JP2003531584A - ニューモコッカス莢膜多糖類の調整的製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はストレプトコッカス・ニューモニエなどの肺炎球菌における莢膜多糖類産生を調節する方法に関する。本発明はさらに動物における肺炎球菌感染症を緩和する方法、および動物における肺炎球菌感染症の調節能を有する物質を同定する方法に関する。図１Ａｉ−Ａｖｉおよび1Ｂｉ−１Ｂｖｉを含む図（１）は、クエルング反応を用いて評価された、周囲の酸素および二酸化炭素濃度がコロニーの形態および莢膜の大きさに及ぼす影響を示す一連の画像である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本研究は、米国政府基金（米国公衆衛生総局承認番号ＡＩ３８４３６およびＡ
Ｉ４４２３１）により一部支援され、したがって米国政府が本発明において一定
の権利を有する。

【０００２】 （技術分野および背景技術） 本発明は、一般に、連鎖球菌（streptococcal）生物からの莢膜多糖類（capsu
lar porlysaccharide）物質の産生、およびかかる物質を用いたワクチンの製造
に関する。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）は、肺炎球
菌（pneumococcus）と呼ばれる場合もあるが、一般に、ヒト鼻咽腔の粘膜表面に
コロニーを形成する共生生物である。生物が下部気道に近づくことを宿主因子が
許容する場合、結果として強力な炎症応答が起こり、肺胞空気腔が滲出液で満た
されるので濃密な硬変に至る。この状態は一般的に肺炎と呼ばれる（Tuomanenら
、１９９５）。肺炎球菌感染症の最も重篤な発現は菌血症であり、これは敗血症
、髄膜炎またはその両方を併発し得る。成人における菌血症は通常、肺炎の合併
症である（Razら、１９９７）。

【０００３】 生物を血流から浄化する主なメカニズム（すなわち、オプソニン食菌作用）に
対抗する肺炎球菌の能力は、生物の主な毒性因子の発現を必要とし、これは多糖
類莢膜である（Averyら、１９３１；Watsonら、１９９０）。肺炎球菌は９０を
下回らない構造的に独自の莢膜多糖類（ＣＰＳ）を合成することができる。 肺炎球菌ＣＰＳは、食作用阻止特性を示し、保菌（carriage）の重要な段階（
すなわち、感染しているが、症状が現れている必要はない個体から生物が次々と
広がること）であり、おそらくは後に疾患の病因となる宿主細胞への接着を抑制
する（Ringら、１９９８）。他の被包性種（例えば、ヘモフィルス・インフルエ
ンゼ（Haemophilus influenzae）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisser
ia meningitidis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogene
s）、およびストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae
）における同様の発見が、宿主細胞との接着的相互作用および体液性免疫に対す
る耐性の両方を許容するためにどれくらいの量のＣＰＳを一時的に変えなければ
ならないかの理解につながった（Hammerschmidtら、１９９６；Levinら、１９９
８；Schragerら、１９９６；Sellinら、１９９５；St. Geme IIIら、１９９１）
。

【０００４】 単一種内においてさえも、エス・ニューモニエにより発現されるＣＰＳの量は
変化する。ＣＰＳ発現を調節する調節メカニズムは、以前にはあまりよく理解さ
れていなかった。ほとんどの肺炎球菌単離菌は少なくとも２形態で表現型の変異
を受け、これはコロニーの不透明度により区別することができる（Weiser、１９
９８；Weiserら、１９９４）。不透明な（Ｏ）コロニーは、同じ菌株の透明な（
Ｔ）変種とは合成されるＣＰＳの量が異なり、Ｏ形は一般により多量のＣＰＳを
産生する（Kimら、１９９８）。

【０００５】 肺炎球菌変種により産生されるＣＰＳの量における比較的小さな違いは、毒性
に対して大きな影響を及ぼし得る（MacLeodら、１９５０）。Ｔ−形コロニーと
比較してＯ−形態コロニーにより産生される１．２〜５．６倍高いＣＰＳの量は
、免疫血清を用いたオプソニン食菌作用に対する肺炎球菌の耐性の増大と相関す
る（Kimら、１９９９）。全身性感染のネズミモデルにおいて、いくつかの肺炎
球菌株のＯ−変種だけが敗血症を引き起こした（Kimら、１９９８）。対照的に
、Ｔ形はさらに多量の他の細胞表面多糖類、テイコ酸（teichoic acid）を発現
する。肺炎球菌細胞壁テイコ酸はＣＰＳと共有結合し、珍しい宿主様成分、ホス
ホリルコリンを含む。この多糖類は、血小板活性化因子の受容体を介した肺炎球
菌の上皮細胞との接着に貢献する（Cundellら、１９９５；Cundellら、１９９５
；Kimら、１９９８）。Ｔ形はさらに、接着およびコロニー形成を促進するよう
に作用するＣｂｐＡを含む細胞表面コリン結合蛋白の変更された分布を示す（Ro
senowら、１９９７）。未成熟ラットモデルにおける保菌中、ＯでなくＴ表現型
を示す肺炎球菌変種の選択が存在する（Weiserら、１９９４）。これらの観察は
、肺炎球菌は高い接着性および保菌を示す形態（すなわち、Ｔ−形）と侵襲性感
染における生存物により効果的に適用される非接着形態（すなわち、Ｏ−形）間
では異なることを示唆する。

【０００６】 肺炎球菌により発現されるＣＰＳの同定は、血清型の決定、エス・ニューモニ
エ変種の区分に用いられる診断法の基礎を形成する。異なる変種は異なる生理学
的特性（例えば、抗菌剤に対する感受性または肺炎の開始または発症の特徴的速
度）を示し得るので、肺炎球菌変種を区分できることは医学的に有利である。さ
らに、ヒト（または他の脊椎動物）の免疫系が各変種の肺炎球菌変種を認識し、
攻撃する能力は各変種のＣＰＳを特異的に認識する能力に依存するので、肺炎球
菌変種特異性ＣＰＳが得られることは、肺炎球菌感染症と関連する疾患を軽減す
るための治療法および予防法および組成物の開発に著しく影響を及ぼす。例えば
、公知の肺炎球菌ワクチンは、多くの肺炎球菌変種から得られるＣＰＳを含む。

【０００７】 肺炎球菌感染症に関連する疾患について有用な診断、予知、治療、および予防
組成物および方法が依然として非常に必要とされている。これらの組成物および
方法の多くは、単離された肺炎球菌ＣＰＳを含み、利用し、あるいはその開発の
ために依存する。ＣＰＳを肺炎球菌から単離するための従来公知の方法は、一般
に低収率を特徴とする。本発明は、肺炎球菌変種から得ることができるＣＰＳの
収率を向上させる方法を含み、診断、予知、治療、および予防用組成物の産生お
よび使用および肺炎球菌感染症に関連する方法を向上させる。

【０００８】 （発明の開示） 本発明は、肺炎球菌を増殖培地中に維持することにより、肺炎球菌から莢膜多
糖類を産生する方法の改良法に関する。一の態様において、改良は、大気より低
い濃度の酸素を有する気体を増殖培地と接触した状態に維持することを含む（例
えば、酸素濃度が約１６％以下、または約０．１％以下）。肺炎球菌はストレプ
トコッカス属の生物、例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種の生物（例
えば、エス・ニューモニエ変種６Ａ、６Ｂ、１８Ｃ、および９Ｖ）であり得る。
もう一つの態様において、改良法は、大気より高い濃度（例えば、少なくとも約
３％または１０％）の二酸化炭素を有する気体を増殖培地と接触した状態維持す
ることを含む。第三の態様において、改良は、大気より高い濃度の二酸化炭素と
、大気より低い濃度の酸素を有する気体を増殖培地と接触した状態に維持するこ
とを含む。さらにもう一つの態様において、改良法は、増殖培地の二酸化炭素濃
度を、同じ温度で５％二酸化炭素を含む気体と平衡させた同じ増殖培地中の二酸
化炭素の濃度と少なくとも等しいレベルに維持することを含む。

【０００９】 本発明はさらに、動物における肺炎球菌感染症を軽減する方法に関する。この
方法は、動物（例えば、少なくとも動物の肺）を大気より高い濃度（例えば、２
５％、５０％、または１００％）の酸素を有する気体と接触した状態に維持する
ことを含む。この方法により軽減することができる感染症の例としては、肺炎、
菌血症、敗血症、および髄膜炎が挙げられる。 本発明はさらに、肺炎球菌感染症を発症する危険性のある動物に対して投与す
るための免疫原性調製物を製造する方法にも関する。この方法は、同じ温度で標
準的な空気と平衡させた同じ培地よりも低い酸素濃度を有する増殖培地中に肺炎
球菌細胞を維持し、該細胞から該細胞により産生される莢膜多糖類を単離するこ
とを含む。単離された多糖類は、免疫原性調製物を構成する。

