ES2330919T3 - Modulacion en la produccion de polisacaridos capsulares de pneumococos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para producir un polisacárido capsular a partir de un neumococo, comprendiendo dicho procedimiento obtener una variante opaca del neumococo y mantener dicha variante opaca del neumococo en un medio de cultivo en contacto con un gas que tiene una concentración de oxígeno menor de aproximadamente el 16%, comprendiendo opcionalmente dicho procedimiento aislar el polisacárido capsular producido.
Description
Modulación en la producción de polisacáridos
capsulares de neumococos.
La invención se refiere ampliamente a la
producción de material polisacárido capsular de organismos
estreptocócicos y a la producción de vacunas usando dicho
material.
El Streptococcus pneumoniae, a veces
denominado neumococo, generalmente es un organismo comensal que
coloniza la superficie de la mucosa de la nasofaringe humana.
Cuando factores del hospedador permiten el acceso del organismo al
tracto respiratorio inferior, sigue una respuesta inflamatoria
enérgica, que conduce a una consolidación densa como espacios
aéreos alveolares rellenos de exudado. Esta afección se denomina
comúnmente neumonía (Tuomanen et al., 1995). La
manifestación más grave de la infección neumocócica es bacteriemia,
que puede complicarse con septicemia, meningitis o ambas.
Habitualmente, la bacteriemia en adultos es una complicación de la
neumonía (Ra2 et al., 1997).
La capacidad de los neumococos para resistir el
mecanismo principal de eliminación del organismo del torrente
sanguíneo (es decir, opsonofagocitosis) requiere la expresión del
factor de virulencia principal del organismo, que es una cápsula
polisacárida (Avery et al., 1931; Watson et al.,
1990). Los neumococos son capaces de sintetizar no menos de 90
polisacáridos capsulares estructuralmente únicos (CPS).
El CPS neumocócico presenta propiedades
antifagocitarias e inhibe la adherencia a células hospedadoras, una
etapa crítica en el estado de portador (es decir, la propagación del
organismo de un individuo infectado pero no necesariamente
sintomático a otro) y posiblemente aspectos posteriores en la
patogénesis de la enfermedad (Ring et al., 1998).
Descubrimientos similares en otras especies encapsuladas (por
ejemplo, Haemophilus influenzae, Neisseria
meningitidis, Streptococcus pyogenes y Streptococcus
agalactiae) han conducido al entendimiento de cómo las
cantidades de CPS deben variar temporalmente para permitir tanto
interacciones adhesivas con células hospedadoras como resistencia a
inmunidad humoral (Hammerschmidt et al., 1996; Levin et
al., 1998; Schrager et al., 1996; Sellin et al.,
1995; St. Geme III et al., 1991).
Incluso en una sola cepa, la cantidad de CPS
expresado por S. pneumoniae varía. No se ha comprendido bien
anteriormente el mecanismo o mecanismos reguladores que modulan la
expresión de CPS. La mayoría de los aislados neumocócicos
experimentan una variación fenotípica entre al menos dos formas, que
pueden distinguirse por la opacidad de la colonia (Weiser, 1998;
Weiser et al., 1994). Las formas de colonia opacas (O)
difieren de las variantes transparentes (T) de la misma cepa en la
cantidad de CPS que se sintetiza, generando generalmente las
colonias de forma O una mayor cantidad de CPS (Kim et al.,
1998).
Diferencias relativamente minoritarias en la
cantidad de CPS generadas por una variante neumocócica pueden tener
un impacto muy importante sobre la virulencia (MacLeod et
al., 1950). Las cantidades de 1,2 a 5,6 veces superiores de CPS
producidas por colonias de forma O, en comparación con colonias de
forma T, se correlaciona con una resistencia aumentada de células
neumocócicas a la opsonofagocitosis usando suero inmune (Kim et
al., 1999). En un modelo murino de infección sistémica, sólo la
variante O de varias cepas neumocócicas causaba septicemia (Kim
et al., 1998). Por el contrario, la forma T expresa mayores
cantidades del otro polisacárido de superficie celular, ácido
teicoico. El ácido teicoico de pared celular neumocócico está unido
covalentemente a CPS y contiene un constituyente similar al
hospedador poco habitual, la fosforilcolina. Este polisacárido
contribuye a la adherencia de células neumocócicas a células
epiteliales a través del receptor para el factor activador de
plaquetas (Cundell et al., 1995; Cundell et al., 1995;
Kim et al., 1998). La forma T también presenta una
distribución alterada de proteínas de unión a colina de superficie
celular, incluyendo CbpA, que actúa promoviendo la adherencia y la
colonización (Rosenow et al., 1997). Durante el estado de
portador en un modelo de rata lactante, existe selección para
variantes neumocócicas que presentan el fenotipo T más que el O
(Weiser et al., 1994). Estas observaciones sugieren que los
neumococos varían entre una forma (es decir, la forma T) que
presenta mayor adherencia y estado de portador y una forma no
adherente (es decir, la forma O), que está mejor adaptada a la
supervivencia en una infección invasiva.
La identificación del CPS expresado por una
forma neumocócica constituye la base del serotipado, un
procedimiento de diagnóstico usado para diferenciar variantes de
S. pneumoniae. Debido a que variantes diferentes pueden
presentar diferentes propiedades fisiológicas (por ejemplo,
susceptibilidad a agentes antimicrobianos o velocidad
característica de aparición o progresión de la neumonía), la
capacidad para diferenciar variantes neumocócicas es médicamente
ventajosa. Además, debido a que la capacidad del sistema inmune
humano (o de otro vertebrado) para reconocer y atacar variantes
neumocócicas depende de su capacidad para reconocer específicamente
el CPS de cada variante, la capacidad para obtener CPS específico
de variante neumocócica afecta significativamente al desarrollo de
métodos terapéuticos y preventivos y composiciones para aliviar
trastornos asociados con infección neumocócica. Por ejemplo, las
vacunas neumocócicas conocidas comprenden CPS obtenido de numerosas
variantes neumocócicas.
Continúa existiendo una necesidad significativa
de composiciones y métodos de diagnóstico, pronóstico, terapéuticos
y preventivos útiles con trastornos asociados con una infección
neumocócica. Muchas de estas composiciones y métodos comprenden,
emplean o dependen para su desarrollo de CPS neumocócico aislado.
Los procedimientos previamente conocidos para aislar CPS de
neumococos se caracterizan generalmente por un bajo rendimiento. La
presente invención incluye un procedimiento de mejora de la
producción de CPS que puede obtenerse a partir de una variante
neumocócica y aumenta la producción y el uso de composiciones y
métodos de diagnóstico, pronóstico, terapéuticos y preventivos
relacionados con infecciones neumocócicas.
La invención se refiere a una mejora en un
procedimiento para producir polisacárido capsular a partir de un
neumococo que comprende obtener una variante opaca del neumococo y
mantener al neumococo en un medio cultivo en contacto con un gas
que tenga una concentración subatmosférica de oxígeno no superior a
aproximadamente el 16%, o no superior a aproximadamente el 0,1%. El
neumococo puede ser un organismo del género Streptococcus,
tal como un organismo de la especie Streptococcus pneumoniae
(por ejemplo, una de las variantes 6A, 6B, 18C y 9V de S.
pneumoniae). En otro aspecto, más que la mejora comprende
mantener un gas que tenga tanto una concentración superatmosférica
de dióxido de carbono (de al menos aproximadamente el 5%) como una
concentración subatmosférica de oxígeno (menor de aproximadamente
el 16%) en contacto con el medio cultivo.
La invención se refiere además a un
procedimiento para preparar una preparación inmunógena para su
administración a un animal en riesgo de desarrollar una infección
neumocócica. Este procedimiento comprende obtener una variante
opaca del neumococo y mantener las células neumocócicas en un medio
de cultivo que tenga un contenido de oxígeno inferior al del mismo
medio equilibrado a la misma temperatura con aire normal, y aislar
el polisacárido capsular producido por las células a partir de las
células. El polisacárido aislado constituye la preparación
inmunógena.
La invención también se refiere a un
procedimiento para producir polisacárido neumocócico, comprendiendo
dicho procedimiento obtener una variante opaca de un neumococo y
mantener dicho neumococo en un medio de cultivo, donde dicho medio
de cultivo está sustancialmente desprovisto de oxígeno.
La invención se refiere además a un
procedimiento de producción de polisacárido neumocócico. Este
procedimiento comprende obtener una variante opaca del neumococo y
mantener las células neumocócicas en un medio de cultivo que tenga
un contenido de oxígeno inferior al del mismo medio equilibrado a la
misma temperatura con un gas que tenga un contenido de oxígeno del
16%, y en el que dicho medio de cultivo tiene un contenido de
dióxido carbono que es superior al del mismo medio equilibrado a la
misma temperatura con aire normal, por ejemplo, un medio saturado
con dióxido de carbono o un medio que comprende una sal de carbonato
o bicarbonato.
