KR20080081978A - 폐렴구균의 캡슐 다당류 생산의 조절 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스테렙토코쿠스 뉴모니아와 같은 폐렴구균의 캡슐 단백질 생산을 조절하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 동물에서의 폐렴구군 감염을 경감시키는 방법 및 동물에서의 폐렴구균 감염을 조절할 수 있는 2개의 약제를 확인하는 방법에 관한 것이다 도 1aⅰ-1aⅵ 및 1bⅰ-1bⅵ를 포함하는 도 1은 팽화 반응을 사용하여 평가할 때 주변 산소 및 이산화 탄소 농도의 콜로니의 형태 및 캡슐 크기에 대한 영향을 나타내고 있다.

Description

폐렴구균의 캡슐 다당류 생산의 조절 방법{MODULATING PRODUCTION OF PNEUMOCOCCAL CAPSULAR POLYSACCHARIDE}
본 연구는 미국 정부의 기금(미국 공공 건강 서비스 보조금 번호 AI38436 및 AI44231)에 의해 일부 지원되며, 따라서 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 보유한다.
본 발명은 연쇄상구균 생물체로부터 유래한 캡슐 다당류 물질의 생산 및 상기 물질을 사용하는 백신의 생산에 광범위하게 관련되어 있다.
때때로 폐렴구균(pneumococcus)이라 칭하는 폐렴 연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)은 일반적으로 인간 비인강(nasopharynx)의 점막 표면을 콜로니화하는 편리공생(commensal) 생물체이다. 숙주의 인자(factor)가 생물체의 하기도(lower respiratory tract) 접근을 허용하는 경우, 왕성한 염증 반응이 뒤이어 일어나고, 이로써 폐포 공간이 삼출물(exudate)를 채울 때 밀집한 경화(consolidation)를 야기시킨다. 이러한 상태를 통상 폐렴이라 칭한다(1995년에 발행된 Tuomanen 등의 문헌을 참조하라). 폐렴구균 감염의 가장 심각한 징후(manifestation)는 패혈증(sepsis), 수막염(meningitis), 또는 패혈증과 수막염 모두에 의하여 악화될 수 있는 균혈증(bacteremia)이다. 성인의 균혈증은 일반적으로 폐렴의 합병증이다(1997년 발행된 Raz 등의 문헌을 참조하라).
혈류[즉, 옵소닌 식세포 현상(opsonophagocytosis)]로부터 유래한 생물체의 클리어런스(clearance)의 주요 메카니즘에 견딜 수 있는 폐렴구균의 능력은 다당류 캡슐인 생물체의 주요 병독성(virulence) 인자의 발현을 필요로 한다(1931년 발행된 Avery 등의 문헌 및 1990년에 발행된 Watson 등의 문헌을 참조하라). 폐렴구균은 90개 이상의 구조적으로 독특한 캡슐 다당류(CPS)를 합성할 수 있다.
폐렴구균 CPS는 항식세포 특성을 나타내고, 운반(즉, 감염되었지만 반드시 증상이 나타나는 것은 아닌 개별 생물체로부터 또 하나의 생물체로의 생물체의 전파)에 있어서 중요한 단계인 숙주 세포에의 부착을 억제하며, 나중에 질병의 발병 양상을 나타낸다(1998년 발행된 Ring 등의 문헌을 참조하라). 다른 캡슐화된 종[예컨대, 헤모필루스 인플루엔자, 네이세리아 메닝기티디스(수막염균), 스트렙토코쿠스 파이오게네스(화농성 연쇄상구균) 및 스트렙토코쿠스 아갈락티아]에서의 유사한 발견은 숙주 세포와의 부착성 상호작용 및 체액성 면역에 대한 저항성을 모두 허용하는데 얼마나 많은 양의 CPS가 일시적으로 변화되어야하는지에 대한 평가를 가능하게 하였다(1996년에 발행된 Hammerschmidt 등의 문헌, 1998년에 발행된 Levin 등의 문헌, 1996년에 발행된 Schrager 등의 문헌, 1995년 발행된 Sellin 등의 문헌, 및 1991년에 발행된 St. Geme III 등의 문헌을 참조하라).
심지어 단일 균주 범위 내에서도 폐렴 연쇄상구균에 의해 발현되는 CPS의 양은 변화한다. CPS 발현을 조절하는 조절 메카니즘은 아직 잘 이해되지 못하였다. 대부분의 폐렴구균 분리물(isolate)은 콜로니의 불투명도(opacity)에 의하여 구별될 수 있는 2 이상의 형태 간의 표현형 변이를 겪는다(1998년에 발행된 Weiser의 문헌, 및 1994년에 발행된 Weiser 등의 문헌을 참조하라). 불투명한(O) 콜로니 형태는 합성 CPS의 양에 있어서 동일한 균주의 투명한(T) 변이체와 상이하며, O형 콜로니는 일반적으로 대량의 CPS를 생성한다(1998년에 발행된 Kim 등의 문헌을 참조하라).
폐렴구균 변이체에 의하여 생성되는 CPS의 양에 있어서의 비교적 작은 차이는 병독성에 주요한 영향을 미칠 수 있다(1950년에 발행된 MacLeod 등의 문헌을 참조하라). T형의 콜로니에 비하여 O형의 콜로니에 의하여 1.2배 내지 5.6배 많은 양으로 CPS가 생산되는 것는 면역 혈청을 사용하는 옵소닌 식세포 현상에 대한 폐렴구균 세포의 증가된 저항성과 상관관계가 있다(1999년에 발행된 Kim 등의 문헌을 참조하라). 뮤린의 전신성 감염 모델에 있어서, 몇몇 폐렴구균 균주의 O 변이체만이 패혈증을 야기시켰다(1998년에 발행된 Kim 등의 문헌을 참조하라). 이와는 대조적으로, T형은 다른 세포 표면 다당류인, 테이코산(teichoic acid)을 더 많은 양으로 발현시킨다. 폐렴구균 세포벽의 테이코산은 CPS에 공유 결합되고, 비정상적인 숙주양 성분인 포스포릴콜린을 함유한다. 이 다당류는 혈소판 활성 인자에 대한 수용체를 통하여 상피 세포에의 폐렴구균 세포의 부착에 기여한다(1995년에 발행된 Cundell 등의 문헌, 1995년에 발행된 Cundell 등의 문헌, 및 1998년에 발행된 Kim 등의 문헌을 참조하라). 또한, T형은 부착 및 콜로니화를 촉진하기 위하여 작용하는 CbpA를 비롯한 세포 표면 콜린 결합 단백질의 변경된 분포를 나타낸다(1997년에 발행된 Rosenow 등의 문헌을 참조하라). 유아 랫트(rat) 모델에 있어서의 운반 과정 중, O 표현형보다는 오히려 T 표현형을 나타내는 폐렴구균 변이체를 선별한다(1994년에 발행된 Weiser 등의 문헌을 참조하라). 이들 관찰은 폐렴구균이 보다 많은 부착 및 운반을 나타내는 하나의 형태(즉, T형)와 침입성 감염에서 생존하는데 더 적합한 비부착 형태(즉, O형) 사이에서 변화한다는 것을 시사한다.
폐렴구균에 의하여 발현되는 CPS의 동정은 연쇄상구균 변이체를 구별하는데 사용되는 혈청형 분류식(serotyping) 진단 방법의 기초를 형성한다. 상이한 변이체는 상이한 생리적 특성(예컨대, 항균제에 대한 감수성 또는 폐렴의 개시 또는 진행 특징적인 속도)을 나타낼 수 있기 때문에, 폐렴구균 변이체를 구별할 수 있는 능력은 의료상의 이점이 있다. 더욱이, 폐렴구균 변이체를 인식하고 공격할 수 있는 인간(또는 기타의 척추동물) 면역 체계의 능력은 각각의 변이체의 CPS를 특이적으로 인식할 수 있는 능력에 의존하기 때문에, 폐렴구균 변이체에 특이적인 CPS를 수득할 수 있는 능력은 폐렴구균 감염과 연관된 질환을 경감시키기 위한 치료·예방 방법 및 조성물의 개발에 상당히 영향을 미친다. 예를 들어, 공지의 폐렴구균 백신은 다수의 폐렴구균 변이체로부터 수득된 CPS를 포함한다.
폐렴구균 감염과 연관된 질환에 유용한 진단, 예후(prognostic), 치료 및 예방 조성물 및 방법에 대한 상당한 필요성이 남아있다. 다수의 상기 조성물 및 방법은 분리된 폐렴구균 CPS에 대한 개발을 위해 이용하거나 의존하는 것들을 포함한다. 폐렴구균으로부터 CPS를 분리하는 공지의 방법은 일반적으로 낮은 수율(收率)의 특성을 나타낸다.
