KR20160053609A

KR20160053609A - 링커를 통한 단백질 g와 항체의 결합체

Info

Publication number: KR20160053609A
Application number: KR1020140152894A
Authority: KR
Inventors: 박승범; 박한검
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2016-05-13
Also published as: KR101695274B1

Abstract

본 발명은 단백질 G-링커 결합체, 상기 단백질 G-링커 결합체가 고체지지물질의 표면에 결합된 바이오칩 또는 바이오센서, 및 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 G-링커 결합체로 인해 항체의 방향성을 조절하면서 선택적으로 표지가 가능하게 되어, 항원-항체 결합부위를 방해하지 않으면서 항체를 센서 표면에 고정할 수 있다.

Description

링커를 통한 단백질 G와 항체의 결합체 {PROTEIN G-LINKER CONJUGATION USING A LINKER}

본 발명은 단백질 G-링커 결합체, 상기 단백질 G-링커 결합체가 고체지지물질의 표면에 결합된 바이오칩 또는 바이오센서, 및 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법에 관한 것이다.

항체는 항원에 매우 특이적으로 결합하기 때문에 질병의 진단 및 치료에 관련된 의학적 연구와 생물학적인 물질을 분석하는데 광범위하게 사용되어왔다. 최근에는 면역학적 측정법의 일환으로 항체를 고체지지물질에 고정화하고 전류, 저항, 질량의 변화 및 광학적인 특징 등을 측정하는 면역센서가 개발되었다.　 그 중 광학적인 특징을 이용한 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 면역센서가 상업화되었는데, 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도(Kinetics)와 평형상수(equilibrium constants))를 제공할 뿐만 아니라 표지 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다.

면역센서에서는 고체지지물질에 항체를 선택적이고 안정적으로 고정화시키는 것이 매우 중요하다. 항체를 고정화하는 기술에는, 크게 화학적 고정화방법과 물리적인 고정화방법의 두 가지가 있다. 물리적인 방법은 재현성이 낮고 단백질을 변성시키기 때문에 거의 사용되지 않고 있으며 화학적인 방법이 단백질을 공유결합으로 잘 결합시켜 재현성이 좋고 적용범위가 넓어 많이 사용되고 있다. 그러나 화학적인 방법으로 항체를 고정화시키는 경우, 항체가 비대칭 거대분자이기 때문에 항체가 방향성을 잃거나 항원과 결합하는 활성을 잃게 되는 경우가 있다.

항체의 항원결합능력을 향상시키기 위해 항체를 고체지지물질에 결합시키기 전에 지지체를 사용하는 경우가 있으며, 이러한 지지체로 단백질 G를 사용하는 기술이 공지되어 있다. 그러나 이러한 단백질 G 자체도 지지체에 결합 될 때, 방향성을 잃어 항체와 결합하는 능력이 감소하는 문제가 있다.

따라서 이와 같은 문제를 해결하기 위해서 대한민국 공개특허 제10-2009-0117406호에서는 저분자 화합물 링커에 벤조페논을 삽입하여 자외선 조사를 통해 항체에 공유결합을 시도하는 것을 기재하고 있다. 그러나, 상기 문헌의 경우 라디칼 기작에 의해 벤조페논의 반응이 일어나므로 자외선 조사 단계가 필요하고, 라디칼 반응의 특성 상 비특이적 반응이 불가피한 한계점이 있다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0117406호

이에, 본 발명자는 항체의 방향성을 조절하면서 선택적으로 표지가 가능하게 되어, 항원-항체 결합부위를 방해하지 않으면서 항체를 센서 표면에 효과적이고 간편하게 고정할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 21번, 22번, 24번, 29번 및 47번에 위치한 아미노산 중 적어도 하나 이상이 시스테인(cystein)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 및 링커를 포함하며, 상기 단백질 G와 링커는, 링커의 말단에 있는 말레이미드 그룹과 단백질 G의 티올기의 반응에 의해 결합된 것인, 단백질 G-링커 결합체를 제공한다.

일 구현예는 상기 단백질 G가 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

다른 일 구현예는 상기 링커가 말단에 말레이미드 그룹을 포함하며, 다른 쪽 말단에는

,

,

, ,

, 또는

를 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 링커가 하기 화학식 1 내지 6 중 어느 하나인 것일 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

상기 화학식 1 내지 6에서, n은 1 내지 5 이다.

