KR20080111349A - 단백질 ｇ-올리고 뉴클레오타이드 결합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 G(protein G)의 N-말단에 시스테인 태그된(cysteine tagged) 단백질 G 변형체와 올리고 뉴클레오타이드를 링커에 의해 결합시킨 단백질 G 결합체에 관한 것으로, 상기 결합체는 바이오칩 및 바이오센서의 표면에 방향성 있게 결합하므로 종래에 비해 항체 고정 능력이 향상된 바이오칩 및 바이오센서를 제공한다.
시스테인 태그, 단백질 G(protein G), 바이오센서, 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 올리고 뉴클레오타이드, 결합체
Description
도 1은 스타필로코칼 단백질 G가 항체와 결합하는 결합 도메인인 B1 및 B2를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용한 단백질 G 변형체의 구조 및 항체와 결합하는 도메인 중 하나인 B2의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 도 2에 개시된 발현 벡터에 의해 형질전환된 E. coli로부터 발현된 시스테인이 태그된 단백질 변형체가 발현되는 양상을 나타내는 단백질 전기영동 사진(SDS-PAGE)이다.
도 4는 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 결합된 금 박막 표면 (Gold thin film)에 상기 올리고 뉴클레오타이드에 상보적인 올리고 뉴클레오타이드 (gA)를 가지고 있는 단백질 G 결합체(gA-G)를 고정화하여 항체가 고정화된 바이오센서 및 바이오칩의 모식도이다.
도 5는 단백질 G 결합체(gA-G)를 단백질 전기영동 (SDS-PAGE)로 분석한 사진이다.
도 6은 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 결합된 금 박막 표면에 단백질 G 결합체(gA-G), 상보적인 올리고 뉴클레오타이드(gA), 그리고 대조군으로 상보적이지 않은 올리고 뉴클레오타이드(gB)가 결합하는 양상을 측정한 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 단백질 G 결합체(gA-G)가 고정화된 바이오센서에 100nM PSA에 대한 항체와 항원인 PSA를 반응하여 얻은 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 에폭시 유리표면에 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 결합한 후 마이크로 어레이어를 이용하여 단백질 G 결합체(gA-G)를 고정화하여 어레이를 만든 다음 그 표면에 형광표지물질이 부착된 항체 Cy3-mouse IgG1(1nM)를 처리하여 형광스캐너를 이용하여 얻은 이미지 사진이다.
도 9는 항체가 결합된 금 나노 입자(Gold nano-particle)가 만들어지는 것을 아가로즈 겔(agarose gel)로 분석한 사진이다. (가)는 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 결합된 금 나노 입자(AuNP-cA)에 상보적인 올리고 뉴클레오타이드(gA), 단백질 G 결합체(gA-G), 대조군으로 상보적이지 않은 올리고 뉴클레오타이드(gB) 및 상보적이지 않은 올리고 뉴클레오타이드(gB)-단백질 G 변형체(gB-G)를 반응시킨 후 아가로즈 겔(agarose gel)로 분석한 사진이다. (나)는 금 나노 입자(Gold nano-particle)에 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 결합된 수에 차이가 있는 두 가지의 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 결합된 금 나노 입자(AuNP-cA-I, AuNP-cA-II)에 단백질 G 결합체(gA-G)를 반응시킨 후 결합되지 않은 단백질 G 결합체(gA-G)를 제거한 연후에 항체를 고정화하여 항체의 고정화 양상을 아가로즈 겔(agarose gel)로 분석한 사진이다. (다)는 IgG-레이블된 AuNP-cA-Ⅰ 및 AuNP-cA-Ⅱ의 개략도를 나타낸 것이다.
본 발명은 N 말단에 시스테인이 태그된 단백질 G 변형체와 올리고 뉴클레오타이드를 링커에 의해 연결시킨 단백질 G 결합체(gA-G), 그의 제조방법 및 상기 결합체를 사용하여 제조된 바이오칩 및 바이오센서에 관한 것이다.
항체는 항원에 매우 특이적으로 결합하기 때문에 질병의 진단 및 치료에 관련된 의학적 연구와 생물학적인 물질을 분석하는데 광범위하게 사용되어왔다 (Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 65-69, Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 40-45). 최근에는 면역학적 측정법의 일환으로 항체를 고체지지물질에 고정화하고 전류, 저항, 질량의 변화 및 광학적인 특징 등을 측정하는 면역센서가 개발되었다 (affinity biosensors. vol. 7: Techniques and protocols). 그 중 광학적인 특징을 이용한 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 면역센서가 상업화되었는데, 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도(Kinetics)와 평형상수(equilibrium constants))를 제공할 뿐만 아니라 표지 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다(J. Mol. Recognit. 1999, 12, 390-408).
면역센서에서는 고체지지물질에 항체를 선택적이고 안정적으로 고정화시키는 것이 매우 중요하다. 항체를 고정화하는 기술에는, 크게 화학적 고정화방법과 물리적인 고정화방법의 두 가지가 있다. 물리적인 방법(Trends Anal. Chem.2000 19, 530-540)은 재현성이 낮고 단백질을 변성시키기 때문에 거의 사용되지 않고 있으며 화학적인 방법(Langumur, 1997, 13, 6485-6490)이 단백질을 공유결합으로 잘 결합시켜 재현성이 좋고 적용범위가 넓어 많이 사용되고 있다. 그러나 화학적인 방법으로 항체를 고정화시키는 경우, 항체가 비대칭 거대분자이기 때문에 항체가 방향성을 잃거나 항원과 결합하는 활성을 잃게 되는 경우가 있다(Analyst 121, 29R-32R).
