KR20080086977A - 소수성 개질된 다당류에 고정화된 효소 - Google Patents
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Abstract
고정화된 효소 및 소수성 개질된 미셀 다당류를 포함하는 고정화 물질, 및 이들을 포함하는 바이오애노드, 바이오캐소드, 바이오연료 전지가 개시되어 있다. 특히, 상기 소수성 개질된 미셀 다당류는 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트일 수 있다.
바이오애노드, 바이오캐소드, 바이오연료 전지, 효소 고정화 물질
Description
본 발명은 해군연구소 (허가 번호 3-00475), 국방 첨단 연구 기획청 (허가 번호 3-00487), 및 미국 중앙정보국 (허가 번호 300477)에서 제공한 정부 지원을 받아 발명되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
본 발명은 일반적으로 생물학적 효소-기재 연료 전지 (또한, 바이오연료 전지로도 공지되어 있음) 및 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고정화된 효소 및 소수성 개질된 미셀 다당류를 포함하는 고정화 물질, 및 이들을 포함하는 바이오애노드, 바이오캐소드, 바이오연료 전지, 및 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
바이오연료 전지는 화학 반응으로부터 유래된 에너지를 살아있는 세포 및/또는 이들의 효소의 촉매 활성에 의해 전기 에너지로 전환시키는 전기화학적 장치이다. 바이오연료 전지는 일반적으로 애노드에서 산소를 물로 환원시키는데 필요한 수소 이온을 발생시키고, 전기적 용도로 사용하는 경우에는 유리 전자를 발생시키는 복합 분자를 사용한다. 바이오애노드는 연료 산화시 전자가 방출되는 바이오연 료 전지의 전극이고, 바이오캐소드는 애노드로부터의 전자 및 양자가 촉매에 의해 과산화물 또는 산소를 물로 환원시키는데 사용되는 전극이다. 바이오연료 전지는 전기 화학 반응을 촉매하는데 사용되는 물질에 의해 전통적인 연료 전지와 구별된다. 바이오연료 전지는 촉매로 귀금속을 사용하기 보다는 반응을 수행하는 효소와 같은 생물학적 분자에 의존한다.
<발명의 개요>
본 발명의 다양한 측면 중 하나는 전자 도체; 하나 이상의 애노드 효소; 및 효소 고정화 물질을 포함하는 바이오애노드이다. 상기 애노드 효소는 산화된 형태의 전자 매개체 및 연료 유체와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체 및 환원된 형태의 전자 매개체를 생성할 수 있다. 상기 환원된 형태의 전자 매개체는 전자 도체로 전자를 방출할 수 있다. 상기 효소 고정화 물질은 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성이고, 소수성 개질된 다당류를 포함한다.
상기 기재된 애노드의 또다른 측면에서, 효소 고정화 물질은 전자 매개체를 포함한다.
또 다른 측면은 전자 도체; 하나 이상의 애노드 효소; 효소 고정화 물질; 및 전극촉매를 포함하는 바이오애노드이다. 상기 애노드 효소는 산화된 형태의 전자 매개체 및 연료 유체와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체 및 환원된 형태의 전자 매개체를 생성할 수 있다. 상기 효소 고정화 물질은 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성이고, 소수성 개질된 다당류를 포함한다. 상기 전극촉매는 전자 도체에 인접하여 있다. 이 전극촉매의 산화된 형태는 환원된 형태의 전자 매개체와 반응하 여 산화된 형태의 전자 매개체 및 환원된 형태의 전극촉매를 생성할 수 있고, 이 환원된 형태의 전극촉매는 전자 도체로 전자를 방출할 수 있다.
상기 기재된 애노드의 또다른 측면에서, 효소 고정화 물질은 전자 매개체, 전극촉매, 또는 전자 매개체와 전극촉매를 포함한다.
다른 측면은 전자 도체; 하나 이상의 캐소드 효소; 및 효소 고정화 물질을 포함하는 바이오캐소드이다. 상기 캐소드 효소는 환원된 형태의 전자 매개체 및 산화제와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 물을 생성할 수 있다. 상기 효소 고정화 물질은 전자 매개체를 포함하고, 산화제에 투과성이고, 소수성 개질된 다당류를 포함한다. 상기 산화된 형태의 전자 매개체는 전자 도체로부터 전자를 수득하여 환원된 형태의 전자 매개체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 전자 도체; 하나 이상의 캐소드 효소; 및 효소 고정화 물질을 포함하는 바이오캐소드이다. 상기 캐소드 효소는 환원된 형태의 전자 매개체 및 산화제와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 물을 생성할 수 있다. 상기 효소 고정화 물질은 전자 매개체, 전극촉매, 또는 전자 매개체와 전극촉매를 포함하고, 산화제에 투과성이고, 소수성 개질된 다당류를 포함한다. 산화된 형태의 전극촉매는 전자 도체로부터 전자를 수득하여 환원된 형태의 전극촉매를 생성할 수 있고, 이 환원된 형태의 전극촉매는 산화된 형태의 전자 매개체와 반응하여 환원된 형태의 전자 매개체 및 산화된 형태의 전극촉매를 형성할 수 있다.
다른 측면은 연료 유체; 전자 매개체; 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드; 및 캐소드를 포함하는 전기 발생용 바이오연료 전지이다. 또한, 전기 발생용 바이 오연료 전지는 연료 유체; 전자 매개체; 애노드; 및 상기 기재된 바와 같은 바이오캐소드를 포함한다. 또한, 전기 발생용 바이오연료 전지는 연료 유체; 전자 매개체; 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드; 및 상기 기재된 바와 같은 바이오캐소드를 포함한다.
또 다른 측면은 애노드 또는 바이오애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계; 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 동안 환원된 형태의 전자 매개체를 산화시키는 단계; 전극촉매를 산화시키는 단계; 및 전자 도체에서 전극촉매를 환원시키는 단계를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 바이오연료 전지를 사용하는 전기 발생 방법이다.
또다른 측면은 애노드 또는 바이오애노드에서 연료 유체를 산화시키고 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계; 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 동안 환원된 형태의 전자 매개체를 산화시키는 단계; 및 전자 도체에서 전자 매개체를 환원시키는 단계를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 바이오연료 전지를 사용하는 전기 발생 방법이다.
본 발명의 다른 측면은 소수성 개질된 다당류에 고정화된 효소이다. 소수성 개질된 다당류는 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있고, 효소보다 작은 화합물에 투과성이다.
또다른 측면은 소수성 개질된 다가양이온성 미셀 중합체에 고정화된 효소이고, 상기 고정화된 효소는 완충 용액에 넣었을 때 효소보다 높은 활성을 나타낸다.
또다른 측면은 소수성 개질된 다가음이온성 미셀 중합체에 고정화된 효소이 고, 상기 고정화된 효소는 완충 용액에 넣었을 때 효소보다 높은 활성을 나타낸다.
또 다른 측면은 소수성 기에 의해 개질된 키토산의 아민 관능기를 적어도 약 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48％ 갖는 소수성 개질된 미셀 키토산이다.
또다른 측면은 화학식 1A에 상응하는 구조를 갖는 소수성 산화환원 반응 매개체 개질된 미셀 키토산이다.
상기 식에서, n은 정수이고; R10a는 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고; R11a는 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이다.
도 1은 Ru(bpy)3 +2 중의 소수성 개질된 키토산의 대표적인 형광 현미경 사진을 도시하고 있다.
도 2는 FITC에 침지시킨 소수성 개질된 키토산 막의 대표적인 형광 현미경 사진을 도시하고 있다.
도 3은 소수성 개질된 키토산을 통과하는 카페인의 유속에 대한 KD1 /2 값을 개질제의 알킬쇄 길이 및 중합체가 재현탁되는 용매의 함수로 나타내고 있다.
도 4는 소수성 개질된 키토산 막을 통과하는 Ru(bpy)3 +2의 수송에 대한 KD1 /2 값을 나타내고 있다.
도 5는 단일 기능성 바이오애노드 또는 바이오캐소드를 도시하고 있다.
도 6은 미세유체 바이오연료 전지를 도시하고 있다.
도 7(a) 내지 (d)는 단일 미세전극 형성 절차를 도시하고 있다.
도 8은 미세유체 바이오연료 전지 적층체를 도시하고 있다.
도 9는 제작 시점으로부터 다양한 시점 (일)에 수집한 부틸-키토산 글루코스 데히드로게나제 바이오애노드에 대한 일련의 전력 곡선을 도시하고 있다.
도 10은 매개된 바이오애노드 (테트라부틸암모늄-개질된 나피온(Nafion; 등록상표) 및 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 포함) 및 직접 전자 전달 바이오캐소드 (부틸-키토산 및 빌리루빈 옥시다제 포함)를 갖는 바이오연료 전지에 대한 전력 곡선이다.
도 11은 매개된 바이오애노드 (부틸-키토산 및 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 포함) 및 직접 전자 전달 바이오캐소드 (부틸-키토산 및 빌리루빈 옥시다제 포함)를 갖는 바이오연료 전지에 대한 전력 곡선이다.
도 12는 테트라펜틸암모늄 이온으로 개질된 저분자량 알기네이트의 형광 현미경 사진이다.
도 13은 공기-호흡 캐소드를 포함하는 I-전지의 개략도이다.
본 발명은 소수성 개질된 다당류, 바람직하게는 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트를 포함하는 효소 고정화 물질, 및 이를 포함하는 바이오애노드, 바이오캐소드, 바이오연료 전지에 관한 것이다. 소수성 개질된 다당류는 효소 고정화에 유리하게 적합한 세공을 내부에 갖는 미셀 구조를 형성한다. 이들 소수성 개질된 다당류 중 일부는 생물학적으로 상용성이고 산성 내지 중성 환경의 효소 (예를 들면, 약 5의 pH에서 활성인 효소)의 고정화에 매우 적합한 다가양이온성 생물학적 중합체이다. 소수성 개질된 다당류는 그의 다가양이온성 특성 이외에도, 특정 효소에 적합하게 세공의 형태를 변화시킬 수 있거나 효소 고정화 물질의 전기적 특성을 변화시킬 수 있는 다양한 소수성 기로 개질될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 바이오전극 조립체는 효소 안정성을 증가시킨다. 바이오캐소드 또는 바이오애노드에 사용한 경우, 고정화 물질은 기계적 및 화학적 안정성을 제공하는 장벽을 형성한다. 따라서, 효소는 이전에 알려진 것보다 더 오랜 기간 동안 안정화된다. 본 발명의 목적상, 효소는 바이오연료 전지가 지속적으로 작동할 때 적어도 약 7일 또는 약 730일 동안 초기 촉매 활성의 적어도 약 75％를 유지하는 경우에 "안정화"된다.
I. 바이오연료 전지
본 발명의 다양한 측면 중 하나의 측면은 고정화된 효소를 갖는 전극에서 일어나는 효소 매개성 산화환원 반응을 통해 전기를 발생시키기 위해 연료 유체를 사용하는 바이오연료 전지이다. 표준 전기화학 전지에서와 같이, 애노드는 동시에 전자를 방출시키면서 연료 유체가 산화 반응하는 위치이다. 전자는 전기 커넥터를 통해 애노드로부터 일부 전력 소모 장치로 향한다. 상기 전자는 상기 장치를 통해 바이오연료 전지의 바이오캐소드로 전자를 수송하는 또 다른 전기 커넥터로 이동하고, 바이오캐소드에서 전자는 산화제를 환원시켜 물을 생성하는데 사용된다. 이러한 방식으로, 본 발명의 바이오연료 전지는 이에 대해 외적인 전기 부하를 위한 에너지 공급원 (전기)으로 작용한다. 연료 유체의 산화환원 반응을 용이하게 위해, 전극은 전자 도체, 전자 매개체, 전자 매개체를 위한 전극촉매, 효소 및 효소 고정화 물질을 포함한다.
본 발명에 있어서, 전자 매개체는 전자를 수용하거나 전자를 제공할 수 있는 화합물이다. 현재 바람직한 바이오연료 전지에서, 산화된 형태의 전자 매개체는 바이오애노드에서 연료 유체 및 효소와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체 및 환원된 형태의 전자 매개체를 생성한다. 그 결과로서 또는 동시에, 환원된 형태의 전자 매개체는 산화된 형태의 전극촉매와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 환원된 형태의 전극촉매를 생성한다. 이어서, 환원된 형태의 전극촉매는 바이오애노드에서 산화되어 전자를 생성하여 전기를 발생시킨다. 연료 유체의 산화를 제외하고는, 바이오애노드에서의 산화환원 반응은 가역적일 수 있어, 효소, 전자 매개체 및 전극촉매는 소모되지 않는다. 임의로, 이러한 산화환원 반응은 전자 매개체 및/또는 전극촉매가 추가의 반응물을 제공하도록 첨가되는 경우에 비가역적일 수 있다.
다르게는, 전자 도체 및 효소가 사용될 수 있으며, 이 때 바이오애노드와 접촉하는 전자 매개체는 개질되지 않은 전극에서 산화된 형태와 환원된 형태 사이에 전자를 전달할 수 있다. 전자 매개체가 개질되지 않은 바이오애노드에서 산화된 형태와 환원된 형태 사이에 전자를 전달할 수 있다면, 전극촉매와 전자 매개체 사이의 후속 반응은 필요하지 않으며, 전자 매개체 자체가 바이오애노드에서 산화되어 전자를 생성하고, 이에 따라 전기가 발생한다.
바이오캐소드에서, 바이오애노드로부터 유래된 전자가 바이오캐소드의 전자 도체로 유동한다. 여기서, 전자는 전자 도체와 접촉하는 산화된 형태의 전극촉매와 합쳐진다. 이러한 반응으로 환원된 형태의 전극촉매가 생성되며, 이는 다시 산화된 형태의 전자 매개체와 반응하여 환원된 형태의 전자 매개체 및 산화된 형태의 전극촉매를 생성한다. 이어서, 환원된 형태의 전자 매개체는 산화된 형태의 산화제와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 물을 생성한다. 한 실시양태에서, 산화제에 투과성이고, 전극촉매, 임의로는 전자 매개체를 포함하며, 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있는, 효소 고정화 물질이 존재한다.
바이오캐소드의 다른 실시양태에서는, 전극촉매가 존재하지 않는다. 이러한 실시양태에서, 전자는 산화된 형태의 전자 매개체와 합쳐져 환원된 형태의 전자 매개체를 생성한다. 이어서, 환원된 형태의 전자 매개체는 산화된 형태의 산화제와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 물을 생성한다. 한 실시양태에서, 산화제에 투과성이고, 임의로는 전자 매개체를 포함하며, 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있는, 효소 고정화 물질이 존재한다.
본 발명의 바이오연료 전지는 바이오캐소드 및/또는 바이오애노드를 포함한다. 일반적으로, 바이오애노드는 연료 유체를 산화시켜 전자를 방출시키고 외부 전기 부하로 향하게 하는 요소를 포함한다. 생성된 전류는 전기 부하에 동력을 제공하며, 이어서 전자는 산화제가 환원되고 물이 생성되는 바이오캐소드로 향한다.
A. 바이오캐소드
본 발명에 따른 바이오캐소드는 전자 도체, 효소 고정화 물질에 고정화된 효소, 전자 매개체 및 전극촉매를 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 성분들은 서로 인접하여 있으며, 이는 이들이 적합한 수단에 의해 물리적으로 또는 화학적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다.
1. 전자 도체
전자 도체는 전자를 전도하는 물질이다. 전자 도체는 이 물질을 통해 전자를 전도할 수 있는 한 사실상 유기 물질 또는 무기 물질일 수 있다. 전자 도체는 탄소-기재 물질, 스테인레스 스틸, 스테인레스 스틸 메쉬, 금속성 도체, 반도체, 금속 산화물, 개질된 도체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 전자 도체는 탄소-기재 물질이다.
특히 적합한 전자 도체는 탄소-기재 물질이다. 탄소-기재 물질의 예로는 탄소 직물, 카본지, 탄소 스크린 인쇄 전극, 카본지 (Toray), 카본지 (ELAT), 카본 블랙 (Vulcan XC-72, E-tek), 카본 블랙, 탄소 분말, 탄소 섬유, 단일벽 탄소 나토튜브, 이중벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 탄소 나노튜브 배열, 다이아몬드-코팅된 도체, 유리질 탄소 및 중간 다공성 탄소가 있다. 또한, 다른 탄소-기재 물질의 예로는 그래파이트, 압착되지 않은 그래파이트 웜(worm), 박리 정제된 플레이크 그래파이트 (슈페리어(Superior; 등록상표) 그래파이트), 고성능 그래파이트 및 탄소 분말 (포뮬라 BT(Formula BT; 상표명), 슈페리어(등록상표) 그래파이트), 고정렬된 열분해 그래파이트, 열분해 그래파이트 및 다결정질 그래파이트가 있다. 바람직한 전자 도체 (지지체 막)는 시트형 카본지이다. 이들 탄소 물질의 조합이 사용될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 전자 도체는 금속성 도체로 만들어질 수 있다. 적합한 전자 도체는 금, 백금, 철, 니켈, 구리, 은, 스테인레스 스틸, 수은, 텅스텐 및 전극 구축에 적합한 기타 금속으로부터 제조될 수 있다. 또한, 금속성 도체인 전자 도체는 코발트, 탄소 및 다른 적합한 금속으로 제조된 나노입자로 구축될 수 있다. 다른 금속성 전자 도체는 은-플레이팅된 니켈 스크린 인쇄 전극일 수 있다.
또한, 전자 도체는 반도체일 수 있다. 적합한 반도체 물질은, 다른 원자로 도핑될 수 있는 규소 및 게르마늄을 포함한다. 반도체는 인, 붕소, 갈륨, 비소, 인듐 또는 안티모니, 또는 이들의 조합으로 도핑될 수 있다.
다른 전자 도체는 금속 산화물, 금속 황화물, 주요족 화합물 (즉, 전이 금속 화합물), 및 전자 도체로 개질된 물질일 수 있다. 이러한 타입의 전자 도체의 예로는 나노 다공성 산화티탄, 산화주석 코팅된 유리, 산화세륨 입자, 황화몰리브덴, 질화붕소 나노튜브, 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 에어로겔, 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 졸겔, 루테늄 탄소 에어로겔, 및 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 중간 다공성 실리카가 있다.
2. 전자 매개체
전자 매개체는 전자(들)을 수용하거나 제공할 수 있는 화합물이다. 다르게 설명하면, 전자 매개체는 전자(들)을 수용하여 환원된 형태를 형성할 수 있는 산화된 형태를 가지며, 이 때 환원된 형태는 또한 전자(들)을 제공하여 산화된 형태를 생성할 수 있다. 전자 매개체는 고정화 물질로 확산되고/되거나 고정화 물질로 혼입될 수 있는 화합물이다.
한 실시양태에서, 전자 매개체의 확산 계수는 최대화된다. 다르게 설명하면, 환원된 형태의 전자 매개체의 집단 수송은 가능한 한 신속하다. 전자 매개체의 신속한 집단 수송은 전자 매개체가 사용되는 바이오연료 전지의 보다 큰 전류 및 전력 밀도를 가능하게 한다.
바이오캐소드의 전자 매개체는 스텔라시아닌과 같은 단백질, 빌리루빈과 같은 단백질 부산물, 글루코스와 같은 당, 콜레스테롤과 같은 스테롤, 지방산 또는 메탈로프로테인일 수 있다. 또한, 전자 매개체는 옥시다제의 기질 또는 조효소일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 바이오캐소드에서 전자 매개체는 빌리루빈이다.
3. 전자 매개체를 위한 전극촉매
일반적으로, 전극촉매는 전자 매개체의 표준 환원 전위를 감소시킴으로써 전자 도체에서 전자의 방출을 용이하게 하는 물질이다.
일반적으로, 본 발명에 따른 전극촉매는 +0.4 V 초과의 표준 환원 전위를 갖는 유기금속 양이온이다. 전극촉매의 예로는 전이 금속 착체가 있으며, 예컨대 오스뮴, 루테늄, 철, 니켈, 로듐, 레늄 및 코발트 착체이다. 이러한 착체를 사용하는 바람직한 유기금속 양이온은 큰 전자 자체교환 속도를 가능하게 하는 큰 유기 방향족 리간드를 포함한다. 큰 유기 방향족 리간드의 예로는 1,10-페난트롤린 (phen), 2,2'-바이피리딘 (bpy) 및 2,2',2"-테르피리딘 (terpy)의 유도체, 예컨대 Ru(phen)3 +2, Fe(phen)3 +2, Ru(bpy)3 +2, Os(bpy)3 +2 및 Os(terpy)3 +2가 있다. 바람직한 실시양태에서, 전극촉매는 루테늄 화합물이다. 가장 바람직하게는, 바이오캐소드에 있는 전극촉매는 Ru(bpy)3 +2 (화학식 2로 나타냄)이다.
