KR20080079802A

KR20080079802A - 현삼추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 외용제조성물

Info

Publication number: KR20080079802A
Application number: KR1020070020263A
Authority: KR
Inventors: 김한성; 이찬우; 김연준; 김지은; 김덕희; 장이섭
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2008-09-02
Also published as: CN101621986A; WO2008105579A1; US20100068310A1; JP2010520232A; US8168197B2; KR101352363B1

Abstract

본 발명은 유효성분으로 현삼(Scrophularia buergeriana Miq.) 추출물을 주성분으로 함유하고 백복령(Poria cocos Wolf) 추출물을 더 함유하여 피부의 건조증상을 개선시키는 용도의 피부 보습용 외용제 조성물에 관한 것으로, 상세하게는, 현삼, 백복령을 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 에틸아세테이트 또는 부탄올을 사용하여 추출한 현삼, 백복령 추출물을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 한다.

현삼 추출물, 백복령 추출물, 보습, PPAR-α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alpha), 각질형성세포 분화, 세라마이드, 자연보습인자, 피부건조 , 아토피, 접촉성 피부염

Description

현삼추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 외용제 조성물{Composition of skin external application for moisturizing comprising Scrophularia buergeriana Miq. extract}

도 1은 본 발명에 의한 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 인간의 각질형성세포의 CE(Cornified Envelope) 형성에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명에 의한 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 인간의 피부세포주의 CE 형성에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명에 의한 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 인간의 피부세포주의 트랜스글루타미네이즈 발현에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명에 의한 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 손상된 피부장벽의 회복에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명에 의한 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 피부 수분량에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 본 발명에 의한 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 인간의 피부에서 표피지질(총 세라마이드) 생성량에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명에 의한 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 PPAR-α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alpha)의 활성화에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 유효성분으로 현삼(Scrophularia buergeriana Miq.) 추출물을 주성분으로 함유하고 백복령(Poria cocos Wolf) 추출물을 더 함유하여 피부의 건조증상 등을 개선시키는 효과가 있는 피부 보습용 외용제 조성물에 관한 것이다. 즉, 현삼 추출물 및 백복령 추출물을 피부에 도포했을 때 피부 각질형성세포(keratinocyte)의 분화(differentiation)를 정상적으로 환원/유지시킴으로써, 표피분화가 불완전함으로 인하여 발생하는 피부건조 증상, 아토피 증상 및 접촉성 피부염 증상 등을 예방 또는 개선하는 효과가 있는 피부 보습용 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부(skin) 중에서 최외각에 위치한 표피(epidermis)의 가장 중요한 기능은, 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등의 물리·화학적 자극인자)에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 때만 그 기능을 유지할 수 있다. 표피 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(Stratum corneum, horney layer)은 각질형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질 세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다(J. Invest. Dermatol. 1983; 80: 44-49). 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치고, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 「표피 세포의 분화」 또는 「각화(keratinization)」라고 부른다. 각화과정 중에 각질형성세포는 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; NMF)와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여, 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부장벽(skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다.

그러나 이러한 각질층은 과도한 세안이나 목욕 등의 생활 습관적 요소나, 건조한 대기, 오염물질 등의 환경적인 요인, 그리고 아토피성 피부나 노인성 피부 같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제적으로 현대에 들어서 더욱 늘어난 여러 요인들로 인해 최근에는 건조피부 증상 및 이로 인한 제반 장해를 호소하는 사람이 점점 증가하고 있는 추세이다. 따라서 적절한 피부수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분손실을 방지하기 위한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 실제로 수분보유능력이 있는 여러 종류의 보습제(moisturizer)가 개발되어 주로 화장품 영역에서 많이 사용되고 있다.

그러나 생활환경 중에 사람에 대한 위해요인이 점점 증가하고, 노령인구가 급격히 늘어나면서, 각질층의 생성-탈락속도(turnover rate)가 늦어지고, 각질형성 세포의 지질합성능력이 저하되거나, 표피에서 정상적인 세포의 분열, 성숙 및 분화가 원활하지 않음으로써, 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 정상적인 각질층의 기능을 유지하지 못하는 상태, 즉 피부장벽기능이 와해된 상태의 피부를 갖고 있는 사람들이 점점 증가하는 추세에 있다.

