CN100529054C - 调节肺炎球菌荚膜多糖的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及调节诸如肺炎链球菌的肺炎球菌中荚膜多糖生产的方法。本发明还涉及缓解动物体内肺炎球菌感染的方法，以及鉴定能够在动物体内调节肺炎球菌感染的制剂。图(1)包括图1Ai-Avi和1Bi-1Bvi，它们是表明通过Quellung反应评估的环境氧气和二氧化碳浓度对菌落形态影响的图像。

Description

调节肺炎球菌荚膜多糖的生产
本研究得到了美国政府资金的部分资助(美国公共卫生服务授权编号AI38436和AI44231)，因此，美国政府可以拥有本发明的部分权利。
发明背景
本发明总体上涉及用链球菌生物生产荚膜多糖材料，并且涉及用所述材料生产疫苗。
肺炎链球菌(有时候被称为肺炎球菌)一般是寄居在人类鼻咽的粘膜表面上的共生生物。当宿主因素容许该生物进入下呼吸道时，会导致严重的炎性反应。引起一种密集的固结化，即肺泡空气间隙中充满了溢泌物，这种症状通常被称为肺炎(Tuomanen et al.，1995)。肺炎球菌感染的最严重的表现是菌血症，它可能并发脓毒症、脑膜炎、或这两者。在成年人体上，菌血症通常是肺炎的并发症(Raz et al.，1997)。
肺炎球菌抵抗将该生物从血液中清除的主要机制(即调理吞噬)的能力需要表达该生物的主要毒力因子，该因子是多糖荚膜(Avery et al.，1931；Watson et al.，1990)。肺炎球菌能够合成不少于90种的在结构上独特的荚膜多糖(CPSs)。
肺炎球菌CPS具有抗吞噬特性，并且能抑制与宿主细胞的粘附。它是运载(即该生物从一个受感染的、但不一定有症状的个体传播到另一个个体)以及有可能在疾病病理学的随后方面的一个关键步骤(Ring etal.，1998)。在其他有荚膜的生物(例如，流感嗜血菌、脑膜炎萘瑟氏菌、酿脓链球菌和无乳链球菌)上的类似的发现，业已使人们理解了CPS的量为什么必须临时改变，以便能够实现与宿主细胞的粘附性相互作用，以及对体液免疫力的抗性(Hammerschmidt et al.，1996；Levin et al.，1998；Schrager et al.，1996；Sellin et al.，1995；St.Geme III et al.，1991)。
即使在同一种菌株内，由肺炎链球菌所表达的CPS的量也不同。调节CPS表达的调控机制以前尚不完全了解。大多数肺炎球菌分离物能在至少两种形式之间发生表型变化，这两种形式可以通过菌落的不透明性进行区分(Weiser，1998；Weiser et al.，1994)。不透明型(O)菌落与相同菌株的透明(T)变体在所合成的CPS的量方面不同，O-型的菌落通常能产生更大量的CPS(Kim et al.，1998)。
由肺炎球菌变体所产生CPS量的相对小的差异，可能对毒力产生重要影响(MacLeod et al.，1950)。与T-型菌落相比，O-型菌落所产生的CPS的量高出1.2-5.6倍，这种提高与肺炎球菌细胞对免疫血清的调理吞噬提高了的抗性相关(Kim et al.，1999)。在系统感染的鼠类模型上，只有若干种肺炎球菌菌株O变体能引起脓毒症(Kim et al.，1998)。相反，所述T型能表达较大量的其他细胞表面多糖——磷壁酸。肺炎球菌细胞壁磷壁酸与CPS共价连接，并且含有一种不常见的宿主样成分-磷酸胆碱。这种多糖导致了肺炎球菌细胞通过血小板活化因子的受体与上皮细胞粘附(Cundell et al.，1995；Cundell et al.，1995；Kim et al.，1998)。T型还表现出包括CbpA在内的细胞表面胆碱结合蛋白的改变了的分布，这种改变起着促进粘附和寄居的作用(Rosenow et al.，1997)。在由幼小的大鼠模型携带期间，选择表现出T，而不是O表现型的肺炎球菌变体(Weiser et al.，1994)。以上观察表明，肺炎球菌可以在具有更强的粘附和携带能力的形式(即T型)和更适合在入侵性感染型的非粘附形式(O型)之间变化。
由肺炎球菌所表达的CPSs的鉴定构成了血清分类的基础，这是一种用于区分肺炎链球菌变体的诊断方法。由于不同的变体可能具有不同的生理学特征(例如，对抗微生物制剂的易感性或肺炎发作或发展的特有速度)，区分肺炎球菌变体的能力在医学上是有利的。另外，由于人类(或其他脊椎动物)免疫系统识别并攻击肺炎球菌变体的能力取决于它专一性识别各种变体的CPS的能力，获得肺炎球菌变体专一性CPS的能力，能显著影响用于缓解与肺炎球菌感染相关疾病的治疗和预防方法以及组合物的开发。例如，已知的肺炎球菌疫苗包括从多种肺炎球菌变体中获得的CPS。
仍然存在着对用于与肺炎球菌感染相关的疾病的诊断、预测、治疗和预防组合物和方法的明显的需求。很多上述组合物和方法包括、采用或依赖于对分离的肺炎球菌CPS的开发。现有用于从肺炎球菌中分离CPS的方法的特征通常是产量低。本发明包括改良可以从肺炎球菌变体中获得的CPS产量的方法，和提高产量，以及与肺炎球菌相关的诊断预测、治疗和预防组合物和方法的应用。
发明简述
本发明涉及一种通过在一种生长培养基中维持肺炎球菌，改良由该肺炎球菌产生荚膜多糖的方法。在一方面，其改进在于包括保持一种具有亚大气浓度的氧气的气体与所述生长培养基接触(例如，氧气浓度不超过大约16％或不超过大约0.1％)。所述肺炎球菌可以是链球菌属的生物，如肺炎链球菌的生物(例如，肺炎链球菌变体6A、6B、18C和9V中的一种)。在另一方面，其改进在于包括维持一种具有超大气浓度(例如，至少大约3％或10％)的二氧化碳的气体与所述生长培养基接触。在第三方面，其改进在于包括保持一种具有超大气浓度的二氧化碳和亚大气浓度的氧气的气体与所述生长培养基接触。在另一方面，其改进在于包括将所述生长培养基的二氧化碳浓度保持在至少等于在相同温度下用含有5％二氧化碳的气体平衡的相同生长培养基中二氧化碳的浓度。