전극촉매는 전자의 효율적인 전달을 용이하게 하는 농도로 존재한다. 바람직하게는, 전자촉매는 효소 고정화 물질이 전자를 전도하는 농도로 존재한다. 특히, 전극촉매는 약 100 mM 내지 약 3 M, 보다 바람직하게는 약 250 mM 내지 약 2.25 M, 보다 더 바람직하게는 약 500 mM 내지 약 2 M, 가장 바람직하게는 약 1.0 M 내지 약 1.5 M의 농도로 존재한다.
4. 효소
본 발명에 있어서, 효소는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시킨다. 일반적으로, 천연-발생 효소, 인조 효소, 인공 효소 및 개질된 천연-발생 효소가 사용될 수 있다. 또한, 천연 또는 유도된 진화에 의해 조작된 효소가 사용될 수 있다. 다르게 설명하면, 효소 특성을 모방하는 유기 또는 무기 분자가 본 발명의 실시양태에 사용될 수 있다.
구체적으로, 바이오캐소드에 사용하기 위한 효소의 예는 옥시도리덕타제이다. 잠재적인 옥시도리덕타제는 라카아제 및 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 알코올-기재 옥시다제 및 콜레스테롤-기재 옥시다제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 효소는 퍼록시다제 또는 산소 옥시도리덕타제이며, 각각 과산화수소 및 산소의 환원을 촉매한다. 산소 옥시도리덕타제의 예로는 라카아제, 시토크롬 c 옥시다제, 빌리루빈 옥시다제 및 퍼록시다제가 있다. 보다 바람직하게는, 효소는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 최적 활성을 갖는 산소 옥시도리덕타제이다. 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 최적 활성을 갖는 옥시도리덕타제는 생리학적 환경, 예를 들어 식물 또는 사람 또는 동물 신체에 대해 적용되는 용도에 유리하다. 가장 바람직하게는, 효소는 빌리루빈 옥시다제이다.
5. 효소 고정화 물질
효소 고정화 물질은 바이오연료 전지에서 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드에 사용된다. 한 실시양태에서, 바이오애노드의 효소 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이고, 효소를 고정화 및 안정화시킨다. 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이어서 바이오애노드에서 연료의 산화 반응이 고정화된 효소에 의해 촉매될 수 있다.
일반적으로, 효소는 바이오캐소드 및/또는 바이오애노드에서 산화환원 반응 을 촉매하는데 사용된다. 본 발명에 따른 바이오캐소드 및/또는 바이오애노드에서, 효소는 이를 고정화 및 안정화시키는 효소 고정화 물질에 고정화된다. 통상적으로, 용액 중의 유리 효소는 수시간 내지 수일 내에 그의 촉매 활성을 상실하는 반면, 적합하게 고정화되고 안정화된 효소는 적어도 약 7일 내지 약 730일 동안 그의 촉매 활성을 보유할 수 있다. 촉매 활성의 보유는 초기 활성의 적어도 약 75％를 갖는 효소로 정의되며, 이는 화학발광, 전기화학, UV-Vis, 방사성화학 또는 형광 검정으로 측정될 수 있다. 효소는 바이오연료 전지가 적어도 약 7일 또는 약 730일 동안 지속적으로 전기를 발생시키면서 초기 활성의 적어도 약 75％를 유지한다.
고정화된 효소는 그의 촉매 활성을 보유하면서 효소 고정화 물질의 특정 영역에 물리적으로 격리된 효소다. 운반자-결합, 가교 결합 및 엔트랩핑 (entrapping)을 비롯하여 효소 고정화를 위한 다양한 방법이 존재한다. 운반자-결합은 효소를 수불용성 운반자에 결합시키는 것이다. 가교 결합은 효소를 이기능성 또는 다기능성 시약에 의해 분자 사이를 가교 결합시키는 것이다. 엔트랩핑은 효소를 반투과성 물질의 격자에 혼입시키는 것이다. 특정한 효소 고정화 방법은 효소 고정화 물질이 (1) 효소를 고정화시키고, (2) 효소를 안정화시키며, (3) 연료 유체 또는 산화제에 투과성인 한, 결정적으로 중요하지는 않다.
연료 유체 또는 산화제에 대한 효소 고정화 물질의 투과성 및 효소의 고정화와 관련하여, 한 실시양태에서 상기 물질은 효소보다 작은 화합물에 투과성이다. 다르게 설명하면, 효소 고정화 물질은 연료 유체 또는 산화제 화합물이 이를 통해 효소와 접촉할 수 있도록 상기 물질을 이동시킨다. 효소 고정화 물질은 이들이 내부 세공, 채널, 개구부 또는 이들의 조합을 함유하여 상기 화합물이 효소 고정화 물질을 통해 이동할 수는 있으나 효소를 효소 고정화 물질 내의 실질적으로 동일한 공간에 격리시키는 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 제한은 효소가 그의 촉매 활성을 보유하도록 한다. 여러 바람직한 실시양태에서, 효소는 효소와 실질적으로 동일한 크기 및 형태를 갖는 공간에 격리되며, 이 때 효소는 실질적으로 그의 촉매 활성을 모두 보유한다. 세공, 채널 또는 개구부는 상기한 요구 조건을 만족시키는 물리적 크기를 가지며, 고정화될 특정 효소의 크기 및 형태에 따라 달라진다.
한 실시양태에서, 효소는 바람직하게는 효소 고정화 물질의 세공 내에 위치하고, 화합물은 수송 채널을 통해 효소 고정화 물질의 내외로 이동한다. 세공 및 수송 채널의 상대적 크기는 세공이 효소를 고정화시키기에는 충분히 크지만 수송 채널은 너무 작아 효소가 이들을 통해 이동할 수 없는 크기일 수 있다. 또한, 수송 채널은 바람직하게는 적어도 약 10 nm의 직경을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 세공 직경 대 수송 채널 직경의 비율은 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 이를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 수송 채널은 직경이 적어도 약 10 nm이고, 세공 직경 대 수송 채널의 직경의 비율은 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 이를 초과한다.
효소의 안정화와 관련하여, 효소 고정화 물질은 효소 변성을 막거나 방해하 는 화학적 및 기계적 장벽을 제공한다. 이를 목적으로 하여, 효소 고정화 물질은 효소의 언폴딩(unfolding)을 방지하면서 효소를 물리적으로 격리시킨다. 효소가 폴딩(folding)된 3-차원 구조로부터 언폴딩되는 과정이 효소 변성에 대한 하나의 메카니즘이다. 한 실시양태에서, 고정화 물질은 바람직하게는 효소가 적어도 약 7일 내지 약 730일 동안 그의 촉매 활성을 보유하도록 효소를 안정화시킨다. 촉매 활성의 보유는 효소가 바이오연료 전지의 일부로 계속 전기를 발생시키면서 그의 초기 활성의 적어도 약 75％를 보유하는 기간 (일)으로 정의된다. 효소 활성은 화학발광, 전기화학, UV-Vis, 방사성화학 또는 형광 검정으로 측정될 수 있으며, 이 때 상기 특성의 강도는 초기에 측정된다. 통상적으로, 형광 검정이 효소 활성을 측정하는데 이용된다. 용액 중의 유리 효소는 수시간 내지 수일 내에 그의 촉매 활성을 상실한다. 따라서, 효소의 고정화는 안정성에 있어 중요한 이점을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는, 고정화된 효소는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 365, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 730일 또는 이를 초과하는 기간 동안 그의 초기 촉매 활성의 적어도 약 75％, 바람직하게는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 365, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 730일 또는 이를 초과하는 기간 동안 그의 초기 촉매 활성의 적어도 약 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하여 보유한다.
몇몇 실시양태에서, 효소 고정화 물질은 미셀 또는 역 (inverted) 미셀 구조를 갖는다. 일반적으로, 미셀로 구성된 분자는 양쪽성이며, 이는 이들이 극성, 친 수성 기 및 비극성, 소수성 기를 함유함을 의미한다. 상기 분자는 미셀을 형성하기 위해 집합할 수 있으며, 극성 기는 집합체의 표면 상에 존재하고, 탄화수소의 비극성 기는 집합체의 내부에 격리되어 있다. 역 미셀은 극성 기와 비극성 기가 반대로 배향된 것이다. 집합체를 구성하는 양쪽성 분자는 극성기가 서로 근접하여 있고 비극성 기가 서로 근접하여 있는 한 다양한 방식으로 배열될 수 있다. 또한, 상기 분자는 서로 마주보는 비극성 기 및 서로 반대 방향을 보는 극성 기를 갖는 이중층을 형성할 수 있다. 다르게는, 극성 기가 서로 마주보고 비극성 기가 서로 반대 방향을 보는 이중층을 형성할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 미셀 효소 고정화 물질은 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) (개질된 나피온(등록상표) 또는 개질된 플레미온(Flemion; 등록상표) 막이다. 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체 막은 암모늄 (NH4 +) 이온보다 큰 소수성 양이온으로 개질된다. 소수성 양이온은 (1) 막의 세공 크기에 영향을 미치고 (2) 세공의 pH 수준을 유지하는데 도움을 주는 화학적 완충제로서 작용하는 두 가지 기능을 하며, 이 둘은 모두 효소를 안정화시킨다.
소수성 양이온의 제 1 기능과 관련하여, 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) (나피온(등록상표) 또는 플레미온(등록상표) 막을 생성하기 위해 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체)를 소수성 양이온과 함께 혼합물-주조하여, 세공 크기가 소수성 양이온의 크기에 따라 달라지는 효소 고정화 물질을 제공한다. 따라서, 소수성 양이온이 커질수록 세공 크기가 커진다. 이러한 소수성 양이온의 기능은 소수성 양이온의 크기를 변화시켜 세공 크기가 특정 효소에 적합하도록 크거나 작아지게 하는 것이다.
소수성 양이온의 제2 기능과 관련하여, 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) 막의 특성은 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이용 교환 중합체) 막 상의 -SO3 -기에 대한 반대 이온으로서 양자 대신 소수성 양이온을 교체함으로써 달라진다. 반대 이온에서의 이러한 교환은 소수성 양이온이 양자보다 -SO3 - 부위에 대해 훨씬 높은 친화성을 갖기 때문에 pH에 대해 완충 효과를 제공한다. 이러한 막에 대한 완충 효과는 용액의 pH는 변화하더라도 세공의 pH는 실질적으로 변화하지 않고 유지되도록 하며; 다르게 설명하면 세공의 pH가 용액의 pH 변화에 내성을 갖게 한다. 또한, 상기 막은 기계적 장벽을 제공하여, 고정화된 효소를 더 보호한다. 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) 막을 제조하기 위해, 제1 단계에서는 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체), 특히 나피온(등록상표)의 현탁액을 소수성 양이온의 용액과 주조하여 막을 형성한다. 막으로부터 과량의 소수성 양이온 및 이들의 염을 추출한 후, 막을 다시-주조한다. 다시-주조할 때, 막은 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼 플루오르화된 이온 교환 중합체) 막의 -SO3 - 부위와 결합된 소수성 양이온을 함유한다. 잉여량의 염은 세공에 트랩핑되거나 막 내에 빈 공간을 초래하기 때문에 막으로부터 소수성 양이온의 염을 제거하면 보다 안정하고 재현가능한 막이 생성된다.
한 실시양태에서, 개질된 나피온(등록상표) 막은 나피온(등록상표) 중합체의 현탁액을 4급 브롬화암모늄과 같은 소수성 양이온의 염의 용액과 주조하여 제조한다. 잉여량의 4급 브롬화암모늄 또는 브롬화수소를 막으로부터 제거한 후에, 이를 다시 주조하여 염-추출된 막을 형성한다. 막의 염 추출은 술폰산 교환 부위에 4급 암모늄 양이온이 계속 존재하도록 하지만, 세공에 트랩핑될 수 있거나 평형화된 막 내에 빈 공간을 초래할 수 있는 잉여량의 염으로 인한 복잡한 상태를 제거한다. 염-추출된 막의 화학적 및 물리적 특성은, 효소 고정화 전에, 전류전압측정, 이온 교환 용량 측정 및 형광 현미경 검사로 특성화된다. 소수성 양이온의 예로는 암모늄-기재 양이온, 4급 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 알킬트리에틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥사데실피리디늄, 에티듐, 비올로겐, 메틸 비올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀)이미늄, 금속 착체, 바이피리딜 금속 착체, 페난트롤린-기재 금속 착체, [Ru(바이피리딘)3]2+ 및 [Fe(페난트롤린)3]3+이 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 소수성 양이온은 암모늄-기재 양이온이다. 특히, 소수성 양이온은 4급 암모늄 양이온이다. 또 다른 실시양태에서, 4급 암모늄 은 화학식 4로 나타낸다.
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실 또는 테트라데실이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 또 다른 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 동일하며, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실이다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 부틸이다. 바람직하게는, 4급 암모늄 양이온은 테트라프로필암모늄 (T3A), 테트라펜틸암모늄 (T5A), 테트라헥실암모늄 (T6A), 테트라헵틸암모늄 (T7A), 트리메틸이코실암모늄 (TMICA), 트리메틸옥틸데실암모늄 (TMODA), 트리메틸헥실데실암모늄 (TMHDA), 트리메틸테트라데실암모늄 (TMTDA), 트리메틸옥틸암모늄 (TMOA), 트리메틸도데실암모늄 (TMDDA), 트리메틸데실암모늄 (TMDA), 트리메틸헥실암모늄 (TMHA), 테트라부틸암모늄 (TBA), 트리에틸헥실암모늄 (TEHA) 및 이들의 조합이다.
다른 다양한 실시양태에서, 미셀 또는 역 미셀 효소 고정화 물질의 예로는 소수성 개질된 다당류가 있고, 이들 다당류는 키토산, 셀룰로스, 키틴, 전분, 아밀로스, 알기네이트 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다양한 실시양태에서, 미셀 또는 역 미셀 효소 고정화 물질은 다가양이온성 중합체, 특히 소수성 개질된 키토산이다. 키토산은 폴리[β-(1-4)-2-아미노-2-데옥시-D-글루코피라노스]이다. 키토산은 통상적으로 키틴 (폴리[β-(1-4)-2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코피라노스])을 탈아세틸화시켜 제조한다. 통상적으로 시판되는 키토산은 대략 85％ 탈아세틸화된다. 이들 탈아세틸화된 또는 유리 아민 기는 히드로카르빌, 특히 알킬기로 더 관능화될 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 소수성 개질된 미셀 키토산은 화학식 1의 구조에 상응한다.
상기 식에서, n은 정수이고; R10은 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고; R11은 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, n은 정수이고, 이에 따라 중합체의 분자량은 약 21,000 내지 약 500,000; 바람직하게는 약 90,000 내지 약 500,000; 보다 바람직하게는 약 150,000 내지 약 350,000; 보다 바람직하게는 약 225,000 내지 약 275,000이 된다. 다수의 실시양태에서, R10은 독립적으로 수소 또는 알킬이고, R11은 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 또한, R10은 독립적으로 수소 또는 헥실이고, R11은 독립적으로 수소 또는 헥실이다. 다르게는, R10은 독립적으로 수소 또는 옥틸이고, R11은 독립적으로 수소 또는 옥틸이다.
다른 다양한 실시양태에서, 소수성 개질된 미셀 키토산은 화학식 1A에 상응하는 소수성 산화환원 반응 매개체 개질된 미셀 키토산이다.
<화학식 1A>
상기 식에서, n은 정수이고; R10a는 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고; R11a는 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이다.
또한, 다양한 실시양태에서, 소수성 개질된 미셀 키토산은 화학식 1B에 상응하는 개질된 키토산 또는 산화환원 반응 매개체 개질된 키토산이다.
상기 식에서, R11, R12 및 n은 화학식 1과 관련하여 정의된 바와 같다. 몇몇 실시양태에서, R11 및 R12는 독립적으로 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 바람직하게는 수소, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실 또는 도데실이다. 다양한 실시양태에서, R11 및 R12는 독립적으로 수소, 부틸 또는 헥실이다.
소수성 개질된 미셀 키토산은 소수성 기로 다양한 정도로 개질될 수 있다. 소수성 개질의 정도는 개질되지 않은 키토산 내의 유리 아민기의 개수에 비한 소수성 기로 개질된 유리 아민기의 비율(％)로 결정한다. 소수성 개질의 정도는 산-염기 적정 및/또는 핵 자기 공명 (NMR), 특히 1H NMR 데이타로부터 추정할 수 있다. 소수성 개질의 정도는 매우 크게 달라질 수 있으며, 적어도 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 42, 44, 46, 48％, 또는 이를 초과한다. 바람직하게는, 소수성 개질의 정도는 약 10％ 내지 약 45％; 약 10％ 내지 약 35％; 약 20％ 내지 약 35％; 또는 약 30％ 내지 약 35％이다.
다른 다양한 실시양태에서, 화학식 1A의 소수성 산화환원 반응 매개체는 오스뮴, 루테늄, 철, 니켈, 로듐, 레늄 또는 코발트와 1,10-페난트롤린 (phen), 2,2'-바이피리딘 (bpy) 또는 2,2',2"-테르피리딘 (terpy), 메틸렌 그린, 메틸렌 블루, 폴리(메틸렌 그린), 폴리(메틸렌 블루), 루미놀, 니트로-플루오레논 유도체, 아진, 오스뮴 페난트롤린디온, 카테콜-펜던트 테르피리딘, 톨루엔 블루, 크레실 블루, 나일 블루, 뉴트랄 레드, 페나진 유도체, 티오닌, 아주레 A, 아주레 B, 톨루이딘 블루 O, 아세토페논, 메탈로프탈로시아닌, 나일 블루 A, 개질된 전이 금속 리간드, 1,10-페난트롤린-5,6-디온, 1,10-페난트롤린-5,6-디올, [Re(phen-디온)(CO)3Cl], [Re(phen-디온)3](PF6)2, 폴리(메탈로프탈로시아닌), 폴리(티오닌), 퀴논, 디이민, 디아미노벤젠, 디아미노피리딘, 페노티아진, 페녹사진, 톨루이딘 블루, 브릴리언트 크레실 블루, 3,4-디히드록시벤즈알데히드, 폴리(아크릴산), 폴리(아주레 I), 폴리(나일 블루 A), 폴리아닐린, 폴리피리딘, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리(티에노[3,4-b]티오펜), 폴리(3-헥실티오펜), 폴리(3,4-에틸렌디옥시피롤), 폴리(이소티아나프텐), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(디플루오로아세틸렌), 폴리(4-디시아노메틸렌-4H-시클로펜타[2,1-b;3,4-b']디티오펜), 폴리(3-(4-플루오로페닐)티오펜), 폴리(뉴트랄 레드) 또는 이들의 조합의 전이 금속 착체이다.
바람직하게는, 소수성 산화환원 반응 매개체는 Ru(phen)3 +2, Fe(phen)3 +2, Os(phen)3 +2, Co(phen)3 +2, Cr(phen)3 +2, Ru(bpy)3 +2, Os(bpy)3 +2, Fe(bpy)3 +2, Co(bpy)3 +2, Cr(bpy)3 +2, Os(terpy)3 +2, Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합이다. 보다 바람직하게는, 소수성 산화환원 반응 매개체는 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합이다. 다양한 바람직한 실시양태에서, 소수성 산화환원 반응 매개체는 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2이다.
개질제로 소수성 산화환원 반응 매개체를 갖는 고정화 물질의 경우, 소수성 산화환원 반응 매개체는 통상적으로 키토산 또는 다당류 백본에 공유 결합한다. 통상적으로, 키토산의 경우, 소수성 산화환원 반응 매개체는 -N-C-결합을 통해 키토산의 아민 관능기들 중 하나에 공유 결합한다. 금속 착체 산화환원 반응 매개체 의 경우, 금속 착체는 키토산 아민기로부터 하나 이상의 금속 착체의 리간드에 부착된 알킬기로 연결되는 -N-C-결합을 통해 키토산에 부착된다. 화학식 1C에 상응하는 구조가 키토산에 부착된 금속 착체의 한 가지 예이다.
상기 식에서, n은 정수이고; R10c는 독립적으로 수소 또는 화학식 1D에 상응하는 구조이고; R11c는 독립적으로 수소 또는 화학식 1D에 상응하는 구조이고; m은 0 내지 10의 정수이고; M은 Ru, Os, Fe, Cr 또는 Co이다.