항체의 항원결합능력을 향상시키기 위해 항체를 고체지지물질에 결합시키기 전에 지지체를 사용하는 경우가 있으며, 이러한 지지체로 단백질 G를 사용하는 기술이 공지되어 있다. 그러나 이러한 단백질 G 자체도 지지체에 결합 될 때, 방향성 을 잃어 항체와 결합하는 능력이 감소하는 문제가 있다.
따라서 이와 같은 문제를 해결하기 위해서 여러 가지 방법이 제안되었다. 예를 들면, 스타필로코칼 단백질 G 에 2-이미노치오란(2-iminothiolane)을 처리하여 단백질의 아미노산기를 인산화시킨 후에 인산화된 스타필로코칼 단백질 G를 이용하여 항체를 고정하는 것이다. 그러나 이러한 방법은 특정한 부분을 인산화시키는 것이 아니라 아미노기를 가지는 아미노산(Arg, Asn, Gln, Lys)의 아미노기를 인산화시키므로 특이성이 떨어질 뿐만 아니라 화학처리를 한 이후 정제과정을 거쳐야하는 번거로움이 있다(Biosensors and Bioelectronics, 2005, 21, 103-110).
한편, 고정화하고자 하는 단백질을 고정화시키는데 DNA를 이용하는 방법은 종래 많이 사용되고 있었다. DNA 표면은 단백질 칩에 비해서 안정하고 제조하기도 쉽다고 알려져 있는데, DNA를 이용하여 단백질을 고정화시키는 경우에는 오랜 시간 동안 보관하거나, 불안정한 단백질을 고정화하거나, 불안정한 조건에서 단백질을 보관하는 것은 피하는 것이 좋다. 한편, DNA 표면에 항체를 고정화하는 방법들이 보고되어 있는데 그 첫 번째 예가 스트립토아비딘-DNA 결합체를 이용하여 바이오틴(biotin)이 결합되어 있는 항체를 고정화시키는 것이다. 또한 DNA가 결합되어 있는 금 박막 표면에 DNA 링커를 이용해서 항체를 고정화시킬 수 있다. 그러나 두 방법 모두, 항체에 작은 분자 또는 DNA를 결합시켜야 하므로 항체의 방향성을 잃게 하거나 항원이 결합 되는 부분이 화학적으로 변형될 가능성이 있다는 단점을 가지 고 있다.
본 발명자는 상기와 같은 면역센서에서 항체가 결합할 때 방향성을 잃는 문제점을 해소하고자 연구한 결과 시스테인이 N-말단에 태그된 단백질 G 변형체를 제조하게 되었고, 그의 유용성을 실험을 통해 확인하고, 이에 관하여 대한민국 특허출원 제10-2007-0052560호로 출원하였다(미공개). 뿐만 아니라, 본 발명자는 이를 기초로 하여 아민기와 티올기 모두에 선택적으로 반응하는 링커를 사용하여 아민으로 변형되어 있는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 시스테인으로 태그된 단백질 G 변형체를 화학적으로 결합시켜 단백질 G 결합체(gA-G)를 제조하였으며 이러한 단백질 G 결합체를 사용하여 항체를 다양한 지지체 위에 쉽고, 일정한 방향성을 가지도록 고정화시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 시스테인이 N-말단에 태그된 단백질 G 변형체를 아민기와 티올기 모두에 선택적으로 반응하는 링커를 사용하여 아민기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 결합시킨 단백질 G 결합체(gA-G conjugate)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 G 변형체 및 아민기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)를 아민기 및 티올기 모두에 선택적으로 반응하는 링커와 화 학적으로 결합시키는 단계를 포함하는 단백질 G 결합체(gA-G conjugate)의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 G 결합체(gA-G conjugate)를 고체지지물질의 표면에 결합시켜 제조된 바이오센서 및 상기 단백질 G 결합체를 아민기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 상보적인 DNA 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 표면에 결합되어 있는 고체지지물질에 결합시키는 것을 특징으로 하는 바이오칩 및 바이오센서의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오칩 또는 바이오 센서를 사용하여 항원을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 첫 번째 양태로서, 본 발명은 시스테인이 N-말단에 태그된 단백질 G 변형체를 아민기와 티올기 모두에 선택적으로 반응하는 링커(C)를 사용하여 아민기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 결합시킨 단백질 G 결합체(gA-G conjugate)에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 시스테인이 N-말단에 태그된 단백질 G 변형체는 하기와 같은 구조를 가진다.
Ax-Cys-Ly- 단백질 G - Qz
(A는 아미노산 링커, L은 단백질 G와 시스테인 태그를 연결하는 링커, Q 는 단백질 정제를 위한 태그이고 x는 0 내지 2, y 또는 z 는 각각 0 또는 1이다)
단백질 G는 그룹 G 스트렙토코카이 (streptococci)에서 분리된 박테리아 세포벽 단백질 (cell wall protein)로서, 포유동물의 항체의 Fc 영역 및 Fab 영역과 결합하는 것으로 알려져 있으며 (J. Immuunol. Methods 1988, 112,113-120) 항체의 Fc 부분에 대한 결합력이 Fab 부분에 대한 결합력보다 약 10배 정도 높다고 알려져 있다. 천연의 단백질 G는 시퀀스되어 그 DNA 서열이 공지되어 있다. 스타필로코칼 단백질 G 와 스타필로코칼 단백질 A는 그람 양성 세균들(Gram-positive bacteria)에서 발견되는 세포 표면과 관련된 다양한 단백질 중 하나로, 면역 글로불린 항체에 결합하는 특징이 있다. 그 중에서도 스타필로코칼 단백질 G 변형체가 스타필로코칼 단백질 A보다 더 유용하게 이용되고 있는데, 이는 스타필로코칼 단백질 G 변형체가 보다 넓은 범위의 포유동물의 항체와 결합할 수 있어, 항체의 수용체로 사용하기에 더 적합하기 때문이다.
