MXPA02009047A - Produccion modulante de polisacarido neumococico capsular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la produccion modulante de polisacarido capsular en neumococos tales como Streptococcus pneumoniae. La invencion ademas se relaciona, con metodos para aliviar infecciones neumococicas en animales y a metodos para identificar ambos agentes capaces de modular infecciones neumococicas en animales. La figura 1 que comprende las figuras 1Ai-lAvi y 1Bi-lBvi es una serie de imagenes que indican el efecto del oxigeno ambiental y la concentracion de dioxido de carbono en la morfologia de las colonias y tamano de capsulas, como se ensaya utilizando la reaccion Quellung.

Description

PRODUCCIÓN MODULANTE PE POLISACÁRIDO NEUMOCÓCICO CAPSULAR Esta invención fue apoyada, en parte, por fondos del gobierno de EE.UU., (Servicio de Salud Pública de EE.UU., números de concesión AI38436 y AI44231(, y, por lo tanto, el Gobierno de EE.UU., puede tener ciertos derechos en la invención .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención se refiere, ampliamente, a la producción de material polisacárido capsular de organismos estreptocócicos y a la producción de vacunas usando tal material . La bacteria Streptococcus pneumoniae, algunas veces nombrada neumococo, es generalmente un organismo comensal que coloniza la superficie de mucosa de la zona nasofaringe humana. Cuando los factores huésped permiten el acceso del organismo al tracto respiratorio inferior, emite una respuesta inflamatoria vigorosa, conduciendo a una consolidación densa como espacios de aire alveolares llenos con exudado. Esta condición se refiere comúnmente como neumonía (Tuomanen et al., 1995). La más seria manifestación de la infección neumocócica es la bacteremia, la cual puede ser complicada por sepsis, meningitis, o ambas. La bacteremia en adultos es usualmente una complicación de la neumonía (Raz et al., 1997). La habilidad de los neumococos a resistir el mayor mecanismo de limpieza del organismo desde la corriente sanguínea (es decir la opsonofagocitosis ) , requiere la expresión del factor de virulencia mayor del organismo, el cual es una cápsula de polisacárido (Avery et al,, 1931; Watson et al., 1990). Los neumococos son capaces de sintetizar no menos de 90 polisacáridos capsulares únicos (CPSs) . Los CPS neumocócicos exhiben propiedades anti-fagocíticas e inhiben la adherencia a las células huésped, una etapa crítica en el transporte (es decir, la expansión del organismo desde un individuo infectado, pero no necesariamente sintomático, a otro) , y posiblemente los aspectos ulteriores en la patogénesis de la enfermedad (Ring et al., 1998). Hallazgos similares en otras especies encapsuladas (por ejemplo, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae) han conducido a una apreciación de cómo cantidades de CPS deben ser variadas temporalmente para permitir tanto interacciones adhesivas con las células huésped como la resistencia a la inmunidad humoral (Hammerschmidt et al., 1996; Levin et al . , 1998/ Schrager et al., 1996; Sellin et al., 1995; St. Geme III et al., 1991). Aún con una sola cepa, la cantidad de CPS expresada por S. pneumoniae varia. Los mecanismos reguladores que modulan la expresión CPS no se han entendido bien previamente. La mayoría de los neumococos aislados sufren de variación fenotípica entre al menos dos formas, las cuales se pueden distinguir por la opacidad de colonias (Weiser, 1998; eiser et al., 1994). Las formas de colonias opacas (O) difieren de la variantes transparentes (T) de la misma cepa, en la cantidad de CPS que se sintetiza, las colonias de la forma O fabrican generalmente una cantidad mayor de CP (Kim et al., 1998). Diferencias, relativamente menores, en la cantidad de CPS obtenida por una variante neumocócxca pueden tener un mayor impacto en la virulencia (MacLeod et al., 1950) . Las cantidades mayores de 1.2 a 5.6 veces de CPS, producidas por las colonias de forma O, comparadas con las colonias de la forma T, se correlacionan con la resistencia aumentada de las células neumocócicas a la opsonof gocitosis, usando suero inmune (Kim et al., 1999). En un modelo de urino de infección sistémica, sólo la variante O de varias cepas neumocócicas causó la sepsis (Kim et al., 1998) . En contraste, la forma T expresa mayores cantidades de los otros polisacáridos superficiales de la célula, el ácido teicóico. El ácido teicóico de las paredes celulares neumocócicas es enlazado covalentemente al CPS y contiene un constituyente inusual de etipo huésped, la fosforilcolina. Este polisacárido contribuye a la adherencia de las células neumocócicas a la células epiteliales por medio del receptor para el factor que activa las plaquetas (Cundell et al., 1995; Cundell et al., 1995; Kim et al., 1998). La forma T también exhibe una distribución alterada de las proteínas que se unen a la colina superficial de la célula, que incluyen la CbpA, que actúa para promover la adherencia y colonización (Rosenow et al., 1997) . Durante el transporte en un modelo de rata infante, hay selección para variantes neumocócicas que exhiben el fenotipo T, más bien que el O (Weiser et al., 1994). Estas observaciones sugieren que los neumococos varían entre una forma (es decir la forma T) , que exhibe mayor adherencia y transporte, y una forma no adherente (es decir la forma O), que se adapta mejor para sobrevivir en infecciones invasivas. La identificación de los CPS expresados por un neumococo forma la base de la serotipificación, un procedimiento de diagnóstico usado para diferenciar las variantes de S. pneumoniae . Debido a que diferentes variantes pueden exhibir diferentes propiedades fisiológicas (por ejemplo, la susceptibilidad a agentes anti-microbianos o el régimen característico del inicio o progresión de la neumonía) , la habilidad de diferenciar variantes neumocócicas es ventajosa médicamente. Asimismo, debido a la habilidad del sistema inmunológico humano (u otros vertebrados) a reconocer y atacar las variantes neumocócicas, depende de su habilidad a reconocer específicamente el CPS de cara variante, la habilidad de obtener CPS específicas de la variante neumocócica afecta significantemente el desarrollo de los métodos y composiciones terapéuticos y preventivos para aliviar desórdenes asociados con la infección neumocócica. Por ejemplo, las vacunas neumocócicas conocidas comprenden el CPS obtenido de numerosas variantes neumocócicas. Permanece una necesidad significante para composiciones y métodos de diagnóstico, pronóstico, terapéuticos y preventivos, útiles con desórdenes asociados con infecciones neumocócicas. Muchos de estos métodos y composiciones comprenden, emplear, o confiar en su desarrollo sobre los CPS neumocócícos aislados. Los métodos, previamente conocidos, para aislar los CPS de los neumococos se caracterizan generalmente por un bajo rendimiento. La presente invención incluye un método para mejorar el rendimiento de los CPS, qué se pueden obtener de una variante neumocócica, y aumentar la producción y el uso de composiciones y métodos de diagnóstico, pronóstico, terapéuticos y preventivos, que pertenecen a las infecciones neumocócicas .

