BRPI0109293B1 - Métodos para produzir polissacarídeo capsular a partir de um pneumococo, para produzir uma preparação imunogênica para a administração a um animal em risco de desenvolver uma infecção pneumocócica, e para produzir polissacarídeo pneumocócico - Google Patents

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“MÉTODOS PARA PRODUZIR POLISSACARÍDEO CAPSULAR A

PARTIR DE UM PNEUMOCOCO, PARA PRODUZIR UMA

PREPARAÇÃO IMUNOGÊNICA PARA A ADMINISTRAÇÃO A UM

ANIMAL EM RISCO DE DESENVOLVER UMA INFECÇÃO

PNEUMOCÓCICA, E PARA PRODUZIR POLISSACARÍDEO PNEUMOCÓCICO.” Esta pesquisa foi sustentada em parte pelos fundos do Governo U.S. (subvenções do U.S. Public Heath Service números AI38436 e AI44231), e o Governo U.S. pode, portanto, ter certos direitos sobre a invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A invenção refere-se amplamente à produção de material de polissacarídeo capsular a partir de organismos estreptocócicos e à produção de vacinas usando tal material.

Streptococcus pneumoniae, algumas vezes designado como pneumococo, é geralmente um organismo comensal, que coloniza superfície da mucosa da nasofaringe humana. Quando fatores hospedeiros permitem com que o organismo acesse o trato respiratório inferior, ocorre uma resposta inflamatória vigorosa, conduzindo a uma densa consolidação, pois os espaços de ar se enchem com exudato. A condição é comumente referida como pneumonia (Tuomanen et al., 1995). A mais séria manifestação mais séria da infecção pneumocócica é a bacteremia, que pode ser complicada pela sepsia, meningite, ou ambos. A bacteremia em adultos é usualmente uma complicação da pneumonia (Raz et al., 1997). A capacidade do pneumococo para resistir ao mecanismo principal de eliminação do organismo a partir da corrente sangüínea (isto é, opsonofagocitose) requer a expressão do fator de maior virulência do organismo, que é uma cápsula de polissacarídeo (Avery et al., 1931; Watson et al., 1990). Pneumococos são capazes de sintetizar não menos do que 90 polissacarídeos capsulares estruturalmente únicos (CPSs). O CPS pneumocócico exibe propriedades antifagocíticas e inibe a aderência a células hospedeiras, um estágio crítico no contágio (isto é, propagação do organismo a partir de um indivíduo infectado, mas não necessariamente sintomático, para outro) e possivelmente aspectos posteriores na patogênese da doença (Ring et al., 1998). Verificações similares em outras espécies encapsuladas (por exemplo, Hemophilus influenzae, Neisseria meningitis, Streptococcus pyogenes, e Streptococcus agalactiae) conduziu a uma apreciação de como as quantidades de CPS precisam ser temporariamente variadas, de modo a permitir ambas as interações adesivas com células hospedeiras e a resistência humoral (Hammerschmidt et al., 1996; Levin et al., 1998; Schrager et al., 1996; Sellin et al., 1995; St. Geme III et al., 1991).

Mesmo dentro de uma cepa única, a quantidade de CPS expressa por S. pneumoniae varia. O(s) mecanismo(s) reguladores, que modulam a expressão de CPS, não haviam sido anteriormente bem compreendidos. A maioria dos isolados pneumocócicos sofre variação fenotípica entre pelo menos duas formas, que podem ser distinguidas pela opacidade da colônia (Weiser, 1998; Weiser et al. 1994). As formas de colônia (O) opaca diferem das variantes transparentes (T) da mesma cepa pela quantidade de CPS que é sintetizada, as colônias de forma O geralmente produzindo uma maior quantidade de CPS (kim et al., 1998).

Diferenças relativamente menores na quantidade de CPS produzido por uma variante convencional podem ter um maior impacto sobre a virulência (MacLeod et al., 1950). As quantidades de CPS 1.2 a 5.6 vezes maiores produzidas pelas colônias em forma O, compradas às colônias em forma T, estão correlacionadas com a resistência aumentada de células pneumocócicas à opsonofagocitose usando soro imune (kim et al., 1999). Em um modelo murino de infecção sistêmica, apenas a variante O de várias cepas pneumocócicas causou sepsia (Kim et al. 1998). Em contraste, a forma Y expressa quantidades mais elevadas do outro polissacarídeo da superfície celular, o ácido teicóico. O ácido teicóico da parede celular pneumocócica está covalentemente ligado ao CPS e contém um constituinte tipo hospedeiro similar, fosforilcolina. Este polissacarídeo contribui para a aderência das células pneumocócicas a células epiteliais através do receptor para o fator de ativação de plaqueta (Cundell et al., 1995; Cundell et al. 1995; Kim et al. 1998). A forma T também exibe uma distribuição alterada de proteínas de ligação de colina da superfície celular, incluindo CbpA, que age para promover a aderência e a colonização (Rosenow et al. 1997). Durante o contágio em um modelo de rato infantil, existe a seleção quanto a variantes pneumocócicas, que exibem o fenótipo T, preferivelmente ao O (Wiser et al., 1994). Esta observação sugere que os pneumococos variam entre uma forma (isto é, a forma T) que exibe maior aderência e contágio, e uma forma não aderente (isto é, a forma o) que está melhor adaptada à sobrevivência em infecção invasiva. A identificação dos CPs expressos por um pneumococo constitui a base da serotipia, um procedimento de diagnóstico usado para a diferenciação de variantes de S. pneumonia. Devido ao fato de que variantes diferentes podem exibir propriedades fisiológicas diferentes (por exemplo, suscetibilidade a agentes antimicrobianos ou a taxa característica do início ou progressão da pneumonia), a capacidade para diferenciar variantes pneumocócicas é vantajosa no âmbito médico. Além disso, como a capacidade do sistema imune humano (ou de outro vertebrado) para reconhecer e atacar as variantes pneumocócicas depende de sua capacidade para reconhecer especificamente o CPS de cada variante, a capacidade para a obtenção de CPS específico para a variante pneumocócica afeta significativamente o desenvolvimento de métodos terapêuticos e preventivos associados à infecção pneumocócica. Por exemplo, vacinas pneumocócicas conhecidas compreendem o CPS obtido a partir de numerosas variantes pneumocócicas.

Permanece uma necessidade significativa quanto a composições e métodos para o diagnóstico, o prognóstico e a prevenção, úteis em relação a distúrbios associados com a infecção pneumocócica.

Muitas destas composições e métodos compreendem, empregam, ou são baseados, quanto ao se desenvolvimento, no CPS pneumocócico isolado. Métodos previamente conhecidos para isolar o CPS a partir de pneumococos são geralmente caracterizados por um baixo rendimento. A presente invenção inclui um método para melhorar o rendimento de CPS, que pode ser obtido a partir de uma variante pneumocócica, e aumenta a produção e o uso de composições e métodos para o diagnóstico, prognóstico, a terapia e a prevenção, referentes a infecções pneumocócicas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a um aperfeiçoamento em um método de produção de polissacarídeo capsular a partir de um pneumococo pela manutenção do pneumococo em um meio de crescimento. Sob um aspecto, o aperfeiçoamento compreende a manutenção de um gás tendo uma concentração subatmosférica de oxigênio em contato com o meio de crescimento (por exemplo, uma concentração de oxigênio não maior do que cerca de 16% ou não maior do que cerca de 0,1 %). O pneumococo pode ser um organismo do gênero Streptococcus, tal que um organismo da espécie Streptococcus pneumonia (por exemplo, uma das variantes S. pneumonia 6 A, 6 B e 9V). Sob outro aspecto, o aperfeiçoamento compreende a manutenção de um gás tendo uma concentração superatmosférica de dióxido de carbono e uma concentração subatmosférica de oxigênio em contato com o meio de crescimento. Em ainda um outro aspecto, o aperfeiçoamento compreende a manutenção da concentração de dióxido de carbono do meio de crescimento em um nível pelo menos igual à concentração de dióxido de carbono no mesmo meio de crescimento equilibrado na mesma temperatura com um gás compreendendo 5% de dióxido de carbono. A invenção também se refere a um método para minorar uma infecção pneumocócica em um animal. Este método compreende a manutenção do animal (por exemplo, pelo menos dos pulmões do animal) em contato com um gás tendo uma concentração superatmosférica (por exemplo, de 25%, 50%, ou 100%) de oxigênio. Exemplos de infecções, que podem ser aliviadas neste método, incluem pneumonia, bacteremia, sepsia e meningite. A invenção refere-se ainda a um método de produção de uma preparação imunogênica para a administração a um animal em risco de desenvolver uma infecção pneumocócica. Este método compreende a manutenção de células pneumocócicas em um meio de crescimento tendo um teor de oxigênio mais baixo do que o mesmo meio equilibrado na mesma temperatura com ar normal e isolamento do polissacarídeo capsular pelas células a partir das células. O polissacarídeo isolado constitui a preparação imunogênica. A invenção refere-se ainda a um método de produção de polissacarídeo pneumocócico. Este método compreende a manutenção das células pneumocócicas em um meio de crescimento tendo um teor de oxigênio mais baixo do que o mesmo meio equilibrado na mesma temperatura com ar normal, por exemplo, um meio substancialmente isento de oxigênio. Em uma modalidade, o meio possui um teor de dióxido de carbono, que é maior do que o mesmo meio equilibrado na mesma temperatura com ar normal, por exemplo, um meio saturado com dióxido de carbono ou um meio compreendendo um sal de carbonato ou bicarbonato. A invenção inclui um método de avaliação de se um composto de teste é útil para minorar uma infecção pneumocócica em um animal. Este método compreende comparar, (a) o grau de fosforilação de CpsD em células pneumocócicas mantidas na presença do composto de teste e (b) o grau de fosforilação de CpsD no mesmo tipo de células mantidas na ausência do composto de teste.

