KR20080055712A - 단백질 안정화 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 동결건조된 제형 및 조성물 중의 골형성 단백질을 안정화시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 동결건조된 조성물 및 이의 후속적 저장 및 재구성을 위한 부형제로서 트레할로즈를 주로 포함하는 제형을 포함하고, 당해 제형은 완충액 및 계면활성제를 포함하는 기타 부형제를 임의로 포함할 수도 있다.
동결건조 제형, 안정성, 골형성 단백질, 트레할로즈

Description

단백질 안정화 제형{Protein stabilization formulations}
본 발명은 가공, 저장 및 재구성 동안 골형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP) 및 밀접하게 관련된 성장 및 분화 인자(GDF)를 안정화시키기 위한 제형 및 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 rhGDF-5를 전달하는 비히클로서 사용되는 다양한 물질들을 포함하여, 동결건조, 저장 및 재구성 동안 rhGDF-5를 보호하기 위한 트레할로즈 및 기타 부형제로 이루어진 제형에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 다양한 근골격계통 결함 및 질환을 치료하기 위해 이러한 제형을 제조하고 사용하는 방법을 포함한다.
생물학적 분자(생물분자)는 3차원 구조 또는 입체형태를 갖고 있으며 이의 생물학적 활성과 특성이 이러한 구조에 의존한다. 이러한 생물분자의 예로는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 단백질이 포함된다. 이들 생물분자는 생명을 위해 필수적이며 다양한 의학적 질환 및 상태를 치료하는데 있어 치료제 및 표적을 나타낸다. 단백질은 광범위한 생물분자 부류를 나타낸다. 효소, 성장 인자, 수용 체, 항체 및 신호전달 분자와 같은 단백질의 상이한 부류는 이들의 생물학적 활성이 이들의 입체형태적 구조에 의존한다. 다른 단백질 부류는 주로 구조 단백질로서 예를 들면, 콜라겐 및 연골이 있으며 그 자체로는 생물학적 활성을 지니지 않는다.
pH, 온도, 용매, 오스몰농도 등에서의 변화와 같은 다양한 환경에 생물분자가 노출되면 이 생물분자의 입체형태적 상태가 비가적역적으로 변화 또는 변성되어 이 생물분자는 생물학적으로 불활성이 될 수 있다. 이들 생물분자의 불활성화에 관여하는 일부 기작은 응집, 산화, 가수분해 및 탈아미드화를 포함하는 결합 절단의 각종 유형, 가교결합 및 기타 공유결합, 예를 들면, 이황화 결합의 재배열을 포함하는 결합 형성의 각종 유형을 포함한다.
골형성 단백질 및 밀접하게 관련된 성장 및 분화 인자(둘다 단량체 및 이량체 형태)는 TGF-β 단백질 슈퍼패밀리(superfamily)에 속한다. 상기 단백질 부류에는 초기에 이소성(ectopic) 연골내 골 형성을 유도하는 능력으로 동정된 골형성 단백질 패밀리의 구성원을 포함한다[참조: Cheng et al. "Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenic proteins", J. Bone Joint Surg. Am. 85A: 1544-52 (2003)]. 이들 단백질중 몇몇에 대해서는 대체 명칭이 있다[참조: Lories et al., Cytokine Growth Factor Rev 16:287-98 (2005)]. 이러한 패밀리의 모든 구성원은 카복시 말단 활성 도메인을 포함하는 공통된 구조적 특징을 공유하며 성숙한 길이가 약 97개 내지 106개 아미노산이다. 모든 구성원은 3개의 분자내 이황화 결합과 1개의 분자간 이황화 결합을 생성하는 시스테인 잔기의 고도로 보존된 패턴을 공유한다. 활성 형태는 단일 패밀리 구성원의 이황화-결합된 동종이량체이거나 2개의 이황화 구성원의 이종이량체이다[참조: Massague Annu. Rev. Cell Biol. 6:957 (1990); Sampath, et al. J. Biol. Chem. 265:13198 (1990); Ozkaynak et al. EMBO J. 9:2085-93 (1990); Wharton, et al. PNAS 88:9214-18 (1991); Celeste et al. PNAS 87:9843-47 (1990); Lyons et al. PNAS 86:4554-58 (1989), 미국 특허 제5,011,691호 및 미국 특허 제5,266,683호].
많은 당이 용액중의 생물 분자를 안정화시키고 분리된 세포와 생물분자를 보호한다는 것은 널리 확립되어 있다. 이들 화합물은 다양한 종에서 동결보호제(cryoprotectant) 및 삼투조절제(osmoregulator)로서 널리 확립되어 있다[참조: Yancey J. Exper. Biol. 208: 2819-30 (2005)]. 동결건조된 약제학적 단백질의 개발에서, 단백질의 안정성을 향상시키고 저장수명을 연장시키기 위해 흔히 당(사카라이드 및 폴리올)이 제형에 부가된다. 당의 안정화 작용 기작에 대한 2가지 주요 이론이 있다: 1) 당 부형제는 고체 상태의 단백질을 희석시키는 작용하여 단백질-단백질 상호작용을 감소시키고 응집과 같은 분자 분해를 방지한다; 및 2) 당 부형제는 단백질 이동성 및 이에 따른 반응성이 최소화된 유리질 매트릭스를 제공한다. 이들 두 기작 모두에서, 당이 무정형의 단백질-접촉 상으로서 유지되는 것이 중요하다. 증가된 온도 및 습윤성과 같은 다양한 환경적 요인은 당 결정화를 유도할 수 있다. 따라서, 고려중인 특정 생물분자 및 시스템을 적합하게 만드는데 사용되는 조건 및 물질을 최적화시키는 것이 중요하다.
동결건조(냉동건조)는 생물분자를 보존하기 위해 통상적으로 사용되는 방법 이다. 냉동건조는 일반적으로 냉동-해동 또는 온도-유도된 변성에 비해 생물분자의 생물학적 활성에 보다 파괴적인 것으로 일반적으로 사료된다. 손상 정도는 상이한 생물분자 및 상이한 조건에 따라 상당히 달라지며, 다양한 조사자들은 상이한 시스템을 연구하였다. 수용액의 냉동은 용질 농도의 초기 증가를 초래하는데, 이는 냉동 자체에 비해 불안정한 화합물에 보다 많은 손해를 줄 수 있다. 당, 단백질, 중합체, 완충액 및 계면활성제와 같은 부형제가 부가되어 생물 분자의 활성을 안정화시킬 수 있지만, 시스템에 따라서 성공에 제약을 받거나 성공 정도가 달라진다. 크로우(Crowe) 등은 당에 의한 건조 인지질 이중층 및 단백질의 안정화를 기술하며[참조: Biochem. J. 242: 1-10 (1987)], 또한 문헌[참조: "The trehalose myth revisited: Introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state" Cryobiology 43, 89-105 (2001)]에서 세포의 트레할로즈 안정화의 기작에 관한 최근의 이해를 검토하고 있다. 최근에는 실용적이고 유용한 동결건조된 단백질을 유지시키기 위해 2가지의 개별적인 상이한 요건이 있다고 사료되고 있다: 1) 단백질은 냉동 공정 동안에 보호되어야 한다; 및 2) 단백질은 후속적 건조 및 재구성 동안에 보호되어야 한다. 이것들은 반드시 어느 한가지 부형제 또는 조건들의 집합에 의해 충족되지는 않는 상이한 요건들이다.
다양한 조사자들은 다양한 생물분자를 보호하기 위한 다양한 부형제의 사용에 관해 보고한 바 있으며, 예를 들면, 글로거(Gloger) 등[참조: Intl. J. Pharm. 260: 59-68 (2003)]은 단백질을 안정화시키 위해 저분자량 덱스트란을 사용한 아비스쿠민의 동결보호(lyoprotection)를 기재하였으며, 완충액 시스템 및 폴리소르베 이트 80 단독이 냉동 동안에 단백질을 보호하는데 적합하지만, 건조 동안에는 단백질을 보호하기 위해 덱스트란이 필요함을 제시하였고[참조: Goodnough, et al. (Appl. Env. Biol. 58(10: 3426-28 (1992)], 안정화제로서 혈청 알부민 및 다양한 기타 부형제를 사용하는 동결건조 동안의 보툴리늄 독소 A형의 안정화를 조사하였고, 부형제중 어떠한 것도 어떠한 유익한 효과도 없었지만 동결건조 혼합물로부터 NaCl을 제거하고 pH를 조절함으로써 활성 독소의 회수율이 급격하게 향상되었음을 보고하였다; 코스탄티노(Costantino) 등[참조; J. Pharm. Sci. 87(11): 1412-20 (1998)]은 동결건조된 재조합 사람 성장 호르몬의 안정성 및 구조에 대한 다양한 사카라이드의 효과를 기술하였고, 시험된 모든 부형제가 단백질의 안정성을 현저하게 향상시켰음을 제시하였다; 라모스(Ramos) 등[참조: Appl. Envir. Microbiol. 63(10): 4020-25 (1997)]은 2-O-β-만노실글리세레이트가 다양한 공급원으로부터 분리된 몇몇 데하이드로게나제 효소를 다양한 열적 스트레스로부터 보호하는데 효과적이고, 2-O-β-만노실글리세레이트에 의해 부여된 보호가 연구된 모든 효소에 대해 트레할로즈와 유사하거나 이보다 뛰어났지만 피. 푸리오시스(P. furiosis)로부터 분리된 글루타메이트 데하이드로게나제를 보호하는데 있어 효과적이지 않았음을 제시하였다; 브루스(Brus) 등[참조: J. Control. Rel. 95:119-31 (2004)]은 올리고뉴클레오타이드-폴리에틸렌이민(PEI) 복합체의 냉동건조에 의한 안정화를 조사하였고, 이들 복합체는 슈크로즈 또는 트레할로즈와 같은 당의 부가로 이익을 얻지 않았지만, 플라스미드-PEI 복합체는 이러한 당의 부가로 이익을 얻었음을 보고하였다. 이들 조사자들중 어느 누구도 BMP의 보호에 대해 보고하지 않았다.
따라서, 무엇이 생물분자의 동결보호를 제공하기 위한 최적의 부형제 조합인지에 관해 서로 상반되는 증거가 있다. 모든 생물분자에 대해 최적인 어떠한 한가지 부형제 조합도 없으며, 오히려 조사중인 생물분자에 대해 목적하는 결과를 수득하기 위해 상당한 정도의 실험이 요구된다. 동결건조, 저장 및 사용 동안에 BMP를 보호하는 부형제들의 약제학적으로 허용되는 조합이 여전히 요구된다.