이러한 비정상적인 표피세포의 분열, 분화로 인해 피부는 피부건조증, 아토피, 건선 등의 다양한 피부 질환을 유발하게 되며, 이러한 제 질환들은 자체로 수분보유기능만을 갖는 통상적인 보습제만으로는 그 증상을 약간 완화시킬 수는 있으나, 근본적인 치유를 기대하기는 어려운 실정이다.

이에 본 발명자들은 표피세포의 분화를 조절하는 물질을 개발하여 피부에 적용함으로써, 정상적인 각질층의 생성과 탈락을 유도하고, 피부 각질층에 존재하는 천연보습인자들의 생성 및 유지를 강화시켜 피부건조증과 이에 수반하는 아토피 등의 건조피부질환을 근본적으로 예방 또는 치료하고자 시도하였다.

본 발명자들은 표피 분화와 관련된 연구를 수행하는 과정에서 현삼 추출물 및 백복령 추출물이 각질형성세포의 분화를 촉진하는 기능이 있음을 발견하였고, 또한 세포간 지질인 세라마이드의 합성도 촉진하는 것을 확인하였으며, 또한 각질세포 분화를 촉진하고 증식을 억제하며 세포간 지질의 합성을 증가시키며 항염작용에서도 그 기능을 가지는 핵호르몬 수용체의 일종인 PPAR-α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alpha)를 활성화시킴을 보았고, 이를 통해 상기 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 효과를 다시 한번 확인 할 수 있었다. 그리고 외용제 제형으로 동물의 피부에 적용했을 때 피부장벽을 강화하는 확실한 결과를 얻음으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 표피 내에 존재하는 각질형성세포의 정상적인 분화를 촉진함으로써 다음과 같은 효과를 유도하는 것이다. 첫째, 각질층 및 피부장벽을 구성하는 골격 성분인 각질세포를 정상적으로 유도하여 외부의 물리적인 자극으로부터 피부를 보호할 수 있게 하고, 둘째, 각질세포를 둘러싸서 피부장벽을 완성시키는 구성성분인 지질의 생합성을 촉진하여 피부장벽의 강화를 유도하는 것이다. 이러한 작용을 통해 궁극적으로 피부의 수분보유능력을 증진시킴으로써, 피부의 유연성과 견고성을 높여 피부가 본래의 보호기능을 원활히 수행하게 하며, 부수적으로는 피부건조로 인한 잔주름 발생의 감소 효과를 부여하여 건조피부나 아토피 등과 같은 피부건조성 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 피부 보습용 외용제 조성물을 제공한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 조성물은 현삼 추출물을 함유하는 피부 보습용 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 의한 조성물은 현삼 추출물에 백복령 추출물을 더 함유하는 피부 보습용 외용제 조성물을 제공한다.

상기 피부 보습용 외용제 조성물은 현삼 추출물을 0.0001~30중량% 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 피부 보습용 외용제 조성물은 피부 장벽기능 강화용, 각질형성세포 분화 촉진용, 세라마이드 생성 촉진용, PPAR-α 활성화제 조성물인 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용되는 “현삼”은 현삼과 다년생 초본으로 줄기는 모가 지며 잎은 좁고 길게 생겼다. 꽃은 연한 황록색으로 8-9월에 피며 뿌리는 덩어리로 백색이나 자르면 바로 검게 변한다. 현삼은 겨울동안 땅위의 줄기는 말라 죽고 뿌리만 살았다가 이듬해 봄 다시 새싹을 돋아내는 숙근약초이다. 한방에서는 뿌리를 약재로 사용한다. 현삼은 기후가 온화하면서 습기가 많은 곳을 좋아하며 추위에 강하다. 한국, 중국, 일본 등지에 분포하며, 한국에서는 경북지방에서 많이 생산된다. 중태(重台), 정마(正馬), 현태(玄台), 귀장(鬼藏), 축마(逐馬), 원삼, 정마, 또는 흑삼이라고도 한다. 주요 성분으로는 스크로폴라딘과 피토스테롤, 피토스테린 등을 함유하고, 기타 당분, 정유, 지방산도 함유하고 있다. 현삼은 열을 내리고 심장기능을 강화하며 염증을 방지하는 작용을 하여, 인후염, 편도선염, 결막염, 임파선염 등에 쓰이며 각종 높은 열을 내는 병에 효과가 있다. 한방에서의 주요 효능으로는 자음(滋陰), 강화(降火), 제번(除煩), 해독(解毒), 양혈(凉血), 생진(生津), 하수(下水), 명목(明目), 정오장(定五臟), 보심혈(補心血), 이인후(利咽喉), 통소변(通小便), 소종독(消腫毒), 장수제화(壯水制火), 구복(久服), 보허(補虛) 등이 있다.

