KR20040074697A - 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물 및이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 다양한 의약품, 화장품 소재로 사용될 수 있다.

Description

피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물{SCROPHULARIA BUERGERIANA EXTRACT WITH PREVENTING OR IMPROVING ACTIVITY OF SKIN WRINKLE AND A COMPOSITION CONTAINING THE EXTRACT}

[산업상 이용분야]

본 발명은 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 내에서 콜라겐, 엘라스틴의 발현을 증가시키고 콜라게나제의 발현을 감소시키며 hairless mouse에서 피부주름을 예방하거나 개선하는 작용을 가지는 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

[종래기술]

피부는 상부층, 표피(두께 약 0.1mm), 하부층 및 진피(두께 약 1 내지 4mm), 기저층으로 이루어진다. 피부외관의 주름살이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선에 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있는 데 두 가지 원인에 의한 주름 형성 메커니즘은 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않은 상태이다. 두 노화에서 공통적으로 발견되는 현상은 진피내의 주 구성단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형, 진피의 기질인 히아루론산이 감소에 의해탄력이 없어짐으로써 주름이 생기고 피부가 늘어지게 되는 것으로 지금까지의 연구결과에 의하면 이들 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 피부의 노화를 억제하는 기전에 따라 종류가 다양하나 대표적으로 콜라겐 생성 촉진제, 엘라스틴 활성화제, 히아루론산 생성 증가제, 자유라디칼 소거제, 세포 증식제, 광노화 억제제, 각질세포 증식억제제, 보습제, 유해 활성산소 생성방지제, 세포 재생물질 등으로 나눌 수 있다. 현재 응용되고 있는 주요 피부 주름 개선 방법에는 자유 라디칼의 형성이나 반응을 억제하는 비타민 C, E, 카로티노이드와 같은 항산화제에 의해 주름의 형성을 예방하는 방법, 레티놀과 같이 진피내의 콜라겐 생합성을 증가시키는 방법, 콜라겐을 피부내로 주입하는 방법, 보툴리눔 독소를 피부에 주사하는 방법 등이 있다 그러나 비타민 C, E, 카로티노이드, 레티놀 모두 상온에서 쉽게 부서지며 레티놀은 처리농도가 높아지면 피부에 부작용을 나타내는 것으로 알려져있으며, 콜라젠 주입이나, 독소의 주사 역시 일시적인 완화효과를 주고 심각한 부작용을 일를 수있다는 문제점이 있다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 본 발명의 현삼 추출물 및 여러 한약재 추출물로 처리한 인간의 섬유아세포에서의 콜라겐 Type I의 RNA 발현 변화를 보여주는 도면이다.

도 2는 본 발명의 현삼 추출물 및 한약재 추출물로 처리한 인간의 섬유아세포에서의 엘라스틴 RNA 발현의 변화이다.

도 3은 본 발명의 현삼 추출물 및 여러 한약재 추출물로 처리한 인간의 태아섬유아세포에서의 콜라겐 단백질 발현 변화를 보인 도면이다.

도 4는 본 발명의 현삼 추출물 및 여러 한약재 추출물로 처리한 인간의 섬유아세포에서의 엘라스틴 단백질 발현 변화를 보인 도면이다.

도 5는 본 발명의 현삼 추출물 및 여러 한약재 추출물로 처리한 인간의 섬유아세포에서의 콜라게나제(collagenase) 효소의 단백질 발현의 변화를 보인 도면이다.

도 6a는 UV에 노출시키지 않은 마우스 사진이고 도 6b는 UV에 노출시키지 않은 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 7a는 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 7b는 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 8a는 오약 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 8b는 오약 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 9a는 당귀 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 9b는 당귀 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 10a는 현삼 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 10b는 현삼 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 바람직한 제1 구체예에 따르면, 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 제2 구체예에 따르면, 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

현삼(玄蔘)은 현삼과의 다년생 초본식물인 현삼의 뿌리를 말하며 한방에서 알려져 있는 효능으로는 녹농간균에 대하여 억제 작용이 있고 혈관을 확장하고 혈압을 하강시키며, 혈당을 낮추는 것으로 알려져 있다. 소량을 쓰면 가벼운 강심작용을 다량을 쓰면 심장 중독을 일으키는 한약재이다. 현삼은 민간요법에서 유래하거나 한방에서 다른 용도로 사용되어오고 있을 뿐 현삼의 피부주름 예방 및 개선 효과에 대해서는 알려진 바 없다.