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una mejora en un método para producir polisacáridos capsulares de neumococos, manteniendo estos neumococos en un medio de crecimiento. En un aspecto, la mejora comprende mantener un gas, que tiene una concentración sub-atmosférica del oxigeno, en contacto con el medio de crecimiento (por ejemplo una concentración del oxigeno no mayor de un 16% o no mayor de un 0.1%) . Los neumococos pueden ser un organismo del género Streptococcus, tal como un organismo de las especies Streptococcus pneumoniae (por ejemplo una variante 6A, 6B, 18C y 9V de S. pneumoniae) . En otro aspecto, la mejora comprende mantener un gas, que tiene una concentración super-atmosférica (por ejemplo, al menos el 3% ó 10%) de dióxido de carbono en contacto con el medio de crecimiento. En un tercer aspecto, la mejora comprende mantener un gas, que tiene una concentración super-atmosférica de dióxido de carbono y una concentración sub-atmosférica de oxigeno, en contacto con el medio de crecimiento. En aún otro aspecto, la mejora comprende mantener la concentración del dióxido de carbono del medio de crecimiento a un nivel al menos igual a la concentración del dióxido de carbono en el mismo medio de crecimiento, equilibrado a la misma temperatura con un gas que comprende el 5% de dióxido de carbono. La invención también se refiere a un método de aliviar una infección neumocócica en un animal. Este método -comprende mantener el animal (por ejemplo, al menos los pulmones del animal) en contacto con un gas que tiene una concentración super-atmosférica (por ejemplo del 25%, 50% ó 100%) de oxigeno. Ejemplos de infecciones que se pueden aliviar con este método incluyen la neumonía, bacteremia, sepsis y meningitis. La invención además se refiere a un método para obtener una preparación inmunógenica para la administración a un animal, con riesgo de desarrollar una infección neumocócica. Este método comprende mantener las células neumocócicas en un medio de crecimiento, que tiene un contenido de oxígeno menor que el mismo medio equilibrado a la misma temperatura con aire normal, y aislar el polisacárido capsular producido por las células desde dichas células. El polisacárido aislado constituye la preparación inmunogénica . La invención asimismo todavía se refiere a un método para producir polisacáridos neumocócicos. Este método comprende mantener las células neumocócicas en un medio de crecimiento que tiene un contenido de oxígeno menor que el mismo medio, equilibrado a la misma temperatura con aire normal, por ejemplo, un medio sustancialmente carente de oxígeno. En una modalidad, el medio tiene un contenido de dióxido de carbono, el cual es mayor que el mismo medio equilibrado a la misma temperatura con aire normal, por ejemplo, un medio saturado con dióxido de carbono o un medio que comprende una sal de carbonato o de bicarbonato. La invención incluye un método para evaluar si un compuesto de prueba es útil para aliviar una infección neumocócica en un animal. Este método comprende comparar: a) el grado de fosforilación de CpsD en las células neumocócicas, mantenidas en la presencia del compuesto de prueba, y b) el grado de fosforilación de CpsD en el mismo tipo de células, mantenidas en la ausencia del compuesto de prueba. Si el grado de fosforilación de CpsD en las células mantenidas en la presencia del compuesto de prueba es menor que el grado de fosforilación de CpsD en las células mantenidas en la ausencia del compuesto de prueba, entonces el compuesto de prueba es útil para aliviar la infección. El grado de fosforilación de CpsD puede, por ejemplo, ser clasificado por evaluar el número de residuos de tirosina fosforilados presentes en CpsD o evaluando la fracción de CpsD que tiene al menos un residuo de tirosina fosforilado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1, que comprende las Figuras lAi-lAvi y IBi-lBvi, es una serie de imágenes que indican el efecto del oxigeno ambiental y la concentración del dióxido de carbono en la morfología de la colonia y el tamaño de cápsula, como se evalúan usando la reacción de Quellung. Las variantes Opacas (Figuras lAi, lAii, lAiii, IBi, IBii y IBiii) y transparentes (Figuras LAiv, lAv, lAvi, lBiv, lBv y lBvi), de un aislado neumocócico de tipo 6A crecieron en un agar de nutriente T, suplementado con catalasa, durante 16 horas a 37 °C, bajo condiciones atmosféricas (Figuras lAi, lAiv, IBi y lBiv) bajo condiciones atmosféricas, que comprenden una concentración aumentada de dióxido de carbono (Figuras lAii, lAv, IVii y lBv) y bajo condiciones anaeróbicas, que comprenden una concentración aumentada de dióxido de carbono (Figuras lAiii, lAvi, IBiii y lBvi) . Las colonias en las imágenes en las Figuras lAi-lAvi son visualizadas usando iluminación transmitida oblicua, y se muestran con una amplificación de 56 veces. El material capsular en las imágenes en las Figuras IBi-lBvi, se visualizaron usando la reacción de Quellung y antisueros de tipo específico, y se muestran con una amplificación de 4000 veces. La Figura 2, que comprende las Figuras 2A-2D, es un cuarteto de gráficas de barras, que ilustran los efectos del oxígeno ambiental y la concentración del dióxido de carbono y el fenotipo de opacidad en la producción de los CPS, en una base por unidad de proteína, como es evaluado usando el ensayo ELISA de captura. Las variantes Opacas (Figuras 2Ai, 2Bi, 2Ci y 2Di) y transparentes (Figuras 2Aii, 2Bii, 2Cii y 2Dii) de aislados de los cuatro tipos neumocócicos (variante 6B en las Figuras 2Ai y 2Aii; variante 6A en las Figuras 2Bi y 2Bii; variante 18C en las Figuras 2i y 2Cii; variante 9V en las Figuras 2Di y 2Dii) crecieron a la fase de log medio (barras sólidas) o fase estacionaria (barras de puntos) a las concentraciones del oxígeno y dióxido de carbono indicadas arriba de las gráficas. La producción de CPS fue determinada en pellas de células tratadas por sonido, y en los sobrenadantes de cultivos (barras sombreadas), y se expresan con relación a la cantidad de la proteína celular total. "*" indica que esta variante no crece bajo esta condición. Los valores representan el promedio de dos experimentos separados, por duplicado . La Figura 3, que comprende las Figuras 3A y 3B, es una pareja de imágenes, que ilustra los efectos del oxígeno ambiental y la concentración del dióxido de carbono y el fenotipo de opacidad en el fosforilación de la tirosina de CpsD en el análisis Western. Los Usados de células totales de las formas 0 (carriles 1-4) y T (carriles 5-8) de la variante neumocócica P303, se removieron después del crecimiento en el medio sólido y se ajustaron a una densidad igual. La imagen en la Figura 3A ilustra proteínas en estas muestras, que se separaron por el ensayo SDS-PAGE, transferido a una membrana, e inmuno-manchadas con el anticuerpo monoclonal designado 4G10, que se une específicamente con la tirosina fosforilada. La imagen en la Figura 3B ilustra membranas duplicadas que son inmuno-borradas usando antisuero llevado contra los neumococos totales, con el fin de demostrar una carga igual. Las condiciones de crecimiento, que corresponden a las células Usadas y aplicadas a los carriles son como siguen: en los carriles 1 y 5, <0.1% O2/10& C02; en los carriles 2 y 6, 16% de 02/ 3% de C02; en los carriles 3 y 7, 21% de 02 / <0.1% de C02; y en los carriles 4 y 8, 19% de 02 / 10% de C02. La flecha en la Figura 3A indica la ubicación de la banda de CpsD de 25 kD. Los marcadores de tamaño son en kilodaltons. La Figura 4 es una imagen que ilustra los efectos del oxígeno ambiental y las concentraciones de dióxido de carbono y el fenotipo de opacidad en la transcripción de cpsD, como es evaluado por el análisis Northern. El ARN total, obtenido de las formas 0 (Carriles 1 y 2) y T (Carriles 3 y 4) de la variante neumocócica P303, se separa en un gel de formamida y se probó usando un fragmento radio-etiquetado de cpsD, obtenido de un neumococo de serotipo 4. Las bacterias de las cuales el ARN se aisló crecieron bajo <0.1% de 02 / 10% de C02 (Carriles 1 y 3 ) o bajo el 21% de 02 / <0.1% de C02 (Carriles 2 y 4) . Los marcadores de tamaño son estándares del ARN, en kilodaltons .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al descubrimiento por el inventor, que la cantidad del polisacárido capsular (CPS) producido por los neumococos, puede ser modulada controlando el contenido de oxígeno y dióxido de carbono del medio en el cual se mantienen. Se ha descubierto también por el inventor que la producción del CPS en Streptococcus pnsumoniae se modula por la presencia de la proteina CpsD y por la modificación post-translación de esta proteina. Con base en estos descubrimientos, la presente invención incluye métodos para modular la producción de CPS por neumococos (por ejemplo, por el uso en la producción de vacunas anti-neumocócicas y otras preparaciones inmunogénicas) , métodos para aliviar infecciones de neumococos y métodos para identificar agentes útiles para aliviar infecciones neumocócicas .

Definiciones Según se usa aquí, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con él en esta sección.

Los artículos "uno" y "unos" se usan aquí para referirse a uno o más (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. En forma de ejemplo "un elemento" significa uno o más de estos elementos. Aire "Normal", se refiere a un gas que tiene aproximadamente un contenido promedio de la atmósfera en una ubicación seleccionada, con respecto a la humedad (es decir, en una base en seco) . El contenido promedio de la atmósfera es de alrededor del 78% de N», 21% de 02, 1% de Ar, y menos del 0.04% de cada uno del C02, H2, He, Ne, Kr y Xe.