본 발명은 일반적으로 다양한 제형 및 조성물 중의 BMP를 안정화시켜 생물학적 활성의 60% 이상을 보존시키고 저장 조건 요건, 예를 들면, 온도 및 습도를 향상시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 BMP를 함유하는 동결건조된 조성물 및 이의 후속적 저장 및 재구성을 위한 부형제로서 트레할로즈를 주로 포함하고 완충액 및 계면활성제를 포함하는 기타 부형제를 추가로 포함하는 제형을 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도 트레할로즈가 동결건조 동안 및 동결건조 후에 BMP의 생물학적 활성을 보존하는데 있어 충분하고 기타 부형제보다 우수함을 발견하였다. 많은 다른 생물분자의 안정화에서, 공급되는 보호의 양과 관련해 당마다 약간의 차이가 있지만, BMP의 경우에는 많은 차이가 있다. 이러한 발견은 추가적 부형제에 대한 유해 반응을 일으킬 가능성이 없는, 환자의 다양한 근골격계 결함을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 아스코르브산 및 글루타티온과 같은 항산화제의 부가가 트레할로즈와 함께 동결건조된 BMP의 안정성을 증가시키지 않고, 오히려 트레할로즈에 의해 부여된 안정성을 저하시킴을 발견하였다.
본 발명의 목적은 동결건조된 BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 이용하여, BMP가 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하고 상기 재수화된 생성물이 외과의에 의해 용이하게 취급될 수 있도록 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동결건조된 BMP, 하나 이상의 BMP, 및 완충액, 계면 활성제 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가적 부형제를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 이용하여, BMP가 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하고 상기 재수화된 생성물이 외과의에 의해 취급될 수 있도록 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동결건조된 BMP, 하나 이상의 BMP 및 압착된(morselized) 콜라겐 섬유를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 이용하여, 재수화된 생성물이 외과의에 의해 용이하게 취급될 수 있도록 하는, 안정하고 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하는 BMP를 함유하는 동결건조된 생체적합성 유동성 물질을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동결건조된 BMP, 하나 이상의 BMP 및 생체적합성 매트릭스를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 이용하여, 재수화된 생성물이 외과의에 의해 용이하게 취급될 수 있도록 하는, 안정하고 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하는 BMP를 함유하는 동결건조된 생체적합성 매트릭스를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 생체적합성 매트릭스의 예로는 콜라겐, 광물화된 콜라겐, 인산칼슘 염, 칼슘 함유 세라믹, 자가, 동종 및 이종 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터의 골, 및 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), PLA-PGA 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리카프롤락톤 및 이들의 혼합물을 포함하는 중합체가 포함된다.
본 발명의 또 다른 목적은 동결건조된 BMP, 하나 이상의 BMP, 생체적합성 매트릭스, 및 완충제, 계면활성제 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가적 부형제를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 이용하여, 재수화된 가단성(malleable) 생성물이 외과의에 의해 용이하게 취급될 수 있도록 하는, 안정하고 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하는 BMP를 함유하는 동결건조된 생체적합성 매트릭스를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동결건조된 BMP를 안정화시키기에 충분한 양의, 트레할로즈, 저분자량 덱스트란, 사이클로덱스트린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 및 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 동결보호제 및 하나 이상의 BMP를 이용하여, BMP가 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하고 재수화된 생성물이 외과의에 의해 용이하게 취급될 수 있도록 하는, 동결건조된 BMP를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트레할로즈, 저분자량 덱스트란, 사이클로덱스트린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 및 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 동결보호제, 하나 이상의 BMP 및 콜라겐을 이용하여, 재수화된 가단성 생성물이 외과의에 의해 용이하게 취급될 수 있도록 하는, 안정하고 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하는 BMP를 함유하는 동결건조된 생체적합성 콜라겐 매트릭스를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트레할로즈, 저분자량 덱스트란, 사이클로덱스트린, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹부터 선택된 하나 이상의 동결보호제, 하나 이상의 BMP 및 압착된 콜라겐 섬유를 사용하여, 재수화된 생성물이 외과의에 의해 용이하게 취급될 수 있도록 하는, 안정하고 재수화시 생물학적 활성의 60% 이상을 보유하는 BMP를 함유하는 동결건조된 생체적합성 유동성 물질을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하나 이상의 동결보호제와 하나 이상의 BMP의 동결건조된 혼합물을 사용하여 환자를 치료하는 것이다. 이러한 조성물은 재구성된 BMP 용액을 환자의 신체의 부위, 예를 들면, 골절, 골 사이, 골 공간, 추간 원판, 연골 결손, 건, 인대 등에 직접 적용하거나, 재구성된 BMP 용액을 환자에게 이식될 장치, 예를 들면, 인공 관골, 무릎, 어깨, 추간 원판 등과 같은 골-접촉 인공 이식물, 건 고정물(tendon anchor), 인대 고정물, 봉합사, 스테이플 등, 골 대체 케이지(bone replacment cage), 자가 골절편(bone chip), 동종 골절편, 이종 골절편, 탈회된 골절편 등에 적용함으로써, 치유 과정을 증진시키기 위해 다양한 근골격계 결함의 치료에서 유용하다.
수용액 중의 또는 건조 고체로서의 BMP의 벌크 형태는 안정하지 않으며 단백질의 생물학적 활성을 보존하기 위해 -20℃ 이하의 냉장을 필요로 한다. BMP는 응집, 이황화 결합의 재배열 및 산화에 민감하기 때문에, 동결건조된 BMP의 생물학적 활성을 보존 및 보호하기 위한 제형이 요구된다.
안정성 및 저장성이 향상된 동결건조된 BMP 생성물이 요구된다.
추간 원판, 비-관절 및 관절 연골과 같은 연조직 내로 주사되하여 이러한 조직의 재생을 촉진하는데 사용될 수 있는, 수용액으로 재구성하기 위한 동결건조된 BMP 생성물이 요구된다.
의사가 사용하기에 적절한 농도의 BMP를 함유하여 오염, 부적절한 투여, 및 낭비 및 목적하지 않는 수술 부위로의 도입을 포함하는 취급과 관련된 많은 위험을 최소화하거나 제거하는, 이식가능한 생체적합성 스캐폴드(scaffold)상에 제공되는 동결건조된 BMP 생성물이 요구된다.
수술 부위에 용이하게 적용될 수 있는 생체적합성 유동성 물질 중에서 재구성될 수 있는 동결건조된 BMP 생성물이 요구된다.
BMP의 발견 이래로, 다양한 근골격계 결함 및 상태의 치료시 치료학적으로 이용하기에 적합한 조성물을 찾아내고자 하는 상당한 조사 활동이 있어왔다. 현재는 액체 형태로 재구성되어 사용시에 의사에 의해 이식될 스캐폴드(scaffold)로 또는 수술 치료 부위로 적용되어야만 하는, 동결건조된 고체로서 시판되는 BMP를 함유하는 제품이 있다. 현재의 rhBMP-2의 제형은 부형제로서 슈크로즈 NF, 글리신USP, L-글루탐산 FCC, 염화나트륨 USP 및 폴리소르베이트 80 NF를 사용하며 실온(15-25℃)에서 저장될 수 있다. 현재의 OP-1의 제형은 소 콜라겐만을 사용하고 2 내지 8℃에서 저장되어야 한다. 재구성된 BMP의 안정성에 대한 부형제의 효과를 기술하는 공개된 보고서는 없다.
다른이들은 동결건조 동안의 BMP의 안정성을, 만니톨, 슈크로즈 및 이들의 혼합물을 이용하고, BMP를 PLGA와 같은 중합체 매트릭스내에 매식하고, 메티오닌과 같은 항산화제를 부가하고, 히스티딘, 아르기닌, 사이클로덱스트린 및 소 혈청 알부민과 같은 기타 부형제를 부가하고, TWEEN 80와 같은 계면활성제를 부가하거나, 이러한 것들을 병용함으로써 증진시키고자 시도하였다.
미국 특허 제5,318,898호 및 제5,516,654호는 배양 배지 중의 덱스트란 설페이트를 이용하는 BMP의 향상된 제조방법을 기술하고 있지만, 이러한 이득이 성취되도록 하는 기작을 논의하거나 단백질을 안정화시키는데 유용한 임의의 다른 부형제를 개시하고 있지 않다. 미국 특허 제5,385,887호에서, 임(Yim) 등은 BMP, 당, 글리신 및 글루탐산으로 이루어진, BMP의 전달을 위한 동결건조된 조성물 및 제형을 기술하고 있다. 임 등은 W-20 알칼리성 포스파타제 검정으로 입증된 바와 같이 동결건조된 제형이 생물학적 활성을 보유한다고 개시하고 있지만, 이들은 임의의 한 제형이 다른 제형보다 우수한 임의의 정량적 이점을 보여주는 제형에 관한 비교 데이타를 개시하고 있지 않다. 이들 발명자들은 BMP의 동결보호에 있어 슈크로즈에 대한 트레할로즈의 우수성에 대해 논의하거나 인지하고 있지 않다.
본 발명은 동결건조, 저장 및 수용액에 의한 재구성에 유용한 BMP의 안정한 제형을 제조 및 사용하여 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 하기에서 예시적 양태로서 기술되며 BMP의 예로서 rhGDF-5를 사용한다. 당업자라면 본 발명이 다수의 상이한 적용 및 양태로서 수행될 수 있고 이의 적용이 본원에 설명된 특정 양태로 특정적으로 제한되지 않음을 이해할 것이다. 하기 예는 다양한 양태중 일부 및 본 발명의 이점을 설명하기 위함이지만, 당업자는 본 발명의 범주 및 목적에서 벗어남이 없이 기타 유사한 양태가 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명은 하나의 측면으로서, 골 및 연골 결손의 외과 치료에서의 후속적 사용을 위한 안정한 동결건조된 BMP를 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에서 의도되는 바와 같이, 이러한 조성물은 하나 이상의 BMP와 BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 포함한다. 이러한 조성물은 재구성된 단백질 용액을 환자의 신체의 부위, 예를 들면, 골절, 골 사이, 골 공간, 추간 원판, 융합 동안에 외과술에 의해 생성된 추간 원판 공간, 연골 결함, 건, 인대 등에 직접 적용하거나, 인공 관골, 인공 무릎, 인공 어깨, 인공 추간 원판, 건 고정물(tendon anchor), 인대 고정물, 봉합사, 스테이플, 골 케이지(bone cage), 자가 골절편(bone chip), 동종 골절편, 이종 골절편, 탈회된 골절편 등과 같은 골 또는 연골과 접촉되어 환자에게 이식되는 물질에 적용함으로써 다양한 근골격계 결함을 치료하는데 유용하다.