또 다른 일 구현예는 상기 단백질 G에 금 결합 펩타이드(GBP, gold binding peptide)가 도입된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 단백질 G-링커 결합체가 고체지지물질의 표면에 결합된 바이오칩 또는 바이오센서를 제공한다.

일 구현예는 고체지지물질은 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금속 중에서 선택되는 것일 수 있다.

다른 일 구현예는 고체지지물질이 금 박막 또는 금 나노입자인 것일 수 있다.

또 다른 일 구현예는 단백질 G-링커 결합체에 항체가 결합된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 단백질 G-링커 결합체로 인해 항체의 방향성을 조절하면서 선택적으로 표지가 가능하게 되어, 항원-항체 결합부위를 방해하지 않으면서 항체를 센서 표면에 고정할 수 있다.

또한, 본 발명은 라디칼 반응과 달리, 친핵성 아실 치환 반응에 의해 일어나기 때문에 자외선 조사가 불필요하고, 항체의 친핵체가 링커를 선택적으로 공격하여 공유결합 반응의 선택성이 증가된다.

도 1은 실시예 1에 따른 PCR 조건을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에 따른 PCR 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3에 따른 링커의 합성 방법을 모식도로 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4.2에 따른 융합단백질에 링커가 연결되었음을 MALDI 질량분석을 통해 나타낸 결과이다.
도 5는 실시예 5.2에 따른 SDS-PAGE 단백질 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 단백질 G, 링커 및 항체와의 결합관계를 나타낸 그림이다.
도 7은 실시예 1 내지 5의 전반적인 실험과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 8은 단백질 G-링커 결합체의 응용가능분야로서 실제적용을 도면으로 나타낸 것으로, 1)은 금 결합 단백질을 추가함으로써 바이오센서로 이용될 수 있음을 나타낸 것이며, 2)는 치료용 항체-약물 결합체의 제조에 이용될 수 있음을 나타낸 것이다.

본 발명은 단백질 G와 링커가 연결됨에 따라, 단백질 G가 항체의 Fc 부위와 결합하면 결합 부위 주위에 존재하는 Fc 부위의 라이신이 인접효과에 의해 링커와 선택적으로 반응하여 공유결합을 형성하여 항체의 방향성을 조절하면서 선택적으로 표지가 가능하게 하여, 항원-항체 결합부위를 방해하지 않으면서 항체를 센서 표면에 고정할 수 있는 것이 특징이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 21번, 22번, 24번, 29번 및 47번에 위치한 아미노산 중 적어도 하나 이상이 시스테인(cystein)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 및 링커를 포함하며, 상기 단백질 G와 링커는, 링커의 말단에 있는 말레이미드 그룹과 단백질 G의 티올기의 반응에 의해 결합된 것인 단백질 G-링커 결합체를 제공한다.

단백질 G(protein G, PG)는 그룹 G 스트렙토코카이 (streptococci)에서 분리된 박테리아 세포벽 단백질 (cell wall protein)로서, 포유동물의 항체의 Fc 영역 및 Fab 영역과 결합하는 것으로 알려져 있는 것으로, 본 발명에서 사용되는 단백질 G는 그 기원이 특별히 제한되지 아니하며, 항체 결합력을 보유하는 한 천연형의 단백질 G에 아미노산이 결실, 부가 또는 치환 등이 일어난 형태로 사용될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 21번, 22번, 24번, 29번, 및 47번에 위치한 아미노산 중 적어도 하나 이상이 시스테인(cystein)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 단백질 G의 N 말단으로부터 21번, 22번, 24번, 29번 및 47번에 위치한 아미노산은 항체와의 결합부위 주위에 존재하면서도 직접적으로 결합에 참여하지 않고 잔기의 방향이 결합부위를 향하고 있기 때문에, 상기 위치의 아미노산을 티올기를 가진 시스테인으로 돌연변이 시킴으로써 링커의 말단에 있는 말레이미드 그룹과 반응시켜 링커를 연결시킬 수 있다.