Se o grau de fosforilação de CpsD nas células mantidas na presença do composto de teste for inferior ao grau de fosforilação de CpsD nas células mantidas na ausência do composto de teste, então o composto de teste é útil para minorar a infecção. O grau de fosforilação de CpsD pode, por exemplo, ser avaliado pela avaliação de um número de resíduos de tirosina fosforilados presentes em CpsD ou pela avaliação da fração de CpsD tendo pelo menos um resíduo de tirosina fosforilado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1, que compreende lAi -lAvi e ÍBi-lBvi, constitui uma série de imagens, que indicam o efeito da concentração de dióxido de carbono e oxigênio ambiental sobre a morfologia da colônia e tamanho da cápsula, conforme avaliado usando a reação de Quellung. Variantes opacas (Figuras lAi, lAii, lAiii, ÍBi, ÍBii, e ÍBiii) e transparentes (Figuras lAiv, lAv, lAvi, ÍBiv, lBv, e lBvi) de um isolado pneumocócico do tipo 6 A foram desenvolvidas em ágar de nutriente T suplementado com catalase por 16 horas a 37°C sob condições atmosféricas (Figuras lAi, lAiv, ÍBi, e ‘Biv), sob condições atmosféricas compreendendo uma concentração de dióxido de carbono aumentada (Figuras lAii, lAv, 1 Bii e 1 Bv) e sob condições anaeróbicas compreendendo uma concentração de dióxido de carbono aumentada (Figuras lAiii, lAvi, 1 Biii, e lBvi). As colônias nas imagens nas Figuras lAi-lAvi foram visualizadas usando iluminação transmitida oblíqua, e são apresentadas em uma ampliação de 56 x. O material capsular nas imagens nas Figuras ÍBi-lBvi foi visualizado usando a reação de Quellung e o anti-soro específico para o tipo, e são apresentados em uma ampliação de 4000 x. A figura 2, que compreende as Figuras 2a- 2D, é um quarteto de gráficos de barra, que ilustra os efeitos da concentração de dióxido de carbono e oxigênio ambiental o fenótipo de opacidade na produção de CPS, em uma base por unidade de proteína, conforme avaliado usando um ELISA de captura. Variantes opacas (Figuras 2Ai, 2Bi, 2Ci, e 2Di) e transparentes (Figuras 2 Aii, 2Bii, 2Cii, e 2Dii) de isolados dos quatro tipos de pneumococos (variante 6B nas figuras 2Ai e 2Aii; variante 6a nas figuras 2Bi e 2Bii; variante 18C nas Figuras 2Ci e 2Cii; variante 9V nas Figuras 2Di e 2Dii) foram desenvolvidas para a fase log médio (barras sólidas) ou a fase estacionária (barras pontilhadas) em concentrações de oxigênio e dióxido de carbono acima indicadas nos gráficos. A produção de CPS foi determinada em pelotas de célula submetidas a tratamento sônico e em sobrenadantes de cultura (barras sombreadas), e é expressa com relação à quantidade de proteína celular total. indica que esta variante não cresceu sob esta condição. Os valores representam a média de sois experimentos separados em duplicata. A figura 3, que compreende as Figuras 3 A e 3B, constitui um par de imagens, que ilustram os efeitos da concentração de dióxido de carbono e oxigênio ambiental e o fenótipo de opacidade sobre a fosforilação de tirosina de CpsD em análise de Western. Lisados de célula completos das formas O (trilhas 1-4) e T (trilhas 5-8) da variante pneumocócica P303 foram removidos após desenvolvimento em meio sólido e ajustados para igual densidade. A imagem na Figura 3 A ilustra proteínas nestas amostras, que foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana e imunomanchadas com um anticorpo monoclonal designado por 4G10, que se liga especificamente com tirosina fosforilada. A imagem na Figura 3 B ilustra membranas em duplicata, que foram imunomanchadas usando anti-soro criado contra pneumococos totais, de modo a demonstrar carga igual. As condições de crescimento correspondendo às células lisadas e aplicadas às trilhas foram as que se segue: mas trilhas 1 e 5, < 0,1% O2/ 10 % C02; nas trilhas 2 e 6, 16% 02/ 3% C02; nas trilhas 3 e 7, 21% O2/ < 0,1% C02; e nas trilhas 4 e 8, 19% 02/ 10% C02. A seta na Figura 3 A indica a localização da faixa de CpsD 25 kD. Os marcadores de tamanho estão em quilodaltons. A figura 4 é uma imagem, que ilustra os efeitos das concentrações de dióxido de carbono e oxigênio ambiental e o fenótipo de opacidade quando da transcrição de cpsD, conforme avalisado por análise de Northern. O RNA total obtido a partir das formas O (trilhas 1 e 2) ou T (trilhas 3 e 4) da variante pneumocócica P303 foi separada em um gel de formamida e testada usando um fragmento rádio-rotulado de cpsD obtido a partir de um pneumococo de serótipo 4. As bactérias, a partir das quais o RNA foi isolado foram desenvolvidas sob < 0,1% 02/10% C02 (trilhas 1 e 3) ou sob 21% O2/, 0,1% C02 (trilhas 2 e 4). Os marcadores de tamanho são padrões de RNA em quilodaltons.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção refere-se à verificação pelo inventor de que a quantidade de polissacarídeo capsular (CPS) produzida pelos pneumococos pode ser modulada pelo controle do teor de dióxido de carbono e oxigênio no meio, no qual eles são mantidos. Foi também verificado pelo invenção, que a produção de CPS em Streptococcus pneumoniae é modulada pela presença da proteína CpsD e pela modificação pós-translacional desta proteína. Com base nestas verificações, a presente invenção inclui métodos para a modulação da produção de CPS por pneumococos (por exemplo, para o uso na produção de vacinas antipneumocócicas e de outras preparações imunogênicas), métodos para minorar infecções pneumocócicas e métodos para identificar agentes úteis para minorar infecções pneumocócicas.

Definições: Como aqui usado, cada um dos termos, que se seguem, possui o significado associado a ele nesta seção.

Os artigos “um” e “um” são aqui usados para a referência a um ou mais do que um (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical pelo artigo. A título de exemplo, “ um elemento” significa um elemento ou mais do que um elemento.

Ar “normal” refere-se a um gás tendo aproximadamente o teor médio da atmosfera em uma localização selecionada, sem considerar a umidade (isto é, em uma base seca). O teor médio da atmosfera é de cerca de 78% de N2, 21% de 02, 1% de Ar, e menos do que 0,04% de cada um de C02, H2, He, Ne, Kr e Xe.