【００１０】 本発明はさらに、肺炎球菌多糖類を産生する方法に関する。この方法は、標準
的な空気と同じ温度で平衡させた同じ培地よりも低い酸素含量を有する増殖培地
、例えば、実質的に酸素を含まない培地中に肺炎球菌細胞を維持することを含む
。一例において、培地は、標準的な空気と同じ温度で平衡させた同じ培地よりも
低い二酸化炭素濃度を有し、例えば、二酸化炭素で飽和させた培地あるいは炭酸
塩または重炭酸塩を含む培地である。 本発明は、試験化合物が動物における肺炎球菌感染症を軽減するために有用で
あるかどうかを評価する方法を包含する。この方法は、 （ａ）試験化合物の存在下で維持された肺炎球菌細胞におけるＣｐｓＤのリン酸
化反応の程度および （ｂ）試験化合物の非存在下で維持された同じ種類の細胞におけるＣｐｓＤのリ
ン酸化反応の程度を比較することを含む。 試験化合物の存在下で維持された細胞におけるＣｐｓＤのリン酸化反応の程度が
試験化合物の非存在下で維持された細胞におけるＣｐｓＤのリン酸化反応の程度
よりも低いならば、該試験化合物は該感染症の軽減に有用である。ＣｐｓＤのリ
ン酸化反応の程度は、例えば、ＣｐｓＤにおいて存在するリン酸化されたチロシ
ン残基の数を評価するか、または少なくとも１個のリン酸化チロシン残基を有す
るＣｐｓＤのフラクションを評価することにより評価することができる。

【００１１】 （図面の簡単な記載） 図１は、図１Ａｉ〜１Ａｖｉおよび１Ｂｉ〜１Ｂｖｉを含み、これはクエルン
グ反応（Quellung reaction）を用いて評価された、周囲の酸素および二酸化炭
素濃度がコロニーの形態および莢膜の大きさに及ぼす影響を示す一連の画像であ
る。タイプ６Ａ肺炎球菌分離菌の不透明（図１Ａｉ，１Ａｉｉ，１Ａｉｉｉ，１
Ｂｉ，１Ｂｉｉ，および１Ｂｉｉｉ）および透明（図１Ａｉｖ，１Ａｖ，１Ａｖ
ｉ，１Ｂｉｖ，１Ｂｖ，および１Ｂｖｉ）変種を、カタラーゼを補足したＴ栄養
寒天上で１６時間３７℃で、大気条件下（図１Ａｉ，１Ａｉｖ，１Ｂｉ，および
１Ｂｉｖ）、二酸化炭素濃度を増大させた大気条件下（図１Ａｉｉ，１Ａｖ，１
Ｂｉｉ，および１Ｂｖ）、および二酸化炭素濃度を増大させた嫌気性条件下（図
１Ａｉｉｉ，１Ａｖｉ，１Ｂｉｉｉ，および１Ｂｖｉ）で成長させた。図１Ａｉ
〜１Ａｖｉにおける画像は傾斜透過照明を用いて可視化され、５６×の倍率で示
す。図１Ｂｉ〜１Ｂｖｉにおける画像における莢膜性物質は、クエルング反応お
よび型特異性抗血清を用いて可視化され、４０００×の倍率で示す。

【００１２】 図２は、図２Ａ〜２Ｄを含み、捕獲（capture）ＥＬＩＳＡを用いて評価され
た単位蛋白あたりに基づく周囲の酸素と二酸化炭素濃度および不透明な表現型の
ＣＰＳ産生に対する効果を示す４枚組の棒グラフである。４種の肺炎球菌の分離
菌（図２Ａｉおよび２Ａｉｉにおける変種６Ｂ；図２Ｂｉおよび２Ｂｉｉにおけ
る変種６Ａ；図２Ｃｉおよび２Ｃｉｉにおける変種１８Ｃ；図２Ｄｉおよび２Ｄ
ｉｉにおける変種９Ｖ）の不透明（図２Ａｉ、２Ｂｉ、２Ｃｉ、および２Ｄｉ）
および透明（図２Ａｉｉ、２Ｂｉｉ、２Ｃｉｉ、および２Ｄｉｉ）変種を前記グ
ラフの酸素および二酸化炭素濃度でｍｉｄ−ｌｏｇ期（黒）または定常期（斜線
）まで成長させた。ＣＰＳ産生を音波処理された細胞ペレットおよび培養上清中
で測定し（文目付）、全細胞蛋白の量と比較して表す。「^＊」はこの変種がこの
条件下で成長しなかったことを示す。値は、２回繰り返した２つの別の実験の平
均値を表す。

【００１３】 図３は、図３Ａおよび３Ｂを含み、ウェスタン分析において周囲の酸素および
二酸化炭素濃度および不透明表現型のＣｐｓＤのチロシンリン酸化反応に対する
影響を示す一対の画像である。固形培地上で成長させ、等しい濃度に調節した後
に、肺炎球菌変種Ｐ３０３のＯ（レーン１〜４）およびＴ（レーン５〜８）形の
全細胞溶解物を除去した。図３Ａの画像は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、
膜に移され、リン酸化チロシンと特異的に結合する４Ｇ１０で表されるモノクロ
ーナル抗体でイムノブロットされたこれらのサンプルにおける蛋白を表す。図３
Ｂの画像は、等しいローディングを示すために、全肺炎球菌に対して成長させた
抗血清を用いてイムノブロットされた二重膜を表す。溶解させ、レーンにかけら
れた細胞に対応する成長条件は次の通りであった：レーン１および５において、
＜０．１％Ｏ_２／１０％ＣＯ_２；レーン２および６において、１６％Ｏ_２／３％
ＣＯ_２；レーン３および７において、２１％Ｏ_２／＜０．１％ＣＯ_２；レーン４
および８において、１９％Ｏ_２／１０％ＣＯ_２。図３Ａにおける矢印は、２５ｋ
ＤのＣｐｓＤバンドの位置を示す。サイズマーカーはキロダルトンで表す。

【００１４】 図４は、ノザン（Nothern）分析により評価された周囲の酸素および二酸化炭
素濃度および不透明表現型のｃｐｓＤの転写に対する影響を示す。肺炎球菌変種
Ｐ３０３のＯ（レーン１および２）またはＴ（レーン３および４）形から得られ
た全ＲＮＡをホルムアミドゲル上で分離し、血清型４肺炎球菌から得たｃｐｓＤ
の放射標識されたフラグメントを用いてプローブした。ＲＮＡが単離される細菌
を＜０．１％Ｏ_２／１０％ＣＯ_２(レーン１および３)または２１％Ｏ_２／＜０．
１％ＣＯ_２（レーン２および４）下で成長させた。サイズマーカーはキロダルト
ンで表されたＲＮＡ基準である。

【００１５】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は、肺炎球菌により産生される莢膜多糖類（ＣＰＳ）の量は、これらが
維持される培地の酸素および二酸化炭素濃度を調節することにより調節すること
ができるという本発明者による発見に関する。ストレプトコッカス・ニューモニ
エにおけるＣＰＳ産生はＣｐｓＤ蛋白の存在およびこの蛋白の翻訳後修飾により
調節されるということも本発明者が発見した。これらの発見に基づいて、本発明
は肺炎球菌によるＣＰＳ産生を調節する方法（例えば、抗肺炎球菌ワクチンおよ
び他の免疫原性調製物の産生において使用するため）、肺炎球菌感染症を軽減す
るための方法、および肺炎球菌感染症を軽減するために有用な薬剤を同定するた
めの方法を包含する。

【００１６】定義 本明細書において用いられる場合、次の用語はこの項におけるこれに関連する
意味を有する。 冠詞「ａ」および「ａｎ」は本明細書において用いられる場合、１または１以
上の（すなわち、少なくとも１の）該冠詞の文法上の対象を意味する。例として
、「ａｎ」は１または１より多くの成分を意味する。 「標準的な」空気とは、湿度に関係なく（すなわち、乾燥基準）選択された位
置で大気のほぼ平均的な含量を有する気体を意味する。大気の平均的含量は約７
８Ｎ_２、２１％Ｏ_２、１％Ａｒ、および０．０４％未満のそれぞれＣＯ_２、Ｈ_２ 、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｋｒ、およびＸｅである。

【００１７】記載 肺炎球菌による莢膜多糖類（ＣＰＳ）の産生が細胞の周囲において存在する酸
素および二酸化炭素の存在および濃度により影響を受けることが見出された。特
に、周囲の酸素含量が減少するにつれ、ＣＰＳの産生は増大し；周囲の二酸化炭
素含量が増大するにつれ、ＣＰＳの産生量も増大する。これらは、ストレプトコ
ッカス・ニューモニエの培養物を用いて観察されたが、他のストレプトコッカス
種（たとえば、ストレプトコッカス・アガラクティエ）などの肺炎球菌に類似し
た莢膜および莢膜遺伝子特性を示す生物、スタフィロコッカス・アウレウス（St
aphylococcus aureus）、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)
、およびアシネトバクター・ジョンソンニ(Acinetobacter johnsonii)などの他
の被包性生物、ならびにこれらのうちの１またはそれ以上に対して表現型類似性
、遺伝子型類似性、または両方を示す生物に対しても適用することができる。生
物がストレプトコッカス・ニューモニエである場合、これは６Ａ、６Ｂ、１８Ｃ
、および９Ｖのうちの一つなどのそのＣＰＳの同一性により特徴づけられる変種
を包含する公知のものまたは今後発見されるその変種であってもよい。