상기와 같은 시스테인으로 돌연변이된 단백질 G는 당해 기술 분야에 널리 알려진 기술, 예를 들어 펩타이드 합성법 또는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있으며, 유전공학적 방법에 의해 특히 효율적으로 제조될 수 있다. 유전공학적 방법은 유전자조작에 의해 원하는 단백질을 대장균(E. coli) 등의 숙주세포에서 다량으로 발현시키는 방법으로서 이에 관한 기술은 공지문헌에 상세히 기술되어 있다(molecular biotechnology: Principle and Application of Recombinant DNA; ASM Press: 1994, J. chem. Technol. Biotechnol. 1993, 56, 3-13). 상기와 같은 공지 기술들을 사용하여 본 발명에서 사용되는 단백질 G는 암호화하는 핵산 서열을 적절한 발현벡터에 포함시키고, 상기 발현벡터로 적절한 숙주세포를 형질전환시킨 후에 이 숙주세포를 배양시킴으로써 용이하게 제조 될 수 있다.

상기 링커는 단백질 G와 결합하기 위해 말단에 말레이미드 그룹을 포함하며, 다른 쪽 말단에는 항체부위와 공유결합하기 위한 이탈기(leaving group)를 포함할 수 있으며, 상기 이탈기로는

,

,

,

,

,

등을 들 수 있다.

예컨대, 상기 링커는 하기 화학식 1 내지 6 중 어느 하나인 것일 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

상기 화학식 1 내지 6에서, n은 1 내지 5 이다.

본 발명에 따른 단백질 G-링커 결합체는 고체지지물질의 표면에 결합하여 항체를 효율적으로 결합시키므로, 항원-항체 반응을 이용하여 바이오칩 또는 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 상기 단백질 G-링커 결합체에서, 단백질 G는 고체지지물질과 결합하기 위한 물질이 추가로 포함될 수 있다. 예컨대, 금 표면에 결합시키기 위해 추가물질로서 금 결합 펩타이드(GBP, gold binding peptide)를 도입한 융합단백질이 사용될 수 있다.

상기 고체지지물질은 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금속 중에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 금 박막 또는 금 나노입자인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명에서의 바이오칩 또는 바이오센서는 면역센서의 일종으로서 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 면역센서를 이용한 항원 분석 방법이면 모두 적용가능하므로 이러한 방법을 사용하여 항원을 분석할 수 있다. 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 방법을 사용하여 항원을 분석할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

실시예 1. 돌연변이 단백질 G 제작

항체와 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 G(protein G)가 결합한 상태의 결정 구조를 참고하여 결합부위에 인접하되, 상기 결합을 직접적으로 방해시키지 않는 위치의 잔기인 발린 (상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 21번 위치, V21) 또는 아스파르산 (상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 22번 위치, D22)를 시스테인(C)으로 돌연변이 시켰다.

<서열번호 1, 단백질 G>

TTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

구체적으로 V21C 돌연변이를 위한 프라이머(Forward primer(서열번호 6), 5'-CTGAAGCGTGTGATGCTGCTACAGCAGAAG-3'(Reverse primer(서열번호 7), 5'- GCAGCATCACACGCTTCAGTAGTTGTCTCG-3'와 D22C 돌연변이를 위한 프라이머(Forward primer(서열번호 8), 5'-GAAGCGGTTTGTGCTGCTACAGCAGAGAAG-3'(Reverse primer(서열번호 9), 5'-CTGTAGCAGCACAAACCGCTTCAGTAGTTGTCT-3'를 이용하여 PCR(조건: 도 1 참조)를 수행함으로써 N 말단으로부터 21번 위치인 발린 또는 22번 위치인 아스파르산이 시스테인으로 돌연변이된 뉴클레오티드(서열번호 4 또는 서열번호 5)를 제조하였고, 이를 DH5α 대장균에 형질전환 후 발현시켜 돌연변이 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 G를 얻었다.