Descrição: Foi verificado que a produção de polissacarídeo capsular (CPS) por pneumococos é influenciada pela presença e pela concentração de dióxido de carbono e de oxigênio presentes no ambiente da célula. Em particular, a produção de CPS aumenta à medida em que o teor de oxigênio do ambiente diminui; a produção de CPS também aumenta à medida em que o teor de dióxido de carbono do ambiente aumenta. Embora estas observações tenham sido realizadas usando culturas de Streptococcus pneumonia, elas podem ser também aplicadas a organismos, que exibem propriedades de cápsula e de gene de cápsula similares aos pneumococos, tais que outras espécies de Streptococcus (por exemplo, Streptococcus agalactiae), para outros organismos encapsulados, tais que Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, e Acinetobacter johnsonii, e organismos que exibem similaridade fenotípica, similaridade genotípica, ou ambas, para um ou mais destes. Quando o organismo é Streptococcus pneumonia, ele pode ser qualquer variante conhecida ou aqui a seguir verificada do mesmo, incluindo variantes caracterizadas pelas identidades de seus CPS, tais que uma das variantes 6 A, 6 B, 18 C, e 9 V.

Estas observações podem ser usadas em conjunção com qualquer método conhecido de cultura de pneumococos, ou com qualquer outro método aqui a seguir desenvolvido, para aumentar (ou diminuir, se desejado) a produção de CPS por pneumococos cultivados por tais métodos. A invenção inclui um método para aumentar o rendimento do CPS obtido através da cultura de um pneumococo de acordo com um método conhecido. O método aperfeiçoado envolve a diminuição do teor de oxigênio do meio no ou sobre o qual o pneumococo é mantido, em relação ao teor de oxigênio, que normalmente está presente no meio durante a cultura do pneumococo. Por exemplo, é comum cultivar pneumococos em um meio gelatinoso ou semi- sólido ou em um meio líquido, em que o meio é mantido em contato com ar normal filtrado (ou de outro modo esterilizado). A produção de CPS por pneumococos pode ser aumentada pela diminuição (em uma base a seco) do teor de gás, com o qual o meio é mantido em contato. O grau, em que o teor de oxigênio é diminuído não é crítico, mas, falando genericamente, quanto maior for a diminuição no teor de oxigênio, maior será o rendimento aumentado de CPS. O teor de oxigênio do gás é preferivelmente < 16%, ou é diminuído ao ponto em que o gás se toma substancialmente anaeróbico (por exemplo, de tal modo que ele contenha < 0,1% de 02). O modo pelo qual o teor de oxigênio do gás é diminuído não é crítico. Métodos convenientes de redução do teor de oxigênio do gás abaixo do teor de oxigênio do gás normal incluem o varrer o vaso de cultura (pelo menos inicialmente, mas altemativamente intermitentemente, periodicamente ou continuamente) com um gás tendo o teor de oxigênio desejado. Por exemplo, um vaso de cultura pode ser varrido com uma mistura de gás compreendendo cerca de 71% de N2, 19% de 02, e 10% de C02 ou com uma mistura compreendendo 95% de Ar e 5% de C02. A produção de CPS por pneumococos pode ser também aumentada pelo aumento do teor de dióxido de carbono do gás, com o qual o meio sobre ou no qual os pneumococos são mantidos é contatado. O grau, em que o teor de dióxido de carbono do gás é aumentado, não é crítico, mas, falando em termos gerais, quanto maior for o aumento de dióxido de carbono, maior será o rendimento aumentado de CPS. O teor de dióxido de carbono do gás é preferivelmente de pelo menos cerca de 5%, ou de pelo menos cera de 10%, embora ele possa ser tão elevado que o meio de cultura seja saturado com dióxido de carbono. Como acima discutido, o teor de dióxido de carbono desejado pode ser alcançado pela varredura do vaso, no qual os pneumococos são cultiyados, com um gás tendo o teor de dióxido de carbono desejado. De modo alternativo, dióxido de carbono pode ser provido ao meio pela incorporação de um sal de carbonato ou de bicarbonato no meio, ou pela adição de tal sal ao meio.

A invenção inclui métodos para aumentar a produção de CPS por pneumococos pelo aumento do teor de dióxido de carbono do meio, no qual os pneumococos são mantidos, pelo aumento do teor de dióxido de carbono de um gás, que está em contato com aquele meio, pela diminuição do teor de oxigênio daquele meio, pela diminuição do teor de oxigênio de um gás, que está em contato com aquele meio, ou qualquer combinação destes.

Em uma modalidade, o teor de 02/C02 do meio (ou de um gás em contato com o meio) pode ser ajustado de modo a maximizar o rendimento de células pneumocócicas durante uma fase, e pode ser então reajustado para maximizar a produção de CPS durante uma segunda fase. A diminuição do teor de oxigênio do gás, que contata o meio, causa uma diminuição no teor de oxigênio do meio sobre ou no qual o pneumococo é mantido, devido ao equilíbrio do gás dissolvido e não dissolvido. A alteração do teor de dióxido de carbono do gás possui um efeito similar. A rapidez com que o gás dissolvido no meio e o gás não dissolvido são equilibrados depende de uma quantidade de fatores conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, a área superficial da interface meio-gás, a viscosidade do meio, e o grau de agitação do meio.

Pneumococos podem ser mantidos no meio (por exemplo, meio líquido), no qual a interface entre o meio e a fase gasosa, se houver, é minimizada. Em tais sistemas de cultura, a alteração do teor da fase gasosa pode ter relativamente pouco efeito sobre o teor de gás do meio líquido, devido à difusão limitada de gás a partir da fase gasosa ao interior do líquido.

Em tais sistemas, o teor de gás do meio líquido pode ser influenciado pelo método usado para preparar o meio. Por exemplo, o meio líquido substancialmente anaeróbico pode ser produzido pela preparação de um meio líquido, sua esterilização em uma autoclave (cujo calor retira substancialmente todo o oxigênio a partir do líquido), e resfriamento do meio autoclavado em uma atmosfera isenta de oxigênio, tal como em um recipiente fechado, através do qual uma corrente estável de gás isento de oxigênio é passada. Exemplos de gases isentos de oxigênio adequados incluem argônio puro, argônio misturado com 5- 10% de C02, nitrogênio puro, ou alguma combinação de N2, Ar e C02. Quando é desejado um alto grau de anaerobicidade ([02], 0,1%), o gás isento de oxigênio, que passa sobre o meio à medida em que ele é resfriado, pode ser passado através de ou sobre uma bobina ou malha de cobre aquecida, usando métodos conhecidos na técnica.

Naturalmente, métodos similares podem ser usados para a preparação de meios sólidos, gelatinosos, e semi-sólidos tendo um teor de gás desejado. A produção de CPS pode ser também aumentada pela seleção de uma forma e variante pneumocócica apropriada como o inóculo usado para semear o meio, para o qual o teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, ou ambos, é modulado. É entendido que diferentes variantes de pneumococos podem gerar CPS estruturalmente distinto. Os métodos aqui descritos podem ser usados para aumentar a produção de CPS usando qualquer variante pneumocócica. É, além disso, entendido, que muitos pneumococos exibem pelo menos duas formas fenotípicas. Estas formas incluem uma forma opaca (O) e uma forma transparente (T), em que a forma opaca é geralmente caracterizada pela produção de uma maior quantidade de CPS. Deste modo, a produção de CPS pode ser adicionalmente aumentada pela seleção, como um inóculo, de uma forma de uma variante de um pneumococo, caracterizada por uma maior produção de CPS. O CPS produzido usando um ou mais dos métodos aqui descritos pode ser usado (isoladamente ou em combinação com outras espécies de CPS pneumocócicas) para produzir vacinas pneumocócicas e outra preparações imunogênicas, usando métodos conhecidos na técnica. Tais métodos envolvem geralmente a separação do CPS a partir das células pneumocócicas, opcionalmente exterminando as células pneumocócicas remanescentes, e combinando o CPS com um veículo farmaceuticamente aceitável (e, opcionalmente, um adjuvante imunológico). Tais preparações podem ser administradas a um animal com o propósito de aumentar a resposta imune do animal à infecção por um pneumococo.

Acredita-se que o CPS pneumocócico permite com que os pneumococos escapem às defesas imunes em animais (por exemplo, humanos), métodos de inibição da produção de CPS podem ser usados para minorar infecções pneumocócicas em animais. Infecções pneumocócicas (e complicações decorrentes das mesmas) que podem ser minoradas deste modo incluem a pneumonia (particularmente pneumonia pneumocócica), bacteremia, sepsia, meningite, endocardite bacteriana, faringite exudativa estreptocócica, celulite, e abcessos viscerais.