“백복령”은 구멍장이버섯(Polyporaceae)과로 적송의 뿌리에 기생한다. 전 국 각지의 소나무를 베어낸 곳에 자라며 재배도 한다. 베어낸 지 여러 해 지난 소나무 뿌리에 기생하여 혹처럼 크게 자라난다. 지름 30~50㎝ 쯤의 덩어리로 겉은 소나무 껍질처럼 거칠고 속은 희거나 분홍빛이 난다. 속이 흰 것은 백복령이라 하고 분홍빛인 것은 적복령이라고 하는데 백복령은 적송의 뿌리에 기생하고 적복령은 곰솔 뿌리에 기생한다. 그리고 솔뿌리를 둘러싼 것을 복신이라고 한다. 백복령 중의 트리테르펜(Triterpene) 성분은 항구토, 항염증 등의 효과를 가진 것으로 보고 되어 있으며, 균핵에는 베타-파키만(β-pachyman)이 함유되어 건조중량의 총 93%를 차지하며, 트리테르페노이드(triterpenoid) 화합물의 파키만산(pachymic acid), 투물로신산(tumulosic acid), 3베타-하이드록시라노스타-7,9(3β-hydroxylanosta-7,9), 24-트리엔-2-산(24-triene-2-acid)을 함유하며, 이 밖에도 키틴질(chitin), 스테롤, 레시틴(lecithin), 아데닌(adenine), 히스티딘(histidine), 콜린(choline), 리파아제, 프로테이나제 등이 함유되어 있다. 백복령은 옛날부터 강장제로 사용되었다. 폐경(肺經)·비경(脾經)·심경(心經)·신경(腎經)·방광경(膀胱經)에 작용하여 비장을 보하고 가래를 삭이며 정신을 안정시킨다. 약리실험 결과에 의하면 이뇨작용과 혈당량을 낮추는 작용, 진정작용 등을 하는 것으로 밝혀졌으며 면역 부활작용을 하는 것으로도 알려져 있다. 또한 부인병에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다

본 발명의 피부 보습용 외용제 조성물은 전체 조성물 중 총 활성성분 즉 현삼 추출물 또는 현삼 추출물에 백복령 추출물을 더 함유하는 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 각각 0.0001～30중량％의 양으로 함유함이 바람직하다. 그 함량이 0.0001중량％ 미만일 경우, 상기 성분에 의한 피부 보습 효과, 피부 장벽기능 강화 효과, 및 피부 각질형성세포 분화 유도 효과 등을 얻을 수 없고, 함량이 30중량％를 초과할 경우, 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않기 때문이다.

본 발명의 피부 보습용 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 본 발명의 피부 외용제 조성물의 제형을 좀 더 설명하면 하기와 같다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 상기한 현삼 추출물, 백복령 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

본 발명에 따른 상기한 현삼 추출물, 백복령 추출물은, 각 화장료 제형으로 제조하여 그대로 도포하는 것이 적합하나, 통상의 외용의 제제로도 할 수 있다.

본 발명의 상기한 현삼 추출물, 백복령 추출물을 함유하는 조성물이 첨가된 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 피부 보습 효과, 피부 장벽기능 강화 효과, 및 피부 각질형성세포 분화 유도 효과를 위한 화장품 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품 류와 클렌징, 세안제, 비누, 미용액 등이 있다.

즉, 본 발명의 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 팩, 젤, 파우더, 메이크업 베이스, 파운데이션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 염모제, 분무제 등과 같은 제형을 들 수 있다.

각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기한 현삼 추출물, 백복령 추출물 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

그 제형으로는 본 발명에 따른 상기한 현삼 추출물, 백복령 추출물을 포함하는 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 외용제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있으며, 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

상기 제제의 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 투여 방법에 의해 상이하나, 1일당 1.0 내지 3. ㎖로 이를 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 상기한 현삼 추출물, 백복령 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 하기 참고예 1 내지 참고예 6과 같이 동결 건조한 현삼, 백복령에서 각 추출용매별로 유효성분을 추출하여 농축, 건조시킨 현삼 추출물, 백복령 추출물을 제조하여 사용하였다.

