KR20080068982A - 지방세포 분화 억제활성을 갖는 눈꽃동충하초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방세포 증식억제 활성을 갖는 눈꽃동충하초 열수 추출물과 이를 유효성분으로 함유하는 비만개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카뎁신 S(cathepsin S)의 활성을 저해함으로써 지방세포의 분화 및 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipis) 열수 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 눈꽃동충하초 열수 추출물은 카뎁신 S(cathepsin S)의 활성을 저해함으로써 지방세포의 증식과 분화를 막고, 혈당 및 총 콜레스테롤 농도를 낮추는 효과가 매우 뛰어나므로 눈꽃동충하초 열수 추출물을 이용한 지질대사에 영향을 미치는 기능성 식품 및 약학 조성물을 제공할 수 있다.

비만, 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipis), 지방세포분화, 카뎁신 S(cathepsin S)

Description

지방세포 분화 억제활성을 갖는 동충하초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만개선용 조성물{Inhibition Activity of Paecilomyces tenuipis in differentiation of adipocytes}

도 1은 눈꽃동충하초 열수 추출물이 카뎁신 S(cathepsin S)의 효소활성을 저해하는 정도를 나타낸 그래프이다.

도 2는 3T3-L1 세포의 분화유도 시 배지에 카뎁신 S(cathepsin S)를 50μM/㎖로 처리하고 눈꽃동충하초 열수 추출물을 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖로 처리하여 지방세포가 분화되는 정도를 오일 레드 O 스테이닝(Oil Red O staining)법으로 확인한 것을 나타낸 그림이다.

도 3은 쥐의 8주간의 평균 체중변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 쥐의 혈당의 평균을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 지방세포 증식억제 활성을 갖는 눈꽃 동충하초 열수 추출물과 이를 유 효성분으로 함유하는 비만개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카뎁신 S(cathepsin S)의 활성을 저해함으로써 지방세포의 분화 및 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipis) 열수 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 비만자의 수는 약 1억 5천만 명에 달하며 우리나라에서도 비만자의 비율은 2004년도에 약 30% 정도이고 매년 그 비율이 증가하고 있는 추세이며, 이에 심각한 건강문제로 인식되고 있다. 경제수준의 향상과 미용에 대한 관심 증가에 따라, 기존의 식이요법이나 운동을 포함하여 약물치료에 이르기까지 다양한 방법으로 비만을 치료하기에 이르렀으나 국내에 범람하고 있는 일부 비만억제제와 다이어트 소재는 효능이 과학적으로 검증 되지 않았다. 비만의 치료방법은 그 원인과 마찬가지로 매우 다양한데 크게 식욕억제, 음식물 흡수 억제, 에너지 대사 촉진, 호르몬 조절 등을 들 수 있다. 그러나 다양한 작용기전에도 불구하고 대부분의 비만 치료 약물은 초기에는 두드러진 효과를 나타내나 시간이 지나면서 차츰 감소하고 6~8개월 후에는 거의 효과가 없어지는 현상을 공통적으로 보인다. 또한 약물투여를 중단하면 체중이 다시 증가하며, 복용 중 부작용으로 인해 시판이 중단된 경우가 대부분이다. 현재 의료계에서는 시부트라민(sibutramine)과 올리스타트(orlistat) 두 가지만 장기간 사용 가능한 비만 치료 약물로 인정하고 있다. 그러나 이 약품들도 부작용에 대한 의문이 제기되고 있는 상황이다.

눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipis)는 사상균의 일종인 동충하초균이 곤충에 감염되어 나온 일종의 약용버섯으로 서식환경에 크게 영향을 받지 않아 한국, 일본, 네팔 등 세계적으로 분포되어 있다. 눈꽃동충하초의 화학적 성분을 보면 수분 7.0%, 조단백질 60.9%, 조지방 2.4%, 회분 6.4% 등으로 구성되어 있고 단백질 중에는 우리 몸에 없어서는 안 될 필수아미노산 8종을 비롯하여 총 17가지의 아미노산이 들어 있다. 식품개발연구원의 보고에 의하면 눈꽃동충하초에 있는 아미노산 중 알라닌은 알코올 대사를 촉진하여 숙취해소와 간 기능 보호에 효과가 있으며 또한 혈중콜레스테롤 저하와 고혈압, 뇌졸중 예방에도 좋다고 한다. 글라이신, 타이로신은 치매 및 파킨슨병 예방에 효과가 있다. 이러한 효능을 가진 눈꽃동충하초는 종자산업법에 따라 품종명은 누에동충하초로, 작물명은 눈꽃동충하초로 등록되어 있고 식품원료로 사용이 가능하도록 식품공전에도 등록되어(1998년 7월 10일) 법적인 보호를 받고 있다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 적고 효과적인 체중 조절 작용을 가진 물질을 제공하고자 400여종의 천연물 추출물을 검색 중 눈꽃동충하초 추출물이 비만 억제 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 카뎁신 S(Cathepsin S)의 활성을 저해함으로써 지방세포의 분화 및 증식을 억제하는 효과를 갖는 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipis) 열수 추 출물을 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 비만 개선용 조성물은 카뎁신 S(Cathepsin S)의 활성을 저해함으로써 지방세포의 분화와 증식을 억제하는 효과를 가진 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipis)의 열수 추출물을 이용함을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 이용된 눈꽃동충하초의 열수 추출물은 먼저 눈꽃동충하초의 결실부만을 모아 분쇄한 후 단위 질량당(kg) 20배의 증류수(L)를 혼합하여 90℃~110℃에서 2시간 동안 가열하여 얻은 것이다. 이로부터 얻어진 추출액은 여과기를 통하여 여과하고 동결건조기를 이용하여 동결건조하여 분말화 한다.

본 발명은 상기 추출공정에서 얻어지는 눈꽃동충하초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 눈꽃동충하초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 조성물은 임상 투여시에 경구로 투여가 가능하며 당업계에서 공지된 의약품 제조 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체 등이 첨가되어 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 상기 눈꽃동충하초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 개선 용 조성물은 실제 임상 투여시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 눈꽃동충하초의 열수 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 들이 포함 될 수 있다.

본 발명에 따른 눈꽃동충하초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 조성물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 30 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명에 따른 눈꽃동충하초의 열수 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 단, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

눈꽃동충하초 열수 추출물의 제조

건조된 눈꽃동충하초의 결실부만을 모아 완전히 분쇄한 후 단위 질량당(kg) 20배의 증류수(L)를 혼합하여 90℃~110℃에서 2시간 동안 가열하여 열수 추출물을 얻었다. 이후 상기 열수 추출물을 여과기로 여과한 후 동결 건조하여 분말화 하였다.

실시예 2

눈꽃동충하초 열수 추출물의 카뎁신 S(cathepsin S) 활성저해 능력측정

<2-1> 생체 외에서의 활성저해능력측정

카뎁신 S(Cathepsin S)는 시스테인 프로테아제(cysteine protease) 중 하나로 몇몇 세포외 구조(extracellular matrix)를 분해하는 역할을 한다. 특히 지방세포가 전구체인 섬유아세포(fibroblast)에서 지방세포(adipocyte)로 분화할 때 일어나는 피브로넥틴(fibronectin)의 분해를 돕는 작용을 한다. 따라서, 카뎁신 S의 활성을 저해하면 지방세포의 분화가 억제되고 지방세포의 증식이 일어나지 않는다.

따라서, 눈꽃동충하초의 카뎁신 S 활성저해 능력을 알아보기 위해 먼저 실험상(in vitro)으로 카뎁신 S(from human spleen, Calbiochem)와 펩타이드 Val-Val-Arg을 특이적 기질로 반응 시켰다(Shindo K, 2002, Paecilopeptin, a New Cathepsin S inhibitor produced by Pacilomyces carneus, Biosci Biotechnol Biochem vol.66(11) pp 2444-2448 논문을 참고). Peptide Institute에서 구입한 기질Z-Val-Val-Arg-MCA는 효소 반응 시 형광량이 증가하여 효소 반응 정도를 측정할 수 있다. 버퍼(buffer)는 100mM potassium phosphate(pH 6.5), 5mM DTT, 4mM EDTA를 이용하였으며 효소는 Calbiochem(Cat#219344)에서 구입하여 126.87mU/㎖로 버퍼에 희석하여 준비하였다. 기질(substrate)은 버퍼에 10mM로 희석하여 준비하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 눈꽃 동충하초의 열수 추출물을 농도에 따라 20㎕ 첨가하고 여기에 50㎕의 카뎁신 S(Cathepsin S) 용액과 200㎕의 기질용액을 첨가하였다. 활성정도는 기질에서 분해되어 나온 MCA에 의한 형광을 측정하여 얻을 수 있는데 37℃에서 excitation/emission=360nm/460nm로 60분 동안 10분 간격으로 측정하였다. 동충하초 열수 추출액 대신 버퍼만을 20㎕ 넣은 웰(well)의 형광증가량을 카뎁신 S의 100% 활성으로 계산하고 추출액을 넣은 웰(well)의 형광증가량을 백분율로 계산하였다.