【００１８】 かかる方法により培養された肺炎球菌によるＣＰＳの産生を増大（または所望
により減少）させるために、これらの観察を、肺炎球菌を培養する任意の公知方
法、または今後開発される任意の方法と関連させて用いることができる。本発明
は、公知方法に従って肺炎球菌を培養することにより得られるＣＰＳの収率を増
大させる方法を包含する。該改良法は、肺炎球菌がその中または上に維持される
培地の酸素含量を、肺炎球菌の培養中の培地における通常の酸素含量と比べて減
少させることを含む。たとえば、肺炎球菌をゼラチン状または半固形培地上ある
いは液体培地中で培養するのが一般的であり、該培地は濾過された（または別の
方法で滅菌された）標準的な空気と接触した状態に維持される。

【００１９】 肺炎球菌によるＣＰＳの産生は、培地が接触した状態に維持される気体の酸素
含量を減少させる（乾燥基準）ことにより増大させることができる。酸素含量を
減少させる程度は重要ではないが、一般的にいって、酸素含量の減少が大きいほ
どＣＰＳの収率の増大が大きくなる。気体の酸素含量は好ましくは＜１６％であ
るか、または気体が実質的に嫌気性（たとえば、＜０．１％Ｏ_２を含有）になる
地点まで減少させる。気体の酸素含量を減少させる方法は重要ではない。気体の
酸素含量を標準的な空気の酸素含量よりも低くなるように減少させる適切な方法
は、培養容器を所望の酸素含量を有する気体でフラッシュする（少なくともはじ
めに、別法として、断続的、周期的、または連続的に）ことを含む。たとえば、
約７１％Ｎ_２、１９％Ｏ_２、および１０％ＣＯ_２を含む気体混合物、または９５
％Ａｒおよび５％ＣＯ_２を含む混合物で培養容器をフラッシュすることができる
。

【００２０】 肺炎球菌によるＣＰＳの産生は、その上またはその中で肺炎球菌が維持される
培地と接触した状態に維持される気体の二酸化炭素の含量を増大させることによ
っても増大させることができる。該気体の二酸化炭素含量を増大させる程度は重
要ではないが、一般的にいって、二酸化炭素含量の増加が大きいほど、ＣＰＳの
収率の増加が大きくなる。該気体の二酸化炭素含量は好ましくは少なくとも５％
、または少なくとも約１０％であるが、培地が二酸化炭素で飽和するほど高くて
もよい。前記のように、肺炎球菌が培養される容器を所望の二酸化炭素含量を有
する気体でフラッシュすることにより、所望の二酸化炭素含量を達成することが
できる。別法として、炭酸塩または重炭酸塩を培地中に組み入れることによるか
、または塩などを培地に添加することにより、二酸化炭素を培地に提供すること
ができる。

【００２１】 本発明は、肺炎球菌がその中に維持される培地の二酸化炭素含量を増加させる
ことによるか、該培地と接触する気体の二酸化炭素含量を増加させるか、該培地
の酸素含量を減少させることによるか、該培地と接触する気体の酸素含量を減少
させることによるか、またはこれらの任意の組み合わせにより、肺炎球菌による
ＣＰＳ産生を増加させる方法を包含する。一例において、培地（または培地と接
触する気体）のＯ_２／ＣＯ_２含量は、一期中の肺炎球菌細胞の収率を最大にする
ように調整することができ、その後、第二期中のＣＰＳの産生を最大にするため
に再調節することができる。

【００２２】 培地と接触する気体の酸素含量を減少させることにより、溶解または非溶解気
体の平衡化のために、その上またはその中で肺炎球菌が維持される培地の酸素含
量が減少する。気体の二酸化炭素含量を変更することも同様の効果がある。気体
が培地中に溶解する速度および非溶解気体が平衡化する速度は、たとえば、培地
−気体界面の表面積、培地の粘度、および培地の攪拌程度を包含する当該分野に
おいて公知の多くの要素に依存する。

【００２３】 肺炎球菌は、培地（例えば、液体培地）中に維持することができ、該培地と気
相間の界面がもしあるならば最小限に抑えられる。かかる培養系において、気相
の含量を変更することは、気相から液体中への気体の拡散が限定されているため
に、気相の含量を変更することは、液体培地の気体含量に対する影響が比較的小
さい。かかる系において、液体培地の気体含量は、該培地を調製するために用い
られる方法により影響を受ける可能性がある。たとえば、実質的に嫌気性である
液体培地は、液体培地を調製し、これをオートクレーブ（その熱により実質的に
すべての酸素を液体から追い出す）内で滅菌し、加圧滅菌された培地を、無酸素
気体の定常流を通した密閉容器中などの無酸素雰囲気中で冷却することにより調
製できる。適当な無酸素気体の例としては、純粋なアルゴン、５〜１０％ＣＯ_２ と混合されたアルゴン、純粋な窒素、またはＮ_２、ＡｒおよびＣＯ_２の組み合わ
せが挙げられる。非常に高度の嫌気性が望ましい場合（［Ｏ_２］＜＜０．１％）
、当該分野において一般的な方法を用いて、冷却しながら培地上を通過する無酸
素気体を加熱された銅コイルまたは網を通してまたはその上を通すことができる
。もちろん、所望の気体含量を有する固体、ゼラチン状、および半固形培地の調
製に同様の方法を用いることができる。

【００２４】 酸素含量、二酸化炭素含量、またはその両方を調節するために培地に播種する
ために用いられる接種物として適当な肺炎球菌変種および形態を選択することに
よってもＣＰＳ産生を向上させることができる。肺炎球菌の異なる変種は構造的
に異なるＣＰＳを産生することができると理解される。本明細書において記載す
る方法は、任意の肺炎球菌変種を用いてＣＰＳ産生を向上させるために用いるこ
とができる。さらに、多くの肺炎球菌は少なくとも２の表現型を示すと理解され
る。これらの形態は、不透明（Ｏ）形および透明（Ｔ）形を包含し、不透明形は
一般に、より多量のＣＰＳを産生することを特徴とする。従って、ＣＰＳ産生は
、接種物としてより高いＣＰＳ産生により特徴づけられる肺炎球菌の変種の一形
態を選択することによりさらに向上させることができる。

【００２５】 当該分野において一般的な方法を用いて肺炎球菌ワクチンおよび他の免疫原性
調製物を調製するために、本明細書において記載される１またはそれ以上の方法
を用いて産生されるＣＰＳを（単独または他の肺炎球菌ＣＰＳ種と組み合わせて
）用いることができる。かかる方法は、一般的に、肺炎球菌細胞からＣＰＳを分
離し、所望により残存する肺炎球菌細胞を殺し、ＣＰＳを医薬的に許容される担
体（および所望により免疫学的アジュバント）と組み合わせることを含む。かか
る調製物は、肺炎球菌による感染症に対する動物の免疫反応を向上させる目的で
動物に投与することができる。

【００２６】 肺炎球菌ＣＰＳは肺炎球菌が動物（例えば、ヒト）における免疫防御を回避す
ることを可能にすると考えられるので、ＣＰＳ産生を抑制する方法は、動物にお
ける肺炎球菌感染症を軽減するために用いることができる。この方法で軽減する
ことができる肺炎球菌感染症（およびこれから生じる合併症）としては、肺炎（
特に肺炎双球菌性肺炎）、菌血症、敗血症、髄膜炎、細菌性心内膜炎、連鎖球菌
性分泌性咽頭炎、蜂巣炎、および内臓膿瘍が挙げられる。 環境における酸素含量を増加させることにより肺炎球菌ＣＰＳ産生が減少し、
これにより免疫系に対する肺炎球菌の感受性が増大することが見出された。同様
に、環境における二酸化炭素含量を減少させることにより肺炎球菌ＣＰＳ産生が
減少することが見出された。

【００２７】 肺炎球菌感染症およびその副作用および合併症は、かかる感染症にかかってい
る動物を大気より高い濃度の酸素を有する気体と接触した状態に維持すことによ
り軽減することができる。別法として、感染部位での酸素圧力は、該部位での通
常の酸素圧力と比べて増大させることができる（たとえば、純粋な酸素または滅
菌空気を直接、動物の体内にある感染部位｛たとえば、肺炎球菌を含む内臓膿瘍
｝に提供することによる）。たとえば、身体部位が肺である場合（たとえば、肺
炎球菌性肺炎に関して）、通常の酸素圧力は通常の空気の圧力である。肺炎球菌
性肺炎は、たとえば人工呼吸装置または標準的酸素マスクを用いて大気より高い
濃度の酸素を患者の肺に提供することにより軽減することができる。