분말상의 건조된 현삼 단위 중량에 대하여 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급 알코올, 에틸아세테이트(Ethylacetate) 또는 노르말 헥산(n-Hexane)을 현삼 중량에 대해 중량비 1~15배로 가한 후, 50~100℃에서 3 내지 24시간 가열하여 추출하거나 4-25℃에서 3-4일간 침적시켜 유효 성분을 추출하였다. 또한 무수 또는 함수 에탄올과 메탄올 추출물에 적정량의 물과 에틸아세테이트, 부탄올(Butanol) 또는 헥산 등의 혼합용매에 용해시킨 후 방치하여 층을 분리시킨 후 상층을 분리하였다. 이렇게 처리하여 얻은 추출물은 감압증발기(evaporator)를 이용하여 농축, 건조시킨 후 물이나 에탄올 또는 1,3-부틸렌글리콜 등의 용매에 녹여 사용하였다.

분말상의 건조된 백복령도 현삼과 같은 상기한 방법에 의해 제조한 추출물을 사용하였다. 즉, 분말상의 건조된 백복령 단위 중량에 대하여 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급 알코올, 에틸아세테이트(Ethylacetate) 또는 노르말 헥산(n-Hexane)을 백복령 중량에 대해 중량비 1~15배로 가한 후, 50~100℃에서 3 내지 24시간 가열하여 추출하거나 4-25℃에서 3-4일간 침적시켜 유효 성분을 추출하였다. 또한 무수 또는 함수 에탄올과 메탄올 추출물에 적정량의 물과 에틸아세테이트, 부탄올(Butanol) 또는 헥산 등의 혼합용매에 용해시킨 후 방치하여 층을 분리시킨 후 상층을 분리하였다. 이렇게 처리하여 얻은 추출물은 감압증발기(evaporator)를 이용하여 농축, 건조시킨 후 물이나 에탄올 또는 1,3-부틸렌글리콜 등의 용매에 녹여 사용하였다.

하기 참고예들 중에서 참고예 1의 추출 방법으로 얻은 추출물이 가장 효과가 높았기 때문에, 본 발명에 의한 현삼 추출물, 백복령 추출물의 효과를 검증하기 위한 하기 시험예에서는 참고예 1의 추출물에 대해서만 언급한다. 그 외 참고예 2 내지 6의 추출물들은 전반적으로 참고예 1의 추출물보다 약 10 내지 50% 정도 효능이 낮았지만, 본 특허의 범위에는 참고예 1 내지 6의 추출물이 모두 포함된다.

[참고예 1] 생약재의 물 추출물의 제조방법

대한민국의 한약재상인 건화약품으로부터 구입한 동결 건조된 현삼, 백복령 각 200g을 분쇄하여 중량비 10배의 물을 넣고 잘 저어주면서 80℃에서 18시간 동안 추출하였다. 상온으로 냉각시킨 후, 여과지를 통해 여과한 여액에 에탄올 4kg을 넣고 실온에서 48시간 동안 방치한 후, 다시 여과하여 얻은 침전물을 증류수 2kg에 녹인 후 재여과한 여액을 감압증발기로 농축함으로써 현삼, 백복령의 물 추출물을 얻었다.

[참고예 2] 생약재의 에탄올 추출물의 제조방법

동결 건조한 현삼, 백복령 각 200g에 중량(kg)비로 10배량의 70% 에탄올을 가한 후 80℃에서 2시간 동안 가열하여 유효성분을 추출하였다. 이를 하루 동안 상 온에서 방치하여 불순물을 침전시킨 후, 여과지를 이용하여 2회 여과한 여액을 감압증발기를 사용하여 완전히 증발시켜 농축함으로써 현삼, 백복령의 에탄올 추출물을 얻었다.

[참고예 3] 생약재의 메탄올 추출물의 제조방법

동결 건조한 현삼, 백복령 각 200g에 중량(kg)비 10배량의 메탄올을 가한 후 70℃에서 2시간 동안 가열하여 유효성분을 추출하였다. 이를 하루 동안 상온에서 방치하여 불순물을 침전시킨 후, 여과지를 이용하여 2회 여과한 여액을 감압증발기를 사용하여 완전히 증발시켜 농축함으로써 현삼, 백복령의 메탄올 추출물을 얻었다.

[참고예 4] 생약재의 헥산 및 에틸아세테이트층 분획

상기 참고예 3의 현삼, 백복령의 메탄올 추출물 각각에 물과 헥산을 1:1로 섞은 혼합용매를 20배량 가하여 완전히 혼탁시킨 후, 상온에서 하루 동안 방치시켜 층을 분리한다. 상층액인 헥산층만을 분리하여 감압증발기로 감압 농축시켜 현삼, 백복령 추출물의 각각 헥산층 분획을 얻었다.