키토산 개질에 사용되는 소수성 기는 (1) 고정화 물질의 세공 크기에 영향을 미치고, (2) 키토산의 전기적 환경을 변화시켜 허용되는 세공 환경을 유지시키는 두 가지 기능을 하며, 이 둘은 모두 효소를 안정화시킨다. 소수성 기의 제1 기능과 관련하여, 키토산의 소수성 개질은 세공 크기가 소수성 기의 크기에 따라 달라 지는 효소 고정화 물질을 생성한다. 이에 따라, 소수성 기를 사용한 키토산의 개질의 크기, 형태 및 정도는 세공의 크기 및 형태에 영향을 미친다. 이러한 소수성 기의 기능은 소수성 기의 크기 및 분지화 정도를 변화시킴으로써 특정 효소에 적합하도록 세공 크기를 보다 크거나 작게 만들거나 또는 그 형태를 다르게 만든다.
소수성 양이온의 제2 기능과 관련하여, 소수성 개질된 키토산 막의 특성은 키토산을 소수성 기로 개질시켜 변화시킨다. 이러한 키토산의 소수성 개질은 양자에 대한 이용가능한 교환 부위의 개수를 증가시켜 세공 환경에 영향을 미친다. 물질의 pH에 영향을 미치는 것 이외에도, 키토산의 소수성 개질은 기계적 장벽인 막을 제공하고, 이는 고정화된 효소를 더 보호한다.
표 1은 소수성 개질된 키토산 막에서 양자에 대한 이용가능한 교환 부위의 개수를 보여준다.
또한, 이러한 다가양이온성 중합체는 효소를 고정화시킬 수 있고, 완충 용액 내의 동일한 효소의 활성에 비해 상기 중합체에 고정화된 효소의 활성을 증가시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 다가양이온성 중합체는 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산이다. 예를 들면, 언급된 소수성 개질의 경우, 글루코스 옥시다제의 효소 활성은 실시예 5의 절차를 이용하여 측정한다. t-아밀 알코올에 현탁시킨 헥실 개질된 키토산 내의 글루코스 옥시다제에서 최고 효소 활성이 관찰되었다. 이들 고정화 막에서는 완충액 중 효소에 비해 2.53배 증가한 글루코스 옥시다제 효소 활성이 나타났다. 표 2는 다양한 소수성 개질된 키토산에 대한 글루코스 옥시다제의 활성을 상세하게 기재하고 있다.
개질제로 알킬기를 갖는 본 발명의 소수성 개질된 키토산을 제조하기 위해, 키토산 겔을 아세트산에 현탁시킨 후에 알코올 용매를 첨가하였다. 이 키토산 겔에 알데히드 (예를 들면, 부타날, 헥사날, 옥타날 또는 데카날)를 첨가한 후에, 나트륨 시아노보로히드라이드를 첨가한다. 생성된 생성물을 진공 여과에 의해 분리하고, 알코올 용매로 세척한다. 이어서, 개질된 키토산을 40 ℃의 진공 오븐에서 건조시켜 조각 모양의 백색 고체를 수득하였다.
개질제로 산화환원 반응 매개체를 갖는 본 발명의 소수성 개질된 키토산을 제조하기 위해, 4,4'-디메틸-2,2'-바이피리딘을 리튬 디이소프로필아민과 접촉시킨 후에 디할로알칸을 첨가하여 4-메틸-4'-(6-할로알킬)-2,2'-바이피리딘을 생성함으로써 산화환원 반응 매개체 리간드를 유도체화시킨다. 이이서, 이 리간드를 무기 염기의 존재하에 Ru(바이피리딘)2Cl2 수화물과 접촉시키고, Ru(바이피리딘)2Cl2가 고갈될 때까지 물-알코올 혼합물 중에서 환류시킨다. 이어서, 생성물을 암모늄 헥사플루오로포스페이트, 임의로는 나트륨 또는 칼륨 과염소산염으로 침전시킨 후에 재결정화시킨다. 이어서, 유도체화된 산화환원 반응 매개체 (Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2)를 탈아세틸화된 키토산과 접촉시키고, 가열한다. 이어서, 산화환원 반응 매개체 개질된 키토산을 침전시키고, 재결정화시킨다.
소수성 개질된 키토산 막은 유리한 에탄올 불용성을 갖는다. 예를 들면, 상기 기재된 키토산 효소 고정화 물질은 일반적으로 약 99 중량％ 또는 99 부피％까지 초과하는 에탄올을 갖는 용액 중에서 효소를 고정화 및 안정화시키는 기능을 한다. 다양한 실시양태에서, 키토산 고정화 물질은 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 이를 초과하는 중량％ 또는 부피％의 에탄올을 갖는 용액 중에서 기능성이다.
다른 실시양태에서, 미셀 또는 역 미셀 효소 고정화 물질은 다가음이온 중합체, 예컨대 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 알기네이트이다. 알기네이트는 β-(1-4)-연결된 D-만누론산 및 α-(1-4)-연결된 L-굴루론산 잔기를 함유하는 분지되지 않은 선형 중합체이다. 양자화되지 않은 형태에서, β-(1-4)-연결된 D-만누론산은 화학식 3A의 구조에 상응하고, 양자화되지 않은 형태에서, α-(1-4)-연결된 L-굴루론산은 화학식 3B의 구조에 상응한다.
알기네이트는 만누론산 잔기의 중합체 블럭 및 굴루론산 잔기의 중합체 블럭으로 이루어진 이종 중합체이다.
알기네이트 중합체는 다양한 방식으로 개질될 수 있다. 한 가지 유형은 암모늄 (NH4 +) 이온보다 큰 소수성 양이온으로 개질된 알기네이트이다. 소수성 양이온은 (1) 중합체의 세공 크기에 영향을 미치고, (2) 세공의 pH 수준을 유지하는데 도움을 주는 화학적 완충제로서 작용하는 두 가지 기능을 하며, 이 둘은 모두 효소 를 안정화시킨다. 소수성 양이온의 제1 기능과 관련하여, 소수성 양이온을 사용하는 알키네이트의 개질은 세공 크기가 소수성 양이온의 크기에 따라 달라지는 효소 고정화 물질을 생성한다. 이에 따라, 소수성 양이온을 사용하는 알키네이트의 개질의 크기, 형태 및 정도는 세공의 크기 및 형태에 영향을 미친다. 이러한 소수성 양이온의 기능은 소수성 양이온의 크기 및 분지화 정도를 변화시킴으로써 특정 효소에 적합하도록 세공 크기를 보다 크거나 작게 만들거나 또는 그 형태를 다르게 만든다.
소수성 양이온의 제2 기능과 관련하여, 알기네이트 중합체의 특성은 양자 대신 소수성 양이온을 알기네이트 상의 -CO2 - 기에 대한 반대 이온으로 교체함으로써 달라진다. 이러한 반대 이온의 변화는 소수성 양이온이 -CO2 - 부위에 대해 양자보다 훨씬 큰 친화성을 갖기 때문에 pH에 대한 완충 효과를 제공한다. 이러한 알기네이트 막에 대한 완충 효과는 용액의 pH가 변화하더라도 세공의 pH는 실질적으로 변화하지 않고 유지되도록 하며, 다르게 설명하면 세공의 pH가 용액의 pH 변화에 대해 내성을 갖게 한다. 또한, 알기네이트 막은 기계적 장벽을 제공하고, 이는 고정화된 효소를 더 보호한다.
개질된 알기네이트 막을 제조하기 위해, 제1 단계에서 알기네이트 중합체의 현탁액을 소수성 양이온의 용액과 주조하여 막을 형성한다. 이어서, 잉여량의 소수성 양이온 및 이들의 염을 막으로부터 추출하고, 막을 다시 주조한다. 다시 주 조할 때, 막은 알기네이트 막의 -CO2 - 부위와 연결된 소수성 양이온을 함유한다. 잉여량의 염은 세공에 트랩핑되거나 막 내에 빈 공간을 초래하기 때문에 막으로부터 소수성 양이온의 염을 제거하면 보다 안정하고 재현가능한 막이 생성된다.
한 실시양태에서, 개질된 알기네이트 막은 알기네이트 중합체의 현탁액을 4급 브롬화암모늄과 같은 소수성 양이온의 염의 용액과 주조하여 제조한다. 잉여량의 4급 브롬화암모늄 또는 브롬화수소를 막으로부터 제거한 후에, 이를 다시 주조하여 염-추출된 막을 형성한다. 막의 염 추출은 카르복실산 교환 부위에 4급 암모늄 양이온이 계속 존재하도록 하지만, 세공에 트랩핑될 수 있거나 평형화된 막 내에 빈 공간을 초래할 수 있는 잉여량의 염으로 인한 복잡한 상태를 제거한다. 소수성 양이온의 예로는 암모늄-기재 양이온, 4급 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 알킬트리에틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥사데실피리디늄, 에티듐, 비올로겐, 메틸 비올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀)이미늄, 금속 착체, 바이피리딜 금속 착체, 페난트롤린-기재 금속 착체, [Ru(바이피리딘)3]2+ 및 [Fe(페난트롤린)3]3+가 있다.
바람직한 실시양태에서, 소수성 양이온은 암모늄-기재 양이온이다. 특히, 소수성 양이온은 4급 암모늄 양이온이다. 또다른 실시양태에서, 4급 암모늄 양이온은 화학식 4로 나타낸다.
<화학식 4>
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실 또는 테트라데실이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 또 다른 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 동일하며, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실이다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 부틸이다. 바람직하게는, 4급 암모늄 양이온은 테트라프로필암모늄 (T3A), 테트라펜틸암모늄 (T5A), 테트라헥실암모늄 (T6A), 테트라헵틸암모늄 (T7A), 트리메틸이코실암모늄 (TMICA), 트리메틸옥틸데실암모늄 (TMODA), 트리메틸헥실데실암모늄 (TMHDA), 트리메틸테트라데실암모늄 (TMTDA), 트리메틸옥틸암모늄 (TMOA), 트리메틸도데실암모늄 (TMDDA), 트리메틸데실암모늄 (TMDA), 트리메틸헥실암모늄 (TMHA), 테트라부틸암모늄 (TBA), 트리에틸헥실암모늄 (TEHA) 및 이들의 조합이다.
세공 특성을 연구하고, 한 가지 소수성 개질된 알기네이트 막에 대한 결과를 도 12에 나타내었다. 상기 막의 세공 구조는 세공이 소수성이고, 미셀 구조를 갖 고, 외부 pH 변화에 대해 완충되고, 높은 세공 상호연결성을 가지므로 효소 고정화에 이상적이다.
또다른 실험에서, 초저 분자량 알기네이트 및 도데실아민을 25％ 에탄올에 넣고 환류시켜 카르복실산기의 아미드화에 의해 도데실-개질된 알기네이트를 생성한다. 다양한 알킬 아민이 도데실아민을 대체하여 다양한 개수의 알키네이트 구조의 반응성 카르복실산기에 부착된 C4-C16 알킬기를 갖는 알킬-개질된 알기네이트를 생성한다. 다양한 실시양태에서, 적어도 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48％, 또는 이를 초과하는 카르복실산기가 알킬아민과 반응한다.
소수성 개질된 알기네이트 막은 유리한 에탄올 불용성을 갖는다. 예를 들면, 상기 기재된 알기네이트 효소 고정화 물질은 일반적으로 적어도 약 25 중량％ 또는 25 부피％의 에탄올을 갖는 용액에서 효소를 고정화 및 안정화시키는 기능을 한다. 다양한 실시양태에서, 알기네이트 고정화 물질은 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 이를 초과하는 중량％ 또는 부피％의 에탄올을 갖는 용액에서 기능성이다.
6. 바이오캐소드 실시양태
다양한 바이오캐소드가 본 발명의 바이오연료 전지에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 이러한 바이오캐소드는 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨) (그 전문이 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
B. 바이오애노드
한 실시양태에서, 바이오애노드는 효소 고정화 물질에 고정화된 효소 및 전자 도체를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 바이오애노드는 임의로 전자 매개체를 위한 전극촉매를 더 포함한다. 바이오애노드가 전자 도체에서 가역적 산화환원 반응을 경험하는 전자 매개체와 접촉하는 경우, 전극촉매는 바이오애노드에 존재하지 않을 수 있다. 바이오애노드의 상기 확인된 성분들은 서로 인접하여 있으며, 이는 이들이 적절한 수단에 의해 물리적으로 또는 화학적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 상기 성분들은 일반적으로 바이오캐소드 성분들과 동일하므로, 하기 논의는 적절하다면 각각의 요소의 조성 차이 및 기능 차이에 관한 것이다
1. 전자 도체
바이오캐소드에서와 같이, 바이오애노드의 전자 도체는 이 물질을 통해 전자를 전도할 수 있는 한 사실상 유기 물질 또는 무기 물질일 수 있다. 한 실시양태에서, 바이오애노드 전자 도체는 카본지이다.
2. 전자 매개체
바이오애노드 전자 매개체는 전자(들)을 수용하거나 제공하여 산화된 형태로부터 환원된 형태로 쉽게 변화한다. 전자 매개체는 고정화 물질 내로 확산되고/되거나 고정화 물질 내로 혼입될 수 있는 화합물이다. 바이오캐소드에서와 같이, 전자 매개체의 확산 계수가 최대화되는 것이 바람직하다.
전자 매개체의 예로는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP), 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ), 이들 각각의 등가물, 및 이들의 조합이 있다. 전자 매개체의 다른 예로는 페나진 메토술페이트, 디클로로페놀 인도페놀, 단쇄 유비퀴논, 칼륨 페리시아니드, 단백질, 메탈로프로테인, 스텔라시아닌, 및 이들의 조합이 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 바이오애노드에서의 전자 매개체는 NAD+이다.
전자 매개체가 전자 도체에서 스스로 산화환원 반응을 할 수 없는 경우, 바이오애노드는 전자 도체에서 전자의 방출을 용이하게 하는 전자 매개체를 위한 전극촉매를 포함한다. 다르게는, 표준 환원 전위가 0.0 V ± 0.5 V인 가역적 산화환원 커플이 전자 매개체로서 사용된다. 다르게 설명하면, 전자 도체 표면에서 가역적 전기화학을 제공하는 전자 매개체가 사용될 수 있다. 전자 매개체는 전자 매개체에 의존적인 천연 발생 효소, 전자 매개체에 의존적이도록 개질된 효소, 또는 전자 매개체에 의존적인 합성 효소와 커플링된다. 전자 도체 표면에서 가역적인 전기화학을 제공하는 전자 매개체의 예는 피롤로퀴놀린 퀴논 (PQQ), 페나진 메토술페이트, 디클로로페놀 인도페놀, 단쇄 유비퀴논 및 칼륨 페리시아니드이다. 이러한 실시양태에서, 바이오애노드에 사용되는 바람직한 전자 매개체는 PQQ이다. 전자 도체 표면에서 가역적 전기화학을 제공하는 전자 매개체의 능력 때문에, 이러한 실시양태에서는 산화환원 반응을 촉매하는데 어떠한 전극촉매도 필요하지 않다.
바이오애노드의 산화환원 반응 중합체에 의한 전극촉매에 사용되는 기질인 바람직한 화합물은 환원된 아데닌 디뉴클레오티드, 예를 들어 NADH, FADH2 및 NADPH를 포함한다.
3. 전자 매개체를 위한 전극촉매
일반적으로, 전극촉매는 전자 도체에서 전자의 방출을 용이하게 하는 물질이다. 다르게 설명하면, 전극촉매는 전자 매개체의 환원 또는 산화가 낮은 표준 환원 전위에서 발생할 수 있도록 전자 매개체의 환원 또는 산화에 대한 동력학을 개선시킨다. 전극촉매는 전자를 생성하여 전기를 발생시킬 수 있도록 바이오애노드에서 가역적으로 산화될 수 있다. 전극촉매가 전자 도체에 인접하여 있는 경우, 전극촉매 및 전자 도체는 서로 전기적으로 접촉하지만, 반드시 서로 물리적 접촉하는 것은 아니다. 한 실시양태에서, 전자 도체는 전자 매개체를 위한 전극촉매의 일부이거나, 이와 결합하거나, 이와 인접하여 있다.
일반적으로, 전극촉매는 아진, 전도 중합체 또는 전기활성 중합체일 수 있다. 전극촉매의 예로는 메틸렌 그린, 메틸렌 블루, 루미놀, 니트로-플루오레논 유도체, 아진, 오스뮴 페난트롤린디온, 카테콜-펜던트 테르피리딘, 톨루엔 블루, 크레실 블루, 나일 블루, 뉴트랄 레드, 페나진 유도체, 티오닌, 아주레 A, 아주레 B, 톨루이딘 블루 O, 아세토페논, 메탈로프탈로시아닌, 나일 블루 A, 개질된 전이 금속 리간드, 1,10-페난트롤린-5,6-디온, 1,10-페난트롤린-5,6-디올, [Re(phen-디온)(CO)3Cl], [Re(phen-디온)3](PF6)2, 폴리(메탈로프탈로시아닌), 폴리(티오닌), 퀴 논, 디이민, 디아미노벤젠, 디아미노피리딘, 페노티아진, 페녹사진, 톨루이딘 블루, 브릴리언트 크레실 블루, 3,4-디히드록시벤즈알데히드, 폴리(아크릴산), 폴리(아주레 I), 폴리(나일 블루 A), 폴리(메틸렌 그린), 폴리(메틸렌 블루), 폴리아닐린, 폴리피리딘, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리(티에노[3,4-b]티오펜), 폴리(3-헥실티오펜), 폴리(3,4-에틸렌디옥시피롤), 폴리(이소티아나프텐), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(디플루오로아세틸렌), 폴리(4-디시아노메틸렌-4H-사이클로펜타[2,1-b;3,4-b']디티오펜), 폴리(3-(4-플루오로페닐)티오펜), 폴리(뉴트랄 레드), 단백질, 메탈로프로테인, 스텔라시아닌, 또는 이들의 조합이 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 전자 매개체를 위한 전극촉매는 폴리(메틸렌 그린)이다.
4. 효소
효소는 바이오애노드에서 연료 유체의 산화를 촉매한다. 또한, 효소는 바이오애노드에서 산화제를 환원시키며, I.A.1.d.에 보다 일반적으로 기술되어 있다. 일반적으로, 천연-발생 효소, 인조 효소, 인공 효소 및 개질된 천연-발생 효소가 사용될 수 있다. 또한, 천연 또는 유도된 진화에 의해 조작된 효소가 사용될 수 있다. 다르게 설명하면, 효소 특성을 모방하는 유기 또는 무기 분자가 본 발명의 실시양태에 사용될 수 있다.
구체적으로, 바이오애노드에 사용하기 위한 효소의 예로는 옥시도리덕타제가 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 옥시도리덕타제는 연료 (알코올, 암모니아 화합물, 탄수화물, 알데히드, 케톤, 탄화수소, 지방산 등)의 CH-OH 기 또는 CH-NH 기에 작용한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 효소는 데히드로게나제이다. 이러한 실시양태의 효소의 예로는 알코올 데히드로게나제, 알데히드 데히드로게나제, 포르메이트 데히드로게나제, 포름알데히드 데히드로게나제, 글루코스 데히드로게나제, 글루코스 옥시다제, 유산 데히드로게나제, 락토스 데히드로게나제, 피루베이트 데히드로게나제, 리폭시게나제를 포함한다. 바람직하게는, 효소는 알코올 데히드로게나제 (ADH)이다.
에탄올이 연료로 사용된 경우, 효소 또는 크렙스 회로(Krebs cycle)가 사용될 수 있다. 예를 들면, 아코니타제, 푸마라제, 말레이트 데히드로게나제, 숙시네이트 데히드로게나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 이소시트레이트 데히드로게나제, 케토글루타레이트 데히드로게나제, 시트레이트 신타제 및 이들의 조합이 바이오애노드에 사용될 수 있다.
현재 바람직한 실시양태에서, 효소는 PQQ-의존성 알코올 데히드로게나제이다. PQQ는 PQQ-의존성 ADH의 조효소이며 PQQ-의존성 ADH에 정전기적으로 부착되어 있어 효소가 막에 잔류하므로 바이오연료 전지의 수명 및 활성을 증가시킬 것이다. PQQ-의존성 알코올 데히드로게나제 효소는 글루코노박터로부터 추출된다. PQQ-의존성 ADN를 추출하는 경우, 2가지 형태가 있을 수 있다: (1) PQQ가 PQQ-의존성 ADH에 정전기적으로 결합된 형태, 또는 (2) PQQ가 PQQ-의존성 ADH에 정전기적으로 결합되지 않은 형태. PQQ가 PQQ-의존성 ADH에 정전기적으로 결합되지 않은 제2 형태에서, PQQ는 바이오애노드의 조립시에 ADH에 첨가된다. 현재 바람직한 실시양태에서, PQQ-의존성 ADH는 정전기적으로 결합되는 PQQ를 사용해 글루코노박터로부터 추 출된다.