본 발명의 바람직한 제1 구체예에 따르면, 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물을 제공한다.

상기 현삼 추출물은 물 또는 알코올 등의 유기 용매로 추출한 추출물이 될 수 있다. 또한 일반적인 용매 추출법을 적용한 조추출물일 수 있으며, 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물일 수도 있다. 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 본 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예컨대 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 현삼 추출물은 콜라겐이나 엘라스틴과 같은 진피 구성단백질의 발현을 촉진하고 콜라게나제와 같은 진피구성단백질을 분해하는 효소의 발현을 억제함으로써 피부주름 형성을 예방하거나 이미 형성돤 피부주름을 개선시킨다.

본 발명의 바람직한 제2 구체예에 따르면, 상기 현삼 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 화장품이나 약제에 함유될 수 있다. 약제로 제조되는 경우 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체에 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)는 모두 사용가능하다.

본 발명의 추출물은 일반적인 외부의약품 이나 기능성화장품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하거나, 여러 종류의 화장품 베이스에 첨가하여 조제된다.

상기 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다. 예컨대 추출물 1 ml을 넓이 4cm²의 피부에 투여되는 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 캡슐제, 좌약 및 앰플제로 존재할 수 있다. 피부투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 등이 해당되며 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함되며 여러 종류의 화장품의 베이스들이 포함될 수 있다.

본 발명의 현삼 추출물을 포함하는 조성물은 기능성 화장품 또는 약품에 첨가될 수 있으며 이러한 기능성 화장품이나 약품의 종류는 특별히 한정되지 않는다.

[실시예]

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

현재까지 피부 주름 예방 및 개선 효과를 측정하는 방법으로는 진피구성 단백질의 발현변화 즉 피부를 지탱하여 주는 콜라겐이나 엘라스틴의 발현정도 및 콜라겐을 부수어 주는 콜라게나제 단백질의 발현분석을 통하여 진피구성 단백질을 발현정도를 측정하는 방법 등이 있다. 또한 헤어리스 마우스(hairless mouse)를 이용한 in vivo 모델 역시 피부주름 연구를 수행하는데 주된 방법으로 받아들여지고 있다. 이하의 실시예에서는 단백질의 발현분석을 통하여 진피구성 단백질을 발현 변화를 측정하는 방법과 헤어리스 마우스를 이용한 in vivo 실험을 통하여 현삼추출물의 주름 예방 및 개선 효과를 규명하였다.

실시예 1: 현삼 추출 조성물의 제조

건조상태의 현삼 100g을 곱게 마쇄한 후 70% 식음용 주정 에탄올로 50℃에서 2시간 동안 추출 후 에탄올에서 녹아 나온 성분을 받아 진공회전증발기를 이용하여 에탄올 성분을 완전히 제거하고 농축하였다. 이후 동결건조기를 이용하여 48시간동안 수분을 완전히 제거한 추출물(9.8 g)을 만들었다. 이렇게 완성된 추출물의 1/10을 10ml의 물에 녹인 것을 원액(98 mg 추출물/ml water)으로 하여 원액의 1/100 희석액(0.98 mg 추출물/ml water)을 이하 실험에 사용하였다.