Descripción Se ha descubierto que la producción del polisacárido capsular (CPS) por neumococos es influenciada por la presencia y concentración del oxígeno y dióxido de carbono presentes en el ambiente celular. En particular, la producción del CPS aumenta conforme el contenido del oxígeno del ambiente disminuye; la producción del CPS también aumenta conforme el contenido de dióxido de carbono del ambiente aumenta. Aunque estas observaciones se han hecho usando cultivos de Streptococcus pneumoniae, ellos pueden también aplicarse a organismos que exhiben cápsulas y propiedades de gene de la c psula similares a los neumococos, tal como otras especies de Streptococcus (por ejemplo Streptococcus agalactiae) a otros organismos encapsulados, tal como Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae y Acinetobacter johnsonii r y organismos que exhiben similarídad fenotipica/ similaridad genotipica, o ambas, a uno o más de ellos. Cuando el organismo es el Streptococcus pneumoniae, o puede ser cualquier variante, conocida o descubierta después, del mismo, que incluyen las variantes caracterizadas por la identidad de su CPS, tal como una de las variantes 6A, 6B, 18C y 9V. Estas observaciones se pueden usar en conjunto con cualquier método conocido de cultivar neumococos, o con cualquier método desarrollado después, para aumentar (o disminuir, si se desea) la producción de CPS por los neumococos cultivados por tales métodos. La invención incluye un método para aumentar el rendimiento de los CPS obtenidos, cultivando un neumococo, de acuerdo con un método conocido. El método mejorado implica la disminución del contenido de oxígeno del medio, dentro o sobre el cual los neumococos se mantienen, con relación al contenido del oxigeno que ocurre normalmente en el medio durante el cultivo de los neumococos. Por ejemplo, es común cultivar neumococos en un medio gelatinoso o semi-sólido o en un medio líquido, donde el medio se mantiene en contacto con el aire normal filtrado (o esterilizado de otra manera) . La producción de CPS por neumococos puede ser aumentada disminuyendo (en una base en seco) el contenido del oxigeno del gas con el cual el medio se mantiene en contacto. El grado al cual el contenido del oxigeno es disminuido no es critico, . pero, hablando generalmente, cuanto mayor sea la disminución del contenido del oxigeno, mayor será el rendimiento aumentado del CPS. El contenido del oxígeno del gas es preferiblemente <16% o se disminuye al punto que el gas es sustancialmente anaeróbico (por ejemplo, contiene <0.1% de 02) . La manera en la cual el contenido del oxígeno del gas es disminuido no es crítica. Métodos convenientes de reducir el contenido del oxígeno del gas, debajo del contenido del oxígeno del aire normal, incluyen llenar el recipiente de cultivo (al menos inicialmente, pero, alternativamente, en forma intermitente, periódica o continuamente) con un gas que tenga el contenido de oxígeno deseado. Por ejemplo, un recipiente de cultivo puede ser llenado con una mezcla de gas que comprenda alrededor del 71% de N2, 19% de 02 y 10% de C02, o con una mezcla que comprenda 95% de Ar y 5% de C02. La producción de CPS por neumococos puede también ser aumentada aumentando el contenido de dióxido de carbono del gas, con el cual el medio sobre o dentro del cual los neumococos se mantienen en contacto. El grado al cual el contenido de dióxido de carbono del gas es aumentado no es crítico, pero, hablando generalmente, cuanto mayor es el aumento en el contenido del dióxido de carbono, mayor es el rendimiento aumentado del CPS . El contenido del dióxido de carbono del gas es preferiblemente al menos de un 5% o al menos un 10%, aunque puede ser tan alto que el medio de cultivo se satura con el dióxido de carbono. Como se discutió antes, el contenido de dióxido de carbono deseado puede ser logrado llenando el recipiente en el cual se cultivan los neumococos con un gas que tenga el contenido de dióxido de carbono deseado. Alternativamente, el dióxido de carbono puede ser provisto al medio incorporando una sal de carbonato o de bicarbonato en el medio o agregando tal sal al medio. La invención incluye métodos para amentar la producción del CPS por los neumococos, aumentando el contenido del dióxido de carbono del medio en el cual se mantienen los neumococos, aumentando el contenido del dióxido de carbono de un gas el cual hace contacto con ese medio, disminuyendo el contenido del oxigeno de ese medio, disminuyendo el contenido del oxigeno de un gas, el cual hace contacto con ese medio, o una combinación de los mismos. En una modalidad, el contenido de O2/CO2 del medio (o de un gas en contacto con el medio) puede ser ajustado para asi maximizar el rendimiento de las células de neumococos durante una fase, y luego puede ser reajustado para llevar al máximo la producción del CPS durante una segunda fase.

La disminución del contenido del oxigeno del gas que hace contacto con el medio causa una disminución en el contenido del oxigeno del medio sobre o dentro del cual los neumococos se mantienen, debido al equilibrio del gas disuelto y no disuelto. El cambio del contenido del dióxido de carbono del gas tiene un efecto similar. La rapidez con la cual el gas disuelto en el medio y el gas no disuelto se equilibra, depende de un número de factores conocidos en el arte, que incluyen, por ejemplo, el área superficial de la interfaz del medio-gas, la viscosidad del medio y el grado de agitación del medio. Los neumococos se pueden mantener en el medio (por ejemplo el medio liquido) en el cual la interfaz entre el medio cualquier fase de gas, si la hay, se minimiza. En tales sistemas de cultivo, la alteración del contenido de la fase de gas puede tener relativamente poco efecto en el contenido del gas del medio liquido, debido a la difusión limitada del gas desde la fase de gas en el liquido. En tales sistemas, el contenido de gas del medio liquido puede ser influenciado por el método usado para preparar el medio. Por ejemplo, se puede obtener el medio liquido, sustancialmente anaeróbico preparando un medio liquido, esterilizándolo en un autoclave (cuyo calor impulsa sustancialmente todo el oxigeno del liquido) , y enfriando el medio de autoclave en una atmósfera libre de oxigeno, tal como en un recipiente cerrado, a través del cual una corriente estable de gas libre de oxígeno se pasa. Ejemplos de gases adecuados libres de oxígeno incluyen el argón puro, argón en mezcla con 5-10% de C02, nitrógeno puro, o una combinación de N2, Ar y C02. Donde un grado muy alto de anaerobicidad se desea ([02]« 0.1%), el gas libre de oxígeno que pasa sobre el medio, conforme se enfría, puede ser pasado a través o sobre un serpentín o malla de cobre calentado, usando métodos conocidos en el arte. Por supuesto, métodos similares pueden ser usados en la preparación del medio sólido, gelatinoso o semi-sólido, que tiene un contenido de gas deseado. La producción de CPS puede también ser aumentada seleccionando una variante de neumococos apropiada y formada como el inoculo usado para sembrar el medio por el cual el contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, o ambos, se modulan. Se entenderá que diferentes variantes de neumococos pueden generar CPS distintos estructuralmente . Los métodos descritos aquí, se pueden usar para aumentar la producción del CPS usando cualquier variante de neumococo. Asimismo, se entenderá que muchos neumococos exhiben al menos dos formas fenotípicas. Estas formas pueden incluir una forma opaca (O) y una forma transparente (T) , en que la forma opaca se caracteriza , generalmente produciendo una mayor cantidad de CPS. Así, la producción de CPS puede ser además aumentada seleccionando, como un inoculo, una forma de una variante de neumococo, caracterizada por una mayor producción de CPS . El CPS producido usando uno o más de los métodos aquí descritos, puede ser usado (solo o en combinación con otras especies de CPS neumocócicas) para obtener vacunas neumocócicas y otras preparaciones inmunogénicas usando los métodos conocidos en el arte. Dichos métodos implican generalmente separar el CPS de las células neumocócicas, matando opcionalmente las células neumocócicas remanentes y combinando el CPS con un portador aceptable farmacéuticamente (y, opcionalmente, un auxiliar inmunológico) . Tales preparaciones pueden ser administradas a un animal con el fin de aumentar la respuesta inmunológica del animal a infecciones por los neumococos. Debido a que el CPS neumocócico se cree habilitará que los neumococos eludan las defensas inmunes en animales (por ejemplo en humanos), los métodos para inhibir la producción de CPS pueden ser usados para aliviar las infecciones neumocócicas en animales. Estas infecciones neumocócicas (y complicaciones que surgen de ellas) que pueden ser aliviadas en esta manera, incluyen la neumonía (particularmente la neumonía neumocócica) , bacteremia, sepsis, meningitis, endocarditis bacterial, faringitis exudativa estreptococica, celulitis y abscesos viscerales.

Se ha descubierto que, aumentando el contenido del oxigeno en el ambiente, disminuye la producción de CPS neumocóeica, aumentando asi la susceptibilidad de los neumococos al sistema inmune. Similarmente, se ha descubierto que disminuyendo el contenido de dióxido de carbono en el ambiente, disminuye la producción de CPS neumocóeica . Las infecciones neumocócicas y sus efectos laterales y complicaciones pueden ser aliviadas manteniendo un animal afligido con tal infección en contacto con un gas, que tiene una concentración sobre-atmosférica de oxigeno. Alternativamente, la tensión del oxigeno en el sitio de la infección puede ser aumentada (por ejemplo, suministrando oxigeno puro o aire esterilizado directamente a un sitio de infección {por ejemplo, un absceso visceral que incluye un neumococo} ubicado dentro de un cuerpo de animal) con relación a la tensión normal del oxigeno en el sitio. Por ejemplo, cuando el sitio del cuerpo son los pulmones (por ejemplo con la neumonía neumocóeica) la tensión normal del oxigeno es aquélla del aire normal. La neumonía neumocóeica puede ser aliviada suministrando una concentración sobre-atmosférica del oxígeno a los pulmones de los pacientes, usando, por ejemplo, un respirador o una máscara estándar de oxígeno.