También se describe en este documento un
procedimiento para evaluar si un compuesto de ensayo es útil para
aliviar una infección neumocócica en un animal. Este procedimiento
comprende comparar:
- (a)
- el grado de fosforilación de CpsD en células neumocócicas mantenidas en presencia del compuesto de ensayo y
- (b)
- el grado de fosforilación de CpsD en el mismo tipo de células mantenidas en ausencia del compuesto de ensayo.
Si el grado de fosforilación de CpsD en las
células mantenidas en presencia del compuesto de ensayo es menor
que el grado de fosforilación de CpsD en las células mantenidas en
ausencia del compuesto de ensayo, entonces el compuesto de ensayo
es útil para aliviar la infección. El grado de fosforilación de CpsD
puede evaluarse, por ejemplo, por evaluación del número de restos
de tirosina fosforilados presentes en CpsD o por evaluación de la
fracción de CpsD que tiene al menos un resto de tirosina
fosforilado.
La Figura 1, que comprende las Figuras
1Ai-1Avi y 1Bi-1Bvi, es una serie de
imágenes que indican el efecto de la concentración de oxígeno y
dióxido de carbono ambiental sobre la morfología de las colonias y
el tamaño de la cápsula, según se evalúa usando la reacción de
Quellung. Se cultivaron variantes opacas (Figuras 1Ai, 1Aii, IAiii,
1Bi, 1Bii y 1Biii) y transparentes (Figuras 1Aiv, 1Av, 1Avi, 1Biv,
1Bv y 1Bvi) de un aislado neumocócico tipo 6A sobre agar nutriente
T complementado con catalasa durante 16 horas a 37ºC en condiciones
atmosféricas (Figuras 1Ai, 1Aiv, 1Bi y 1Biv), en condiciones
atmosféricas que comprenden una concentración de dióxido de carbono
aumentada (Figuras 1Aii, 1Av, 1Bii y 1Bv) y en condiciones
anaerobias que comprenden una concentración de dióxido de carbono
aumentada (Figuras 1Aiii, 1Avi, 1Biii y 1Bvi). Las colonias de las
imágenes de las Figuras 1Ai-1Avi se visualizaron
usando iluminación oblicua transmitida y se muestran a unos
aumentos de 56x. El material capsular de las imágenes de las Figuras
1Bi-1Bvi se visualizó usando la reacción de
Quellung y antisueros específicos de tipo y se muestran a unos
aumentos de 4000x.
La Figura 2, que comprende las Figuras
2A-2D, es un cuarteto de gráficas de barras que
representa los efectos de la concentración de oxígeno y dióxido de
carbono ambiental y el fenotipo de opacidad sobre la producción de
CPS, en base por proteína unitaria, según se evaluó usando un ELISA
de captura. Se cultivaron variantes opacas (Figuras 2Ai, 2Bi, 2Ci y
2Di) y transparentes (Figuras 2Aii, 2Bii, 2Cii y 2Dii) de aislados
de los cuatro tipos neumocócicos (variante 6B en las Figuras 2Ai y
2Aii; variante 6A en las Figuras 2Bi y 2Bii; variante 18C en las
Figuras 2Ci y 2Cii; variante 9V en las Figuras 2Di y 2Dii) hasta una
fase semilogarítmica (barras oscuras) o fase estacionaria (barras
punteadas) a las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono
indicadas encima de las gráficas. Se determinó la producción de CPS
en sedimentos de células sonicados y en sobrenadantes de cultivo
(barras sombreadas), y se expresa respecto a la cantidad de proteína
celular total. El "*" indica que esta variante no creció en
esta condición. Los valores representan la media de dos experimentos
separados por duplicado.
La Figura 3, que comprende las Figuras 3A y 3B,
es un par de imágenes que representan los efectos de la
concentración de oxígeno y dióxido de carbono ambiental y del
fenotipo de opacidad sobre la fosforilación de tirosina de CpsD en
análisis de Western. Se retiraron lisados de células completas de
formas O (carriles 1-4) y T (carriles
5-8) de la variante neumocócica P303 después del
cultivo en medio sólido y se ajustaron a una densidad equivalente.
La imagen de la Figura 3A representa proteínas en estas muestras que
se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron en
una membrana y se inmunotransfirieron con un anticuerpo monoclonal
denominado 4G10, que se une específicamente con tirosina
fosforilada. La imagen de la Figura 3B representa membranas por
duplicado que se inmunotransfirieron usando antisueros generados
contra neumococos completos para demostrar una carga equivalente.
Las condiciones de cultivo correspondientes a las células lisadas y
aplicadas en los carriles eran las siguientes: en los carriles 1 y
5, O_{2} <0,1%/CO_{2} al 10%; en los carriles 2 y 6, O_{2}
al 16%/CO_{2} al 3%; en los carriles 3 y 7, O_{2} al
21%/CO_{2} <0,1%; y en los carriles 4 y 8, O_{2} al
19%/CO_{2} al 10%. La flecha en la Figura 3A indica la
localización de la banda de CpsD de 25 kD. Los marcadores de tamaño
están en kilodaltons.
La Figura 4 es una imagen que representa los
efectos de las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono
ambientales y del fenotipo de opacidad sobre la transcripción de
cpsD, según se evaluaron por análisis de Northern. El ARN
total obtenido de formas O (Carriles 1 y 2) o T (Carriles 3 y 4) de
la variante neumocócica P303 se separó en un gel de formamida y se
sondó usando un fragmento radiomarcado de cpsD obtenido a
partir de un neumococo de serotipo 4. Las bacterias de las que se
aisló el ARN se cultivaron en O_{2} <0,1%, CO_{2} al 110%
(Carriles 1 y 3) o en O_{2} al 21%/CO_{2} <0,1% (Carriles 2 y
4). Los marcadores de tamaño son patrones de ARN en
kilodaltons.
La invención se refiere al descubrimiento por el
inventor de que la cantidad de polisacárido capsular (CPS)
producido por neumococos puede modularse por control del contenido
de oxígeno y dióxido de carbono del medio en el que se mantienen.
También se ha descubierto por el inventor que la producción de CPS
en Streptococcus pneumoniae está modulada por la presencia
de proteína CpsD y por la modificación postraduccional de esta
proteína. Basándose en estos descubrimientos, la presente invención
incluye métodos para modular la producción de CPS por neumococos
(por ejemplo, para el uso en la producción de vacunas neumocócicas y
otras preparaciones inmunógenas). También se describen métodos para
aliviar infecciones neumocócicas y métodos de identificación de
agentes útiles para aliviar infecciones neumocócicas.
Como se usan en este documento, cada uno de los
siguientes términos tiene el significado asociado con el mismo en
esta sección.
Los artículos "un", "uno" y "una"
se usa en este documento para referirse a uno o a más de uno (es
decir, a al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A
modo de ejemplo, "un elemento" se refiere a un elemento o más
de un elemento.
El término de aire "normal" se refiere a un
gas que tiene aproximadamente el contenido promedio de la atmósfera
en una localización seleccionada, sin tener en cuenta la humedad (es
decir, en base seca). El contenido promedio de la atmósfera es de
aproximadamente N_{2} al 78%, O_{2} al 21%, Ar al 1% y menos del
0,04% de cada uno de CO_{2}, H_{2}, He, Ne, Kr y Xe.
Se ha descubierto que la producción de
polisacárido capsular (CPS) por neumococos está influenciada por la
presencia y la concentración de oxígeno y dióxido de carbono
presentes en el entorno de las células. En particular, la
producción de CPS aumenta a medida que disminuye el contenido de
oxígeno del entorno; la producción de CPS también aumenta a medida
que aumenta el contenido de dióxido de carbono del entorno. Aunque
estas observaciones se han realizado usando cultivos de
Streptococcus pneumoniae, también pueden aplicarse a
organismos que presenten propiedades de cápsula y de genes de
cápsula similares a neumococos, tales como otras especies de
Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus agalactiae),
a otros organismos encapsulados tales como Staphylococcus
aureus, Klebsiella pneumoniae y Acinetobacter johnsonii y
a organismos que presenten similitud fenotípica, similitud
genotípica o ambas, con uno o más de éstos. Cuando el organismos es
Streptococcus pneumoniae puede ser cualquier variante
conocida o que se descubra de aquí en adelante del mismo, incluyendo
variantes caracterizadas por la identidad de su CPS, tales como una
de las variantes 6A, 6B, 18C y 9V.
Estas observaciones pueden usarse junto con
cualquier método conocido de cultivo de neumococos o con cualquier
método que se desarrolle de aquí en adelante, para aumentar (o
disminuir, si se desea) la producción de CPS por neumococos
cultivados por dichos métodos. La invención incluye un procedimiento
de aumento de la producción de CPS obtenida por cultivo de un
neumococo de acuerdo con un procedimiento conocido. El procedimiento
mejorado implica disminuir el contenido de oxígeno del medio en o
sobre el que se mantiene el neumococo, respecto al contenido de
oxígeno que normalmente se da en el medio durante el cultivo del
neumococo. Por ejemplo, es común cultivar neumococos en un medio
gelatinoso o semisólido o en un medio líquido, donde el medio se
mantiene en contacto con aire normal filtrado (o esterilizado de
otro modo).