본 발명에서 사용되는 단백질 G 는 그 기원이 특별히 제한되지 아니하며, 항체 결합력을 보유하는 한 천연형의 단백질 G에 아미노산이 결실, 부가 또는 치환 등이 일어난 형태도 본 발명의 목적에 부합되게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실 시예로서, 본 발명자는 스타필로코칼 단백질 G의 유전자 중 항체와 결합하는 결합 도메인 (B1, B2)만을 사용하였다.
단백질 G-B1 영역은 3개의 베타-쉬트(β-sheet)와 1개의 알파-헬릭스(α-helix)로 구성되는데, 그 중 C-말단의 3번째 베타-쉬트와 알파-헬릭스가 항체 Fc 와의 결합에 관여한다. B1 영역은 서열번호 1, B2 영역은 서열번호 2로, B1의 아미노산 서열과 B2의 아미노산 서열을 비교하면, 4개의 서열의 차이가 있으나 구조상의 차이는 거의 없다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자는 B1 영역의 경우, N-말단 쪽에 10개의 아미노산을 제거한 형태를 사용하였는데(도 1), 10개의 아미노산이 제거된 형태는 항체와의 결합 기능에 아무런 영향이 없음이 알려져 있다(Biochem. J. (1990) 267, 171-177, J. mol. Biol (1994) 243, 906-918, Biochemistry (2000) 39, 6564-6571).
본 발명에서 시스테인 태그 "Cys" 란 단백질 G의 N-말단에 융합되는 시스테인을 말한다. 바람직한 시스테인 태그는 하나의 시스테인으로 구성된다.
본 발명에서 사용되는 단백질 G 변형체에서 시스테인 태그는 단백질 G에 직접 공유결합으로 연결될 수도 있으나, 링커(L)를 통하여 연결될 수도 있다. 링커는 단백질 G와 시스테인 사이에 삽입되는 것으로 임의의 서열을 가진 펩타이드이다. 링커는 아미노산 2개 내지 10개로 구성된 펩타이드이면 족하며, 본 발명의 실시예 에서는 5 개의 아미노산으로 구성된 링커를 사용하였다. 본 발명의 시스테인 태그는 단백질 G 내부에 삽입된 것이 아니고 단백질 G가 고체지지물질에 부착될 때 방향성을 제공하기 위한 것으로서 링커를 부착하면 티올기가 외부에 더 쉽게 노출되어 바이오센서에 더 효율적으로 방향성을 부여하여 결합시킬 수 있다.
또한 본 발명에서 사용되는 단백질 G 변형체의 상기 시스테인에는 0 내지 2개의 아미노산이 연결될 수 있으며, 바람직하게는 메티오닌이다.
본 발명에서 사용되는 단백질 G 변형체는 분리를 용이하게 하기 위하여, C-말단에 단백질 정제를 위한 태그 (Q)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 헥사 히스티딘을 C-말단에 결합시켰으나, 본 발명의 목적상 단백질 정제를 위한 태그로서 공지된 태그를 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 변형체는 원핵세포의 개시코돈인 메티오닌을 포함하거나 또는 포함하지 아니할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자는 하나의 시스테인이 태그된 변형체를 제조하였다.
상기와 같은 단백질 G 변형체는 당해 기술 분야에 널리 알려진 기술, 예를 들어 펩타이드 합성법 또는 유전공학적 방법에 제조할 수도 있으며, 유전공학적 방법에 의해 특히 효율적으로 제조할 수 있다. 유전공학적 방법은 유전자조작에 의해 원하는 단백질을 대장균(E. coli) 등의 숙주세포에서 다량으로 발현시키는 방법 으로서 이에 관한 기술은 공지문헌에 상세히 기술되어 있다(molecular biotechnology: Principle and Application of Recombinant DNA ; ASM Press: 1994, J. chem. Technol. Biotechnol. 1993, 56, 3-13). 상기와 같은 공지 기술들을 사용하여 본 발명에서 사용되는 단백질 G 변형체를 암호화하는 핵산 서열을 적절한 발현벡터에 포함시키고, 상기 발현벡터로 적절한 숙주세포를 형질전환시킨 후에 이 숙주세포를 배양시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 본 발명에 사용되는 단백질 G 변형체의 제조방법은 본 발명자가 출원한 대한민국 특허 출원 제10-2007-0052560호에 상세히 기술되어 있으며, 상기 특허출원에 기재된 내용은 모두 본 발명의 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 일 실시예에서는, N 말단에 시스테인이 태그된 스타필로코칼 단백질 G 변형체 (도 2) 를 암호화하는 염기서열을 포함하는 발현벡터(pET-cys1-L-proteinG)를 제조하였다.
시스테인은 티올 잔기를 가지고 있는 아미노산으로 시스테인을 유전공학적으로 단백질에 삽입하면 단백질을 특이적으로 고정화시킬 수 있음이 알려져 있다 (FEBS Lett. 1990, 270, 41-44, Biotechnol. Lett. 1993, 15, 29-34). 스타필로코칼 단백질 G의 C-말단에 시스테인을 결합시키는 방법은 공지되어 있다. 그러나 본 발명에서는 스타필로코칼 단백질 G 변형체의 활성부위와 멀리 떨어진 N-말단에 티올기가 있는 시스테인을 태그하였다. 스타필로코칼 단백질 G가 항체와 결합하는 활 성부위는 C-말단(3번째 베타 쉬트와 알파 헬릭스)에 존재하므로, 시스테인을 단백질 G 변형체 내부가 아닌 N-말단에 부착시킴으로써 C-말단에 시스테인을 붙이는 등의 방법에 의하였을 때 생길 수 있는 항체의 결합 능력상실을 최소화하였다.