本发明还涉及一种缓解动物体内肺炎球菌感染的方法。该方法包括保持所述动物(例如，至少是该动物的肺)与一种具有超大气浓度(例如，25％、50％或100％)的氧气的气体接触。可以用该方法缓解的感染的例子包括肺炎、菌血症、脓毒症、和脑膜炎。
本发明还涉及一种制备用于给有发生肺炎球菌感染的危险的动物服用的免疫原性制剂的方法。该方法包括在其氧气含量低于在相同温度下用普通空气平衡的相同培养基中的氧气含量的生长培养基中维持肺炎球菌细胞，并从该细胞中分离由该细胞所产生的荚膜多糖。所述荚膜多糖构成了所述免疫原性制剂。
本发明还涉及一种生产肺炎球菌多糖的方法。该方法包括在其氧气含量低于在相同温度下用普通空气平衡的相同培养基中的氧气含量的生长培养基中维持肺炎球菌细胞，例如，基本上缺乏氧气的培养基。在一种实施方案中，所述培养基的二氧化碳含量高于在相同温度下用普通空气平衡相同培养基中的二氧化碳含量，例如，由二氧化碳饱和的培养基或含有碳酸盐或碳酸氢盐的培养基。
本发明包括一种评估测试化合物是否可用于缓解动物体内的肺炎球菌感染的方法。该方法包括
(a)在有所述测试化合物的条件下维持的肺炎球菌细胞中CpsD的磷酸化程度，和
(b)在没有所述测试化合物的条件下维持的相同类型细胞中CpsD的磷酸化程度。
如果在有所述测试化合物的条件下维持的细胞中的CpsD的磷酸化程度，低于在没有所述测试化合物的条件下维持的所述细胞中的CpsD的磷酸化程度的话，该测试化合物就可用于缓解所述感染。例如，CpsD的磷酸化程度可以通过测定存在于CpsD上的磷酸化酪氨酸残基的数量或通过测定具有至少一个磷酸化的酪氨酸残基的CpsD的比例进行评估。
附图说明
图1，包括图1Ai-Avi和1Bi-1Bvi，它们是表明通过Quellung反应评估的环境氧和二氧化碳浓度对菌落形态影响的图像。在37℃下，在大气条件下(图1Ai，1Aiv，1Bi和1Bvi)，在含有较高二氧化碳浓度的大气条件下(图1Aii，1Av，1Bii和1Bv)，在含有较高二氧化碳浓度的厌氧条件下(图1Aiii，1Avi，1Biii和1Bvi)，在补充了过氧化氢酶的T营养琼脂上生长6A型肺炎球菌分离物的不透明的(图1Ai，1Aii，1Aiii、1Bi、1Bii和1Biii)和透明的(图1Aiv，1Av，1Avi、1Biv、1Bv和1Bvi)变体。在图1Ai-1Avi中的照片上的菌落是通过偏振透射光照射观察的，并且以放大56倍的形式显示。图1Bi-1Bvi中的照片中的荚膜材料是通过Quellung反应和类型专一性抗血清观察的，并且以放大4000倍的形式显示。
图2，包括图2A-2D，它是表示通过捕捉ELISA评估的环境氧气和二氧化碳浓度以及不透明性表现型对以每单位蛋白为基础的CPS产量的影响的四联棒图。让四种类型肺炎球菌分离物(图2Ai和2Aii中的变体6B；图2Bi和2Bii中的变体6A；图2Ci和2Cii中的变体18C；图2Di和2Dii中的变体9V)的不透明的(图2Ai、2Bi、2Ci和2Di)和透明的(图2Aii、2Bii、2Cii和2Dii)变体在曲线图上面所标明的氧气和二氧化碳浓度下，生长到中对数期(实心柱)或稳定期(点划线柱)。在超声波处理的细胞沉淀和培养上清液(加斜线的柱)中测定CPS产量，并且以相对总细胞蛋白量的形式表达。“*”表示该变体在该条件下不生长。有关数值表示重复进行的两个独立实验的平均值。
图3，包括图3A和3B，它是表示在Western分析中环境氧气和二氧化碳浓度以及不透明性表现型对CpsD的酪氨酸磷酸化的影响的一对照片。在固体培养基上生长之后，除去肺炎球菌变体P303的O型(泳道1-4)和T型(泳道5-8)的全细胞裂解物，并调整到相等的密度。图3A中的照片表示所述样品中的蛋白，这些蛋白是通过SDS-PAGE分离的，转移到一种膜上，并且用被称为4G10的单克隆抗体进行免疫吸印，这种抗体能专一性地结合磷酸化的酪氨酸。图3B中的照片表示用抗完整肺炎球菌的抗血清进行免疫吸印的复制的膜的照片，以便证实加样量相等。相应于裂解的细胞和加样到各泳道中的生长条件如下：在泳道1和5中，小于1％氧气/10％二氧化碳；在泳道2和6中，16％氧气/3％二氧化碳；在泳道3和7中，21％氧气/小于0.1％二氧化碳；而在泳道4和8中，19％氧气/10％二氧化碳。图3A中的箭头表示25kD CpsD带的位置。大小标记物以千道尔顿为单位。
图4，表示通过Northern分析评估的环境氧气和二氧化碳浓度以及不透明性表现型对CpsD的转录的影响的照片。在甲酰胺凝胶上分离从肺炎球菌变体P303的O型(泳道1和2)或T型(泳道3和4)中获得的总RNA，并且用放射性标记过的由血清型4肺炎球菌中获得的CpsD的片段进行检测。在小于0.1％氧气/10％二氧化碳(泳道1和3)或1％氧气/小于0.1％二氧化碳(泳道2和4)的条件下生长用于分离RNA的细菌。大小标记物是以前道尔顿为单位的RNA标准物。
发明详述
本发明涉及本发明人的发现，即由肺炎球菌所产生的荚膜多糖(CPS)的量可以通过控制用于维持该细菌的培养基中的氧气和二氧化碳含量来进行调节。本发明人业已发现，肺炎链球菌中的CPS产量是由CpsD蛋白的存在以及该蛋白的翻译后修饰调控的。基于上述发现，本发明包括用于调节肺炎球菌的CPS产量的方法(例如，用于生产抗肺炎球菌疫苗和其他免疫原性制剂)，用于缓解肺炎球菌感染的方法，以及鉴定可用于缓解肺炎球菌感染的制剂的方法。
定义
在本文中，下面的每一个术语具有在本节与它相关的含义。
