막과 다공성 코팅층 내막이 적당하게 접착되어 있고 외막 내 기공들간의 상호연결성이 매우 우수한 것을 확인하였다.
비교예 1: 단일막 구조의 다공성 스캐폴드의 제조
PLCL/소금 혼합액으로 원통형 샤프트를 코팅하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 회전하는 원통형 샤프트에 고점도 PLCL 용액을 겔 방사시켜 단일막 구조의 다공성 스캐폴드를 제조하였다. 제조된 단일막 구조의 다공성 스캐폴드의 내층과 단면의 주사현미경 사진을 도 4a 및 4b에 나타내었다.
실험예 1: 파열 강도 및 누혈 여부 조사
실시예 1에서 제조된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드의 파열 강도 및 혈액 누출 여부를 조사하기 위하여 사람의 혈액을 상기 다공성 스캐폴드가 결합되어 있는 관에 일정량을 채우고 공기압을 서서히 가하여 압력을 1500 ㎜Hg까지 증가시키면서 스캐폴드의 변형이 야기되고 혈액의 누출이 관찰되는 압력을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 이때, 비교예 1에서 제조된 단일막 구조의 다공 성 스캐폴드를 비교군으로 사용하였다.
| 파열 압력(mmHg) | 누혈 압력(mmHg) | |
| 단일막 스캐폴드 | - | 30 |
| 이중막 스캐폴드 (PLCL/소금, 9:1) | >1500 | >1500 |
| 이중막 스캐폴드 (PLCL/소금, 2:1) | 1200 | 1200 |
| 이중막 스캐폴드 (PLCL/소금, 1:1) | 1200 | 1200 |
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 비교예 1에서 제조된 다공성 코팅층 내막을 포함하지 않는 단일막 구조의 다공성 스캐폴드는 30 ㎜Hg 이하의 압력에서도 혈액이 누출되는 현상이 관찰되었고, 이처럼 누혈 압력이 30 mmHg 이하로 나타나 파열 압력을 측정할 수 없었다. 반면, 본 발명의 제조방법에 따라 실시예 1에서 제조된 다공성 코팅층 내막과 고분자 섬유층 외막으로 구성된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드는 1200 ㎜Hg의 압력 하에서도 스캐폴드의 변형이나 누혈 현상이 관찰되지 않았다. 특히, PLCL과 소금의 혼합비가 9:1인 다공성 스캐폴드에서는 압력이 1500 ㎜Hg 이상 가해져도 파열 현상이 관찰되지 않았다.
실험예
2: 세포 주입 및 증식 효율 조사
상기 실시예 1에서 제조된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드에 대한 세포의 주입 및 증식 효율을 조사하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 개의 장골로부터 골수를 채취하여 피콜(picoll) 밀도균배법에 의해 골수단핵세포를 분리하고 이를 상기 다공성 스캐폴드에 1× 105 세포/㎟의 밀도로 파종하였다. 상기 다공성 스캐폴드를 다시 개의 복부 대동맥에 이식하여 이중막의 다공성 코팅층 내막에 형성된 미세 기공에 세포가 효과적으로 주입되어 증식하는지 여부를 주사전자현미경으로 관찰하였다. 이때, 비교군으로 상기 비교예 1에서 제조된 단일막 구조의 다공성 스캐폴드를 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 골수단핵세포가 본 발명에 따른 다공성 스캐폴드의 다공성 코팅층 내막에 형성된 기공에 효과적으로 주입되어 증식된 것을 확인할 수 있었고, 이식 8주후까지 스캐폴드의 파열이나 혈액의 누출은 관찰되지 않았으며, 혈전형성도 거의 관찰할 수 없었다.