La producción de CPS por neumococos puede
aumentarse por disminución (en base seca) del contenido de oxígeno
del gas con el que se mantiene en contacto el medio. El grado en el
que se disminuye el contenido de oxígeno no es crítico pero,
hablando en general, cuanto mayor sea la disminución del contenido
de oxígeno, mayor será la producción aumentada de CPS. El contenido
de oxígeno del gas es preferiblemente <16%, o se disminuye hasta
el punto en el que el gas es sustancialmente anaerobio (por ejemplo,
de modo que contiene O_{2} <0,1%). El modo en el que se
disminuye el contenido de oxígeno del gas no es crítico. Los
procedimientos convenientes para reducir el contenido de oxígeno
del gas por debajo del contenido de oxígeno del aire normal incluyen
lavado abundante del recipiente de cultivo (al menos inicialmente,
pero como alternativa de forma intermitente, periódica o continua)
con un gas que tenga el contenido de oxígeno deseado. Por ejemplo,
un recipiente de cultivo puede lavarse abundantemente con una
mezcla de gas que comprenda aproximadamente N_{2} al 71%, O_{2}
al 19% y CO_{2} al 10% o con una mezcla que comprenda Ar al 95% y
CO_{2} al 5%.
La producción de CPS por neumococos también
puede aumentarse por aumento del contenido de dióxido de carbono
del gas con el que contacta el medio sobre o en el que se mantienen
los neumococos. El grado en el que se aumenta el contenido de
dióxido de carbono del gas no es crítico pero, hablando en general,
cuanto mayor sea el aumento del contenido de dióxido de carbono,
mayor será la producción aumentada de CPS. El contenido de dióxido
de carbono del gas es preferiblemente de al menos aproximadamente el
5%, o de al menos aproximadamente el 10%, aunque puede ser tan
elevado que el medio de cultivo se sature con dióxido de carbono.
Como se ha analizado anteriormente, el contenido de dióxido de
carbono deseado puede conseguirse lavando abundantemente el
recipiente en el que se cultivan los neumococos con un gas que tenga
el contenido de dióxido de carbono deseado. Como alternativa, el
dióxido de carbono puede suministrarse al medio por incorporación de
una sal de carbonato o bicarbonato en el medio o por adición de
dicha sal al medio.
Se describen procedimientos de aumento de la
producción de CPS por neumococos por aumento del contenido de
dióxido de carbono del medio en el que se mantienen los neumococos,
por aumento del contenido de dióxido de carbono de un gas que
contacta con ese medio, por disminución del contenido de oxígeno de
ese medio, por disminución del contenido de oxígeno de un gas que
contacta con ese medio o cualquier combinación de éstos. En una
realización, el contenido de O_{2}/CO_{2} del medio (o de un
gas en contacto con el medio) puede ajustarse para maximizar la
producción de células neumocócicas durante una fase y después puede
reajustarse para maximizar la producción de CPS durante una segunda
fase.
La disminución del contenido de oxígeno del gas
que contacta con el medio provoca una disminución en el contenido
de oxígeno del medio sobre o en el que se mantienen los neumococos,
debido al equilibrado del gas disuelto y no disuelto. El cambio del
contenido de dióxido de carbono del gas tiene un efecto similar. La
rapidez con la que el gas disuelto en el medio y el gas no disuelto
se equilibran depende de varios factores conocidos en la técnica,
incluyendo, por ejemplo, el área superficial de la superficie de
contacto medio-gas, la viscosidad del medio y el
grado de agitación del medio.
Los neumococos pueden mantenerse en un medio
(por ejemplo, medio líquido), en el que la superficie de contacto
entre el medio y cualquier fase gas, si existe, se minimice. En
dichos sistemas de cultivo, la alteración del contenido de la fase
gas puede tener un efecto relativamente pequeño sobre el contenido
de gas del medio líquido, debido a la difusión limitada de gas
desde la fase gas hacia el líquido. En dichos sistemas, el contenido
de gas del medio líquido puede estar influenciado por el
procedimiento usado para preparar el medio. Por ejemplo, puede
prepararse un medio líquido sustancialmente anaerobio por
preparación de un medio líquido, esterilización del mismo en un
autoclave (cuyo calor empuja sustancialmente todo el oxígeno desde
el líquido) y enfriamiento del medio autoclavado en una atmósfera
sin oxígeno, tal como en un recipiente cerrado por el que se pasa
una corriente continua de gas sin oxígeno. Los ejemplos de gases
sin oxígeno adecuados incluyen argón puro, argón mezclado con
CO_{2} al 5-10%, nitrógeno puro o alguna
combinación de N_{2}, Ar y CO_{2}. Cuando se desee un grado muy
alto de anaerobicidad ([O_{2}] <<0,1%), el gas sin oxígeno
que pasa sobre el medio a medida que se enfría puede pasar a través
de o sobre una bobina o malla de cobre calentada usando
procedimientos conocidos en la técnica. Por supuesto, pueden usarse
procedimientos similares para la preparación de medios sólidos,
gelatinosos y semisólidos que tengan un contenido de gas
deseado.
La producción de CPS también puede aumentarse
por selección de una variante y forma neumocócica apropiada como el
inóculo usado para sembrar el medio para el que se modula el
contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono o ambos. Se
entiende que diferentes variantes de neumococos pueden generar CPS
estructuralmente diferentes. Los procedimientos descritos en este
documento pueden usarse para aumentar la producción de CPS usando
cualquier variante neumocócica. Se entiende además que muchos
neumococos presentan al menos dos formas fenotípicas. Estas formas
pueden incluir una forma opaca (O) y una forma transparente (T),
donde la forma opaca se caracteriza generalmente por producción de
una mayor cantidad de CPS. Por lo tanto, la producción de CPS puede
aumentarse adicionalmente por selección, como inóculo, de una forma
de una variante de un neumococo caracterizada por una mayor
producción de CPS.
El CPS producido usando uno o más de los
procedimientos descritos en este documento puede usarse (en
solitario o en combinación con otras especies de CPS neumocócico)
para preparar vacunas neumocócicas y otras preparaciones
inmunógenas usando procedimientos conocidos en la técnica. Dichos
procedimientos implican generalmente separar el CPS de las células
neumocócicas, opcionalmente destruir las células neumocócicas
restantes y combinar el CPS con un vehículo farmacéuticamente
aceptable (y, opcionalmente, un adyuvante inmunológico). Dichas
preparaciones pueden administrarse a un animal con el fin de
aumentar la respuesta inmune del animal a una infección por un
neumococo.
Debido a que se piensa que el CPS neumocócico
permite que los neumococos eludan las defensas inmunes en animales
(por ejemplo, seres humanos), pueden usarse procedimientos para
inhibir la producción de CPS para aliviar infecciones neumocócicas
en animales. Las infecciones neumocócicas (y complicaciones que
surgen a partir de las mismas) que pueden aliviarse de este modo
incluyen neumonía (particularmente neumonía neumocócica),
bacteriemia, septicemia, meningitis, endocarditis bacteriana,
faringitis exudativa estreptocócica, celulitis y abscesos
viscerales.
Se ha descubierto que el aumento del contenido
de oxígeno en el entorno disminuye la producción de CPS neumocócico,
aumentando de este modo la susceptibilidad de los neumococos al
sistema inmune. De forma similar, se ha descubierto que disminuir
el contenido de dióxido de carbono en el entorno disminuye la
producción de CPS neumocócico.
Las infecciones neumocócicas y sus efectos
secundarios y complicaciones pueden aliviarse manteniendo a un
animal aquejado de dicha infección en contacto con un gas que tenga
una concentración superatmosférica de oxígeno. Como alternativa,
puede aumentarse la tensión de oxígeno en el sitio de la infección
(por ejemplo, suministrando oxígeno puro o aire esterilizado
directamente a un sitio de infección {por ejemplo, un absceso
visceral que implique un neumococo} localizado en el interior de un
cuerpo animal), respecto a la tensión de oxígeno normal en el
sitio. Por ejemplo, cuando el sitio corporal son los pulmones (por
ejemplo, como con una neumonía neumocócica), la tensión normal de
oxígeno normal es la del aire normal. La neumonía neumocócica puede
aliviarse suministrando una concentración supraatmosférica de
oxígeno a los pulmones de los pacientes usando, por ejemplo, un
respirador o una máscara de oxígeno convencional.
Las infecciones neumocócicas y sus efectos y
complicaciones secundarias también pueden aliviarse disminuyendo la
tensión de dióxido de carbono en el sitio de infección en un animal
por debajo de la tensión de dióxido de carbono que se da
normalmente en dichos sitios de infección y, preferiblemente, por
debajo de la tensión de dióxido de carbono que se da normalmente en
ese sitio corporal, incluso en ausencia de infección neumocócica.
La disminución de la tensión de dióxido de carbono en un sitio
corporal interno distinto de los pulmones puede implicar
suministrar un flujo de gas estéril a través de, sobre o más allá
del sitio corporal. Cuando el sitio de infección son los pulmones,
la tensión de dióxido de carbono puede reducirse aumentando la
frecuencia de respiración, por acción voluntaria del paciente o de
forma artificial (por ejemplo, usando un ventilador o fármacos que
aceleren la respiración).