반응 결과 0.185㎎/㎖의 눈꽃동충하초 열수 추출물이 62.5 mU/㎎의 카뎁신 S 10㎎의 활성(6.34 units)을 50% 까지 저해하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 눈꽃 동충하초 열수 추출물의 농도가 증가 할수록 카뎁신 S의 활성이 억제됨을 알 수 있었다.

<2-2> 생체 내에서 활성저해능력측정

3T3-L1 세포(쥐의 지방세포)를 여섯 개의 웰 플레이트(well plate)에 완전히 깔리도록 키우고 분화유도 배지로 치환할 때 무처리한 것을 대조군으로 이용하고 눈꽃동충하초 열수 추출물을 0.033㎎/㎖ 농도로 첨가한 것을 실험군으로 하여 1시간 동안 더 배양 하고 이후 세포 내(In vivo)의 카뎁신 S의 활성을 측정하였다. 세포를 PBS로 2번 세척하고 0.5% triton X-100이 들어간 PBS 300㎕에 세포를 모아 원심분리튜브에 넣고 액체 질소와 37℃ 배양기에 번갈아 반응시키며 세포를 분쇄하였다. 12,000rpm으로 3분간 원심분리하여 상층액만을 특이적 기질인 Z-Val-Val-Arg-MCA와 반응시키고 형광량을 측정하여 카뎁신 S의 활성을 측정하였다. 그 결과를 표1에 나타내었다.

그 결과, 눈꽃 동충하초의 열수추출물이 세포 내의 카뎁신 S의 활성을 30% 정도 저해 하고 있음을 확인하였다.

이와 더불어 3T3-L1 세포(mouse의 지방세포)의 분화유도 배지에 카뎁신 S를 50μM/㎖ 농도로 처리하였을 때 지방세포의 분화가 더욱 활발히 일어나는 것을 확인하고 카뎁신 S (50μM/㎖)와 함께 눈꽃동충하초 열수 추출물을 25㎍/㎖, 또는 50㎍/㎖ 농도로 처리하면 눈꽃동충하초 열수 추출물이 카뎁신 S의 효소반응을 억제하여 분화유도가 적게 일어나는 것을 확인하였다. 먼저 3T3-L1 세포를 6 웰 플레이트(well plate)에 키우고 분화 유도 배지로 치환할 시에 무 처리한 웰(well)을 대조군으로 하고 카뎁신 S만 첨가해 준 웰(well)과 카뎁신 S와 눈꽃동충하초 열수 추 출물을 첨가한 것을 실험군으로 하여 세포의 분화 결과를 비교하였다. 처음 분화유도 배지에만 이 같은 처리를 하고 이후 분화가 완료되는 10일 까지는 대조군과 같이 무 처리한 상태로 배양하였다. 3T3-L1 지방세포의 분화 정도는 Oil red O staining을 통하여 지방 방울(droplet)을 염색하여 그 정도를 비교할 수 있다. 분화되지 않은 3T3-L1 세포는 염색이 되지 않고 분화되어 완전한 지방세포가 되면 붉은 색의 지방 방울이 많이 보인다.