하층액인 물층에 에틸아세테이트 용매를 2배량 첨가하여 진탕한 후, 상온에서 하루 동안 방치시켜 층을 분리시켰다. 상층액인 에틸아세테이트층을 분리하여 감압증발기로 감압 농축시켜 현삼, 백복령 추출물의 각각 에틸아세테이트층 분획을 얻었다.

[참고예 5] 생약재의 부탄올층 분획

상기 참고예 4의 에틸아세테이트층 분획 과정중의 하층액인 물층에 부탄올 2배량을 첨가하여 상기 참고예 4와 같이 수행하여 부탄올층 분획을 얻었다.

[참고예 6] 생약재의 물층 분획

상기 참고예 5에서 나온 최종의 물층을 감압증발기에서 농축하여 현삼, 백복령 각각의 물층 분획을 얻었다.

상기의 방법으로 추출된 현삼, 백복령 추출물, 또는 추출 이후 더 나아가 농축된 현삼, 백복령 추출물을 30% 수용액, 1,3-부틸렌글리콜에 5%(w/w)의 농도로 용해시킨 용액 또는 에탄올에 10%(w/w)의 농도로 용해시킨 용액으로 제조하여 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 팩 등과 같은 화장료 제형에 첨가하여 사용하였다.

이하, 본 발명자들은 본 발명에 의한 참고예 1의 현삼, 백복령 추출물의 효과를 입증하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 하기 실시예 3에서 현삼 추출물과 백복령 추출물의 혼합 비율은 1:1로 하였다.

성분	실시예
성분	1	2	3
현삼	○		○
백복령		○	○

[시험예 1] 인간 각질형성세포의 분화유도 시험

현삼, 백복령 추출물의 세포분화 촉진효과를 보기 위해 첫째, 각질형성세포의 분화시 생성되는 각질세포막(Cornified Envelop, CE)의 양을 흡광도를 이용하여 측정하는 방법과 둘째, 인간피부세포주(HaCaT)의 분화시 생성되는 각질세포막(Cornified Envelop, CE)의 양을 동위원소를 이용하여 측정하는 2가지 방법으로 시험하였다.

첫번째 흡광도를 이용한 시험에서는 일차 배양한 인간의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 후, 하기 표 2의 시험물질들을 표에 제시한 농도로 배양액에 첨가하여, 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이 세포를 수확(cell harvest)하여 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척한 뒤, 2% 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)와 20mM 농도의 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리한 침전물을 다시 PBS 1ml에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액 일부를 취하여 단백질 함량을 측정하여, 세포분화정도의 평가시 기준으로 삼았다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘농도에 시험물질을 첨가하여 실시한 시험 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.

두번째 동위원소를 이용한 시험에서는 일차 배양한 인간의 인간피부세포주를 24웰형의 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 후, 1uCi/ml의 농도로 [35S]-메티오닌을 표 2의 시험물질들과 함께 표에 제시한 농도로 배양액에 첨가하여, 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 2일간 배양하였다. 이 세포를 수확(cell harvest)하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 뒤, 2% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)와 20 mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 PBS 500㎕씩를 가하여 피펫팅한 후 100㎕씩 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 분주 후 칵테일 용액(Cocktail solution)을 2.5ml 첨가시켜 액체섬광계수기(Liquid Scintillation Counter, LSC)를 이용하여 측정하여 전체 단백질의 양을 결정하였다. 결정된 전체 단백질양을 기준으로 하여 각각의 해당되는 양을 25mm 필터를 이용하여 걸러 내었다. 이러한 방법으로 필터에 걸러진 불용성 단백질만을 취하여 필터 자체를 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 넣었다. 칵테일 용액(Cocktail solution)을 2.5ml를 첨가하여 필터를 잘 녹인 후 액체섬광계수기로 측정하였다. 이 값을 전에 측정한 전체 단백질 양으로 나누어주어 분화 시 형성되는 CE의 양을 결정하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

시험 물질 (현삼의 물 추출물)		각질형성세포에서의 분화능(%)	인간피부세포주에서의 분화능(%)
대조군	Low Ca² ⁺(0.03mM)	100	100
대조군	High Ca² ⁺(1.2mM)	210	224
시험물질 처리군	현삼 1.0ppm	118	124
	백복령 1.0ppm	118	120
	현삼, 백복령 혼합 1.0ppm	128	136

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 현삼, 백복령 추출물은 각질형성세포 및 인간피부세포주 모두에서 분화를 촉진하는 것을 알 수 있었다. 또한, 현삼 추출물만을 사용한 것 보다 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물을 사용한 것이 더 효과적임을 알 수 있었다.