Como se describe con mayor detalle en el
ejemplo, una producción de CPS aumentada en neumococos se
correlaciona con una expresión reducida del gen cpsD y con
un bajo grado de fosforilación de la proteína CpsD. La producción
de CPS puede aumentarse por lo tanto por agentes que aumenten la
expresión de cpsD, que aumenten el grado de fosforilación de
CpsD o ambos. A la inversa, la producción de CPS puede inhibirse por
agentes que inhiban o reduzcan la expresión de cpsD, que
inhiban la fosforilación de CpsD, que aumenten la desfosforilación
de CpsD fosforilada o alguna combinación de éstos. Como se ha
analizado anteriormente, la disminución de la producción de CPS en
neumococos implicados en una infección en un animal puede hacer a
esos neumococos más susceptibles al ataque por el sistema inmune
del animal.
También se describen en este documento
procedimientos para evaluar si un compuesto de ensayo es un
inhibidor de la producción de CPS neumocócico y procedimientos de
evaluación de si un compuesto de ensayo es un potenciador de la
producción de CPS neumocócico. En cada uno estos procedimientos, las
células neumocócicas se mantienen en presencia del compuesto de
ensayo y, por separado pero preferiblemente de forma idéntica, en
ausencia del compuesto ensayo. Puede evaluarse un efecto directo
del compuesto de ensayo sobre la producción de CPS por evaluación
de la cantidad de CPS producido por las células en presencia y
ausencia del compuesto de ensayo. Como alternativa, el nivel de
expresión de cpsD (evaluado por medición de la producción del
ARN correspondiente o de la proteína correspondiente) o el grado de
fosforilación de CpsD (evaluado por medición del número de restos
de tirosina fosforilados presentes en CpsD o la fracción de CpsD que
tiene al menos un resto de tirosina fosforilado) se evalúa y se
correlaciona con la inhibición o aumento de la producción de CPS,
como se ha analizado anteriormente.
Las publicaciones a las que se hace referencia
en esta solicitud son las siguientes.
Arrecubieta et al., 1995,
Gene 167: 1-7
Austrian et al., 1966,
J. Bacteriol. 92: 1281-1284
Auzat et al., 1999, Mol.
Microbiol. 34: 1018-1028
Avery et al., 1931, J
Exp. Med. 54: 73
\global\parskip0.970000\baselineskip
Avery et al., 1944, J
Exp. Med. 79: 137-157
Caparon et al., 1992, J.
Bacteriol. 174: 5693-5701
Chen et al., 1988,
Gene 164: 155-164
Cundell et al., 1995,
Nature 377: 435-438
Cundell et al., 1995,
Infect. Immun. 63: 757-761
Gibson et al., 1993,
Infect. Immun. 61: 478-485
Hammerschmidt et al., 1996,
Mol. Microbiol. 20: 1211-1220
Howden, 1976, J. Clin. Pathol. 29:
50-53
Iannelli et al., 1999, J.
Bacteriol. 181: 2652-2652
Ilan et al., 1999, EMBO
J. 18: 3241-3248
Kim et al., 1998, J.
Infect. Dis. 177: 368-377
Kim et al., 1999, Infec.
Immun. 67: 2327-2333
Knecht et al., 1970, J.
Exp. Med. 132: 475-487
Levin et al., 1998, Mol.
Microbiol. 30: 209-219
MacLeod et al., 1950, J.
Exp. Med. 92: 1-9
Modde, 1978, Experimentia
34: 1285-1286
Neufeld, 1902, Z. Hyg.
Infektionskr. 40: 54
Raz et al., 1997, Clin.
Infect. Dis. 24: 1164-1168
Ring et al., 1998, J.
Clin. Invest. 102: 347-360
Rosenow et al., 1997,
Mol. Microbiol. 25: 819-829
Saluja et al., 1995,
Mol. Microbiol. 16: 215-227
Schrager et al., 1996,
J. Clin. Invest. 98: 1954-1958
Sellin et al., 1995,
Microb. Pathogen. 18: 401-415
St. Geme III et al., 1991,
Infect. Immun. 59: 1325-1333
Stevenson et al., 1996,
J. Bacteriol. 178: 4885-4893
Throup et al., 2000,
Mol. Microbiol. 35: 566-576
Tomasz, 1964, Bacteriol.
Proc. 64: 29
Tuomanen et al., 1995,
New Eng. J. Med. 332: 1280-1284
Vincent et al., 1999, J.
Bacteriol. 181: 3472-3477
Wani et al., 1996,
Infect. Immun. 64: 3967-3974
Watson et al., 1990,
Infect. Immun. 58: 3135-3138
Weiser, 1998, Microb. Drug
Resist. 4: 129-145
Weiser et al., 1994,
Infect. Immun. 62: 2582-2589
Weiser et al., 1999,
Infect. Immun. 67: 3690-3692
Weyand et al., 2000, J.
Biol. Chem. 275: 3192-3200
\global\parskip1.000000\baselineskip
La invención se describe ahora con referencia al
siguiente Ejemplo. Este Ejemplo se proporciona con fines
ilustrativos solamente y la invención no se limita a este Ejemplo,
sino que incluye todas las variaciones que sean evidentes como
resultado de los contenidos proporcionados en este documento.
Los experimentos que se presentan en este
Ejemplo demuestran que las diferencias en el fenotipo de opacidad
entre neumococos (es decir, forma O frente a forma T) están
afectadas por las concentraciones ambientales de oxígeno y que
condiciones de cultivo anaerobias tales como las que pueden darse en
la neumonía influyen en la capacidad de neumococos de forma O para
aumentar la expresión de CPS y evadir la eliminación inmune.
Se describen a continuación los materiales y
procedimientos usados en los experimentos que se presentan en este
Ejemplo.
Las cepas de S. pneumoniae usadas en este
estudio se describen en la Tabla I e incluyen las variantes O y T
descritas anteriormente de los aislados clínicos P303 (tipo 6A),
P324 (tipo 6B), P68 (tipo 18C) y P10 (tipo 9V), como se describen
(Kim et al., 1998; Weiser et al., 1994). Las bacterias
se cultivaron en recipientes no cerrados herméticamente en un medio
semisintético (medio C+Y, pH 8,0) o tríptico de soja sin agitación
a 37ºC, como se describe (Tomasz, 1964). Los cultivos de caldo se
sembraron en placas de agar tríptico de soja (TSA) convencionales
que contenían agar al 1% (p/v), sobre las que se extendieron 5000
unidades de catalasa (obtenida en Worthington Biochemical,
Freehold, NJ). Se incubaron los medios inoculados a 37ºC en una
jarra de anaerobiosis por extinción de llama a menos que se
especifique otra cosa. Se determinó la morfología de las colonias
en este medio TSA con aumentos e iluminación oblicua transmitida,
como se describe (Weiser et al., 1994).
Se controló la concentración de dióxido de
carbono ambiental en condiciones aerobias usando un incubador de
CO_{2}. Se obtuvieron condiciones de cultivo anaerobias usando el
sistema BBL GasPak^{TM} de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Becton Dickinson, Cockeysville, MD). En algunos
experimentos se empleó el componente de bicarbonato de sodio del
sistema para generar una atmósfera de dióxido de carbono al 10% y en
otros experimentos no. Después de recoger las bacterias, se midió
el pH del medio cultivo para confirmar que no se veía afectado por
estas condiciones de cultivo diferentes.
Se realizó el análisis de muestras clínicas
usando procedimientos similares. Se examinaron un total de 502
pacientes aquejados de meningitis, de los que aproximadamente el 20%
tenían una meningitis neumocócica demostrada bacteriológicamente.
Se recogió una muestra de hisopo nasofaríngeo de pacientes en los
que se había realizado un diagnóstico clínico presunto de
meningitis neumocócica. Esta muestra se sembró en placas
inmediatamente tanto sobre agar sangre de oveja al 5% como sobre
agar tríptico de soja que contenía 5000 unidades de catalasa, y las
placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera de aire que contenía
CO_{2} al 5%. También se sembraron muestras de líquido
cefalorraquídeo (LCR) sobre placas de tanto de agar sangre como
transparentes, como se cultivaron muestras de sangre de pacientes
en las que se observaron neumococos después de una incubación
convencional en aerobiosis durante hasta 48 horas. Inicialmente, se
confirmó que los aislados que presentaban una morfología típica en
agar sangre eran neumococos por tinción Gram y reacción de Quellung.
Todos los aislados se almacenaron a -80ºC en conservadores
bacterianos y se determinó la morfología de las colonias como se
describe en este documento. Se examinaron las diferencias
estadísticas entre las proporciones de los fenotipos T y O en
cultivos nasofaríngeos y de sitio invasivo usando una Prueba Exacta
de Fisher.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron competentes para transformación
natural neumococos encapsulados y no encapsulados como se describe
(Weiser et al., 1999). Se transformaron mutaciones en
sistemas de transducción de señales de dos componentes (TCSTS) en
la cepa P303 por selección de colonias a partir de un medio que
comprendía eritromicina (1 microgramo por mililitro). Se exploraron
los transformantes encapsulados para determinar una morfología de
colonia alterada y la expresión de CPS confirmada mediante la
reacción de Quellung usando antisueros específicos de tipo
(obtenidos en Statens Seruminstitut, Copenhague, Dinamarca).