본 발명은 증식 배지 내에 폐렴구균을 유지시킴으로써, 폐렴구균으로부터 유래한 캡슐 다당류를 생산하는 방법의 개량에 관한 것이다. 제1 실시 양태에 있어서, 상기 개량 방법은 증식 배지와 접촉하고 있는 서브 대기(sub-atmospheric) 농도(예컨대, 약 16% 이하 또는 약 0.1% 이하의 산소 농도)의 산소를 함유하는 가스를 유지하는 단계를 포함한다. 폐렴구균은 스트렙토코쿠스 속(genus)의 생물체[예컨대, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 종(species)(예: 스트렙토코쿠스 뉴모니아 변이체 6A, 6B, 18C 및 9V 중 하나)의 생물체]일 수 있다. 제2 실시 양태에 있어서, 상기 개량 방법은 증식 배지와 접촉하고 있는 초대기(super-atmospheric) 농도(예컨대, 약 3% 또는 10% 이상)의 이산화탄소를 함유하는 가스를 유지하는 단계를 포함한다. 제3 실시 양태에 있어서, 상기 개량 방법은 증식 배지와 접촉하고 있는 가스 중의 이산화탄소 농도를 초대기 농도로 그리고 산소 농도를 서브 대기 농도로 유지하는 단계를 포함한다. 제4 실시 양태에 있어서, 상기 개량 방법은 5%의 이산화탄소를 포함하는 가스와 같은 온도에서 평형을 이루는 동일한 증식 배지 내의 이산화탄소의 농도와 적어도 동일한 레벨에서 증식 배지의 이산화탄소 농도를 유지시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 동물에 있어서의 폐렴구균 감염을 경감시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 산소의 초대기 농도(예컨대, 25%, 50% 또는 100%)를 갖는 가스와 접촉한 채로 동물(예컨대, 적어도 동물의 폐)을 유지시키는 단계를 포함한다. 이 방법으로 경감될 수 있는 감염의 예로는 폐렴, 균혈증, 패혈증 및 수막염을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 폐렴구균에 감염될 위험이 있는 동물에게 투여하기 위한 면역원성 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 정상적인 공기와 같은 온도에서 평형을 이루는 증식 배지보다 산소 함량이 낮은 증식 배지 내에 폐렴구균 세포를 유지시키는 단계와, 상기 세포로부터 유래한 세포에 의하여 생산된 캡슐 다당류를 분리시키는 단계를 포함한다. 분리된 다당류는 면역원성 제제를 구성한다.
또한, 본 발명은 폐렴구균 다당류를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 정상 공기와 같은 온도에서 평형을 이루는 동일한 증식 배지보다 산소 함량이 낮은 증식 배지(예컨대, 산소가 실질적으로 부족한 배지) 내에 폐렴구균 세포를 유지시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 배지는 정상적인 공기와 같은 온도에서 평형을 이루는 동일한 배지보다 이산화탄소 함량이 높은 배지(예컨대, 이산화탄소로 포화된 배지, 또는 탄산염 또는 중탄산염을 포함하는 배지)이다.
본 발명은 시험 대상 화합물이 동물 내의 폐렴구균 감염을 경감시키는데 유 용한지 여부를 평가하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 시험 대상 화합물의 존재 하에서 유지된 폐렴구균 세포 내의 CpsD의 인산화 정도와, (b) 시험 대상 화합물의 부재 하에서 유지된 동일한 종류의 세포 내의 CpsD의 인산화 정도를 비교하는 단계를 포함한다. 시험 대상 화합물의 존재 하에서 유지된 폐렴구균 세포 내의 CpsD의 인산화 정도가 시험 대상 화합물의 부재 하에서 유지된 동일한 종류의 세포 내의 CpsD의 인산화 정도보다 낮은 경우, 시험 화합물은 상기 감염을 경감시키는데 유용하다. 예를 들어, CpsD 내에 존재하는 인산화된 티로신 잔기의 수를 평가함으로써, 또는 1개 이상의 인산화된 티로신 잔기를 보유하는 CpsD의 분획물을 평가함으로써, CpsD의 인산화 정도를 평가할 수 있다.
본 발명은 폐렴구균 변이체로부터 수득될 수 있는 CPS의 수율을 향상시키는 방법을 포함하며, 폐렴구균의 감염과 연관된 진단, 예후, 치료 및 예방 조성물 및 방법의 생산 및 사용을 향상시킨다.
본 발명은 폐렴구균에 의하여 생산된 캡슐 다당류(CPS)가 유지되는 배지의 산소 및 이산화탄소 함량을 조절함으로써, 상기 캡슐 다당류의 양을 조절할 수 있다는 발명자의 발견에 관한 것이다. 또한, 본 발명자는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 있어서의 CPS 생산은 CpsD 단백질의 존재 및 이 단백질의 번역후 변형에 의하여 조절된다는 것을 발견하였다. 이들 발견에 기초하여, 본 발명은 폐렴구균에 의한 CPS 생산을 조절하는 방법(예컨대, 항폐렴구균 백신 및 기타 면역원성 제제의 생산에 사용하기 위한), 폐렴구균 감염을 경감시키는 방법, 및 폐렴구균 감염을 경감시키는데 유용한 제제를 동정하는 방법을 포함한다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어 각각은 이 섹션에서 그것과 연관된 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 물품을 "단수(單數)"로 표기하더라도, 이는 문법적 의미인 1을 의미하는 것이 아니라, 1 또는 1 초과의 수(즉, 1 이상의 수)를 의미한다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"정상(normal)" 공기는 습도에 관계없이(즉, 건조물을 기준으로) 선택된 위치에서 대략 대기의 평균 함량을 보유하는 가스를 의미한다. 대기의 평균 함량은 약 78%의 N2, 약 21%의 O2, 1%의 Ar, 각각 0.04% 미만인 CO2, H2, He, Ne, Kr 및 Xe이다.
본 발명에 대한 상술
폐렴구균에 의한 캡슐 다당류(CPS)의 생산은 세포 주위에 존재하는 산소 및 이산화탄소의 존재 및 농도에 의하여 영향을 받는다는 것이 발견되었다. 특히, CPS의 생산은 주위의 산소 함량이 감소함에 따라 증가하고, 또한, CPS의 생산은 주위의 이산화탄소 함량이 증가함에 따라 증가한다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 배양물을 사용하여 이러한 관찰을 하였지만, 이는 폐렴구균 속[예컨대, 다른 스트렙토코쿠스 종(예: 스트렙토코쿠스 아갈락티아)] 및 기타 캡슐화된 생물체[예컨대, 스타 필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클레브실라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia) 및 아시네토박터 존소니(Acinetobacter johnsonii)]와 유사한 캡슐 및 캡슐 유전자 특성을 나타내는 생물체, 및 상기 생물체 중 하나 이상에 대한 표현형 유사성, 유전자형 유사성, 또는 표현형 및 유전자형 양자의 유사성을 나타내는 생물체에도 적용될 수 있다. 상기 생물체가 스트렙토코쿠스 뉴모니아인 경우, 상기 생물체는 그 CPS의 동일성에 의하여 특징지워지는 변이체(예컨대, 변이체 6A, 6B, 18C 및 9V 중 하나)를 비롯한 임의의 공지되었거나 향후 발견될 변이체일 수 있다.
이러한 관찰은 폐렴구균을 배양하는 임의의 공지 방법 또는 향후 개발될 임의의 방법과 병용함으로써, 상기 방법에 의하여 배양된 폐렴구균에 의한 CPS의 생산을 증가(필요한 경우, 감소)시킬 수 있다. 본 발명은 공지의 방법에 따라 폐렴구균을 배양함으로써 수득되는 CPS의 수율을 증가시키는 방법을 포함한다. 개량된 방법은 폐렴구균의 배양 과정 중에 배지 내에서 통상 발생하는 산소 함량에 비하여 상대적으로, 배지 내에서 또는 배지 상에서 폐렴구균이 유지되는 배지의 산소 함량을 감소시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 여과된(또는 멸균된) 정상 공기와 접촉하여 배지가 유지되는 액체 배지 내에서 또는 젤라틴 또는 반고체 배지 상에서 폐렴구균을 배양하는 것이 일반적이다.
배지가 접촉하고 있는 가스의 산소 함량(건조물을 기준으로)을 감소시킴으로써, 폐렴구균에 의한 CPS의 생산을 증가시킬 수 있다. 산소 함량이 감소되는 정도는 중요하지 않지만, 일반적으로 말해서 산소 함량이 감소될수록 CPS의 수율은 증가하게 된다. 가스의 산소 함량은 바람직하게는 <16%이거나, 또는 가스가 실질적으 로 혐기성인 지점(예컨대, <0.1% O2인 지점)까지 감소된다. 가스의 산소 함량을 감소시키는 방법은 중요하지 않다. 정상 공기의 산소 함량 미만으로 가스의 산소 함량을 감소시키는 편리한 방법은 소정의 산소 함량을 갖는 가스로 배양 용기를 플러싱(flushing)하는(적어도 처음에 플러싱하지만, 대안으로 간헐적으로, 정기적으로 또는 연속적으로 플러싱 함) 단계를 포함한다. 예를 들어, 약 71%의 N2, 19%의 O2 및 10%의 CO2를 포함하는 가스 혼합물 또는 95%의 Ar 및 5%의 CO2를 포함하는 혼합물로 배양 용기를 플러싱할 수 있다.