본원에서 사용되는 "형태형성인자(morphogen)", "골 형태형성인자", "골형성 단백질(bone morphogenic protein, bone morphogenetic protein), "BMP", "골발생 단백질", 골발생 인자", "성장 및 분화 인자" 및 "GDF"란 용어들은 rhGDF-5로 대표되는 단백질 부류를 포괄한다. 그러나, 당업자는 rhGDF-5가 단지 BMP로서 작용할 수 있는 진정한 조직 형태형성인자 TGF-β패밀리 하위부류를 대표하는 것이고 본 명세서를 제한하기 위함이 아님을 인지할 것이다. "냉동보호제"는 냉동 동안에 생물분자를 안정화시킬 수 있는 분자를 지칭하기 위해 사용되며, 본원의 범주에서 냉동-건조(동결건조) 동안에 생물분자를 안정화시킬 수 있는 분자를 지칭하는 "동결보호제"란 용어와 등가이다. 본원에서 사용되는 "압착된"이란 용어는 압착(morselization)에 의해 수득된 생성물 및 절단, 초핑(chopping), 분할, 분쇄, 미분쇄하거나 또는 그밖의 생체적합성 매트릭스, 예를 들면, 콜라겐의 양의 크기를 감소시켜 개개의 입자 또는 섬유의 전체 크기가 감소되도록 하는 공정을 지칭한다. 본원에서 사용된 "부형제"란 용어는 하나 이상의 BMP에 부가되는, 아미노산, 단백질, 완충제, 계면활성제 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가적 화합물을 지칭한다.
rhGDF-5가 pH 4.5 내지 pH 10.5의 중성 pH 범위에서 난용성이라는 것은 공지되어 있다. 이러한 pH 범위에서 rhGDF-5 생성물을 제형화하고 제조하는 것은 곤란할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 단백질 제형의 개발을 위해 적합한 pH 범위를 선택하는데 있어 중요한, pH 3 및 pH 4 완충액 중의 rhGDF-5의 용해도를 평가하기 위한 연구를 고안하였다. 본 연구 결과는 실시예 11에 기술되어 있다. rhGDF-5의 용해도는 완충액의 pH에 의존할 뿐만 아니라, 완충용액의 이온 강도에도 의존한다. pH 4에서, 약 10 mg/mL의 rhGDF-5 용액은 5 및 10 mM 인산나트륨 완충액 중에서 혼탁한 한편, 50 및 100mM 인산나트륨 완충액 중에서 rhGDF-5는 거대 입자를 형성하여 결국에는 침전하였다. 다른 연구(데이타는 제시하지 않음)에서, rhGDF-5를 pH 3.5 및 pH 4의 5 mM 포스페이트 완충액에서 3.5 mg/mL로 제형화한 경우에도 당해 용액은 혼탁하였다.
일반적으로 단백질 물질의 용해도는 과 포화된/침전된 용액을 원심분리 또는 침전한 후에 단백질 농도를 측정함으로써 측정된다. 그러나, 일부 혼탁한 단백질 용액은 원심분리하거나 여과하기가 곤란하다. 불용성 입자를 제거하기 위해 혼탁한 용액을 원심분리 또는 여과(0.22㎛)한 후라도, 입자가 매우 미세하기 때문에 여 과물이 여전히 혼탁해 보이고 때때로 단백질이 필터 표면에 점착되어 여과물은 다수의 단백질을 손실하므로 매우 빈번하게 성공적이지 못하다. 따라서, rhGDF-5를 pH 3.5 또는 pH 4 완충액 중에서 3.5 mg/mL 또는 10 mg/mL로 제형화하는 경우에 청정한 용액을 수득하기가 곤란할 수 있다.
rhGDF-5를 pH 3.0의 5mM, 10mM 및 25 mM 인산나트륨 용액 중에서 10mg/ml로 제형화한 경우, 단백질 용액은 청정하였다; 그러나, 50mM 및 100 mM 인산나트륨과 같은 보다 높은 이온 강도 용액 중에서 10mg/ml의 rhGDF-5에서, rhGDF-5 용액은 혼탁하였다. 따라서, 바람직한 양태에서 rhGDF-5는 약 pH 3.0의 낮은 이온 강도 완충액 중에서 제형화하여야 한다.
본 발명에 따른 한 양태에서, 조성물은 트레할로즈 대 BMP의 건식 중량 비율이 생체적합성 매트릭스 함유 생성물의 경우에 1mg BMP당 약 1 mg 내지 약 500 mg 트레할로즈의 범위, 보다 바람직하게는 1mg BMP당 약 5 mg 내지 약 200 mg 트레할로즈의 범위가 되도록 하여 하나 이상의 BMP의 수성 혼합물을 BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈와 함께 동결건조시켜 제조할 수 있다. 트레할로즈의 부가는 동결건조된 제형 중의 단백질의 향상된 용해도 및 안정성을 제공한다. 동결건조는 당업계에 일반적으로 공지된 관행에 따라서 수행한다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 BMP, BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈 및 완충제의 혼합물을 동결건조시켜 제조할 수 있다. 완충제의 부가는 동결건조된 제형 중의 단백질의 향상된 용해성 및 안정성을 제공한다. 당업계에 공지된 생체적합성 완충제로는 글리신; 아세테이트의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염; 시트레이트의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염; 락테이트의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염; 모노-염기성 포스페이트, 디-염기성 포스페이트, 트리-염기성 포스페이트 및 이들의 혼합물을 포함하는 포스페이트의 나트륨 또는 칼륨 염이 포함된다. 완충제는 조성물에 부가되어 벌킹제(bulking agent)로서 작용하는 글리신을 추가로 가질 수 있다. 글리신은 1 mg BMP당 약 0.04 mg 내지 약 200 mg 글리신, 보다 바람직하게는 0.04mg BMP당 약 1 mg 내지 약 80 mg 글리신의 비율로 부가될 수 있다. 완충제 및 벌킹제의 부가는 단독의 트레할로즈를 갖는 조성물보다 다소 우수한 단백질의 안정성을 제공하며, 여기서 pH는 약 2.0 내지 약 5.0 pH 단위, 보다 바람직하게는 약 2.5 내지 약 4.5 pH 단위 내에서 조절한다.
대안적 양태에서, 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 하나 이상의 BMP, BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈, 완충제, 및 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 계면활성제의 수성 혼합물을 동결건조시켜 제조할 수 있다. 계면활성제는 BMP 1mg당 약 0.001 mg 내지 약 0.2 mg의 농도로 부가할 수 있다. 계면활성제의 부가는 용해도 및 동결건조 특성을 변경시킴으로써 추가적 안정화를 단백질에 제공한다. 동결건조는 당업계에 일반적으로 공지된 관행에 따라서 수행한다.
본 발명의 다른 양태에서, 안정한 동결건조된 BMP를 제조하기 위한 조성물 및 방법은 하나 이상의 BMP, 하나 이상의 BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 동결보호제 트레할로즈, 및 완충액 및 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가적 부형제로 이루어진다. 이러한 완충액 및 계면활성제의 부가는 단독의 부형제로서 트레할로즈를 갖는 조성물에 비해 증가된, 동결건조된 BMP의 안정성의 향상을 제공한다.
대안적 양태에서, 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 BMP/콜라겐 혼합물을 동결건조시키기 전에 하나 이상의 BMP 및 하나 이상의 부형제의 용액을 동결건조된 콜라겐 상으로 침착시켜 제조할 수 있다. 콜라겐은 임의로 가교결합 또는 광물화된 콜라겐일 수 있거나, Healos®로서 공지된 물질에 의해 제공되고 미국 특허 제5,972,385호; 제5,866,165호; 제5,776,193호; 제5,455,231호; 및 제5,231,169호에 기재된 바와 같은 가교결합되고 광물화된 콜라겐일 수 있다. 이러한 양태에서 제공된 조성물은 정형외과 분야의 의학적 상태를 치료하는데 특히 유용하며 의사가 골, 연골 또는 건을 생성시키기 위해 수술 부위에 용이하게 위치시킬 수 있는 가요성의 가단성 물질을 제공한다. BMP/콜라겐 혼합물은 멸균수, 식염 용액 및 골수 흡인물을 포함하는 수용액으로 재구성하여 골절, 골 사이, 골 공간, 척추 융합 동안에 외과술에 의해 생성된 추간 원판 공간과 같은 환자의 결함 부위에 직접 적용할 수 있다. 추가로, BMP/콜라겐 혼합물은 척추 융합 수술 동안에 추간 원판 공간 내에 놓여진 이식물과 골절편 사이의 공간, 파열되거나 손상된 건, 파열되거나 손상된 인대, 관절 연골내 연골 결손 및 관절 연골내 연골하 결손과 같은 연골이 손상되거나 손실된 영역을 충전하기 위해 사용될 수 있다.
대안적 양태에서, 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 하나 이상의 BMP 및 하나 이상의 부형제의 동결건조된 혼합물을 제조하고, 동결건조된 BMP 혼합물을 물, 식염 용액 또는 골수 흡인물로 재구성하고, BMP/콜라겐 혼합물을 수술에 의해 이식 하기 전에, 재구성된 BMP 용액을 동결건조된 콜라겐 상에 위치시킴으로써 사용할 수 있다. 콜라겐은 임의로 가교결합 또는 광물화된 콜라겐일 수 있거나, Healos®로서 공지된 물질에 의해 제공되고 미국 특허 제5,972,385호; 제5,866,165호; 제5,776,193호; 제5,455,231호; 및 제5,231,169호에 기재된 바와 같은 가교결합되고 광물화된 콜라겐일 수 있다. 이러한 양태에서 제공된 조성물은 정형외과 분야의 의학적 상태를 치료하는데 특히 유용하며 의사가 골, 연골 또는 건을 생성시키기 위해 수술 부위에 용이하게 위치시킬 수 있는 가요성의 가단성 물질을 제공한다. BMP/콜라겐 혼합물은 멸균수, 식염 용액 및 골수 흡인물을 포함하는 수용액으로 재구성하여 골절, 골 사이, 골 공간, 척추 융합 동안에 외과술에 의해 생성된 추간 원판 공간과 같은 환자의 결함 부위에 직접 적용할 수 있다. BMP/콜라겐 혼합물은 척추 융합 수술 동안에 추간 원판 공간 내에 놓여진 이식물과 골절편 사이의 공간, 파열되거나 손상된 건, 파열되거나 손상된 인대, 관절 연골내 연골 결손 및 관절 연골내 연골하 결손과 같은 연골이 손상되거나 손실된 영역을 충전하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 양태에 제공된 조성물 및 방법은 또한 콜라겐 물질과 분리된 성분 및 용기로서 BMP를 가짐으로써 저장 및 제조의 용이성에 특히 유용하다.