本文所使用的冠词“一个”(“a”“an”)表示一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法宾语。举例来说，“一个因子”表示一个因子或一个以上因子。
“普通”空气表示在特定部位大体上具有大气的平均含量的气体，不考虑湿度(即以干重为基础)。大气的平均含量为大约78％的氮气，21％的氧气，1％的氩气，以及各自低于0.04％的二氧化碳、氢气、氦气、氖气、氪气和氙气。
说明
业已发现，肺炎球菌荚膜多糖(CPS)的产量受该细胞环境中所存在的氧气和二氧化碳的存在和浓度的影响。具体地讲，CPS的产量随着环境中氧气含量的降低而提高；CPS的产量还会随着环境中二氧化碳含量的提高而提高。尽管以上发现是利用肺炎链球菌的培养物作出的，还可将其应用于具有类似于诸如其他链球菌的(例如，无乳链球菌)的链球菌的生物的荚膜和荚膜基因特性的生物，应用于诸如金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、约氏不动杆菌的其他有荚膜的生物，以及具有与上述一种或多种特性类似的表现型、基因型或同时具有这两者的生物。当所述生物是肺炎链球菌时，它可以是任何一种已知的或以后发现的它的变体，包括根据其CPS的性质鉴定的变体，如变体6A、6B、18C和9V中的一种。
以上发现可用于与任何已知的培养肺炎球菌的方法组合，或者与以后开发的任何方法组合，以便提高(或者降低，如果需要的话)由所述方法所培养的肺炎球菌的CPS产量。本发明包括一种提高通过按照已知方法培养肺炎球菌获得的CPS的产量的方法。这种改良的方法包括降低在它里面或在它上面维持所述肺炎球菌的培养基中的氧气的含量，这种降低是相对在培养所述肺炎球菌期间正常情况下出现在该培养基中的氧气含量而言。例如，通常是在明胶或半固体培养基或液体培养基中培养肺炎球菌，其中，保持该培养基与经过过滤的(或以其他方式灭菌)的普通空气接触。
通过降低与所述培养基保持接触的气体中的氧气含量(以干重为基础)，可以提高肺炎球菌的CPS产量。氧气含量降低的程度并不重要，不过，一般来说，氧气含量降低的越多，CPS的产量就提高的越多。所述气体的氧气含量优选低于16％，或者降低到使该气体基本上成为厌氧的程度(例如，使它含有小于0.1％的氧气)，使所述气体中氧气含量降低的方式并不重要。将气体中氧气含量降低到低于普通空气中氧气含量程度的常见方法，包括用一种具有所需氧气含量的气体冲洗培养容器(至少在开始进行冲洗，或者间歇性冲洗、定期冲洗或连续冲洗)。例如，可以用含有大约71％氮气、19％氧气和10％二氧化碳的气体混合物或者用含有95％氩气和5％二氧化碳的气体混合物冲洗培养容器。
还可以通过提高与在它上面或里面维持的肺炎球菌的培养基接触的气体的二氧化碳含量提高肺炎球菌的CPS产量。所述气体二氧化碳提高的程度并不重要，不过，一般来说，二氧化碳含量提高的越多，CPS的产量就提高的越多。所述气体的二氧化碳含量优选至少为大约5％，或至少为大约10％，不过，二氧化碳的浓度还可以高到使培养基被二氧化碳饱和的程度。如上文所述，理想的二氧化碳含量可以通过用具有所需二氧化碳含量的气体冲洗用来培养所述肺炎球菌的容器而获得。另外，还可以通过将碳酸盐或碳酸氢盐掺入培养基中或者将所述盐添加到培养基中为所述培养基提供二氧化碳。
本发明包括通过提高用于维持肺炎球菌的培养基中的二氧化碳含量、提高与所述培养基接触的气体的二氧化碳含量、降低所述培养基的氧气含量、降低与所述培养基接触的气体的氧气含量、或这些措施的任意组合来提高肺炎球菌的CPS产量。在一种实施方案中，所述培养基(或与该培养基接触的气体的)的氧气/二氧化碳含量可以进行调节，以便能够在一个时期提高肺炎球菌细胞的产量，然后可以再次调节，以便提高在第二个时期中的CPS产量。
降低与所述培养基接触的气体中的氧气含量会导致在它上面或里面维持肺炎球菌的培养基的氧气含量，这是因为溶解的和非溶解的气体的平衡作用。改变气体的二氧化碳含量具有类似的作用。所述气体溶解在培养基中以及非溶解气体平衡的速度，取决于本领域已知的多种因素，例如，包括培养基-气体界面的面积，培养基的粘度，以及培养基的搅动程度。
可以在培养基(例如，液体培养基)中维持肺炎球菌，其中，培养基和任何气相之间的界面(如果有的话)是最小化的。在这种培养系统中，改变气相的含量可能对液体培养基的气体含量产生相对较小的影响，因为只有有限的气体从所述气相中扩散到液体中。在所述系统中，所述液体培养基的气体含量可以受到用于制备该培养基的方法的影响。例如，通过以下方法可以制备大体上为厌氧的液体培养基：制备液体培养基，在高压灭菌器中灭菌(高压灭菌器中的热量可以排除液体中的几乎所有的氧气)，并且在没有氧气的环境中冷却高压灭菌的培养基，如在有稳定的、不含氧气的气流通过的密封容器中冷却。合适的不含氧气的气体的例子包括纯氩气，与5-10％二氧化碳混合的氩气，纯的氮气，或氮气、氩气和二氧化碳的某种组合。在需要很高程度的厌氧条件时([氧气]＜＜0.1％＝，利用本领域已知方法，让通过加热的铜线圈或滤网或从它上面经过的不含氧气的气体从冷却中的培养基上通过。当然，可以用类似方法制备具有需要的气体含量的固体、凝胶和半固体培养基。
还可以通过选择合适的肺炎球菌变体并将其制成用于接种其氧气含量、二氧化碳含量或这两种含量受到调控的培养基的接种物，来提高CPS产量。可以理解的是，肺炎球菌的不同变体可能产生结构上不同的CPS。本文所披露的方法可用于利用任何肺炎球菌变体提高CPS产量。还应当理解的是，很多肺炎球菌至少具有两种表现形式。这些形式可以包括不透明型(O)和透明型(T)，其中，不透明型的特征通常是能产生更大数量的CPS。因此，通过筛选以更大的CPS产量为特征的肺炎球菌变体作为接种物可以进一步提高CPS产量。