Las infecciones neumocócicas y sus efectos y complicaciones secundarios pueden también ser aliviados disminuyendo la tensión del dióxido de carbono en el sitio de infección en un animal debajo de la tensión del dióxido de carbono, que ocurre normalmente en tales sitios de infección, y preferiblemente debajo de la tensión del dióxido de carbono que ocurre normalmente en ese sitio del cuerpo, aún en la ausencia de la infección neumocócica. la disminución de la tensión del dióxido de carbono en un sitio interno del cuerpo, además délos pulmones, puede implicar el suministro de un gas estéril a través de, sobre o pasando el sitio del cuerpo. Cuando el sitio de infección es en los pulmones, la tensión del dióxido de carbono puede ser reducida aumentando el régimen de respiración, o por acción voluntaria del paciente o artificialmente (por ejemplo, usando un ventilador o drogas que estimulan la respiración) . Como se describe en mayor detalle en el ejemplo, la producción de CPS aumentada en neumococos se correlaciona con la expresión baja del gene cpsD y con un grado bajo de fosforilación de la proteina CpsD. La producción del CPS puede, por lo tanto, ser aumentada por agentes que aumentan la expresión del cpsD, aumentan el grado de fosforilación del CpsD, o ambos. A la inversa, la producción de CPS puede ser inhibida por agentes que inhiben o reducen la expresión del cpsD, inhiben la fosforilación del CpsD, aumentan la desfosforilación del CpsD fosforilado, o alguna combinación de ellos. Como se discutió antes, la disminución de la producción del CPS en los neumococos implicada por una infección en un animal, puede hacer a esos neumococos más susceptibles al ataque por el sistema inmunológico del animal . La invención incluye métodos para evaluar si un compuesto de prueba es un inhibidor de la producción del PS neumocócico y métodos para evaluar si un compuesto de prueba ¦ es un agente que aumenta la producción de los CPS neumocócicos . En cada uno de estos métodos, las células neumocócicas se mantienen en la presencia del compuesto de prueba y, separadamente, pero preferiblemente en forma idéntica, en la ausencia del compuesto de prueba. Un efecto directo del compuesto de prueba en la producción del CPS puede ser evaluada por evaluar la cantidad del CPS producido por las células, en la presencia y ausencia del compuesto de prueba. Alternativamente, el nivel de expresión del cpsD (evaluado midiendo la producción de cualquiera del ARN correspondiente o la proteina correspondiente) o el grado de fosforilación del CpsD (evaluado midiendo o el número de residuos de tirosina fosforilados presentes en el CpsD, o la fracción de CpsD que tiene al menos un residuo de tirosina fosforilado) se evaluó y se correlacionó con la inhibición o aumento de la producción del CPS, como se discutió antes.

Re erencias Las publicaciones referidas en esta solicitud son como sigue: Arrecubieta et al., 1995, Gene 167:1-7 Austrian et al., 1966, J. Bacteriol. 92:1281-1284 Auzat et al., 1999, Mol. Mícrobiol. 34:1018-1028 Avery et al., 1931, J Exp. Med. 54:73 Avery et al., 1944, J Exp. Med. 79:137-157 Caparon et al., 1992, J. Bacteriol. 174:5693-5701 Chen et al., 1988, Gene 164:1 5-164 Cundell et al., 1995, Nature 377:435-438 Cundell et al., 1995, Infect. Immun.63:757-761 Gibson et al., 1993, Infect. Immun. 61:478-485 Harnrnerschmidt et al., 1996, Mol. Microbiol.20:1211-1220 Howden, 1976, J. Clin. Pathol.29:50-53 Iannelli et al., 1999, J. Bacteriol. 18 :2652-2652 Han et al., 1999, EMBO J. 18:3241-3248 im et al., 1998, J. Infect. Dis. 177:368-377 Kim et al., 1999, Mee. Immun. 67:2327-2333 necht et al., 1970, J. Exp. Med. 132:475-487 Levin et al., 1998, Mol. Microbiol. 30:209-219 MacLeod et al., 1950, J. Exp. Med. 92:1-9 Modde, 1978, Experimentia 34:1285-1286 Neufeld, 1902, Z. Hyg. Infektionskr. 40:54 Raz et al., 1997, Clin. Infect. Dis. 24:1164-1168 Ring et al., 1998, J. Clin. Invest. 102:347-360 Rosenow et al., 1997, Mol. Microbiol.25:819-829 Saluja et al., 1 95, Mol. Microbiol. 16:215-227 Schrager et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:1954-1958 Sellin et al, 1995, Microb. Pathogen. 18:401-415 St. Geme ?? et al., 1991, Infect. Immun. 59:1325-1333 Stevenson et al., 1996, J. Bacteriol. 178:4885-4893 Throup et al.» 2000, Mol. Microbiol. 35:566-576 Tomasz, 1964, Bacteriol. Proc. 64:29 Tuomanen et al., 1995, New Eng. J. Med. 332:1280-1284 Vincent et al., 1999, J. Bacteriol. 181: 3472-3477 Wani et al., 1996, Infect. Immun. 64:3967-3974 Watson et l., 1990, Infect. Immun. 58:3135-3138 Weiser, 1998, Microb. Drag esist. 4:129-145 Weíser et al., 1994, Infect. Immun. 62:2582-2589 Weiser et al., 1999, Infect. Immun. 67:3690-3692 Weyand et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:3192-3200 Ejemplo La invención será ahora descrita con referencia al siguiente Ejemplo. Este Ejemplo es provisto con el fin de ilustración únicamente, y la invención no se limita al mismo, sino más bien abarca toda variante que sea vidente como resultado de las enseñanzas aquí provistas. Dependencia del Oxígeno de la Expresión de Polísacárido Capsular por Streptococcus pneumoniae asociado con la Modificación Post-Translación del CpsD Los experimentos presentados en este Ejemplo demuestran que las diferencias en el fenotipo de opacidad entre los neumococos (es decir la forma O versus la forma T) se afectan por las concentraciones ambientales del oxígeno. y que las condiciones del crecimiento anaeróbico, tal como puede ocurrir en la neumonía, tienen influencia en la habilidad de los neumococos de forma O en aumentar la expresión del CPS y evadir la evacuación de la inmunidad. Los materiales y métodos usados en los experimentos presentados en el Ejemplo se describen ahora. Cepa Bacterial v Condiciones de Crecimiento Las cepas de S. pneumonías usadas en este estudio son las descritas en la Tabla I e incluidas previamente descritas como variantes O y T de aislados clínicos P303 (tipo 6A) , P324 (tipo 6B) , P68 (tipo 18C) y plO (tipo 9V) , como se describió (Kim et al.,m 1997; Weiser et al., 1994). Las bacterias crecieron en recipientes no sellados en un medio de soya semi-sintético (medio C+Y, pH 8.0) o tríptico, sin sacudir a 37°C, como se describió (Tomasz, 1964) . Los cultivos del caldo se colocaron sobre placas de agar de soya tríptico estándar (TSA) , que contienen 1% (p/v) de agar en donde 5000 unidades de catalasa (obtenida de Worthington Biochemical, Free old, NJ) , se rociaron. Los medios inoculados se incubaron a 37 °c en una jarra de extinción de vela, a no ser que se especifique de otra manera. La morfología de colonias se determinó en este medio de TSA bajo amplificación e iluminación transmitida oblicua, como se describió (Weiser et al., 1994).

Tabla I Reactividad de Cepas Neumocócicas y Mutantes con un Anticuerpo Monoclonal, que se Une Específicamente con Fosfotirosina Para cada cepa/mutante, el fenotipo 0 creció en la presencia del oxigeno se probó. ' + ' indica 5 reactividad con una sola banda de 25-27 kD.