Foi verificado que o aumento do teor de oxigênio no ambiente diminui a produção de CPS pneumocócico, deste modo aumentando a susceptibilidade dos pneumococos ao sistema imune. Similarmente, foi verificado que a diminuição do teor de dióxido de carbono no ambiente diminui a produção de CPS pneumocócica.

Infecções pneumocócicas e seus efeitos colaterais e complicações podem ser minorados pela manutenção de um animal afligido com uma tal infecção em contato com um gás tendo uma concentração superatmosférica de oxigênio. Altemativamente, a tensão de oxigênio no sítio da infecção pode ser aumentada (por exemplo, pelo provimento de oxigênio puro ou de ar esterilizado diretamente a um sítio de infecção (por exemplo, um abcesso visceral envolvendo um pneumococo} localizado dentro de um corpo animal), em relação à tensão de oxigênio normal no sítio. Por exemplo, quando o sítio do corpo são os pulmões (por exemplo, como no caso de pneumonia pneumocócica), a tensão de oxigênio normal é aquela do ar normal. A pneumonia pneumocócica pode ser minorada pelo provimento de uma concentração superatmosférica de oxigênio aos pulmões dos pacientes usando, por exemplo, um respirador ou uma máscara de oxigênio padrão.

Infecções pneumocócicas e seus efeitos colaterais e complicações podem ser também minorados pela diminuição da tensão de dióxido de carbono no sítio de infecção em um animal abaixo da tensão de dióxido de carbono que ocorre normalmente em tais sítios de infecção, e preferivelmente abaixo da tensão de dióxido de carbono que normalmente ocorre no sítio do corpo, mesmo na ausência de infecção pneumocócica. A diminuição da tensão de dióxido de carbono em um sítio do corpo interno, ou que os pulmões, pode envolver o provimento de um fluxo de gás estéril através de, sobre ou em frente do sítio do corpo. Quando o sítio de infecção são os pulmões, a tensão de dióxido de carbono pode ser reduzida pelo aumento da taxa de respiração, ou por ação voluntária do paciente ou artificialmente (por exemplo, usando um ventilador ou drogas para a aceleração da respiração).

Como descrito em mais detalhes no exemplo, a produção de CPS aumentada em pneumococos está correlacionada com a baixa expressão do gene cpsD e com um baixo grau de fosforilação da proteína CpsD. A produção de CPS pode, portanto, ser aumentada por agentes, que aumentam a expressão de cpsD, aumentam o grau de fosforilação de CpsD, ou ambos.

Inversamente, a produção de CPS pode ser inibida por agentes, que inibem ou reduzem a expressão de cpsD, inibem a fosforilação de CpsD, aumentam a desfosforilação de CpsD fosforilado, ou alguma combinação destes. Como acima discutido, a diminuição da produção de CPS em pneumococos envolvida em uma infecção em um animal pode tomar estes pneumococos mais suscetíveis ao ataque pelo sistema imune do animal. A invenção inclui métodos para avaliar se um composto de teste é um agente de inibição da produção de CPS pneumocócico e métodos para avaliar se um componente de teste é um agente de aumento da produção de CPS pneumocócico. Em cada um destes métodos, as células pneumocócicas são mantidas na presença do composto de teste e, separadamente mas preferivelmente de modo idêntico, na ausência do composto de teste. Um efeito direto do composto de teste sobre a produção de CPS pode ser avaliado pela avaliação da quantidade de CPS produzida pelas células na presença e na ausência do composto de tes. Altemativamente, o nível de expressão de CpsD (avaliado pela medição da produção ou do RNA correspondente ou da proteína correspondente) ou o grau de fosforilação de CpsD (avaliado pela medição ou da quantidade de resíduos de tirosina fosforilados presentes no CpsD ou da fração de CpsD tendo, pelo menos um resíduo de tirosina fosforilado) é avaliado, e correlacionado com a inibição ou aumento da produção de CPs, como acima discutido.

Referências: As publicações referidas neste pedido são as que se seguem: Arrecubieta et al., 1995, Gene 167: 1-7 Austrian et al., 1966, J. Bacteriol. 92: 1281-1284 Auzat et al., 1999, Mol. Mocrobiol. 34: 1018 - 1028 Avery et al., 1931, J. Exp. Med. 54: 73 Avery et al., 1944, J. Exp. Med. 79: 137-157 Caparon et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 5693- 5701 Chen et al., 1988, Gene 164 : 155-164 Cundell et al., 1995, Nature 377 : 435-438 Cundell et al., 1995, Infect. Immun. 63: 757-761 Gibson et al, 1993, Infect. Immmun., 61: 478-485 Hammerschmidt et al., 1996, Mol. Microbio. 20: 1211-1220 Howden, 1976, J. Clin. Patho. 29: 50-53 Iannelli et al„ 1999, J. Bacteriol. 181: 2652-2652 Ilan et al., 1999, EMBOj., 18: 3241-3248 Kim et al., 1998, J. infct. Dis. 177: 368-377 Kim et al. et al., 1999, Infec. Immun. 67: 2327-2333 Rnecht et al., 1979, J. Exp. Med. 132: 475-487 Levin et al., 1998, Mol. Microbiol. 30 : 209-219 Macleod et al., 1950, J. Exp. Med, 92: 1-9 Modde, 1978, Experimentia 34 : 1285-1286 Neufeld, 1902, Z. Hyg. Infektionskr. 40:54 Raz et al., 1997, Clin. Infct. Dis. 24: 1164-1168 Ring et al., 1998, J. Clin. Invest. 102: 347-360 Rosenow et al., 1997, Mol. Microbiol. 25: 819-829 Saluja et al, 1995, Mol. Microbiol. 16: 215-227 Schrager et al, 1996, J. Clin. Invest. 98: 1954-1958 Sellin et al, 1995, Microb. Pathogen 18: 401-415 St. Geme III et al, 1991, Infect. Immmun. 59: 1325-1333 Stevenson et al, 1996, J. Bacteriol. 178 : 4885-4893 Throup et al. 2000, Mol. Microbiol. 35 : 566- 576 Tomasz, 1964, Bacteriol. Proc. 64: 29 Tuomanen et al, 1995, New Eng. J. Med. 332: 1280-1284 Vincent et al, 1999, J. Bacteriol. 181 : 3472-3477 Wani et al., 1996, Infec. Immun. 64: 3967- 3974 Watson et al, 1990, Infect. Immun. 58 : 3135 - 3138 Weiser, 1998, Microb. Drug Resist., 4 : 129- 145 Weiser et al. 1994, Infec. Immun. 62: 2582- 2589 Weiser et al., 1999, Infect. Immun. 67: 3690-3692 Weyand et al, 2000, J. Biol. Chem. 275 : 3192- 3200 Exemplo A invenção é agora descrita com referência ao seguinte Exemplo. Este exemplo é provido apenas com o propósito ilustrativo, e a invenção não está limitada a estes Exemplo, mas preferivelmente abrange todas as variações, que são evidentes como um resultado do ensinamento aqui provido.

Dependência de Oxigênio de Expressão de Polissacarídeo Capsular por Streptococcus pneumoniae está associada com a modificação pós- translacional de CpsD

Os experimentos apresentados neste Exemplo demonstram que as diferenças em fenótipo de opacidade entre pneumococos (isto é, forma O contra forma T) são afetadas pelas concentrações ambientais de oxigênio, e que as condições de crescimento anaeróbico, tais como ocorrem em pneumonia, influenciam a capacidade de pneumococos de forma O para aumentar a expressão de CPS e escapar à eliminação imune.

Os materiais e métodos usados nos experimentos apresentados neste Exemplo são agora descritos.