【００２８】 肺炎球菌感染症およびその副作用および合併症は、動物における感染部位での
二酸化炭素圧力をかかる感染部位での通常の二酸化炭素圧力よりも低く、好まし
くは肺炎球菌感染症の非存在下でも身体部位での通常の二酸化炭素圧力よりも低
く減少させることによっても軽減することができる。肺以外の体内の部位での二
酸化炭素圧力を減少させることは、身体部位を通して、その上、またはその上方
に滅菌気体流を提供することを含むことができる。感染部位が肺である場合、患
者の自発的動作によるかまたは人工的に（たとえば、ベンチレーターまたは呼吸
促進剤を使用して）吸入速度を増加させることにより二酸化炭素圧力を低下させ
ることができる。

【００２９】 実施例にさらに詳細に記載するように、肺炎球菌における増大したＣＰＳ産生
は、ｃｐｓＤ遺伝子の低い発現およびＣｐｓＤ蛋白のリン酸化反応の程度が低い
ことと相関する。ＣＰＳの産生は、従って、ｃｐｓＤの発現を増加させるか、Ｃ
ｐｓＤのリン酸化反応の程度を増加させるか、またはその両方である薬剤により
向上させることができる。反対に、ＣＰＳの産生は、ｃｐｓＤの発現を抑制また
は減少させるか、ＣｐｓＤのリン酸化反応を抑制するか、リン酸化した肺炎球菌
の脱リン酸化反応を向上させるか、またはこれらの組み合わせである薬剤により
抑制することができる。前記のように、動物における感染症に関与する肺炎球菌
におけるＣＰＳ産生を減少させることにより、これらの肺炎球菌を動物の免疫系
による攻撃をさらに受けやすくすることができる。

【００３０】 本発明は、試験化合物が肺炎球菌ＣＰＳ産生の抑制物質であるかどうかを評価
する方法および試験化合物が肺炎球菌ＣＰＳ産生のエンハンサーであるかどうか
を評価する方法を包含する。これらの方法のそれぞれにおいて、肺炎球菌細胞は
試験化合物の存在下で維持され、試験化合物の非存在下で別々に、好ましくは同
様に維持される。試験化合物のＣＰＳ産生に対する直接的影響は、試験化合物の
存在下および非存在下で細胞により産生されるＣＰＳの量を評価することにより
評価することができる。別法として、ｃｐｓＤの発現のレベル（対応するＲＮＡ
または対応する蛋白のいずれかの産生を測定することにより評価）またはＣｐｓ
Ｄのリン酸化反応の程度（ＣｐｓＤ中に存在するリン酸化チロシン残基の数また
は少なくとも１個のリン酸化チロシン残基を有するＣｐｓＤのフラクションのい
ずれかを測定することにより評価）を前記のように評価し、ＣＰＳ産生の抑制ま
たは向上と相関させる。

【００３１】引用文献 本出願において言及した刊行物は以下の通りである。 Arrecubieta et al., 1995, Gene 167:1-7 Austrian et al., 1966, J. Bacteriol. 92:1281-1284 Auzat et al., 1999, Mol. Microbaiol. 23:1018-1028 Avery et al., 1931, J Exp. Med. 54:73 Avery et al., 1944, J Exp. Med. 79:137-175 Caparon et al., 1992, J. Bacteriol. 174:5693-5701 Chen et al., 1988, Gene 164:155-164 Cundell et al., 1995, Nature 377:435-438 Cundell et al., 1995, Infect. Immun. 63:757-761 Gibson et al., 1993, Infect. Immun. 61:478-485 Hammerschmidt et al., 1996. Mol. Microbiol. 20:1211-1220 Howden, 1976, J. Clin. Pathol. 29:50-53 Ianneli et al., 1999, J. Bacteriol. 181:2652-2652 Ilan et al., 1999, EMBO J. 18:3241-3248 Kim et al., 1998, J. Infect. Dis. 177:368-377 Kim et al., 1999, Infec. Immun. 67:2327-2333 Knecht et al., 1970, J. Exp. Med. 132:475-487 Levin et al., 1998, Mol. Microbiol. 30:209-219 MacLeod et al., 1950, J. Exp. Med. 92:1-9 Modde, 1978, Experimentia 34:1285-1286 Neufeld, 1902, Z. Hyg. Infektionskr. 40:54 Raz et al., 1997, Clin. Infect. Dis. 24:1164-1168 Ring et al., 1998, J. Clin. Invest. 102:347-360 Rosenow et al., 1997, Mol. Microbiol. 25:819-829 Saluja et al., 1995, Mol. Microbiol. 16:215-227 Schrager et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:1954-1958 Sellin et al., 1995, Microb. Pathogen. 18:401-415 St. Geme III et al., 1991, Infect. Immun. 59:1325-1333 Stevenson et al., 1996, J. Bacteriol. 178:4885-4893 Throup et al., 2000, Mol. Microbiol. 35:566-576 Tomasz, 1964, Bacteriol. Proc. 64:29 Tuomanen et al., 1995, New Eng. J. Med. 332:1280-1284 Vincent et al., 1999, J. Bacteriol. 181:3472-3477 Wani et al., 1996, Infect. Immun. 64:3967-3974 Watson et al., 1990, Infect. Immun. 58:3135-3138 Weiser, 1998, Microb. Drug Resist. 4:129-145 Weiser et al., 1994, Infect. Immun. 62:2582-2589 Weiser et al., 1999, Infect. Immun. 67:3690-3692 Weyand et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:3192-3200

【００３２】 （実施例） 本発明を次の実施例を参照して説明する。この実施例は、説明のみの目的で提
供され、本発明はこの実施例に限定されず、むしろ本明細書に提供された記載の
結果として明らかであるすべてのバリエーションを包含する。ストレプトコッカス・ニューモニエによる莢膜多糖類発現の酸素依存性はＣｐｓ Ｄの翻訳後修飾と関連する この実施例において行われた実験は、肺炎球菌間の不透明表現型における違い
（すなわち、Ｏ−形対Ｔ−形）は酸素の環境濃度により影響を受け、嫌気性成長
条件、例えば、肺炎におけるものはＯ−形肺炎球菌のＣＰＳの発現を増大させ、
免疫クリアランスを回避する能力に影響を及ぼす。

【００３３】 この実施例において提示された実験において用いられる物質および方法を説明
する。細菌種および成長条件 この研究において使用したエス・ニューモニエの株を表Ｉに示し、記載されて
いるように、これらはすでに記載した臨床分離菌Ｐ３０３（６Ａ型）、Ｐ３２４
（６Ｂ型）、Ｐ６８（１８Ｃ型）およびＰ１０（９Ｖ型）のＯおよびＴ変種を含
んでいた（Kimら、１９９８；Weiserら、１９９４）。細菌を密封されていない
容器中で、半合成（Ｃ＋Ｙ培地、ｐＨ８．０）またはトリプシン大豆培地中で記
載されているようにして振とうせずに３７℃で成長させた(Tomasz, 1964)。ブロ
ス培養物を、１％（ｗ／ｗ）寒天を含む標準的トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）プ
レート上にプレートし、その上に５０００単位のカタラーゼ（Worthington Bioc
hemical, Freehold, NJから入手）を広げた。接種された培地を特に記載しない
限りろうそく消光瓶中で３７℃でインキュベートした。コロニーの形態をこのＴ
ＳＡ培地上で、記載されているような倍率および傾斜透過照明下で測定した（Wi
serら、１９９４）。

【００３４】

【表１】 表Ｉ 肺炎球菌株および変異株のホスホチロシンと特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体との反応性 ７ 各株／変種について、酸素の存在下で成長させたＯ表現型を試験した。 「＋」は２５〜２７ｋＤの単一のバンドとの反応性を示す。

【００３５】 好気性条件下でＣＯ_２インキュベーターを用いて周囲の二酸化炭素濃度を調節
した。嫌気性成長条件は、ＢＢＬ ＧａｓＰａｋシステムを用いて、製造業者の
指示に従って得た(Becton Dickinson,Cockeysville,MD)。いくつかの実験におい
ては、１０％二酸化炭素雰囲気を得るためにシステムの重炭酸ナトリウム成分を
用い、また他の実験においては用いなかった。細菌を収穫した後、増殖培地のｐ
Ｈを測定して、これらの異なる培養条件により影響を受けなかったことを確認し
た。