대안적 양태에서, 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 BMP/압착된 콜라겐 혼합물을 동결건조시키기 전에 하나 이상의 BMP 및 하나 이상의 부형제의 용액을 동결건조된 압착된 콜라겐 상으로 침착시켜 제조할 수 있다. 압착된 콜라겐은 가교결합 또는 광물화될 수 있거나, 가교결합되고 광물화될 수 있다. 이러한 압착은 직경이 약 25㎛이고 길이가 약 110㎛인 소형 콜라겐 섬유를 제공하며, 이는 수술 부 위로 주사하기에 적합한 유동성 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 재구성은 멸균수, 식염수 또는 골수 흡인물과 같은 수용액과 콜라겐 겔의 혼합물로 수행할 수 있으며, 여기서 콜라겐 겔은 재구성된 생성물을 점도를 조절한다. 콜라겐 겔은 약 0.1 % 내지 약 30 % w/w 콜라겐, 보다 바람직하게는 약 0.3 % 내지 약 3.0 % w/w 콜라겐을 함유하며, 콜라겐 겔의 점도는 약 10 cP 내지 약 400 cP, 보다 바람직하게는 약 70 cP 내지 약 100 cP이다. 콜라겐 겔의 pH는 바람직하게는 약 4.0 pH 단위 내지 약 8.0 pH 단위이다. 이러한 조성물은 골절, 골 사이, 골 공간, 척추 융합 동안에 외과술에 의해 생성된 추간 원판 공간을 포함하난 이에 제한되지 않는 다양한 근골격계 상태의 치료하고, 척추 융합 수술 동안에 추간 원판 공간 내에 놓여진 이식물과 골절편 사이의 공간, 파열되거나 손상된 건, 파열되거나 손상된 인대, 관절 연골내 연골 결손 및 관절 연골내 연골하 결손과 같은 연골이 손상되거나 손실된 영역을 충전하는데 유용하다.
대안적 양태에서, 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 하나 이상의 BMP 및 하나 이상의 부형제의 동결건조된 혼합물을 제조하고, 동결건조된 BMP 혼합물을 물 또는 식염 용액으로 재구성하고, 재구성된 BMP 용액을 추간 원판 내로 주사함으로써 사용할 수 있다. 이러한 양태에 제공된 조성물 및 방법은 추간 원판을 치료하는데 특히 유용하다.
본 발명에 의해, 가공, 저장 및 재구성 동안 골형성 단백질을 안정화시키기 위한 제형 및 방법이 제공된다.
하기 실시예에서 사용된 실험적 방법은 다음과 같았다:
RP-HPLC 순도 연구를 위해, 재구성된 rhGDF-5 시험 샘플을 10 mM HCl을 사용하여 0.1 mg/ml의 농도로 희석시키고, 50℃에서 0.3ml/분의 유속으로 Vydac 218TP52 컬럼상의 역상-HPLC에 적용하였다. rhGDF-5는 214nm에서 UV 검출을 사용하여 0.15% 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴의 구배를 사용하여 용출시킨다.
원편광이색성(CD) 연구를 위해, 원편광이색성 분광분석을 AVIV 모델 60DS 원편광이색성 분광편광계에서 수행하였다. 상응하는 부형제 스캔과 함께 기준선 플라시보 수행값을 샘플 스캔으로부터 공제하였다. 스캔을 평균 잔류량(115의 값)을 사용하여 정규화시키고 다음 식에 대입하였다:
[θ] = [0.1 x M잔류] / [농도 (mg/ml) x 광 경로]
[θ] 의 값을 각 파장에서 계산하여 평균 잔류 타원율을 수득하였다. 마지막으로, 프로그램 PROSEC v.2.1 (1987년에 AVIV Associates에 의해 판권이 취득됨)을 사용하여 2차 구조의 추정치를 측정하였다. .
시차주사열량측정(DSC)을 MicroCal VP-DSC 장치에서 수행하였다. 스캔속도는 60℃/h였다. 온도 범위는 5 내지 100℃였다. 장치 기준선 스캔(플라시보 데이타)을 시험 샘플 열 스캔으로부터 공제하였다. 단백질 농도는 0.33mg/ml였다.
평광 현미경(PLM)을 결정화도 평가를 위해 사용하였다. 상대 습도가 1%인 건조 공기 백(bag) 내의 바이알에서 미량의 고체 샘플을 취하였다. 상기 고체 샘플을 유리 슬라이드에 도말하고 한 방울의 실리카 오일을 고체 샘플에 적가하였다. 이어서, 슬라이드를 Sony CCD-IRIS/RGB 컬러 비디오 카메라와 편광 부속품이 장착된 Zeiss 광학 현미경으로 조사하였다. Flash Bus FBG 소프트웨어를 사용하여 영상을 포착하였다. 벌크 rhGDF-5를 바이오팜(Biopharm)으로부터 10mM HCl 중의 3.8 mg/ml의 농도로 -80℃에서 냉동된 형태로 수령하였다. 냉동된 벌크 단백질을 제형에서 사용하기 전에 2 내지 8℃에서 밤새 해동시켰다.
실시예 1: rhGDF-5(0.5 mg/ml, 5 ml/스트립)와 트레할로즈 50 mg/ml를 함유한 Healos® 스트립(비-멸균). 각 스트립은 2.5mg의 rhGDF-5와 250mg의 트레할로즈를 함유하였다.
트레할로즈 용액의 제조:
트레할로즈 2수화물 25.48g을 조심스럽게 칭량하고 멸균 폴리프로필렌 병으로 옮기고, 여기에 정제수 350ml을 실온에서 부가하고 청정한 용액이 수득될 때까지 천천히 교반하였다. 상기 청정한 용액에 0.1N HCl을 적가하여 pH를 3.9로 조정한 다음, 용적을 정제수로 조정하여 400ml 최종 용적을 수득하였다. pH를 측정한 결과 4.2인 것으로 확인되었다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈 용액으로의 희석
rhGDF-5 용액 22.39ml을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 트레할로즈 용액을 조심스럽게 부가하여 용적을 150ml로 조정하였다; pH를 측정한 결과 2.5인 것으로 확인되었다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. UV 흡광계수를 수득하여 단백질 농도를 정확하게 계산하였다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈 용액을 부가하여 170 ml 용액중 0.5 mg/ml의 목적 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 2.7인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.499 mg/ml 단백질 함량을 나타냈다.
rhGDF-5/트레할로즈 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 Healos® 스트립 내로 분배하였다. 멸균 피펫을 사용하여, 2.5 ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액을 각 스트립당 총 5 ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액에 대해 2개의 스팟(spot)에 동등하게 스트립상으로 분배하였다. 스트립을 소형 2cm×5 cm PETG 트레이에 삽입하고, 상기 소형 트레이트를 대형 PETG 트레이에 삽입하고 동결건조시켰다. 각각의 대형 트레이는 24개의 스트립을 포함한다.
Figure 112007089847388-PAT00001
Figure 112007089847388-PAT00002
실시예 2: rhGDF-5(0.5 mg/ml, 5 ml/스트립)와 만니톨 50 mg/ml를 함유한 Healos® 스트립 (비-멸균). 각각의 스트립은 2.5mg의 rhGDF-5 및 250mg의 만니톨을 함유하였다.
만니톨 용액의 제조:
만니톨 23.03g을 조심스럽게 칭량하고 멸균 폴리프로필렌 병으로 옮기고, 여기에 정제수 350ml을 실온에서 부가하고, 청정한 용액이 수득될 때까지 천천히 교반하였다. pH를 측정한 결과 7.2인 것으로 확인되었다; 0.1N HCl를 적가하여 pH를 3.8로 조정하였다; 그 다음, 용적을 정제수로 조정하여 400ml 최종 용적을 수득하였다. pH를 측정한 결과 3.9인 것으로 확인되었다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 만니톨 용액으로의 희석:
22.37 ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 만니톨 용액을 조심스럽게 부가하여 용적을 150ml로 조정하였다. pH를 측정한 결과 2.7인 것으로 확인되었다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. UV 흡광계수를 수득하여 정확한 단백질 농도를 계산하였다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 만니톨 용액을 부가하여 용액 170ml 중의 0.5 mg/ml의 목적 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 2.8인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.493 mg/ml 단백질 함량을 나타냈다.
rhGDF-5/만니톨 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 Healos® 스트립 내로 분배하였다. 멸균 피펫을 사용하여, rhGDF-5/만니톨 용액 2.5ml를 각 스트립당 총 5 ml의 rhGDF-5/만니톨 용액에 대해 2개의 스팟(spot)에 동등하게 스트립상으로 분배하였다. 스트립을 소형 2cm×5 cm PETG 트레이에 삽입하고, 상기 소형 트레이트를 대형 PETG 트레이에 삽입하고 동결건조시켰다. 각각의 대형 트레이는 24개의 스트립을 포함한다.
Figure 112007089847388-PAT00003
Figure 112007089847388-PAT00004
실시예 3: rhGDF-5(0.5 mg/ml, 5 ml/스트립)와 트레할로즈 100 mg/ml를 함유하는 Healos® 스트립(멸균). 각각의 스트립은 2.5mg의 rhGDF-5 and 500mg의 트레할로즈를 함유하였다.