La concentración ambiental del dióxido de carbono se controló bajo condiciones aeróbicas, usando un incubador de C02. Las condiciones de crecimiento anaeróbicas se obtuvieron usando el sistema BBL GasPark™, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) . En algunos experimentos, el componente de bicarbonato de sodio del sistema se empleó con el fin de generar una atmósfera de 10% de dióxido de carbono, y en otros experimentos no. Después de recoger las bacterias, el pH del medio de crecimiento se midió para confirmar que no se afectó por estas diferentes condiciones del cultivo. El análisis de los especímenes clínicos se realizó usando métodos similares. Un total de 502 pacientes que sufrían de meningitis se examinaron, de los cuales, aproximadamente el 20% se había probado bacteriológicamente tenía la meningitis A neumocócica. Una muestra de torunda nasofaríngea se recogió de pacientes en donde se había hecho un diagnóstico clínico supuesto de meningitis neumocócica. Esta muestra se colocó inmediatamente sobre agar de sangre de oveja al 5% y agar de soya tríptica que contiene 5000 unidades de catalasa, y las placas se incubaron a 3 °C en una atmósfera de aire, que contiene 5% de C02. Las muestras del fluido cerebroespinal (CSF) también se colocaron sobre tanto agar de sangre como en placas transparentes, como las muestras de sangre del paciente cultivadas en las cuales los neumococos se observaron en seguida de la incubación aeróbica estándar por hasta 48 horas. Inicialmente, los aislados que exhibieron la morfología típica en agar de sangre se confirmaron como siendo de neumococo por el teñido Gram y la reacción de Quellung. Todos los aislados se almacenaron a -80°C en preservadores bacteriales y la morfología de la colonia se determinó como se describe aquí. Las diferencias estadísticas entre los regímenes de los fenotipos T y 0 en los cultivos nasofaríngeos y del sitio invasivo se examinaron usando la Prueba de Extracto de Fisher .

Transformación Genética Los neumococos encapsulados y no encapsulados se hicieron competentes para la transformación natural, como se describió (Weiser et al., 1999). Las mutaciones en los sistemas de transducción de señal de dos componentes (TCSTSs) se transformaron en la capa P303 por la selección de colonias del medio que comprende la erítromicina (1 miligramo por mililitro) . Los transformantes encapsulados se clasificaron para la morfología alterada de colonia, y la expresión de CPS se confirmó por la reacción de Quellung, usando antisueros de tipo específico (obtenidos de Statens Sruminstitut, Copenhague, Dinamarca) .

Reacción de Quellung Las cápsulas neumocócicas se visualizaron en el crecimiento de bacterias a la fase de logaritmo medio en el medio semi-sintético bajo varias condiciones. Para la reacción de Quellung, un volumen igual de cultivo y una composición que comprende el anti-suero de tipo 6 y 1% (peso/volumen) de azul de metileno, obtenido de Statens Seruminstitut (Copenhague, Dinamarca) se mezclaron en un portaobjetos de vidrio durante un minuto, como se describió (Neufeld, 1902) .

Cuantificación de CPS Las variantes neumocócicas de forma O y T crecieron en un medio semi-sintético a la fase de logaritmo medio (A620 = 0.3) o durante 16 horas (en este tiempo las células estaban en la fase estacionaria) . Las células se recogieron por centrifugación a 2000 x g, se lavaron en una solución salina amortiguada de fosfato (PBS) , se trataron por sonido durante tres intervalos de 10 segundos a 0°C y se almacenaron a -20°C. Se usó una técnica ELISA de captura para determinar las cantidades de CPS en las variantes que crecen bajo las condiciones seleccionadas, como se describió (Kim et al., 1998) . Se usó el anti-suero del conejo de tipo específico (obtenido de Statens Seruiiinstitut, Copenhague, Dinamarca) con una dilución de 1:5000 en 0.05 molar de Na2Co3 (pH de 9.6) y se fijó durante la noche a la temperatura ambiente a las paredes de los pozos en las placas microtituladoras . Entre cada etapa de incubación, la placa se lavó cinco veces con el Tris amortiguador (que comprende 10 milimoles de Tris, 150 milimoles de NaCl, 0.05% de Brij™ 35, y 0.02% (peso/volumen) de azida de sodio. El Brij™ 35 (polioxietilen (23) lauril-éter, Ci2H25 (OCH2CH2) 23OH) es un detergente. El CP purificado obtenido de neumococos de tipo 6B, 6A, 18C o 9V se usaron en una concentración conocida, y se compraron de American Type Tissue Collection (Rockville, MD) para su uso como un estándar. El CPS en muestras de células tratadas con sonido se detectó usando anticuerpos monoclonales designados HASP 4 (que se unen específicamente con el tipo 6A y 6B de CPSs) . El HASP 22 (que se une específicamente con el tipo 18C de CPS), y SEP 33 (que se une específicamente con el tipo 9V de CPS), y se usaron a una concentración determinada en los experimentos piloto. La unión de anticuerpos monoclonales y el CPS se detectó usando antisueros que reaccionan específicamente con la IgM del ratón y que se conjugó con la fosfatasa alcalina. Este reactivo se usó como se describió (Kim y eiser, 1998) . La determinación total de la proteína células se llevó a cabo con los extractos de células tratadas con sonido, usando el estuche de ácido micro-bicinconínico, de acuerdo con las direcciones del fabricante (Piere Chemical Co., Rockford, IL) . La cantidad de CPS en la fracción del sobrenadante se basa en la concentración de proteínas en la fracción correspondiente del sonicado celular (es decir, con el fin de normalizar el contenido de CPS sobre una base de proteína por unidad) . El método ELISA de captura, usado para comparar cantidades del ácido teicóico total en sonicados celulares se ha descrito (Kim et al., 1998). Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron al menos tres veces. Los resultados se expresan como valores medios por concentración total de proteínas celulares.

Análisis Western Las bacterias crecieron en agar de soya tríptico, suplementado con catalasa, como se describió antes. Después del crecimiento bajo condiciones seleccionadas, durante 16 horas a 37 °C, las células se removieron de la superficie usando una torunda Dacron™ estéril, se resuspendieron en PBS y se lavaron en PBS con el fin de ajustar la densidad celular, tal como A62o = 0.5. Después de centrifugar, las células en pellas se resuspendieron en amortiguador de carga de gel de Laemmli y se calentaron a 100 °C durante 5 minutos. Las muestras se separaron luego por el análisis de SDS-PAGE en 12.5% (peso/volumen) de geles de poliacrilamída, y luego se transfirieron a membranas de Immobilon-P™, como se describió (Wani et al., 1996). El inmuno-manchado se realizó usando un anticuerpo monoclonal designado 4G10 (Upstate Biotechnology Inc., altham, MA) con una dilución de 1:2000 en amortiguador de TSBP (Wani et al., 1996) y la reactividad de las muestras manchadas con este anticuerpo se detectó usando el antisuero de la IgG del ratón, conjugado con la fosfatasa alcalina, como se describió (Kim et al., 1999) . La carga de aproximadamente números iguales de bacterias se confirmó por el inmuno-manchado de membranas duplicadas usando los antisueros descritos previamente, elevados contra el neumococo total (Vani et al., 1996) .

Análisis Northern El ARN total se aisló de las variantes O y T de las células cepa P303, crecidas en la fase de logaritmo medio en el medio semi-sintético bajo condiciones atmosféricas y anaeróbicas y purificado como se describió (Weyand et al., 2000), La siguiente separación del ARN en un gel de formamida, ARN teñido con bromuro de etidio, se fotografió y la imagen se digitalizó por comparación con los marcadores de tamaño del ARN. Este ARN se transfirió a una membrana, usando el sistema VacuGene™ XL, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia L B Biotechnology, Uppsala, Suecia) . La membrana se hibridizó previamente en una solución que comprende el 0.5 molar de NaP04 a un pH de 7.2, 1.5 milimolar de EDTA y 7% (peso/volumen) de SDS durante 15 minutos a 65°C. La sonda se preparó de un fragmento interno del gene cps4D y se amplificó por la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando aprestos que tienen las siguientes secuencias: 5 ' -CCGGAATTCG TACAAATATA CAGTTGAGCG GAGATAAAC-3 ' (SEQ ID NO: 1) Y 5 ' -CGCGGATCCT GTTGCTGTTA CCAAGATGGA CG-3' (SEQ ID NO: 2) y el ADN genómico, obtenido de una cepa de etipo 4. La cepa es la misma cepa usada en la secuencia de genoma completa por el Institute for Genomic Research. El producto de la PCR fue digerido usando la endonucleasas de restricción BamHI y EconRI, y luego clonado en un vector que tiene terminadores de transcripción que flanquean el polienlazador para permitir la clonación de las secuencias de estreptococos. Este vector se construyó de pJDC9 por la inserción del cásete de resistencia a la kanamicina de extremos romos de pUK4K (Pharmacia, Upsalla, Suecia) en un sitio Clal de extremos romos, para permitir la selección de este marcador en E.coli (Chen y Morrison, 1988). El fragmento de cps4D se insertó en el vector digerido de BamHI y EcoRI y se transformó en la cepa de E. coli DH5ot. El ARN total se extrajo de las variantes O y T neumocócicas de la cepa P303 crecida a una fase de logaritmo medio en un medio de soya tríptico, bajo condiciones atmosféricas y anaerobicas. Los resultados de los experimentos presentados en este ejemplo son ahora descritos.