배지 내에서 또는 배지 상에서 폐렴구균이 유지되는 배지가 접촉하고 있는 가스의 이산화탄소 함량을 증가시킴으로써, 폐렴구균에 의한 CPS의 생산도 역시 증가시킬 수 있다. 가스의 이산화탄소 함량이 증가되는 정도는 중요하지 않지만, 일반적으로 말해서 이산화탄소 함량이 증가할수록 CPS의 수율은 증가하게 된다. 가스의 이산화탄소함량은 약 5% 이상 또는 약 10% 이상인 것이 바람직하지만, 배양 배지가 이산화탄소로 포화될 정도로 높을 수 있다. 전술한 바와 같이, 폐렴구균이 배양되는 배양 용기를 소정의 이산화탄소 함량을 갖는 가스로 플러싱함으로써, 원하는 이산화탄소 함량을 달성할 수 있다. 대안으로, 배지 내에 탄산염 또는 중탄산염을 혼입하거나 배지에 상기 염을 첨가함으로써, 배지에 이산화탄소를 제공할 수 있다.
본 발명은 폐렴구균이 유지되는 배지의 이산화탄소 함량을 증가시키는 것, 상기 배지와 접촉하는 가스의 이산화탄소 함량을 증가시키는 것, 상기 배지의 산소 함량을 감소시키는 것, 상기 배지와 접촉하는 가스의 산소 함량을 감소시키는 것, 또는 이들의 혼용에 의하여, CPS 생산을 증가시키는 방법을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 배지(또는 배지와 접촉하고 있는 가스)의 O2/CO2 함량을 조절하여 하나의 제1 기(期, phase) 기간 중의 폐렴구균 세포의 수율을 최대화할 수 있고, 이어서 상기 O2/CO2 함량을 재조절하여 제2 기(期, phase) 기간 중의 CPS의 생산을 최대화할 수 있다.
배지와 접촉하고 있는 가스의 산소 함량을 감소시키면, 용해 가스와 비용해 가스의 평형으로 인하여 배지 상 또는 내에 폐렴구균이 유지되는 배지의 산소 함량이 감소된다. 가스의 이산화탄소 함량을 변화시키면 위와 유사한 효과가 있다. 배지에 용해된 가스와 비용해 가스용해가 얼마나 신속하게 평형을 이루는가는 당업계에 공지된 다수의 인자(예컨대, 배지-가스 계면의 표면적, 배지의 점도 및 배지의 교반 정도를 포함함)에 달려있다.
배지와 임의의 가스 상(相)의 계면(만약 계면이 있다고 하더라도)이 최소화되는 배지(예컨대, 액체 배지) 내에 폐렴구균을 유지시킬 수 있다. 상기 배양 시스템에 있어서, 가스 상의 함량을 변경시키면, 가스 상으로부터 유래한 가스의 액체로의 확산이 제한되기 때문에, 액체 배지의 가스 함량에 상대적으로 적은 영향을 미칠 수 있다. 상기 시스템에 있어서, 액체 배지의 가스 함량은 배지를 제조하기 위해 사용되는 방법에 의하여 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 액체 배지를 제조하고, 고압멸균기(고압멸균기의 열은 액체로부터 유래한 실질적으로 모든 산소를 구동시킴) 내에서 멸균시키고, 무산소 대기 내에서[예컨대, 무산소 가스의 정상류(steady stream)가 통과하는 폐쇄 용기 내에서] 고압멸균 배지를 냉각시킴으로써, 실질적으로 혐기성인 액체 배지를 제조할 수 있다. 적당한 무산소 가스의 예로는 순수 아르곤, 5-10%의 CO2와 혼합된 아르곤, 순수 질소, 또는 N2, Ar 및 CO2의 몇몇 배합물을 들 수 있다. 매우 높은 정도의 혐기도를 필요로 하는 경우([O2]<<0.1%), 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 냉각될 때 배지 위를 통과하는 무산소 가스를 가열된 구리 호일 또는 메쉬(mesh)에 관통시키거나 또는 그 위로 통과시킬 수 있다. 물론, 상기 방법과 유사한 방법을 사용하여, 소정의 가스 함량을 갖는 고체, 젤라틴 및 반고체 배지를 제조할 수 있다.
또한, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 또는 산소 및 이산화탄소 함량이 조절되는 배지를 접종하는데 사용되는 접종물로서의 적당한 폐렴구균 변이체 및 형태를 선택함으로써, CPS 생산을 향상시킬 수 있다. 폐렴구균의 상이한 변이체는 구조적으로 상이한 별개의 CPS를 생성시킬 수 있다. 본 명세서에 기재되어 있는 방법은 임의의 폐렴구균 변이체를 사용하여 CPS 생산을 향상시키는데 사용할 수 있다. 더욱이, 다수의 폐렴구균은 2 이상의 표현형 형태를 나타낸다고 이해된다. 상기 형태로는 불투명(O)형 및 투명(T)형을 들 수 있는데, 상기 불투명형은 일반적으로 보다 많은 양의 CPS를 생성시키는 특징을 나타낸다. 따라서, 보다 많은 양의 CPS 생산의 특징을 나타내는 폐렴구균의 변이체의 일 형태를 접종물로서 선택함으로써 CPS 생산을 향상시킬 수도 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 1 이상의 방법을 사용하여 생산된 CPS는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 폐렴구균 백신 및 기타 면역원성 제제를 제조하는데 (단독으로 또는 기타 폐렴구균 CPS 종과 함께) 사용할 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 폐렴구균 세포로부터 CPS를 분리하는 단계, 잔존하는 폐렴구균 세포를 임의로 사멸시키는 단계, 및 약학적 허용 담체(및 임의의 면역학적 아쥬반트(adjuvant))와 CPS를 배합하는 단계를 포함한다. 폐렴구균에 의한 감염에 대한 동물의 면역 반응을 향상시킬 목적으로 동물에게 상기 제제를 투여할 수 있다.
폐렴구균 CPS가 폐렴구균이 동물(예컨대, 인간)에 있어서의 면역 방어를 회피할 수 있도록 한다고 여겨지기 때문에, CPS 생산을 억제하는 방법은 동물에 있어서 폐렴구균 감염을 경감시키는데 사용될 수 있다. 상기 방법으로 경감될 수 있는 폐렴구균 감염(및 상기 폐렴구균 감염으로 인해 발생하는 합병증)으로는 폐렴(특히, 폐렴구균성 폐렴), 균혈증, 패혈증, 수막염 박테리아성 심내막염, 스트렙토코쿠스 삼출물성 인두염, 봉와직염(cellulitis) 및 내장 농양(visceral abscesses) 등을 들 수 있다.
주위의 산소 함량을 증가시키면, 폐렴구균 CPS 생산이 감소됨으로써, 면역 체계에 대한 폐렴구균의 감수성이 증가된다는 것을 발견하였다. 마찬가지로, 주위의 이산화탄소 함량을 감소시키면, 폐렴구균 CPS 생산이 감소된다는 것을 발견하였다.
폐렴구균에 감염된 동물을 초대기 농도의 산소를 갖는 가스와 접촉하도록 유지시킴으로써, 폐렴구균 감염 및 이의 부작용 및 합병증을 경감시킬 수 있다. 대안 으로, 감염 부위에서의 산소압(oxygen tension)은 (예컨대, 동물 체내에 위치한 감염 부위{예컨대, 폐렴구균을 포함하는 내장 농양 부위}에 직접 순수 산소 또는 멸균 공기를 제공함으로써) 그 부위에서의 정상 산소압에 비하여 상대적으로 증가될 수 있다. 예를 들어, 신체 부위가 폐인 경우(예컨대, 폐렴구균성 폐렴이 있는 경우), 정상 산소압은 정상 공기압이다. 예컨대, 호흡장치 또는 표준 산소 마스크를 사용하여 피험체의 폐에 초대기 농도의 산소를 제공함으로써, 폐렴구균성 폐렴을 경감시킬 수 있다.
또한, 동물 내의 폐렴구균 감염 부위에서 통상적으로 발생하는 이산화탄소압 미만으로, 바람직하게는 심지어 폐렴구균 감염의 부재 하에서도 신체 부위에서 통상적으로 발생하는 이산화탄소압 미만으로, 동물 내의 폐렴구균 감염 부위에서의 이산화탄소압을 감소시킴으로써, 폐렴구균 감염, 이의 부작용 및 합병증을 경감시킬 수 있다. 폐 이외의 신체 다른 부위에서의 이산화탄소압을 감소시키는 단계는 상기 체내 부위를 관통하거나 또는 상기 체내 부위 위를 통과하는 무균 가스 흐름을 제공하는 단계를 포함한다. 감염 부위가 폐인 경우, 환자의 자발적인 행동에 의하거나 또는 인위적으로[예컨대, 환기 장치 또는 호흡 가속 약물(respiration quickening drugs)을 사용하여] 호흡 속도를 증가시킴으로써, 이산화탄소압을 감소시킬 수 있다.