본 발명의 실시예에서는 시스테인을 결합시킨 스타필로코칼 단백질 G 변형체를 제조하였다 (실시예 1). 위의 발명에 따라 유전자 조작을 한 후 단백질 발현 벡터에 삽입하여 단백질을 발현한 다음 단백질 전기영동을 통해 단백질 G 변형체를 분리하였다.
본 발명에서 사용되는 올리고 뉴클레오타이드(guide oligonucleotide, 이하, gA로도 표현함)는 그 길이가 18 내지 30nt 인 올리고머이며고, DNA, RNA, PNA 또는 LNA를 올리고머로서 사용가능하며 바람직하게는 올리고 DNA이다. 그 서열은 실험 목적에 따라 어떠한 서열도 사용 가능하며 이는 당업자들이 용이 적절하게 선택할 수 있으며, 공지 기술에 의해 제조하거나 시판품, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니나 바이오니아 또는 IDT 등에서 시판하는 custom oligonucleotide 등을 사용할 수 있다. 이러한 올리고머의 제작 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 올리고 뉴클레오타이드(gA)는 단백질 G와 링커를 통해 결합하기 위하여 아민기를 포함하고 있으며, 이러한 아민기는 5' 말단, 3' 말단 또는 염기서열 중간에 위치할 수 있다. 또한, 올리고 뉴클레오타이드(gA)에 아민기를 포함시키기 위하여, 당업자는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 상기 올리고 뉴클레 오타이드(gA)의 특정 부위를 아민으로 변형시킬 수 있다. 바람직하게는 5' 말단이 아민으로 변형된 올리고 뉴클레오타이드이다. 상기 올리고 뉴클레오타이드는 그 아민기와 링커와의 결합을 통해 단백질 G 변형체와 연결된다.
또한, 본 발명에서 사용되는 올리고 뉴클레오타이드(gA)는 항체를 결합시키고자 하는 바이오센서의 표면에 결합되어 있는 올리고 뉴클레오타이드(이하, cA로 표현함)와 상보적인 염기 서열을 가진다.
본 발명에서는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 단백질 G 변형체를 결합시켜 단백질 G 결합체를 제조하기 위한 링커로서 아민기 및 티올기 모두와 반응하는 링커(C)를 사용한다. 이러한 본 발명에서 사용되는 링커는 아민기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 단백질 G 변형체를 결합시키기 위한 것으로 예를 들어, Sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), BMPS(N-[Maleimidopropyloxy]succinimide ester), GMBS(N-[Malwimidobutyryloxy]succinimide ester) 및 SMPB(Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate) 등이 있으나, 이러한 예에 한정되지 않고 아민기 및 티올기 모두와 선택적으로 반응하는 성질을 가지는 링커이면 어떠한 것이든 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 Sulfo-SMCC이다.
상기 링커(C)를 통하여 말단이 아민으로 변형된 올리고 뉴클레오타이드(gA) 및 단백질 G 변형체가 상호 연결되어 단백질 G 결합체(gA-G)를 형성하게 된다. 이때, 본 발명의 단백질 G 변형체와 올리고 뉴클레오타이드(gA)는 각각 하나의 티올기와 아민기를 가지고 있어 결합체 형성시 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 단백질 G 변형체가 각각 하나씩 결합된다.
본 발명에 따른 단백질 G 결합체(gA-G)는 바이오센서의 고체지지물질 표면의 올리고 뉴클레오타이드(cA)와 상보적으로 방향성 있게 결합하여 항체를 효율적으로 결합시키므로, 항원-항체 반응을 이용하는 바이오칩 및 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 일 양태로서, 본 발명은 상기 단백질 G 변형체 및 말단이 아민으로 변형된 올리고 뉴클레오타이드(gA)를 아민기 및 티올기 모두에 반응하는 링커와 공유 결합하는 단계를 포함하는 단백질 G 결합체(gA-G)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단백질 G 결합체(gA-G)의 제조방법은 상기에서 언급한 바와 같이 단백질 G 변형체 및 말단이 아민으로 변형된 올리고 뉴클레오타이드(gA)를 아민기 및 티올기 모두에 반응하는 링커와 공유 결합하는 단계를 포함하는데, 이때 바람직하게는 단백질 G 변형체 또는 올리고 뉴클레오타이드(gA) 중 하나의 단백질 G 결합체 구성성분과 링커를 먼저 결합시킨 후에 나머지 구성성분을 결합시킬 수 있다.
또한, 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 제조방법은 추가적으로 상기 결합 단계 이후에 단백질 G 결합체(gA-G)를 분리, 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 분리, 정제 단계에서는 하나 이상의 공지의 단백질 분리, 정제 방법을 당업자가 적절하게 채택할 수 있다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 Sulfo-SMCC를 5' 말단이 아민으로 변형되어 있는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 한 개의 시스테인을 태그한 스타필로코칼 단백질 G 변형체를 결합시켜 단백질 G 결합체(gA-G)를 두 가지 크로마토그래피(anion exchange excellulose로 충진되어진 컬럼, IDA excellulose로 충진되어진 컬럼)로 분리하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단백질 G 결합체(gA-G)를 고체지지물질의 표면에 결합시켜 제조된 바이오칩 또는 바이오센서 및,
a) 단백질 G 결합체(gA-G)의 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 상보적인 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드(cA)를 고체지지물질 표면에 결합시키는 단계;
b) 상기 고체지지물질 표면에 결합된 올리고 뉴클레오타이드(cA)와 단백질 G 결합체(gA-G)의 올리고 뉴클레오타이드(gA)를 결합시키는 단계; 및
c) 상기 고체지지물질에 고정화된 단백질 G 결합체(gA-G)와 항체를 결합시키 는 단계를 포함하는 바이오칩 또는 바이오센서의 제조방법에 관한 것이다.