<서열번호 2, 단백질 G V21C>

TTYKLVINGKTLKGETTTEACDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

<서열번호 3, 단백질 G D22C>

TTYKLVINGKTLKGETTTEAVCAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE

<서열번호 4, 단백질 G V21C>

5'-ACAACTTATAAACTGGTAATTAACGGGAAAACACTGAAAGGCGAGACAACTACTGAAGCGTGTGATGCTGCTACAGCAGAGAAGGTCTTCAAACAATACGCTAATGATAATGGAGTTGACGGGGAATGGACGTATGATGATGCGACAAAAACCTTTACAGTGACAGAA-3'

<서열번호 5, 단백질 G D22C>

5'-ACAACTTATAAACTGGTAATTAACGGGAAAACACTGAAAGGCGAGACAACTACTGAAGCGGTTTGTGCTGCTACAGCAGAGAAGGTCTTCAAACAATACGCTAATGATAATGGAGTTGACGGGGAATGGACGTATGATGATGCGACAAAAACCTTTACAGTGACAGAA-3'

실시예 2. 금 결합 단백질과 돌연변이 단백질 G의 융합 단백질 제작

서열번호 10로 표시되는 염기서열(GBP, 금 결합 단백질)과 상기 실시예 1의 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 염기서열(단백질 G V21C 또는 D22C)로 이루어진 뉴클레오티드(서열번호 11 또는 12)를 합성하였다.

구체적으로 금 결합 단백질과 단백질 G 의 염기서열 사이에 글라이신 및 세린을 총 8개 삽입하여 (즉, GGSGGGSG를 삽입) 각 단백질의 접힘이 방해 받지 않도록 염기서열을 설계하였고, 서열번호 11 및 12는 하기와 같다.

<서열번호 10, 금 결합 단백질>

5'-ATGCACGGGAAAACACAAGCCACATCAGGTACCATTCAGAGCATGCATGGCAAAACTCAAGCAACTTCCGGCACGATCCAGAGTATGCACGGTAAGACCCAGGCAACGTCTGGTACAATTCAGTCGATGCATGGTAAAACTCAGGCGACATCTGGAACAATACAGTCAATGCATGGCAAAACCCAGGCCACTAGCGGTACAATTCAATCCATGCATGGTAAAACGCAAGCAACGAGTGGGACCATCCAGAGTATGCATGGAAAGACCCAAGCCACGAGCGGAACAATACAGTCA-3'

<서열번호 11, 융합단백질(V21C) >

5'-ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGAATTCGCCATGCACGGGAAAACACAAGCCACATCAGGTACCATTCAGAGCATGCATGGCAAAACTCAAGCAACTTCCGGCACGATCCAGAGTATGCACGGTAAGACCCAGGCAACGTCTGGTACAATTCAGTCGATGCATGGTAAAACTCAGGCGACATCTGGAACAATACAGTCAATGCATGGCAAAACCCAGGCCACTAGCGGTACAATTCAATCCATGCATGGTAAAACGCAAGCAACGAGTGGGACCATCCAGAGTATGCATGGAAAGACCCAAGCCACGAGCGGAACAATACAGTCAGGTGGATCGGGTGGCGGCTCTGGTACAACTTATAAACTGGTAATTAACGGGAAAACACTGAAAGGCGAGACAACTACTGAAGCGtgtGATGCTGCTACAGCAGAGAAGGTCTTCAAACAATACGCTAATGATAATGGAGTTGACGGGGAATGGACGTATGATGATGCGACAAAAACCTTTACAGTGACAGAATAA-3

<서열번호 12, 융합단백질(D22C)>

5'-ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGAATTCGCCATGCACGGGAAAACACAAGCCACATCAGGTACCATTCAGAGCATGCATGGCAAAACTCAAGCAACTTCCGGCACGATCCAGAGTATGCACGGTAAGACCCAGGCAACGTCTGGTACAATTCAGTCGATGCATGGTAAAACTCAGGCGACATCTGGAACAATACAGTCAATGCATGGCAAAACCCAGGCCACTAGCGGTACAATTCAATCCATGCATGGTAAAACGCAAGCAACGAGTGGGACCATCCAGAGTATGCATGGAAAGACCCAAGCCACGAGCGGAACAATACAGTCAGGTGGATCGGGTGGCGGCTCTGGTACAACTTATAAACTGGTAATTAACGGGAAAACACTGAAAGGCGAGACAACTACTGAAGCGGTTtgtGCTGCTACAGCAGAGAAGGTCTTCAAACAATACGCTAATGATAATGGAGTTGACGGGGAATGGACGTATGATGATGCGACAAAAACCTTTACAGTGACAGAATAA-3'