실시예 2: 세포배양을 통한 진피구성단백질의 RNA 및 단백질의 발현변화

가. 인간의 섬유아세포(human fibroblast)의 세포배양

한림대학교에서 확립한 인간의 태아섬유아세포의 세포배양을 통하여 진피구성 단백질 RNA발현 및 단백질의 발현변화를 조사하였다. 인간의 섬유아세포의 세포배양 방법으로는 인간의 섬유아세포 세포주를 트립신-EDTA로 배양함에 의하여 1:4로 희석률(2의 분열 수에 해당)로 새 페트리 디쉬(10 mm 지름)로 바꾸어 주면서 연속적으로 수를 늘리면서 다량으로 계대 배양하고, 배양액은 DMEM-10% 소 태아 혈청(페니실린-스트렙토마이신 포함)을 배지로 사용하고 37℃, 5% CO₂에서 매 3일 간격으로 배지를 교체하였다.

나. 세포배양을 통한 진피구성단백질의 RNA 발현의 변화 분석

상기 계대 배양된 인간의 섬유아세포를 이용하여 진피구성단백질의 RNA 발현이 많은 젊은 세포와 진피구성 단백질 RNA의 발현이 적은 노화된 세포에 각각의 한약재를 처리한 후 3일 뒤에 세포 내에서 발현되는 진피구성 단백질 RNA의 발현을 RT-PCR(역전사-PCR) 방법을 이용하여 측정하였다. RNA를 제조하기 위해 추출물을 처리한 페트리 디쉬의 세포(젊은 세포-분열수 30, 늙은 세포- 분열수 60)를 PBS(phosphate Buffered Saline)으로 2회 세척하고 RNA Zol B(Biotecx Co)를 가하여(0.2 ml/10⁶cells) total RNA를 제조하고, RT-PCR에 의해 정량하였다. 즉 total RNA를 먼저 3'쪽 프라이머와 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 단일 가닥(single-stranded) DNA를 만들고, 이 산물을 2개의 프라이머와 Taq 폴리머라제를 사용하여 증폭한 다음 알려진 크기의 증폭산물을 아가로스 겔에서 전기영동하여 분리하고 에티듐 브로마이드로 염색한 후 사진을 찍었다. 콜라젠 및 엘라스틴의 RNA 발현을 비처리구, 처리구에 대해 측정하여 비교한다.

현삼추출물 처리구와 기타 한약재 처리구의 콜라겐 RNA의 발현정도를 평가하였다. RT-PCR(역전사 PCR)에 의해 증폭하고 아가로즈 겔에서 전기영동으로 분석하여 그 결과를 도 1에 도시하였다(1. 대조구(비처리 젊은 섬유아세포); 2. 부평초 ; 3. 강진향; 4. 합판피; 5. 천황연; 6. 금전초; 7. 삼초뿌리; 8. 양 강; 9. 당 귀 ; 10. 현삼추출물; 11. 상백리; 12. 영 지; 13. 인 진; 14. 익모초; 15. 오약; 16. 남성; 17. 숙지황; 18. 건지황; 19. 유근피; 20. 형개; 21 무역전사반응(무반응 대조구); 22 DNA(RNA 대신 DNA첨가 반응 대조구)) 21, 22번의 경우는 PCR에 대한control로써 21번은 RT(역전사)반응을 하지 않고 PCR만 한 경우 22번은 인간의 게놈 DNA(genomic DNA)를 이용하여 PCR을 한 샘플이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 현삼추출물 및 합판피, 천황연, 영지, 당귀, 오약 등의 한약재 추출물이 콜라겐 RNA 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.

같은 실험 방법으로 엘라스틴의 RNA 발현정도를 측정하여 도 2에 도시하였다(1. 대조구(비처리 젊은 섬유아세포); 2. 부평초; 3. 강진향; 4. 합판피; 5. 천황연; 6. 금전초; 7. 삼초뿌리; 8. 양 강; 9. 당 귀; 10. 현삼추출물; 11. 상백리; 12. 영 지; 13. 인 진; 14. 익모초 ; 15. 오약 ; 16. 남성; 17. 숙지황 ; 18. 건지황 ; 19. 유근피 ; 20. 형개). 도 2의 결과에서 현삼추출물 및 한약재 추출물 상백리, 익모초, 당귀, 오약, 건지황, 유근피 등이 엘라스틴 RNA 발현을 증가시키는 것으로 나타나 있다.