5. 효소 고정화 물질
상기 기재된 바와 같이, 효소 고정화 물질은 바이오연료 전지에서 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드에 사용된다. 효소 고정화 물질의 조성 및 고정화 메카니즘에 대한 보다 상세한 설명은 상기 I.A.5.에서 찾아볼 수 있다. 한 실시양태에서, 바이오애노드의 효소 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이며, 효소를 고정화 및 안정화시킨다. 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이어서 바이오애노드에서의 연료 유체의 산화가 고정화된 효소에 의해 촉매될 수 있다. 바람직하게는, 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트이다.
6. 바이오애노드 실시양태
추가의 실시양태에서, 전자 도체는 효소에 물리적으로 결합될 수 있다. 물리적 결합은 전자 매개체외 효소 사이의 공유 또는 이온 결합일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 전자 매개체가 전자 도체에서 가역적인 전기화학을 나타낼 수 있다면, 전자 매개체는 효소에 물리적으로 결합될 수 있으며, 또한 전자 매개체는 전자 도체에 물리적으로 결합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 전자 매개체는 고정화 물질에 고정화된다. 바람직한 실시양태에서, 전자 매개체는 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트 막에 고정화된 산화된 NAD+이다. 상기 실시양태에서, 연료 유체가 전지에 첨가 된 후에 NAD+가 NADH로 환원되고, 이 NADH는 소수성 개질된 키토산 막 또는 소수성 개질된 알기네이트 막을 통해 확산될 수 있다.
본 발명의 바이오캐소드를 포함하는 바이오연료 전지를 제작 및 사용하는데 유용한 바이오애노드를 제조 및 사용하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 바이오애노드는 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨) (그 전문이 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 다른 잠재적으로 유용한 바이오애노드는 미국 특허 제6,531,239호 및 동 제6,294,281호 (상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
C. 연료 유체 및 산화제
바이오애노드에서 산화되어 전자를 생성할 수 있는 연료 유체 및 바이오캐소드에서 환원되어 물을 생성할 수 있는 산화제가 본 발명의 바이오연료 전지의 성분이다.
바이오애노드를 위한 연료 유체는 전자 매개체 및 고정화된 효소의 산화 반응에서 소모된다. 연료 유체의 분자 크기는 효소 고정화 물질을 통한 확산 계수가 크도록 충분히 작다. 연료 유체의 예로는 수소, 암모니아, 알코올 (예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소부탄올, 부탄올 및 이소프로판올), 알릴 알코올, 아릴 알코올, 글리세롤, 프로판디올, 만니톨, 글루쿠로네이트, 알데히드, 탄수화물 (예컨대, 글루코스, 글루코스-1, D-글루코스, L-글루코스, 글루코스-6-포스페이트, 락테이트, 락테이트-6-포스페이트, D-락테이트, L-락테이트, 프룩토스, 갈락토스-1, 갈락토스, 알도스, 소르보스 및 만노스), 글리세레이트, 조효소 A, 아세틸 Co-A, 말레이트, 이소시트레이트, 포름알데히드, 아세트알데히드, 아세테이트, 시트레이트, L-글루코네이트, β-히드록시스테로이드, α-히드록시스테로이드, 락트알데히드, 테스토스테론, 글루코네이트, 지방산, 지질, 포스포글리세레이트, 레티날, 에스트라디올, 사이클로펜탄올, 헥사데칸올, 장쇄 알코올, 코니페릴-알코올, 신나밀-알코올, 포르메이트, 장쇄 알데히드, 피루베이트, 부타날, 아실-CoA, 스테로이드, 아미노산, 플라빈, NADH, NADH2, NADPH, NADPH2, 탄화수소, 아민, 및 이들의 조합이 있다. 바람직한 실시양태에서, 연료 유체는 알코올, 보다 바람직하게는 메탄올 및/또는 에탄올, 가장 바람직하게는 에탄올이다.
바이오캐소드를 위한 산화제는 바이오애노드에 의해 공급되는 전자를 사용하여 전자 매개체 및 고정화된 효소의 환원 반응에서 소모된다. 산화제의 분자 크기는 효소 고정화 물질을 통한 확산 계수가 크도록 충분히 작다. 당업계에 공지된 산화제의 공급원을 제공하는 다양한 수단이 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 산화제는 기체 산소이며, 이는 확산을 통해 바이오캐소드로 수송된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 산화제는 과산화 화합물이다.
실시양태의 바이오연료 전지는 (i) 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드; (ii) 상기 기재된 바와 같은 바이오캐소드; (iii) 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드 및 바이오캐소드; (iv) 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드 및 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨)에 기재 된 바와 같은 바이오캐소드; 및 (v) 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 바이오애노드 및 상기 기재된 바와 같은 바이오캐소드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오연료 전지는 애노드 분획을 캐소드 분획으로부터 분리시키는 중합체 전해질 막 ("PEM" 또는 염 브릿지, 예를 들면 나피온(등록상표) 117)을 포함할 수 있다. 그러나, 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 실시양태의 경우, PEM는 필요하지 않으며, 막이 없는 바이오연료 전지가 생성된다. 산화제 또는 연료 유체 반응의 촉매 작용을 위해 바이오애노드 및 바이오캐소드에 사용되는 효소의 우선적인 선택성이 애노드 분획을 캐소드 분획으로부터 물리적으로 분리시킬 필요가 없도록 한다.
II. 미세유체 바이오연료 전지
본 발명의 다양한 측면 중 하나는 내부에 고정화된 효소를 갖는 미세성형된 미세전극에서 일어나는 효소 매개성 산화환원 반응을 통해 전기를 발생시키기 위한 연료 유체를 사용하는 미세유체 바이오연료 전지이다. 표준 바이오연료 전지에서와 같이, 바이오애노드는 동시에 전자를 방출시키면서 연료 유체가 산화 반응하는 부위이다. 전자는 바이오애노드로부터 전기 커넥터를 통해 일부 전력 소비 장치로 향한다. 전자는 장치를 통해 또다른 전기 커넥터로 이동하고, 이 커넥터는 전자를 바이오연료 전지의 바이오캐소드로 수송하고, 이 바이오캐소드에서 전자가 산화제를 환원시키는데 사용되어 물이 생성된다. 이러한 방식으로, 본 발명의 바이오연료 전지는 그에 대한 외부 전기 부하를 위한 에너지 공급원 (전기)으로 작용한다. 연료 유체의 산화환원 반응을 용이하게 하기 위해, 미세전극은 전자 도체, 전자 매개체, 전자 매개체를 위한 전극촉매, 효소, 및 효소 고정화 물질을 포함한다.
그러나, 표준 바이오연료 전지와 다르게는, 본 발명의 바이오연료 전지는 하나 이상의 미세성형된 전극을 사용한다. 한 실시양태에서, 미세성형된 전극은 미세전극 내에서 연료가 유동하도록 하는 관통(flow-through) 구조를 갖는다. 통상적인 바이오연료 전지 전극과 비교하였을 때, 이러한 구조에서는 더 많은 양의 미세전극 표면적이 연료와 접촉되기 때문에 더 높은 전류 밀도가 생성된다. 또다른 실시양태에서, 미세성형된 전극은 불규칙적인 지형도를 갖는다. 다시, 더 많은 양의 표면적이 연료와 접촉되기 때문에 미세전극의 전류 밀도는 통상적인 바이오연료 전지 전극보다 더 크다. 이러한 특징들은 본원에 개시된 다른 특징들과 조합되어 크기가 더 작은 공급원으로부터 통상적인 바이오연료 전지에 비해 전류 밀도가 증가된 바이오연료를 생성한다. 마지막으로, 본 발명의 방법은 일회용 연료 전지를 경제적으로 생성하는데 유리하게 사용될 수 있다.
A. 미세유체 채널
바이오애노드 및/또는 바이오캐소드 이외에, 미세유체 바이오연료 전지는 사용시 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드, 연료 유체 및 산화제가 하우징되는(housed) 하나 이상의 미세유체 채널을 특징으로 한다. 미세유체 채널의 형태는 용도에 따라 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 미세유체 채널은 간단하게 바이오연료 전지의 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드가 내부에 함유된 직사각형 챔버일 수 있다. 도 5를 참조한다. 다른 실시양태에서, 임의의 원하는 목적을 위해, 예 컨대 바이오애노드 용액 및 바이오캐소드 용액이 서로 물리적으로 접촉하지 않도록 하기 위해, 미세유체 채널의 형태가 더욱 정교해질 수 있다. 도 6를 참조한다.
도 5 및 6을 참조하여, 연료 유체 및/또는 산화제는, 미세유체 채널의 한쪽 말단 (입구) (33)에서 반대쪽 말단 (출구) (35) 방향으로, 미세전극(들) 상에서 또는 이를 통해 미세유체 채널 (34)을 관통한다. 도 6에서, 바이오애노드는 (41)로 표시되고, 바이오캐소드는 (40)으로 표시된다. 미세유체 채널은 동일한 미세유체 채널 (34) 외부로 연료 유체 및/또는 산화제가 누출되는 것을 방지하면서, 미세전극(들) 상에서의 연료 유체 및/또는 산화제의 대류 유동을 용이하게 해야 한다.
B. 전기 커넥터
전기 커넥터는 미세전극으로부터 미세유체 바이오연료 전지 외부의 전기 부하로 연결시키는 전기적 접촉을 제공한다. 가장 일반적인 의미로, 전기 커넥터는 바이오애노드로부터 전기 부하로, 그리고 다시 바이오캐소드로의 전자 전달을 용이하게 하는 임의의 물질 및 구조일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 미세유체 바이오연료 전지의 전기 커넥터는 또다른 장치가 물리적 및 전기적 접촉을 만들 수 있는 부착 도선을 제공한다. 이어서 이러한 다른 방치, 예를 들어, 구리 전선은 전자를 수송하고, 전자는 외부 전기 부하로 및 부하로부터 수송된다.
한 바람직한 실시양태에서, 전기 커넥터는 다른 프로세싱 전에 미세유체 바이오연료 전지의 기판 상에 형성된 박층 커넥터이다. 이러한 실시양태에서, 그 후에 형성된 미세전극들은 이들의 각각의 전기 커넥터가 교차하도록 배열된다. 다른 실시양태에서, 전기 커넥터는 미세전극의 프로세싱에 이어서 미세전극에 부착된 전 기 전도성인 물질의 실린더형 본체를 갖는다.
III. 미세유체 바이오연료 전지 제작
본 발명에 따른 미세유체 바이오연료 전지의 제작에서, 다른 바이오연료 전지 성분들이 그 위에 구축되는 기판이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 첫번째 단계는 전기 커넥터를 형성시키는 것이고, 이어서 미세전극이 제작되며, 임의로 바이오연료 챔버를 한정하는 단계가 이어진다. 다른 실시양태에서는, 다른 특징부에 이어서 전기 커넥터가 형성된다.
A. 전기 커넥터 제작
본 발명의 미세유체 바이오연료 전지는 나머지 성분들이 그 위에 형성되는 기판을 제공함으로써 형성된다. 전도성이 아니고, 미세전극의 전도성 물질을 부동태화시키지 않으며, 전도성 물질이 프로세싱을 통해 부착되고, 금형이 가역적으로 실링될 수 있는 임의의 물질로 기판을 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 기판은 유리이다. 바람직한 실시양태에서, 기판은 폴리(디메틸실록산) (PDMS)이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 기판은 폴리카르보네이트이다. 한 실시양태에서, 기판은 편평하다. 다른 실시양태에서, 기판은 특정 용도에 유리하게 적합한 기하학적 형상을 취할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 기판 상에 형성된 첫번째 바이오연료 전지 특징부는 전기 커넥터이고, 이는 완성된 바이오연료 전지 내에서 미세전극과 전기적으로 접촉되어 외부 전기 부하를 미세전극에 연결하는 수단을 제공할 것이다. 커넥터는 임의의 전기 전도성 물질로 제조될 수 있다. 상기 물질의 예로는 백금, 팔라듐, 금, 이러한 귀금속들의 합금, 탄소, 니켈, 구리 및 스테인레스 스틸이 있다. 바람직한 실시양태에서, 커넥터는 백금으로 제조된다.
규소 웨이퍼 산업에 공지된 통상적인 포토리소그래피 기술을 사용하여 커넉터를 기판 상에 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 박층 백금 전기 커넥터를 형성시키기 위해, 먼저 티탄 부착층을 기판 상에 스퍼터링(sputtering)한다. 이어서 백금층을 티탄 층 상에 스퍼터링한다. 상기 2 가지 스퍼터링 공정은, 예를 들면 아르곤-이온 스퍼터링 시스템에서 수행할 수 있다. 이어서, 커넥터를 포토리소그래피에 의해 한정하고, 포토레지스트가 백금 층 상에 도포되어 원하는 커넥터 위치를 보호한다. 시판되는 에칭제로 두 층을 화학적으로 에칭(etching)한 후, 포토레지스트를 벗겨내면, 완성된 백금 전기 커넥터가 생성된다. 다른 실시양태에서, 전기 커넥터는 마지막에 형성되는 특징부이다. 이러한 실시양태는 하기 III.B.6에 기술되어 있다.
B. 미세전극의 제작
바이오연료 전지의 기판 상에 전기 커넥터가 생성된 후, 다음 단계는 바이오애노드 및 바이오캐소드의 제작이다. 이들은 연속적으로 또는 동시에 형성될 수 있다.
1. 바이오애노드 제작
한 실시양태에서, 바이오애노드 및 바이오캐소드가 기판 상에 연속적으로 형성되고, 형성 순서는 중요하지 않다. 설명의 목적을 위해서만, 바이오애노드 제작이 먼저 기술될 것이다. 미세규모의 바이오애노드를 제작하는 첫번째 단계는 주조 용 금형의 표면에 마이크로채널의 패턴을 생성시키는 것이다. 일반적으로, 전도성이 아니고, 전도성 물질을 부동태화시키지 않으며, 기판에 가역적으로 실링될 수 있는 임의의 물질로 주조용 금형을 제조할 수 있으며, 상기 물질의 예로는 규소, 유리 및 중합체가 있다. 주조용 금형은 바람직하게는 중합체로 제조되고, 더욱 더 바람직하게는 PDMS로 제조된다. 가장 바람직하게는, 주조용 금형은 폴리카르보네이트로 제조된다.
주조용 금형이 중합체인 바람직한 실시양태에서, 공지된 소프트 리소그래피 기술을 이용하여 패턴을 생성시켜 주조용 금형 내에 마이크로 채널을 생성하여, 바이오애노드의 형상 및 크기를 한정한다. 소프트 리소그래피 기술은 일반적으로 원하는 디자인의 양각 이미지를 갖는 리소그래피에 의해 한정된 마스터(master)에 대해 예비중합체를 성형하는 공정을 수반한다. 이용되는 소프트 리소그래피 기술은 약 1 ㎛ 내지 약 1 ㎜ 사이, 약 1 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 사이, 바람직하게는 약 10 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 사이, 더욱 바람직하게는 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛인, 가장 바람직하게는 약 10 ㎛ 이하로 작은 주조용 금형 내의 마이크로채널을 생성할 수 있어야 한다. 소프트 리소그래피 기술의 예로는 근접-장 위상 변이 리소그래피(near-field phase shift lithography), 복제(replica) 성형, 미세전달 성형 (μTM: microtransfer molding), 용매-보조 미세접촉 성형 (SAMIM: solvent-assisted microcontact molding), 및 미세접촉 인쇄 (μCP: microcontact printing)가 포함된다. 바람직하게는, 마이크로채널은 복제 성형을 사용하여 형성된다.
마이크로채널이 주조용 금형 내에 형성된 후, 주조용 금형의 패턴화된 측면 이 기판에 부착되어 미세전극의 금형이 완성된다. 도 7(a)를 참조한다. 전기 커넥터 (31)가 기판 상에 앞서 형성된 실시양태에서, 마이크로채널은 완성된 미세전극이 커넥터와 전기적으로 접촉되도록 전기 커넥터 상에 정렬되어야 한다. 또한, 배관(tubing) 커넥터 (30)가 기판에 부착되어 나중에 입구 저장소가 될 위치를 유지한다.
이어서, 도 7(b)를 참조하여, 전자 도체 용액은 주조용 금형의 마이크로채널 내로 마이크로채널의 한쪽 말단에서 주조용 금형 내에 생성된 입구 저장소 (32)를 통해 유동한다. 이러한 입구 저장소 (32)는 전통적인 금속 주조 업계에서의 주입 용기와 유사하다. 잉여량의 용액은 입구 저장소 반대편의 마이크로채널의 말단에 위치한 배출구를 통해 마이크로채널을 빠져나갈 것이다.
전자 도체 용액은 고체 미세전극이 생성되도록 경화를 통해 제거될 수 있는, 전자 도체 공급원 및 액체 담체를 포함하는 임의의 용액일 수 있다. 수많은 가능한 전자 도체 물질은 상기 I.A.1에 열거되어 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 전자 도체 공급원은 탄소 공급원이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 전자 도체 공급원은 탄소-기재 잉크이다. 이와 같은 한 실시양태에서, 액체 담체는 탄소-기재 잉크 희석제, 예를 들면 에르콘(Ercon) N160 용매 희석제이다. 용액 내의 액체 담체의 특성에 따라, 2가지 유형의 미세전극 구조가 본 발명에 따라 형성될 수 있다 - 고체 미세전극 또는 관통 미세전극. 액체 담체의 점도가 낮으면, 고체 미세전극이 생성된다. 이러한 미세전극은 실질적으로 연속적이고 고체이며, 사용되는 동안 연료 유체가 상기 미세전극 위에서 유동한다. 액체 담체의 점도가 높으면, 사용되 는 동안 연료 유체가 이를 관통하여 유동할 수 있는 구조를 갖는 관통 미세전극이 생성되어, 연료 유체와 접촉된 미세전극의 표면적을 효과적으로 증가시킨다.
특정 구조와 상관없이, 본 발명에 따라 형성된 미세전극은 지형도가 반드시 편평하여야 하는, 전통적인 공정을 사용하여 형성된 미세전극에 비해 여러 장점을 갖는다. 이와 같이, 통상적인 미세전극 위에서 유동하는 임의의 유체는 일반적으로 규칙적인 유동 패턴을 갖고, 일반적으로 한정된 양의 미세전극 표면적과 접촉된다. 이러한 편평한 기하학적 표면적은 편평한 미세전극의 정상부 및 측면의 직사각형 표면적을 합산하여 계산한다. 미세전극 전류의 생성은 연료 유체와 접촉된 표면적에 의해 대부분 결정되므로, 편평한 미세전극의 전류 생성 능력은 단지 이러한 크기를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 반면에, 본 발명에 따라 형성된 미세전극은 매우 불규칙적인 3차원 지형도를 갖고, 이로써 2 개 이상의 명확한 장점이 나타난다. 첫번째로, 본 발명의 미세전극의 유효 표면적은 편평한 스크린 인쇄 미세전극에 비하여 실질적으로 증가한다. 본원에 기재된 미세전극의 유효 표면적은 미세전극의 지형도를 특징짓는 개별적인 피크 및 골의 표면적의 합이다. 이러한 유효 표면적을 계산하는 한 가지 정확한 방법은 본 발명에 따라 형성된 미세전극의 전류 출력을 길이, 폭 및 높이 치수가 동일한 편평한 미세전극과 비교하는 것이다. 예를 들면, 이러한 미세전극 분석을 수행한 결과, 통상적인 유리질 탄소 전극에서는 전류 출력이 2.06 × 10-4 A/㎠인데 비해, 본 발명의 미세전극에서는 9.85 × 10-4 A/㎠이었다. 또한, 미세전극의 불규칙한 지형도는 유체의 난류를 생성시킬 수 있다. 이같은 유동 패턴은 미세전극 상에서 유체의 혼합을 유도하고, 이는 차례로 유체가 미세전극에 수송되는 속도를 증가시키기 때문에 유리하다. 유체의 수송 속도의 증가는 미세전극 내에서 일어나는 반응을 용이하게 함으로써, 미세전극의 전류 부하 능력을 증가시킨다.