하기 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있는 바와 같이, 폐렴구균에 있어서의 증가된 CPS 생산은 cpsD 유전자의 낮은 발현 및 CpsD 단백질의 낮은 인산화 정도와 상관관계가 있다. 따라서, cpsD의 발현을 증가시키거나, CpsD의 인산화 정도 를 증가시키거나, 또는 양자를 모두 증가시키는 제제에 의하여, CPS의 생산을 향상시킬 수 있다. 반대로, cpsD의 발현을 억제 또는 감소시키는 것, CpsD의 인산화를 억제하는 것, 인산화된 CpsD의 탈인산화를 증강시키는 것, 또는 이들의 일부 혼용에 의하여, CPS의 생산을 억제할 수 있다. 전술한 바와 같이, 동물 내의 감염과 관련된 폐렴구균에 있어서의 CPS의 생산 감소는 상기 폐렴구균이 동물의 면역 체계에 의한 공격에 대해 더 감수성이 있도록 할 수 있다.
본 발명은 시험 대상 화합물이 폐렴구균 CPS 생산 억제제인지 여부를 평가하는 방법, 및 시험 대상 화합물이 폐렴구균 CPS 생산 증강제인지 여부를 평가하는 방법을 포함한다. 상기 각각의 방법에 있어서, 폐렴구균 세포는 시험 대상 화합물의 존재하에 유지되지만, 이와는 별개로 시험 대상 화합물의 부재 하에서도 동일하게 유지되는 것이 바람직하다. 시험 대상 화합물의 존부 하에 세포에 의하여 생산된 CPS의 양을 평가함으로써, CPS 생산에 대한 시험 대상 화합물의 직접적인 영향을 평가할 수 있다. 대안으로, cpsD의 발현 수준(상응하는 RNA 또는 상응하는 단백질의 생산을 측정함으로써 평가됨) 또는 CpsD의 인산화 정도(1 이상의 인산화된 티로신 잔기를 갖는 CpsD 또는 CpsD 분획물에 존재하는 인산화된 티로신 잔기의 수를 측정함으로써 평가됨)를 평가하는데, cpsD의 발현 수준 및 CpsD의 인산화 정도는 전술한 바와 같이 CPS 생산의 억제 또는 증강과 상관관계가 있다.
참고 문헌
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실시예
본 발명은 하기의 실시예를 참고하여 기술될 것이다. 이러한 실시예는 본 발 명을 예시하고자 제시되는 것이지, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않으며, 본 명세서에서 제공된 교시의 결과로 자명한 모든 변형예를 본 발명에 포함한다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아 에 의한 캡슐 다당류 발현의 산소 의존성은 CpsD 의 번역후 변형과 관련되어 있다
본 실시예에서 제시된 실험은 폐렴구균 중에서도 불투명 표현형의 차이(즉, O형 vs T형)가 주위의 산소 농도에 의하여 영향을 받으며, 폐렴에서 발생할 수 있는 혐기성 증식 조건이 CPS의 발현을 증가시키는 O형 폐렴구균의 능력에 영향을 주며 면역 클리어런스를 회피한다는 것을 입증한다.
본 실시예에 기재된 실험에 사용된 물질 및 방법에 관하여 기술하고자 한다.
박테리아 균주 및 증식 조건
본 실험에 사용된 S. 뉴모니아의 균주는 하기 표 1에 기재되어 있으며, 문헌 [Kim 등 1998, Weiser 등 1994]에 기재된 바와 같이 임상적 분리물 P303 (타입 6A), P324 (타입 6B), P68 (타입 18C) 및 P10 (타입 9V)의 전술한 O 및 T 변이체를 포함한다. 박테리아를 문헌 [Tomasz, 1964]에 기재된 바와 같이 반합성 배지(C+Y 배지, pH 8.0) 또는 트립신 콩 배지(tryptic soy medium) 중에서 밀폐되지 않은 용기 내에서, 37℃에서 교반하지 않고 증식시켰다. 1% (w/v) 한천을 함유하는 표준 트립신 콩 한천 (TSA) 평판에 배양액에 배양물을 플래이팅하고(plating), 여기에 카탈라제 5,000 단위(미국 뉴저지주 프리홀드에 소재하는 워팅톤 바이오케미칼에서 입수)를 뿌렸다. 특별한 언급이 없는 한, 촛불 소멸병(candle extinction jar)에서 37℃에서 접종된 배지를 배양하였다. 문헌 [Weiser 등 1994]에 기재된 바와 같이, 이러한 TSA 배지상에서 확대 및 경사 투과된 조사(照射)로 콜로니 형태를 측정하였다.
포스포티로신에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체와, 폐렴구균 균주 및 돌연변이체의 반응성
균주 캡슐화 점액상 특성/유전자형 표현형7 Mab 4G10(+/-) 참고 문헌
+/- 타입 호기성 혐기성
P303 + 6A 없음 있음 임상적 분리물 + Kim 등 1998
P324 + 6B 없음 있음 임상적 분리물 + Kim 등 1998
P68 + 18C 없음 있음 임상적 분리물 + Kim 등 1998
P10 + 9V 없음 있음 임상적 분리물 + Weiser 등 1994
D39 + 22 없음 있음 임상적 분리물 + Avery 등 1944
R6x - 없음 없음 D39 (Δ cps2A - cps2H) - Iannelli 등 1999
SIII + 3 있음 있음 임상적 분리물 - Avery 등 1944
P138 + 3 있음 있음 R6x xSIII DNA - Saluja 등 1995
P728 + 2 없음 있음 R6x xD39 DNA + 본 실시예
7 각각의 균주/변이체의 경우, 산소의 존재하에서 증식된 O 표현형을 테스트하였으며, '+'는 25∼27 kD의 단일 밴드를 갖는 반응성을 나타냄
주위 이산화탄소 농도는 CO2 배양기를 사용하여 호기성 조건하에서 조절하였다. 혐기성 증식 조건은 제조업자(미국 메릴랜드 칵키즈빌에 소재하는 벡톤 디킨슨)의 지침에 따른 BBL GasPakTM 시스템을 사용하여 얻었다. 몇몇의 실험에서, 시스템의 중탄산나트륨 성분을 사용하여 10%의 이산화탄소 대기를 생성하고, 기타의 실험에서는 그러하지 않았다. 박테리아를 수거한 후, 증식 배지의 pH를 측정하여 이것이 이러한 상이한 배양 조건에 의하여 영향을 받지 않음을 확인하였다.
임상적 견본의 분석은 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 수막염을 앓고 있는 총 502명의 환자를 조사하였으며, 이 중 약 20% 정도가 박테리아성으로 밝혀진 폐렴구균 수막염이었다. 비인두(nasopharyngeal) 면봉 샘플을 폐렴구균성 수막염의 임상적 진단이 추정되는 환자로부터 수집하였다. 이 샘플을 5000 단위의 카탈라제를 함유하는 트립신 콩 한천 및 5%의 양의 혈액 한천 모두에서 즉시 플래이팅하고(plating), 이 평판을 37℃에서 5% CO2를 함유하는 공기 대기 중에서 항온배양하였다. 뇌척수액(CSF) 샘플을 혈액 한천 및 투명 평판 모두에서 플래이팅하고, 마찬가지로 48 시간 이하 동안 표준 호기성 항온배양 후 폐렴구균이 관찰된 환자의 혈액 샘플을 배양하였다. 초기에 혈액 한천상에서 전형적인 형태를 나타낸 분리물은 그램 균주 및 팽화 반응에 의하여 폐렴구균인 것으로 확인되었다. 모든 분리물을 -80℃에서 박테리아 보존기내에서 보관하고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 콜로니 형태를 측정하였다. 비인두 및 침입성 부위 배양액 내의 T 표현형 및 O 표현형의 비율간의 통계적 차이를 Fisher의 Exact 테스트를 사용하여 조사하였다.
유전적 형질전환
캡슐화된 폐렴구균 및 캡슐화되지 않은 폐렴구균은 문헌 [Weiser 등 1999]에 기재된 바와 같이 자연적인 형질전환에 대한 능력을 갖게 되었다. 2 성분 시그날 변환 시스템(TCSTS)에서의 돌연변이는 에리트로마이신(1 ㎍/㎖)을 포함하는 배지로부터 콜로니의 선택에 의하여 균주 P303으로 형질전환되었다. 캡슐화된 형질전환체를 변형된 콜로니 형태에 대하여 선별하고, CPS의 발현을 타입 특이성 항혈청(덴마크 코펜하겐에 소재하는 스타텐스 세럼인스티튜트에서 입수함)을 사용한 팽화 반응에 의하여 확인하였다.
팽화 반응
폐렴구균 캡슐은 각종 조건하에서 반-합성 배지에서의 대수기로 증식된 박테리아에서 가시화되었다. 팽화 반응의 경우, 문헌 [Neufeld, 1902]에 기재된 바와 같이, 스타텐스 세럼인스티튜트(덴마크 코펜하겐 소재)로부터 입수한 1% (w/v) 메틸렌 블루와 타입 6 항혈청을 포함하는 조성물 및 배양액의 동일 부피를 1 분간 유리 슬라이드상에서 혼합하였다.