利用本文所披露的一种或多种方法所生产的CPS可以用于(单独或者与其他类型的肺炎球菌的CPS组合)通过本领域已知的方法制备肺炎球菌疫苗和其他免疫原性制剂。所述方法通常包括从肺炎球菌细胞中分离CPS，选择性地将其余的肺炎球菌细胞灭活，并且将所述CPS与一种可以药用的载体(以及选择性的免疫学佐剂)组合。所述制剂可以给动物服用，以便增强该动物对肺炎球菌感染的免疫反应。
由于肺炎球菌CPS被认为使得肺炎球菌能逃脱动物(例如人)体内的免疫防御，可以将抑制CPS生产的方法用于缓解动物体内的肺炎球菌感染。可以用这种方法缓解的肺炎球菌感染(以及由此产生的并发症)包括肺炎(特别是肺炎球菌肺炎)、菌血症、脓毒症、脑膜炎细菌性心脏内膜炎，链球菌渗出性咽炎，蜂窝织炎和内脏溃疡。
业已发现，提高环境中的氧气含量能降低肺炎球菌CPS产量，从而提高肺炎球菌对免疫系统的感染性。类似的，业已发现降低环境中的二氧化碳含量，能降低肺炎球菌CPS产量。
通过保持受所述感染困扰的动物与具有超大气浓度的氧气的气体接触可以缓解肺炎球菌感染及其副作用和并发症。另外，可以相对感染部位的普通氧气含量提高该感染部位{例如，与肺炎球菌相关的内脏溃疡}的氧气含量(例如，通过向位于动物体内的感染部位直接提供纯氧气或灭菌过的空气)。例如，当所述身体部位是肺(例如，具有肺炎球菌肺炎的肺)时，所述普通氧气含量就是普通空气的氧气含量。例如，通过使用呼吸器或标准氧气面罩给患者肺提供超大气浓度的氧气，可以缓解肺炎球菌性肺炎。
还可以通过将动物体内的感染部位的二氧化碳含量降低到低于正常情况下出现在该感染部位的二氧化碳含量，并且优选低于正常情况下出现在该身体部位的二氧化碳含量(即使在没有肺炎球菌感染的情况下也是如此)，缓解肺炎球菌感染及其副作用和并发症。降低除了肺以外的体内部位的二氧化碳含量的方法，可能包括提供一个穿过通过、经过该身体部位的无菌气体流。当感染部位是肺时，可以通过提高呼吸速度降低二氧化碳含量，呼吸速度的提高是患者的自愿行为或人工行为(例如，使用呼吸器或呼吸加快药物)。
正如在实施例中更详细地说明的，肺炎球菌中CPS产量的提高与CpsD基因的低水平表达相关，并且与CpsD蛋白的低度磷酸化相关。因此，CPS产量可以通过能增强CpsD表达、增加CpsD的磷酸化程度的制剂或这两者来提高。相反，CPS产量可以通过能抑制或降低CpsD表达、抑制CpsD磷酸化、增强磷酸化CpsD的脱磷酸化或它们的某种组合的制剂而受到抑制。正如上文所披露的，与动物感染相关的肺炎球菌中CPS产量的降低，能够使得这种肺炎球菌更容易受到所述动物免疫系统的攻击。
本发明包括评估一种测试化合物是否是肺炎球菌CPS生产的抑制剂的方法，以及评估一种测试化合物是否是肺炎球菌CPS生产的增强剂的方法。在上述每一种方法中，在存在所述测试化合物的条件下，以及分别，但优选在缺乏相同的测试化合物的条件下维持肺炎球菌细胞。可以通过测定在有和没有所述测试化合物的条件下，由细胞所产生的CPS的量评估该测试化合物对CPS生产的直接影响。另外，评估了CpsD的表达水平(通过测定相应的RNA或相应的蛋白的产生评估)，或CpsD的磷酸化程度(通过测定存在于CpsD中的磷酸化酪氨酸残基的数量或至少具有一个磷酸化酪氨酸残基的CpsD的比例)，并按照上述方法将它与CPS生产的抑制或增强相关联。
参考文献
本申请涉及到的参考文献如下。
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实施例
下面将结合以下实施例来进行说明。提供本实施例只是用于说明目的的，并且，本发明不局限于本实施例，相反，本发明包括在阅读本发明说明书之后可以得出的所有变化。
肺炎链球菌的荚膜多糖表达的氧气依赖性与CpsD的翻译后修饰相 关
本实施例所提供的实验证实，肺炎球菌之间透明度表现型的差异(即O型与T型)受环境氧气浓度的影响，并且，诸如可能出现在肺炎球菌上的厌氧生长条件，会影响O型肺炎球菌增强CPS表达的能力，并逃脱免疫清除。
下面将介绍在本实施例的实验中所使用的材料和方法。
细菌菌株和生长条件
用于本研究中的肺炎链球菌菌株如表1所示，并且包括以前公开的临床分离物P303(6A型)、P324(6B型)、P68(18C型)和P10(9V型)的O和T变体(Kim et al.，1998；Weiser et al.，1994)。按公开方法在37℃下，在不进行摇动的条件下，在非密封容器中，在半合成(C+Y培养基，pH8.0)或胰化大豆培养基中生长细菌(Tomasz，1964)。将液体培养液铺平板到含有1％(w/v)琼脂的胰化大豆琼脂(TSA)平板上，在该平板上涂有5000单位的过氧化氢酶(购自WorthingtonBiochemical，Freehord，NJ)。在37℃下，在烛罐中培养接种过的培养基，除非另有说明。按公开方法，在显微镜和偏振透射光下确定该TSA培养基上的菌落形态(Weiser et al.，1994)。
表I
肺炎球菌菌株和变体与能专一性结合磷酸酪氨酸的单克隆抗体的反应性
Figure C0180965400151
7对每一种菌株/突变体来说，测定了在有氧条件下生长的O表现型。‘+’，表示具有单一的25-27kD的带的反应性。
在通气条件下，用二氧化碳培养箱控制环境二氧化碳浓度。厌氧生长条件是按照生产商的说明利用BBL GasPakTM系统获得的(BectonDickinson，Cockeysville，MD)。在某些实验中，在该系统中使用碳酸氢钠成分，以便产生10％的二氧化碳气体，而在其他实验中，不使用该成分。在收获所述细菌之后，测定生长培养基的pH，以便证实其pH没有受到所述不同培养条件的影响。