다른 실시양태에서, 프라이머(primer)가 주조용 금형의 마이크로채널 내로 유동되고, 전자 도체 용액의 도입 전에 신속하게 건조된다. 프라이머는 전자 도체가 주조용 금형에 반영구적으로 부착되는 것을 방지하는 것을 돕는 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 탄소-기재 잉크 실시양태에서, 필요하다면, 탄소-기재 잉크 희석제가 프라이머로 사용될 수 있다.
용액이 주조용 금형의 마이크로채널에 충전된 후에 열을 가하여 전자 도체 용액을 경화시킨다. 일반적으로, 액체 담체를 용액으로부터 제거하기에 충분하지만 생성된 미세전극이 손상되지 않도록 충분히 낮은 온도에서 가열이 수행되어야 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 가열은 약 75 ℃에서 일어난다. 또한, 실질적으로 모든 액체 담체를 용액으로부터 제거하기에 충분한 시간 동안 가열하여야 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 적어도 약 1 시간 동안 가열한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 약 75 ℃에서 약 1 시간 동안 가열한다. 도 7(c)를 참조하여, 경화 공정으로 고체화된 미세전극 (36)이 생성되고, 이는 담체의 증발로 인해 주조용 금형의 마이크로채널(들)의 원래 크기보다 대략 20％ 더 작다.
본 발명에 따른 방법에서, 4가지 이상의 실시양태 중 하나를 통해 전자 매개체, 임의로는 전자 매개체를 위한 전극촉매, 효소, 및 효소 고정화 물질이 부여되 도록 미세전극이 처리되어 바이오애노드가 형성된다. 첫번째 실시양태에서, 효소를 함유하는 효소 고정화 물질을 경화된 미세전극에 적용한 후에, 전자 매개체 및 임의로는 전극촉매를 도입한다. 바이오애노드를 형성시키기 위해, 미세전극을 경화시킨 후 기판으로부터 주조용 금형을 제거한다. 도 7(c)를 참조한다. 도 7(d)를 참조하여, 주조용 금형 대신에 주조용 금형의 마이크로채널의 대략 2배의 폭을 갖는 마이크로채널 (34)이 있는 기체-투과성 금형이 가역적으로 미세전극 위에서 실링된다. 기체-투과성 금형은 전도성이지 않고, 전자 도체를 부통태화시키지 않으며, 용매의 증발을 용이하게 하는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 규소 중합체, 예컨대 PDMS를 기체-투과성 금형 물질로 사용한다. 더욱 바람직하게는, 열가소성 수지, 예컨대 폴리카르보네이트가 기체-투과성 금형 물질이다. 기체-투과성 금형을 위치시킨 후에, 바이오애노드 효소를 함유하는 효소 고정화 물질을 경화된 미세전극에 적용한다. 이는 주조 용액을 입구 저장소 (33) 내로, 그리고 기체-투과성 금형을 통과하여 배출구 (35)로 주사기에 의해 방출시켜 달성된다. 이 시점에서, 전극촉매를 임의로 포함하는 전자 매개체 용액은 상기 기술된 바와 같은 입구 저장소 (33) 및 배출구 (35)를 사용하는 기체-투과성 금형의 마이크로채널을 통과하여 유체역학적으로 유동한다. 미세전극의 폭보다 대략 2배 더 큰 마이크로채널의 폭으로, 소량의 전자 매개체 용액이 불가피하게 기판 상에 코팅될 것이나, 이는 전체 미세전극이 적절하게 코팅되도록 한다. 이어서 전자 매개체 용액의 용매가 기체-투과성 금형을 통해 또는 금형 내의 입구 저장소 및/또는 배출구를 통해 증발되어 바이오애노드가 남는다. 전자 매개체가 중합될 필요가 있으 면, 이를 위해 전기중합 공정을 사용할 수 있다. 전자 매개체가 전기중합될 필요가 있다면 이러한 실시양태는 덜 바람직하다. 완성된 바이오애노드에 대해서 도 7(d)를 참조한다.
따라서, 더욱 바람직한 두번째 실시양태에서, 전자 매개체 및 임의의 전극촉매가 고체화된 미세전극에 적용되고, 필요하다면 전자 매개체가 전기중합된 후, 효소를 함유하는 효소 고정화 물질이 미세전극에 적용된다. 두번째 실시양태에서, 주조용 금형은 미세전극의 경화 후에 기판으로부터 제거된다. 주조용 금형 대신, 상기 기술된 기체-투과성 금형이 미세전극 위에서 가역적으로 실링된다. 여기서, 전극촉매를 임의로 포함하는 전자 매개체 용액은 상기 기재된 바와 같이 입구 저장소 및 배출구를 사용하여 기체-투과성 금형의 마이크로채널을 통해 유체역학적으로 유동한다. 다시, 소량의 전자 매개체 용액이 불가피하게 기판 상에 코팅되지만, 이는 전체 미세전극이 적절하게 코팅되도록 한다. 이어서 전자 매개체 용액의 용매를 기체-투과성 금형을 통해 증발시키면 전자 매개체로 코팅된 미세전극이 남는다. 전자 매개체가 중합될 필요가 있으면, 이를 위해 전기중합 공정을 사용할 수 있다. 이어서, 바이오애노드 효소를 함유하는 효소 고정화 물질이 적용되어 바이오애노드가 형성된다. 이는 효소 고정화 물질 및 바이오애노드 효소를 를 함유하는 용액을 입구 저장소 내로 및 기체-투과성 금형을 통해 주사기로 방출하여 달성된다.
더욱 더 바람직한 세번째 실시양태에서는, 전자 매개체 및 임의의 전극촉매를 주조용 금형에 주입하기 전에 전자 도체 용액에 도입시키고, 경화시킨 후에 효 소를 함유하는 효소 고정화 물질을 경화된 미세전극에 적용한다. 세번째 실시양태에서, 전자 매개체 및 임의의 전극촉매는 주조용 금형의 마이크로채널에 도입시키기 전에 전자 도체 용액에 현탁시킨다. 이어서 개질된 전자 도체 용액이, 상기 III.A에서 기술된 바와 같이, 주조용 금형의 마이크로채널 내로 유동되어 경화된다. 이러한 실시양태는 유리하게 바이오애노드의 전도성을 증강시키고, 공정 단계를 생략시킴으로써 간편성을 증가시키고, 전자 매개체 수송 효율을 개선시킨다. 또한 이 실시양태로 기체 확산 스타일 애노드의 수송 효율을 또한 가지면서 개별적인 전자 매개체의 선택성 특성을 갖는 전도성이 높은 복합 바이오애노드가 생성된다. 이 때 전자 매개체의 전기중합이 필요하다면 수행될 수 있다. 그 후에, 바이오애노드 효소를 함유하는 효소 고정화 물질이 개질된 미세전극에 적용되어 바이오애노드가 형성된다. 이는 효소 고정화 물질 및 바이오애노드 효소를 함유하는 용액을 입구 저장소 내로 및 기체-투과성 금형을 통해 주사기로 방출시킴으로써 달성된다.
가장 바람직한 네번째 실시양태에서는, 전자 매개체, 임의의 전극촉매, 및 효소를 함유하는 효소 고정화 물질 모두가 주조용 금형에 주입되기 전에 전자 도체 용액 내에서 조합되어, 경화시 본 발명에 따른 완전한 바이오애노드가 제조된다. 가장 바람직한 네번째 실시양태에서, 전자 매개체, 임의의 전극촉매, 및 효소를 함유하는 효소 고정화 물질 모두가 전자 도체 용액 내에서 조합된다. 이어서, 용액을 상기 기술된 바와 같이 주조용 금형 내로 도입한다. 개지된 용액의 경화로 본 발명에 따른 완전한 바이오애노드가 형성된다. 이러한 실시양태는 다른 실시양태 에서 요구되는 과잉 단계 및 금형을 생략하면서 가장 간단한 바이오애노드 형성 기술을 제시한다.
모든 실시양태에서, 효소 고정화 물질, 효소, 전자 매개체, 및 임의의 전극촉매의 특정 조성은 상기 I.B.2. 내지 I.B.4에 기술되어 있다. 바이오애노드에 바람직한 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트이다. 애노드에서 바람직한 효소는 알코올 데히드로게나제이다. 전자 매개체/전극촉매 조합이 사용되는 경우, 이는 바람직하게는 각각 NAD+ 및 폴리(메틸렌 그린)이다. 가역적인 전기화학을 제공하는 전자 매개체가 사용된다면, 바람직한 전자 매개체는 PQQ이다. 또한, 모든 실시양태에서 주조용 금형은 하나 초과의 마이크로채널을 포함할 수 있다.
2. 바이오캐소드 제작
본 발명에 따른 바이오캐소드를 형성시키기 위해, 바이오애노드를 제작하기 위해 사용된 동일한 일반적인 공정 단계들을 사용하여 바이오캐소드를 제조할 수 있다. 바이오캐소드를 효소 고정화 물질, 효소, 전자 매개체, 및 전극촉매로 처리하기 위한 4가지 일반적인 실시양태는 바이오애노드에 대한 것들과 동일하지만, 전극촉매를 생략하는 선택은 이용할 수 없다. 효소 고정화 물질, 효소, 전자 매개체, 및 전극촉매의 특정 조성은 상기 I.A.2. 내지 I.A.5에 기술되어 있다. 바이오캐소드에 바람직한 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트이다. 또한, 캐소드에 바람직한 효소는 빌 리루빈 옥시다제이고, 바람직한 전자 매개체는 빌리루빈이고, 바람직한 전극촉매는 개질된 막 중의 Ru(bpy)3 2+이다.
C. 작동가능한 바이오연료 전지의 형성
바이오애노드 및 바이오캐소드가 본 발명에 따라 형성된 후, 주조용 금형 또는 기체-투과성 금형이 임의로 제거된다. 이러한 임의의 실시양태에서, 바이오애노드 및 바이오캐소드는 기판 상에서 유지된다. 주조용 금형 또는 기체-투과성 금형이 제거된 후, 미세유체 채널 성형품이 바이오애노드 및 바이오캐소드 위에 정렬된다. 이러한 성형품은 바이오연료 전지의 연료 유체가 이를 통과하여 유동할 수 있는 하나 이상의 미세유체 채널이 생성되도록 미세패턴화된다 성형품은 전도성이지 않고, 전도성 물질을 부동태화시키지 않으며, 기판에 부착되는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 성형품은 PDMS이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 오버레이(overlay)는 폴리카르보네이트이다. 성형품 내의 미세유체 채널(들)의 미세패턴은 임의의 공지된 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 미세유체 채널은 미세전극보다 약 2배 내지 4배 더 크다. 또다른 실시양태에서, 미세유체 채널은 미세전극과 크기가 대략 동일하다. 성형품의 미세유체 채널은 내부에서 연료 유체가 미세전극과 계면(界面)되는 전기화학 전지를 본질적으로 한정한다. 바이오애노드, 바이오캐소드, 연료 유체 및 산화제의 하우징에 오직 하나의 미세유체 채널이 사용되는 경우, 동일한 미세유체 챔버 내의 연료 유체와 산화제의 혼합물은 본 발명의 미세전극의 기능을 손상시키지 않는데, 이는 이들의 산화환원 반응이 선택적이기 때문이다. 다르게 설명하면, 바이오애노드는 연료 유체와만 반응할 것이고, 바이오캐소드는 산화제와만 반응할 것이며, 교차 반응은 일어나지 않는다.
다른 실시양태에서, 주조용 금형 또는 기체-투과성 금형(들)은 기판과 계속 접촉되고, 상기 기재된 미세유체 채널 성형품으로서 작용하면서 바이오연료 전지의 미세유체 채널들을 한정하는 기능을 한다. 이러한 실시양태에서, 연료 유체는 금형(들)의 마이크로채널과 바이오애노드 또는 바이오캐소드 간의 공간을 통해 이동한다. 이러한 실시양태에서, 후속 가공은 개별적인 바이오애노드 미세유체 채널과 바이오캐소드 미세유체 채널 사이의 접합점이 생성되도록 수행되어야 한다. 접합점을 형성시키기 위해, 개별적인 미세유체 챔버들을 연결시키는 통로는 임의의 적절한 수단에 의해, 예컨대 금형(들)의 정상부에 수직의 힘을 가하거나 또는 충분한 물질을 금형(들)로부터 제거함으로써 금형(들) 내에 형성된다. 그 후에, 통로가 접합점을 실링하는 물질로 덮여서, 작동하는 동안 연료 유체 또는 산화제가 누출되지 않도록 한다. 물질은 금형 물질에 결합하여 적절한 실링을 생성시킬 수 있어야 한다. 한 실시양태에서, 덮개 물질은 단순하게 금형 물질, 예컨대 PDMS 또는 폴리카르보네이트의 편평한 조각이다.
D. 임의의 형성 실시양태
상기 III.B.1.에서 기재된 미세전극 제작 기술은 바이오애노드 및 바이오캐소드가 연속적으로 형성된 후에, 바이오애노드와 바이오캐소드를 마이크로채널을 통해 연결하는 방법에 의해 바이오연료 전지가 형성되는 실시양태를 나타낸다. 다 른 실시양태에서, 바이오애노드 및 바이오캐소드는 동시에 형성될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 단일 주조용 금형이 패턴화되어 바이오애노드 및 바이오캐소드 모두가 형성된다. 다르게는, 주조용 금형의 조합이 사용되어 개별적인 바이오애노드 및 바이오캐소드가 형성될 수 있다. 2 가지 경우에서는, 바이오애노드 및 바이오캐소드를 동시에 형성한 후에, 미세유체 채널 성형품을 가하거나 또는 III.B.3에 기술된 바와 같은 주조용 금형(들)을 변형시킴으로써 작동가능한 바이오연료 전지를 형성한다.
상기 III.A.에 기재된 실시양태는 다른 가공 단계 전에 전기 커넥터가 기판 상에 형성되는 것을 기술하고 있다. 다른 실시양태에서, 전기 커넥터는 최종 가공 단계로서 미세유체 바이오연료 전지에 첨가된다. 여기서, 홀들이 미세유체 채널 성형품 또는 개질된 주조용 금형(들) 내에 생성되어, 각 바이오애노드 및 바이오캐소드의 일부가 노출된다. 이어서, 전기 커넥터가 각 바이오애노드 및 바이오캐소드의 노출된 부분에 물리적으로 결합된다. 이러한 실시양태에서, 전기 커넥터는 외부 전기 부하가 바이오애노드 및 바이오캐소드와 전기적으로 접촉되도록 하는 임의 구조의 임의의 물질일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 전기 커넥터는 실린더형 구리체일 수 있다. 또한, 전기 커넥터와 바이오애노드 및 바이오캐소드 사이의 전기적 접촉을 유지시킬 수 있는 임의의 결합 기술을 사용할 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 은 에폭시 페이스트를 사용하여 전기 커넥터와 바이오애노드 및 바이오캐소드를 전기적으로 결합시킬 수 있다. 이러한 실시양태는 이러한 성분들 간의 전도성을 증가시키는 장점을 갖는다.
상기의 실시양태들에는 바이오애노드 및 바이오캐소드 둘 모두가 바이오연료 전지의 마이크로채널(들) 내에 하우징된 바이오연료 전지가 기재되어 있다. 이것이 바람직한 실시양태이긴 하지만, 본 발명의 다른 실시양태에는 바이오연료 전지의 마이크로채널(들)의 외부에 위치한 애노드 또는 캐소드가 포함된다. 여기서, 연료 전지는 미세유체 바이오애노드 또는 바이오캐소드를 적절한 외부 애노드 또는 캐소드와 조합함으로써 형성된다.
E. 미세유체 바이오연료 전지의 사용
본 발명의 작동가능한 미세유체 바이오연료 전지의 제작이 완료된 후에, 이는 바이오애노드 및 바이오캐소드 각각에 대해 연료 유체 공급원 및 산화제가 이용가능한 무수한 용도로 사용될 수 있다. 사용 시, 연료 유체 및 산화제는 미세유체 채널(들)을 통해 이동하여 바이오애노드 및 바이오캐소드와 접촉한다. 여기서, 상기 I.에 기재된 산화환원 반응이 일어나 전류 공급원이 생성된다. 본 발명의 미세유체 바이오연료 전지는 전기 공급이 필요한 임의의 용도, 예컨대 전자 장치, 상업용 장난감, 내과용 장치, 및 전기 구동형 비히클에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 미세유체 바이오연료 전지는 살아 있는 생물체 내로 이식될 수 있고, 이 때 연료 유체는 생물체로부터 유래되고 전류는 살아 있는 생물체 내에 이식된 장치에 전력을 공급하기 위해 사용된다.
또한, 본 발명의 다중 미세유체 바이오연료 전지는 일련의 전기 회로에서 결합되어 바이오연료 전지 적층체를 형성할 수 있다. 도 8을 참조한다. 원하는 적층체가 수득될 때까지, 한 바이오연료 전지의 바이오애노드 (41)가 또다른 바이오 연료 전지의 바이오캐소드 (40)에 전기적으로 결합되고, 이 바이오캐소드는 다시 또다른 바이오애노드 (41)에 연결되어 일련의 적층체를 형성한다. 연료 유체 및/또는 산화제는 입구 저장소 (33)에서 미세유체 챔버 내로 유동한다. 적층체를 형성시킴으로써, 미세유체 바이오연료 전지 회로의 전체 전압 출력은 이론적으로 일련의 개별적인 미세유체 바이오연료 전지로부터의 전압 출력의 합이다. 이같은 적층체의 더 큰 전체 전압 출력은 전력 요구량이 개별적인 바이오연료 전지가 제공할 수 있는 것보다 높은 전자 장치, 장난감, 의료 장치 및 비히클에 전기를 공급하는데 유용하다.
IV. 전기 발생 방법
본 발명은 (a) 애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계; (b) 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 동안 환원된 형태의 전자 매개체를 산화시키는 단계; (c) 전극촉매를 산화시키는 단계; 및 (d) 전자 도체에서 전극촉매를 환원시키는 단계를 포함하는 전기 발생 방법을 포함하며, 여기서 전기는 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드를 포함하는 바이오연료 전지를 사용하여 발생시킨다. 또다른 전기 발생 방법은 (a) 애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계; (b) 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 동안 환원된 형태의 전자 매개체를 산화시키는 단계; 및 (c) 전자 도체에서 전자 매개체를 환원시키는 단계를 포함하며, 여기서 전기는 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드를 포함하는 바이오연료 전지를 사용하여 발생시킨다.
정의
본원에 사용된 용어 "탄화수소" 및 "히드로카르빌"은 오직 탄소 및 수소 원소로만 이루어진 유기 화합물 또는 라디칼을 설명한다. 이러한 잔기로는 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 잔기가 있다. 이들 잔기는 또한 다른 지방족 또는 시클릭 탄화수소 기로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 잔기, 예컨대 알크아릴, 알켄아릴 및 알킨아릴을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 이들 잔기는 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소 원자를 포함한다.
본원에 기재된 "치환된 히드로카르빌" 잔기는 하나 이상의 탄소가 아닌 원자로 치환된 히드로카르빌 잔기로, 탄소쇄 원자가 헤테로 원자, 예컨대 질소, 산소, 규소, 인, 붕소, 황, 또는 할로겐 원자로 치환된 잔기를 포함한다. 이러한 치환기로는 할로겐, 헤테로시클로, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 히드록시, 보호된 히드록시, 케토, 아실, 아실옥시, 니트로, 아미노, 아미도, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르가 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 알킬기는 바람직하게는 주쇄에 1 내지 8개의 탄소 원자를 함유하고 20개까지의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬이다. 이들은 직쇄 또는 분지쇄, 또는 고리형일 수 있으며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 헥실 등을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 알케닐기는 바람직하게는 주쇄에 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하고 20개까지의 탄소 원자를 함유하는 저급 알케닐이다. 이들은 직쇄 또는 분지쇄, 또는 고리형일 수 있으며, 에테닐, 프로페닐, 이소 프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, 헥세닐 등을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 알키닐기는 바람직하게는 주쇄에 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하고 20개까지의 탄소 원자를 함유하는 저급 알키닐이다. 이들은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있으며, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 이소부티닐, 헥시닐 등을 포함한다.
본원에서 단독으로 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "아릴" 또는 "아르"는 고리 부분에 6 내지 12개의 탄소를 함유하는 임의로 치환된 호모시클릭 방향족 기, 바람직하게는 모노시클릭 또는 바이시클릭 기, 예컨대 페닐, 바이페닐, 나프틸, 치환된 페닐, 치환된 바이페닐 또는 치환된 나프틸을 나타낸다. 페닐 및 치환된 페닐은 보다 바람직한 아릴이다.