\vskip1.000000\baselineskip
Se visualizaron cápsulas neumocócicas en
bacterias cultivadas hasta una fase semilogarítmica en medio
semisintético en diversas condiciones. Para la reacción de
Quellung, se mezcló un volumen equivalente de cultivo y una
composición que comprendía antisuero tipo 6 y azul de metileno al
1% (p/v) obtenido en el Statens Seruminstitut (Copenhague,
Dinamarca) en un portaobjetos de vidrio durante un minuto, como se
describe (Neufeld, 1902).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron variantes neumocócicas de forma O
y T en el medio semisintético hasta una fase semilogarítmica
(A_{620} = 0,3) o durante 16 horas (momento en el que las
células estaban en la fase estacionaria). Las células se recogieron
por centrifugación a 2000 x g, se lavaron en solución salina
tamponada con fosfato (PBS), se sonicaron durante tres intervalos
de 10 segundos a 0ºC y se almacenaron a -20ºC. Se usó una técnica
de ELISA de captura para determinar las cantidades de CPS presentes
en variantes cultivadas en condiciones seleccionadas, como se
describe (Kim et al., 1998). Se usó antisuero de conejo
específico de tipo (obtenido en Statens Seruminstitut, Copenhague,
Dinamarca) a una dilución de 1:5.000 en Na_{2}CO_{3} 0,05 molar
(pH 9,6) y se fijó durante una noche a temperatura ambiente a las
paredes de pocillos en placas de microtitulación. Entre cada etapa
de incubación, la placa se lavó cinco veces con tampón Tris (que
comprendía Tris 10 milimolar, NaCl 150 milimolar, Brij^{TM} 35 al
0,05% y azida sódica al 0,02% (p/v). El Brij^{TM} 35
(polioxietilen(23) lauril éter
C_{12}H_{25}(OCH_{2}CH_{2})_{23}OH) es un
detergente. Se usó CPS purificado obtenido de neumococos tipo 6B,
6A, 18C o 9V a una concentración conocida y se adquirió en la
Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD) para su uso
como patrón. Se detectó el CPS en muestras de células sonicadas
usando anticuerpos monoclonales denominados HASP 4 (que se une
específicamente con CPS tipo 6A y 6B), HASP 22 (que se une
específicamente con CPS tipo 18C) y HASP 33 (que se une
específicamente con CPS tipo 9V) y se usaron a una concentración
determinada en experimentos piloto. La unión de anticuerpos
monoclonales y CPS se detectó usando antisueros que reaccionan
específicamente con IgM de ratón y que están conjugados con
fosfatasa alcalina. Este reactivo se usó como se describe (Kim y
Weiser, 1998). Se realizó la determinación de proteína celular
total con extractos celulares sonicados usando el microkit de ácido
bicincónico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL). La cantidad de CPS en la fracción de
sobrenadante se basaba en la concentración de proteína en la
fracción sonicada de células correspondiente (es decir, para
normalizar el contenido de CPS en base por proteína unitaria).
Se ha descrito el método de ELISA de captura
usado para comparar cantidades de ácido teicoico total en sonicados
de células (Kim et al., 1998). Todos los experimentos se
realizaron por duplicado y se repitieron al menos tres veces. Los
resultados se expresan como valores medios por concentración total
de proteína celular.
Se cultivaron bacterias en agar tríptico de soja
complementado con catalasa como se ha descrito anteriormente.
Después del cultivo en condiciones seleccionadas durante 16 horas a
37ºC, las células se retiraron de la superficie usando un hisopo
estéril Dacron^{TM}, se resuspendieron en PBS y se lavaron en PBS
para ajustar la densidad celular de modo que A_{620} =
0,5. Después de centrifugar, las células sedimentadas se
resuspendieron en tampón de carga en gel Laemmli y se calentaron a
100ºC durante 5 minutos. Después, las muestras se separaron
mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al
12,5% (p/v) y después se transfirieron a membranas de
Immobilon-P^{TM} como se describe (Wani et
al., 1996).
Se realizó una inmunotransferencia usando un
anticuerpo monoclonal denominado 4G10 (Upstate Biotechnology Inc.,
Waltham, MA) a una dilución 1:2000 en tampón TSBP (Wani et
al., 1996) y se detectó la reactividad de muestras
inmunotransferidas con este anticuerpo usando antisueros de IgG de
ratón conjugados con fosfatasa alcalina como se describe (Kim et
al., 1999). Se confirmó la carga de cantidades aproximadamente
equivalentes de bacterias por inmunotransferencia de membranas por
duplicado usando antisueros descritos anteriormente generados
contra neumococos completos (Wani et al., 1996).
Se aisló el ARN total de variantes O y T de
células de la cepa P303 cultivadas hasta una fase semilogarítmica
en medio semisintético en condiciones atmosféricas y anaerobias y se
purificó como se describe (Weyand et al., 2000). Después de
la separación de ARN en un gel de formamida, se fotografió el ARN
teñido con bromuro de etidio y la imagen se digitalizó para su
comparación con marcadores de tamaño de ARN. El ARN se transfirió a
una membrana usando el Sistema VacuGene^{TM} XL de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala,
Suecia). La membrana se hibridó previamente en una solución que
comprendía NaPO_{4} 0,5 molar a pH 7,2, EDTA 1,5 milimolar y SDS
al 7% (p/v) durante 15 minutos a 65ºC. La sonda se preparó a partir
de un fragmento interno del gen cps4D y se amplificó por PCR
usando cebadores que tienen las siguientes secuencias:
| 5'-CCGGAATTCG TACAAATATA CAGTTGAGCG GAGATAAAC-3' | (SEC ID Nº: 1) y |
| 5'-CGCGGATCCT GTTGCTGTTA CCAAGATGGA CG-3' | (SEC ID Nº: 2) |
y ADN genómico a partir de una cepa tipo 4. La
cepa es la misma cepa usada en secuenciación de genoma completo por
el Instituto para Investigación Genómica. El producto de PCR se
digirió usando las endonucleasas de restricción BamHI y
EcoRI, y después se clonó en un vector que tenía terminadores
de la transcripción flanqueando al polienlazador para permitir la
clonación de secuencias estreptocócicas. Este vector se construyó a
partir de pJDC9 por inserción del casete de resistencia a
kanamicina con extremos romos de pUK4K (Pharmacia, Upsalla, Suecia)
en un sitio CLAI de extremos romos para permitir la selección
de este marcador en E. coli (Chen y Morrison, 1988). Se
insertó el fragmento cps4D en un vector digerido con
BamHI y EcoRI y se usó para transformar la cepa
DH5\alpha de E. coli. Se extrajo el ARN total a partir de
variantes O y T neumocócicas de la cepa P303 cultivadas hasta una
fase semilogarítmica en medio tríptico de soja en condiciones
atmosféricas y anaerobias.
Se describen a continuación los resultados de
los experimentos que se presentan en este Ejemplo.
Para ensayar si se produce selección para
diferentes fenotipos neumocócicos en el estado de portador y la
bacteriemia en seres humanos, se obtuvieron aislados emparejados del
mismo serotipo de la nasofaringe y sangre de pacientes que
presentaban signos de septicemia. Era necesario obtener aislados
emparejados debido a la heterogeneicidad de una cepa a otra en la
morfología de las colonias no relacionada con la opacidad. No podían
aislarse neumococos de la nasofaringe de pacientes bacteriémicos
una vez que se había iniciado el tratamiento con antibióticos. Por
lo tanto, los cultivos de nasofaringe y sangre se obtuvieron
sustancialmente al mismo tiempo. Esta limitación requería que el
estudio se llevase a cabo en una localización geográfica que tuviera
una alta incidencia de bacteriemia neumocócica para que pudiera
obtenerse un número suficiente de aislados emparejados.
Se obtuvieron aislados de sangre y nasofaringe
de 19 pacientes adultos en Blantyre, Malawi, y sólo se consideraron
como aislados emparejados si se demostraba posteriormente que los
aislados eran del mismo tipo mediante la reacción de Quellung que
usa antisueros específicos de tipo. La mayoría de los aislados
emparejados eran del tipo 1, el tipo más común en esta
localización, como se indica en la Tabla II. La mayoría de los
pacientes también dieron positivo para infección por el virus de la
inmunodeficiencia humana, que se piensa que explica la alta
incidencia de enfermedad neumocócica invasiva entre estos pacientes.
De los 19 aislados emparejados, 17 (89%) eran del fenotipo T en la
nasofaringe, mientras que 12 (63%) eran del fenotipo O en la sangre.
De los diez aislados emparejados en los que no concordada el
fenotipo de los neumococos obtenidos de los dos sitios, todos
presentaban un fenotipo más tipo T en la nasofaringe (P <
0,001). Esto demuestra que, en general, existe una selección para
variantes fenotípicas que da como resultado la presencia en sangre
de un fenotipo más tipo O derivado de entre la población
predominantemente tipo T en la nasofaringe en una infección
bacteriémica natural.