用类似方法对临床样品进行分析。一共检查了患有脑膜炎的502位患者，其中大约20％在细菌学上被证实为肺炎球菌性脑膜炎。从在临床诊断中被推测为肺炎球菌性脑膜炎的患者体内收集鼻咽洗漱液样品，将该样品马上铺平板到5％绵羊血琼脂和含有5000个单位的过氧化氢酶的胰化大豆琼脂上，并在含有5％二氧化碳的空气环境中，在37℃下培养所述平板。与培养存在肺炎球菌的患者血液样品的做法相同，将脑脊液(CSF)样品同样铺平板到血液琼脂和透明平板上，按照标准通气培养方法培养48小时。首先通过格兰氏染色和Quellung反应证实在血液琼脂上表现出典型的形态特征的分离物是肺炎球菌。所有分离物在-80℃下在细菌保存器中保存，并按本文所披露的方法测定菌落形态学。用Fisher’sExact Test检查鼻咽和入侵部位培养物的T和O表现型比例之间的统计学差异。
遗传转化
按公开方法使得胶囊化的和非胶囊化的肺炎球菌成为天然转化感受态(Weiser et al.，1999)。通过从含有红霉素(1微克/毫升)的培养基中筛选将双成分信号转导系统(TCSTSs)中的突变转入菌株P303。筛选具有改变了的菌落形态的胶囊化的转化体，并且用类型专一性抗血清(购自Statens Seruminstitut，哥本哈根，丹麦)通过Quellung反应证实CPS表达。
Quellung反应
观察在各种条件下，在半合成培养基中生长到中对数期的细菌中的肺炎球菌荚膜。为了进行Quellung反应，按照公开方法将等体积的培养物和含有6型抗血清和1％(w/v)购自Statens Seruminstitut(哥本哈根，丹麦)的亚甲基兰的组合物在玻璃载玻片上混合1分钟(Neufeld，1902)。
CPS的定量
让O和T型肺炎球菌变体在半合成的生长培养基上生长到中对数期(A620＝0.3)或生长16小时(此时细胞处于稳定期)。通过以2000xg的速度离心收集细胞，用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)洗涤，在0℃下超声波处理3次，每次10秒，并在-20℃下保存。按公开方法用捕捉ELISA技术测定存在于在特定条件下生长的变体中的CPS的量(Kim et al.，1998)。类型专一性兔抗血清(购自Statens Seruminstitut，哥本哈根，丹麦)是以1∶5000的稀释比例用0.05摩尔碳酸钠(pH9.6)稀释之后使用的，并且在室温下用一夜时间使其固定在微量滴定板的孔的壁上。在每一个培养步骤之间，用Tris缓冲液(含有10mMTris，150mM氯化钠，0.05％BrijTM35，和0.02％(w/v)叠氮化钠)洗涤5次。BrijTM35(聚氧乙烯(23)月桂基酯C12H25(OCH2CH2)23OH)是一种洗涤剂。在已知浓度下使用从6B、6A、18C或9V型肺炎球菌中获得的纯化CPS，并且是从美国典型组织保藏所(Rockville，MD)购买的，将其作为标准物。用被命名为HASP4(它能专一性结合6A和6B型CPSs)、HASP22(它能专一性结合18C型CPS)和HASP33(它能专一性结合9V型CPS)的单克隆抗体检测超声波处理过的细胞样品中的CPS，所述抗体是以在中试实验中确定的浓度使用的。用能与小鼠IgM专一性起反应的并且与碱性磷酸酶结合的抗血清检测单克隆抗体与CPS的结合。该制剂是按公开方法使用的(Kim和Weiser，1998)。利用微量二辛可酸试剂盒，按照生产商的说明(Pierce Chemical Co，Rockford，IL)用超声波处理过的细胞提取物进行总细胞蛋白测定。上清液级份中的CPS的量取决于相应的细胞超声处理级份中的蛋白浓度(即为了以每单位蛋白为基础统一CPS含量)。
业已披露了用于比较细胞超声处理物中的总的磷壁酸的含量的捕捉ELISA方法(Kim et al.，1998)。所有实验都成双地进行，并且重复至少3次。结果以每一种总的细胞蛋白浓度的平均值形式表示。
Western分析
按上述方法在添加了过氧化氢酶的胰化大豆琼脂上生长细菌。在37℃下，在特定条件下生长16小时之后，用消毒的DacronTM刷将细胞从培养基表面上取出，重新悬浮在PBS中，并且用PBS洗涤，以便将细胞密度调节到A620＝0.5。在离心之后，将细胞沉淀重新悬浮在Laemmli凝胶加样缓冲液中，并且加热到100℃，保持5分钟。然后在12.5％(w/v)的聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离所述样品，并按公开方法转移到Immobilon-PTM膜上(Wani et al.，1996)。
用以1∶2000的稀释比例稀释在TSBP缓冲液(Wani et al.，1996)中的被称为4G10(Upstate Biotechnology Inc.，Waltham，MA)的单克隆抗体进行免疫吸印，按公开方法用与碱性磷酸酶结合的小鼠IgG抗血清检测吸印的样品与该抗体的反应性(Kim et al.，1999)。通过用以前披露的抗完整肺炎球菌的抗血清(Wani et al.，1996)对复制的膜进行免疫吸印，证实添加了大体上相等数量的细菌。
Northern分析
按公开方法从在半合成培养基中，在大气和厌氧条件下生长到中对数期的菌株P303细胞的O和T变体中分离总RNA并进行纯化(Weyand等，2000)。在甲酰胺凝胶上分离RNA之后，对用溴化乙锭染色的RNA进行照相，并将其图像数字化，以便与RNA大小标记物进行比较。使用VacuGeneTMXL系统，按照生产商(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)的说明将所述DNA转移到一种膜上。在65℃下，在含有0.5M磷酸钠，pH7.2，1.5mM EDTA和7％(w/v)SDS的溶液中将所述膜预杂交15分钟。探针是用cps4D基因的内部片段制备的，并且用具有以下序列的引物通过PCR进行扩增。