【００３６】 臨床試験片の分析を同様の方法を用いて行った。髄膜炎にかかっている５０２
人の患者すべてを調査し、その約２０％が細菌学的に肺炎球菌性髄膜炎であるこ
とが判明した。肺炎球菌性髄膜炎の臨床的診断の予測を行った患者から鼻咽頭ス
ワブサンプルを集めた。このサンプルを５％ヒツジ血液寒天および５０００単位
のカタラーゼを含むトリプシン大豆寒天上に直接プレートし、該プレートを５％
ＣＯ_２を含む空気雰囲気中で３７℃でインキュベートした。脳脊髄液（ＣＳＦ）
サンプルも血液寒天および透明プレート上にプレートし、４８時間まで標準的好
気性インキュべーションした後に肺炎球菌が観察された培養された患者の血液サ
ンプルも培養した。最初に、血液寒天上で典型的な形態を示した分離菌をＧｒａ
ｍ染色およびクエルング反応により肺炎球菌であることを確認した。すべての分
離菌を−８０℃で細菌プレザーバー中に保存し、コロニーの形態を本明細書に記
載したようにして確認した。鼻咽頭および侵襲性部位培養物におけるＴおよびＯ
表現型の比率の統計的相違をフィッシャーの完全試験（Fisher's Exact Test）
を用いて調べた。

【００３７】遺伝的形質転換 被包性および非被包性肺炎球菌を記載されているようにして自然の形質転換に
対して免疫反応を起こし得るようにした（Weiserら、１９９９）。エリスロマイ
シンを含む培地（１ミリリットルあたり１マイクログラム）からコロニーを選択
することにより、二成分シグナル変換システム（ＴＣＳＴＳ）における突然変異
をＰ３０３株中に形質転換した。被包性形質転換体を変更されたコロニーの形態
についてスクリーンし、ＣＰＳの発現を型特異性抗血清（Statens Seruminstitu
t, copenhagen, Denmarkから入手）を用いたクエルング反応により確認した。

【００３８】クエルング反応 肺炎球菌莢膜を、半合成培地中、様々な条件下で、ｍｉｄ−ｌｏｇ期まで成長
させた細菌において可視化させた。クエルング反応のために、等体積の培養物お
よびタイプ６の抗血清およびStatens Seruminstitute(Copenhagen, Denmark)か
ら入手した１％（ｗ／ｖ）メチレンブルーを含む組成物を記載されているように
してスライドガラス上で１分間混合した（Neufeld, 1902）。ＣＰＳの定量 Ｏ−およびＴ−形肺炎球菌変種を半合成培地中でｍｉｄ−ｌｏｇ期（Ａ_６２０ ＝０．３）まで、または１６時間（この時点で細胞は定常期にあった）成長させ
た。２０００×ｇでの遠心分離により細胞を収穫し、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢ
Ｓ）中で洗浄し、０℃で１０秒間隔で３回音波処理し、−２０℃で貯蔵した。記
載されているようにして、選択された条件下で成長させた変種中に存在するＣＰ
Ｓの量を定量するために、捕獲ＥＬＩＳＡ技術を用いた（Kimら、１９９８）。
型特異性ウサギ抗血清（Statens Seruminstitute, Copenhagen, Denmarkから入
手）を１モル濃度Ｎａ_２ＣＯ_３（ｐＨ９．６）中１：５０００の希釈度で用い、
室温で一夜マイクロタイタープレート中のウェルの壁に固定した。各インキュべ
ーション段階間で、プレートをＴｒｉｓ緩衝液（１０ミリモルＴｒｉｓ、１５０
ミリモルＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、および０．０２％（ｗ／ｖ）アジ
化ナトリウムを含む）で５回洗浄した。Ｂｒｉｊ３５（ポリオキシエチレン（２
３）ラウリルエーテルＣ_１２Ｈ_２５（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２３ＯＨ）は界面活性剤
である。タイプ６Ｂ、６Ａ、１８Ｃまたは９Ｖ肺炎球菌から得られる精製ＣＰＳ
は公知濃度で使用し、標準として使用するためにAmerican Type Tissue Collect
ion（Rockville, MD）から購入した。音波処理された細胞サンプルにおけるＣＰ
Ｓを、ＨＡＳＰ４（タイプ６Ａおよび６ＢのＣＰＳと特異的に結合する）、ＨＡ
ＳＰ２２（タイプ１８ＣのＣＰＳと特異的に結合する）およびＨＡＳＰ３３（タ
イプ９ＶのＣＰＳと特異的に結合する）と称するモノクローナル抗体を用いて検
出し、パイロット試験において決められた濃度で使用した。マウスＩｇＭと特異
的に反応し、アルカリホスファターゼと接合する抗血清を用いて、モノクローナ
ル抗体とＣＰＳの結合を検出した。この試薬を記載されているように使用した（
KimおよびWeiser、１９９８）。全細胞蛋白定量を、音波処理された細胞抽出物
についてミクロ−ビシンコニニン酸キットを用いて製造業者の指示に従って全細
胞蛋白定量を行った (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)。上清フラクション
中のＣＰＳの量は対応する細胞音波処理フラクション中の蛋白濃度に基づく（す
なわち、単位蛋白あたりにもとづいてＣＰＳ含量を標準化するため）。 細胞音波処理物中の全テイコン酸の量を比較するために使用した捕獲ＥＬＩＳ
Ａ法はすでに記載されている（Kimら、1998）。すべての実験は二重反復試験に
おいて行い、少なくとも３回繰り返した。結果を全細胞蛋白濃度あたりの平均値
として表す。

【００３９】ウェスタン（Western）分析 前記のようにカタラーゼを補足したトリプシン大豆寒天上で細菌を成長させた
。選択された条件下で、３７℃で１６時間成長させた後、滅菌Ｄａｃｒｏｎスワ
ブを用いて細胞を表面から除去し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、Ａ_６２０＝０．５と
なるように細胞密度を調節するためにＰＢＳ中で洗浄した。遠心分離後、ペレッ
ト化された細胞をＬａｅｍｍｌｉゲル添加緩衝液中に再懸濁させ、１００℃まで
５分間加熱した。サンプルを１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後、記載されているようにＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ膜に移した（Waniら、１９９６）。 ４Ｇ１０と称するモノクローナル抗体（Upstate Biotechnology Inc., Waltha
m,MA）を１：２０００の希釈度でＴＳＢＰ緩衝中用いてイムノブロッティングを
行い（Waniら、１９９６）、ブロットされたサンプルのこの抗体との反応性を、
記載されているようにしてアルカリホスファターゼと接合したマウスＩｇＧ抗血
清を用いて検出した（Kimら、１９９９）。ほぼ同数の細菌のローディングを、
すでに記載されている全肺炎球菌に対して成長させた抗血清を用いて二重膜のイ
ムノブロッティングにより確認した（Waniら、１９９６）。

【００４０】ノザン分析 記載されているようにして、大気および嫌気性条件下で半合成培地中、ｍｉｄ
−ｌｏｇ期まで成長させたＰ３０３株細胞のＯおよびＴ変種から全ＲＮＡを単離
し、精製した（Weyandら、２０００）。ホルムアミドゲル上でＲＮＡを分離した
後、エチジウムブロミド染色されたＲＮＡを撮影し、ＲＮＡサイズマーカーと比
較するために画像をデジタル化した。ＶａｃｕＧｅｎｅ ＸＬシステムを用いて
製造業者の指示に従ってＲＮＡを膜に移した（Pharmacia LKB Biotechnology, U
ppsala, Sweden）。０．５モルＮａＰＯ_４（ｐＨ７．２）、１．５ミリモルＥＤ
ＴＡ、および７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む溶液中、６５℃で１５分間、膜を予備
ハイブリッド形成させた。ｃｐｓ４Ｄ遺伝子の内部フラグメントからプローブを
調製し、次の配列： ５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＡＣＡＡＡＴＡＴＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＧＡＧ
ＡＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１）および ５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＧ−
３’（配列番号２） を有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、タイプ４株からゲノムＤＮＡ
を得た。該株はInstitute for Genomic Researchによる全ゲノム配列決定におい
て使用されたものと同じ株である。制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩを用いてＰＣＲ産物を消化し、その後、ポリリンカーと隣接する転写タ
ーミネーターを有するベクター中にクローンして、連鎖球菌配列のクローニング
を許容した。このベクターは、ｐＵＫ４Ｋの平滑末端カナマイシン耐性カセット
（Pharmacia, Upsalla, Sweden）を平滑末端ＣｌａＩ部位中に挿入して、イー・
コリにおけるこのマーカーの選択を許容することによりｐＪＤＣ９から構築した
（ChenおよびMorrison、１９８８）。ｃｐｓ４ＤフラグメントをＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩ消化ベクター中に挿入し、イー・コリＤＨ５α株中に形質転換した
。全ＲＮＡを、大気および嫌気性条件下でトリプシン大豆培地中ｍｉｄ−ｌｏｇ
期まで成長させたＰ３０３株の肺炎球菌ＯおよびＴ変種から抽出した。