CPS 의 정량화
O형 및 T형 폐렴구균 변이체를 대수기(A620=0.3)로 반-합성 배지에서 증식시키거나 또는 16 시간[세포가 정상(stationary phase)이 되는 시간] 동안 증식시켰다. 2,000×g에서의 원심분리에 의하여 세포를 수거하고, 이를 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하고, 0℃에서 10 초 간격으로 3회 초음파 처리하고, 이를 -20℃에서 보관하였다. 포착형 ELISA 기법을 사용하여 문헌 [Kim 등 1998]에 기재된 바와 같이 선택된 조건하에서 증식된 변이체에 존재하는 CPS의 양을 측정하였다. 타입 특이성 토끼 항혈청(덴마크 코펜하겐에 소재하는 스타텐스 세럼인스티튜트에서 입수함)을 0.05 몰의 Na2CO3 (pH 9.6) 중의 1:5,000 희석액으로 사용하였으며, 이를 밤새 실온에서 미량역가(microtiter) 평판에서의 웰의 벽면에 고정시켰다. 매 항온배양 단계 사이에서, 평판을 Tris 완충액(10 mM의 Tris, 150 mM의 NaCl, 0.05% BrijTM 35 및 0.02% (w/v) 나트륨 아지드를 포함)으로 5회 세척하였다. BrijTM 35 (폴리옥시에틸렌(23) 라우릴 에테르 C12H25(OCH2CH2)23OH)가 세정제이었다. 타입 6B, 6A, 18C 또는 9V 폐렴구균으로부터 얻은 정제된 CPS를 공지의 농도에서 사용하였으며, 표준물로서 사용하기 위하여 아메리칸 타입 티슈 콜렉션 (미국 메릴랜드주 락빌에 소재)으로부터 구입하였다. 초음파 처리된 세포 샘플 중의 CPS를 HASP 4(타입 6A 및 6B CPS와 특이적으로 결합함), HASP 22 (타입 18C CPS와 특이적으로 결합함) 및 HASP 33(타입 9V CPS와 특이적으로 결합함)으로 표기된 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였으며, 지료 실험(pilot experiment)에서 측정한 농도에서 사용하였다. 모노클로날 항체와 CPS의 결합은 마우스 IgM과 특이적으로 반응하고, 알칼리성 포스파타제와 결합되는 항혈청을 사용하여 검출하였다. 이러한 시약은 문헌[Kim 및 Weiser, 1998]에 기재된 바와 같이 사용하였다. 총 세포성 단백질 측정은 제조업자(미국 일리노이주 락포드에 소재하는 피어스 케미칼 컴파니)의 지침에 따라 마이크로-비신코닌산 키트를 사용하여 초음파 처리된 세포 추출물을 가지고 수행하였다. 상청액 분획물에서의 CPS의 함량은 해당 세포 초음파 처리 분획물에서의 단백질 농도를 기준으로 하였다 (즉, 단위 단백질을 기준으로 한 CPS 함량을 표준화하기 위함).
세포 초음파 처리에서 총 테이코산의 함량을 비교하기 위하여 사용된 포착 ELISA 기법은 문헌 [Kim 등 1998]에 기재되어 있다. 모든 실험은 2중으로 수행하였으며, 3회 이상 반복하였다. 결과는 총 세포성 단백질 농도당 평균값으로 기재하였다.
웨스턴 분석
전술한 바와 같은 카탈라제를 사용하여 보충된 트립신 콩 한천상에서 박테리아를 증식시켰다. 16 시간 동안 37℃에서 선택된 조건하에서 증식시킨 후, 세포를 무균 DacronTM 면봉을 사용하여 표면으로부터 제거하고, 이를 PBS에서 재현탁시키고, 이를 PBS에서 세정하여 A620=0.5가 되도록 세포 밀도를 조절하였다. 이를 원심분리한 후, 펠릿화된 세포를 Laemmli 겔 장입 완충액에 재현탁시키고, 이를 100℃에서 5 분간 가열하였다. 이어서 SDS-PAGE에 의하여 12.5% (w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 샘플을 분리한 후, 문헌[Wani 등 1996]에 기재된 바와 같이 이를 Immobilon-PTM 막에 전달하였다.
4G10 (미국 메릴랜드주 월탐에 소재하는 업스테이트 바이오테크날러지 인코포레이티드)으로 표기된 모노클로날 항체를 TSBP 완충액 [문헌: Wani 등 1996]에서의 1:2000 희석액을 사용하여 면역블로팅을 수행하고, 이 항체로 블로팅된 시료의 반응성을 문헌[Kim 등 1999]에 기재된 바와 같은 알칼리성 포스파타제와 결합된 마우스 IgG 항혈청을 사용하여 검출하였다. 대략 동일한 수의 박테리아의 장입은 전체 폐렴구균 [Wani 등 1996]에 대하여 상승된 전술한 항혈청을 사용하여 이중막의 면역블롯팅을 함으로써 확인되었다.
노던 분석
총 RNA를 대기 및 혐기성 조건하에서 반-합성 배지에서 대수기로 증식된 균주 P303 세포의 O 및 T 변이체로부터 분리하고, 이를 문헌[Weyand 등 2000]에 기재된 바와 같이 정제하였다. 포름아미드 겔상에서 RNA를 분리한 후, 브롬화에티듐 염색된 RNA를 사진 촬영하고, 그 화상을 RNA 크기 마커와의 비교를 위하여 디지털화하였다. 제조업자 (스웨덴 웁살라에 소재하는 파마시아 LKB 바이오테크날러지)의 지침에 따라 VacuGeneTM XL 시스템을 사용하여 RNA를 막에 전달하였다. pH 7.2의 0.5 몰의 NaPO4, 1.5 mM의 EDTA 및 7% (w/v) SDS를 포함하는 용액 중에서 15 분간 65℃에서 막을 예비하이브리드화하였다. 프로브는 cps4D 유전자의 내부 단편로부터 제조하고, 서열 5'-CCGGAATTCGTACAAATATACAGTTGAGCG GAGATAAAC-3' (서열 번호: 1) 및 5'-CGCGGATCCT GTTGCTGTTA CCAAGATGGA CG-3' (서열 번호: 2)을 갖는 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 증폭시키고, 게놈 DNA를 타입 4 균주로부터 얻었다. 균주는 인스티튜트 포 게노믹 리서치(Institute for Genomic Research)에 의하여 서열화된 전체 게놈에 사용된 것과 동일한 균주이다. PCR 산물은 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 EcoRI를 사용하여 분해시킨 후, 이를 폴리링커에 인접하는 전사 종결자를 갖는 벡터로 클로닝하여 연쇄상구균 서열을 클로닝하도록 하였다. 이 벡터는 블런트 종결된 ClaI 부위에 pUK4K (스웨덴 웁살라에 소재하는 파마시아)의 블런트 종결된 카나마이신 저항성 카세트를 삽입하여 pJDC9로부터 작제되여 이. 콜리(E. coli)에서의 이 마커의 선택이 가능토록 하였다. 문헌[Chen 및 Morrison, 1988]. cps4D 단편을 BamHI 및 EcoRI 분해된 벡터에 삽입하고, 이를 이. 콜리 균주 DH5α로 형질전환시켰다. 대기하 그리고 혐기성 조건하에서 트립신 콩 배지내에서 대수기로 증식된 균주 P303의 연쇄상구균 O 및 T 변이체로부터 총 RNA를 추출하였다.
본 실시예에 제시된 실험의 결과를 하기에 기재한다.
사람에서의 표현형 변이체에 대한 선택
사람에서의 균혈증 및 운반에서의 상이한 폐렴구균 표현형에 대하여 선택이 일어날 지의 여부를 테스트하기 위하여, 동일한 혈청형의 분리물쌍을 패혈증의 징후를 나타낸 환자의 혈액 및 비인강으로부터 얻었다. 불투명도와 관련없는 콜로니 형태에서의 균주-대-균주 이질성으로 인하여 분리물쌍을 얻어여만 한다. 일단 항생 치료를 개시하면 균혈증 환자의 비인강으로부터 폐렴구균을 분리할 수 없다. 그러므로, 비인강과 혈액의 배양물을 실질적으로 동시에 얻는다. 이러한 제약점으로 인하여 충분한 수의 분리물쌍을 얻을 수 있도록 하기 위하여 폐렴구균 균혈증의 발병 빈도가 높은 지리적 지역에서 이러한 연구를 수행할 것을 요구되었다.
혈액 및 비인강 분리물을 말라위 블란타이어(Blantyre, Malawi)의 성인 환자 19 명으로부터 얻었으며, 분리물이 그 후에 타입 특이성 항혈청을 사용한 팽화 반응에 의하여 동일한 타입인 것으로 나타나는 경우 분리물쌍으로 간주한다. 대다수의 분리물쌍은 하기 표 2에 기재한 바와 같이 이러한 지역에서의 가장 흔한 타입인 타입 1이다. 또한, 대다수의 환자들은 사람 면역결핍 바이러스에 의한 감염에 대하여 양성 반응으로 나타났는데, 이는 이들 환자 중에서 침입성 폐렴구균 질환의 발병률이 높기 때문인 것으로 여겨졌다. 분리물쌍 19개 중에서 17 개 (89%)가 비인강에서 T 표현형을 가지며, 12개 (63%)는 혈액 중에서 O 표현형을 갖는다. 2 개의 부위로부터 얻은 폐렴구균의 표현형이 일치하지 않는 분리물쌍 10 개 중에서, 모두가 비인강에서의 T-형 표현형이 더 많은 것으로 나타났다 (P<0.001). 이는 일반적으로 자연적인 균혈증 감염에서 비인강의 우세한 T형 개체로부터 유래한 더 많은 O형 표현형의 혈액에서의 존재를 야기하는 표현형 변이체에 대한 선택이 있음을 예시한다.