Selección para Variantes Fenotipicos en Humanos Con el fin de probar si la selección ocurre para diferentes fenotipos neumocócicos en transporte y la bacteremia en humanos, aislados en parejas del mismo serotipo se obtuvieron de la nasofaringe y sangre de pacientes que exhibieron signos de sepsis. Fue necesario obtener aislados en parejas, debido a la heterogeneidad de cepa a cepa en la morfología de colonias no relacionada a la opacidad. Los neumococos pueden no ser aislados de la nasofaringe de pacientes bacterémicos, una vez que el tratamiento antibiótico se ha iniciado. Los cultivos de la nasofaringe y la sangre, por lo tanto, se obtuvieron sustancialmente en forma simultánea. Esta limitación requirió que el estudio sea llevado a cabo en una ubicación geográfica que tiene una alta incidencia de bacteremia neumocócica, con el fin que un número suficiente de aislados en parejas pueda ser obtenido. Los aislados de sangre y nasofaríngeos se obtuvieron de 19 pacientes adultos en Blantyre, Malawi y se consideraron solamente como aislados en parejas, si estos aislados son mostrados subsiguientemente ser del mismo tipo por la reacción de Quellung, que usa el antisuero de tipo específico. La mayoría de los aislados en parejas fueron del tipo I, el tipo más común en esta ubicación, como se indica en la Tabla II. La mayoría de los pacientes también probaron ser positivos para la infección con el virus de inmunodeficiencia humana, que se cree cuenta para la alta incidencia de la enfermedad neumocócica invasiva entre estos pacientes. De los 19 aislados en parejas, 17 (89%) fueron del fenotipo T en la nasofaringe, en tanto 12 (63%) fueron del fenotipo O en la sangre. De los diez aislados en parejas, en los cuales el fenotipo de los neumococos obtenido de los dos sitios fue discordante, todos exhibieron un fenotipo T más en la nasofaringe (P<0.001). Esto demuestra que, en general, hay una selección para variantes fenotípicas que resultan en la presencia en la sangre de más fenotipo O, derivados entre la población predominantemente de tipo T en la nasofaringe en la infección bacterémica natural Tabla II Fenotipo de Opacidad de los Aislados Obtenidos de las Infecciones Humanas de Transporte e Invasivas Notas: 1 4/19 aislados invasivos se obtuvieron del fluido cerebroespinal más bien que de la sangre 2 N/A significa estado clínico no disponible.

Efecto del Oxígeno en Cantidades de CPS Los factores huésped y bacteriales que pueden promover la selección de las variantes O durante la infección y las variantes T durante el transporte, se investigaron. Se hipotetizó que la tensión menor del oxígeno de la clase que se encontrará en el pulmón consolidado,. promoverá una transición del fenotipo T al 0. El crecimiento de un aislado clínico de tipo 6A, P303, en concentraciones reducidas de oxígeno no tuvo efecto en el régimen de interrupción espontánea de la forma T a la 0. El crecimiento bajo condiciones anaeróbicas (en la presencia de una concentración elevada de dióxido de carbono) , sin embargo, se asocia con un desplazamiento a una morfología de colonia mayor y más mucoide, que se marcó particularmente por la variante 0, como se muestra en la Figura 1A. Debido a que los neumococos exhiben un fenotipo 0 que expresa mayores cantidades de CPS que aquéllas exhibidas por el fenotipo T, se considera posible que el tamaño mayor de colonias asociado con la forma O fue un resultado de producción aumentada de este material (Kim et al., 1998) . En los estudios iniciales, la zona refráctil de colonias bacteriales que rodean el CPS se visualizó usando la reacción de Quellung y los antisueros de etipo 6, como se muestra en la Figura IB. Esta zona fue mayor para la variante 0 crecida bajo condiciones anaeróbicas en la presencia del 10% del dióxido de carbono, en comparación con cualquier crecimiento del mismo fenotipo, en la presencia del oxigeno o el crecimiento de la variante T bajo cualquiera de las condiciones probadas, que incluyen la ausencia del oxígeno. En contraste, cuando las bacterias se cultivaron bajo condiciones atmosféricas, una zona de material capsular no pudo ser detectada alrededor de los neumococos de la forma T. Este resultado confirmó la capacidad de la forma 0 para sintetizar cantidades crecientes de CPS, e indicaron que la tensión reducida del oxigeno, tensión mayor del dióxido de carbono, o ambos, promueven la producción aumentada del CPS. El efecto de la concentración del oxigeno ambiental y el dióxido de carbono, se evaluó cuantitativamente, usando un ensayo desarrollado midiendo cantidades de CPS, como se indica en la Figura 2 (Kim et al./ 1998). Las cantidades del CPS por miligramo de proteína celular total, como se evaluaron usando el análisis ELISA de captura, descrito aquí, se correlaciona con el área superficial de la colonia y con los valores del volumen capsular, calculados con base en la visualización de las zonas, usando la reacción de Quellung y con el área superficial de la colonia, como se indica en la Tabla III. Las bacterias de la forma O en cualquier crecimiento de fase de logaritmo medio o fase estacionaria exhibió cantidades aumentadas de CPS asociado con las células, comparado con los organismos de forma T. El crecimiento de la variante 6A de tipo O bajo las condiciones anaeróbicas, en la presencia del 10% del C02, causó una elevación de 7.9 veces en la cantidad del CPS producida, comparada con la producción de CPS en las mismas células cultivadas bajo condiciones atmosféricas. Comparado con las variantes T crecidas bajo condiciones anaeróbicas, en la presencia del 10% del CO2, la variante O obtuvo 29 veces más de CPS. Resultados similares se obtienen usando los aislados 0 y T, obtenidos de dos aislados clínicos no relacionados (es decir, usando los tipos 6B y 18C) .

Tabla III Características del Crecimiento Neumocócico Bajo Varias Condiciones 3 Para variantes 0 y T de aislado clínico 6A del mismo tipo. 4 Estos valores se basan en las colonias observadas después de 16 horas de crecimiento. Los valores representan el promedio de determinaciones hechas usando tres colonias aisladas de un solo pozo. 3 Estos valores se basan en el material capsular revelado usando la reacción de Quellung y la fórmula para el volumen de un elipsoide esférico, V = (TC/6)LW2. LOS valores representan el promedio de determinaciones para tres formas diplococales divididas por dos para corresponder a una sola célula. "UD" significa una zona de material capsular no detectable. 6 Estos valores se basan en la evaluación ELISA de captura de organismos crecidos en cultivos líquidos en la fase del logaritmo medio. Los valores son el promedio de dos determinaciones separadas.

La producción de CPS en el sobrenadante del cultivo se evaluó para los neumococos de tipo 18C después del crecimiento a la fase estacionaria. La observación que una cantidad mayor de polisacárido se produce en el sobrenadante de cultivo de la variante de forma O conforme la concentración del oxígeno disminuye y conforme la concentración del dióxido de carbono aumenta, indica que la producción de CPS aumentada fue atribuible a la síntesis aumentada del CPS por células bajo condiciones de oxígeno disminuidas / dióxido de carbono aumentadas, más bien que siendo atribuidas a la liberación disminuida del CPS de células bajo las condiciones de oxígeno aumentado / dióxido de carbono disminuido. Un aislado de tipo 9V se usó para determinar si la síntesis aumentada de CPS se puede atribuir al oxígeno disminuido o dióxido de carbono aumentado. Las bacterias de tipo 9V crecidas en la fase estacionaria, en la presencia del 10% de dióxido de carbono, exhibió una producción del CPS 12 veces mayor en la ausencia del oxigeno, que las mismas células crecidas en la presencia del 10% de dióxido de carbono y en la presencia del oxigeno. Esto confirmó que la tensión del oxigeno, más bien que la tensión del dióxido de carbono, es el factor ambiental predominante que afecta el grado de la producción de CPS.