[시험예 2] 인간의 피부세포주의 트랜스 글루타미네이즈(transglutaminase)의 발현 효과

인간의 피부세포주를 96웰형 세포배양 플레이트의 각 웰에 5x10⁴개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 부착시킨 피부세포주에 시험물질을 처리한 후, 2일이 지난 다음, 배지를 제거하고, -20℃의 냉장고에 보관하였다. 동결-해동(Freeze-thawing)을 2회 반복하여 물질 처리한 세포를 파괴시킨 후, 아세톤:에탄올=1:1(v/v)의 비율로 하여 처리하고 4℃ 에서 30분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 그 후, 실온에 방치하여 유기용매가 증발되게 하고, 블록킹(1% 소혈청알부민), 트랜스글루타미네이즈 항체(primary antibody), HRP(horseradish peroxidase, 양고추냉이 퍼록시다제) 안티-마우스 항체(secondary antibody)를 수행하고, 발색은 오르토-페닐디아민(o-phenyldiamine, OPD)를 첨가하여 수행하였다. 발현량은 490nm에서 흡광도를 측정하였고, 보정은 630nm에서 백그라운드(background)를 측정하여 수행하였다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2 mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘농도에 시험물질을 첨가하여 실시한 시험 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

시험 물질 (현삼의 물 추출물)		트랜스글루타미네이즈 발현량(%)
대조군	Low Ca² ⁺(0.03mM)	100
대조군	High Ca² ⁺(1.2mM)	139
시험물질 처리군	현삼 1.0ppm	260
	백복령 1.0ppm	210
	현삼, 백복령 혼합 1.0ppm	268

상기 표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 현삼, 백복령 추출물은 음성 대조군에 비해 두 배 이상의 증가양상을 보였고, 양성 대조군보다도 상당히 많은 양이 발현됨을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 의한 현삼, 백복령 추출물이 트랜스글루타미네이즈의 발현을 향상시키는 것을 알 수 있었다. 또한, 현삼 추출물만을 사용한 것 보다 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물을 사용한 것이 더 효과적임을 알 수 있었다.

[시험예 3] 무모생쥐 피부에서의 피부장벽회복 및 보습력 시험

본 발명자들은 현삼, 백복령 추출물이 장기간의 피부손상으로 인한 피부장벽의 회복에 미치는 효과를 평가하기 위한 시험을 실시하였다. 출생 후 8 내지 10주가 경과한 젊은 무모생쥐의 등에 아세톤을 1일 2회씩 5일 동안 주기적으로 도포하여 실험동물 등 피부의 장벽기능을 손상시킨 다음, 증발계(Evaporimeter)로 경피수분손실량(Transepidermal water loss, TEWL)을 측정하여 40g/㎡/hr 이상의 경피수분손실을 나타내는 피부를 가진 실험동물만을 대상으로 비히클(Vehicle)(프로필렌글리콜:에탄올=7:3)과 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물 5%를 함유한 시험물질을 피부면적 5cm2 당 200㎕의 용량으로 1일 2회씩 3일동안 연속 도포하면서 일정시간마다 TEWL을 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 전반적으로 현삼추출물 및 백복령 추출물의 혼합물을 도포한 처리군이 비히클군에 비해 더 빠르게 장벽손상이 회복되었다. 또한, TEWL 측정시점에 독일 Courage Khazaka사의 코니오미터(Corneometer)를 사용하여 측정한 피부 수분량의 경우에도 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물을 처치한 군의 피부수분량이 비히클 처치군보다 높았으며, 장벽손상회복과 더불어 피부수분량도 증가하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.