상기 고체지지물질로는 하기 표1에 기재된 금속 또는 멤브레인, 세라믹, 유리, 고분자 표면 또는 실리콘 등이 사용될 수 있다. 바람직한 고체지지물질은 금 박막 또는 금 나노입자이다.
| 표면 화학 전처리 유/무 | 기질 종류 | 응용 분야 | |
| 박막, 표면 | 나노입자 또는 나노 구조물 | ||
| 무 | Ag | ○ | |
| Ags | ○ | ||
| Au | ○ | ○ | |
| CdSe | ○ | ||
| CdS | ○ | ||
| AuAg | ○ | ||
| AuCu | ○ | ||
| Cu | ○ | ○ | |
| FePt | ○ | ||
| GaAs | ○ | ||
| Ge | ○ | ||
| Hg | ○ | ||
| Pd | ○ | ○ | |
| Pt | ○ | ○ | |
| Stainless Steel 316L | ○ | ||
| Zn | ○ | ||
| ZnSe | ○ | ||
| PdAg | ○ | ||
| Ru, Ir | ○ | ||
| 유 (말레이미드 그룹, 에폭시 그룹, 나이트로페놀 플로린 그룹, 및 메틸 아이오다이드그룹) | 멤브레인 | ○ | |
| 세라믹 | ○ | ||
| 유리 | ○ | ||
| 고분자 표면 | ○ | ||
| 실리콘 | ○ | ||
또한, 상기 고체지지물질의 표면에는 본 발명의 단백질 G 결합체(gA-G)의 올리고 뉴클레오타이드(gA)의 염기서열과 상보적인 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드(complementary oligonucleotide, 이하, cA라고도 표현함)가 결합되어 있다. 고체지지물질의 표면에 올리고 뉴클레오타이드를 결합시키는 당해 업계에 널리 공지되어 있는 방법을 적절히 선택하여 사용할 수 있으며 그 결합 방법은 바이오칩 및 바이오센서의 고체 지지체 구조에 따라 다르다. 일례로서, 유리 슬라이드의 경우 에폭시로 활성화된 유리 슬라이드 위에 아민으로 변형된 상보적 올리고 뉴클레오타이드(cA)를 결합시킬 수 있으며, 금 표면의 경우에는 티올기로 변형된 상보적 올리고 DNA(cA)를 결합시킬 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오칩 및 바이오센서는, 본 발명의 단백질 G 결합체(gA-G)의 그 구성성분인 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 고체지지물질 표면의 올리고 뉴클레오타이드(cA)의 상보적인 결합에 의해 고체지지물질과 결합하게 되며, 이러한 고체지지물질에 결합된 상기 단백질 G 결합체가 항체와 결합함으로써 제조된다. 본 발명의 바이오칩 및 바이오센서는 상기 단백질 G 결합체 및 항체를 고체지지물질에 접촉시킴으로써 용이하게 결합시켜 제조될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오칩 또는 바이오센서는 면역센서의 일종으로서 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 면역센서를 이용한 항원 분석 방법이면 모두 적용가능하므로 이러한 방법을 사용하여 항원을 분석할 수 있다. 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 방법을 사용하여 항원을 분석할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 시스테인 태그된 스타필로코칼 단백질 G 변형체의 단백질 발현 분석
<1-1> 시스테인을 태그한
스타필로코칼
단백질 G
변형체
유전자 제작
N-말단에 시스테인을 태그하기 위해 2개의 프라이머를 제작하였다. 5‘ 프라이머의 염기서열에는 ATG(개시 코돈) 뒤에 GAT(Asp 코돈)와 TGC(시스테인 코돈)가 첨가되었고 단백질 G와의 링커로서 GGC GGC GGC GGC AGC (4개의 Gly 코돈과 1개의 Ser 코돈)을 포함하고 있다. 또한 이 유전자를 발현벡터인 pET21a (Novagen) 에 삽입하기 위해서 N-말단의 프라이머에는 NdeI을, C-말단의 프라이머에는 XhoI 제한 효소 절단 부위를 도입하였다. 스타필로코커스 지노믹 유전자를 얻어 상기 프라이머로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 항체와 결합하는 도메인으로 알려진(B1[앞에 10개의 아미노산이 잘린 형태] , B2) 아미노산 부분만을 수득하였고 수득된 단편을 각 프라이머에 도입된 제한 효소로 절단한 후, NdeI 및 XhoI 제한효소로 잘린 pET21a 벡터에 삽입하여 pET-cys1-L-protein G벡터를 제작하였다. 상기 발현벡터는 N-말단에 메티오닌(Met)을 발현한다.
5' 프라이머 1: 센스 (서열번호 1)
5-GGGAATTCCATATGGATTGCGGCGGCGGCGGCAGCAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCT-3
3' 프라이머 2: 안티센스 (서열번호 2)
5-GAGCTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGTC-3
<1-2> 시스테인을
태그된
스타필로코칼
단백질 G
변형체의
단백질 전기영동
제작된 pET-cys1-L-protein G에 의해 형질 전환된 E. coli BL21을 37℃에서 O.D. (optical density, A600nm) 0.6이 될 때까지 진탕 배양 후, 총 농도 1 mM의 IPTG (이소프로필 베타-디-티오갈락토피라노사이드, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 25℃에서 단백질 발현을 유도하였다. 14시간 후, 세포를 원심 분리하여 얻은 대장균을 초음파 (Branson, Sonifier450, 3 KHz, 3 W, 5 min)로 파쇄한 후, 전체 단백질 용액을 수득하였고 원심분리를 통해 용해성 분획 단백질 용액과 비용해성 분획 단백질로 분리하여 각각의 용액을 얻었다. 단백질 용액을 정제하기 위해서 IDA excellulose로 충진되어진 컬럼에 헥사 히스티딘이 결합되어 있는 재조합 유전자를 발현시킨 세포를 파쇄한 용액을 로딩하였다. 히스티딘이 결합되어 있는 재조합 단백질을 용리 용액(50mM Tris-Cl, 0.5M 이미다졸, 0.5M NaCl, pH8.0)으로 용리시켰다. 얻어진 단백질 용액을 다시 한번 정제하기 위해 Q cellulose로 충진된 컬럼에 로딩하고 1M NaCl로 용리한후 용리된 단백질 용액은 10 mM DTT가 포함된 PBS 완충액 (phosphate-buffered Saline,pH7.4)으로 투석하였다.