트레할로즈 용액의 제조:
25.49g의 트레할로즈 2수화물 조심스럽게 칭량하고 멸균 폴리프로필렌 병으로 옮기고, 여기에 190ml의 정제수를 실온에서 부가하고, 청정한 용액이 수득될 때까지 천천히 교반하였다. 청정한 트레할로즈 용액의 pH를 측정한 결과, 6.2인 것으로 확인되었다. pH를 조정하기 위해 트레할로즈 용액에 HCl를 부가하지 않았다. 용적을 정제수로 조정하여 200ml의 최종 용적을 수득하였다. pH를 측정한 결과 6.3인 것으로 확인되었다. 용액을 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈 용액으로의 희석:
23.03ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 트레할로즈 용액을 조심스럽게 부가하여 용적을 170ml로 조정하였다. pH를 측정한 결과, 3.0인 것으로 확인되었다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. UV 흡광계수를 수득하여 단백질 농도를 정확하게 계산하였다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈 용액을 부가하여 175ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과, 3.0인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.518 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다.
rhGDF-5/트레할로즈 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 멸균 Healos® 스트립상으로 분배하였다. 멸균 피펫을 사용하여, 2.5ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액을 각 스트립당 총 5 ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액에 대해 2개의 스팟에 동등하게 스트립상으로 분배하였다. 스트립을 스틸 트레이에 위치시키고, 이를 멸균 이중 파우치에 조심스럽게 패킹시키고 동결건조를 위해 멸균 조건하에 옮겼다.
Figure 112007089847388-PAT00005
실시예 4: 저 용량 rhGDF-5 (5 ml/스트립, 0.5 mg/ml), 트레할로즈 40 mg/ml 및 글리신 10 mg/ml을 함유한 Healos® 스트립(멸균). 각각의 스트립은 2.5mg의 rhGDF-5, 200mg의 트레할로즈 및 50mg의 글리신을 함유하였다.
트레할로즈/글리신 용액의 제조:
17.84g의 트레할로즈 2수화물 및 4.03g의 글리신을 조심스럽게 칭량하고 멸균 폴리프로필렌 병으로 옮기고, 여기에 300ml의 정제수를 실온에서 부가하고 청정한 용액이 수득될 때까지 천천히 교반하였다. pH를 측정한 결과, 5.5인 것으로 확인되었다. 어떠한 산도 부가하지 않고 용적을 정제수를 사용하여 350ml로 조정하였다. pH를 측정한 결과, 5.5인 것으로 확인되었다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈/글리신 용액으로의 희석:
39.47ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 트레할로즈/글리신 용액을 조심스럽게 부가하여 용적을 295ml로 조정하였다. pH를 측정한 결과 4.1인 것으로 확인되었다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. UV 흡광계수를 수득하여 단백질 농도를 정확하게 계산하였다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈 용액을 부가하여 300ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 4.1인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.507 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다.
용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고, 용액을 즉시 사용하여 멸균 Healos® 스트립상으로 분배하였다. 멸균 피펫을 사용하여, 2.5ml의 rhGDF-5 용액을 각 스트립당 총 5 ml의 rhGDF-5/트레할로즈/글리신 용액에 대해 2개의 스팟에 동등하게 스트립상으로 분배하였다. 스트립을 스틸 트레이에 위치시키고, 이를 멸균 이중 파우치에 조심스럽게 패킹시키고 동결건조를 위해 멸균 조건하에 옮겼다.
Figure 112007089847388-PAT00006
Figure 112007089847388-PAT00007
실시예 5: rhGDF-5 (0.5 mg/ml, 2.5 mg/스트립), 트레할로즈 40 mg/ml, 글리신 10 mg/ml 및 폴리소르베이트 0.1 mg/ml를 함유한 Healos® 스트립 (멸균). 각각의 스트립은 2.5mg의 rhGDF-5, 200mg의 트레할로즈, 50mg의 글리신 및 0.5mg의 폴리소르베이트 80을 함유하였다.
폴리소르베이트 80 용액의 제조:
23.03mg의 폴리소르베이트 80을 50 ml 멸균된 1회용 튜브내로 칭량해 넣고, 여기에 25ml의 정제수를 부가하고 2분 동안 와동시켜(vortex) 균질한 용액을 수득하였다.
트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액의 제조:
10.19g의 트레할로즈 2수화물 및 2.303g의 글리신 조심스럽게 칭량하고 멸균 폴리프로필렌 병으로 옮기고, 여기에 상기로부터의 25 ml의 폴리소르베이트 80 용액을 부가하였다. 폴리소르베이트 튜브를 25ml의 정제수로 2회 세정하고, 세정물을 트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액으로 옮겼다. 추가량의 정제수를 트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액에 부가하여 총 용적이 190ml가 되도록 하였다. 용액을 2분 동안 교반하여 청정한 용액을 수득하였다. 용액의 pH를 측정한 결과 5.6인 것으로 확인되었다; 용적을 정제수를 사용하여 200ml로 조정하였다. pH를 측정한 결과 5.5인 것으로 확인되었다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액으로의 희석:
23.03ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액을 조심스럽게 부가하여 용적을 170ml로 조정하였다. pH를 측정한 결과 4.1인 것으로 확인되었다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. UV 흡광계수를 수득하여 단백질 농도를 정확하게 계산하였다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액을 부가하여 175ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 4.1인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.510 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다.
용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고, 무균 조건하에 층류 후드 내에서 즉시 사용하여 멸균 Healos® 스트립상으로 분배하였다. 멸균 피펫을 사용하여, 2.5ml의 rhGDF-5/트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액을 각 스트립당 총 5ml의 rhGDF-5/트레할로즈/글리신/폴리소르베이트 용액에 대해 2개의 스팟에 동등하게 스트립상으로 분배하였다. 스트립을 스틸 트레이에 위치시키고, 이를 멸균 이중 파우치에 조심스럽게 패킹시키고 동결건조를 위해 멸균 조건하에 옮겼다.
Figure 112007089847388-PAT00008
실시예 6: rhGDF-5(0.5 mg/ml)와 트레할로즈(50 mg/ml)의 동결건조된 바이알 생성물
트레할로즈 용액의 제조:
멸균 폴리프로필렌 병에 12.16g의 트레할로즈 2수화물 및 마그네틱 교반 막대를 충전시키고, 여기에 190ml의 정제수를 실온에서 부가하였다. 용액을 트레할로즈가 완전히 용해될 때까지 실온에서 교반하였다. pH를 측정한 결과 6.5인 것으로 확인되었다. 청정한 트레할로즈 용액에, 0.1 N HCl을 적가하여 pH를 5.8로 조정하였다. 용적을 정제수를 사용하여 200ml로 조정하였다; pH를 측정한 결과, 5.5인 것으로 확인되었다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈 용액으로의 희석:
14.47ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 병을 와류(swirling)시키면서 트레할로즈 용액을 천천히 부가하여 최종 용적이 100ml가 되도록 하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 때때로 와류시켰다; pH를 측정한 결과, 3.0인 것으로 확인되었다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈 용액을 부가하여 110ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 3.1인 것으로 확인되었다.; UV 판독은 0.510 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 바이알내로 분배하였다.
바이알 충전: 1.1ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액을 5ml들이 1형 플린트 유리 바이알내로 수동으로 분배해 넣고, 각 바이알을 동결건조기에 부하하기 전에 마개로 부분적으로 막았다. 동결건조 후, 마개를 가압하고 주름지게 하였다(crimp). 생성물은 백색 내지 회백색 케이크로서 수득되었다.
Figure 112007089847388-PAT00010
실시예 7: rhGDF-5 (0.5 mg/ml)과 만니톨 (50 mg/ml)의 동결건조된 바이알 생성물
만니톨 용액의 제조:
멸균 폴리프로필렌 병에 11.52g의 만니톨 및 자기 교반 막대를 충전시키고, 여기에 185ml의 정제수를 실온에서 부가하였다. 혼합물을 만니톨이 완전히 용해될 때까지 실온에서 10분 동안 교반하였다. pH를 측정한 결과 6.6인 것으로 확인되었다. 청정한 용액에 0.1 N HCl을 적가하여 pH를 5.5로 조정하였다. 용적을 정제수를 사용하여 200ml로 조정하였다; pH를 측정한 결과, 5.7인 것으로 확인되었다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 만니톨 용액로의 희석:
14.48ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮겼다; 여기에 만니톨 용액을 조심스럽게 부가하여 용적이 100 ml가 되도록 하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. UV 흡광계수를 수득하여 단백질 농도를 정확하게 계산하였다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 만니톨 용액을 부가하여 110ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 단백질 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과, 3.1인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.498 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 바이알내로 분배하였다.
바이알의 충전: 1.1ml의 만니톨/rhGDF-5 용액을 5ml들이 1형 플린트 유리 바이알내로 수동으로 분배해 넣고, 각 바이알을 동결건조기에 부하하기 전에 마개로 부분적으로 막았다. 동결건조 후, 마개를 가압하고 주름지게 하였다. 생성물은 백색 내지 회백색 케이크로서 수득되었다.
Figure 112007089847388-PAT00011
Figure 112007089847388-PAT00012
실시예 8: pH 3.0의 글리신-HCl 완충액 중의 rhGDF-5(0.5 mg/ml)와 트레할로즈(50 mg/ml)의 동결건조된 바이알 생성물
트레할로즈 용액의 제조:
멸균 폴리프로필렌 병에 12.16g의 트레할로즈 2수화물 및 마그네틱 교반 막대를 충전시키고, 여기에 pH 3.0의 5 mM 글리신-HCl 완충액 200ml를 실온에서 부가하였다. 용액을 트레할로즈가 완전히 용해될 때까지 실온에서 교반하였다. 트레할로즈/글리신 용액의 pH는 3.1이었다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고, 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈 용액으로의 희석:
벌크 rhGDF-5 용액을 2 내지 8℃에서 3000 M.W. 컷-오프 막을 사용하여 5 mM 글리신-HCl 완충액에 대해 밤새 투석하였다. 투석 후, 용액을 3.8 mg/ml까지 다소 농축시켰다. 14.47ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 병을 와류시키면서 트레할로즈-글리신 용액을 천천히 부가하여 최종 용적이 100 ml가 되도록 하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 때때로 와류시켰다; pH를 측정한 결과 3.0인 것으로 확인되었다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈-글리신 용액을 부가하여 110ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 단백질 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 3.0인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.507 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 바이알내로 분배하였다.
바이알 충전: 1.1ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액을 5ml들이 1형 플린트 유리 바이알내로 분배해 넣고, 각 바이알을 동결건조기에 부하하기 전에 마개로 부분적으로 막았다. 동결건조 후, 마개를 가압하고 주름지게 하였다. 생성물은 백색 내지 회백색 케이크로서 수득되었다.