사람의 운반 및 침입성 감염으로부터 얻은 분리물의 불투명 표현형
콜로니 표현형 환자수 타입(번호) HIV 상태
비인강 혈액/CSF1 + - N/A2
T T 7 1(4),4,18,19 5 1 1
0 0 2 1(2) 1 0 1
0 T 0
T 0 10 1(4),4(2),6,12,15,22 5 1 4
주: 1 4/19 침입성 분리물은 혈액보다는 뇌척수액으로부터 얻음 2 N/A는 이용이 불가한 임상적 상태를 의미함
CPS 의 양에 대한 산소의 효과
감염 중의 O 변이체 및 운반 중의 T 변이체의 선택을 촉진할 수 있는 숙주 및 박테리아 인자를 조사하였다. 경화된 폐에서 생길 수 있는 유형인 더 낮은 산소압이 T 표현형으로부터 O 표현형으로의 전이를 촉진하는 것으로 가정한다. 감소된 산소의 농도에서 타입 6A 임상적 분리물 P303의 증식은 T형으로부터 O형으로의 자발적인 변화율에 아무런 영향을 미치지 않는다. 그러나, 혐기성 조건(상승된 농도의 이산화탄소의 존재)하에서의 증식은 도 1a에 도시되어 있는 바와 같이 O 변이체에 대하여 특별하게 마킹된 더 크고 더 많은 점액상의 콜로니 형태로의 이동과 관련이 있다.
O 표현형을 나타내는 폐렴구균이 T 표현형을 나타내는 것보다 더 많은 양의 CPS를 발현하기 때문에, O형과 관련된 콜로니 크기가 더 크면 이러한 물질의 생산을 증가시키는 결과를 초래할 수도 있다고 생각되었다. 문헌[Kim 등 1998]. 초기의 연구에서는, 박테리아 콜로니를 둘러싸는 CPS의 굴절성 영역이 도 1B에 도시한 바와 같이 팽화 반응 및 타입 6 항혈청을 사용하여 가시화되었다. 이러한 영역은 산소의 존재하에서의 동일한 표현형의 증식 또는, 산소의 부재를 비롯한 임의의 테스트 조건하에서 T 변이체의 증식과 비교하여 10% 이산화탄소의 존재하에서의 혐기성 조건하에서 증식된 O 변이체에 대하여 더 크게 된다. 반대로, 박테리아를 대기 조건하에서 배양하는 경우, 캡슐 물질의 영역은 T형 폐렴구균의 콜로니 주변에서는 검출되지는 않았다. 이러한 결과에 의하여 O형이 증가된 양의 CPS를 합성할 수 있는 능력을 확인하였으며, 감소된 산소압, 더 높은 이산화탄소압 또는 양자 모두는 CPS 생산의 증가를 촉진시키는 것으로 나타난다.
상기 주위의 산소 및 이산화탄소 농도의 효과는 도 2에 도시된 바와 같이 CPS의 양을 측정하기 위하여 개발된 분석을 사용하여 정량적으로 평가되었다. 문헌 [Kim 등 1998]. 본 명세서에 기재된 포착형 ELISA를 사용하여 평가한 바와 같이 총 세포성 단백질 1 ㎎당 CPS의 양은 하기 표 3에 기재한 바와 같이 콜로니 표면적, 팽화 반응을 사용한 영역의 가시화를 기준으로 하여 계산된 캡슐 체적, 그리고 콜로니 표면적과 상관관계가 있다. 대수기 또는 정상기 증식에서의 O형 박테리아는 T형 유기체에 비하여 세포 관련된 CPS의 양이 증가된 것으로 나타났다. 10% CO2의 존재하에서 혐기성 조건하에서 O 타입 6A 변이체의 증식은 대기 조건하에서 배양된 동일한 세포에서의 CPS 생성과 비교하여 생성된 CPS의 양이 7.9 배 증가하였다. 10%의 CO2의 존재하에서 혐기성 조건하에서 증식된 T 변이체와 비교하면, O 변이체는 CPS보다 29 배가 되었다. 2 개의 비연관된 임상적 분리물 (즉, 타입 6B 및 18C를 사용함)로부터 얻은 O 및 T 분리물을 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
각종 조건하에서 증식된 폐렴구균의 특성
콜로니 형태3
O형 T형
O2(%) 21 16 <0.1 21 16 <0.1
CO2(%) <0.1 3 10 <0.1 3 10
평균 콜로니 면적(㎟)4 3.53 7.42 169 1.02 5.15 12.3
캡슐을 포함한 단일 세포 점유 체적 (㎛3)5 3.64 6.85 63.5 UD 4.62 10.6
캡슐 다당류(ng/㎍ 총 단백질)6 126 221 997 35.4 19.4 34.2
3 동일한 타입 6A의 임상적 분리물의 O 및 T 변이체에 대한 것임. 4 이들 값은 16 시간 증식 후에 관찰된 콜로니에 기초한 것임. 값은 3개의 단일 웰의 분리된 콜로니를 사용하여 행해진 측정의 평균을 나타냄. 5 이들 값은 팽화반응 및 구형 타원체 체적에 대한 식인 V=(π/6)LW2을 사용하여 밝혀진 캡슐 물질에 기초한 것임. 값은 3개의 쌍구균 형태를 단일 세포에 상응하도록 2개로 나누어 측정한 평균값임. "UD" 는 캡슐 물질의 영역이 검출되지 않음을 의미함. 6 이들 값은 대수기에서 액체 배지 중의 생물체 증식의 포착형 ELISA 평가에 기초한 것임. 값은 2회의 별도의 측정의 평균이다.
배지 상청액에서의 CPS 생산을 정상(stationary phase)으로의 증식 후에 타입 18C의 폐렴 구균에 대하여 평가하였다. 산소 농도가 감소했을 때와 이산화탄소의 농도가 증가했을 때 더 많은 양의 다당류가 O형 변이체의 배지 상청액 중에서 생산된다는 관찰은 CPS의 생산 증가가 증가된 산소/감소된 이산화탄소 상태에서 세포로부터 CPS 방출이 감소하는 것에 기인하는 것보다는 감소된 산소/증가된 이산화탄소 상태하에서 세포에 의해 CPS 합성이 증가함에 기인한다는 것을 나타낸다. 타입 9V의 분리물은 CPS의 합성 증가가 산소의 감소 또는 이산화탄소의 증가에 의한 것인지를 결정하는 데 사용되었다. 10% 이산화탄소의 존재하에 정상(stationary phase)으로 증식한 타입 9V 박테리아는 10% 이산화탄소의 존재하에 그리고 산소의 존재하에 증식한 동일한 세포보다 산소의 부재하에 12배 더 많은 CPS를 생산하였다. 이것은 이산화탄소압보다는 산소압이 CPS 생산의 정도에 영향을 미치는 우세한 주변 요인이라는 것을 확인하게 하였다.
cpsD / CpsD 의 변화와 관련된 CPS 생산의 변화
본 연구의 다음 단계는 CPS 생산에 대한 산소의 효과가 매개되는 메카니즘이다. 산소 압력/존재의 시그널을 보내고 변환하기 위한 2성분 시그널 변환 시스템의 관여를 시험하였다. 타입 3 분리물의 게놈에서 발견된 전술한 2성분 시그널 변환 시스템의 12 중 11에서의 현저한 돌연변이는 전술한 바와 같이(Throup 등, 2000) 균주 P303으로 형질전환되었다. 10개가 반응 조절자 동족체에서 잠복 돌연변이로 작제되었고, 7개는 히스티딘 키나아제 동족체에서 잠복 돌연변이로 작제되었다. 세포가 혐기성 조건하에서 증식되었던 실험에 있어서, P303에서 시험한 각각의 17개의 동족체 돌연변이에 대하여 팽화 반응을 사용하여 평가했을 때 캡슐 형성 영역 또는 콜로니 크기의 증가에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이 결과는 산소의 효과가 TCSTS를 통하여 매개되는 것같지 않다는 것을 나타내지만, 폐렴구균의 이들 시스템 중 하나는 유전자가 본질적인 것으로 보였기 때문에 시험할 수 없었다.
CPS의 발현에 요구되는 것으로 알려진 유전자좌 내의 유전자는 다음에 시험되었다. CPS의 양에 대한 산소의 효과는 다수 타입의 균주에서 관찰되었기 때문에 상이한 타입 사이에서 보존되는 유전자가 가장 가능한 대항으로 생각되었다. 캡슐 유전자좌 내의 유전자 중에서 단지 처음 4개인 cpsA -D는 다양한 타입의 폐렴 구균에 공통된다(Iannelli 등, 1999). 타입 3 폐렴구균은 표 1에 기재된 바와 같이 대기 조건하에서 증식하는 경우, 팽화 반응에 의하여 평가했을 때 점액상의 콜로니를 형성하고, 큰 캡슐을 가지는 것으로 알려져 있다(Knecht 등, 1970). 시험된 모든 기타의 폐렴구균 타입과는 달리, 타입 3 균주는 혐기성 조건하에서 배양하는 경우 대기 조건하에서 배양할 때의 크기에 비하여 콜로니 또는 캡슐 크기의 증가를 나타내지 않았다. 이 관찰에 기초하여, 타입 3과 기타 타입의 유전자좌 사이의 cpsA -D에서의 차이가 측정되었다.