본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 염소, 브롬, 불소 및 요오드를 나타낸다.
본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "아실"은 유기 카르복실산의 -COOH 기로부터 히드록실기를 제거하여 형성된 잔기, 예를 들면 RC(O)- (여기서, R은 R1, R1O-, R1R2N- 또는 R1S-이고, R1은 히드로카르빌, 헤테로치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, R2는 수소, 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌임)를 나타낸다.
본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "아실옥시"는 산소 연결 (-O-)을 통해 결합된 상기 기재된 아실기, 예를 들면 RC(O)O- (여기서, R은 용어 "아실"과 관련하여 정의된 바와 같음)를 나타낸다.
용어 "헤테로원자"는 탄소 및 수소가 아닌 원자를 의미할 것이다. 본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "헤테로시클로" 또는 "헤테로시클릭"은 하나 이상의 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 갖고, 바람직하게는 각각의 고리에 5 또는 6개의 원자를 갖는, 임의로 치환되고, 완전히 포화되거나 또는 불포화된 모노시클릭 또는 바이시클릭 방향족 또는 비방향족 기를 나타낸다. 헤테로시클로기는 바람직하게는 고리에 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 황 원자 및/또는 1 내지 4개의 질소 원자를 가지며, 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 결합될 수 있다. 헤테로시클로의 예로는 헤테로방향족, 예컨대 푸릴, 티에닐, 피리딜, 옥사졸릴, 피롤릴, 인돌릴, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 등이 있다. 치환기의 예는 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌, 케토, 히드록시, 보호된 히드록시, 아실, 아실옥시, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 할로겐, 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르 기들 중 하나 이상을 포함한다.
하기 실시예로 본 발명을 설명한다.
실시예 1: 알킬 개질된 키토산의 제조
중간 분자량 키토산 (알드리치(Aldrich)로부터 입수가능함) (0.500 g)을 1％ 아세트산 15 mL에 빠르게 교반하면서 용해시켰다. 이로부터 점성 겔-유사 용액이 생성되었으며, 이어서 메탄올 15 mL를 첨가하였다. 키토산 겔을 대략 15 분 동안 교반한 후에, 알데히드 (부타날, 헥사날, 옥타날 또는 데카날) 20 mL를 키토산 겔에 첨가하고, 이어서 나트륨 시아노보로히드라이드 1.25 g을 첨가하였다. 현탁액이 실온으로 냉각될 때까지 겔을 계속 교반하였다. 생성된 생성물을 진공 여과에 의해 분리하고, 메탄올의 150 mL 증분으로 3회 세척하였다. 이어서, 개질된 키토산을 40 ℃의 진공 오븐에서 2 시간 동안 건조시킨 결과 백색 고체 조각이 남았다. 각 중합체의 1 중량％의 현탁액이 50％ 아세트산, 클로로포름 및 t-아밀 알코올에서 형성되었다.
실시예 2: Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 개질된 키토산의 제조
치환된 바이피리딘, 4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘을 합성하여 Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 개질된 키토산의 제조를 시작하였다. 치환된 바이피리딘을 제조하기 위해, 4,4'-디메틸-2,2'-바이피리딘 1.69 g을 함유하는 THF 50 mL를 9.1 mmol의 리튬 디이소프로필아민을 함유하는 THF 4.1 mL에 30 분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 1.5 시간 동안 교반한 후에, 0 ℃로 냉각시키고, 이어서 원하는 쇄 길이를 갖는 9.2 mmol의 디브로모알칸을 교반하면서 적가하였다. 이 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하고, 빙수로 켄칭하고, 에테르로 추출하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로부터 3회 재결정화시켰다. 4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘이 제조되면, 이를 Ru(bpy)2Cl2가 고갈될 때 까지 2:3 메탄올-물 용액 60 mL 중에서 Ru(bpy)2Cl2 (그의 수화물 형태) 1.315 g, 4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘 0.8201 g 및 중탄산나트륨 0.76 g을 환류시킴으로써 반응시켜 Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2를 형성하였다. Ru(bpy)2Cl2의 고갈은 UV-Vis 흡수 데이타로 결정하였다. 3M 암모늄 헥사플루오로포스페이트 (또는 나트륨 또는 칼륨 과염소산염) 4 mL를 첨가하여 생성된 착체를 침전시킨 후에, 아세톤/CH2Cl2로부터 재결정화시켰다. 이 반응 순서로 Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 (77％)를 수득하였다.
Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2를 제조한 후에 Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 137 mg을 1％ 아세트산 및 DMF (1:1, 1 mL) 중 탈아세틸화된 키토산 5 mg의 혼합물에 용해시켰다. 이 혼합물을 90 ℃에서 12 시간 동안 가열하였다. 반응 기간 후에, 아세토니트릴을 첨가하여 Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 개질된 키토산을 침전시켰다. 침전물을 1％ 아세트산에 용해시켜 수집 및 정제한 후에, 메탄올에서 재결정화시키고, 감압하에 건조시켰다.
실시예 3: 소수성 개질된 키토산의 형광 영상화
각각의 중합체 현탁액 2 ㎕를 유리 현미경 슬라이드 (피셔; Fisher) 위에서 주조하고, 데시케이터에서 건조시켰다. 20 ㎕ 부피의 0.01 mM Ru(bpy)3 2+ 또는 0.01 mM FITC를 중합체 주조물 위에 피펫으로 올리고, 2 분 동안 침지시켰다. 침지시킨 후에, 슬라이드를 18 MΩ 물로 세정하고, 데시케이터에서 건조시켰다. 올림푸스(Olympus) BX60M 에피형광 현미경 (미국 뉴욕 멜빌 소재)을 이용하여 중합체를 영상화시켰다. 비디오 카메라 (소니(Sony) SSC-DC50A)의 40× 초장 작용 거리 렌즈로 중합체를 관찰하였다. 형광 여기는 수은 램프를 사용하여 달성하였다. 프레임 그래버 카드(frame grabber card) (인테그랄 테크놀로지스, 인크.(Integral Technologies, Inc.), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 사용하여 영상을 수득하고, 이 영상을 델(Dell) PC에서 SPOT 소프트웨어 (디아그노스틱 인스트루먼츠, 인크.; Diagnostic Instruments, Inc.)를 사용하여 분석하였다. Ru(bpy)3 +2 및 플루오레세인에서 소수성 개질된 다중전해질 각각에 대해 형광 영상화를 수행하여 소수성 개질의 형태학적 효과를 결정하였다. 도 1은 Ru(bpy)3 +2에서 소수성 개질된 키토산의 대표적인 형광 현미경 사진이다. 집합체가 소수성 개질된 키토산 내에서 형성되고, 형태는 알킬쇄 길이가 변화하는 것을 관찰할 수 있었다. 부틸 개질된 키토산은 작은 섬유 모양의 상호연결을 갖는 것으로 나타난 반면, 헥실 개질된 키토산은 보다 작은 미셀 도메인을 함유하는 큰 도메인을 갖는다. 알킬쇄 길이가 증가할수록, 미셀 도메인의 개수는 감소하였으나, 도메인의 크기는 증가하였다. 개 질되지 않은 키토산의 형광 현미경 사진에서는 독특한 도메인이 나타나지 않았으며, 또한 개질되지 않은 키토산에서는 미셀 구조가 관찰되지 않았다. 도 2는 FITC에 침지된 소수성 개질된 키토산 막의 대표적인 형광 현미경 사진이다. 동일한 형태학적 변화가 양이온성 또는 음이온성 형광 염료를 사용하여 관찰될 수 있었다.
실시예 4: 소수성 개질된 키토산의 전기화학적 측정
유리질 탄소 작용 전극 (직경 3 mm, CH 인스트루먼츠(CH Instruments))을 뷸러(Buehler) 연마천 상에서 0.05 ㎛ 알루미나로 연마하고, 18 MΩ 물에서 세정하였다. 각각의 중합체 현탁액 2 ㎕를 유리질 탄소 전극 표면 상에서 주조하고, 사용할 때까지 진공 데시케이터에서 건조시켰다. 순환 전압전류법을 이용하여 전극 표면에서 중합체 막을 통과하는 산화환원 반응 종의 유속을 측정하였다. 작용 전극을 지지 전해질로서의 0.1 M 황산나트륨을 백금 메쉬 반대 전극과 함께 함유하는 1.0 mM 산화환원 반응 종 용액에서 평형화시키고, 포화 칼로멜 기준 전극에 대해 측정하였다. 연구된 산화환원 반응 종은 카페인, 칼륨 페리시아니드 및 Ru(bpy)3 2+이다. 데이타를 CH 인스트루먼츠 일정전위기 모델 810에 접속된 델 컴퓨터에서 수집하여 분석하였다. 순환 전압전류법은 0.05 V/s 내지 0.20 V/s 범위의 스캔 속도로 수행하였다. 모든 실험은 3회 수행하였으며, 표준 편차 1에 상응하는 것은 불확실한 것으로 보고하였다.
2 가지 소수성 개질된 다중전해질의 순환 전압전류법 연구 결과는 소수성 개질된 알킬쇄 길이의 함수로 나타내었다. 모든 순환 전압전류법 실험은 선형 ip 대 v1/2 플롯으로 나타내었으며, 이는 수송-제한된 전기화학을 의미한다. 전기화학적 유속은 방정식 2로 나타낸 바와 같은 농도의 함수로, KD1 /2 값은 여기에서 유속을 비교하는 농도 독립적 방법으로 보고되었다.
<방정식 2>
여기서, i는 피크 전류이고, n은 전달된 전자의 개수이고, F는 패러데이(Faraday) 상수이고, A는 전극의 면적이고, C*는 산화환원 반응 종의 농도이고, v는 스캔 속도이고, K는 추출 계수이고, D는 확산 계수이다. 도 3은 소수성 개질된 키토산을 통한 카페인의 유속에 대한 KD1 /2 값을 개질제의 알킬쇄 길이 및 중합체가 재현탁되는 용매의 함수로 나타내었다. 용매는 다시 주조하는 동안 중합체가 팽창하는 정도를 결정한다. 키토산 및 키토산 유도체에 대한 대부분의 문헌 연구는 재현탁에 사용되는 용매로 아세트산을 사용하지만, KD1 /2 값으로부터 클로로포름이 보다 높은 평균 유속을 제공함을 유의하는 것이 중요하다. 개질되지 않은 키토산은 아세트산 용액에서만 용해될 수 있다. 카페인 중 개질되지 않은 키토산에 대한 KD1/2 값은 5.52 (±0.14)×10-3이었다. 키토산의 소수성 개질은 카페인의 유속을 감소시킬 수 있으나, 유속을 뚜렷하게 증가시킬 수는 없음이 분명하다.
반면, Ru(bpy)3 +2와 같은 큰 소수성 이온의 수송은 세공 구조/크기의 작은 변화에 크게 영향을 받을 수 있다. 도 4는 소수성 개질된 키토산 막을 통한 Ru(bpy)3 +2의 수송에 대한 KD1 /2 값을 보여준다. 개질되지 않은 키토산을 통한 Ru(bpy)3 +2 수송에 대한 KD1 /2 값은 2.17 (±0.33)×10-4이었다. 키토산의 소수성 개질이 모든 경우에서의 Ru(bpy)3 +2의 수송을 t-아밀 알코올에 재현탁시킨 옥틸 개질된 키토산 막에 비해 11.1배 만큼 증가시켰음이 분명하다.
실시예 5: 전극의 제조
2 중량％의 소수성 개질된 키토산 중합체 용액을 t-아밀 알코올에 현탁시키고, 글루코스 옥시다제 용액을 첨가하였다. 이 용액을 전극 물질 상에 피펫으로 올렸다. 이 전극 물질은 통상적으로 탄소 직물 또는 다른 탄소 물질이었다.
실시예 6: 소수성 개질된 키토산에 대한 글루코스 옥시다제 활성 시험
글루코스 옥시다제 (GOx)는 동시에 과산화수소를 방출시키는 β-D-글루코스의 D-글루코노-δ-락톤으로의 산화를 촉매한다. 이는 β-D-글루코스에 대해 고도로 특이적이며, α-D-글루코스에 대해서는 작용하지 않는다. 퍼록시다제의 존재하에, 과산화수소는 510 nm에서 측정된 퀴논이민 염료 착체의 정량적 형성과 p-히드록시벤조산 및 4-아미노 안티피린이 관련된 분석의 제2 반응에 참여한다. GOx 효소의 활성을 소수성 개질된 나피온 및 키토산 막 각각에서 측정하였다. 소수성 개 질된 키토산 막에 GOx 효소를 고정화시키고, 이를 플라스틱 용기에서 주조한 후에 물에 대해 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 수행하였으며, 표준 편차 1에 상응하는 것은 불확실한 것으로 보고하였다.
상기 기재하고 표 2에 나타낸 바와 같이, t-아밀 알코올에 현탁시킨 헥실 개질된 키토산 중의 글루코스 옥시다제에서 최고 효소 활성이 관찰되었다. 이들 고정화 막에서는 완충액 중 효소에 비해 2.53배 증가한 GOx 효소 활성이 나타났다.
실시예 7: 키토산-부틸 바이오애노드
글루코스 데히드로게나제. 1 cm2 AvCarb(상표명) 카본지로부터 에노드를 제작하였다. 0.05 V/s의 스캔 속도로 12 스윕(sweep) 절편에 대해 -0.3 V 내지 1.3 V 범위에서 순환 전압전류법을 수행함으로써, 0.4 mM 메틸렌 그린, 0.1 M 질산나트륨 및 10 mM 붕산나트륨에서 애노드를 전기중합시켰다. 이어서, 이들을 세정하고, 진공 데시케이터에서 완전하게 건조시켰다. 소수성 개질된 키토산 (부틸, 헥실, 옥틸 또는 데실) 0.01 g을 나피온(등록상표) DE 520 1 mL와 혼합하고, 혼합 비드와 1 시간 동안 볼텍스로 교반하여 키토산 혼합물을 제조하였다. 이어서, 키토산/나피온(등록상표) 혼합물 분취액 40 ㎕를 글루코스 데히드로게나제 (포스페이트 완충액 (pH 7.15) 10 mL 중 효소 1 mg) 분취액 20 ㎕와 1 분 동안 혼합하였다. 키토산/효소 혼합물을 피펫으로 애노드에 올리고, 진공 데시케이터에서 완전하게 건조시켰다.
I-전지 설정 (도 13)을 이용하여 연료 전지가 애노드 의존성이 되고, 백금 캐소드가 완충 용액에 가라앉아 힘이 저하되지 않도록 하였다. I-전지는 백금 전극이 공기 호흡 방식으로 작동하도록 한다. 도 13은 본 실험에 사용되는 I-전지의 개략도이다. 도 13에서, 유리 튜브 (50)는 연료 용액 (52) 및 이 연료 용액에 잠긴 바이오애노드 (51)를 함유한다. 유리 튜브 (50)를 O-고리 (53)에 의해 나피온(등록상표) 다중전해질 막 (54)에 연결시키고, 연료 용액 (52)은 또한 나피온(등록상표) 다중전해질 막 (54)과 접촉시켰다. 나피온(등록상표) 다중전해질 막 (54)은 O-고리 (56)를 사용하여 또다른 유리 튜브 (58)에 연결시킨 20％ 백금 가스 확산 전극 캐소드 (55)와 접촉시켰다. 공기 (59)는 20％ 백금 가스 확산 전극 캐소드 (55)와 접촉시킬 수 있으며, 캐소드 (55)가 일정전위기 (57)를 통해 바이오애노드 (51)에 전기적으로 연결되었다. 처음에 사용된 연료는 1 mM NAD+를 갖는 1 mM 글루코스였으나, 첫주 후에는 연료 농도를 1 mM NAD+를 갖는 100 mM 글루코스로 증가시켰다. 우선 연료 전지를 평형화시키고 개방 회로 전위에 도달하게 하여 부틸-키토산 바이오애노드에 대한 전력 곡선 (도 9)을 수득하였다.
알코올 데히드로게나제. 글루코스 데히드로게나제 대신 알코올 데히드로게나제를 사용하는 것을 제외하고는 상기 글루코스 데히드로게나제에 대해 기재된 바와 동일한 절차에 의해 알코올 데히드로게나제를 함유하는 바이오애노드를 제조하였다. 부틸-키토산 바이오애노드, 백금 캐소드 및 1 mM 에탄올 연료 용액을 갖는 단일 구획 전지인 바이오연료 전지에 대해 pH 8, 실온 및 실내 습도에서 수명 연구를 수행하였다. 백금 캐소드를 중합체 전해질 막으로 코팅하였다. 이 연구의 데 이타를 하기 표에 기재하였다.
실시예 8: 키토산-부틸 바이오캐소드
빌리루빈 옥시다제. 소수성 개질된 키토산 (부틸, 헥실, 옥틸 또는 데실) 0.01 g을 나피온(등록상표) DE 520 1 mL와 혼합하고, 혼합 비드와 1 시간 동안 볼텍스로 교반하여 키토산 혼합물을 제조하였다. 이어서, 키토산/나피온(등록상표) 혼합물 분취액 40 ㎕를 빌리루빈 옥시다제 (포스페이트 완충액 (pH 7.15) 10 mL 중 효소 1 mg) 분취액 20 ㎕와 1 분 동안 혼합하였다. 키토산/효소 혼합물을 카본지의 1 cm2 조각에 피펫으로 올려 캐소드를 제작하고, 진공 데시케이터에서 완전하게 건조시켰다. (1) TBA-개질된 나피온(등록상표) NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 (도 10) 또는 (2) 부틸-키토산 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 (도 11)와 합한 부틸-키토산 빌리루빈 옥시다제 캐소드에 대한 전력 곡선 데이타를 수집하였다.
또한, 다양한 바이오연료 전지의 작동에 가장 적합한 온도를 결정하기 위한 연구를 수행하였다. (1) TBA-개질된 나피온(등록상표) NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 및 부틸-키토산 빌리루빈 옥시다제 캐소드, (2) 부틸-키토산 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 및 TBA-개질된 나피온(등록상표) 빌리루빈 옥시다제 캐소드, 및 (3) 부틸-키토산 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 및 부틸-키토산 빌리루빈 옥시다제 캐소드에 대한, 최대 개방 회로 전위 (V), 최대 전류 밀도 (mA/cm2) 및 최대 전력 밀도 (mW/cm2)를 다양한 온도에서 측정하였다. 이 온도 데이타를 하기 표에 기재하였다.
<표>
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실시예 9: 알킬 개질된 알기네이트의 제조
4급 브롬화암모늄이 혼입된 알기네이트 막은 4급 브롬화암모늄을 3 중량％ 알기네이트 현탁액과 함께 주조하여 형성되었다. 사용되는 중합체는 초저 분자량, 저분자량 또는 중간 분자량 알기네이트이다. 4급 브롬화암모늄을 3 중량％ 현탁액 에 첨가하여 혼합물-주조 용액을 제조하였다. 모든 혼합물-주조 용액을 4급 브롬화암모늄의 농도가 알기네이트 현탁액 중 카르복실산 부위의 농도를 초과하도록 제조하였다. 최적화시킨 후에, 가장 안정하고 재현가능한 막이 교환 부위의 농도의 3배에 해당하는 4급 브롬화암모늄 농도를 갖는 것으로 결정되었다.
주조 용액 1 mL를 칭량 보트(weighing boat)에 넣고 건조시켰다. 18 MΩ 물 7.0 mL를 칭량 보트에 첨가하고, 밤새 침지시켰다. 물을 제거하고, 필름을 18 MΩ 물로 철저하게 세정하고 건조시켰다. 이어서, 필름을 다시 메탄올 1.0 mL에 현탁시켰다. 테트라프로필암모늄 (T3A), 테트라펜틸암모늄 (T5A), 테트라헥실암모늄 (T6A), 테트라헵틸암모늄 (T7A), 트리메틸이코실암모늄 (TMICA), 트리메틸옥틸데실암모늄 (TMODA), 트리메틸헥실데실암모늄 (TMHDA), 트리메틸테트라데실암모늄 (TMTDA) , 트리메틸옥틸암모늄 (TMOA), 트리메틸도데실암모늄 (TMDDA), 트리메틸데실암모늄 (TMDA), 트리메틸헥실암모늄 (TMHA), 테트라부틸암모늄 (TBA), 트리에틸헥실암모늄 (TEHA)의 브롬화암모늄 염을 알기네이트 개질제로 사용하여 어떤 것이 가장 우수한 미셀 구조를 생성하는지 관찰하였다. 미셀 구조는 효소의 효과적인 고정화에 중요하다.