Cepa Bacteriana e Condições de Crescimento As cepas de S. pneumoniae usadas neste estudo estão descritas na Tabela I e incluíram as variantes O e T previamente descritas de isolados clínicos P303 (tipo 6A), P324 (tipo 6B), P 68 (tipo 18C) e P10 (tipo 9 V), conforme descrito (Kim et al, 1998; Weiser et al. 1994). As bactérias foram desenvolvidas em vasos não selados em meio de soja semi-sintético (meio C + Υ, ρΗ 8,0) ou tríptico sem agitação a 37°C, conforme descrito (Tomaz, 1964). As culturas de caldo foram colocadas em placas sobre ágar de soja tríptica (TSA) contendo 1% de ágar (p/v), sobre as quais 5000 unidades de catalase (obtida de Worthington Biochemical, Freehold, NJ) foram espalhadas. Os meios inoculados foram incubados 37°C em uma jarra de extinção de vela, a não ser que especificado de outro modo. A morfologia da colônia foi determinada neste meio de TSA sob ampliação e iluminação transmitida oblíqua, conforme descrito (Weiser et al., 1994). A concentração de dióxido de carbono ambiental foi controlada sob condições aeróbicas usando uma incubadora de C02. As condições de crescimento anaeróbico foram obtidas usando o sistema BBL

GasPak™ de acordo com as instruções do fabricante (Becton Dickinson, Cockeysville, MD). Em alguns experimentos, o componente bicarbonato de sódio do sistema foi empregado para gerar uma atmosfera de 10% de dióxido de carbono, e em outros experimentos, não o foi. Após a colheita das bactérias, o pH do meio de crescimento foi medido para confirmar que ele não havia sido afetado por estas diferentes condições de cultura. A análise de espécimes clínicos foi executada usando métodos similares. Um total de 502 pacientes afligidos com meningite foram examinados, dos quais aproximadamente 20% haviam sido comprovados como tendo meningite pneumocócica. Uma amostra de mecha nasofaríngica foi coletada a partir de pacientes, nos quais um diagnóstico clínico presumível de meningite menigocócica havia sido realizado. Esta amostra foi colocada em placa imediatamente sobre ambos 5% de ágar de sangue de ovelha e ágar de soja tríptica contendo 5000 unidades de catalase, e as placas foram incubadas a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de C02. Amostras de fluido cerebroespinhal (CSF) foram também colocadas em placas tanto sobre placas de ágar de sangue e placas transparentes, como foram cultivadas amostras de sangue de paciente, nas quais pneumococos foram observados, seguindo-se incubação aeróbica padrão por até 48 horas. Inicialmente, os isolados que exibiram morfologia típica sobre ágar de sangue foram confirmados como sendo pneumococos por mancha de Gram e reação de Quellung. Todos os isolados foram armazenados a -80°C em conservadores bacterianos, e a morfologia da colônia foi determinada como aqui descrito.

Diferenças estatísticas entre as taxas de fenótipos T e O em culturas de sítio invasivo e nasofríngico e examinadas usando o Teste Exato de Fisher.

Transformação Genética Pneumococos encapsulados e não encapsulados foram tomados competentes para a transformação natural conforme descrito (Weiser et al., 1999). Mutações em sistemas de transdução de sinais de dois componentes (TCSTSs) foram transformados na cepa P 303 pela seleção de colônias a partir do meio compreendendo eritromicina (1 micrograma por mililitro). Os transformantes encapsulados foram testados quanto à morfologia de colônia alterada, e a expressão de CPS confirmada pela reação de Quellung usando anti-soros com especificidade de tipo (obtidos de States Seruminstitut, Cpenhagen, Dinamarca).

Reação de Quellung Cápsulas pneumocócicas foram visualizadas em bactérias desenvolvidas para a fase log médio em meio semi-sintético sob várias condições. Para a reação de Quellung, um igual volume de cultura e uma composição compreendendo anti-soro tipo 6 e 1% (p/v) de azul de metileno obtido de Statens Seruminstitut (Copenhagen, Dinamarca) foram misturados em uma lâmina de vidro, conforme descrito (Neufeld, 1902).

Quantificação de CPS

Variantes pneumocócicas de forma O e T foram desenvolvidas em um meio semi-sintético para a fase log médio (A62o = 0,3) ou por 16 horas (em cujo tempo as células estavam na fase estacionária). As células foram colhidas através de centrifugação a 2000 x g, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), submetidas a tratamento sônico por três intervalos de 10 segundos a 0°C, e armazenadas a - 20°C. Uma técnica ELISA de captura foi usada para determinar as quantidades de CPS presentes em variantes desenvolvidas sob condições selecionadas, conforme descrito (KIM et al., 1998). O anti-soro de coelho com especificidade de tipo (obtido de Statens Seruminstitut, Copenhagen, Dinamarca) foi usado em uma diluição de 1; 5. 000 em Na2C03 0,05 molar (pH 9,6) e foi fixado durante a noite, em temperatura ambiente, às paredes de reservatórios em placas de microtitulação. Entre cada estágio de incubação, a placa foi lavada cinco vezes com tampão Tris (compreendendo Tris 10 milimolar, NaCl 150 milimolar, Brij™ 35 a 0,05% e azida de sódio a 0,02% (p/v). O CPS purificado obtido a partir de pneumococos tipo 6B, 6 A, 18 C ou 9 V foi usado em uma concentração conhecida e foi adquirido de American Type Tissue Collection (Rockville, MD) para uso como um padrão. O CPS em células submetidas a tratamento sônico foi detectado usando anticorpos monoclonais designados por HASP 4 (que se liga especificamente com os CPSs tipo 6A e 6B), HASP 22 (que se liga especificamente com o CPS tipo 18C), e HASP 33 (que se liga especificamente com o CPS tipo 9V), e foram usados em uma concentração determinada em experimentos pilotos. A ligação de anticorpos monoclonais e o CPS foi detectada usando anti-soro, que reage especificamente com IgM de camundongo e que é conjugado com fosfatase alcalina. Este reagente foi usado como descrito (Kim and Weiser, 1998). A determinação de proteína celular foi executada com extratos celulares submetidos a tratamento sônico usando o kit de ácido micro- bicinconínico de acordo com as instruções do fabricante (Pierce Chemical Co. Rockford, IL). A quantidade de CPS na fração de sobrenadante estava baseada na concentração de proteína na fração submetida a tratamento sônico da célula correspondente (isto é, de modo a normalizar o teor de CPS em uma base por unidade de proteína. O método ELISA de captura usado para comparar quantidades do ácido teitóico total em frações submetidas a tratamento sônico da célula foram descritas (Kim et al., 1998). Todos os experimentos foram realizados em duplicata, e repetidos pelo menos três vezes. Os resultados são expressos como valores médios por concentração de proteína celular total.

Análise de Western As bactérias foram desenvolvidas em ágar de soja tríptico, suplementado com catalase, conforme descrito acima. Após crescimento sob condições selecionadas por 16 horas a 37°C, as células foram removidas a partir da superfície usando uma mecha Dacron™ estéril, novamente suspensa em PBS, e lavada com PBS de modo a ajustar a densidade celular, de tal modo que A62o = 0, 5. Após centrifugação, as células em pelotas foram novamente suspensas em tampão de carga de gel Laemmli e aquecidas a 100°C por 5 minutos. As amostras foram então separadas por SDS-PAGE em 12, 5% (p/v) de géis de poliacrilamida, e então transferidas para membranas Immmobilin- P ™ conforme descrito (Wani et al., 1996). O imunoblot foi executado usando um anticorpo monoclonal designado por 4G10 (Upstate Biotechnology Inc., Waltham, MA) em uma diluição de 1: 2000 em tampão TSBP (Wani et al., 1996) e a reatividade das amostras manchadas com este anticorpo foi detectada usando anti-soro de IgG de camundongo conjugado com fosfatase alcalina conforme descrito (Kim et al., 1999). A carga de quantidades aproximadamente iguais de bactérias foi confirmada por imunoblot de membranas duplicadas usando anti-soros previamente descritos citados contra pneumococos completos (Wani et al., 1996).