Figure 112007089847388-PAT00013
실시예 9: pH 3.0의 포스페이트 완충액 중의 rhGDF-5(0.5 mg/ml)와 트레할로즈(50 mg/ml)의 동결건조된 바이알 생성물
트레할로즈 용액의 제조:
멸균 폴리프로필렌 병에 12.16g의 트레할로즈 2수화물 및 마그네틱 교반 막대를 충전시키고, 여기에 pH 3.0의 5mM 포스페이트 완충액 200ml를 실온에서 부가하였다. 용액을 트레할로즈가 완전히 용해될 때까지 실온에서 교반하였다. 트레할로즈/포스페이트 완충용액의 pH는 3.0이었다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈 용액으로의 희석:
벌크 rhGDF-5 용액을 2 내지 8℃에서 3000 M.W. 컷-오프 막을 사용하여 포스페이트 완충액에 대해 밤새 투석하였다. 투석 후, 용액을 3.8 mg/ml까지 다소 농축시켰다. 14.47ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 병을 와류시키면서 트레할로즈/포스페이트 완충용액을 천천히 부가하여 최종 용적이 100ml가 되도록 하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 때때로 와류시켰다; pH를 측정한 결과 3.0인 것으로 확인되었다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈/포스페이트 완충용액을 부가하여 110ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 단백질 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 3.0인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.50 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다. 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 즉시 사용하여 바이알내로 분배하였다.
바이알 충전: 1.1ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액을 5ml들이 1형 플린트 유리 바이알내로 분배해 넣고, 각 바이알을 동결건조기에 부하하기 전에 마개로 부분적으로 막았다. 동결건조 후, 마개를 가압하고 주름지게 하였다. 생성물은 백색 내지 회백색 케이크로서 수득되었다. 생성물은 백색 내지 회백색 케이크로서 수득되었다.
Figure 112007089847388-PAT00014
실시예 10: 2.5mg rhGDF-5 및 250mg 트레할로즈를 함유한 압착된 콜라겐 실린더
트레할로즈 용액의 제조:
9.56g의 트레할로즈 2수화물을 조심스럽게 칭량하고 멸균 폴리프로필렌 병으로 옮기고, 여기에 145ml의 정제수를 실온에서 부가하고 청정한 용액이 수득될 때까지 천천히 교반하였다. 청정한 트레할로즈 용액의 pH를 측정한 결과, 5.3인 것으로 확인되었다. 용적을 정제수로 조정하여 150ml의 최종 용적을 수득하였다. 용액의 pH를 측정한 결과, 5.3인 것으로 확인되었다. 용액을 즉시 사용하여 단백질 용액을 희석시켰다.
rhGDF-5 용액의 트레할로즈 용액으로의 희석:
16.45ml의 rhGDF-5 용액을 폴리프로필렌 플라스크로 조심스럽게 옮기고, 여기에 트레할로즈 용액을 조심스럽게 부가하여 용적을 120ml로 조정하였다; pH를 측정한 결과 2.9인 것으로 확인되었다. 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. UV 흡광계수를 수득하여 단백질 농도를 정확하게 계산하였다. UV 판독에 근거하여, 보다 많은 트레할로즈 용액을 부가하여 125ml의 용액중 0.5 mg/ml의 목적 단백질 농도를 수득하였다; pH를 측정한 결과 2.9인 것으로 확인되었다; UV 판독은 0.498 mg/ml 단백질 농도를 나타냈다.
압착된 콜라겐 실린더와 rhGDF-5/트레할로즈 용액의 혼합
용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 용액을 즉시 사용하여, 테플론 주형 내에 패킹된 사전형성된 압착된 콜라겐 실린더상에 분배하였다. 동결건조 전에 각 실린더를 5ml의 rhGDF-5/트레할로즈 용액과 혼합하였다.
Figure 112007089847388-PAT00015
하기 표 11의 데이타는, 2 내지 8 ℃ 샘플의 RP-HPLC 시험에서는 늦은 용출 피크(late eluting peak)이 출현하였으나, -20 ℃ 샘플에서는 출현하지 않은 것으로 입증됨에 따라, 어떠한 부형제도 함유하지 않는 Healos®상으로 침착된 동결건조된 rhGDF-5가 -20℃에서는 안정하지만 2 내지 8℃에서는 안정하지 않음을 보여준다.
Figure 112007089847388-PAT00016
부형제 및 가용성 콜라겐 겔을 이용한 유동성 압착된 콜라겐/rhGDF-5의 상이한 제조예를 개발하였으며, 각각의 제조예를 이의 성능, 안정성 및 제조 용이성에 대해 평가하였다.
압착된 콜라겐 제조예 1:
- 압착된 콜라겐 실린더 및 rhGDF-5를 건조 형태로 동결건조시킨다.
- 습윤한 형태의 콜라겐 겔을 별도로 보관한다.
- 이들 두 형태를 2 내지 8℃에서 개별적 주사기 내에 별도로 보관한다.
- 이들 두 형태를 주입 전에 혼합한다.
압착된 콜라겐 제조예 2:
-압착된 콜라겐 실린더 및 rhGDF-5 및 콜라겐 겔을 습윤한 형태로 함께 혼합한다(동결건조시키지 않음).
-모두 2 내지 8℃에서 단일 주사기내에 습윤한 형태로 보관한다; 즉시 사용가능함.
압착된 콜라겐 제조예 3:
- 압착된 콜라겐 실린더 및 rhGDF-5 및 콜라겐 겔을 건조 형태로 동결건조시킨다.
- 모두를 2 내지 8℃에서 단일 주사기내에서 건조 형태로 보관한다.
- 주사 전에 물로 재수화시킨다.
압착된 콜라겐 제조예 4:
-압착된 콜라겐 실린더 및 콜라겐 겔을 함께 페이스트화시킨다.
-rhGDF-5를 건조 형태로 별도로 보관한다.
- 둘다를 2 내지 8℃에서 개별적 주사기 내에서 별도로 보관한다.
- 둘다를 주사 전에 혼합한다.
압착된 콜라겐 제조예 5:
-압착된 콜라겐 실린더 및 콜라겐 겔을 함께 건조 형태로 동결건조시킨다.
-rhGDF-5를 건조 형태로 별도로 보관한다.
- 둘다를 2 내지 8℃에서 개별적 주사기 내에서 별도로 보관한다.
- rhGDF-5를 멸균수 또는 골수 흡인물로 재구성한다.
- 건조 압착된 콜라겐 및 콜라겐을 주사 전에 재구성된 rhGDF-5 용액과 혼합한다.
rhGDF-5의 안정성을 다음의 기술로 평가하였다: 완충액 및 항산환제의 존재 및 부재하에 만니톨, 슈크로즈 및 트레할로즈와 같은 몇가지 부형제를 이용한, RP-HPLC, 시차주사열량측정(DSC), 원편광이색성(CD), 편광 현미경(PLM) 및 생물검정. rhGDF-5의 몇가지 트레할로즈-함유 동결건조된 제형은 저장 동안에 목적하지 않는 황색 및 유리질 케이크 구조를 나타냈고, 따라서 양호하지 않았다.
동결건조된 rhGDF-5 제형의 용융 거동은 DSC를 사용하여 연구하였다. DSC 데이타는 트레할로즈-기반 제형 및 만니톨-기반 제형이 둘다 벌크 rhGDF-5의 열적 안정성을 유의적으로 향상시켰음을 입증하였다.
도 1, 2 및 3은 벌크 rhGDF-5의 DSC 프로파일과 비교한 rhGDF-5의 트레할로즈 제형 및 만니톨 제형의 DSC 프로파일의 비교를 도시한 것이다. 벌크 rhGDF-5는 다음의 2가지 주요 전이를 나타낸다: 40℃ 부근에서의 하나 및 85℃ 부근에서의 다른 하나. 고온 전이는 아마도 단백질의 열적 폴딩 풀림(unfolding)를 나타낼 수 있을 것이다. 제1 흡열 전이의 용융 온도(Tm)는 부형제의 존재하에 7 내지 14℃만큼 증가한다. 그 자체로 고려되는 경우, 본 연구는 트레할로즈 및 만니톨은 둘다 안정화제로서 동등하게 효과적일 수 있음을 시사한다.
트레할로즈/rhGDF-5 제형의 PLM(편광 현미경)은 도 4에 도시한다. 샘플은 주요 복굴절 현상을 나타내지 않는다. 따라서, 시스템은 치료학적 적용에 이상적인 무정형이다. 도 5는 저장 기간 후의 만니톨/rhGDF-5 제형의 PLM을 도시한 것이다. 샘플 중에서 다수의 결정이 관찰되었는데, 이는 만니톨이 저장 동안에 결정화되었음을 나타낸다. 이러한 결과는 트레할로즈가 rhGDF-5에 대한 보다 우수한 동결보호제임을 시사한다. 먼쪽의 UV CD 스펙트럼은 트레할로즈-기반 제형이 천연의 벌크 단백질의 2차 구조 분포와 유사한 2차 구조 분포를 가짐을 보여주었다.
다양한 부형제를 함유한 동결건조된 rhGDF-5의 RP-HPLC에 의한 실시간 안정성 연구는 트레할로즈 존재하의 rhGDF-5가 50 mg/ml 또는 100 mg/ml 농도에서 완충액의 존재 또는 부재하에 및 폴리소르베이트의 존재 또는 부재하에, 2 내지 8℃ 및 15 내지 25℃ 저장 조건 둘다에서 rhGDF-5에 대해 향상된 안정성을 일관되게 부여한 반면에, 만니톨은 유사한 저장 조건하에 동일한 수준의 안정성을 제공하지 못했음을 명백하게 입증하였다.