추정 전사 감쇠기(putative transcriptional attenuator)를 암호하는 cpsA의 동족체 및 미지의 기능의 단백질을 암호하는 cpsB는 타입 3 캡슐화 유전자좌에 존재한다(Genbank accession 제Z47210호, Arrecubieta, 1995). 혈청형 2 폐렴구균에서 CpsC를 암호하는 유전자는 타입 3 캡슐화 유전자좌에 매우 보존되어 있으나, 혈청형 3 폐렴구균에서 예기된 CpsD는 다음의 아미노산 69개(226개 중)가 잘려진다. CpsC 및 CpsD가 폐렴구균 캡슐의 발현에 필요하며, 이들은 모두 콜란산이라고 칭하는 세포외 다당류의 쇄 길이 조절 및 외부로의 수송에 관련된 이. 콜리에서 발현되는 단일 단백질(Wzc)에서 상동성이 있다(Morona 등, 1999, Stevenson 등, 1996).
이. 콜리에서, Wzc는 티로신 잔기에서 가역 자가인산화를 한다(Vincent 등, 1999). 인산화된 티로신 잔기와 특이적으로 결합하는 4G10이라 칭하는 모노클로날 항체는 웨스턴 분석에 의하여 인산화된 티로신이 폐렴구균에 존재한다는 것을 측정하는 데 사용되었다. CpsD의 예상 크기인 약 26kD의 단일 밴드는 타입 6A 분리물의 전체 세포 용해물 내에 존재하였다. 또한, 동일한 크기의 단일 밴드는 본 발명에서 사용된 타입 6B, 18C 및 9V 균주의 전체 세포 용해물에 존재하였으나, 타입 3 폐렴구균(절단된 CpsD를 포함함)으로부터 수득되지 않았다. 이들 관찰은 CpsD는 티로신 잔기에서 인산화될 수 있다는 것을 나타내었다. 4G10이 인산화된 티로신 잔기를 함유하는 인식화 CpsD이었다는 추가의 증거는 균주 D39(비캡슐화 돌연변이) 및 R6x(cps2A-H를 지나는 7504개의 염기쌍 결실을 함유하고, 이중 단지 A-D만이 기타의 타입에서 공통된다, Iannelli 등, 1999)를 비교함으로써 얻어졌다. R6x 타입 폐렴구균에 있어서의 돌연변이는 몇몇의 시험에서 (타입 2)D39 모균주 또는 타입 3균주로부터 수득한 DNA를 사용하여 박테리아를 형질전환시킴으로써 보정되어 D39 타입 2의 유전적 기초에서 타입 3 또는 2 캡슐을 가진 캡슐화 균주를 생산하였다.
R6x와 타입 3 R6x 형질전환체를 반응시키지 못하는 4G10 및 항체와 타입 2 R6x 형질전환체의 반응은 이 밴드에 상응하는 단백질의 발현은 캡슐화 유전자좌 및 온전한 cpsD의 카피에서 처음 4개의 공통의 유전자 중의 하나를 필요로 한다는 것을 확인하였다. 4G10 반응성 단백질은 크기에 기초하여 CpsA 또는 B 가 아닌 것같다는 것이 결정되었다. 타입 2 및 3 CpsC 사이에 오직 15개 보존 아미노산 변경만이 있고, 그 중 어느것도 티로신을 포함하지 않았다. 타입 3에서의 4G10 반응성 밴드의 부족은 4G10 반응성 단백질이 CpsC가 아니라는 것을 나타낸다. 그래서, CpsD 단백질은 폐렴구균 내에 인산화 가능한 티로신 잔기를 포함한다는 결론지었다.
CpsD의 티로신 인산화에 대한 산소와 이산화탄소의 다양한 농도 하에서의 증식의 효과를 조사하였다. 산소와 이산화탄소의 다양한 농도하에서 증식한 P303이라고 칭하는 타입 6A 폐렴구균 분리물의 O형과 T형의 전체 세포의 용출물을 동등한 밀도로 조절하고, 포스포티로신 특이적 모노클로날 항체 4G10을 사용하여 웨스텐 분석에 의하여 조사하였다. 이들 실험의 결과는 도 3에 도시되어 있다. CpsD의 예상 크기의 단일 밴드는 산소의 존재하에 증식한 O 변이체에서 검출되었다. 도 3의 레인 1에 나타난 바와 같이, 혐기성에서 증식한 대략 동등한 수의 세포로부터 수득한 추출물에는 반응성이 없었다. 도 3의 레인 2-4의 결과에 의하여 나타난 바와 같이, <0.1 내지 10%의 이산화탄소압의 차이의 명백한 효과는 없었다. 시험된 모든 조건하에서(산소 <0.1% 내지 21% 및 이산화탄소 <0.1% 내지 10%), T 변이체의 세포 추출물을 갖는 항체의 반응성은 미약하다. 유사한 결과를 기타의 균주를 사용하여 얻었다. 그래서, CpsD의 티로신 인산화는 불투명도 표현형에 의하여 영향을 받으며 산소의 존재하에 증식할 것을 요한다고 결론지었다.
티로신 인산화에서의 차이는 CpsD의 활성에 영향을 주고 산소의 존재하에 O 폐렴구균에서의 CPS 발현 감소를 설명할 수 있다. 혐기성 조건에서 증식한 O 또는 T 폐렴구균은 어느 것도 인산화된 티로신을 발현하지 않고, 그러나, 양 표현형 형태는 CPS 생산의 정도에서 큰 차이를 나타낸다.
노던 분석은 O 변이체와 T 변이체 사이의 차이가 cpsD의 전사 수준의 차이에 기인하는지를 결정하기 위하여 사용되었다. 이들 실험의 결과는 도 4에 도시되어 있다. 전체 세포 RNA는 대기 조건 또는 10% 이산화탄소 존재하의 혐기성 조건에서 증식한 폐렴구균 균주 P303 의 O형 및 T형으로부터 수득하였다. RNA는 cpsD의 클로닝된 단편을 사용하여 프로빙되었다. 방사능 표지된 프로브와 mRNA의 cpsD의 하이브리드화를 평가하고 하이브리드화 분석 혼합물에 존재하는 RNA의 총량에 대한 값을 조정함으로써 전사 활성에서의 정량적인 차이를 측정하였다. 이들 실험은 산소 농도가 cpsD 전사 수준에 실질적인 영향을 미치지 않는 것을 나타내었다. 그러나, cpsD는 O형 세포에 비하여 T형 세포에서 3.4배 더 높은 수준으로 전사되었다. 그래서, cpsD의 전사 조절은 폐렴구균의 불투명 표현형을 결정하는 것으로 결론지었다.
임의의 구체적인 이론의 작용에 의하여 충분하게 되기를 바라는 것은 아니지만, CpsD는 CPS 생산을 조절하는 것으로 생각된다. CpsD의 티로신 인산화 정도에서 관찰되는 차이와 CPS 생산에서의 차이간의 상호관계는 이 이론을 지지한다. 세포외 다당류 콜란산의 사슬 길이 조절 및 외부로의 수송에 관여하는 이. 콜리에서의 티로신 자가인산화 효소에 대한 그것의 아미노산 서열 유사성의 일부에 기초하여, CpsD는 티로신 키나아제로서 작용하는 것으로 생각된다. Cps23FD는 Wzc에 대하여 229개의 아미노산 중 188개 이상에서 30%의 동일성 및 49%의 유사성을 갖는다. 혈청형 23f 폐렴구균의 CpsD 는 티로신 잔기를 비롯한 반복 특성(YGX)4을 포함하는 특이한 카르복실 말단 아미노산 서열(YGSYGNYGNYGKNKK; 서열 번호:3)을 함유한다. 이러한 카르복실 말단 영역은 CpsD의 잔여물보다 폐렴구균 변이체 중에서 아미노산 서열 이질성을 상당히 더 크게 나타낸다. 폐렴구균 균주 사이에서의 CPS 생산의 변이성은 상기 균주 사이의 이러한 카르복실 말단부의 변이성, 상기 단백질의 인산화능에 영향을 미치는 서열 변이에 기인하는 것으로 생각된다. 다수의 기타 박테리아 단백질 키나아제가 확인되어 왔으며, 이들은 티로신이 풍부한 반복 특성을 갖는 C-말단이 공통된다(Ilan 등, 1999). cpsD에 돌연변이가 잠복하는 폐렴구균 균주를 생성하는 것은 불능인 반면 CPS를 생산하는 균주의 능력은 유지하는 것은 CPS 및 캡슐 생산에서의 유전자의 중요성의 또 다른 증거이다.