다. 세포배양을 통한 진피구성 단백질 발현의 변화

상기 계대 배양된 인간의 섬유아세포를 이용하여 진피구성단백질의 발현이 많은 젊은 세포와 진피구성 단백질의 발현이 적은 노화된 세포에 각각의 한약재를 처리한 후 3일 뒤에 세포 내에서 발현되는 진피구성단백질 발현을 SDS 폴리아크릴아마이드(SDS PAGE)겔에서 전기영동으로 분리하고 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 측정하였다.

측정을 위하여 추출물을 처리한 페트리 디쉬의 세포(젊은 세포-분열수 30, 늙은 세포- 분열수 60)를 PBS(phosphate Buffered Saline)으로 2회 세척하고 한약재 처리 후 진피구성 단백질의 발현을 조사하기 위하여 각각 회수한 세포를 이용하여 NET buffer(150mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7.4, 5mM EDTA pH8)을 이용하여 세포를 용출(lysis)시키고 단백질을 정량하여 20㎍의 단백질을 SDS PAGE 겔에서 150V 1시간동안 전기영동 후에 Transfer membrane에 70V 30분간 옮기고 밀크 용액(milk solution)에 멤브레인(membrane)을 담그고 하룻밤 동안 방치하였다. 이후 TBST 세척액으로 10분간 3회 세척하고 1차 항체를 이용하여 1시간 30분 동안 반응시켰으며 세척액으로 3회 세척한 후 2차 항체로 1시간 동안 반응시키고 세척액으로 3회 세척한 후 ECL 키트를 이용하여 필름에 감광시키는 방법을 이용하여 단백질의 발현을 조사하였다. 그 결과를 도 3에 도시하였다(1. 대조구(비처리 젊은 섬유아세포); 2. 부평초; 3. 강진향; 4. 합판피; 5. 천황연; 6. 금전초; 7. 삼초뿌리; 8. 양 강 ; 9. 당 귀; 10. 현삼추출물; 11. 상백리; 12. 영 지; 13. 인진; 14. 익모초; 15. 오약; 16. 남성; 17. 숙지황; 18. 건지황; 19. 유근피). 도 3에 도시된 바와 같이 현삼추출물 및 한약재 합판피, 당귀, 상백리, 영지, 숙지황 등이 콜라겐 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.

같은 실험방법을 이용하여 엘라스틴의 발현 변화를 조사하여 도 4에 도시하였다(1. 대조구(비처리 젊은섬유아세포); 2. 부평초 ; 3. 강진향; 4. 합판피; 5. 천황연; 6. 금전초; 7. 삼초뿌리; 8. 양 강; 9. 당 귀; 10. 현삼추출물; 11. 상백리; 12. 영 지; 13. 인진 ; 14. 익모초 ; 15. 오약 ; 16. 남성; 17. 숙지황; 18. 건지황; 19. 유근피). 도 4에 도시된 바와 같이 현삼추출물 및 한약재 추출물 합판피, 당귀, 건지황 등이 엘라스틴 단백질 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.

콜라겐을 부수는 것으로 알려져 있는 콜라게나제 단백질 발현변화는 도 5에도시되어 있다(1. 대조구(비처리 늙은 섬유아세포); 2. 대조구(비처리 젊은섬유아세포); 3. 금전초; 4. 유근피; 5. 형 개; 6. 부평초; 7. 상백리; 8. 삼초뿌리; 9. 강진향; 10. 현삼추출물; 11. 인삼; 12. 영지; 13. 양강; 14. 합판피; 15. 남성; 16. 익모초; 17. 천황연). 도 5에 도시된 바와 같이 현삼추출물 및 한약재 추출물 인삼, 양강 등이 콜라게나제 발현을 낮추는 것으로 나타났다.