Se investigaron factores del hospedador y
bacterianos que podían promover la selección de variantes O durante
la infección y de variantes T durante el estado de portador. Se
formuló la hipótesis de que una menor tensión de oxígeno, de la
clase que se encontraría en un pulmón consolidado promovería una
transición del fenotipo T al O. El cultivo de un aislado clínico
tipo 6A, P303, en concentraciones reducidas de oxígeno no tenía
efecto sobre el índice de cambio espontáneo de forma T a O. El
cultivo en condiciones anaerobias (en presencia de una
concentración elevada de dióxido carbono), sin embargo, se asociaba
con un cambio a una morfología de colonia de mayor tamaño y más
mucoide que era particularmente marcada para la variante O, como se
muestra en la Figura 1A.
Debido a que los neumococos que presentan el
fenotipo O expresan mayores cantidades de CPS que los que presentan
el fenotipo T, se consideraba posible que el mayor tamaño de colonia
asociado con la forma O fuera un resultado de una producción
aumentada de este material (Kim et al., 1998). En estudios
iniciales, la zona refractaria de CPS alrededor de las colonias
bacterianas se visualizó usando la reacción de Quellung y antisueros
tipo 6, como se muestra en la Figura 1B. Esta zona era de mayor
tamaño para la variante O cultivada en condiciones anaerobias en
presencia de dióxido de carbono al 10%, en comparación con el
cultivo del mismo fenotipo en presencia de oxígeno o cultivo de la
variante T en cualquiera de las condiciones ensayadas, incluyendo la
ausencia de oxígeno. Por el contrario, cuando se cultivaron las
bacterias en condiciones atmosféricas, podía no detectarse una zona
de material capsular alrededor de las colonias de neumococos de
forma T. Este resultado confirmaba la capacidad de la forma O para
sintetizar cantidades aumentadas de CPS e indicaba que una tensión
reducida de oxígeno, una mayor tensión de dióxido de carbono o ambas
promueven una producción de CPS aumentada.
El efecto de la concentración de oxígeno y
dióxido de carbono ambiental se evaluó cuantitativamente usando un
ensayo desarrollado para medir cantidades de CPS, como se indica en
la Figura 2 (Kim et al., 1998). Las cantidades de CPS por
miligramo de proteína celular total, según se evaluaron usando el
ELISA de captura descrito en este documento, se correlacionan con
el área de superficie de colonia y con valores de volumen capsular
calculados basándose en la visualización de zonas usando la reacción
de Quellung y con el área de superficie de colonia, como se indica
en la Tabla III. Las bacterias de forma O en crecimiento en fase
semilogarítmica o fase estacionaria presentaban cantidades
aumentadas de CPS asociado con células en comparación con los
organismos de forma T. El cultivo de la variante O tipo 6A en
condiciones anaerobias en presencia de CO_{2} al 10% causaba un
aumento de 7,9 veces en la cantidad de CPS producido, en comparación
con la producción de CPS en las mismas células cultivadas en
condiciones atmosféricas. En comparación con las variantes T
cultivadas en las condiciones anaerobias en presencia de CO_{2}
al 10%, la variante O generaba 29 veces el mismo CPS. Se obtuvieron
resultados similares usando aislados O y T obtenidos de dos aislados
clínicos no relacionados (es decir, usando los tipos 6B y 18C).
La producción CPS en sobrenadante de cultivo se
evaluó para neumococos tipo 18C después del cultivo hasta una fase
estacionaria. La observación de que se producía una mayor cantidad
de polisacárido en el sobrenadante de cultivo de la variante de
forma O a medida que se disminuía la concentración de oxígeno y que
se aumentaba la concentración de dióxido de carbono indica que la
producción aumentada de CPS podía atribuirse a una síntesis
aumentada de CPS por células en condiciones de oxígeno
disminuido/dióxido de carbono aumentado, más que poder atribuirse a
una liberación disminuida de CPS a partir de las células en
condiciones de oxígeno aumentado/dióxido de carbono disminuido. Se
usó un aislado tipo 9V para determinar si la síntesis aumentada de
CPS podía atribuirse a oxígeno disminuido o dióxido de carbono
aumentado. Bacterias tipo 9V cultivadas hasta una fase estacionaria
en presencia de dióxido de carbono al 10% presentaban una producción
de CPS 12 veces mayor en ausencia de oxígeno que las mismas células
cultivadas en presencia de dióxido de carbono al 10% y en presencia
de oxígeno. Esto confirmaba que la tensión de oxígeno, más que la
tensión de dióxido de carbono, es el factor ambiental predominante
que afecta al grado de producción de CPS.
La siguiente fase del estudio abordaba el
mecanismo por el que estaba mediado el efecto del oxígeno sobre la
producción de CPS. Se examinó la implicación de un sistema de
transducción de señales de dos componentes para percibir y
transducir la tensión/presencia de oxígeno. Mutaciones marcadas
descritas anteriormente en 11 de los 12 sistemas de transducción de
señales de dos componentes que se encuentran en el genoma de un
aislado tipo 3 se transformaron en la cepa P303, como se describe
(Troup et al., 2000). Se prepararon 10 construcciones que
albergaban mutaciones en homólogos de reguladores de respuesta, así
como 7 construcciones que albergaban mutaciones en homólogos de
histidina quinasa. Para cada uno de los 17 homólogos mutantes
ensayados en P303, no había efectos sobre un tamaño de colonia o
zona de formación de cápsula aumentada, según se evaluó usando la
reacción de Quellung, en experimentos en los que las células se
cultivaron en condiciones anaerobias. Este resultado indicaba que
es poco probable que el efecto del oxígeno esté mediado por un
TCSTS, aunque uno de estos sistemas en los neumococos no podía
examinarse debido a que los genes parecen ser esenciales.
A continuación se examinaron los genes de un
locus que se sabe que es necesario para la expresión de CPS. Puesto
que se observó el efecto del oxígeno sobre las cantidades de CPS en
cepas de múltiples tipos, los genes conservados entre diferentes
tipos se consideraron los candidatos más probables. Entre los genes
en los loci de la cápsula, sólo los primeros cuatro,
cpsA-D, son comunes para neumococos de
diferentes tipos (Iannelli et al., 1999). Se sabe que los
neumococos tipo 3 forman colonias mucoides y tienen cápsulas de gran
tamaño, según se evaluó mediante la reacción de Quellung, cuando se
cultivan en condiciones atmosféricas, como se indica en la Tabla I
(Knecht et al., 1970). A diferencia de todos los demás tipos
neumocócicos ensayados, las cepas tipo 3 no muestran un aumento en
el tamaño de las colonias o cápsulas cuando se cultivan en
condiciones anaerobias, respecto a los tamaños cuando se cultivan
en condiciones atmosféricas. Basándose en esta observación, se
determinaron diferencias en cpsA-D entre el
tipo 3 y loci de otros tipos.
Están presentes homólogos de cpsA, que
codifica un supuesto atenuador de la transcripción, y cpsB,
que codifica una proteína de función desconocida, en el locus de
encapsulación tipo 3 (nº de acceso de Genbank Z47210; Arrecubieta,
1995). El gen que codifica CpsC en neumococos de serotipo 2 está muy
conservado en el locus de encapsulación tipo 3, pero el CpsD
predicho en neumococos de serotipo 3 está truncado después del
aminoácido 69 (de 226). CpsC y CpsD son necesarias para la expresión
de la cápsula neumocócica y en conjunto son homólogas a una sola
proteína (Wzc) expresada en Escherichia coli que está
implicada en la regulación de longitud de cadena y la exportación
del polisacárido extracelular denominado ácido colánico (Morona
et al., 1999; Stevenson et al., 1996).
En E. coli, Wzc experimenta una
autofosforilación reversible en un resto de tirosina (Vincent et
al., 1999). Se usó un anticuerpo monoclonal que se denomina
4G10 que se une específicamente con restos de tirosina fosforilados
para determinar mediante análisis de Western que estaba presente
tirosina fosforilada en el neumococo. Una sola banda de
aproximadamente 26 kD, el tamaño predicho de CpsD, estaba presente
en lisados de células completas del aislado tipo 6A. También se
observó una sola banda del mismo tamaño en lisados de células
completas de las cepas tipo 6B, 18C y 9V usadas en este estudio,
pero estaba ausente de los neumococos tipo 3 (que tenían una CpsD
truncada). Estas observaciones indicaban que CpsD es fosforilable en
un resto de tirosina. Se obtuvieron pruebas adicionales de que 4G10
estaba reconociendo CpsD que tenía restos de tirosina fosforilados,
por comparación de cepas D39 (un mutante no encapsulado) y R6x (una
cepa que tenía una deleción de 7504 pares de bases que abarcan
cps2A-H, de la que sólo
A-D son comunes a otros tipos; Iannelli et
al., 1999). La mutación en neumococos tipo R6x se corrigió en
algunos experimentos por transformación de las bacterias usando ADN
obtenido de la cepa parental D39 (tipo 2) o de una cepa tipo 3 para
dar una cepa encapsulada con cápsula tipo 3 ó 2 en el fondo
genético tipo 2 D39.