단백질들의 전기영동을 위하여 상기에서 수득된 단백질 용액을 완충액(12 mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% 글리세롤, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브롬화페놀블루)과 혼합하여 100℃에서 5분간 가열시킨 후, 1㎜ 두께의 15% 분리 젤 (pH 8.8, 가로 20 cm, 세로 10 cm) 위에 5% 저장 젤 (pH 6.8, 가로 10 ㎝, 세로 12.0 ㎝)을 덮은 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 200-100V, 25 ㎃로 1시간 동안 전기영동하고 쿠마시(Coomasie) 염색액으로 염색하여 재조합 단백질을 확인하였다.
도 3에 개시된 레인의 설명은 다음과 같다;
레인 1: 단백질 크기 마커,
레인 2: 플라스미드 pET-cys1-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 전체 단백질,
레인 3: 플라스미드 pET-cys1-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질,
레인 4: IDA 컬럼 후 정제된 단백질,
레인 5: Q cellulose 컬럼 후 정제된 단백질,
실시예
2 : 단백질 G 결합체(
gA
-G)의 제조
Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1carboxylate) 를 이용하여, 올리고 뉴클레오타이드로서(gA) 아민으로 변형되어 있는 DNA (gA)와 1개의 시스테인을 태그한 스타필로코칼 단백질 G 변형체를 화학적으로 결합시켜 단백질 G 결합체(gA-G)를 제조하였다.
구체적으로, 60 nmole의 5' 말단이 아민으로 변형된 올리고 DNA (gA)를 400 μL의 0.25 M 인산버퍼에 녹인 후 75 μL DMF용액에 녹아있는 1.5 mg (3400 nmole)의 Sulfo-SMCC와 반응시켰다. 상온에서 한 시간 동안 반응시킨 후, 활성화된 올리고 DNA (gA)를 Sephadex G25 gel filtration을 이용하여 반응하지 못한 과량의 Sulfo-SMCC로부터 결합 버퍼(20 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA pH7.0)에 분리한다. 올리고 DNA 활성화 반응을 수행함과 동시에, 시스테인 단백질 G 변형체를 20 mM DTT과 반응시켜 완전히 환원시킨 후, gel filtration을 이용하여 DTT를 제거한다. 이 결과 수득된 시스테인 단백질 G 변형체는 바로 활성화된 올리고 DNA(gA)와 상온에서 두 시간 동안 반응시킨다.
단백질 G와 결합되지 않은 올리고 DNA(gA)는 히스-태그 친화성 컬럼(IDA column)을 통하여 단백질 G 변형체 및 시스테인 태그된 단백질 G 결합체(gA-G)로부터 분리된다. 이후, 단백질 G 결합체(gA-G)는 이온교환컬럼(ion exchange column)을 통하여 결합하지 않은 단백질 G 변형체를 제거하면서 정제가 된다.
단백질 G 결합체(gA-G)를 두 가지 크로마토그래피(IDA excellulose로 충진되어진 컬럼, anion exchange Q cellulose로 충진되어진 컬럼)으로 분리한 다음 단백질 G 결합체(gA-G)를 단백질 전기영동 (Native gel, SDS-PAGE)으로 분석하였다. 단백질 전기영동을 수행한 후에, DNA와 단백질에 특이적인 염색시약인 겔 레드(Gel Red)와 쿠마시 염색액(Commassie)으로 염색하여 분석한 결과, Native gel에서 단백질 G 변형체-DNA 결합체(gA-G)가 상보적인 DNA서열을 가진 올리고머(cA)에만 특이적으로 결합하여 결합체의 이동이 뒤쳐지는 것을 확인하였다(레인2 대 레인3). 그리고 DNA 염색에서만 DNA 밴드의 강도가 증가하였으므로 단백질 G 결합체(gA-G)에 상보적인 올리고머(cA)와 특이적으로 반응하였음을 추가적으로 확인할 수 있었다.
상기 결과를 종합해 보면, 제조된 단백질 G 결합체(gA-G)에서는 일률적으로 하나의 단백질 G 변형체(G)가 하나의 올리고머(gA)에 결합되어 있음을 알 수 있었다. (도 5)
실시예
3 : 단백질 G 결합체(
gA
-G)가 고정화된 바이오센서 및 바이오칩의 제조방법
올리고 DNA (gA)를 한 개의 시스테인을 태그한 스타필로코칼 단백질 G 변형체와 화학적으로 결합을 시킨 후, 올리고 DNA(gA)와 상보적인 올리고 DNA(cA)를 결합시킨 금 박막 표면에 반응시켜 단백질 G 결합체(gA-G)가 고정화된 바이오센서 및 바이오칩을 제조하였다.
구체적으로, 금 박막 표면에 올리고 DNA(cA)를 반응시킨 후, 그 위에 상보적인 올리고 DNA (gA), 단백질 G 결합체(gA-G), 그리고 상보적이지 않은 대조군 올리고 DNA (gB)가 고정되는 반응을 실시간으로 감지할 수 있는 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR)를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정하였다.