동결건조된 케이크 제형의 실시간 안정성 연구는, 실온 뿐만 아니라 2 내지 8℃ 저장 조건에서 주(main) 피크는 유의적으로 감소되고 응집물은 증가됨으로 입증되는 바와 같이, 만니톨이 단백질을 안정화시키지 않았음을 명백히 보여주었다. 응집물은 이들은 면역학적 반응과 부작용을 유발할 수 있기 때문에 단백질 제형에서 가장 바람직하지 않은 종이다. 반대로, 트레할로즈는, 실시간 안정성 연구에서 입증된 바와 같이, 특히 2 내지 8℃ 저장 조건에서 응집물 형성을 억제하고 주 피크를 보호함으로써 단백질을 매우 잘 안정화시켰다. 따라서, 트레할로즈는 제형 중의 rhGDF-5를 안정화시키는데 있어 만니톨보다 우수하다. 또한, 실시간 안정성 데이타는 pH를 조절하기 위한 완충액으로서 포스페이트 또는 글리신을 갖는 rhGDF-5/트레할로즈 제형이 완충액을 함유하지 않는 rhGDF-5/트레할로즈 제형보다 더욱 우수함을 나타낸다. 실시간 안정성 데이타는 rhGDF-5 트레할로즈/글리신 제형의 이상적 저장 조건은 2 내지 8℃이고 25℃에서의 저장 또한 적절함을 나타낸다.
트레할로즈-기반 rhGDF-5 제형의 양호한 생화학적 및 생물리학적 데이타에 추가하여, 이들 제형은 알칼리성 포스파타제 생물학적 검정에서도 효능을 나타냈다. 물리 화학적 분석 방법, 시험관내 검정 및 실시간 안정성 데이타는 동결건조된 정치 생성물 뿐만 아니라 다양한 근골격계 장애의 치료에서 사용하기 위한 콜라겐-기반 배합 생성물 중의 rhGDF-5를 안정화시키는데 있어 우수한 부형제로서의 트레할로즈의 유망성을 보여준다.
실시예 11: 상이한 이온 강도 용액 및 2가지 pH 완충액 (pH 3 및 pH 4) 중의 rhGDF-5의 안정성
인산나트륨 완충액의 다양한 이온 강도 용액을 본 연구에서 사용하였다. 벌크 단백질 용액을 약 10 mg/mL까지 농축시키고 pH 3 또는 pH 4의 5, 10, 25, 50 및 100 mM 포스페이트 완충액으로 투석하였다. 투석 후, 샘플을 청정도에 대해 점검하고 UV-Vis 분광광도계에서 단백질 농도에 대해 분석하였다. 상세한 과정은 하기에 기술한다.
완충액 제조
pH 3의 100 mM 포스페이트 완충액:
13.5ml의 농축된 H3PO4 (14.8 M) 용액을 2000-mL 비이커로 옮기고, 여기에 탈이온수를 1900-mL 표시선까지 부가하였다. 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하고 2000-mL 눈금 실린더로 옮겼다. 추가의 물을 부가하여 2000mL가 되도록 하였다. 내용물을 상기 비이커로 다시 옮기고 철저히 혼합하였다.
pH 3의 50 mM 포스페이트 완충액:
6.76ml의 농축된 H3PO4 (14.8 M) 용액을 2000-mL 비이커로 옮기고, 여기에 탈이온수를 1900-mL 표시선까지 부가하였다. 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하고 2000-mL 눈금 실린더로 옮겼다. 추가의 물을 부가하여 2000mL가 되도록 하였다. 내용물을 상기 비이커로 다시 옮기고 철저히 혼합하였다.
pH 3의 25 mM 포스페이트 완충액:
3.39ml의 농축된 H3PO4(14.8 M) 용액을 2000-mL 비이커로 옮긴 다음, 탈이온수 1900-mL 표시선까지 부가하였다. 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하고 2000-mL 눈금 실린더로 옮겼다. 추가의 물을 부가하여 2000mL가 되도록 하였다. 내용물을 상기 비이커로 다시 옮기고 철저히 혼합하였다.
pH 3의 10 mM 포스페이트 완충액:
1.35ml의 농축된 H3PO4 (14.8 M) 용액을 2000-mL 비이커로 옮기고, 여기에 탈이온수를 1900-mL 표시선까지 부가하였다. 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하고 2000-mL 눈금 실린더로 옮겼다. 추가의 물을 부가하여 2000mL가 되도록 하였다. 내용물을 상기 비이커로 다시 옮기고 철저히 혼합하였다.
pH 3의 5 mM 포스페이트 완충액:
0.676ml의 농축된 H3PO4(14.8 M)를 2000-mL 비이커로 옮긴 다음, 탈이온수를 1900-mL 표시선까지 부가하였다. 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하고 2000-mL 눈금 실린더로 옮겼다. 추가의 물을 부가하여 2000mL가 되도록 하였다. 내용물을 상기 비이커로 다시 옮기고 철저히 혼합하였다.
샘플 제조
벌크 단백질 rhGDF-5(롯트 번호 2142131)를 2 내지 8℃에서 해동시켰다. 벌크 단백질 용액(3.8 mg/mL에서 24 mL)를 원심분리 여과 장치(Pall Life Science, Cat # OD010C37, 10K MWCO)를 사용하여 약 6 mL의 용적까지 농축시켰다. 약 0.9ml의 농축된 rhGDF-5 용액을 각 투석 카셋트(Pierce, Cat # 66380)로 옮기고 실온에서 포스페이트 완충액에 대해 밤새 투석하였다. 농축된 rhGDF-5 용액을 상기 투석 카셋트로부터 조심스럽게 제거하여 소형 유리 바이알에 넣어서 용액 청정도를 점검하였다. 단백질 농도를 분석 방법 단락에서 기술한 바와 같이 UV-Vis 분광광도계에서 측정하였다.
pH 4에서의 용해도
보다 많은 NaOH 용액을 pH 3 완충액에 부가하여 pH 3 완충액으로부터 pH 4.0의 완충액을 제조하였다. 단백질 용액을 실온에서 pH 4 완충액에 대해 밤새 투석하였다. 샘플을 용액 청정도 및 단백질 농도에 대해 분석하였다.
분석 방법
소형 유리 바이알 내의 용액 샘플을 청정도 및 입자에 대해 점검하였다. 샘플 바이알을 검은색 배경에 대고 수직 광을 사용하여 조사하였다. 시험 샘플의 청정도를 대조군으로서의 순수한 물 샘플과 비교하였다. 각 용액 샘플의 pH를 보정된 pH 메터를 사용하여 직접 측정하였다.
결과
10 mg/ml rhGDF-5 용액의 용해도 연구의 결과는 5, 10 및 25 mM의 인산나트륨의 낮은 이온 강도 완충액이 우수한 용해도를 나타내는 청정한 용액을 산출한 반면에, 50 및 100 mM의 인산나트륨의 높은 이온 강도 완충액은 불량한 용해도를 나타내는 혼탁한 용액을 산출하였음을 보여주었다. pH 4에서 5 및 10 mM 인산나트륨 완충액은 불량한 용해도를 나타내는 혼탁한 용액을 산출하였다. 25, 50 및 100 mM의 인산나트륨 완충액은 원심분리 후에 청정한 용액을 산출하였지만, 단백질 회율은 거의 0이였으며, 이는 단백질이 침전되었음을 나타낸다. 따라서, pH 3 부근의 낮은 이온 강도 완충액이 높은 pH의 높은 이온 강도 완충액보다 바람직하다.
실시예 12: 5% 트레할로즈를 함유한 다양한 완충액 중에서 다양한 온도에서의 rhGDF-5의 안정성
본 연구에서는 다양한 완충액을 동결건조 및 5℃에서의 저장 동안 5% 트레할로즈 용액중 0.7 mg/mL rhGDF-5를 보호하는데 있어서의 이들의 효과에 대해 시험하였다. 시험된 완충액은 5mM 글리신-HCl pH3, 5 mM 인산나트륨 pH 3, 5 mM 나트륨 시트레이트 pH 3, 10 mM 나트륨 락테이트 pH 3, 물중 0.01% TFA, 1 mM HCl 및 트레할로주가 존재하지 않는 1mM HCl 중의 rhGDF-5의 대조 용액이었다. 완충액은 다음과 같이 제조하였다:
5 mM 글리신 완충액, pH 3
2000-mL 비이커에 0.75g의 글리신(MW 75.05g)과 1900ml의 탈이온수를 충전시켰다; 용액을 교반하면서 HCl 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하였다. 추가의 물을 부가하여 2000 mL가 되도록 하고 철저히 혼합하였다.
5 mM 시트레이트 완충액, pH 3
2000-mL 비이커에 2.11g의 시트르산 1수화물(MW210.14)과 1900ml의 탈이온수를 충전시켰다; 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하였다. 추가의 물을 부가하여 2000mL가 되도록 하고 용액을 혼합하였다.
5 mM 포스페이트 완충액, pH 3
0.676 mL 인산 용액(14.8M)을 1900ml의 탈이온수를 함유하는 2000-mL 비이커로 옮겼다; 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하였다. 추가의 물을 부가하여 2000mL가 되도록 하고 용액을 철저히 혼합하였다.
10 mM 락테이트 완충액, pH 3
2000-ml 크기의 비이커에 1.81g 락트산(MW 90.08)과 1900ml의 탈이온수를 충전시켰다; 수득된 용액을 NaOH 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하였다. 추가의 물을 부가하여 2000 mL가 되도록 하고 용액을 철저히 혼합하였다.
1 mM HCl 용액
1ml의 2N HCl 용액을 1900ml의 탈이온수를 함유하는 2000-mL 비이커로 옮겼다. 용액의 최종 용적을 보다 많은 탈이온수를 부가하여 2000 mL 표시선까지 조정하였다.
0.01% TFA 용액
0.2 mL TFA 용액을 1900ml의 탈이온수를 함유하는 2000-mL 비이커로 옮겼다. 용액의 최종 용적을 추가의 물을 부가하여 2000 mL 표시선까지 조정하고 용액을 철저히 혼합하였다.
제형 제조
벌크 단백질 rhGDF-5(롯트 번호 2142131)를 2 내지 8℃에서 해동시켰다. 벌크 단백질 용액(3.8 mg/mL에서 55 mL)을 원심분리 여과 장치(Pall Life Science, Cat # OD010C37, 10K MWCO)를 사용하여 약 10 mL의 용적까지 농축시켰다. 약 1.4ml의 농축된 rhGDF-5 용액을 각 투석 카셋트(Pierce, Cat # 66380)로 옮기고 카셋트를 2 내지 8℃에서 포스페이트 완충액에 대해 밤새 투석하였다.
농축된 rhGDF-5 용액을 상기 투석 카셋트로부터 조심스럽게 제거하여 소형 유리 바이알에 넣었다. 용액의 단백질 농도를 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 단백질을 시험 완충액 중에서 5% (w/v) 트레할로즈와 함께 0.7 mg/mL로 제형화하고, 0.22㎛ 필터를 통해 여과하였다. 용액을 동결건조 전에 2 내지 8℃에서 저장하였다.