5’-CCGGAATTCG TACAAATATA CAGTTGAGCG GAGATAAAC-3’(SEQ ID NO：1)和
5’-CGCGGATCCT GTTGCTGTTA CCAAGATGGA CG-3’(SEQ IDNO：2)
而基因组DNA获自4型菌株。该菌株与基因组研究所用于进行全基因组测序的菌株相同。用限制性内切酶BamHI和EcoRI消化所述PCR产物，然后克隆到在多接头两侧具有转录终止子的载体上，以便能够克隆链球菌序列。该载体是按照以下方法由pJDC9构建的：将pUK4K(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的平端卡那霉素抗性框插入平端ClaI位点，以便能够在大肠杆菌中筛选该标记(Chen和Morrison，1988)。将cps4D片段插入BamHI和EcoRI消化过的载体，并转入大肠杆菌菌株DH5α。总RNA是从在大气和厌氧条件下，在胰化大豆培养基中生长到中对数期的菌株P303的肺炎球菌的O和T变体中提取的。
下面将披露在本实施例中提供的实验的结果。
在人体中筛选表现型变体
为了验证是否对载体和人类菌血症中的不同肺炎球菌表现型进行了选择，从表现出脓毒症症状的患者的鼻咽和血液中获得相同血清类型的成对的分离物。由于菌株与菌株之间在与不透明性无关的菌落形态学方面存在异质性，必须获得成对的分离物。一旦开始抗生素治疗，就不能从菌血症患者的鼻咽中分离肺炎球菌。因此，鼻咽和血液的培养物基本上是同时获得的。这种制约因素需要该研究在具有肺炎球菌菌血症高发的地区进行，以便可以获得足够数量的成对的分离物。
从住在Blantyre、Malawi地区的19位成年患者体内获得血液和鼻咽分离物，并且只有在这些分离物随后在用类型专一性抗血清进行Quellung反应中证实为相同类型的时候才被认为是成对的分离物。大部分成对的分离物是1型的，在该地区的最常见的类型如表II所示。检测还证实了大多数患者的人类免疫缺陷病毒感染成阳性，这种感染被认为是造成在这些患者中出现高的侵入性肺炎球菌疾病的原因。在19对分离物中，有17(89％)对在鼻咽中是T表现型的，而12(63％)对在血液中是O表现型的。有10对分离物在从两种部位获得的肺炎球菌的表现型方面不一致，都表现出在鼻咽中更像是T表现型(p＜0.001)。这证实了一般存在对表现型变体的选择，由此导致了来自主要为T样群体的更像是O样表现型的血液在天然菌血症感染的鼻咽中的存在。
表II
从人类携带者和侵入性感染中获得的不透明性表现型
注：14/19侵入性分离物是从脑脊液中获得，而不是从血液中获得的。
2N/A表示不存在的临床症状。
氧气对CPS数量的影响
研究了在感染期间能促进O变体筛选，并且在携带期间促进T变体筛选的宿主和细菌因素。据推测，在固结肺中出现的较低的氧气含量会促进从T到O表现型的转变。6A型临床分离物P303在较低氧气浓度下的生长对T型向O型自动转变的速度没有影响。不过，如图1A所示，在厌氧条件下的生长(存在较高浓度的二氧化碳)与向更大和更多类粘蛋白菌落形态的转变相关，这种现象对于O变体来说特别明显。
由于具有O表现型的肺炎球菌所表达的CPS的量高于具有T表现型的肺炎球菌所表达的CPS的量。因此认为，与O型相关的更大的菌落体积有可能是这种材料的产量增加所导致的(Kim et al.，1998)。在初步研究中，通过Quellung反应和6型抗血清观察细菌菌落周围的CPS的折射区，如图1B所示。与相同表现型在有氧气的条件下的生长或T变体在包括缺乏氧气在内的任何实验过的条件下的生长相比，在有10％二氧化碳的厌氧条件下生长的O变体的该区更大。相反，当所述细菌是在大气条件下培养的时，在T型肺炎球菌的菌落周围检测不到荚膜材料区。这一结果证实了O型合成较大数量CPS的能力，并且表明较低的氧气含量、较高的二氧化碳含量，或者这两者能够促进CPS产量的提高。
利用为了测定CPS的量而开发的一种方法定量测定环境氧气和二氧化碳浓度的作用，并且表示在图2中(Kim et al.，1998)。用本文所披露的捕捉ELISA测定的每毫克总细胞蛋白的CPS量与菌落表面积相关，并且与根据通过Quellung反应观察到的区域计算出的荚膜体积值和菌落表面积相关，如表III所示。与T型生物相比，在中对数期或稳定期生长的O型细菌表现出较大量的与细胞相关的CPS。与在大气条件下培养的相同细胞中的CPS产量相比，O型6A变体在有10％二氧化碳的厌氧条件下的生长会导致CPS的产量提高7.9倍。
与在有10％二氧化碳的厌氧条件下生长的T变体相比，O变体的CPS产量提高了29倍。利用从两种不相关的临床分离物获得的O和T分离物获得了类似结果(即使用6B和18C型)。
表III
在各种条件下生长的肺炎球菌的特征分析
Figure C0180965400211
3对于相同的6A型临床分离物的O和T变体而言。
4这些值是基于在生长16小时之后所观察到的菌落。这些值表示用3个单一的孔分离的菌落进行的测定的平均值。
5这些值是基于用Quellung反应观察到的荚膜材料计算的值，用于计算球形椭圆形的体积的公式为V＝(π/6)LW2。有关数值表示由两个相应的单细胞分裂的三种双球菌形式测定的平均值。“UD”表示荚膜材料区检测不到。
6这些值基于对在液体培养基中生长到中对数期的生物的捕捉ELISA测定。有关数字是两次独立测定的平均值。