상기 서열번호 11의 염기서열의 5'말단의 NdeI 제한효소 절단 부위, 3'말단에는 XhoI 제한효소 절단 부위를 도입하도록 프라이머(NdeI 절단 프라이머(센스): 5'-GGAATTCCATATGGAATTCGCCATGCACG-3' 서열번호 13)(XhoI 절단 프라이머(안티센스): 5'-CCGCTCGAGTTATTCTGTCACTGTAAAGGTTTTT-3' 서열번호 14)를 설계한 뒤, 상기 프라미어를 이용하여 PCR를 수행(조건: 도 2 참조)함으로써 서열번호 11의 염기서열 말단에 제한효소 부위가 도입된 뉴클레오티드를 증폭시켰다. 상기 증폭된 뉴클레오티드와 pET21a(+) 벡터를 각각 NdeI와 XhoI 제한효소로 절단한 후, T4 ligase를 이용하여 서로 연결시켜 발현벡터를 얻었다.

이후 상기 발현벡터를 BL21 대장균에 형질전환 시켰고, 0.5mM의 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 더하고 37℃에서 4시간 동안 배양하여 단백질 발현을 유도함으로써 금 결합 단백질과 돌연변이 단백질 G의 융합 단백질을 발현시켰다.

세포 펠릿(pellet)을 분쇄 버퍼(300mM 염화나트륨, 50mM 인산나트륨, 10mM 이미다졸, pH 8.0)에 서스펜션 시킨 후 초음파 분쇄기를 이용해 세포를 분쇄하였다. 이후, 융합단백질의 N 말단에는 히스티딘 태그가 부착되어 있어서 수세 버퍼(300mM 염화나트륨, 50mM 인산나트륨, 50mM 이미다졸, pH 8.0)로 씻어주면 융합단백질만 니켈 비드에 붙고 다른 단백질은 씻겨 나가는 원리를 이용하여, 상기 분쇄액을 니켈 비드가 충전된 컬럼에 넣고 4℃에서 1시간 동안 부착시켰고, 용출 버퍼(300mM 염화나트륨, 50mM 인산나트륨, 300mM 이미다졸, pH 8.0)로 융합단백질을 니켈 비드에서 해리시키고 용출액을 모아서 원하는 융합단백질를 얻었다. 정제된 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 10% 글리세롤이 포함된 PBS(phosphate-buffered saline(pH 7.4)로 버퍼를 교체하였다.

실시예 3. 링커 합성

도 3에 기재된 바와 같이 링커를 합성하였으며, 구체적인 합성 방법은 하기 3.1 내지 3.6과 같다.

3.1.

2-아미노에탄올(2-aminoethanol)을 다이클로로메테인(dichloromethane, DCM)에 녹인 용액에 다이클로로메테인에 녹인 다이터트뷰틸바이카보네이트(di-tert-butyl bicarbonate)를 천천히 넣어주었다. 이를 교반기에서 0℃에서 천천히 상온까지 밤새 교반하여 용매를 모두 날려주었다.

3.2

트라이페닐포스핀(triphenylphosphine)을 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)에 녹인 용액에 -78℃ 조건에서 다이에틸 아조다이카복실레이트(diethyl azodicarboxylate)를 THF에 녹인 용액을 천천히 넣어주었다. 이후 상기 3.1에서 얻은 화합물을 THF에 녹인 용액과 말레이미드(maleimide)를 THF에 녹인 용액을 같이 첨가하였고, -78℃에서 수분 동안 교반 해주다가 상온으로 온도를 높이고 36시간 동안 교반하여, 용액의 용매를 모두 날려 농축하였다. 이후 에틸 이써(ethyl ether)를 넣어서 석출시키고 이것을 여과하였고, 여과 후 얻은 용액을 날려 농축시킨 후 실리카 겔 컬럼을 통해서 정제하였다.

3.3 TFA(trifluoroacetic acid)를 DCM에 녹여 30%의 용액을 만들었고, 상기 용액에 상기 3.2에서 얻은 화합물을 넣어 상온에서 2시간동안 교반하여 용액을 모두 날렸다. 이후 에틸 이써를 넣어서 여러 번 날려줌으로써 TFA를 온전히 제거하여 추가적인 정제 없이 화합물을 얻어냈다.