【００４１】 この実施例において行った実験の結果を記載する。ヒトにおける表現型変種の選択 ヒトにおける保菌および菌血症における異なる肺炎球菌表現型について選択が
起こるかどうかを試験するために、同じ血清型の対になった分離菌を敗血症の徴
候を示している患者の鼻咽腔および血液から入手した。不透明度と関連性のない
コロニー形態における株間の異種性のために、対になった分離菌を得ることが必
要であった。いったん抗生物質治療が開始されると、肺炎球菌を菌血症の患者の
鼻咽腔から単離することができなかった。鼻咽腔および血液の培養物は従って実
質的に同時に入手した。この制約のために、十分な数の対になった分離菌を得る
ために、実験を肺炎球菌性菌血症の発生率が高い地域において行うことが必要と
された。

【００４２】 血液および鼻咽腔分離菌をブランタイア（マラウイ）の１９人の成人患者から
入手し、分離菌がその後、型特異性抗血清を用いたクエルング反応により同じタ
イプのものであることが証明されれば、対になった分離菌と見なした。対になっ
た分離菌のほとんどは１型であり、これは表ＩＩにおいて示すように、この地域
における最も一般的なタイプである。患者のほとんどはヒト免疫不全ウイルスで
の感染についても試験すると陽性であり、これはこれらの患者の間で侵襲性肺炎
球菌性疾患の発生率が高いためであると考えられる。１９対の分離菌のうち、１
７（８９％）が鼻咽腔中のＴ表現型のものであり、一方１２（６３％）が血液中
のＯ表現型のものであった。２部位から入手される肺炎球菌の表現型が一致しな
かった１０対の分離菌のすべてが鼻咽腔においてよりＴ−様の表現型を示した（
ｐ＜０．００１）。このことは一般に、自然の菌血症感染において鼻咽腔におけ
る優勢なＴ−様集団の中から得られるよりＯ−様な表現型が血液中に存在する結
果となる表現型の変種が選択されることを立証する。

【００４３】

【表２】 注：１ ４／１９の侵襲性分離菌を血液ではなく脳脊髄液から入手した。 ２ Ｎ／Ａは利用できない臨床状態であることを意味する。

【００４４】ＣＰＳの量に対する酸素の効果 感染中のＯ変種および保菌中のＴ変種の選択を促進できる宿主および細菌ファ
クターを調査した。硬化した肺において起こるような低い酸素圧力はＴからＯ表
現型への変化を促進するという仮説が立てられた。タイプ６Ａ臨床分離菌Ｐ３０
３の低酸素濃度における成長は、Ｔ−からＯ−形への自発的なスイッチング速度
に影響を及ぼさなかった。しかしながら、嫌気性条件下（すなわち、高濃度の二
酸化炭素の存在下）での成長は、より大きく、より多くの粘液性コロニー形態へ
の移行と関連し、これは図１Ａにおいて示されるようにＯ変種について特に顕著
であった。

【００４５】 Ｏ−表現型を示す肺炎球菌は、Ｔ表現型を示すものよりも多量のＣＰＳを発現
するので、Ｏ形に関連するコロニーの大きさが大きいほど、この物質の産生が増
大する結果となる可能性があると考えられた（Kimら、 1998）。初期の研究にお
いて、細菌コロニーを取り巻くＣＰＳの屈折領域は、図１Ｂに示されるように、
クエルング反応およびタイプ６抗血清を用いて可視化された。この領域は、嫌気
性条件下で、１０％の二酸化炭素の存在下で成長させたＯ変種については、酸素
の存在下での同じ表現型の成長または酸素の非存在下を含む試験された任意の条
件下でのＴ変種の成長のいずれかよりも大きかった。対照的に、細菌が大気条件
下で培養された場合、莢膜物質の領域はＴ−形肺炎球菌のコロニーのまわりには
検出することができなかった。この結果から、Ｏ形の増大した量のＣＰＳを合成
する能力が確認され、酸素圧力の低下、より高い二酸化炭素圧力、またはその両
方によりＣＰＳ産生の増大が促進されることがわかった。

【００４６】 周囲の酸素および二酸化炭素濃度の影響を、図２において示すように、ＣＰＳ
の量を測定するために開発された分析法を用いて定量的に評価した（Kimら、199
8）。全細胞蛋白１ミリグラムあたりのＣＰＳの量は、本明細書に記載された捕
獲ＥＬＩＳＡを用いて評価すると、表ＩＩＩに示すように、コロニー表面積およ
びクエルング反応を用いた領域の可視化に基づいてコロニー表面積に関して計算
された莢膜体積値と相関する。ｍｉｄ−ｌｏｇ期または定常期成長のいずれかの
Ｏ形細菌はＴ−形生物と比較して細胞関連ＣＰＳの量が増大していた。嫌気性条
件下、１０％ＣＯ_２の存在下でのＯタイプ６Ａ変種の成長は、大気条件下で培養
された同じ細胞におけるＣＰＳ産生と比べて、産生されるＣＰＳの量において７
．９倍の上昇を起こした。嫌気性条件下、１０％ＣＯ_２の存在下で成長させたＴ
変種と比較して、Ｏ変種は２９倍のＣＰＳを産生した。２つの関連性のない臨床
分離菌（すなわち、タイプ６Ｂおよび１８Ｃを使用）から得られたＯおよびＴ分
離株を用いて同様の結果が得られた。

【００４７】

【表３】 ３ 同じタイプ６Ａ臨床分離菌のＯおよびＴ変種について ４ これらの値は１６時間成長後に観察されるコロニーに基づく。値は、３つの
単一のウェルの単離されたコロニーを用いて行われた測定の平均を表す。 ５ これらの値はクエルング反応および長円体の体積についての公式Ｖ＝（π／
６）ＬＷ^２を用いて明らかにされる莢膜物質に基づく。値は、単一の細胞に対応
させるために２で割った３の双菌形態についての測定値の平均を表す。「ＵＤ」
は莢膜性物質の領域が検出できなかったことを意味する。 ６ これらの値はｍｉｄ−ｌｏｇ期で液体培地中で成長させた生物の捕獲ＥＬＩ
ＳＡ評価に基づく。値は２回の別個の測定の平均である。

【００４８】 培養上清におけるＣＰＳの産生を、定常期まで成長させた後にタイプ１８Ｃ肺
炎球菌について評価した。酸素濃度が減少し、二酸化炭素濃度が増大するにつれ
、より多量の多糖類がＯ−形変種の培養上清において産生されたという観察から
、 ＣＰＳ産生の増大が、増大した酸素／減少した二酸化炭素条件下での細胞か
らのＣＰＳの放出の減少のためではなく、減少した酸素／増大した二酸化炭素条
件下での細胞によるＣＰＳの合成の増大によることがわかる。ＣＰＳの合成の増
大が減少した酸素または増大した二酸化炭素によるかを確認するために、タイプ
９Ｖの分離菌を用いた。１０％二酸化炭素の存在下で定常期まで成長させたタイ
プ９Ｖ細菌は、１０％二酸化炭素の存在下、酸素の存在下で成長させた同じ細胞
よりも、酸素の非存在下で１２倍高いＣＰＳ産生を示した。このことから、二酸
化炭素圧力ではなく酸素圧力がＣＰＳ産生の程度に影響をおよぼす主な環境的要
因であることが確認された。

【００４９】ＣＰＳ産生における変化はｃｐｓＤ／ＣｐｓＤにおける変化と相関する 次の研究段階は酸素のＣＰＳ産生に対する影響を媒介する機構を取り扱う。酸
素圧力／存在を感知し、変換するための二成分シグナル変換システムを含むこと
を試験した。タイプ３分離菌のゲノムにおいて見られる二成分シグナル変換シス
テムの１２のうちの１１においてすでに記載された顕著な突然変異が、記載され
ているようにＰ３０３株中に形質転換された（Throupら、２０００）。反応調節
ホモログにおいて突然変異を有する１０の構造物を調製し、ヒスチジンキナーゼ
ホモログにおいて突然変異を有する７の構築物も同様に調製した。Ｐ３０３にお
いて試験された１７の突然変種ホモログのそれぞれについて、クエルング反応を
用いて評価すると、細胞を嫌気性条件下で成長させた実験において、増大したコ
ロニーの大きさまたは莢膜形成の領域に対して影響はなかった。この結果から、
酸素の影響がＴＣＳＴＳにより媒介されることは起こりえないことがわかるが、
遺伝子は必須と思われるので、肺炎球菌におけるこれらのシステムのうちのひと
つを調べることができなかった。