Análise de Northern O RNA total foi isolado a partir das variantes O e T de células da cepa P 303 desenvolvidas para a fase log médio em meio semi-sintético sob condições atmosféricas e anaeróbicas e purificadas conforme descrito (Weyand et al., 2000). Seguindo-se à separação de RNA sobre um gel de formamida, RNA manchado com brometo de etídio foi fotografado e a imagem foi digitalizada para comparação com marcadores de tamanho de RNA. O RNA foi transferido para uma membrana usando o Sistema VacuGene™ XL, de acordo com as instruções do fabricante (Pharmacia LKB

Biotechnology, Yppsala, Suécia). A membrana foi pré-hidridizada em uma solução compreendendo NaP04 0, 5 molar, em pH de 7,2, EDTA 1, 5 milimolar, e SDS a 7% (p/v) por 15 minutos a 65C. A sonda foi preparada a partir de um fragmento interno do gene cps4D, e foi amplificada por PCR usando iniciadores tendo as seguintes seqüências : 5 ’-CCGGAATTCG TACAAATATA CAGTTGAGGG GAGATAAAC-3 ’ (SEQIDNO: l)e 5’- CGCGGATCCT GTTGCTGTTA CCAAGATGGA CG-3’ (SEQ ID NO:2) e DNA genômico obtido a partir de uma cepa tipo 4. A cepa é a mesma cepa usada na seqüenciação do genoma total pelo Institute for Genomic Research. O produto de PCR foi digerido usando endonucleases de restrição BamHI e EcoRI, e então clonado em um vetor tendo terminadores transcricionais flanqueando o poli-ligador para permitir a clonagem de seqüências estreptocócicas. Este vetor foi construído a partir de pJDC9 por inserção de um cassete de resistência de canamicina de terminação obtusa Ciai para permitir a seleção deste marcador em E. coli (Chen and Morrison, 1988). O

fragmento cps4D foi inserido no interior do vetor digerido com BamHI e EcoRI e transformado na cepa E. coli DH5-a. O RNA total foi extraído a partir de variantes O e T pneumocócicas da cepa P303 desenvolvidas para a fase log médio em meio de soja tríptica sob condições atmosféricas e anaeróbicas.

Os resultados dos experimentos apresentados neste Exemplos são agora descritos.

Seleção para Variantes Fenotípicas em Humanos De modo a testar se a seleção ocorre para diferentes fenótipos pneumocócicos no contágio e bacteremia em humanos, isolados pareados do mesmo serótipo foram obtidos a partir da nasofaringe e do sangue dos pacientes, que exibiram sinais de sepsia. Foi necessário obter isolados pareados, devido à heterogeneidade cepa-a-cepa na morfologia de colônia não relacionada à opacidade. O pneumococo não pôde ser isolado a partir da nasofaringe de pacientes bacterêmicos, uma vez iniciado o tratamento. Culturas da nasofaringe e do sangue foram portanto obtidas de modo substancialmente simultâneo. Esta limitação requereu que o estudo fosse executado em uma localização geográfica tendo uma alta incidência de bacteremia pneumocócica, de modo a que números suficientes de isolados pareados pudessem ser obtidos.

Isolados do sangue e da nasofaringe foram obtidos a partir de 19 pacientes adultos em Blantyre, Malásia, e foram apenas considerados como isolados pareados se os isolados subseqüentemente demonstrassem ser do mesmo tipo pela reação de Quellung usando anti-soro com especificidade de tipo. A maioria dos isolados pareados eram do tipo 1, o tipo mais comum neste local, como indicado na Tabela II. A maioria dos pacientes foi também testadas como positiva para infecção com o vírus de imunodeficiência humana, que é considerado como a alta incidência de doença pneumocócica invasiva entre estes pacientes. Dos 19 isolados pareados, 17 (89%) foram do fenótipo T na nasofaringe, enquanto que 12 (63%) foram do tipo O no sangue. Dos dez isolados pareados, nos quais o fenótipo de pneumococos obtidos a partir dos dois sítios estavam em desacordo, exibiram todos um fenótipo tipo T na nasofaringe (P < 0,001). Isto demonstra que, em geral, existe uma seleção quanto a variantes fenóticas, que resulta na presença no sangue de um fenótipo tipo O derivado dentre a população predominantemente tipo T na nasofaringe em infecção bacterêmica natural.

Tabela II

Fenótipo de Opacidade em isolados Obtidos a Partir de Contágio Humano e Infecções Invasivas Notas: '4/19 isolados invasivos foram obtidos a partir do fluido cerebroespinhal, preferivelmente a que do sangue. 2 N/A significa estado clínico não disponível.

Efeito do Oxigênio nas Quantidades de CPS

Fatores hospedeiros e bacterianos, que poderíam promover a seleção de variantes O durante a infecção e de variantes T durante o contágio foram investigados. Foi considerada a hipótese de que a tensão de oxigênio mais baixa, do tipo que seria encontrada em pulmão consolidado, promovería uma transição a partir de fenótipo T para o O. O crescimento de um isolado clínico do tipo 6 A, P303, em concentrações reduzidas de oxigênio, não teve efeito sobre a taxa de deslocamento espontâneo da forma T para a O. O crescimento sob condições anaeróbicas (na presença de uma concentração elevada de dióxido de carbono, entretanto, estava associado com um deslocamento para uma morfologia de colônia maior e mais mucóide, que estava particularmente marcada para a variante O, como mostrado na Figura 1 A.

Como os pneumococos, que exibem o fenótipo O, expressam maiores quantidades de CPS do que aqueles que exibem o fenótipo T, foi considerado possível que este maior tamanho de colônia associado com a forma O fosse um resultado da produção aumentada deste material (Kim et al., 1998). Em estudos iniciais, a zona retrátil de CPS, que circunda as colônias bacterianas, foi visualizada usando a reação de Quellung e o anti-soro do tipo 6, conforme mostrado na Figura 1 B. Esta zona era maior para a variante O, desenvolvida sob condições anaeróbicas na presença de 10% de dióxido de carbono, comparada a qualquer crescimento do mesmo fenótipo na presença de oxigênio ou ao crescimento da variante T sob quaisquer das condições testadas, incluindo a ausência de oxigênio. Em contraste, quando as bactérias foram cultivadas sob condições atmosféricas, uma zona de material capsular não pôde ser detectada em tomo de colônias de pneumococos de forma T. Este resultado confirmou a capacidade da forma O para sintetizar quantidades aumentadas de CPS, e indicou que a tensão de oxigênio reduzida, a tensão de dióxido de carbono mais alta, ou ambas, promovem a produção de CPS aumentada. O efeito da concentração de dióxido de carbono e oxigênio ambiental foi avaliado quantitativamente usando um ensaio desenvolvido para medir as quantidades de CPS, como indicado na Figura 2 (Kim et al., 1998). As quantidades de CPS por miligrama de proteína celular total, conforme avaliadas usando ELISA de captura aqui descrito, correlacionadas com a área superficial da colônia e com valores de volume capsular calculados com base na visualização da zonas usando a reação de Quellung e com a área superficial da colônia, conforme indicado na Tabela III. Bactérias em forma de O, ou em fase de crescimento estacionária ou em fase de log médio, exibiram quantidades aumentadas de CPS associado a célula, comparadas aos organismos de forma T. O crescimento da variante 6 A tipo O sob condições anaeróbicas, na presença de 10% de CO2, causou um aumento de 7,9 vezes na quantidade de CPS produzida, comparada com a produção de CPS nas mesmas células cultivadas sob condições atmosféricas.

Comparadas às variantes T desenvolvidas sob as condições anaeróbicas, na presença de 10% de CO2, a variante O produziu 29 vezes outro tanto de CPS.

Resultados similares foram obtidos usando os isolados O e T obtidos a partir de dois isolados clínicos não relacionados (isto é, usando os tipos 6B e 18C).

Tabela III

Características de Pneumococos Desenvolvidos Sob Várias Condições 3 Para as variantes O e Y do mesmo isolado clínico tipo 6 A 4 Estes valores são baseados em colônias observadas após 16 horas de crescimento. Os valores representam a média de determinações efetuadas usando três colônias isoladas em reservatório único. 5 Estes valores são baseados em material capsular revelado usando a reação de Quellung e a fórmula para o volume de um elipsóide esférico, V = (π/6) LW2. Os valores representam a média de determinações para três formas diplococais, divididas por dois para corresponder a uma célula única. “UD” significa que uma zona de material capsular não era detectável. 6 Estes valores são baseados em avaliação de ELISA de captura de organismos desenvolvidos em cultura líquida em fase de log médio. Os valores constituem a média de duas determinações separadas. A produção de CPS em sobrenadante de cultura foi avaliada para pneumococos tipo 18 C, após crescimento para fase estacionária. A observação de que uma quantidade maior de polissacarídeo foi produzida no sobrenadante da cultura da variante da forma O, à medida em que a concentração de oxigênio foi diminuída e à medida em que a concentração de dióxido de carbono foi aumentada, indica que a produção de CPS aumentada era atribuível à síntese aumentada de CPS pelas células, sob condições de oxigênio aumentado/ dióxido de carbono diminuído. Um isolado do tipo 9V foi usado para determinar se a síntese aumentada de CPS era atribuível ao oxigênio diminuído ou ao dióxido de carbono aumentado. Bactérias do tipo 9V, desenvolvidas até a fase estacionária na presença de 10% de dióxido de carbono exibiram produção de CPS 12 vezes maior na ausência de oxigênio do que as mesmas células desenvolvidas na presença de 10% de dióxido de carbono e na presença de oxigênio. Isto confirmou que a tensão de oxigênio, preferivelmente a que a tensão de dióxido de carbono, é o fator ambiental predominante, que afeta o grau de produção de CPS.