La falta de reacción de 4G10 con R6x y el
transformante R6x tipo 3 y la reacción del anticuerpo con el
transformante R6x tipo 2 confirmaba que la expresión de la proteína
que se corresponde con esta banda requiere uno de los primeros
cuatro genes comunes en el locus de encapsulación y una copia
intacta de cpsD. Se determinó que la proteína reactiva con
4G10 probablemente no es CpsA ni B basándose en el tamaño. Sólo hay
15 cambios de aminoácidos conservativos entre CpsC tipo 2 y 3, de
los cuales ninguno implica tirosina. La ausencia de banda reactiva
con 4G10 en la cepa tipo 3 indicaba que la proteína reactiva con
4G10 no es CpsC. Por lo tanto, se concluía que la proteína CpsD
comprende un resto de tirosina fosforilable en el neumococo.
Se examinó el efecto del cultivo en diversas
concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono sobre la
fosforilación de tirosina de CpsD. Lisados de células completas de
las forma O y T del aislado neumocócico tipo 6A denominado P303 que
se habían cultivado en diversas concentraciones de oxígeno y de
dióxido de carbono se ajustaron a una densidad equivalente y se
examinaron mediante análisis de Western usando el anticuerpo
monoclonal específico de fosfotirosina 4G10. Los resultados de
estos experimentos se muestran en la Figura 3. Se detectó una sola
banda del tamaño esperado para CpsD en la variante O cultivada en
presencia de oxígeno. No había reactividad con el extracto obtenido
a partir de un número aproximadamente equivalente de células
cultivadas en condiciones anaerobias, según se indica en el carril
1 de la Figura 3. No había un efecto evidente de las diferencias en
la tensión de dióxido de carbono de <0,1 al 10%, según indicaban
los resultados en los carriles 2-4 de la Figura 3.
En todas las condiciones ensayadas (oxígeno de <0,1% al 21% y
dióxido de carbono de <0,1% al 10%), la reactividad de los
anticuerpos con extractos celulares de la variante T era débil. Se
obtuvieron resultados similares usando otras cepas. Por lo tanto,
se concluía que la fosforilación de tirosina de CpsD se ve afectada
por el fenotipo de opacidad y requiere el cultivo en presencia de
oxígeno.
La diferencia en la fosforilación de tirosina
puede afectar a la actividad de CpsD y explica la expresión
disminuida de CPS en neumococos O en presencia de oxígeno. Ni los
neumococos O ni T cultivados en condiciones anaerobias expresan
tirosina fosforilada; sin embargo, las dos formas fenotípicas
presentan grandes diferencias en el grado de producción de CPS.
Se usó análisis de Northern para determinar si
las diferencias entre las variantes O y T se debían a diferencias
en el nivel de transcripción de cpsD. Los resultados de estos
experimentos se muestran en la Figura 4. Se obtuvo el ARN celular
total de formas O y T de la cepa neumocócica P303 cultivada en
condiciones atmosféricas o en condiciones anaerobias en presencia
de dióxido de carbono al 10%. El ARN se sondó usando un fragmento
clonado de cpsD. Se determinaron las diferencias
cuantitativas en la actividad transcripcional por evaluación de la
hibridación de sonda radiomarcada con cpsD en ARNm y ajuste
de estos valores para la cantidad total de ARN presente en la
mezcla de ensayo de hibridación. Estos experimentos demostraban que
la concentración de oxígeno no tenía un efecto sustancial sobre el
nivel de transcripción de cpsD. Sin embargo, cpsD se
transcribía a un nivel 3,4 veces mayor en células de forma T,
respecto a células de forma O. Por lo tanto, se concluía que la
regulación de la transcripción de cpsD determina el fenotipo
de opacidad de neumococos.
Sin desear ligarse a teoría particular de
funcionamiento alguna, se piensa que CpsD regula la producción de
CPS. La correlación entre las diferencias observadas en el grado de
fosforilación de tirosina de CpsD y las diferencias en la
producción de CPS confirman esta teoría. Se piensa que CpsD funciona
como una tirosina quinasa, basándose en parte en su similitud de
secuencia de aminoácidos con una enzima autofosforilante de tirosina
en E. coli que está implicada en la regulación de la
longitud de cadena y la exportación del polisacárido extracelular
ácido colánico. La Cps23FD tiene una identidad del 30% y una
similitud del 49% sobre 188 de 299 aminoácidos con Wzc. La CpsD de
neumococos de serotipo 23f contiene una secuencia aminoácidos
carboxilo-terminal poco habitual (YGSYGNYGNY GKNKK;
SEC ID Nº: 3) que contiene un motivo repetitivo (YGX)_{4}
que incluye restos de tirosina. Esta región
carboxilo-terminal presenta una heterogeneicidad de
secuencia de aminoácidos considerablemente mayor entre variantes
neumocócicas que el resto de CpsD. Se piensa que la variabilidad en
la producción de CPS entre cepas neumocócicas puede atribuirse a la
variabilidad de esta porción carboxilo-terminal
entre las cepas, afectando la variación de secuencia a la capacidad
de fosforilación de la proteína. Se han identificado varias otras
proteínas quinasas bacterianas y éstas tienen en común un extremo
C-terminal con un motivo repetitivo rico en
tirosina (Ilan et al, 1999). La incapacidad para generar una
cepa neumocócica que albergue una mutación en cpsD al tiempo
que mantenga la capacidad de la cepa para producir CPS es una prueba
adicional de la importancia de este gen en la producción de CPS y
cápsula.
Se propone el siguiente modelo de un mecanismo
para regular la producción de CPS en respuesta al fenotipo de
opacidad de colonia y a la tensión de oxígeno. El modelo implica la
regulación de la transcripción de cpsD y la modificación
postraduccional de CpsD.
CpsD es un factor regulador negativo que actúa
sobre genes implicados en la biosíntesis de CPS específico de tipo
neumocócico. Una transcripción relativamente reducida de cpsD
explica las cantidades relativamente elevadas de CPS expresado en
neumococos tipo O en condiciones anaerobias. Aparte de la regulación
de la transcripción de cpsD, que explica una proporción
significativa de la regulación de la expresión de CPS, está
implicado un segundo nivel de regulación, en concreto la
fosforilación o autofosforilación de un resto o restos de tirosina
en CpsD. La fosforilación de CpsD afecta sólo a la variante O y
requiere cultivo en condiciones aerobias. La capacidad de detección
de CpsD que esté fosforilada en uno o más restos de tirosina sólo en
la variante O puede deberse a una actividad fosfatasa aumentada en
neumococos T. La fosforilación de tirosina aumenta la actividad
reguladora negativa de CpsD, de modo que la CpsD fosforilada
disminuye la síntesis de CPS en condiciones aerobias. Como
resultado, se genera menos CPS por variantes O en condiciones
aerobias que en condiciones de cultivo anaerobias. Una producción
de CPS relativamente reducida en neumococos de forma T, incluso en
ausencia de una fosforilación de tirosina apreciable de CpsD, puede
atribuirse a una expresión aumentada de cpsD en neumococos
de forma T.
Lo que se había descrito anteriormente como un
crecimiento mejorado en condiciones anaerobias puede ser de hecho
un efecto de una síntesis aumentada de CPS que dé como resultado un
mayor tamaño de colonia (Modde, 1978).
Están presentes homólogos de CpsD con una
similitud aún mayor con Wzc en muchas otras especies de bacterias
que expresan polisacáridos de superficie. Los ejemplos de dichas
especies incluyen Streptococcus agalactiae, Staphylococcus
aureus, Klebsiella pneumoniae y Acinetobacter johnsonii.
Puesto que las cápsulas y su tamaño son determinantes críticos de
la virulencia, la capacidad para regular las cantidades de CPS
basándose en la modificación transcripcional y postraducción de
esta clase de gen/proteína puede ser importante para facilitar la
capacidad de bacterias encapsuladas para adaptarse a las diferentes
necesidades de colonización e infección.
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletArrecubieta et al.
Gene, 1995, vol. 167, 1-7 [0035]
\bulletAustrian et al. J.
Bacteriol., 1996, vol. 92,1281-1284
[0035]
\bulletAuzat et al. Mat.
Microbiol., 1999, vol. 34, 1018-1028
[0035]
\bulletAvery et al. J Exp.
Med., 1931, vol. 54, 73 [0035]
\bulletAvery et al. J Exp.
Med., 1944, vol. 79, 137-157 [0035]
\bulletCaparon et al. J.
Bacteriol., 1992, vol. 174,
5693-5701[0035]
\bulletChen et al. Gene,
1988, vol. 164, 155-164 [0035]
\bulletCundell et al.
Nature, 1995, vol. 377, 435-438
[0035]
\bulletCundell et al.
Infect. Immun., 1995, vol. 63, 757-761
[0035]
\bulletGibson et al. Infect.