【００５０】 ＣＰＳの発現に必要とされることが知られている位置における遺伝子を次に試
験した。ＣＰＳの量に対する酸素の効果は、複数の種類の株において観察された
ので、異なる種間で保存された遺伝子は最も可能性のある候補であると考えられ
た。莢膜部位における遺伝子のうち、最初の４つ、ｃｐｓＡ−Ｄだけが異なる種
の肺炎球菌について共通である（Iannelliら、１９９９）。タイプ３の肺炎球菌
は、表Ｉに示すように、大気条件下で成長させた場合に、粘液性コロニーを形成
し、クエルング反応により評価すると、大きな莢膜を有することが知られている
（Knechtら、１９７０）。試験した他のすべての肺炎球菌タイプと異なり、タイ
プ３株は嫌気性条件下で培養された場合に、大気条件下で培養された場合のサイ
ズと比較して、コロニーまたは莢膜のサイズの増大を示さなかった。この観察に
基づいて、タイプ３と他のタイプの座間のｃｐｓＡ−Ｄにおける差を確認した。

【００５１】 推定転写アテニュエーターをコード化するｃｐｓＡのホモログ、および未知の
機能を有する蛋白をコード化するｃｐｓＢがタイプ３カプセル化位置に存在する
（Genbank受入番号Ｚ４７２１０；Arrecubieta、１９９５）。血清型２において
ＣｐｓＣをコード化する遺伝子はタイプ３カプセル化位置において高度に保存さ
れるが、血清型３肺炎球菌において予想されるＣｐｓＤはアミノ酸６９以降（２
２６のうち）が切断されている。ＣｐｓＣおよびＣｐｓＤは肺炎球菌莢膜の発現
に必要とされ、ともに鎖長調節およびコラン酸と称する細胞外多糖類の流出に関
与するエシェリキア・コリ（Eschelichia coli）において発現される単一の蛋白
（Ｗｚｃ）に対して相同性である（Moronaら、１９９９；Stevensonら、１９９
６）。

【００５２】 イー・コリにおいて、Ｗｚｃはチロシン残基で可逆的自己リン酸化反応を受け
る（Vincentら、１９９９）。ウェスタン分析によりリン酸化チロシンが肺炎球
菌において存在することを確認するために、リン酸化チロシン残基と特異的に結
合する４Ｇ１０と称するモノクローナル抗体を用いた。約２６ｋＤの１本のバン
ドは、ＣｐｓＤの大きさの推定値であるが、タイプ６Ａ分離株の全細胞溶解物に
おいて存在していた。おなじ大きさの１本のバンドも、この実験において用いら
れたタイプ６Ｂ、１８Ｃ、および９Ｖ株の全細胞溶解物においてみられたが、タ
イプ３肺炎球菌（切断されたＣｐｓＤを有する）においては存在しなかった。こ
れらの観察から、ＣｐｓＤはチロシン残基でリン酸化可能であることがわかった
。さらに、Ｄ３９株（非被包性突然変種）とＲ６ｘ（７５０４塩基対欠失ｃｐｓ
２Ａ−Ｈを有し、そのうちのＡ−Ｄのみが他のタイプと共通である株;Iannelli
ら、 １９９９）を比較することにより、４Ｇ１０がリン酸化チロシン残基を有
するＣｐｓＤを認識する証拠が得られた。Ｒ６ｘタイプの肺炎球菌における突然
変異をある実験において、（タイプ２）Ｄ３９親株またはタイプ３株のいずれか
から得られたＤＮＡを用いて細菌を形質転換してＤ３９タイプ２遺伝子バックグ
ラウンドにおいてタイプ３または２のいずれかの莢膜を有する被包性株を得るこ
とにより補正した。

【００５３】 ４Ｇ１０がＲ６ｘおよびタイプＲ３のＲ６ｘ形質転換体と反応しないことおよ
びタイプ２のＲ６ｘ形質転換体との抗体の反応により、このバンドに対応する蛋
白の発現は、カプセル化部位における最初の４個の共通な遺伝子のうちの１個お
よびｃｐｓＤの完全なコピーを必要とすることが確認された。４Ｇ１０反応性蛋
白はサイズに基づいてＣｐｓＡまたはＢと似ていないことが確認された。タイプ
２および３ＣｐｓＣでわずか１５個の保存アミノ酸変化しか存在せず、どれもチ
ロシンを含まない。タイプ３株において４Ｇ１０反応性バンドがないことは、４
Ｇ１０反応性蛋白はＣｐｓＣでないことを示す。従って、ＣｐｓＤ蛋白は肺炎球
菌においてリン酸化可能なチロシン残基を含むと結論づけることができる。

【００５４】 様々な酸素および二酸化炭素濃度での成長がＣｐｓＤのチロシンリン酸化反応
に対して及ぼす影響を試験した。様々な酸素および二酸化炭素濃度で成長させた
Ｐ３０３と称するタイプ６Ａの肺炎球菌分離菌のＯおよびＴ形の全細胞の溶解物
を等密度に調製し、ホスホチロシン特異性モノクローナル抗体４Ｇ１０を用いて
ウェスタン分析により試験した。これらの実験の結果を図３に示す。ＣｐｓＤに
ついて予想される大きさの単一のバンドを酸素の存在下で成長させたＯ変種にお
いて検出した。図３のレーン１において示されるように、嫌気的に成長させたほ
ぼ同数の細胞から得られた抽出物と反応しなかった。図３のレーン２〜４におけ
る結果により示されるように、＜０．１〜１０％の二酸化炭素圧力における差の
明らかな効果はなかった。試験したすべての条件下（酸素＜０．１％〜２１％、
二酸化炭素＜０．１％〜１０％）で、抗体のＴ変種の細胞抽出物との反応性はわ
ずかであった。同様の結果が他の株を用いても得られた。従って、ＣｐｓＤのチ
ロシンリン酸化反応は不透明な表現型により影響を受けず、酸素の存在下での成
長が必要とされると結論づけられた。

【００５５】 チロシンリン酸化反応における差は、ＣｐｓＤの活性に影響を及ぼし、酸素の
存在下でのＯ肺炎球菌におけるＣＰＳの発現の減少の原因である。嫌気的に成長
させたＯまたはＴ肺炎球菌のいずれもリン酸化チロシンを発現しないが、２つの
表現型はＣＰＳ産生の程度において大きな差を示す。 ＯおよびＴ変種位間の違いがｃｐｓＤの転写のレベルの差によるかどうかを確
認するためにノザン分析を用いた。結果を図４に示す。全細胞性ＲＮＡが大気条
件下または１０％二酸化炭素の存在下で嫌気的に成長させた肺炎球菌Ｐ３０３株
のＯおよびＴ形から得られた。ｃｐｓＤのクローンされたフラグメントを用いて
ＲＮＡをプローブした。転写活性における定量的な差を、ｍＲＮＡにおいてｃｐ
ｓＤと放射標識されたプローブのハイブリダイゼーションを評価し、これらの値
をハイブリダイゼーション分析混合物中に存在するＲＮＡの全量について調節す
ることにより定量した。これらの実験から、酸素濃度はｃｐｓＤ転写のレベルに
実質的な影響を及ぼさないことがわかった。しかしながら、ｃｐｓＤはＯ−形細
胞と比較して、Ｔ−形細胞において３．４倍高いレベルで転写された。従って、
ｃｐｓＤの転写の調節により、肺炎球菌の不透明表現型が決まると結論づけられ
た。

【００５６】 特定の操作の理論に拘束されることを望まないが、ＣｐｓＤはＣＰＳ産生を調
節すると考えられる。ＣｐｓＤのチロシンリン酸化反応の程度においてみられる
差とＣＰＳ産生における差の間の相関性は、この理論を支持する。鎖長調節およ
び細胞外多糖類コラン酸の流出に関与するイー・コリにおけるチロシン自己リン
酸化酵素に対するそのアミノ酸配列類似性に一部基づいて、ＣｐｓＤはチロシン
キナーゼとして機能すると考えられる。Ｃｐｓ２３ＦＤはＷｚｃに対して２２９
アミノ酸のうちの１８８について３０％の同一性および４９％の類似性を有する
。血清型２３ｆ肺炎球菌のＣｐｓＤは通常でないカルボキシル末端アミノ酸配列
（ＹＧＳＹＧＮＹＧＮＹＧＫＮＫＫ；配列番号：３）を含み、これはチロシン残
基を含む繰り返し特性（ＹＧＸ）_４を含む。このカルボキシル末端は、ＣｐｓＤ
の残りよりも肺炎球菌変種のうちでかなり大きなアミノ酸配列異種性を示す。肺
炎球菌株間でのＣＰＳ産生における多様性は、株間のこのカルボキシル末端部分
の多様性に起因すると考えられ、配列の多様性は蛋白のリン酸化反応適性に影響
を及ぼす。他の多くの細菌蛋白キナーゼが同定され、これらは共通にチロシン豊
富な繰り返し特性を有するＣ−末端を有する（Ilanら、１９９９）。ＣＰＳを産
生する能力を維持しながらｃｐｓＤにおいて突然変異を有する肺炎球菌株を生成
できないことは、ＣＰＳおよび莢膜産生におけるこの遺伝子の重要性のさらなる
証拠である。