Alterações na produção de CPS Correlacionadas com Alterações em cpsD/ CpsD A próxima fase do estudo foi dirigida ao mecanismo, pelo qual é mediado o efeito de oxigênio sobre a produção de CPS. O envolvimento de um sistema de transdução de sinal para detectar e transduzir a presença/tensão de oxigênio foi examinado. Mutações assinaladas previamente descritas em 11 dos 12 sistemas de transdução de sinal de dois componentes encontradas no genoma de um isolado tipo 3 foram transformadas na cepa P303, conforme descrito (Throup et al., 2000).

Mutações abrigando 10 constructos em resposta a homólogos reguladores de resposta foram executadas, assim como o foram mutações abrigando 7 constructos em homólogos de histidina quinase. Para cada um dos 17 homólogos mutantes testados em P303, não houve efeito sobre o tamanho de colônia aumentado ou zona de formação de cápsula, conforme avaliado usando a reação de Quellung, em experimentos, nos quais as células foram desenvolvidas sob condições anaeróbicas. Este resultado indicou que é improvável que o efeito do oxigênio seja mediado através de um TCSTS, embora um destes sistemas no pneumococo não pudesse ser examinado porque os genes pareciam ser essenciais.

Os genes em um local conhecido como sendo requerido para a expressão de CPS foram examinados a seguir. Como o efeito do oxigênio sobre as quantidades de CPS foi observado em cepas de múltiplos tipos, os genes conservados dentre diferentes tipos foram considerados os candidatos mais prováveis. Dentre os genes nos locais de cápsula, apenas os primeiro quatro, CPsA-D, são comuns a pneumococos de diferentes tipos (Iannelli et al., 1999). Os pneumococos do tipo 3 são conhecidos como formadores de colônias mucóides e possuem cápsulas grandes, conforme avaliado pela reação de Quellung, quando desenvolvidos sob condições atmosféricas, conforme indicado na Tabela I (Knecht et al., 1970). Diferentemente de todos os outros tipo pneumocócicos testados as cepas do tipo 3 falharam em apresentar um aumento nos tamanhos de colônias ou cápsulas, quando cultivadas sob condições anaeróbicas, em relação aos tamanhos quando cultivadas sob condições atmosféricas. Com base nesta observação, foram determinadas as diferenças em cpsA-D entre o tipo 3 e locais de outros tipos.

Homólogos de cpsA, que codificam um atenuador transcricional putativo, e de cpsB, que codificam uma proteína de função desconhecida, estão presentes nos locais de capsulação do tipo 3 (número de acesso ao Genbank Z 47210; Arrecubieta, 1995). O gene, que codifica CpsC em pneumococos do serótipo 2 está altamente conservado no local de capsulação do tipo 3, mas o CpsD previsto em pneumococos do serótipo 3 está truncado seguindo-se ao aminoácido 69 (de 226). CpsC e CpsD são requeridos para a expressão da cápsula pneumocócica e juntos são homólogos para uma proteína única (Wzc) expressa em Escherichia coli, que está envolvida na regulação do comprimento de cadeia e exportação do ácido colânico designado pelo polissacarídeo extracelular (Morona et al., 1999;

Stevensonet al., 1996).

Em E. coli, Wzc sofre autofosforilação reversível em um resíduo de tirosina (Vincent et al., 1999). Um anticorpo monoclonal, que é designado por 4G10, que se liga especificamente com resíduos de tirosina fosforilados, foi usado para determinar, por análise de Western, que tirosina fosforila está presente no pneumococo. Uma faixa única de aproximadamente 26 kD, o tamanho previsto de CpsD, estava presente nos lisados de célula total do isolado tipo 6 A. Uma única faixa do mesmo tamanho foi também observada em lisados de célula total de cepas dos tipos 6B, 18 C e 9V usadas neste estudo, mas ausente de pneumococos tipo 3 (que possuem um CpsD truncado). Estas observações indicaram que CpsD é fosforilável em um resíduo de tirosina. Evidência adicional de que 4G10 reconhecia CpsD tendo resíduos de tirosina fosforilados foi obtida pela comparação de cepas D39 (um mutante não encapsulado) e R6x (uma cepa tendo um cps 2A-H de extensão de deleção de par de base 7504, dos quais apenas A-D são comuns a outros tipos; Iannelli et al., 1999). A mutação nos pneumococos tipo R6x foi corrigida em alguns experimentos pela transformação das bactérias usando DNA obtido a partir do da cepa de origem D 39 (tipo 2) ou de uma cepa tipo 3 para fornecer uma cepa encapsulada com uma cápsula do tipo 2 ou 3 na base genética D39 tipo 2. A falha de 4G10 para reagir com o transformante R6x e R6x tipo 3 e a reação do anticorpo com o transformante tipo 2 R6x confirmou que a expressão da proteína, que corresponde a esta faixa requer um dos primeiros quatro genes comuns no local de capsulação e uma cópia intacta do cpsD. Foi determinado que a proteína reativa 4G10 não é provável que seja CpsA ou B, com base no tamanho. Existem apenas 15 alterações de aminoácido conservativo entre o CpsC tipo 2 e 3, das quais nenhuma envolve tirosina. A falta da faixa reativa 4G10 na cepa tipo 3 indicou que a proteína reativa 4G10 não é CpsC. Foi, portanto, concluído, que a proteína CpsD compreende um resíduo de tirosina fosforilável no pneumoco. O efeito do crescimento sob as várias concentrações de oxigênio e dióxido de carbono sobre a fosforilação da tirosina do CpsD foi examinada. Lisados de células completas das formas O e T do isolado pneumocócico tipo 6 A, designado por P303, que havia sido desenvolvido sob várias concentrações de oxigênio e dióxido de carbono, foram ajustadas para uma densidade equivalente e examinadas por análise de Western usando o anticorpo monoclonal específico para fosfotirosina 4G10. Os resultados destes experimentos são apresentados na Figura 3. Uma única faixa de tamanho esperado para CpsD foi detectada na variante O, desenvolvida na presença de oxigênio. Não houve reatividade com o extrato obtido a partir de um número aproximadamente igual de células desenvolvidas anaerobicamente, conforme indicado na trilha 1 da Figura 3. Não houve efeito aparente de diferenças na tensão de dióxido de carbono a partir de < 0,1 a 10%, conforme indicado pelos resultados nas trilhas 2-4 da Figura 3.

Sob todas as condições testadas (oxigênio < 0,1% a 21% e dióxido de carbono < 0,1% a 10%) a reatividade do anticorpo com os extratos celulares da variante T foi falha. Resultados similares foram obtidos usando outras cepas. Foi, portanto, concluído que a fosforilação de CpsD é afetada pelo fenótipo de opacidade e requer crescimento na presença de oxigênio. A diferença na fosforilação de tirosina pode afetar a atividade de CpsD e ser levada em conta para a expressão diminuída de CPS em pneumococos O, na presença de oxigênio. Nem os pneumococos O nem T, desenvolvidos anaerobicamente, expressam tirosina fosforilada: entretanto, as duas formas fenotípicas exibem grandes diferenças no grau de produção de CPS. A análise de Northern foi usada para determinar se as diferenças entre as variantes O e T foram devidas a diferenças no nível de transcrição de cpsD. Os resultados destes experimentos são apresentados na Figura 4. O RNA celular total foi obtido a partir das formas O e T da cepa pneumocócica P 303, desenvolvidas ou sob condições atmosféricas ou anaerobicamente, na presença de 10% de dióxido de carbono. O RNA foi testado usando um fragmento clonado de cpsD. Diferenças quantitativas na atividade transcricional foram determinadas pela avaliação da hibridização da sonda radio-rotulada com cpsD em mRNA e pelo ajuste destes valores para a quantidade total de RNA presente na mistura de ensaio de hibridização. Estes experimentos demonstraram que a concentração de oxigênio não possuía efeito substancial sobre o nível de transcrição de cpsD. Entretanto, cpsD foi transcrito em um nível 3,4 vezes maior em células de forma T, em relação a células de forma O. Foi, portanto, concluído, que a regulação transcricional de cpsD determina o fenótipo de opacidade de pneumococos.