세공 특성을 결정하기 위해, 이어서 각각의 중합체 3 방울을 슬라이드 위에 올리고 건조시켰다. 건조가 완료된 후에, 이들을 에탄올 중 1 mM Ru(bpy)+2에 3 시간 이상 동안 침지시켰다. 에탄올로 세정한 후에, 중합체를 건조시키고, 이어서 형광 현미경으로 영상화시켜 미셀 구조를 관찰하였다. 구조의 한 가지 예를 도 12 에 나타내었다.
또다른 실험에서, 초저 분자량 알기네이트 및 도데실아민을 25％ 에탄올에 넣고 환류시켜 카르복실산기의 아미드화에 의해 도데실-개질된 알기네이트를 생성하였다.
실시예 10: 알기네이트 전극의 제조
실시예 9에 기재된 소수성 암모늄 양이온으로 개질된 알기네이트 중합체의 3 중량％ 용액을 t-아밀 알코올에 현탁시키고, 효소 (예를 들면, 알코올 데히드로게나제, 글루코스 데히드로게나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코스 옥시다제)의 용액을 첨가하였다. 이 용액을 전극 물질 상에 피펫으로 올렸다. 이 전극 물질은 통상적으로 탄소 직물 또는 다른 탄소 물질이다.
실시예 11: 알기네이트 바이오연료 전지
소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 애노드 효소를 갖는 바이오연료 전지는 소수성 개질된 알기네이트를 효소 및 완충액의 용액과 혼합물-주조하고, 이 혼합물을 탄소 직물 상에 피펫으로 올려 상기 실시예 10에 기재된 것과 유사한 바이오애노드를 형성함으로써 제조하였다. 상기 및 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 소수성 개질된 나피온(등록상표) 막을 포함하는 바이오캐소드는 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 바이오연료 전지의 형성에 사용될 수 있다. 별법으로, 소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 캐소드 효소를 갖는 바이오연료 전지는 소수성 개질된 알기네이트를 효소 및 완충액의 용액과 혼합물-주조하고, 이 혼합물을 탄소 직물 상에 피펫으로 올려 바이오캐소드를 형성함으로써 제조하였다. 상기 및 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 소수성 개질된 나피온(등록상표) 막을 포함하는 바이오애노드는 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 바이오연료 전지의 형성에 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 제조된 소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 캐소드 효소 및 상기 기재된 바와 같이 제조된 소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 애노드 효소를 갖는 바이오애노드를 갖는 바이오연료 전지가 제조될 수 있다.
실시예 12: 미세유체 바이오연료 전지
PDMS 미세성형 채널의 생성에 사용되는 마스터는 미세성형 채널에 대해 30 초 동안 1000 rpm의 스핀 프로그램에서 작동하는 스핀 코터 (브루어 사이언스(Brewer Science), 미국 미주리주 롤라 소재)를 이용하여 SU-8 10 네거티브형 포토레지스트로 4-인치 규소 웨이퍼를 코팅하여 제조하였다. 유동 채널의 경우, 30 초 동안 1750 rpm의 스핀 프로그램이 SU-8 50 네거티브형 포토레지스트와 사용된다. 포토레지스트를 90 ℃에서 5 분 동안 미리 베이킹 후에, 미세성형 채널 또는 유동 채널 설계 구조 (조스텐스(Jostens), 미국 캔자스주 토페카 소재)를 함유하는 네거티브 필름을 통해 인접한-UV 투사 공급원 (오토플루드 1000(Autoflood 1000), 옵티컬 어소시에이츠(Optical Associates), 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)을 사용하여 4 분 동안 UV에 노출시켰다. 투명도는 손으로 그린 컴퓨터 디자인으로부터 만들었다 (PC 버젼 8.0, 매크로미디어 인크.(Macromedia Inc.), 미국 캘리포니 아주 샌프란시스코 소재). 도안은 인쇄 지원으로 2400 dpi의 해상도를 갖는 영상 세터 (조스텐스, 미국 캔자스주 토페카 소재)를 이용하여 투명도로 옮겼다. 이러한 노출에 이어, 웨이퍼를 90 ℃에서 5 분 동안 후속-베이킹하고, 나노(Nano) SU-8 현상기로 현상하였다. 규소 웨이퍼 상에 남아있을 수 있는 임의의 잉여량의 노출되지 않은 포토레지스트를 제거하기 위해, 설계 디자인을 함유하는 웨이퍼를 아세톤 및 이소프로판올로 세정하였다. 포토레지스트의 두께는 프로필로미터(profilometer) (알파 스텝-200(Alpha Step-200), 텐코 인스트루먼츠(Tencor Instruments), 미국 캘리포니아주 마우틴뷰 소재)로 측정하였으며, 이는 PDMS 구조의 채널 깊이에 상응한다.
이어서, 실가드(Sylgard) 184 엘라스토머 및 경화제의 탈기된 10:1 혼합물을 규소 웨이퍼에 붓고, 75 ℃에서 대략 2 시간 동안 경화시켰다. 모서리 주위를 잘라내고 PDMS를 다시 웨이퍼로부터 벗겨내어 PDMS를 마스터 웨이퍼로부터 분리하였다. 마스터는 PDMS 채널의 다수의 카피를 생성하기 위해 다시 사용될 수 있다. 생성된 PDMS 유동 채널은 200 mm 폭, 100 mm 깊이 및 3.0 cm 길이를 갖는다.
소다-라임(Soda-lime) 유리 플레이트를 지역 유리 상점에서 구입하였다. 플레이트는 7 cm 폭, 10 cm 길이 및 1.54 mm 두께를 갖는다. 유리 플레이트를 피라니아(piranha) 용액 (70％ 농축된 H2SO4/30％ H2O2)에 15 분 동안 침지시켜 세척함으로써 유기 불순물을 제거하였다. 이어서, 유리를 나노퓨어(Nanopure) (18 MΩ-cm) 물로 철저하게 세정하고, 질소로 건조시켰다. 전통적인 리소그래피 및 스퍼터링 절차를 이용하여, 팔라듐 전극을 유리 상에서 특정 패턴으로 제작하였다. 각각의 플레이트는 전극을 갖는 여러 유동 채널을 보유할 수 있었다. 이는 특히 한 층의 티탄 (흡착 특성을 위함) 및 한 층의 팔라듐의 아르곤 이온 스퍼터링에 의해 달성된다. 이를 달성하기 위해, 유리를 금속 침착에 이용되는 침착 시스템 (박막 침착 시스템(Thin Film Deposition System), 커트 제이. 레스커사(Kurt J. Lesker Co.))에 넣었다. 금속의 두께는 석영 결정 침착 모니터(인피콘 XTM/2(Inficon XTM/2), 레이볼드 인피콘(Leybold Inficon))를 이용하여 모니터링하였다. 티탄은 Ti-표적으로부터 약 2.3 Å/s의 속도에서 200 Å의 깊이로 침착시켰다. 팔라듐은 Pd-표적으로부터 약 1.9 Å/s의 속도에서 2000 Å의 깊이로 침착시켰다. AZ 1518 포지티브형 포토레지스트는 팔라듐 코팅된 유리 상에서 역학적으로 분산된다. 베이크를 95 ℃에서 1 분 동안 사전 노출시킨 후에 9 초 동안 포지티브 필름을 통해 자외선에 노출시켰다. 필름을 제거하고, 유리를 시판되는 현상기 (AZ 300 MIF 현상기)에 45 초 동안 넣었다. 물로 세정하고, 질소로 건조시킨 후에, 유리를 나중에 95 ℃에서 1 분 동안 베이킹하였다. 왕수(Aqua regia) (8:7:1 H2O:HCl:HNO3)를 사용하는 습윤 에칭을 이용하여 원치않는 팔라듐을 제거하고, 티탄 에칭제로 원치않는 티탄을 유리로부터 제거하였다. 일단 완료되면, 유리를 아세톤 및 이소프로판올로 세정하여 나머지 포토레지스트를 제거하고, 질소로 건조시켰다.
물 속에 잠긴 상태에서 1-mm 다이아몬드 드릴 비트 및 드레멜(Dremel) 회전 공구 (드레멜)로 각각의 유리 플레이트에 흐름 입구를 뚫었다. 이들의 어답터의 주사기 커넥터 부분을 드레멜 회전 공구로 제거하고, 원반형으로 절단하였다. 샌딩 디스크로 연마한 후에, 이들의 어답터를 J.B. 벨트(J.B. Weld)로 유리 플레이트에 부착시켰다. 에폭시를 사용 전에 오븐 (75 ℃)에서 2 시간 동안 경화시켰다. 구리 전선 및 콜로이드성 은에 의해 팔라듐 전극을 연결시켰다.
탄소 잉크 미세전극를 제작하기 위해, 우선 PDMS 미세성형 채널을 철저하게 세척된 팔라듐 도선과 (이들이 부착되어 피팅(fitting)된 상태로) 접촉하고 있는 유리 플레이트로 실링하였다. PDMS 채널은 우선 용매 희석제 (N-160)로 프라이밍하였다. 희석제는 어느 한 저장소에 진공을 적용하여 제거하였다. 희석제가 제거되자마자, 시판되는 탄소 잉크 및 용매 희석제의 혼합물을 채널에 첨가하고, (물 흡입기를 통해) 반대편 말단에 진공을 적용하여 채널을 통해 밀어내었다. 잉크/희석제 혼합물은 첨가된 희석제의 부피가 처음 잉크 중량의 0.2 부피/중량％가 되도록 만들었다. 채널을 탄소 잉크로 충전시킨 후에, 진공이 적용되는 저장소를 잉크/희석제 용액으로 충전시키고, 칩 전체를 75 ℃의 오븐에 1 시간 동안 넣어 두었다. 이 기간 후에, PDMS가 유리로부터 제거되어 유리 표면에 부착된 탄소 미세전극이 남게 할 수 있었다. 최종 경화/조건화 단계는 칩을 12 ℃의 별도의 오븐에 1 시간 동안 넣어 수행한다. 탄소 미세전극의 높이는 프로필로미터로 측정하고, 폭은 현미경을 통해 측정하였다.
탄소 잉크 전극을 더 특성화하기 위해, 순환 전압전류법을 이용하여 CH 인스트루먼츠 810 바이일정전위기 (미국 텍사스주 오스틴 소재)를 사용하는 3-전극 포맷으로 수행하였다. 탄소 미세전극은 은/염화은 기준 전극 및 보조 전극으로서의 백금 전선을 갖는 작용 전극이다. 순환 전압전류법 실험에 사용되는 정전기적 전지는 보다 큰 PDMS 조각 (2 cm×3 cm)을 작은 부분 (1 cm×2 cm)들로 절단하여 만든 PDMS 조각으로 제작하고; 이어서 상기 PDMS 조각을 탄소 전극 위에서 실링하여 전극의 전체 길이가 용액에 노출되도록 하였다. 유동 실험의 경우, PDMS 마이크로채널 (약 200 mm 폭, 100 mm 깊이 및 약 2 cm 길이)을 탄소 전극 위에서 실링하여 전체 전극이 마이크로채널 내부에 실링되도록 하였다. 보조 및 기준 전극은 전기화학 전지 홀더 (CH 인스트루먼츠)를 사용하여 저장소의 출구에 함유시켰다.
탄소 작용 전극은 메틸렌 그린과 전기중합된다. 메틸렌 그린은 NADH에 대해 공지된 전극촉매이다. 10 mM 붕산나트륨 중에 0.4 mM 메틸렌 그린 및 0.1 M 질산나트륨을 함유하는 용액 중에서 0.05 V/s의 스캔 속도로 7 스캔 주기에 대해 -0.3 V 내지 1.3 V 범위에서 CH 인스트루먼츠 모델 810 일정전위기 (미국 텍사스주 오스틴 소재)를 이용하는 순환 전압전류법을 수행하여 박막 폴리(메틸렌 그린)이 형성되었다. 한 조각의 PDMS를 사용하여 전체 탄소 전극 위에서 전기화학 전지를 한정하였다. 백금 전선 보조 전극을 갖는 칼로멜 기준 전극이 전기화학 전지를 완성시켰다. 전극을 세정한 후에 밤새 건조시키고, 이어서 추가로 개질시켰다.
유리 플레이트에 뚫어 놓은 흐름 입구는 주사기 펌프 (펌프 11, 하바드 아파라터스(Harvard Apparatus), 미국 메사추세츠주 홀리스톤 소재)로부터의 흐름으로의 접근을 허용한다. 주사기를 선택된 용액으로 충전시키고, 주사기 펌프에 넣었다. 고압 피팅, 이들의 어답터 및 테플론(Teflon) PEEK 배관을 사용하여, 주사기를 유리 마이크로칩에 연결시켰다. 흐름 입구의 한쪽 말단에 정렬된 200 ㎛-폭 PDMS 유동 채널을 통과하는 유속은 0 ㎕/분 내지 15 ㎕/분 범위로 달라진다. 채널을 전극 위에서 직접 실링하였다. 채널의 다른 말단에서, 저장소를 홀 펀치(hole punch)로 형성하고, 여기에 캐소드 또는 기준 및 반대 전극을 넣었다.
탄소 잉크 전극은 일반적으로 전극 길이가 2.5 cm이고, 폭은 55 ㎛이고, 높이는 87 ㎛이다. 1 mM 트리스(2,2'-바이피리딜)디클로로루테늄(II) 6수화물 및 0.1 M 황산나트륨의 용액을 전해질로 사용하여 순환 전압전류법에 의해 전극에 대한 반응을 특성화하였다. 유속이 증가할수록 전류 밀도가 증가하였으며, 이는 유속이 증가함에 따라 분석 물질이 전극 표면에 보다 빠르게 도달하기 때문인 것으로 예상된다. 처음에, 0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중에서 3 분 동안 1.5 V를 적용하는 전기화학적 예비처리를 이용하여 전극을 세척하였다.
메틸렌 그린을 -0.3 V 내지 1.3 V 범위에서 14개 스캔 절편을 사용하여 탄소 미세전극 상에 고정화시키고, 거대-규모 탄소 전극에 대해서도 동일한 절차를 이용하였다. 시판되는 마이크로피팅을 사용하여, 탄소 미세전극 위에서 가역적으로 실링된 3 cm×240 mm×100 mm PDMS 채널을 통해 20 mL/분까지의 유속으로 방출할 수 있다. NADH는 0.5 mL/분 내지 15.0 mL/분 범위의 다양한 유속으로 PDMS 유동 채널을 통해 방출하였다.
전자 도체 및 효소 고정화 물질을 포함하는 전극 형성 과정을 간단하게 하기 위해 상기 절차를 약간 변형시켰다. 이와 같이 하여, 전자 도체 용액은 효소 고정화 물질을 포함하도록 개질되었다. 에르콘 N160 용매 희석제에서 현탁시키고 철저하게 볼텍스로 교반한 t-아밀 알코올 중 소수성 개질된 키토산의 2 중량％ 용액 또 는 알코올 용액 중 소수성 개질된 알기네이트의 3 중량％ 용액을 첨가하여 추가의 물질을 제조하였다. 마지막으로, 상기 개질된 희석제 1 mL를 에르콘 E-978(I) 탄소-기재 잉크 0.5 g에 첨가하였다. 이어서, 상기 개질된 전자 도체 용액을 주조용 금형 및 기판에 의해 형성된 금형 공동을 통해 유동시키고, 본 실시예에서 상기 기재한 방법에 따라 경화시켰다.
본 발명에 따른 바이오애노드를 형성하기 위해, 경화 및 활성화 단계 후에 전자 도체 위에 추가의 물질을 유동시켜 완성되는 애노드를, 상기 본 실시예에 기재된 일반적 단계에 이용하였다. 시작을 위해, 전자 도체를 통한 주사기 방출에 의해 메틸렌 그린 용액을 제조하였다. 이어서, 용액을 50 mV/s의 스캔 속도로 -0.3 V 내지 1.3 V 범위에서 14개 스캔 절편에 대해 전기중합시켰다. 이어서, t-아밀 알코올 중 소수성 개질된 키토산의 2 중량％ 용액 또는 알코올 중 소수성 개질된 알기네이트의 3 중량％ 용액, 효소 용액, 및 저급 지방족 알코올 중의 전자 매개체를 합하여 나머지 애노드 요소의 주조 용액을 제조하였다. 이어서, 상기 용액을 함께 철저하게 볼텍스로 교반하고, 대략 100 mm 마이크로채널을 통해 약 1 mL/분의 유속으로 방출시켰다. 이어서, 전자 도체 및 주조 용액을 밤새 건조시켰다.
바이오캐소드의 경우, 마이크로칩 및 채널 마스터는 포토리소그래피를 이용하여 상기 본 실시예에서 기재된 바와 같이 제작하였다. 미세성형 절차로부터 제조된 탄소 잉크 미세전극은 상기 기재된 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트 막 혼합물로 추가로 개질될 수 있다.
탄소 미세전극을 개질시켜 바이오애노드로 사용하였다. PDMS에 구멍을 뚫어, 미세전극 주위에 위치하고 Ag/AgCl 기준 전극 및 보조 전극으로서의 백금 전선을 포함하는 거대한 저장소를 형성하였다. 특히, 이는 정전기적 전지이다. 10 mM 붕산나트륨 중 0.4 mM 메틸렌 그린 및 0.1 M 질산나트륨의 용액을 피펫으로 PDMS 저장소에 넣었다. 50 mV/s의 스캔 속도로 14개 스캔 절편에 대해 -0.3 V 내지 1.3 V 범위에서 CH 인스트루먼츠 650 일정전위기 (미국 텍사스주 오스틴 소재)를 이용하여 순환 전압전류법을 통한 메틸린 그린의 중합을 수행하였다. 메틸렌 그린 용액을 피펫으로 저장소로부터 제거하고, PDMS를 제거하였다. 이어서, 폴리(메틸렌 그린) 개질된 탄소 잉크 미세전극을 18MΩ (나노퓨어) 물로 세정하고, 밤새 건조시켰다.
효소/소수성 개질된 키토산 혼합물 또는 효소/소수성 개질된 알기네이트 혼합물을 미세전극 위에서 가역적으로 실링된 마이크로채널 및 유체역학 유동을 이용하여 탄소 미세전극 상에 고정화시켰다. 이러한 유동 채널의 크기는 미세전극 위에서의 정렬이 가능한 크기이지만 전극보다 훨씬 넓지는 않다. 이를 달성하기 위해, PDMS 마이크로채널 (130 mm 폭, 100 mm 깊이 및 약 2 cm 길이)을 탄소 전극 (약 40 mm 폭, 약 2 cm 길이 및 약 100 mm 높이) 위에서 실링하여 전극 전체가 마이크로채널 내부에 실링되도록 하였다. 각각 20 mL의 소수성 개질된 키토산 (또는 소수성 개질된 알기네이트 혼합물)에 대해 전자 매개체 1 mg을 갖는 2:1 비율의 효소 및 소수성 개질된 키토산 혼합물 (또는 소수성 개질된 알기네이트 혼합물)을 제조하고, 충분히 혼합될 때까지 볼텍스로 교반하였다. 혼합물을 주사기 펌프 (하바 드 아파라터스, 미국 오하이오주 브룩필드 소재)를 사용하여 주사기를 통해 1.0 mL/분으로 체널에 도입시켰다. 혼합물이 채널의 전구간을 통과하면 (육안으로 모니터링함), 용매를 실온에서 증발시켰다. 이는 PDMS가 기체에 투과성이기 때문에 가능하였다. 증발이 완료된 후에, PDMS를 제거하자 코팅된 바이오애노드가 남았다.
본 발명에 따른 바이오캐소드를 형성하기 위해, 경화 및 활성화 단계 후에 전자 도체 위에 추가의 물질을 유동시켜 완성된 바이오캐소드를, 본 실시예에 기재된 일반적 단계에 사용하였다.
전자 도체를 개질시키기 위해, 빌리루빈, 빌리루빈 옥시다제 및 소수성 개질된 키토산 (또는 소수성 개질된 알기네이트 혼합물)의 주조 용액을 함께 약 20 분 동안 볼텍스로 교반하였다. 이어서, 용액을 약 1 mL/분의 유속으로 대략 100 mm 마이크로채널을 통해 방출하였다. 이어서, 전자 도체 및 주조 용액을 밤새 건조시켰다. 건조되면, 전극을 Ru(bpy)3 +2 및 황산나트륨의 용액에 약 24 시간 동안 침지시켰다.