【００５７】 コロニー不透明表現型および酸素圧力に応答してＣＰＳ産生を調節するための
次のメカニズムのモデルが提案される。該モデルは、ｃｐｓＤの転写調節および
ＣｐｓＤの翻訳後修飾を含む。 ＣｐｓＤは負の調節因子であり、これは肺炎球菌型特異性ＣＰＳの生合成に関
与する遺伝子に対して作用する。比較的低いｃｐｓＤ転写は、嫌気性条件下でＯ
−タイプの肺炎球菌において発現された比較的多量のＣＰＳの原因である。高い
割合のＣＰＳ発現調節の原因であるｃｐｓＤの転写調節に加えて、第二のレベル
の調節、すなわち、ＣｐｓＤ上のチロシン残基のリン酸化反応または自己リン酸
化反応が関与する。ＣｐｓＤのリン酸化反応は、Ｏ変種にのみ影響を及ぼし、好
気性条件下での成長を必要とする。１またはそれ以上のチロシン残基でリン酸化
されたＣｐｓＤの検出可能性は、Ｔ肺炎球菌におけるホスファターゼ活性の増大
のためである。チロシンリン酸化反応は、ＣｐｓＤの負の調節活性を増大させる
ので、リン酸化されたＣｐｓＤは好気性条件下でのＣＰＳの合成を減少させる。
結果として、好気性条件下では、嫌気性成長条件下よりもＯ変種により産生され
るＣＰＳは少ない。感知できるＣｐｓＤのチロシンリン酸化反応が存在しない場
合でさえも、Ｔ−形肺炎球菌における比較的低いＣＰＳの産生は、Ｔ−形肺炎球
菌におけるｃｐｓＤの発現の増大が原因である。

【００５８】 嫌気性条件下での向上された成長についてすでに記載したことは、実際、増大
したＣＰＳ合成の影響であり、より大きなコロニーが得られる（Modde、１９７
８）。 Ｗｚｃに対してより高い類似性を有するＣｐｓＤのホモログが表面多糖類を発
現する多くの他の細菌種において存在する。かかる種の例としては、ストレプト
コッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、スタフィロコッカス
・アウレウス（Staphylococcus aureus）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebs
iella pneumoniae）、およびアシネトバクター・ジョンソンニ（Acinetobacter
johnsonii）が挙げられる。莢膜およびその大きさは毒性の重要な決定因子であ
るので、このクラスの遺伝子／蛋白の転写及び翻訳後修飾に基づいてＣＰＳの量
を調節できることは、被包性細菌がコロニー形成および感染の異なる要件に適用
される能力を助長するのに重要である。

【００５９】 本明細書において記載されたすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は
、出典明示によりその内容全体を本明細書に引用したものとする。 本発明は具体例を参照して開示したが、本発明の精神および範囲を逸脱するこ
となく本発明の様々な修正および変更が当業者によりできることは明らかである
。添付のクレームは、かかる例およびその等価な変更をすべて包含する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａｉ〜１Ａｖｉおよび１Ｂｉ〜１Ｂｖｉはクエルング反応を用い
て評価された、周囲の酸素および二酸化炭素濃度がコロニーの形態および莢膜の
大きさに及ぼす影響を示す一連の画像である。

【図２】 図２Ａ〜２Ｄは、捕獲ＥＬＩＳＡを用いて評価された単位蛋白あたり
に基づく周囲の酸素と二酸化炭素濃度および不透明な表現型のＣＰＳ産生に対す
る効果を示す４枚組の棒グラフである。

【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、ウェスタン分析において周囲の酸素および二酸
化炭素濃度および不透明表現型のＣｐｓＤのチロシンリン酸化反応に対する影響
を示す一対の画像である。

【図４】 図４は、ノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ）分析により評価された周囲の酸素
および二酸化炭素濃度および不透明表現型のｃｐｓＤの転写に対する影響を示す
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:46 Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 CA04 DA05 EA04 GA11 HA01 4B063 QA18 QA19 QQ06 QQ67 QR52 QS02 4B064 AF11 CA02 CA19 CC12 DA01 DA03 4C086 AA01 HA08 MA01 MA04 MA12 NA14 ZB35

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 肺炎球菌を増殖培地中に維持することにより肺炎球菌から莢
   膜多糖類を産生する方法において、大気より低い濃度の酸素を有する気体を増殖
   培地と接触した状態に維持することを含む改良方法。
2. 【請求項２】 気体が約１６％より高くない酸素濃度を有する請求項１記載
   の改良法。
3. 【請求項３】 気体が約０．１％より高くない酸素濃度を有する請求項２記
   載の改良法。
4. 【請求項４】 肺炎球菌がストレプトコッカス属の生物である請求項１記載
   の改良法。
5. 【請求項５】 肺炎球菌がストレプトコッカス・ニューモニエ種の生物であ
   る請求項４記載の改良法。
6. 【請求項６】 肺炎球菌が、変種６Ａ、６Ｂ、１８Ｃおよび９Ｖからなる群
   から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ種の変種である請求項５記載
   の改良法。
7. 【請求項７】 肺炎球菌を増殖培地中に維持することにより肺炎球菌から莢
   膜多糖類を産生する方法において、大気より高い濃度の二酸化炭素を有する気体
   を増殖培地と接触した状態に維持することを含む改良方法。
8. 【請求項８】 気体が少なくとも約３％の二酸化炭素濃度を有する請求項７
   記載の改良法。
9. 【請求項９】 気体が少なくとも約１０％の二酸化炭素濃度を有する請求項
   ８記載の改良法。
10. 【請求項１０】 気体が大気より低い濃度の酸素を有する請求項７記載の改
    良法。
11. 【請求項１１】 動物における肺炎球菌感染症を軽減する方法であって、該
    動物を大気より高い濃度の酸素を有する気体と接触した状態に維持することを含
    む方法。
12. 【請求項１２】 動物の肺が気体と接触した状態に維持される請求項１１記
    載の方法。
13. 【請求項１３】 気体が少なくとも約２５％の酸素濃度を有する請求項１１
    記載の方法。
14. 【請求項１４】 気体が少なくとも約５０％の酸素濃度を有する請求項１３
    記載の方法。
15. 【請求項１５】 気体が実質的に純粋な酸素である請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 感染症が、肺炎、菌血症、敗血症および髄膜炎からなる群
    から選択される請求項１１記載の方法。
17. 【請求項１７】 肺炎球菌感染症を発症する危険性のある動物に投与するた
    めの免疫原性調製物を製造する方法であって、 標準的な空気と同じ温度で平衡状態にした同じ培地よりも低い酸素含量を有す
    る増殖培地中に肺炎球菌細胞を維持し； 該細胞が産生した莢膜多糖類を該細胞から単離し、これにより単離された多糖
    類が免疫原性調製物を構成することを含む方法。
18. 【請求項１８】 肺炎球菌を増殖培地中に維持することにより肺炎球菌から
    莢膜多糖類を産生する方法において、増殖培地の二酸化炭素濃度を同じ温度で５
    ％の二酸化炭素を含む気体と平衡状態にした同じ増殖培地中の二酸化炭素濃度と
    少なくとも等しいレベルに維持することを含む改良方法。
19. 【請求項１９】 肺炎球菌多糖類を製造する方法であって、標準的な空気と
    同じ温度で平衡状態にした同じ培地よりも低い酸素含量を有する増殖培地中に肺
    炎球菌細胞を維持することを含む方法。
20. 【請求項２０】 培地が実質的に酸素を含まない請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 培地が標準的な空気と同じ温度で平衡状態にした同じ培地
    よりも高い二酸化炭素含量を有する請求項１９記載の方法。
22. 【請求項２２】 培地が二酸化炭素で飽和している請求項２１記載の方法。
23. 【請求項２３】 培地が炭酸塩または重炭酸塩を含む請求項２１記載の方法
    。
24. 【請求項２４】 試験化合物が動物における肺炎球菌感染症の軽減に有用で
    あるかどうかを評価する方法であって、 試験化合物の存在下で維持された肺炎球菌細胞におけるＣｐｓＤのリン酸化反
    応の程度および 試験化合物の存在しない下で維持された同じ型の細胞におけるＣｐｓＤのリン
    酸化反応の程度を比較することを含み、 試験化合物の存在下で維持された細胞におけるＣｐｓＤのリン酸化反応の程度
    が試験化合物の存在しない下で維持された細胞におけるＣｐｓＤのリン酸化反応
    の程度よりも低いならば、その試験化合物は感染症の軽減に有用であるとする方
    法。
25. 【請求項２５】 ＣｐｓＤのリン酸化反応の程度が、ＣｐｓＤにおいて存在
    するリン酸化チロシン残基の数を評価することにより評価される請求項２４記載
    の方法。
26. 【請求項２６】 ＣｐｓＤのリン酸化反応の程度が、少なくとも１個のリン
    酸化チロシン残基を有するＣｐｓＤのフラクションを評価することにより評価さ
    れる請求項２４記載の方法。