Immun., 1993, vol. 61, 478-485
[0035]
\bulletHammerschmidt et al.
Mol. Microbiol., 1996, vol. 20,
1211-1220 [0035]
\bulletHowden. J. Clin.
Pathol., 1976, vol. 29, 50-53 [0035]
\bulletIannelli et al. J.
Bacteriol., 1999, vol. 181, 2652-2652
[0035]
\bulletIlan et al. EMBO
J., 1999, vol. 18, 3241-3248 [0035]
\bulletKim et al. J. Infect.
Dis., 1998, vol. 177, 368-377 [0035]
\bulletKim et al. Infec.
Immun., 1999, vol. 67, 2327-2333
[0035]
\bulletKnecht et al. J. Exp.
Med., 1970, vol. 132, 475-487 [0035]
\bulletLevin et al. Mol.
Microbiol., 1998, vol. 30, 209-219
[0035]
\bulletMacLeod et al. J.
Exp. Med., 1950, vol. 92, 1-9 [0035]
\bulletModde. Experimentia,
1978, vol. 34, 1285-1286 [0035]
\bulletNeufeld. Z. Hyg.
Infektionskr., 1902, vol. 40, 54 [0035]
\bulletRaz et al. Clin.
Infect. Dis., 1997, vol. 24,1164-1168
[0035]
\bulletRing et al. J. Clin.
Invest., 1998, vol. 102, 347-360
[0035]
\bulletRosenow et al. Mol.
Microbiol., 1997, vol. 25, 819-829
[0035]
\bulletSaluja et al. Mol.
Microbiol., 1995, vol. 16, 215-227
[0035]
\bulletSchrager et al. J.
Clin. Invest., 1996, vol. 98, 1954-1958
[0035]
\bulletSellin et al. Microb.
Pathogen., 1995, vol. 18, 401-415
[0035]
\bulletSt. Geme III et al.
Infect. Immun., 1991, vol. 59,
1325-1333[0035]
\bulletStevenson et al. J.
Bacteriol, 1996, vol. 178,
4885-4893[0035]
\bulletThroup et al. Mol.
Microbiol., 2000, vol. 35, 566-576
[0035]
\bulletTomasz. Bacteriol.
Proc., 1964, vol. 64, 29 [0035]
\bulletTuomanen et al. New
Eng. J. Med., 1995, vol. 332, 1280-1284
[0035]
\bulletVincent et al. J.
Bacteriol., 1999, vol. 181, 3472-3477
[0035]
\bulletWani et al. Infect.
Immun., 1996, vol. 64, 3967-3974
[0035]
\bulletWatson et al. Infect.
Immun., 1990, vol. 58, 3135-3138
[0035]
\bulletWeiser. Microb. Drug
Resist., 1998, vol. 4, 129-145
[0035]
\bulletWeiser et al. Infect
Immun., 1994, vol. 62, 2582-2589
[0035]
\bulletWeiser et al. Infect
Immun., 1999, vol. 67, 3690-3692
[0035]
\bulletWeyand et al. J.
Biol. Chem., 2000, vol. 275, 3192-3200
[0035]
Claims (16)
1. Procedimiento para producir un polisacárido
capsular a partir de un neumococo, comprendiendo dicho procedimiento
obtener una variante opaca del neumococo y mantener dicha variante
opaca del neumococo en un medio de cultivo en contacto con un gas
que tiene una concentración de oxígeno menor de aproximadamente el
16%, comprendiendo opcionalmente dicho procedimiento aislar el
polisacárido capsular producido.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
que dicho gas tiene una concentración de oxígeno no superior a
aproximadamente el 0,1%.
3. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
que dicho neumococo es un organismo del género
Streptococcus.
4. Procedimiento de la reivindicación 3, en el
que dicho neumococo es un organismo de la especie Streptococcus
pneumoniae.
5. Procedimiento de la reivindicación 4, en el
que dicho neumococo es una variante de la especie Streptococcus
pneumoniae seleccionada del grupo que consiste en las variantes
6A, 6B, 18C y 9V.
6. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
que dicho gas tiene una concentración superatmosférica de dióxido
de carbono.
7. Procedimiento para producir un polisacárido
capsular a partir de un neumococo, comprendiendo dicho procedimiento
obtener una variante opaca del neumococo y mantener dicha variante
opaca del neumococo en un medio de cultivo en contacto con un gas
que tiene una concentración de dióxido de carbono de al menos
aproximadamente el 5% y una concentración de oxígeno menor de
aproximadamente el 16%, comprendiendo opcionalmente dicho
procedimiento aislar el polisacárido capsular producido.
8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el
que dicho gas tiene una concentración de dióxido de carbono de al
menos aproximadamente el 10%.
9. Procedimiento de la reivindicación 7, en el
que dicho gas tiene una concentración de oxígeno no superior a
aproximadamente el 0,1%.
10. Procedimiento para preparar una preparación
inmunógena para su administración a un animal en riesgo de
desarrollar una infección neumocócica, comprendiendo el
procedimiento las etapas de:
- a)
- obtener una variante opaca del neumococo;
- b)
- mantener dicha variante opaca del neumococo en un medio de cultivo que tiene un contenido de oxígeno inferior al del mismo medio equilibrado a la misma temperatura con un gas que tiene una concentración de oxígeno menor del 16%; y
- c)
- aislar el polisacárido capsular producido por las células a partir de las células; en el que el polisacárido aislado constituye la preparación inmunógena.
11. Procedimiento de la reivindicación 10, en el
que dicho gas tiene una concentración de oxígeno no superior a
aproximadamente el 0,1%.
12. Procedimiento de la reivindicación 10, en el
que dicho gas tiene una concentración superatmosférica de dióxido
de carbono.
13. Procedimiento para producir un polisacárido
neumocócico, comprendiendo dicho procedimiento obtener una variante
opaca de un neumococo y mantener dicho neumococo en un medio de
cultivo, donde dicho medio de cultivo está sustancialmente
desprovisto de oxígeno.
14. Procedimiento para producir un polisacárido
neumocócico, comprendiendo dicho procedimiento obtener una variante
opaca de un neumococo y mantener dicho neumococo en un medio de
cultivo que tenga un contenido de oxígeno inferior al del mismo
medio equilibrado a la misma temperatura con un gas que tenga un
contenido de oxígeno del 16%, y en el que dicho medio de cultivo
tiene un contenido de dióxido de carbono que es superior al del
mismo medio equilibrado a la misma temperatura con aire normal.
15. Procedimiento de la reivindicación 14, en el
que dicho medio de cultivo está saturado con dióxido de carbono.
16. Procedimiento de la reivindicación 14, en el
que dicho medio de cultivo comprende una sal de carbonato o
bicarbonato.
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|---|---|---|---|---|
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| RU2460539C2 (ru) * | 2006-10-10 | 2012-09-10 | Вайет | СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЛИСАХАРИДОВ Streptococcus pneumoniae 3 ТИПА (ВАРИАНТЫ) |
| WO2009059054A2 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Bacteria strains an d bacteriocin produced therefrom |
| PT2385981T (pt) * | 2008-12-18 | 2019-10-28 | Wyeth Llc | Método para controlar peso molecular de polissacárido de streptococcus pneumoniae com a utilização de carbono. |
| WO2010080486A2 (en) | 2008-12-18 | 2010-07-15 | Wyeth Llc | Method for controlling streptococcus pneumoniae serotype 19a polysaccharide molecular weight |
| CN102093963B (zh) * | 2010-11-26 | 2012-11-14 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 富含磷壁酸的肺炎链球菌的培养方法 |
| US10150979B2 (en) | 2014-05-07 | 2018-12-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Purification of secreted polysaccharides from S. agalactiae |
| US10611664B2 (en) | 2014-07-31 | 2020-04-07 | Corning Incorporated | Thermally strengthened architectural glass and related systems and methods |
| EP3174835A1 (en) | 2014-07-31 | 2017-06-07 | Corning Incorporated | Thermally tempered glass and methods and apparatuses for thermal tempering of glass |
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| WO2017123573A2 (en) | 2016-01-12 | 2017-07-20 | Corning Incorporated | Thin thermally and chemically strengthened glass-based articles |
| US11795102B2 (en) | 2016-01-26 | 2023-10-24 | Corning Incorporated | Non-contact coated glass and related coating system and method |
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| US20210062138A1 (en) * | 2018-01-22 | 2021-03-04 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Medium for culturing pneumococcal samples |
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Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2510606A1 (fr) * | 1981-07-30 | 1983-02-04 | Berri Balzac | Procede d'obtention de polyosides capsulaires, polyosides capsulaires ainsi obtenus et leur application a la preparation de vaccins |
| CA2116261A1 (en) * | 1993-04-20 | 1994-10-21 | David E. Briles | Epitopic regions of pneumococcal surface protein a |
| WO1995031548A1 (en) * | 1994-05-16 | 1995-11-23 | The Uab Research Foundation | Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide genes and flanking regions |
| JP4856345B2 (ja) * | 2000-03-16 | 2012-01-18 | ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア | ニューモコッカス莢膜多糖類の調整的製造 |
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