3.4

Boc-AA-OH(boc이 보호된 아미노산 n=1, 3, 5), HCTU(O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate)와 TEA(triethylamine)를 DMF(dimethylforamide)에 녹인 용액을 상온에서 10분간 교반하면서 활성화시켜 주었다. 상기 3.3에서 얻은 화합물을 넣어주었고 상온에서 밤새 교반하였으며, 이를 브라인(brine)과 EA(ethyl acetate)를 통해서 유기층으로 화합물들을 뽑아내었다. 이를 MgSO₄를 통해서 물을 제거해주고 얻은 용액을 날려준 후, 실리카 겔 컬럼을 통해서 원하는 화합물을 얻었다.

3.5

TFA(trifluoroacetic acid)를 DCM에 녹여 30%의 용액을 만들었고, 상기 3.4에서 얻은 화합물을 넣어준 후 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 이후 용액을 모두 날려주고, 에틸 이써를 넣어서 여러 번 날려줌으로써 TFA를 온전히 제거하여 추가적인 정제 없이 화합물을 얻어내었다.

3.6

상기 3.5에서 얻은 화합물을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹였다. 이후 1,1-카보닐다이이미다졸(1,1-carbonyldiimidazole)을 넣어주고 10분간 볼텍싱(vortexing)하여 하기 화학식 1의 링커를 제조하였다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 n은 1, 3 또는 5이다.

실시예 4. 돌연변이 단백질 G와 링커의 연결

4.1

이황화결합을 통해 이량체로 존재하는 상기 실시예 1의 돌연변이 단백질 G를 환원시키기 위해, TCEP(tris-(2-carboxyethyl)phosphine)을 상기 돌연변이 단백질 G에 15배 당량(TCEP: 돌연변이 단백질 G=15:1) 정도 첨가한 후 4℃ 조건에서 30분간 보관하였다. 이후 상기 실시예 3에서 제조된 링커(화학식 1의 구조를 가지며, n은 3이다)를 돌연변이 단백질 G의 15배 당량 정도 첨가한 후 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 반응하여 링커가 연결된 돌연변이 단백질 G를 크기 배제 크로마토그래피법을 이용하여 반응하지 않은 것들로부터 정제하였고, MALDI 질량분석을 이용하여 반응 전후의 피크의 이동을 측정하였다.

4.2

TCEP을 상기 실시예 2의 금 결합 단백질과 돌연변이 단백질 G의 융합 단백질에 15배 당량(융합단백질 기준) 정도 첨가한 후 4℃ 조건에서 30분간 보관하였다. 이후 상기 실시예 3에서 제조된 링커(화학식 1의 구조를 가지며, n은 3이다)를 융합단백질의 15배 당량 정도 첨가한 후 4℃ 조건에서 30분간 반응시켰다. 반응하여 링커가 연결된 융합단백질를 크기 배제 크로마토그래피법을 이용하여 반응하지 않은 것들로부터 정제하였고, MALDI 질량분석을 이용하여 반응 전후의 피크의 이동을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 융합단백질에 링커가 연결되었음을 나타낸 것으로, (A)는 반응 전의 융합단백질의 분자 피크를 나타내고(반응 전 융합단백질의 분자 피크가 m/z=19205.47에서 관찰되며, 9603.77의 피크는 z=2일 때의 m/z를 나타냄), (B)는 링커가 연결된 융합단백질의 분자 피크를 나타내며(19205.47의 피크는 사라지고, 19448.04가 생성됨), (C)는 상기 (A) 및 (B)의 스펙트라를 겹쳐서 나타낸 것이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 19205.47의 피크는 사라지고, 19448.04가 생성 됨을 통해 융합단백질에 링커가 연결되었음을 확인하였다.

실시예 5. 항체와의 공유결합 형성

5.1

IgG 항체를 링커(화학식 1의 구조를 가지며, n은 1, 3 또는 5이다)가 연결된 돌연변이 단백질 G에 0.2배 당량(링커가 연결된 돌연변이 단백질 G 기준) 정도 첨가한 후, 4℃ 조건에서 12시간 동안 반응시켜, 돌연변이 단백질 G와 항체의 Fc 부위에 결합시키고, Fc에 존재하는 라이신 잔기의 아민기와 링커의 아실 이미다졸기의 반응으로 아마이드 결합을 생성시켰다.