Cambios en la Producción de CPS correlacionados con los cambios en cps/D CpsD La siguiente fase del estudio se dirige al mecanismo por el cual el efecto del oxigeno en la producción de CPS es mediado, La implicación del sistema de traducción de señal de dos componentes, para detectar y transducir la tensión / presencia del oxigeno se examinó. Las mutaciones marcadas, descritas previamente, en 11 de los 12 sistemas de transducción de señal de dos componentes, encontrados en el genoma de un aislado de tipo 3, fue transformado en la cepa P303, como se describió (Throup et al., 2000). Mutaciones albergadas de 10 constructores, en respuesta a los homólogos reguladores se obtuvieron, donde hay 7 mutaciones que albergan constructores en los homólogos de cinasa de la histidina.- Para cada uno de los 17 homólogos de constructores probados en P303, no hubo efecto en el tamaño de la colonia aumentado o la zona de formación de cápsula, como se evaluó usando la reacción de Quellung, en experimentos en donde las células crecieron bajo condiciones anaeróbicas. Este resultado indicó que es oro probable que el efecto del oxigeno sea mediado a través de un TCSTS, aunque uno de estos sistemas en los neumococos no pudo ser examinado, debido a que los genes parece son esenciales. Los genes en un sitio conocido que se van a requerir para la expresión de CPS se examinaron en seguida. Puesto que el efecto del oxigeno en cantidades del CPS se observaron en capas de múltiple tipos, los genes conservados entre diferentes tipos se consideran los candidatos más probables. Entre los genes en el sitio de la cápsula, sólo los primeros cuatro, cpsA-D son comunes en los neumococos de diferentes tipos (Iannelli et al., 1999). Los neumococos de tipo 3 se conoce forman colonias mucoides y tienen cápsulas grandes, como se evaluó por la reacción de Quellung, donde el crecimiento es bajo condiciones atmosféricas, como se indicó en la tabla I (Knecht et al., 1970) A diferencia de todos los otros tipos de neumococos probados, las cepas de tipo 3 fallaron en mostrar un aumento en los tamaños de colonias o cápsulas, cuando las se cultivaron bajo condiciones anaeróbicas, con relación a los tamaños cuando se cultivaron bajo condiciones atmosféricas. Con base en esta observación, las diferencias en cpsA-D entre el tipo 3 y el lugar de otros tipos fueron determinadas.

Los homólogos de cpsA, que codifican un atenuador de transcripción supuesto, y cpsB, que codifican una proteina de función desconocida, están presentes en el sitio de encapsulado de tipo 3 (Genbank, No. de acceso Z47219; Arrecubierta, 1995) . El CpsC que codifica el gene en los neumococos del serotipo 2, está altamente conservado en el sitio de encapsulado de tipo 3, pero el CpsD pronosticado en los neumococos del serotipo 3, es truncado en seguida del aminoácido 69 (de 226) . El CpsC y CpsD son requeridos para la expresión de la cápsula neumococal y juntos son homólogos a una sola proteina (Wzc) expresada en Escherlchia coli que está implicada en la regulación de longitud de cadena y exporta el ácido colánico designado del polisacárido extracelular (Morona et al., 1999; Stevenson et al., 1996). En E. coli, Wzc sufre una autofosforilación reversible en un residuo de tirosina (Vincent et al., 1999). Un anticuerpo monoclonal, que se designa 4G10, que se une específicamente con los residuos de tirosina fosforilados, se usó para determinar, por el análisis Western, que la tirosina fosforilada está presente en los neumococos. Una simple banda de aproximadamente 26 kD, el tamaño pronosticado de CpsD, estaba presente en los Usados celulares totales del aislado del tipo 6A. Una simple banda del mismo tamaño fue también vista en los Usados de células totales de las cepas de los tipos 6B, 18C y 9V, usadas en este estudio, pero estaba ausente de los neumococos de tipo 3 (que tienen un CpsD truncado) . Estas observaciones indican que el CpsD es fosforilable en un residuo de tirosina. Evidencia ulterior que 4G10 fue el reconocimiento de CpsD que tiene residuos de tirosina fosforilados se obtuvieron comparando las cepas D39 (como un mutante no encapsulado) y R6x (una cepa que tiene una supresión de la pareja base 7504, que extiende cps2A-H, del cual sólo A-D son comunes en otros tipos; Iannelli et al 1999) . La mutación del neumococo de tipo R6x se corrigió en algunos experimentos transformando las bacterias usando el ADN obtenido de cualquier cepa padre D39 (tipo 2) o una cepa de tipo 3, para suministrar una cepa encapsulada, con cualquier cápsula de tipo 3 ó 2, en el antecedente genético de tipo 2 de D39. La falla de 4G10 en reaccionar con el transformante T6x de tipo 3 y la reacción del anticuerpo con el transformante R6x de tipo 2, confirmó que la expresión de la proteína que corresponde a esta banda requiere uno de los primeros cuatro genes comunes en el sitio de encapsulado y una copia intacta de cpsD. Se determinó que la proteína reactiva 4D10 no será probablemente CpsA o B, con base en el tamaño. Existen sólo 15 cambios de los aminoácidos conservativos entre los CpsC de tipos 2 y 3, de los cuales ninguno implica la tirosina. La carencia de la banda reactiva 4G10 en la cepa de tipo 3, indicó que la proteína reactiva 4G10 no es CpsC. Por lo tanto, se concluyó que la proteina CpsD comprende un residuo de tirosina que se puede fosforilar en el neumococo. El efecto del crecimiento bajo varias concentraciones del oxígeno y el dióxido de carbono en la fosforilación de la tirosina de CpsD, se examinó. Los Usados de células totales de las formas 0 y T del aislado neumocócico de tipo 5A, designado P303, que ha crecido bajo varias concentraciones del oxígeno y el dióxido de carbono, se ajustaron a una densidad equivalente y se examinó por el análisis Western, usando el anticuerpo 4G10 monoclonal específico de la fosfotirosina . Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3. Una sola banda del tamaño esperado para CpsD se detectó en la variante O crecida en la presencia del oxígeno. No hubo reactividad con el extracto obtenido de un número aproximadamente igual de células crecidas anaeróbicamente, como se indica en el carril 1 de la Figura 3. No hubo efecto aparente en las diferencias en la tensión del dióxido de carbono de <0.1 al 10%, como se indica por los resultados en los carriles 2.4 de la Figura 3. Bajo todas las condiciones probadas (oxígeno de < 0.1 al 21% y dióxido de carbono de <0.1 al 10%), la reactividad del anticuerpo con los extractos celulares de la variante T fue moderada. Resultados similares se obtuvieron usando otras cepas. Por lo tanto se concluyó que la fosforilación de la tirosina de CpsD se afectó por el fenotipo de opacidad y requiere el crecimiento en la presencia del oxigeno. La diferencia en la fosforilación de la tirosina puede afectar la actividad de CpsD y cuente para la expresión disminuida de CPS en los neumococos 0, en la presencia del oxigeno. Ninguno de los neumococos 0 ni T crecidos expresan anaeróbicamente la tirosina fosforilada sin embargo las dos formas fenotípicas exhibieron grandes diferencias en el grado de la producción de CPS. El análisis Northern se usó para determinar si las diferencias entre las variantes 0 y T se deben a las diferencias en el nivel de transcripción de cpsD. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 4. El ARN celular total se obtuvo de las formas O y T de la cepa P303 neumocócica crecida en cualquier condición atmosférica o anaeróbica, en la presencia del 10% del dióxido de carbono. El ARN se probó usando el fragmento clonado de cpsD. Las diferencias cuantitativas en la actividad de transcripción fueron determinadas evaluando la hibridización de la sonda rotulada con radio con cpsD en mARN y ajusfando estos valores a la cantidad total del ARN presente en la mezcla del ensayo de hibridización. Estos experimentos demostraron que la concentración del oxigeno no tubo efecto sustancial en el nivel de la transcripción de cpsD. Sin embargo, el cpsD se transcribió a un nivel mayor de 3.4 veces en las células de la forma T, con relación a las células de forma 0. Por lo tanto, se concluyó que la regulación de transcripción de cpsD determina el fenotipo de opacidad de los neumococos. Sin el deseo de estar ligado a cualquier teoría particular de operación, se cree que el CpsD regula la producción del CPS. La correlación entre las diferencias observadas en el grado de la fosforilación de la tirosina de CpsD y diferencias en la producción del CPS apoyan esta teoría. Se cree que el CpsD funciona como una cinasa de tirosina, basada, en parte, en su similaridad de la secuencia de aminoácidos a la enzima de autofosforilación de la tirosina en E. coli, que está implicado en la regulación de la longitud de cadena y exporta el ácido colánico del polisacárido extracelular . El Cps23FD tiene un 30% de identidad y 49% de similaridad sobre 188 de los 229 aminoácidos al Wzc. El CpsD de los neumococos del serotipo 23f contienen una secuencia de aminoácido terminal de carboxilo, no usual (YGSYGNYGNYGKNKK; SEQ ID NO: 3) la cual contiene una característica repetitiva (YGX)4, que incluye residuos de tirosina. Esta región terminal de carboxilo exhibe considerablemente mayor heterogeneidad de la secuencia de aminoácidos entre las variantes neumocócicas, que el resto del CpsD. Se cree que la variabilidad en la producción del CPS entre las cepas neumocócicas se puede atribuir a la variabilidad de esta porción terminal de carboxilO/ entre las cepas, la variación de secuencia que afecta la habilidad de fosforilar de la proteína. Un número de otras cinasas de proteínas bacteriales se han identificado y ellas tienen en común una terminal C con una característica repetitiva rica en tirosina (lian et al, 1999) . La inhabilidad de crear una cepa neumocócica que aloja una mutación en cpsD, mientras mantiene la habilidad de la cepa en producir CPS, es una evidencia más de la importancia de este gene en CPS y la producción de cápsula. El siguiente modelo de un mecanismo para regular la producción de CPS en respuesta al fenotipo de opacidad de colonia y la tensión del oxígeno se proponen. El modelo implica la regulación de transcripción de cpsD y la modificación post-transición de CpsD. El CpsD es un factor regulador negativo el cual actúa en genes implicados en la biosíntesis del CPS específico de tipo neumocócico. La transcripción de cpsD relativamente baja cuenta para las cantidades relativamente altas de CPS, expresadas en lo neumococos de tipo 0, bajo condiciones anaeróbicas . Aparte de la regulación de transcripción de cpsD, que cuenta para una proporción significante de la regulación de expresión de CPS, un segundo nivel de regulación está implicado, es decir la fosforilación o autofosforilación de residuos de tirosina en CpsD. La fosforilación de CpsD afecta sólo la variante 0 y requiere el crecimiento bajo condiciones aeróbicas . La capacidad de detección de CpsD, que es fosforilado en uno o más de los residuos de tirosina, sólo en la variante 0, puede ser debida a la actividad de la fosfotasa aumentada en neumococos T. La fosforilación de tirosina aumenta la actividad reguladora negativa de CpsD, de modo que la síntesis del CpsD fosforilado disminuye bajo condiciones aeróbicas. Como resultad, menos CPS se obtiene por las variantes 0 bajo condiciones aeróbicas que bajo las condiciones de crecimiento anaeróbicas. La producción de CPS, relativamente baja, en los neumococos de forma T, aún en la ausencia de la fosforilación de tirosina apreciable de CpsD, se puede atribuir a la expresión aumentada de cpsD en los neumococos de forma T. Lo que se describió previamente como el crecimiento mejorado bajo condición anaeróbica puede, de hecho, ser un efecto de la síntesis de CPS aumentada, que resulta en el tamaño grande de colonias (Modde, 1978) . Los homólogos ' de CpsD que tienen similaridad aún más grande a Wzc, se presentan en muchas otras especies de bacterias que expresan los polisacáridos superficiales. Ejemplos de tales especies incluyen: Streptococcus agalactina r Staphylococcus aureusr Klebsiella pneumoniae y Acinetobacter johnsonii . Puesto que las cápsulas y su tamaño son determinantes críticos de virulencia, la habilidd de regular las cantidades de CPS con base en la modificación de transcripción y post-transcripción de esta clase de genes / proteínas puede ser importante en facilitar la habilidd de las bacterias encapsuladas a adaptarse a los diferentes requisitos de colonización e infección. La descripción de cada patente, solicitud de patente y publicaciones citadas aquí, se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. Mientras la invención se ha descrito con referencia a modalidades específicas, es evidente que otras modalidades y variantes de la invención pueden ser ideadas por los expertos en la materia, sin apartarse del espíritu y ámbito verdaderos de la invención. Las reivindicaciones anexas incluyen todas esas modalidades y variaciones de equivalentes .