상기 기재된 바이오애노드와 유사한 방식으로 바이오캐소드를 제조하였다. PDMS 마이크로채널은 탄소 잉크 미세전극 위에서 실링하였다. 소수성 개질된 키토산 (또는 소수성 개질된 알기네이트)을 전자 매개체 및 캐소드 효소와 혼합하였다. 이어서, 용매를 증발시킨 후에 혼합물이 채널의 말단에 도달할 때까지 혼합물을 채널을 통해 1.0 mL/분으로 방출하였다. 트리스(2,2'-바이피리딜)디클로로루테 늄(II) 6수화물은 그의 1.0 mM 용액을 5 시간 동안 0.5 mL/분의 유속으로 유동시켜 막 내에서 교환하였다. PDMS 유동 채널을 제거하자 코팅된 전극이 남았으며, 이를 바이오캐소드로 사용하였다.
상기 관점에서, 본 발명의 여러 목적이 달성되고, 다른 유리한 결과를 얻게되는 것이 관찰될 것이다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 상기 방법에 다양한 변화가 있을 수 있으므로, 상기 상세한 설명에 함유되어 있거나 첨부된 도면에서 보여주는 모든 내용은 단지 설명을 하기 위한 것으로, 제한적 의미로 사용되지는 않는 것으로 해석되어야 한다.
본원의 특허청구범위 내에 포함되는 다른 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 명세서 또는 실시를 고려하여 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서는 실시예와 함께 단지 예를 들어 설명한 것으로, 본 발명의 범위 및 취지는 실시예 뒤에 첨부하는 특허청구범위에 의해 지시되는 것으로 여겨져야 한다.
Claims (71)
- (a) 전자 도체;(b) 산화된 형태의 전자 매개체 및 연료 유체와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체 및 환원된 형태의 전자 매개체를 생성할 수 있는 하나 이상의 애노드 효소; 및(c) 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하며, 여기서 상기 환원된 형태의 전자 매개체는 전자 도체로 전자를 방출할 수 있고, 상기 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류를 포함하는 것인 바이오애노드.
- 제1항에 있어서, 효소 고정화 물질이 전자 매개체를 포함하는 것인 바이오애노드.
- (a) 전자 도체;(b) 산화된 형태의 전자 매개체 및 연료 유체와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체 및 환원된 형태의 전자 매개체를 생성할 수 있는 하나 이상의 애노드 효소;(c) 연료 유체 및 전자 매개체에 투과성인 효소 고정화 물질; 및(d) 전자 도체에 인접하여 있는 전극촉매 (이 전극촉매의 산화된 형태는 환 원된 형태의 전자 매개체와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 환원된 형태의 전극촉매를 생성할 수 있고, 이 전극촉매의 환원된 형태는 전자 도체로 전자를 방출할 수 있음)를 포함하며, 여기서 상기 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류를 포함하는 것인 바이오애노드.
- 제3항에 있어서, 효소 고정화 물질이 전자 매개체, 전극촉매, 또는 전자 매개체와 전극촉매를 포함하는 것인 바이오애노드.
- (a) 전자 도체;(b) 환원된 형태의 전자 매개체 및 산화제와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 물을 생성할 수 있는 하나 이상의 캐소드 효소; 및(c) 전극촉매 (이 전극촉매의 산화된 형태는 전자 도체로부터 전자를 수득하여 환원된 형태의 전극촉매를 생성할 수 있으며, 이 전극촉매의 환원된 형태는 산화된 형태의 전자 매개체와 반응하여 환원된 형태의 전자 매개체 및 산화된 형태의 전극촉매를 생성할 수 있음); 전자 매개체; 또는 상기 전극촉매와 전자 매개체를 포함하며 산화제에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하며, 여기서 상기 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류를 포함하는 것인 바이오캐소드.
- (a) 전자 도체;(b) 환원된 형태의 전자 매개체 및 산화제와 반응하여 산화된 형태의 전자 매개체 및 물을 생성할 수 있는 하나 이상의 캐소드 효소; 및(c) 전자 매개체 (이 전자 매개체의 산화된 형태는 전자 도체로부터 전자를 수득하여 환원된 형태의 전자 매개체를 생성할 수 있음)를 포함하며 산화제에 투과성인 효소 고정화 물질을 포함하며; 여기서 상기 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류를 포함하는 것인 바이오캐소드.
- 연료 유체; 전자 매개체; 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이오애노드; 제5항 또는 제6항의 바이오캐소드를 포함하는, 전기 발생용 바이오연료 전지.
- 연료 유체; 전자 매개체; 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이오애노드; 및 캐소드를 포함하는 전기 발생용 바이오연료 전지.
- 연료 유체; 전자 매개체; 애노드; 및 제5항 또는 제6항의 바이오캐소드를 포함하는 전기 발생용 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류가 키토산, 셀룰로스, 키틴, 전분, 아밀로스, 알기네이트 및 이들의 조합을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 개질된 다당류가 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 개질된 다당류가 미셀 구조를 갖는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 고정화 물질이 소수성 개질된 알기네이트를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제13항에 있어서, 소수성 개질된 알기네이트가 NH4 + 보다 큰 소수성 양이온으로 개질된 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제14항에 있어서, 소수성 양이온이 암모늄-기재 양이온, 4급 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥스데실피리디늄, 에티듐, 비올로겐, 메틸 비 올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀)이미늄, 금속 착체, 바이피리딜 금속 착체, 페난트롤린-기재 금속 착체, [Ru(바이피리딘)3]2+ 또는 [Fe(페난트롤린)3]3+를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제14항에 있어서, 소수성 양이온이 하기 화학식 4로 나타낸 4급 암모늄 이온을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.<화학식 4>
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. - 제16항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아닌 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제16항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 동일하며, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제16항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 부틸인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제16항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4 중 하나가 헥실, 옥틸, 데실, 도데실 또는 테트라데실이고, 나머지는 독립적으로 메틸, 에틸 또는 프로필인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제12항에 있어서, 상기 소수성 개질된 미셀 다당류가 하기 화학식 1에 상응하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.<화학식 1>
상기 식에서,n은 정수이고;R10은 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고;R11은 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이다. - 제21항에 있어서, 소수성 개질된 다당류의 분자량이 약 90,000 내지 약 500,000인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항에 있어서, 소수성 개질된 다당류의 분자량이 약 225,000 내지 약 275,000인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 알킬이고, R11이 독립적으로 수소 또는 알킬인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 헥실이고, R11이 독립적으로 수소 또는 헥실인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 옥틸이고, R11이 독립적으로 수소 또는 옥틸인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고, R11이 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항 또는 제27항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 오스뮴, 루테늄, 철, 니켈, 로듐, 레늄 또는 코발트와 1,10-페난트롤린 (phen), 2,2'-바이피리딘 (bpy) 또는 2,2',2"-테르피리딘 (terpy), 메틸렌 그린, 메틸렌 블루, 폴리(메틸렌 그린), 폴리(메틸렌 블루), 루미놀, 니트로-플루오레논 유도체, 아진, 오스뮴 페난트롤린디온, 카테콜-펜던트 테르피리딘, 톨루엔 블루, 크레실 블루, 나일 블루, 뉴트랄 레드, 페나진 유도체, 티오닌, 아주레 A, 아주레 B, 톨루이딘 블루 O, 아세토페논, 메탈로프탈로시아닌, 나일 블루 A, 개질된 전이 금속 리간드, 1,10-페난트롤린-5,6-디온, 1,10-페난트롤린-5,6-디올, [Re(phen-디온)(CO)3Cl], [Re(phen-디온)3](PF6)2, 폴리(메탈로프탈로시아닌), 폴리(티오닌), 퀴논, 디이민, 디아미노벤젠, 디아미노피리딘, 페노티아진, 페녹사진, 톨루이딘 블루, 브릴리언트 크레실 블루, 3,4-디히드록시벤즈알데히드, 폴리(아크릴산), 폴리(아주레 I), 폴리(나일 블루 A), 폴리아닐린, 폴리피리딘, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리(티에노[3,4-b]티오펜), 폴리(3-헥실티오펜), 폴리(3,4-에틸렌디옥시피롤), 폴리(이소티아나프텐), 폴 리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(디플루오로아세틸렌), 폴리(4-디시아노메틸렌-4H-시클로펜타[2,1-b;3,4-b']디티오펜), 폴리(3-(4-플루오로페닐)티오펜), 폴리(뉴트랄 레드) 또는 이들의 조합의 전이 금속 착체인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항 또는 제27항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(phen)3 +2, Fe(phen)3 +2, Os(phen)3 +2, Co(phen)3 +2, Cr(phen)3 +2, Ru(bpy)3 +2, Os(bpy)3 +2, Fe(bpy)3 +2, Co(bpy)3 +2, Cr(bpy)3 +2, Os(terpy)3 +2, Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항 또는 제27항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리 딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제21항 또는 제27항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 전자 도체가 탄소-기재 물질, 금속성 도체, 반도체, 금속 산화물 또는 개질된 도체를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 전자 도체가 탄소-기재 물질을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제33항에 있어서, 전자 도체가 탄소 직물, 카본지, 탄소 스크린 인쇄 전극, 카본 블랙, 탄소 분말, 탄소 섬유, 단일벽 탄소 나노튜브, 이중벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 탄소 나노튜브 배열, 다이아몬드-코팅된 도체, 유리 탄소, 중간 다공성 탄소, 그래파이트, 압착되지 않은 그래파이트 웜(worm), 박리 정제된 플레이크 그래파이트, 고성능 그래파이트, 고정렬된 열분해 그래파이트, 열분해 그래파이트 또는 다결정질 그래파이트를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 효소가 옥시도리덕타제를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제4항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 애노드 효소가 글루코스 옥시다제, 알코올-기재 옥시다제 또는 콜레스테롤-기재 옥시다제를 포함하는 것인 바이오애노드 또는 바이오연료 전지.
- 제5항, 제6항, 제7항 및 제9항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 캐소드 효소가 라카아제, 사이토크롬 C 옥시다제, 빌리루빈 옥시다제 또는 퍼록시다제를 포함하는 것인 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제5항, 제6항, 제7항 및 제9항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 캐소드 효소가 약 6.5 내지 약 7.5 범위의 pH에서 최적의 활성을 갖는 산소 옥시도리덕타제를 포함하는 것인 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제5항, 제6항, 제7항 및 제9항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 캐소드 효소가 빌리루빈 옥시다제를 포함하는 것인 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
- 제1항 내지 제4항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 애노드 효소가 PQQ-의존성 데히드로게나제를 포함하는 것인 바이오애노드 또는 바이오연료 전지.
- 제7항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 산화제가 산소 또는 과산화물을 포함하는 것인 바이오연료 전지.
- 제41항에 있어서, 산화제가 산소를 포함하는 것인 바이오연료 전지.
- 제7항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 연료 유체가 암모니아, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소부탄올, 부탄올 및 이소프로판올, 알릴 알코올, 아릴 알코올, 글리세롤, 프로판디올, 만니톨, 글루쿠로네이트, 알데히드, 탄수화물, 글루코스, 글루코스-1, D-글루코스, L-글루코스, 글루코스-6-포스페이트, 락테이트, 락테이트-6-포스페이트, D-락테이트, L-락테이트, 프룩토스, 갈락토스-1, 갈락토스, 알도스, 소르보스, 만노스, 글리세레이트, 조효소 A, 아세틸 Co-A, 말레이트, 이소시트레이트, 포름알데히드, 아세트알데히드, 아세테이트, 시트레이트, L-글루코네이트, β-히드록시스테로이드, α-히드록시스테로이드, 락트알데히드, 테스토스테론, 글루코네이트, 지방산, 지질, 포스포글리세레이트, 레티날, 에스트라디올, 시클로펜탄올, 헥사데칸올, 장쇄 알코올, 코니페릴-알코올, 신나밀-알코올, 포르메이트, 장쇄 알데히드, 피루베이트, 부타날, 아실-CoA, 스테로이드, 아미노산, 플라빈, NADH, NADH2, NADPH, NADPH2 또는 수소를 포함하는 것인 바이오연료 전지.
- 제43항에 있어서, 연료 유체가 메탄올, 에탄올 또는 프로판올을 포함하는 것인 바이오연료 전지.
- 제44항에 있어서, 연료 유체가 에탄올을 포함하는 것인 바이오연료 전지.
- 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오애노드가 정전기적으로 연결된 PQQ 분자를 갖는 PQQ-의존성 알코올 데히드로게나제를 포함하는 것인 바이오연료 전지.
- 제7항 및 제10항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오애노드 및 바이오캐소드가 염 브릿지 또는 중합체 전해질 막에 의해 분리되지 않은 것인 바이오연료 전지.
- (a) 애노드 또는 바이오애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드 또는 바 이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계;(b) 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 동안 환원된 형태의 전자 매개체를 산화시키는 단계;(c) 전극촉매를 산화시키는 단계; 및(d) 전자 도체에서 전극촉매를 환원시키는 단계를 포함하는, 제7항 내지 제47항 중 어느 한 항의 바이오연료 전지를 사용하는 전기 발생 방법.
- (a) 애노드 또는 바이오애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계;(b) 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 동안 환원된 형태의 전자 매개체를 산화시키는 단계; 및(c) 전자 도체에서 전자 매개체를 환원시키는 단계를 포함하는, 제7항 내지 제47항 중 어느 한 항의 바이오연료 전지를 사용하는 전기 발생 방법.
- 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있으며 효소보다 작은 화합물에 투과성인 소수성 개질된 미셀 다당류에 고정화된 효소.
- 제50항에 있어서, 약 95 중량％ 또는 95 부피％를 초과하는 에탄올을 포함하 는 용액에 고정화된 효소.
- 완충 용액에 넣었을 때 효소보다 높은 활성을 나타내는, 소수성 개질된 다가양이온성 미셀 중합체에 고정화된 효소.
- 완충 용액에 넣었을 때 효소보다 높은 활성을 나타내는, 소수성 개질된 다가음이온성 미셀 중합체에 고정화된 효소.
- 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 알코올 데히드로게나제, 알데히드 데히드로게나제, 포르메이트 데히드로게나제, 포름알데히드 데히드로게나제, 글루코스 데히드로게나제, 글루코스 옥시다제, 유산 데히드로게나제, 락토스 데히드로게나제, 피루베이트 데히드로게나제 또는 빌리루빈 옥시다제를 포함하는 고정화된 효소.
- 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 또는 다가양이온성 중합체가 키토산을 포함하는 것인 고정화된 효소.
- 제50항, 제51항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 또는 다가음이온 중합체가 알기네이트를 포함하는 것인 고정화된 효소.
- 제50항, 제51항, 제52항, 제54항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 개질된 미셀 다당류 또는 소수성 개질된 다가양이온성 미셀 중합체가 하기 화학식 1에 상응하는 것인 고정화된 효소.<화학식 1>
상기 식에서,n은 정수이고;R10은 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고;R11은 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이다. - 제57항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 알킬이고, R11이 독립적으로 수소 또는 알킬인 고정화된 효소.
- 제57항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 헥실이고, R11이 독립적으로 수소 또는 헥실인 고정화된 효소.
- 제57항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 옥틸이고, R11이 독립적으로 수소 또는 옥틸인 고정화된 효소.
- 제57항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고, R11이 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체인 고정화된 효소.
- 제61항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 오스뮴, 루테늄, 철, 니켈, 로듐, 레늄 또는 코발트와 1,10-페난트롤린 (phen), 2,2'-바이피리딘 (bpy) 또는 2,2',2"-테르피리딘 (terpy), 메틸렌 그린, 메틸렌 블루, 폴리(메틸렌 그린), 폴리(메틸렌 블루), 루미놀, 니트로-플루오레논 유도체, 아진, 오스뮴 페난트롤린디온, 카테콜-펜던트 테르피리딘, 톨루엔 블루, 크레실 블루, 나일 블루, 뉴트랄 레드, 페나진 유도체, 티오닌, 아주레 A, 아주레 B, 톨루이딘 블루 O, 아세토페논, 메탈로프탈로시아닌, 나일 블루 A, 개질된 전이 금속 리간드, 1,10-페난트롤린-5,6-디온, 1,10-페난트롤린-5,6-디올, [Re(phen-디온)(CO)3Cl], [Re(phen-디온)3](PF6)2, 폴리(메탈로프탈로시아닌), 폴리(티오닌), 퀴논, 디이민, 디아미노벤젠, 디아미노피리딘, 페노티아진, 페녹사진, 톨루이딘 블루, 브릴리언트 크레실 블루, 3,4-디히드록시벤즈알데히드, 폴리(아크릴산), 폴리(아주레 I), 폴리(나일 블루 A), 폴리아닐린, 폴리피리딘, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리(티에노[3,4-b]티오펜), 폴리(3-헥실티오펜), 폴리(3,4-에틸렌디옥시피롤), 폴리(이소티아나프텐), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(디플루오로아세틸렌), 폴리(4-디시아노메틸렌-4H-시클로펜타[2,1-b;3,4-b']디티오펜), 폴리(3-(4-플루오로페닐)티오펜), 폴리(뉴트랄 레드) 또는 이들의 조합의 전이 금속 착체인 고정화된 효소.
- 제61항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(phen)3 +2, Fe(phen)3 +2, Os(phen)3 +2, Co(phen)3 +2, Cr(phen)3 +2, Ru(bpy)3 +2, Os(bpy)3 +2, Fe(bpy)3 +2, Co(bpy)3 +2, Cr(bpy)3 +2, Os(terpy)3 +2, Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합인 고정화된 효소.
- 제61항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥 실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합인 고정화된 효소.
- 제61항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2인 고정화된 효소.
- 소수성 기에 의해 개질된 키토산의 아민 관능기를 약 10％ 이상 갖는 소수성 개질된 미셀 키토산.
- 하기 화학식 1A에 상응하는 구조를 갖는 소수성 산화환원 반응 매개체 개질된 미셀 키토산.<화학식 1A>
상기 식에서,n은 정수이고;R10a는 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이고;R11a는 독립적으로 수소 또는 소수성 산화환원 반응 매개체이다. - 제67항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 오스뮴, 루테늄, 철, 니켈, 로듐, 레늄 또는 코발트와 1,10-페난트롤린 (phen), 2,2'-바이피리딘 (bpy) 또는 2,2',2"-테르피리딘 (terpy), 메틸렌 그린, 메틸렌 블루, 폴리(메틸렌 그린), 폴리(메틸렌 블루), 루미놀, 니트로-플루오레논 유도체, 아진, 오스뮴 페난트롤린디온, 카테콜-펜던트 테르피리딘, 톨루엔 블루, 크레실 블루, 나일 블루, 뉴트랄 레드, 페나진 유도체, 티오닌, 아주레 A, 아주레 B, 톨루이딘 블루 O, 아세토페논, 메탈로프탈로시아닌, 나일 블루 A, 개질된 전이 금속 리간드, 1,10-페난트롤린-5,6-디온, 1,10-페난트롤린-5,6-디올, [Re(phen-디온)(CO)3Cl], [Re(phen-디온)3](PF6)2, 폴리(메탈로프탈로시아닌), 폴리(티오닌), 퀴논, 디이민, 디아미노벤젠, 디아미노피리딘, 페노티아진, 페녹사진, 톨루이딘 블루, 브릴리언트 크레실 블루, 3,4-디히드록시벤즈알데히드, 폴리(아크릴산), 폴리(아주레 I), 폴리(나일 블루 A), 폴리아닐린, 폴리피리딘, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리(티에노[3,4-b]티오펜), 폴리(3-헥실티오펜), 폴리(3,4-에틸렌디옥시피롤), 폴리(이소티아나프텐), 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜), 폴리(디플루오로아세틸렌), 폴리(4-디시아노메틸렌- 4H-시클로펜타[2,1-b;3,4-b']디티오펜), 폴리(3-(4-플루오로페닐)티오펜), 폴리(뉴트랄 레드) 또는 이들의 조합의 전이 금속 착체인 개질된 키토산.
- 제67항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(phen)3 +2, Fe(phen)3 +2, Os(phen)3 +2, Co(phen)3 +2, Cr(phen)3 +2, Ru(bpy)3 +2, Os(bpy)3 +2, Fe(bpy)3 +2, Co(bpy)3 +2, Cr(bpy)3 +2, Os(terpy)3 +2, Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합인 개질된 키토산.
- 제67항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Co(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Cr(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2, Fe(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)- 2,2'-바이피리딘)+2, Os(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2 또는 이들의 조합인 개질된 키토산.
- 제67항에 있어서, 소수성 산화환원 반응 매개체가 Ru(bpy)2(4-메틸-4'-(6-헥실)-2,2'-바이피리딘)+2인 개질된 키토산.
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