Sem desejarmos estar limitados por qualquer teoria particular de operação, acredita-se que CpsD regula a produção de CPS. A correlação entre as diferenças observadas no grau de fosforilação de tirosina de CpsD e diferenças na produção de CPS apoiam esta teoria. Acredita-se que CpsD funciona como um tirosina quinase, baseada em parte em sua similaridade de seqüência de aminoácido para uma enzima de autofosforilação de tirosina em E. coli, que está envolvida na regulação do comprimento de cadeia e exportação do ácido colânico do polissacarídeo extracelular. Cps23FD possui 30% de identidade e 49% de similaridade em relação a 188 de 229 aminoácidos para Wzc. CpsD do pneumococo de serótipo 23f contém uma seqüência de aminoácido com terminal carboxila não usual (YGSYGNYGNYGKNKK; SEQ ID NO: 3) que contém uma característica repetitiva (YGX)4, que inclui resíduos de tirosina. Esta região com terminal carboxila exibe uma heterogeneidade de seqüência de aminoácido consideravelmente maior contra variantes pneumocócicas do que o restante dos CpsD. Acredita-se que a variabilidade na produção de CPS dentre as cepas pneumocócicas é atribuível à variabilidade desta porção terminal carboxila dentre as cepas, a variação da seqüência afetando a capacidade de fosforilação da proteína. Um número de outras quinases de proteína bacteriana foram identificados e estes possuem em comum um término C com uma característica repetitiva rica em tirosina (Ilan et al., 1999). A incapacidade para gerar uma cepa pneumocócica, que abrigue uma mutação em cpsD, ao mesmo tempo em que é mantida a capacidade da cepa para produzir CPS é adicionalmente evidenciada pela importância deste gene na produção de cápsula e CPS. É proposto a seguir um modelo de um mecanismo para regular a produção de CPS em resposta a um fenótipo de opacidade de colônia e tensão de oxigênio. O modelo envolve a regulação transcricional de cpsD e a modificação pós-translacional de CpsD.

CpsD é um fator regulador negativo, que age sobre os genes envolvidos na biossíntese de CPS com especificidade de tipo pneumocócico. A transcrição de cpsD relativamente baixa é levada em consideração para as quantidades relativamente altas de CPS expresso em pneumococos do tipo O sob condições anaeróbicas. À parte da regulação transcricional de cpsD, que é levada em consideração para uma proporção significativa da regulação da expressão de CPS, um segundo nível de regulação está envolvido, ou seja a fosforilação ou a autofosforilação de resíduo(s) de tirosina em CpsD. A fosforilação de CpsD afeta a penas a variante O e requer crescimento sob condições aeróbicas. A detectabilidade de CPsD, que é fosforilado em um ou mais resíduos de tirosina apenas na variante O pode ser devida à atividade de fosfatase aumentada em pneumococos T. A fosforilação de tirosina aumenta a atividade reguladora negativa de CpsD, de tal modo que o CPsD fosforilado diminui a síntese de CPS sob condições aeróbicas. Como um resultado, menos CPS é produzido pelas variantes O sob condições aeróbicas do que sob condições de crescimento anaeróbicas. A produção de CPS relativamente baixa em pneumococos de forma T, mesmo na ausência de fosforilação de tirosina apreciável de CpsD, é atribuível à expressão aumentada de cpsD em pneumococos de forma T. O que havia sido anteriormente descrito como crescimento aperfeiçoado sob condição anaeróbica pode ser, de fato, um efeito da síntese de CPS aumentada, que resulta em um tamanho de colônia maior (Modde, 1978).

Homólogos de CpsD com ainda maior similaridade para Wzc estão presentes em muitas outras espécies de bactérias, que expressam polissacarídeos superficiais. Exemplos de tais espécies incluem Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter johnsonii. Como as cápsulas e seus tamanhos são determinantes críticos de virulência, a capacidade para regular quantidades de CPS com base em modificação transcricional e pós-translacional desta classe de gene/ proteína pode ser importante para facilitar a capacidade de que bactérias encapsuladas se adaptem aos diferentes requerimentos de colonização e infecção. A exposição de cada patente, pedido de patente e publicação aqui citado é aqui incorporada, a título referencial, em sua totalidade.

Embora esta invenção tenha sido exposta com referência a modalidades específicas, é evidente que outras modalidades e variações desta invenção podem ser considerados por outros versados na técnica, sem que haja afastamento do verdadeiro espírito e escopo da invenção. As reivindicações apensas incluem todas tais modalidades e variações equivalentes.

Claims (19)

1. Método para produzir polissacarídeo capsular a partir de um pneumococo, caracterizado pelo fato de compreender obter uma variante opaca do pneumococo e manter a dita variante opaca do pneumococo em um meio de crescimento em contato com um gás tendo uma concentração de oxigênio inferior a cerca de 16%, o dito método opcionalmente compreendendo isolar o polissacarídeo capsular produzido.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito gás possui uma concentração de oxigênio não maior do que cerca de 0,1%.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito pneumococo é um organismo do gênero Streptococcus.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito pneumococo é um organismo da espécie Streptococcus pneumoniae.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito pneumococo é uma variante da espécie Streptococcus pneumoniae selecionada a partir do grupo que consiste das variantes 6A, 6B, 18C e 9V.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito gás possui uma concentração superatmosférica de dióxido de carbono.

7. Método para produzir polissacarídeo capsular a partir de um pneumococo, caracterizado pelo fato de compreender obter uma variante opaca do pneumococo e manter a dita variante opaca do pneumococo em um meio de crescimento em contato com um gás tendo uma concentração de dióxido de carbono maior do que cerca de 5% e uma concentração de oxigênio inferior a cerca de 16%, o dito método opcionalmente compreendendo isolar o polissacarídeo capsular produzido.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito gás possui uma concentração de dióxido de carbono de pelo menos cerca de 10%.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito gás possui uma concentração de oxigênio não maior do que cerca de 0,1%.

10. Método para produzir uma preparação imunogênica para a administração a um animal em risco de desenvolver uma infecção pneumocócica, caracterizado pelo fato de compreender: a) obter uma variante opaca do pneumococo; b) manter a dita variante opaca de pneumococo em um meio de crescimento tendo um teor de oxigênio menor do que o mesmo meio equilibrado na mesma temperatura com um gás tendo uma concentração de oxigênio menor do que 16%; e c) isolar o polissacarídeo capsular produzido pelas células a partir das células;em que o polissacarídeo isolado constitui a preparação imunogênica.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito gás possui uma concentração de oxigênio não maior do que cerca de 0,1%.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito gás possui uma concentração superatmosférica de dióxido de carbono.

13. Método para produzir polissacarídeo pneumocócico, caracterizado pelo fato de que compreende obter uma variante opaca de penumococo e manter o dito pneumococo em um meio de crescimento tendo um teor de oxigênio mais baixo do que o mesmo meio equilibrado na mesma temperatura com um gás que possui teor de oxigênio de 16%.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito gás possui uma concentração de oxigênio não maior do que cerca de 0,1%.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito meio de crescimento é substancialmente isento de oxigênio.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito meio de crescimento possui um teor de dióxido de carbono que é maior do que o mesmo meio equilibrado na mesma temperatura com ar normal.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito meio de crescimento é saturado com dióxido de carbono.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito meio de crescimento compreende um sal de carbonato ou de bicarbonato.

19. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que dito meio de crescimento tem um teor de dióxido de carbono que é maior que o mesmo meio equilibrado na mesma temperatura com um gás compreendendo 5% de dióxido de carbono.