在生长到稳定期之后，测定18C型肺炎球菌的培养上清液中的CPS产量。发现在O型变体的培养上清液中多糖的产量随着氧气浓度的降低以及二氧化碳浓度的提高而增加，这表明较高的CPS产量是因为在较低的氧气/较高的二氧化碳条件下细胞的CPS合成增加而导致的，而不是因为在较高的氧气/较低的二氧化碳条件下由细胞中释放出的CPS减少所致。用9V型分离物确定CPS合成的增加是由于氧气的减少所致还是由于二氧化碳的增加所致。与有10％二氧化碳以及存在氧气的条件下生长的相同的细胞相比，在有10％二氧化碳和在没有氧气的条件下生长到稳定期的9V型细菌的CPS产量提高了12倍。这证实了氧气含量，而不是二氧化碳含量是影响CPS产量程度的主要环境因素。
与CpsD/CpsD改变相关的CPS产量的变化
本研究下一阶段的目的是了解氧气影响CPS产量的机理。检验了用于传感并转导氧气含量/存在的双成分信号转导系统的作用。按公开方法将以前披露的出现在3型分泌物基因组中的双成分信号转导系统的12种标记突变中的11种导入P303(Throup等，2000)。制备了在响应调节子同系物上具有突变的10种结构，以及在组氨酸激酶同系物上具有突变的7种结构。对在P303中实验的这17种突变型同系物中的每一种来说，在细胞在厌氧条件下生长的实验中，用Quellung反应测定时这些突变对菌落体积的增加或荚膜区的形成没有影响。这一结果表明，氧气的作用不可能是通过TCSTS介导的，不过，在肺炎球菌中的上述系统中的一种无法检查，因为该基因似乎是必需基因。
然后，检验已知是CPS表达所需要的基因座的的基因。由于在多种类型的菌株中观察到了氧气对CPS量的影响，因此，在不同类型之间保守的基因被认为最有可能是候选基因。在荚膜基因座上的基因中，只有头4个基因cpsA-D是不同类型的肺炎球菌所共有的(Iannelli et al.，1999)。如表I所示，在大气条件下生长时，通过Quellung反应测定了解到3型肺炎球菌能形成类粘蛋白菌落并具有大的荚膜(Knecht et al.，1970)。与所有其他实验过的类型的肺炎球菌不同，相对在大气条件下培养时的体积而言，在厌氧条件下培养时，3型菌株没有表现出菌落体积或荚膜的增加。根据这一发现，确定了3型cpsA-D和其他类型基因座之间的差别。
编码一种推测的转录弱化剂的cpsA的同系物和编码一种具有未知功能的蛋白的cpsB出现在3型胶囊化基因座上(GenBank保藏号Z47210；Arrecubieta，1995)。血清型2肺炎球菌中编码CpsC的基因在3型胶囊化基因座之间是高度保守的，不过，血清型3肺炎球菌中推测的CpsD在69号氨基酸之后截短了(截短了226个氨基酸)。CpsC和CpsD是肺炎球菌荚膜表达所需要的，并且它们都与在大肠杆菌中表达的一种蛋白(Wzc)同源，这种蛋白与链长调控和被称为colanic酸的细胞外多糖的输出相关(Morona et al.，1999；Stevenson et al.，1996)。
在大肠杆菌中，Wzc在酪氨酸残基上发生可恢复的自发磷酸化(Vincent et al.，1999)，将被称为4G10的能专一性结合磷酸化的酪氨酸残基的单克隆抗体用于Western分析，测定出现在肺炎球菌中的磷酸化的酪氨酸。在6A型分离物的全细胞裂解物中出现了大约为26kD的单一的带，这是CpsD的推测的大小。同样在用于本研究中的6B、18C和9V菌株的全细胞裂解物中出现了相同大小的单一的带，但是，3型肺炎球菌中缺乏这条带(它具有截短的CpsD)。以上发现证实，CpsD是可以在酪氨酸残基上磷酸化的。通过比较菌株D39(一种非胶囊化的突变体)和R6x(一种具有跨越cps2A-H的7504个碱基对的缺失的菌株，其中，只有A-D是其他类型所共有的；Iannelli et al.，1999)，获得了4G10是由具有磷酸化的酪氨酸残基的CpsD识别的进一步的证据。在某些实验中，通过用从(2型)D39亲本菌株或三种菌株获得的DNA转化有关细菌纠正了R6x型肺炎球菌中的所述突变，从而得到了具有2型D39遗传背景的具有3型或2型荚膜的胶囊化的菌株。
4G10不能与R6x和3型R6x转化体起反应，以及该抗体能够与2型R6x转化体起反应的事实，证实了与该带相关的蛋白的表达需要所述胶囊化基因座上头4个共有基因中的一个，并且需要完整拷贝的CpsD。根据大小确定，4G10反应性蛋白不可能是CpsA或B。在2型和3型CpsC之间，只有15个保守氨基酸的变化，其中没有酪氨酸。在3型菌株中4G10反应性蛋白的缺乏表明，4G10不是CpsC。因此，得出的结论是，在所述肺炎球菌中CPS蛋白包括可以磷酸化的酪氨酸残基。
检验了在各种浓度的氧气和二氧化碳下的生长对CpsD的酪氨酸磷酸化的影响。将在各种浓度的氧气和二氧化碳条件下生长的被称为P303的6A型肺炎球菌分离物的O和T型全细胞的裂解物调整到相同的密度，并且用磷酸酪氨酸专一性单克隆抗体4G10通过Western分析进行检验。该实验的结果如图3所示。在有氧条件下生长的O变体中检测到了具有CpsD的预期大小的单一的带。如图3中的泳道2-4的结果所示，二氧化碳含量在低于0.1％到10％之间的变化所产生的影响没有明显差别。在实验过的所有条件下(氧气＜0.1％至21％，二氧化碳＜0.1％至10％)，所述抗体与T变体的细胞提取物的反应都是微弱的。用其他菌株获得了类似结果。因此，所得出的结论是，CpsD的酪氨酸磷酸化受不透明性表现型的影响，并且需要在有氧气的条件下生长。
酪氨酸磷酸化的差别可以影响CpsD的活性，并且导致了在有氧气的条件下O型肺炎球菌中CPS表达的减弱。厌氧生长的O或T型肺炎球菌都不能表达磷酸化的酪氨酸，不过，这两种表现型形式在CPS生产的程度方面存在很大差别。
通过Northern分析确定O和T变体之间的差别是否是由于CpsD转录水平的差别所导致的。以上实验的结果如图4所示。从在大气条件下或者在有10％二氧化碳的厌氧条件下生长的肺炎球菌菌株P303的O和T型中获得总细胞RNA。用克隆的CpsD片段检测所述RNA。通过测定放射性标记过的探针与mRNA上的CpsD的杂交并且将该测定值相对存在于杂交分析混合物中的RNA的总量进行调整，确定了转录活性方面的定量差别。以上实验证实，氧气浓度对CpsD转录的水平没有明显影响。不过，与O型细胞相比，T型细胞中CpsD的转录水平提高了3.4倍。因此，所得出的结论是，CpsD的转录调控决定肺炎球菌的不透明性表现型。