콜로니의 불투명한 표현형 및 산소압에 대한 반응에서 CPS 생산을 조절하는 메카니즘의 다음의 모델이 제안된다. 상기 모델은 cpsD의 전사 조절 및 CpsD의 후전사 변형을 포함한다.
CpsD는 폐렴구균 타입 특이적 CPS의 생합성에 관련된 유전자에 작용하는 음성 조절인자이다. 비교적 낮은 cpsD 전사는 혐기성 조건하에서 O 타입의 폐렴구균에서 CPS가 비교적 많은 양으로 발현되는 것을 설명한다. CPS 발현 조절의 상당한 부분을 설명하는 cpsD의 전사 조절와 별개로, 제2 수준의 조절, 즉 CpsD 상의 티로신 잔기의 인산화 또는 자기인산화가 관여된다. CpsD의 인산화는 단지 O 변이체에 영향을 미치고, 호기성 조건하에서의 증식을 요한다. O 변이체에서만 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기에서 인산화되는 CpsD의 검출능은 T 폐렴구균의 포스파타제 활성 증가에 기인할 수 있다. 티로신 인산화는 CpsD의 음성 조절 활성을 증가시켜 인산화된 CpsD는 호기성 조건하에서 CPS 합성을 감소시킨다. 결과로서, CPS는 혐기성 증식 조건하에서보다 호기성 조건하에서 O 변이체에 의하여 더 적은 양이 생산된다. CpsD의 인식가능한 티로신 인산화의 부재한 경우에도 T형 폐렴구균에서 비교적 적은 CPS가 생산되는 것은 T형 폐렴구균에서의 cpsD의 발현 증가에 기인한다.
혐기성 조건하에서의 개선된 증식으로 전술된 것은 사실상 콜로니 크기를 더 크게 하는 CPS 합성 증가의 효과일 수 있다(Modde, 1978).
Wzc와 더 큰 유사성을 갖는 CpsD의 상동성은 표면 다당류를 발현하는 다수의 기타의 박테리아 종에서 나타난다. 이들 종의 예로서는 스트렙토코쿠스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클렙실라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 및 아시네토박터 존소니(Acinetobacter johnsonii)가 있다. 캡슐과 이들의 크기는 병독성의 중요한 결정소이기 때문에, 이들 부류의 유전자/단백질의 전사 및 후전사 변형에 기초한 CPS 양의 조절능은 콜로니화와 감염의 상이한 요구에 적응하는 캡슐화된 박테리아의 능력을 촉진하는데 중요할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 명세서는 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 특정한 실시 상태를 기준으로 설명되었으나, 본 발명의 기타의 실시 상태 및 변형은 본 발명의 진정한 정신 및 범위를 벗어남이 없이 당기술분야의 숙련자에 의하여 발명될 수 있다는 것은 자명하다. 첨부된 청구범위는 모든 이들 실시 상태와 등가의 변형을 포함한다.
도 1ai-1avi 및 1bi-bvi을 포함하는 도 1은 팽화 반응(Quellung reaction)을 사용하여 평가할 때, 콜로니 형태 및 캡슐 크기에 대한 주위(environmental) 산소 및 이산화탄소 농도의 영향을 나타내는 일련의 화상(image)이다. 타입 6A의 폐렴구균 분리물의 불투명(도 1ai, 1aii, 1aiii, 1bi, 1bii 및 1biii) 및 투명(도 1aiv, 1av, 1avi, 1biv, 1bv 및 1bvi) 변이체를 대기 조건(도 1ai, 1aiv, 1bi 및 1biv), 증가된 이산화탄소 농도를 포함하는 대기 조건(도 1aii, 1av, 1bii 및 1bv), 및 증가된 이산화탄소 농도를 포함하는 혐기성 조건(도 1aiii, 1avi, 1biii 및 1bvi) 하에 37 ℃에서 16시간 동안 카탈라제로 보충된 T 영양 한천 상에서 증식하였다. 도 1ai-1avi의 화상에 있어서의 콜로니는 비스듬하게 투과된 조명을 사용하여 시각화되었으며, 56배로 확대하여 나타낸 것이다. 도 1bi-1bvi의 화상에 있어서의 캡슐 물질은 팽화 반응 및 타입 특이성 항혈청을 사용하여 시각화되었으며, 4000배로 확대하여 나타낸 것이다.
도 2A-2D를 포함하는 도 2는 포착형(capture) ELISA를 사용하여 평가할 때, 단위 단백질당 CPS 생산에 대한 주위 산소 및 이산화탄소의 농도 및 불투명 표현형의 영향을 기술한 4개조의 막대 그래프이다. 4가지 폐렴구균 타입(도 2ai 및 2aii에 있어서의 변이체 6B, 도 2bi 및 2bii에 있어서의 변이체 6A, 도 2ci 및 2cii에 있어서의 변이체 18C, 도 2di 및 2dii에 있어서의 변이체 9V)의 분리물의 불투명(도 2ai, 2bi, 2ci 및 2di) 및 투명(도 2aii, 2bii, 2cii 및 2dii) 변이체는 상기 그래프에서 나타낸 산소 및 이산화탄소 농도에서 중간 대수기(고정 막대) 또는 정 상기(점조각 막대)로 증식하였다. CPS 생산은 초음파처리된 세포 펠렛 및 배양 상청액 내에서 측정하였고(평행선의 음영이 있는 막대), 총 세포 단백질의 양에 대한 상대값으로 나타내었다. "*"은 상기 변이체가 이 조건 하에서 증식하지 않았다는 것을 나타낸다. 값은 이중으로 각각 2회 실험한 것의 평균이다.
도 3A 및 도 3B를 포함하는 도 3은 웨스턴(Western) 분석에 있어서 CpsD의 티로신 인산화에 대한 주위 산소 및 이산화탄소 농도 및 불투명 표현형의 영향을 기술한 한쌍의 화상이다. O형(레인 1-4) 및 T형(레인 5-8)의 폐렴구균 변이체 P303의 전체 세포 용해물(lysate)을 고체 배지 상에서 증식 후에 제거하고, 동일한 밀도로 조절한다. 도 3A의 화상은 SDS-PAGE에 의하여 분리되고, 막으로 옮겨지고, 인산화된 티로신과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체(4G10이라 칭함)로 면역 블롯팅(immunoblotting)된 상기 샘플 내의 단백질을 묘사한 것이다. 도 3B의 화상은 동등한 로딩을 입증하기 위해, 전체 폐렴구균에 대항하여 상승된 항혈청을 사용하여 면역 블롯팅된 이중 막을 기술한 것이다. 용해되어 레인에 도포된 세포에 상응하는 증식 조건은 레인 1 및 5의 경우 <0.1% O2/10% CO2, 레인 2 및 6의 경우 16% O2/3% CO2, 레인 3 및 7의 경우 21% O2/<0.1% CO2, 및 레인 4 및 8의 경우 19% O2/10% CO2이다. 도 3A의 화살표는 25 kD의 CpsD 밴드의 위치를 나타낸다. 크기 마커(size marker)는 킬로달톤 단위이다.
도 4는 노던(Northern) 분석에 의하여 평가할 때, cpsD의 전사에 대한 주위 산소 및 이산화탄소 농도 및 불투명 표현형의 영향을 묘사한 화상이다. O형(레인 1 및 2) 또는 T형(레인 3 및 4)의 폐렴구균 변이체 P303으로부터 수득된 총 RNA는 포름아미드 겔 상에서 분리하고, 혈청형 4의 폐렴구균으로부터 수득된 cpsD의 방사능표지된 단편을 사용하여 프로빙(probing)하였다. RNA가 분리된 박테리아는 <0.1% O2/10% CO2 하에서(레인 1 및 3) 또는 21% O2/<0.1% CO2 하에서(레인 2 및 4) 증식하였다. 크기 마커는 킬로달톤 단위의 RNA 표준물이다.

Claims (3)

  1. 시험 화합물의 존재 하에 유지된 폐렴구균 세포 내의 캡슐 다당류 D (CpsD)의 인산화 정도와, 시험 화합물의 부재 하에서 유지된 동일 유형의 세포 내의 CpsD의 인산화 정도를 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 시험 화합물의 부재 하에서 유지된 상기 세포 내의 CpsD의 인산화 정도와 비교했을 때 시험 화합물의 존재 하에 유지된 상기 세포 내의 CpsD의 인산화 정도에서의 감소가, 시험 화합물이 감염을 경감시키는데 유용하다는 것을 가리키는 것임을 특징으로 하는, 시험 화합물이 동물 내의 폐렴구균 감염을 경감시키는데 유용한지 여부를 평가하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, CpsD의 인산화 정도는 CpsD 내에 존재하는 인산화된 티로신 잔기를 검출함으로써 평가되는 것을 특징으로 하는, 시험 화합물이 동물 내의 폐렴구균 감염을 경감시키는데 유용한지 여부를 평가하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, CpsD의 인산화 정도는 하나 이상의 인산화된 티로신 잔기를 갖는 CpsD를 측정함으로써 평가되는 것을 특징으로 하는, 시험 화합물이 동물 내의 폐렴구균 감염을 경감시키는데 유용한지 여부를 평가하는 방법.
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