분화유도 10일째에 Oil red O staining을 하였다. Oil red O를 이소프로판올(isopropanol)에 3g/L의 농도로 녹인 후 여과하여 스톡 솔루션(stock solution)을 제조하였으며, 실제 사용할 때는 스톡 솔루션(stock solution)과 증류수의 비율이 6:4가 되도록 혼합한 후 사용하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에서 분화시킨 3T3-L1 세포를 PBS로 세척한 후 10% 포르말린(Formalin)으로 1시간 동안 고정하였다. 다시 PBS로 2번 세척한 후 Oil red O 염색시약으로 1시간 동안 염색한 후 현미경으로 분화정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 a는 대조군으로 3T3-L1이 정상 분화하였을 때의 사진이며, b는 카뎁신 S를 50uM/㎖ 처리하여 세포가 과 분화된 사진이고, c는 카뎁신 S 50uM/㎖ 및 눈꽃동충하초 열수 추출물 25㎍/㎖을 처리한 3T3-L1세포의 분화사진이며 d는 카뎁신 S 50uM/㎖ 및 눈꽃 동충하초 열수 추출물 50㎍/㎖을 처리한 3T3-L1 세포의 분화사진이다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 카뎁신 S는 지방세포의 분화를 도와 지방조 직이 발달하는 데 영향을 미치는데 이때 눈꽃동충하초 열수 추출물을 처리하면 눈꽃동충하초 추출물이 카뎁신 S의 효소반응을 억제하여 지방세포의 분화유도가 적게 일어났음을 확인 할 수 있었다.

실시예 3

눈꽃동충하초 열수 추출물의 비만억제 능력

본 발명에 따른 눈꽃동충하초 열수 추출물의 비만억제효과를 알아보기 위하여 표 2와 같이 사료를 만들고 실험동물에 식이 시키며 각종 지표를 관찰하였다. 실험동물은 C57BL/6 쥐(mice)로 3주령인 수컷을 1주일동안 고지방 식이를 공급하면서 적응시킨 후 이용하였다. 모든 실험군의 쥐는 7마리씩 완전 임의 배치하였다. 실험군은 고지방식이군(고지방식이 100%), 디팻군[고지방 식이 99.5% + 타사의 비만억제 기능성식품 0.5%(디팻 히비스커스, CJ뉴트라)], 눈꽃동충하초군(고지방식이 99.5% + 눈꽃동충하초 열수 추출물 0.5%)의 세군으로 하였다. 고지방 식이는 Research diets사의 D12451(45% fat, 5.252cal/g)을 이용하였다.

총 8주 동안 실험 식이를 공급하며 1주일에 2회 간격으로 체중과 사료 섭취량을 측정하였다. 그 결과를 도 3 및 표 3에 나타내었다.

도 3에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 눈꽃동충하초 열수 추출물을 섭취한 군(눈꽃동충하초군)은 고지방 식이만 섭취한 군(고지방식이군)과 비교하여 체중증가가 현저히 억제되었으며, 타사의 기능성 식품을 섭취한 군(디펫군)과 비교하여도 더 나은 체중 조절 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.

특히, 표 3에 나타낸 8주간의 체중 증가량을 보면, 눈꽃동충하초군은 7.4 ± 1.3이고, 고지방식이군은 15.7 ± 3.6으로서 눈꽃동충하초군의 경우가 대조군인 고지방식이군에 비해 약 50%의 체중증가가 억제되었음을 알 수 있었다.

실시예 4

눈꽃동충하초 열수 추출물의 콜레스테롤 저하효과

혈중 생화학 지표의 측정을 위해 쥐를 12시간 절식시키고 심장채혈을 하고 즉시 혈당을 측정하였다. 혈당은 로체(Roche)의 아큐트렌드-GC기기를 이용하여 측정하였다. 상기 실시예 3의 고지방식이군, 디팻군 및 눈꽃동충하초군에 속하는 각각의 쥐에 대하여 혈당을 측정하여 각 군의 쥐의 혈당의 평균을 비교한 결과를 도 4 (*:P<0.05, 고지방식이군과 비교)에 나타내었다.

도 4에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 고지방식이군은 혈당이 259.3 ± 31이고, 디팻군은 혈당이 271.1 ± 40.5인데 반하여, 눈꽃동충하초군은 혈당이 235.8 ± 29로서 눈꽃동충하초 열수 추출물은 체중 증가를 억제하는 효과와 함께 혈당을 낮추는 효과도 가지고 있는 것을 알 수 있었다.