이 후 SDS-PAGE 단백질 전기영동을 실시하여 항체의 중사슬(heavy chain)과 돌연변이 단백질 G가 공유결합된 밴드가 생기는 것을 확인하였다.

5.2

IgG 항체를 링커(화학식 1의 구조를 가지며, n은 1, 3 또는 5이다)가 연결된 융합단백질에 0.2배 당량(링커가 연결된 융합단백질 기준) 정도 첨가한 후, 4℃ 조건에서 12시간 동안 반응시켜, 융합단백질의 돌연변이 단백질 G 부분과 항체의 Fc 부위에 결합시키고, Fc에 존재하는 라이신 잔기의 아민기와 링커의 아실 이미다졸기의 반응으로 아마이드 결합을 생성시켰다.

이 후 SDS-PAGE 단백질 전기영동을 실시하여 항체의 중사슬(heavy chain)과 융합단백질이 공유결합된 밴드가 생기는 것을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 SDP-PAGE 단백질 전기영동 결과를 나타낸 것으로, L1, L2, L3는 화학식 1에서 각각 n이 1, 3 또는 5일 때의 링커를 나타낸 것이며, GBP-PG(native)는 돌연변이 되지 않은 단백질 G와 금 결합 단백질의 융합단백질을 나타내고, GBP-PG(V21C)는 돌연변이 단백질 G(V21C)와 금 결합 단백질의 융합단백질을 나타낸 것이다.

도 5에 나타난 바와 같이, DTT(dithiothreitol) 존재 하에서 항체의 이황화결합이 환원되기 때문에 항체는 경사슬(light chain)과 중사슬(heavy chain)로 분리되어 각각 15kDa, 50kDa에서 관찰되었으며, 시스테인이 없는 단백질 G(native)를 포함하는 융합단백질에서는 링커의 말레이미드와 반응하지 않으므로 공유결합이 형성되는 밴드가 관찰되지 않았다. 이에 반해 돌연변이 단백질 G를 포함하는 융합단백질은 링커와 연결되어 항체의 Fc 부위와 공유결합이 형성되어 공유결합된 크기의 밴드가 관찰되었다(Fc 부위는 중사슬에 존재하므로 중사슬과 융합단백질이 공유결합된 크기의 밴드가 관찰된다).