도 1은 본 발명의 제조방법에 따라 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드를 제조하는 공정도를 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 제조방법에서 고분자/포로젠 혼합액이 코팅된 샤프트에 생분해성 고분자 겔을 방사하기 위한 겔 방사 장치의 모식도를 나타낸 것이고,
도 3a는 본 발명에 따라 실시예 1에서 제조된 이중막 구조의 다공성 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(5:5) 스캐폴드(PLCL/소금, 1/1)의 외부 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이고,
도 3b는 본 발명에 따라 실시예 1에서 제조된 이중막 구조의 다공성 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(5:5) 스캐폴드(PLCL/소금, 1/1)의 단면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이고,
도 3c는 본 발명에 따라 실시예 1에서 제조된 이중막 구조의 다공성 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(5:5) 스캐폴드(PLCL/소금, 1/1)의 내부 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이고,
도 4a는 종래기술에 따라 비교예 1에서 제조된 단일막 구조의 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(5:5) 스캐폴드의 단면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이고,
도 4b는 종래기술에 따라 비교예 1에서 제조된 단일막 구조의 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(5:5) 스캐폴드의 내부 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이고,
도 5는 본 발명에 따라 실시예 1에서 제조된 이중막 구조의 다공성 폴리(L- 락트산-co-카프로락톤)(5:5) 스캐폴드(PLCL/소금, 9/1)에 골수단핵세포를 파종하고 배양한 후 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
Claims (15)
1) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시키고 포로젠을 혼합하여 고분자/포로젠 혼합액을 제조하는 단계;
2) 원통형 샤프트를 상기 고분자/포로젠 혼합액으로 코팅하여 다공성 코팅층 내막을 형성하는 단계;
3) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생분해성 고분자 겔을 제조하는 단계;
4) 단계 3)에서 다공성 코팅층 내막이 형성된 원통형 샤프트를 비용매 응고조에 담그고 회전시키면서 상기 생분해성 고분자 겔을 낙하 방사하여 형성된 겔 상태의 섬유를 상기 샤프트의 다공성 코팅층 내막에 감기게 하여 고분자 섬유층 외막을 형성하는 단계; 및
5) 상기 샤프트에 형성된 이중막 구조의 다공성 스캐폴드를 분리하고 이로부터 유기용매 및 포로젠을 제거하는 단계를 포함하는, 이중막 구조의 튜브형 다공성 스캐폴드의 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 1)에서 생분해성 고분자가 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸린카보네이트, 이들의 유도체 및 공 중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 1)에서 생분해성 고분자가 5,000 내지 1,000,000 달톤 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 1)에서 생분해성 고분자가 유기용매에 무게/부피 비로 1 내지 20%의 양으로 용해되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 1)에서 유기용매가 클로로폼, 메틸렌클로라이드, 아세트산, 에틸아세테이트, 다이메틸카보네이트 및 테트라하이드로퓨란으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 1)에서 포로젠이 소금, 이탄산나트륨, 이탄산암모늄, 파라핀 및 폴리에틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 1)에서 포로젠이 생분해성 고분자와 중량비로 9:1 내지 1:2의 범위로 혼합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 2)에서 코팅이 압출성형법, 함침법, 전기방사법, 동결건조법, 상-분리법, 입자침출법, 가스-형성법(gas-foaming), 탄화수소 주형법(hydrocarbon templating) 및 용융 주조법(melt molding)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 2)에서 다공성 코팅층 내막에 형성된 기공이 40 마이크론 이하의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 3)에서 생분해성 고분자 겔 내 생분해성 고분자의 농도가 4 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 4)에서 겔 상태의 섬유가 50 내지 150 마이크론의 직경을 가지고, 고분자 섬유층 외막에 형성된 기공이 10 내지 500 마이크론의 크기를 갖는 것을 특징으 로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 4)에서 비용매가 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 헵탄, 및 시클로헥산으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
단계 5)에서 유기용매 및 포로젠이 감압 건조 및 용해시키는 방법에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항의 제조방법에 따라 제조된, 다공성 코팅층 내막과 고분자 섬유층 외막의 이중막 구조를 갖는 생분해성 및 생체적합성 인공혈관용 튜브형 다공성 스캐폴드.
제14항에 있어서,
다공성 코팅층 내막이 40 마이크론 이하의 크기의 기공을 갖고, 고분자 섬유층 외막이 10 내지 500 마이크론 크기의 기공을 갖는 것을 특징으로 하는 튜브형 다공성 스캐폴드.
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