또한 채혈의 혈장을 분리하여 혈중 총 콜레스테롤과 HDL(high density lipoprotein, 고밀도 지단백) 콜레스테롤의 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다. 총 콜레스테롤은 아산제약의 총 콜레스테롤 측정 kit를 이용하였다. 효소시약 1병과 완충액 1병을 섞어 효소시액을 만들고 효소시액 1.5㎖와 혈청 10㎕ 또는 표준액 10㎕와 섞어 반응을 비교하였다. 37℃에서 5분간 반응시킨 후 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 샘플(sample)의 총 콜레스테롤 농도는 다음과 같이 계산하였다.

샘플의 총 콜레스테롤 농도(㎎/㎗) = 샘플의 흡광도／표준액의 흡광도 ⅹ 표준액의 농도

HDL 콜레스테롤은 아산제약의 HDL 콜레스테롤 측정 kit를 이용하여 측정하였으며 실험방법은 상기의 총 콜레스테롤 측정방법과 같다.

그 결과, 눈꽃동충하초 열수 추출물 식이군(눈꽃동충하초군)과 디팻 식이군(디펫군)의 혈중 총 콜레스테롤 농도는 고지방식이만 섭취한 군(고지방식이군)에 비하여 현저히 낮으며, 특히 눈꽃동충하초군은 혈중 HDL 콜레스테롤의 농도가 다른 식이군(디펫군 및 고지방식이군)에 비하여 높았다. 결과적으로, 총 콜레스테롤 중 HDL 콜레스테롤의 비율은 27.9 %로 눈꽃동충하초군이 다른 식이군(디펫군 및 고지방식이군)에 비하여 가장 높음을 알 수 있었다.

따라서, HDL 콜레스테롤은 혈관 벽에서 콜레스테롤을 제거하여 간으로 운반함으로써 소화시키기 좋은 형태로 만드는 역할을 하기 때문에 눈꽃동충하초군이 총 콜레스테롤 중 HDL 콜레스테롤의 비율이 높다는 사실을 통하여 눈꽃동충하초 열수 추출물이 심혈관계 질환 예방에 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5

눈꽃동충하초 열수 추출물을 이용한 약학적 조성물의 제조

하기에 본 발명에 따른 눈꽃동충하초의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명의 조성물이 이에 한정되는 것은 아니다.

산제의 제조

약전 제제총칙 중 산제의 제조방법에 따라 1포당 하기의 성분 함량으로 제조한다.

눈꽃동충하초의 열수 추출물(건조분말).............. 300㎎

유당.............................................. 100㎎

탈크.............................................. 10㎎

정제의 제조

약전 제제총칙 중 정제의 제조방법에 따라 1정당 하기의 성분 함량으로 제조한다.

눈꽃동충하초의 열수 추출물(건조분말)............... 300㎎

옥수수전분......................................... 100㎎

유당............................................... 100㎎

스테아린산 마그네슘................................ 2㎎

캅셀제의 제조

약전 제제총칙 중 캅셀제의 제조방법에 따라 1캅셀당 하기의 성분 함량으로 제조한다.

눈꽃동충하초의 열수 추출물(건조분말)................ 300㎎

옥수수전분.......................................... 100㎎

유당................................................ 100㎎

스테아린산 마그네슘................................. 2㎎

액제의 제조

약전 제제총칙 중 액제제의 제조방법에 따라 액제 100㎖당 하기의 성분 함량으로 제조한다.

눈꽃동충하초의 열수 추출물(건조분말).................. 1g

이성화당.............................................. 10g

만니톨................................................ 5g

정제수................................................ 적량

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 눈꽃동충하초 열수 추출물은 지방세포의 증식과 분화를 막고, 혈당 및 총 콜레스테롤 농도를 낮추는 효과가 매우 뛰어나므로 눈꽃동충하초 열수 추출물을 이용한 지질대사에 영향을 미치는 기능성 식품 및 약학 조성물을 제공할 수 있다.

Claims (3)

1. 지방세포 증식억제 활성을 갖는 눈꽃동충하초 열수 추출물.
2. 상기 제1항의 눈꽃동충하초 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만개선용 조성물.
3. 제2항에 있어서,

   상기 추출물은 카뎁신 S(cathepsin S)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 비만개선용 조성물.

Images