이상의 인간섬유아세포를 이용한 진피 유전자의 발현 변화 및 단백질 발현 변화를 조사한 결과에서 RT-PCR 결과에서 현삼추출물 및 한약재 추출물 당귀, 오약, 등이 진피단백질 콜라겐 RNA와 엘라스틴 RNA 발현을 동시에 증가시키는 것을 알 수 있다. 또한 현삼추출물이 단백질 발현 분석에서 콜라겐과 엘라스틴 단백질의 발현을 증가시키고 콜라게나제 단백질의 발현을 공통적으로 감소시키는 것으로 나타났다.

실시예 3: 헤어리스 마우스를 이용한 주름제거 효능 측정

RNA 발현분석과 단백질발현 분석에 주름 억제 효과가 있는 것으로 측정된 추출물에 대하여 헤어리스 마우스를 이용한 주름예방 및 개선 효능을 확인하였다. 실험에 사용된 헤어리스 마우스는 찰스리버에서 구매하였다. 실험에 사용된 마우스의 연령은 6주령 마우스를 사용하여 8주간 실험하였으며 이는 헤어리스 마우스의 주름생성 정도를 고려할 때 아직 주름이 생성되지 않은 마우스를 사용하였다. 실험기간 중 사육실 환경은 23±2℃, 상대습도 55±10 %를 유지하였고 12시간 인공 조명 하에서 마우스용 케이지에 4마리씩 넣어 사육하였으며, 실험동물용 사료 및 식수는 자유로이 공급하였다. 이렇게 사육된 마우스에 현삼 추출물의 주름억제 효과를 검증하기 위하여 현삼 추출물을 원액의 1/50로 희석하고 한약재 추출물 당귀와 오약도 같은 농도로 희석하여 등이 충분히 젖을 정도의 양을 매일 투여하였다.

사육된 마우스를 1주일에 3회씩 UV 램프에 노출시켰으며 매회당 UVA는 14 J/㎠, UVB는 20 mJ/㎠로 조사하였다. 주름의 생성정도는 Donald methods(photochemistry and photobiology 1987) 방법을 사용하여 측정하였다. 도 6a는 UV에 노출시키지 않은 마우스 사진이고 도 6b는 UV에 노출시키지 않은 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 7a는 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 7b는 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 8a는 한약재 오약을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 8b는 한약재 오약을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 9a는 한약재 당귀를 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 9b는 한약재 당귀를 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 10a는 현삼 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스 사진이고 도 10b는 현삼 추출물을 투여한 후 UV에 노출시킨 마우스의 주름을 측정한 결과를 보인 그래프이다. 측정결과 현삼 추출물의 주름생성 예방 및 개선 효과가 다른 추출물에 비하여 월등히 높은 것으로 나타났다.

이상의 결과에서 현삼추출물은 인간섬유아세포를 이용한 실험에서도 진피세포 구성단백질의 발현증가 뿐만 아니라 RNA 발현의 증가를 유도하였으며, 헤어리스 마우스를 이용한 주름 생성 실험에서도 주름예방 및 개선 효과를 가지는 것으로 나타났다. 또한 현삼추출물을 처리하였을 때 헤어리스 마우스의 피부에는 암이나 기타 부작용 등이 발생하지 않았다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 주름제거 및 지연시킬 수 있는 현삼 추출물을 이용하여 주름 억제용 기능성 약제, 화장품 및 그에 파생되는 소재를 개발 공급할 수 있다. 또한 현삼을 생산하는 농민들의 소득을 제고하고 아울러 시장개방체제에서 우리 나라 농민들에게 적합한 경쟁력 있는 고소득 작물을 제시할 수 있을 것이다.

본 발명의 단순한 변형 또는 변경은 모두 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (5)

1. 피부주름 예방 및 개선 활성이 우수한 현삼 추출물.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 유기 용매로 추출되는 것인, 현삼 추출물.
3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 진피구성 단백질의 발현을 촉진하고 진피구성 단백질을 분해하는 효소의 발현을 억제하는 것인, 현삼 추출물.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 따른 현삼 추출물을 포함하는 의약조성물.
5. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 따른 현삼 추출물을 포함하는 화장품 조성물.