不希望受任何特定操作理论的约束，相信CpsD控制CPS的产生。在CpsD的酪氨酸磷酸化程度方面出现的差别和在CPS产量方面的差别之间的相关性支持这种理论。据信CpsD起着酪氨酸激酶的作用，这是部分基于其氨基酸序列与大肠杆菌中的酪氨酸自发磷酸化酶的相似性，这种酶与链长调控和细胞外多糖colanic酸的输出相关。Cps23FD与Wzc在229个氨基酸中的188个上面具有30％的相同性和49％的相似性。血清型23f肺炎球菌的CpsD含有一种异常的羧基末端氨基酸序列(YGSYGNYNNYGKNKK；SEQ ID NO：3)，该序列含有包括酪氨酸残基在内的重复特征(YGX)4。与CpsD的其余部分相比，该羧基末端区在肺炎球菌变体之间表现出明显更大的氨基酸序列杂合性。据信，肺炎球菌菌株之间CPS产量的波动性是由于在这些菌株之间该羧基末端部分的波动性所致，这种序列波动影响了该蛋白的磷酸化能力。业已鉴定了多种其他的细菌蛋白激酶，并且这些激酶同样拥有具有富含酪氨酸的重复特征的C-末端(Ilan et al.，1999)。不能产生在CpsD上具有突变的肺炎球菌菌株，同时保持该菌株生产CPS的能力这一事实是该基因在CPS和荚膜生产中的重要性的进一步的证据。
下面提供了根据菌落不透明性表现型和氧气含量调控CPS生产的机制的模型，该模型包括CpsD的转录调控和CpsD的翻译后修饰。
CpsD是一种负调控因子，它作用在参与肺炎球菌类型专一性CPS生物合成的基因上。较弱的CpsD转录是导致在厌氧条件下O型肺炎球菌中CPS的表达量较高的原因。除了造成显著水平的CPS表达调控的CpsD的转录调控之外，还涉及到第二种水平的调控，即在CpsD上的酪氨酸残基的磷酸化或自发磷酸化。CpsD的磷酸化只影响O变体，并且需要在通气条件下生长。只能在O变体中检测到在一个或多个酪氨酸残基上磷酸化的CpsD的能力，可能是因为在T肺炎球菌中具有较高的磷酸酶活性。酪氨酸磷酸化增强了CpsD的负调控活性，因此，磷酸化的CpsD降低了在通气条件下CPS的合成。结果，O变体在通气条件下产生的CPS少于在厌氧生长条件下产生的CPS。T型肺炎球菌中较低的CPS产量，即使是在没有明显的CpsD的酪氨酸磷酸化的情况下也是这样，是因为T型肺炎球菌中CpsD表达的增强。
以前业已披露的改进在厌氧条件下的生长的做法，事实上可能是增强的CPS合成导致较大菌落体积的作用(Modde，1978)。
在能表达表面多糖的很多其他细菌种中存在与Wzc具有更大相似性的CpsD的同系物。所述细菌种的例子包括无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、约氏不动杆菌。由于荚膜及其大小是毒粒的关键决定因素，基于这种类型基因/蛋白的转录和翻译后修饰来调控CPS量的能力，在促进胶囊化的细菌在适应寄居和感染的不同的要求方面的能力方面可能是重要的。
在本文中所引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容，以其全文形式收作本文参考。
尽管业已结合具体实施方案对本发明进行了说明，显而易见的是，本领域其他技术人员在不超出本发明的实际构思和范围的前提下，可以提出本发明的其他实施方案和改变。所附权利要求书包括所有诸如此类的实施方案和等同的变化。

Claims (15)

1.一种由肺炎球菌产生荚膜多糖的方法，该方法是通过以下步骤完成的：获得肺炎球菌的不透明型变体，在一种生长培养基中维持所述肺炎球菌的不透明型变体，并保持氧气浓度不超过16％的气体与所述生长培养基接触，该方法任选地包括分离所产生的荚膜多糖。
2.如权利要求1的方法，其中，所述气体的氧气浓度不超过0.1％。
3.如权利要求1的方法，其中，所述肺炎球菌是链球菌属的生物。
4.如权利要求3的方法，其中，所述肺炎球菌是肺炎链球菌的生物。
5.如权利要求4的方法，其中，所述肺炎球菌是选自肺炎链球菌变体6A、6B、18C和9V的肺炎链球菌的变体。
6.如权利要求1的方法，其中，所述气体具有超过大气浓度的二氧化碳。
7.一种制备用于给有发生肺炎球菌感染的危险的动物施用的免疫原性制剂的方法，该方法包括：
a)获得肺炎球菌的不透明型变体；
b)在其氧气含量低于在相同温度下用氧气浓度低于16％的气体平衡的相同培养基中的氧气含量的生长培养基中维持所述肺炎球菌的不透明型变体；和
c)从该细胞中分离由该细胞所产生的荚膜多糖，由此，所分离的多糖构成了所述免疫原性制剂。
8.如权利要求7的方法，其中，所述气体的氧气浓度不超过0.1％。
9.如权利要求7的方法，其中，所述气体具有超过大气浓度的二氧化碳。
10.一种生产肺炎球菌多糖的方法，该方法包括获得肺炎球菌的不透明型变体，在其氧气含量低于在相同温度下用氧气浓度为16％的气体平衡的相同培养基中的氧气含量的生长培养基中维持肺炎球菌细胞。
11.如权利要求10的方法，其中，所述气体的氧气浓度不超过0.1％。
12.如权利要求10的方法，其中，所述生长培养基基本上缺乏氧气。
13.如权利要求10的方法，其中，所述生长培养基的二氧化碳含量高于在相同温度下用普通空气平衡的相同培养基中的二氧化碳含量。
14.如权利要求13的方法，其中，所述生长培养基是由二氧化碳饱和的。
15.如权利要求13的方法，其中，所述生长培养基含有碳酸盐或碳酸氢盐。
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