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> PROTEIN G-LINKER CONJUGATION USING A LINKER <130> HY140455 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein G <400> 1 Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 1 5 10 15 Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln 20 25 30 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55 <210> 2 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant protein G (V21C) <400> 2 Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 1 5 10 15 Thr Thr Glu Ala Cys Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln 20 25 30 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55 <210> 3 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant protein G (D22C) <400> 3 Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 1 5 10 15 Thr Thr Glu Ala Val Cys Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln 20 25 30 Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45 Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55 <210> 4 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant protein G (V21C) <400> 4 acaacttata aactggtaat taacgggaaa acactgaaag gcgagacaac tactgaagcg 60 tgtgatgctg ctacagcaga gaaggtcttc aaacaatacg ctaatgataa tggagttgac 120 ggggaatgga cgtatgatga tgcgacaaaa acctttacag tgacagaa 168 <210> 5 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant protein G (D22C) <400> 5 acaacttata aactggtaat taacgggaaa acactgaaag gcgagacaac tactgaagcg 60 gtttgtgctg ctacagcaga gaaggtcttc aaacaatacg ctaatgataa tggagttgac 120 ggggaatgga cgtatgatga tgcgacaaaa acctttacag tgacagaa 168 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 ctgaagcgtg tgatgctgct acagcagaag 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 gcagcatcac acgcttcagt agttgtctcg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 8 gaagcggttt gtgctgctac agcagagaag 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 9 ctgtagcagc acaaaccgct tcagtagttg tct 33 <210> 10 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gold binding protein <400> 10 atgcacggga aaacacaagc cacatcaggt accattcaga gcatgcatgg caaaactcaa 60 gcaacttccg gcacgatcca gagtatgcac ggtaagaccc aggcaacgtc tggtacaatt 120 cagtcgatgc atggtaaaac tcaggcgaca tctggaacaa tacagtcaat gcatggcaaa 180 acccaggcca ctagcggtac aattcaatcc atgcatggta aaacgcaagc aacgagtggg 240 accatccaga gtatgcatgg aaagacccaa gccacgagcg gaacaataca gtca 294 <210> 11 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein (V21C) <400> 11 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggaattcg ccatgcacgg gaaaacacaa gccacatcag gtaccattca gagcatgcat 120 ggcaaaactc aagcaacttc cggcacgatc cagagtatgc acggtaagac ccaggcaacg 180 tctggtacaa ttcagtcgat gcatggtaaa actcaggcga catctggaac aatacagtca 240 atgcatggca aaacccaggc cactagcggt acaattcaat ccatgcatgg taaaacgcaa 300 gcaacgagtg ggaccatcca gagtatgcat ggaaagaccc aagccacgag cggaacaata 360 cagtcaggtg gatcgggtgg cggctctggt acaacttata aactggtaat taacgggaaa 420 acactgaaag gcgagacaac tactgaagcg tgtgatgctg ctacagcaga gaaggtcttc 480 aaacaatacg ctaatgataa tggagttgac ggggaatgga cgtatgatga tgcgacaaaa 540 acctttacag tgacagaata a 561 <210> 12 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein (D22C) <400> 12 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggaattcg ccatgcacgg gaaaacacaa gccacatcag gtaccattca gagcatgcat 120 ggcaaaactc aagcaacttc cggcacgatc cagagtatgc acggtaagac ccaggcaacg 180 tctggtacaa ttcagtcgat gcatggtaaa actcaggcga catctggaac aatacagtca 240 atgcatggca aaacccaggc cactagcggt acaattcaat ccatgcatgg taaaacgcaa 300 gcaacgagtg ggaccatcca gagtatgcat ggaaagaccc aagccacgag cggaacaata 360 cagtcaggtg gatcgggtgg cggctctggt acaacttata aactggtaat taacgggaaa 420 acactgaaag gcgagacaac tactgaagcg gtttgtgctg ctacagcaga gaaggtcttc 480 aaacaatacg ctaatgataa tggagttgac ggggaatgga cgtatgatga tgcgacaaaa 540 acctttacag tgacagaata a 561 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (sense strand) <400> 13 ggaattccat atggaattcg ccatgcacg 29 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (antisense strand) <400> 14 ccgctcgagt tattctgtca ctgtaaaggt tttt 34

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 21번, 22번, 24번, 29번 및 47번에 위치한 아미노산 중 적어도 하나 이상이 시스테인(cystein)으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 G 및 링커를 포함하며,
상기 단백질 G와 링커는, 링커의 말단에 있는 말레이미드 그룹과 단백질 G의 티올기의 반응에 의해 결합된 것인, 단백질 G-링커 결합체.
제1항에 있어서, 상기 단백질 G는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 단백질 G-링커 결합체.
제1항에 있어서, 상기 링커는 말단에 말레이미드 그룹을 포함하며, 다른 쪽 말단에는
,
,
,
,
, 또는
를 포함하는 것인, 단백질 G-링커 결합체.
제1항에 있어서, 상기 링커는 하기 화학식 1 내지 6 중 어느 하나인 것인, 단백질 G-링커 결합체:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

상기 화학식 1 내지 6에서, n은 1 내지 5 이다.
제1항에 있어서, 상기 단백질 G는 금 결합 펩타이드(GBP, gold binding peptide)가 도입된 것인, 단백질 G-링커 결합체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단백질 G-링커 결합체가 고체지지물질의 표면에 결합된 바이오칩 또는 바이오센서.
제6항에 있어서, 상기 고체지지물질은 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금속 중에서 선택되는 것인 바이오칩 또는 바이오센서.
제6항에 있어서, 상기 고체지지물질은 금 박막 또는 금 나노입자인 바이오칩 또는 바이오센서.
제6항에 있어서, 상기 단백질 G-링커 결합체에 항체가 결합된 바이오칩 또는 바이오센서.
제6항의 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법.