그 결과, 상보적이지 않은 대조군 올리고 DNA (gB)를 주입하였을 경우에는 거의 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 없었고 상보적인 올리고 DNA (gA,7.5 kDa)를 주입하였을 때는 231RU 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였고 올리고 DNA (gA)에 결합된, 단백질 G 결합체 (gA-G, 21.5kDa)를 주입하였을 경우에는 564RU 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였다. 이러한 결과에 의하면, 올리고 DNA (cA)가 고정화된 금 박막 표면 위에 올리고 DNA (gA,7.5 kDa)와 단백질 G 결합체 (gA-G, 21.5kDa)가 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있다.
또한 표면(mm2)에 결합된 올리고 DNA (gA,7.5 kDa)와 단백질 G 결합체 (gA-G, 21.5kDa)의 개수를 계산했을 때, 올리고 DNA (gA,7.5 kDa)는 1.8 × 1010 molecules/mm2 이고 단백질 G 결합체 (gA-G, 21.5kDa)는 1.6 × 1010 molecules/mm2 으로 올리고 DNA (gA,7.5 kDa)에 비해 약간 낮은 밀도를 갖는다. 이것은 올리고 DNA가 상보적인 반응을 할 때, 단백질 G 변형체가 약간 상보작용을 방해하는 것을 알 수 있다.
그러나 단백질 G 결합체 (gA-G)는 항체를 효율적으로 결합시킬 수 있는 표면을 형성하는 것은, 그 표면 위에 여러 항체를 반응시킨 경우, 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR)를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호가 증가하는 것으로 증명할 수 있다.(도 6)
실시예
4 : 단백질 G 결합체(gA-G)를 통해 항체를 결합시킨 바이오 센서를 이용한 항원의 감지
올리고 DNA의 상보적인 결합으로 고정화된 스타필로코칼 단백질 G 결합체를 통해 항체를 결합시킨 바이오센서를 이용하여 항원을 감지하였다.
구체적으로, 상보적인 올리고 DNA(cA)를 결합한 금 박막 표면에 50nM의 단백질 G 결합체 (gA-G)를 고정화시키는 시간을 달리하여(10분, 7분) 고정화시킨 후 항체(anti-human Kallikrein 3/PSA antibody, R&D systems,100nM)와 그의 항원(Recombinant Human kallikrein 3/PSA, 100nM)이 결합되는 양상을 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR) 를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정하였다.
그 결과, 10분 동안 단백질 G 결합체 (gA-G)를 반응시켰을 경우, 775RU 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였고 7분 동안 단백질 G 결합체 (gA-G)를 반응시킨 경우, 297RU 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였다. 775RU 정도 gA-G가 고정화된 표면에 항체를 반응시킨 경우에는 2440RU 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였고 297RU 정도 gA-G가 고정화된 표면에 항체를 반응시킨 경우에는 1296RU 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였다. 775RU 정도 gA-G가 고정화된 표면에 항체가 2440RU 정도 결합 되어있는 표면에서는 항원을 반응시켰더니 435RU 정도 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였고 297RU 정도 gA-G가 고정화된 표면에 항체가 1296RU 정도 결합되어있는 표면에서는 항원을 반응시켰더니 231RU 정도 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였다.(도 7)
실시예
5 : 금 박막 이외의
DNA
어레이에
결합된
단백질 G 결합체를 이용한 항체 고정
금 박막 표면이 아닌 다른 표면에서도 DNA 어레이를 제작하고 DNA (gA, 21.5kDa)에 결합된 단백질 G 결합체를 이용하여 항체를 고정화시켰다.
구체적으로, 유리표면 위에 만들어진 에폭시 그룹에 아민기가 결합되어 있는 올리고 뉴클레오타이드 (cA와 cB)들을 DNA 어레이어(arrayer)를 이용해서 어래이를 제작한 후 BSA로 비 특이적인 반응을 막은 다음에 표면에 단백질 G 결합체(gA-G)와 형광으로 표지 되어 있는 항체(Monoclonal mouse IgG-Cy3 (150nM))를 섞은 용액을 반응시킨 후에 형광스캐너를 이용하여 형광 시그널을 측정하였다.
그 결과, 항체와 결합된 단백질 G 결합체 (gA-G)가 상보적인 올리고 뉴클레오타이드 cA에 결합을 하기 때문에 상보적인 올리고 뉴클레오타이드 cA에서만 형광이 측정되었고 상보적이지 않은 올리고 뉴클레오타이드 cB에서는 형광이 측정되지 않았다. 위의 결과는 비 특이적인 반응 없이 특이적으로 DNA 어레이를 이용해서 쉽게 항체를 고정화시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. (도 8)
실시예
6 : 단백질 G 결합체 (
gA
-G)를 이용하여 항체를 결합시킨
금 나노 입자의 제조
단백질 G 결합체 (gA-G)를 이용하여 항체가 결합한 금 나노 입자를 제조하였다.
구체적으로, 상보적인 올리고 뉴클레오타이드 cA가 결합되어 있는 금 나노 입자를 gA-G(21.5 KDa)와 gA (7.5KDa)에 결합시켰을 때 gA-G(21.5 KDa)가 결합된 밴드가 gA (7.5KDa)보다 더 이동 정도가 낮아져서 네이티브(native) 겔에서 밴드 상 더 높은 곳에 위치하는 것을 알 수 있었다. 또한, 단백질 G 결합체(gA-G)가 cA에 결합하기에 충분한 공간을 확보하기 위해 상보적인 올리고 뉴클레오타이드(cA)를 두 가지 다른 개수로 금 나노 입자에 결합되게 만든 다음(평균 21개 또는 9.5개의 gA가 결합할 수 있게 만듬), 단백질 G 결합체(gA-G)를 결합시킨 뒤 항체를 결합시켰다(human IgGs).