[시험예 4] 인간 피부에서 표피지질(총 세라마이드) 생성량 증가 효과 시험

현삼, 백복령 추출물이 실제 인간 피부에서의 지질 합성 증가에 미치는 효과를 평가하기 위하여 시험을 실시하였다. 시험 물질 조성은 Carbopol ETD 2020 0.5%, TEA 0.45%, 시험물질 5%, 및 탈이온화된 물로 100을 맞추어 사용하였다. 12명의 성인 남, 녀를 대상으로 팔뚝에 50ml 폴리프로필렌 코르니컬 튜브(polypropylene cornical tube)의 직경만큼의 영역을 표시한 후 매일 2회씩 대조군들과 현삼 추출물, 백복령 추출물, 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물을 20㎕씩 도포하면서 피검자를 2군으로 나누어 3일째와 11일째 생성 지질량을 하기와 같은 방법으로 지질을 추출하여 분석하였다. 팔뚝을 수돗물을 이용하여 씻은 후 Scotch^® 810 Magic tape으로 1회 테입 스트립핑(tape stripping)을 한 다음 자른 50ml 폴리프로필렌 코르니컬 튜브를 저장소(reservoir)로 사용하여 1ml의 사이클로헥산/에탄올(cyclohexane/ethanol)을 4:1의 비율로 첨가한 후 약 1분간 섞어 준 뒤 이를 새로운 튜브에 옮겼다. 다시 1ml의 사이클로헥산/에탄올(cyclohexane/ethanol)을 1:1의 비율로 첨가하여 약 1분간 섞어 준 뒤 이를 새로운 튜브에 모았다. 이 후 이를 50℃에서 질소 가스를 이용하여 건조시킨 다음 500㎕의 클로로포름:메탄올(chloroform:methanol)=2:1의 용액 일정량에 녹여 보관하였다. 각 시료들을 CAMAG사의 Automated TLC sampler-4를 이용하여 Silicagel TLC(Thin Layer chromatography) 판에 점적하고, AMD(Automated Multiple Development)를 이용하여 하기 표 4과 같은 조성비의 전개 용매로 전개하였다.

	클로로포름	메탄올	물	아세트산	헥산	디에틸에테르	피트롤리움에테르	용매이동 거리(cm)
1차	40	10	1					3.0
2차	190	9		1				6.5
3차				2	12	3		7.5
4차							100	Top

TLC 판을 전개시킨 후 TLC Scanner-II(CAMAG 사: 농도계(densitometer))를 이용하여 570nm 파장에서 각 밴드(band)의 크기를 측정하였다. 비처치군의 세라마이드 생성량을 100%로 환산한 각 처치군의 세라마이드 생성량은 하기 표 5 및 도 6에 나타내었다.

시험 물질 (현삼의 물 추출물)		3일간 처리 후의 세라마이드 증가율(%)
대조군	무처치군	100
	비히클	111.3
	글리세린(5%)	110.2
시험물질 처리군	현삼(5%)	133.6
	백복령(5%)	130.1
	현삼, 백복령 혼합물(5%)	140.0

상기 표 5 및 도 6에 나타난 바와 같이 현삼 추출물, 백복령 추출물, 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물 처치 3일 후 및 11일 후에 음성대조군 (무처리군/비히클) 대비 증가상태를 보였고 양성대조군(글리세린) 보다도 증가를 보였다. 이는, 현삼, 백복령 추출물에 의한 세라마이드 증가를 입증하는 것이다. 또한, 현삼 추출물만을 사용한 것 보다 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물을 사용한 것이 더 효과적임을 알 수 있었다.

[시험예 5] 피부세포 분화촉진/증식억제 및 지질생합성촉진과 항염에 있어 역할을 하는 PPAR-α(Peroxisome Proliferator Activated Receptor-alpha) 활성화 시험

원숭이 신장 상피 세포주인 CV-1세포(ATCC CCL 70)를 숯(charcol)/덱스트란 처리 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 계대 배양하였고, 페놀 레드(phenol red)의 에스트로겐에 의한 효과를 제거하기 위해 무-페놀 레드 배지를 사용하였다. 플라스미드는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버셜 프로모터(universal promoter) 뒤에 PPAR-(유전자를 지닌 것과 리간드 결합 형의 PPAR-)이 결합하여 활성화되는 PPRE(PPARs Response Element)를 프로모터로 가지고 뒤에 리포터로써 역할을 하는 반디불(firefly) 루시퍼라제 유전자를 지닌 것 그리고 참조로 사용될 유니버셜 프로모터에 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드가 사용되었다.