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. En un método para producir polisacáridos capsulares desde un neumococo, manteniendo este neumococo en un medio de crecimiento, la mejora que comprende mantener un gas, que tenga una concentración sub-atmos érica del oxigeno, en contacto con dicho medio de crecimiento.

2. La mejora de la reivindicación 1, en que el gas tiene una concentración del oxigeno no mayor de aproximadamente el 16%.

3. La mejora de la reivindicación 2, en- que el gas tiene una concentración del oxigeno no mayor de aproximadamente el 0.1%.

. La mejora de la reivindicación 1, en que el neumococo es un organismo del género Streptococcus.

5. La mejora de la reivindicación 4, en que el neumococo es un organismo de la especie Strptococcus pneu oniae .

6. La mejora de la reivindicación 5, en que el neumococo es una variante de la especie Streptococcus pneumoniae, seleccionada del grupo que consta de las variantes 6A, 6B, 18C y 9V.

7. En un método para producir polisacáridos capsulares a partir de neumococos/ por mantener estos neumococos en un medio de crecimiento, la mejora que comprende mantener un gas, que tiene una concentración sobre-atmosférica de dióxido de carbono, en contacto con el medio de crecimiento.

8. La mejora de la reivindicación 7, en que el gas tiene una concentración del dióxido de carbono de al menos aproximadamente el 3% .

9. La mejora de la reivindicación 8, en que el gas tiene una concentración de dióxido de carbono de al menos aproximadamente el 10%.

10. La mejora de la reivindicación 7, en que el gas tiene una concentración sub-atmosférica del oxígeno.

11. Un método para aliviar una infección neumocócica en un animal, este método comprende mantener el animal en contacto con un gas, que tiene una concentración sobre-atmosférica del oxígeno.

12. El método de la reivindicación 11, en que los pulmones del animal se mantienen en contacto con dicho gas.

13. El método de la reivindicación 11, en que el gas tiene una concentración del oxígeno de cuando menos aproximadamente el 25%.

14. El método de la reivindicación 13, en que el gas tiene una concentración del oxigeno de cuando menos aproximadamente el 50%.

15. El método de la reivindicación 14, en que el gas es el oxigeno sustancialmente puro.

16. El método de la reivindicación 11, en que la infección se selecciona del grupo que consta de la neumonía, bacteremia, sepsis y meningitis.

17. Un método para obtener una preparación inmunogénica, para la administración a un animal con riesgo de desarrollar una infección neumocócica, este método comprende : mantener las células neumocócicas en un medio de crecimiento, que tiene un contenido de oxígeno menor que el mismo medio, equilibrado a la misma temperatura con aire normal; y aislar el polisacárido capsular, producido por las células a partir de dichas células, por lo cual el polisacárido aislado constituye la preparación inmunogénica.

18. En un método para producir polisacáridos capsulares, a partir de neumococo, manteniendo estos neumococos en un medio de crecimiento, la mejora que comprende mantener la concentración del dióxido de carbono del medio de crecimiento a un nivel al menos igual a la concentración del dióxido de carbono, en el mismo medio de crecimiento, equilibrado a la misma temperatura con un gas, que comprende el 5% de dióxido de carbono.

19. Método para producir polisacáridos neumocócicos, este método comprende mantener las células neumocócicas en un medio de crecimiento, que tiene un contenido de oxígeno menor que el mismo medio equilibrado a la misma temperatura con aire normal.

20. El método de la reivindicación 19, en que el medio carece sustancialmente del oxígeno.

21. El método de la reivindicación 19, en que el medio tiene un contenido de dióxido de carbono, el cual es mayor que el mismo medio equilibrado a la misma temperatura con aire normal.

22. El método de la reivindicación 21, en que el medio se satura con el dióxido de carbono.

23. El método de la reivindicación 21, en que el medio comprende una sal de carbonato o de bicarbonato.

24. Un método para evaluar si un compuesto de prueba es útil para aliviar una infección neumocócica en un animal, este método comprende comparar: el grado de fosforilación del CpsD en células neumocócicas, mantenidas en la presencia del compuesto de prueba; y el grado de fosforilación del CpsD, en el mismo tipo de células, mantenidas en la ausencia del compuesto de prueba; en que el grado de fosforilación del CpsD en las células, mantenidas en la presencia del compuesto de prueba, es menor que el grado de fosforilación del CpsD en las células mantenidas en la ausencia del compuesto de prueba, entonces este compuesto de prueba es útil para aliviar la infección.

25. El método de la reivindicación 24, en que el grado de fosforilación del CpsD es evaluado contando el número de residuos de tirosina fosforilados/ presentes en el CpsD.

26. El método de la reivindicación 124, en que el grado de fosforilación del CpsD es evaluado contando la fracción del CpsD que tiene al menos un residuo de tirosina fosforilado.