그 결과, 평균 21개의 gA가 결합할 수 있는 금 나노 입자에 더 많은 개수의 단백질 G 결합체(gA-G)와 항체가 결합하는 것을 알 수 있었다.
또한 이 실험에서는 원심분리기를 이용하여 cA가 결합되어 있는 금 나노 입자에 gA-G(21.5 KDa)이 결합된 금나노 입자를 회수할 수 있었으며 단백질 변형체에 달린 헥사 히스티딘을 이용하여 쉽게 결합 되지 않은 항체를 제거할 수 있었다. 상기의 결과를 종합해보면 단백질 G 결합체(gA-G)는 항체가 결합 되어 있는 금 나노 입자를 만드는데 유용하게 사용될 수 있음을 증명할 수 있다 (도 9).
본 발명에 따른 시스테인 태그된 단백질 G 변형체와 올리고 뉴클레오타이드(gA)가 링커에 의해 결합된 단백질 G 결합체는 바이오센서의 고체지지물질 표면의 올리고 뉴클레오타이드(cA)와 상보적으로 방향성 있게 결합하여 항체를 효율적으로 결합시키므로 항원-항체 반응을 이용하는 바이오칩 및 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Protein G-oligonucleotide conjugate
<130> PA9705-0306/KR
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer 1 : sense
<400> 1
gggaattcca tatggattgc ggcggcggcg gcagcaaagg cgaaacaact actgaagct 59
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer : antisense
<400> 2
gagctcgagt tcagttaccg taaaggtctt agtc 34
Claims (20)
- 하기 식으로 표현되는 N-말단에 시스테인 태그된 단백질 G 변형체를 아민기와 티올기 모두에 선택적으로 반응하는 링커를 사용하여 아민기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 결합시킨 단백질 G 결합체(gA-G conjugate).Ax-Cys-Ly- 단백질 G - Qz(A는 아미노산 링커, L은 단백질 G와 시스테인 태그를 연결하는 링커, Q 는 단백질 정제를 위한 태그이고 x는 0 내지 2, y 또는 z 는 각각 0 또는 1이다).
- 제1항에 있어서, 상기 올리고 뉴클레오타이드(gA)는 올리고 DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질 G 결합체.
- 제2항에 있어서, 상기 올리고 뉴클레오타이드(gA)는 올리고 DNA인 단백질 G 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 아민기를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)는 5' 말단이 아민기로 변형된 것인 단백질 G 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 아민기와 티올기 모두에 반응하는 링커는 Sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), BMPS(N-[Maleimidopropyloxy]succinimide ester), GMBS(N-[Malwimidobutyryloxy]succinimide ester) 및 SMPB(Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate)에서 선택되는 하나인 단백질 G 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 올리고 뉴클레오타이드(gA)는 18nt 내지 30nt의 길이를 가지는 단백질 G 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 G 변형체 및 올리고 뉴클레오타이드(gA)가 각각 하나씩 결합된 단백질 G 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 G 변형체에서 단백질 G와 시스테인 태그를 연결하는 링커(L)는 2 내지 10개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드인 단백질 G 결합체.
- 제8항에 있어서, 단백질 G와 시스테인 태그를 연결하는 링커(L)는 DDDDK(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)의 아미노산 서열을 가지는 것인 단백질 G 결합체.
- 하기 식으로 표현되는 N-말단에 시스테인 태그된 단백질 G 변형체 및 아민기 를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드(gA)를 아민기 및 티올기 모두에 반응하는 링커와 공유 결합시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질 G 결합체의 제조방법.Ax-Cys-Ly- 단백질 G - Qz(A는 아미노산 링커, L은 단백질 G와 시스테인 태그를 연결하는 링커, Q 는 단백질 정제를 위한 태그이고 x는 0 내지 2, y 또는 z 는 각각 0 또는 1이다).
- 제10항에 있어서, 상기 결합 단계 이후에 단백질 G 결합체를 분리, 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 단백질 G 결합체의 제조방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질 G 결합체를 고체지지물질의 표면에 결합시켜 제조된 바이오칩 또는 바이오센서.
- 제12항에 있어서, 상기 고체지지물질은 그 표면에 단백질 G 결합체의 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 상보적인 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드(cA)가 결합된 바이오칩 또는 바이오센서.
- 제12항에 있어서, 상기 고체지지물질은 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금속 중에서 선택되는 것인 바이오칩 또는 바이오센서.
- 제14항에 있어서, 상기 바이오칩 또는 바이오센서는 금 박막 또는 금 나노입자인 바이오칩 또는 바이오센서.
- 제12항에 있어서, 상기 단백질 G 결합체에 항체가 결합된 바이오칩 또는 바이오센서.
- a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질 G 결합체의 올리고 뉴클레오타이드(gA)와 상보적인 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드(cA)를 고체지지물질 표면에 결합시키는 단계;b) 상기 고체지지물질 표면에 결합된 올리고 뉴클레오타이드(cA)와 단백질 G 결합체의 올리고 뉴클레오타이드(gA)를 결합시키는 단계; 및c) 상기 고체지지물질에 고정화된 단백질 G 결합체와 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 바이오칩 또는 바이오센서의 제조방법.
- 제17항에 있어서, 상기 고체지지물질은 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금속 중에서 선택되는 것인 제조방법.
- 제18항에 있어서, 상기 바이오칩 또는 바이오센서는 금 박막 또는 금 나노입자인 바이오칩 또는 바이오센서.
- 제12항의 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법.
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