CV-1 세포를 9x10⁴의 농도로 24웰형 플레이트에 깐 후 24시간 배양한 다음 상기 세 종류의 플라스미드 유전자를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 하였다. 그 후 24시간 배양한 다음 1xPBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후 리간드 후보물질들을 농도별로 처리하고 24시간 배양한 다음 1xPBS로 세척하고 1xPLB(Passive Lysis Buffer)로 세포를 깬 후 Dual-LuciferaseR Reporter Assay System kit를 사용하여 시료와 참조의 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

본 실험에서 양성 대조군은 PPAR-α의 리간드 중 가장 강력한 것으로 알려진 Wy-14,643을 사용하였고 음성 대조군은 시료들을 녹일 때 사용한 에탄올과 무처리군으로 하였다. 그 결과는 도 7에 나타나 있다. 도 7에 나타나 있듯이, 또한, 현삼 추출물만을 사용한 것 보다 현삼 추출물 및 백복령 추출물의 혼합물을 사용한 것이 더 효과적인 PPAR-α의 활성화 경향을 보였다.

이상의 결과로부터, 현삼 추출물 및 백복령 추출물은 피부 세포의 분화 촉진과 증식 억제 및 각질형성세포의 분화 촉진, 손상된 피부 장벽 회복 및 피부 보습력 증가에 있어서 그 효과가 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

하기에 상기 조성물의 제형예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

하기 생약재 추출물은 실시예 1~3 중 어느 하나의 추출물이다.

[제형예 1] 비누 제조

생약재 추출물...............................1.00 (%)

유지........................................적당량

수산화나트륨................................적당량

염화나트륨..................................적당량

향료........................................소 량

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비에 의해 비누를 제조하였다.

[제형예 2] 로션 제조

생약재 추출물...............................3.00 (%)

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염.............1.00

수용성 콜라겐 (1 % 수용액)..................1.00

시트르산나트륨..............................0.10

시트르산....................................0.05

감초 엑기스.................................0.20

1,3-부틸렌글리콜............................3.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)에 의해 로션을 제조하였다.

[제형예 3] 크림 제조

생약재 추출물...............................1.00(%)

폴리에틸렌글리콜모노스테알레이트............2.00

자기유화형모노스테아르산글리세린............5.00

세틸알코올..................................4.00

스쿠알렌....................................6.00

트리2-에틸헥산글리세릴....................6.00

스핑고당지질................................1.00

1.3-부틸렌글리콜............................7.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 크림을 제조하였다.

[제형예 4] 팩 제조

생약재 추출물................................5.00(%)

폴리비닐알코올..............................13.00

L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염..............1.00

라우로일히드록시프롤린.......................1.00

수용성 콜라겐 (1 % 수용액)...................2.00

1,3-부틸렌글리콜.............................3.00

에탄올.......................................5.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 팩을 제조하였다.

[제형예 5] 미용액 제조

생약재 추출물..................................2.00(%)

히드록시에틸렌셀룰로오스(2 % 수용액)..........12.00

진탄검(2 % 수용액)...........................2.00

1,3-부틸렌글리콜...............................6.00

진한 글리세린..................................4.00

히알루론산나트륨 (1 % 수용액)..................5.00

정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 미용액을 제조하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 피부 보습용 외용제 조성물은 유효성분으로 현삼 추출물을 주성분으로 함유하고 백복령 추출물을 더 함유하는 것을 특징으로 하며, 각질층 및 피부장벽을 구성하는 골격 성분인 각질세포를 정상적으로 유도하여 외부의 물리적인 자극으로부터 피부를 보호할 수 있게 하고, 각질세포를 둘러싸서 피부장벽을 완성시키는 구성성분인 지질의 생합성을 촉진하여 피부장벽의 강화를 유도할 수 있다. 따라서 이러한 작용을 통해 상기 현삼 추출물 및 백복령 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물은 피부 보습용으로, 표피 분화가 불완전함으로 인해서 발생하는 피부 건조 증상, 아토피 피부염 증상, 접촉성 피부염 증상 또는 건선 등을 예방 또는 개선하며, 피부 장벽기능 강화용, 및 피부 각질 형성세포 분화 유도용 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

현삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물에 백복령 추출물을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 피부 장벽기능을 강화하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 각질형성세포 분화를 촉진하는 것임을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 세라마이드 생성을 촉진하는 것임을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 PPAR-α를 활성화하는 것임을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출물은 0.0001~30중량%의 양으로 함유 됨을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출물은 현삼을 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출하거나 분획함으로써 제조된 것을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 팩, 젤, 파우더, 메이크업 베이스, 파운데이션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 염모제 또는 분무제의 제형을 가지는 화장료 조성물임을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 연고, 젤, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 가지는 약학 조성물임을 특징으로 하는 피부 보습용 외용제 조성물.