충전 및 동결건조
각각의 제형화된 용액을 3-mL 유리 바이알(West Pharmaceutical Services, Cat # 68000316)에 1 mL/바이알로 충전시켰다. 상기 바이알을 마개(West Pharmaceutical Services, Cat # 99150630)로 부분적으로 막고 동결건조기(FTS System, LyoStar II)로 옮겼다. 열전쌍을 플라시보 바이알에 위치시켜 동결건조 공정을 모니터링하였다. 대조군으로서, 트레할로즈를 함유하지 않는 다른 제형을 또한 시험하였다. 1 mM HCl 용액 중의 200ml의 4.5 mg/mL rhGDF-5를 각 유리 바이알로 옮겨서 동결건조시켰다.
분석 방법
동결건조 케이크의 온전성
동결건조된 샘플을 동결건조된 케이크의 균열, 수축 및 붕괴에 대해 점검하였다.
재구성 시간
1mL의 탈이온수를 각 샘플 바이알에 부가하고 혼합하였다. 재구성 시간을 기록하였다.
용액 청정도-가시적 외관
소형 유리 바이알 내의 용액 샘플을 청정도 및 입자에 대해 점검하였다. 샘플 바이알을 검은색 배경에 대고 수직 광을 사용하여 조사하였다. 시험 샘플의 청정도를 대조군으로서 순수한 물 샘플과 비교하였다.
pH 방법
각 용액 샘플의 pH를 보정된 pH 메터를 사용하여 직접 측정하였다.
UV 분광분석법
단백질 농도를 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 측정하였다. rhGDF-5의 농도를 280nm에서 1.16mL/mg*cm의 흡광계수를 사용하여 계산하였다.
HPLC 방법
비환원된 rhHPLC 방법(TM 0051 D)를 사용하여 단백질의 변형된 종을 모니터링하였다. 시험 샘플을 50 mM 아세트산을 사용하여 약 0.1 mg rhGDF-5/mL 용액으로 희석시켰다. 희석된 샘플(각각 50ml)을 HPLC 컬럼(Vydac 218TP52, C18 컬럼)에 주입하였다. 샘플을 이동상으로서 물 중의 0.15%(v/v) TFA 및 아세토니트릴 중의 0.15%(v/v) TFA를 사용하여 0.3mL/분으로 용출시켰다. 용출된 피크는 214 nm에서 검출되었다. 각 피크 면적의 백분율을 계산하여 주 피크 및 소(minor)피크(분해된 피크)의 변화를 모니터링하였다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)
SEC를 사용하여 단백질 응집을 모니터링하였다. 전형적으로, 30㎕의 각 시험 샘플을 SEC 컬럼(TOSOH Bioscience, Cat # 08540)에 직접 주입하고 물중의 0.1% (v/v) TFA 및 45%(v/v) 아세토니트릴을 사용하여 0.5ml/분의 속도로 용출시켰다. 단백질 피크를 280nm에서 모니터링하고, 응집물의 백분율을 계산하였다.
겔 전기영동
단백질 응집물 및 분해된 소형 조각을 겔 전기영동 방법을 사용하여 모니터링하였다. 전형적으로, 약 10㎍ 단백질을 건조시키고 10% β-머캅토에탄올을 함유유하거나 함유하지 않는 70㎕의 SDS-PAGE 샘플 완충액(Invitrogen, Cat # LC2676)으로 재구성하였다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 각 샘플 약 18ml를 겔(Invitrogen, Cat # NP0341Box)에 부하하였다. 겔을 200볼트에서 약 35분 동안 전개 완충액(running buffer)(Invitrogen, Cat # NP0002)을 사용하여 전개시켰다. 겔을 Simplyblue 용액(Invitrogen, Cat # LC6060)으로 염색하고 탈이온수로 탈색시켰다. 겔을 스캐닝하고 영상을 수집하였다.
생물학적 활성 검정
6-개월 안정성 샘플(글리신 제형 및 HCl 제형)만을 생물학적 활성에 대해 분석하였다. 세포-기반 검정(TM 0046)을 사용하여 알칼리성 포스파타제 활성을 측정하여 당해 샘플의 안정성을 측정하였다.
함수량
함수량을 카를 피셔(Karl Fischer) 적정법을 사용하여 PDD로 수행하였다.
결과
동결건조 케이크의 온전성
모든 저장 조건하의 시험 샘플 케이크는 0시간째부터 9개월 시점까지 고체이며 백색의 외관을 나타냈다. 케이크 주변에서 약간의 수축이 관찰되었거나, 케이크는 바이알의 유리 벽으로부터 다소 분리되었는데, 이는 트레할로즈 또는 슈크로즈와 같은 당이 벌킹제로서 사용되는 경우에 흔히 관찰되는 것이다. 모든 시험 샘플에서 붕괴된 케이크는 나타나지 않았다. 통상적으로 케이크 붕괴는 재구성 시간을 변경하여 단백질 불안정을 유도할 수 있다. 트레할로즈가 존재하지 않는 제형에서는 백색의 솜털 모양의(fluffy) 경량 케이크가 수득되었다.
재구성 시간
1mL의 물을 각 시험 시점에서 각 샘플 바이알에 부가하였다. 샘플을 온화하게 혼합하고 재구성 시간을 기록하였다. 케이크가 완전히 용해되기 위해 약 30 내지 40초가 요구되었다.
용액 청정도
재구성된 샘플을 검은색 배경하에 수직 광을 사용하여 조사하였다; 모든 샘플 용액은 청정하고 무색인 것으로 확인되었다.
pH
재구성된 용액의 pH를 보정된 pH 메터를 사용하여 측정하였다. 연구 과정 동안 모든 제형 전반에 걸쳐 pH의 유의적 변화는 없었다. 트레할로즈/완충액을 함유하는 제형 샘플의 pH는 대략 3.0±0.2였다. 트레할로즈를 함유하지 않는 제형의 pH는 약 4.0이었다.
UV 분광분석법
단백질 농도를 UV 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 연구 과정 동안 글리신 완충액, 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, 락테이트 완충액 또는 0.01% TFA를 함유하는 rhGDF-5/트레할로즈 제형 중의 단백질 농도에서의 유의적 변화는 없었다. 280nm에서의 흡광도는 rhGDF-5/트레할로즈/HCl 제형에서 당해 제형을 25℃/60% 및 40℃/75% RH에서 저장한 경우에 증가되었다. 단백질의 농도는 40℃에서 저장한 제형 중에서 증가하는 것으로 나타났다; 0시간째에서의 초기 단백질 농도 0.7mg/mL는 6개월 시점에서 1mg/mL까지 증가하였다. 이는 트레할로즈가 280 nm에서 유사 흡광도를 갖는 푸르푸랄 화합물로 분해되었을 수 있다는 것을 내포한다.
비환원된 rhHPLC 결과
비환원된 rhHPLC를 사용하여, 메티오닌 산화, 탈아미드화 반응 및 기타 반응에 의해 형성된 rhGDF-5의 분해 종을 모니터링하였다. HCl 제형 및 트레할로즈 부재 제형을 제외한, 9개월 동안 2 내지 8℃ 및 25℃에서 저장된 모든 샘플에서 주 피크의 백분율에서의 유의적 변화는 없었다. 상기 두 제형은 모두 9개월 시점에서 주 피크가 90% 미만이었다.
그러나, 제형들을 40℃/75% RH와 같은 가속화된 저장 조건에서 저장한 경우에, 오직 하나의 제형(즉, rhGF-5/트레할로즈/글리신)만이 6개월 시점에서 주 피크가 90%를 초과하였다. 나머지 제형들은 가속화된 저장 조건하에 rhGDF-5/트레할로즈/글리신 제형만큼 안정하지 않았다. 특히, rhGDF-5/트레할로즈/HCl 제형은 6개월 시점에서 주 피크가 오직 66%였다. 도 6 및 7은 40℃/75% RH에서 6개월 동안 저장한 rhGDF-5/트레할로즈/글리신 제형 및 rhGDF-5/트레할로즈/HCl 제형의 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다. 도 8, 9 및 10은 5℃, 25℃ 및 40℃에서 저장시에 시험된 다양한 완충액의 단백질 회수율(%)을 도시한 것이다.
rpHPLC 분석으로부터의 결과는 트레할로즈 및 글리신 완충액의 조합이 저장 동안에 동결건조된 rhGDF-5에 가장 우수한 안정성을 제공함을 나타낸다. 추가로, HCl의 강산이 단백질 및 트레할로즈 둘다에 약간의 탈안정화 효과를 미칠 수 있기 때문에 rhGDF-5/트레할로즈/HCl의 제형은 덜 안정하다.
실시예 13: 다양한 온도에서, 5% 트레할로즈를 함유한 pH 3 글리신 완충액 중의 rhGDF-5의 안정성
본 연구에서는 rhGDF-5를 5% (w/v) 트레할로즈 및 pH 3의 5 mM 글리신-HCl 완충액과 함께 약 0.01, 0.03, 0.1, 2.5, 4.5 및 9 mg/mL로 제형화하였다. 제형화된 용액을 사용하여 3-mL 유리 바이알 내에 1 mL/바이알로 충전시키고, 바이알을 동결건조시켰다. 동결건조된 샘플 바이알을 2 내지 8℃, 25℃/60% RH 및 40℃/75% RH에서 저장하였다. 각각의 지정된 시점에서, 샘플을 생성물의 안정성에 대해 분석하였다. 본 연구에서 사용된 방법은 케이크 외관, 재구성 시간, 용액 청정도, pH, rpHPLC(역상 고성능 크로마토그래피), UV(자외선 분광분석), SEC(크기 배제 크로마토그래피)와 겔 전기영동을 포함한다. 3가지 저장조건하에 6개월 동안 저장한 후, 0.1mg/ml 정도로 낮은 단백질 농도 내지 9 mg/mL 정도로 높은 단백질 농도를 갖는 제형에서는 유의적 변화가 없었던 것으로 확인되었다. 단백질 농도가 0.01 및 0.03 mg/ml와 같이 너무 낮은 경우, 기존의 방법은 확실하지 않아서 미세한 변화를 검출하기에 충분하지 않았다.
본 연구의 결과는 트레할로즈 및 글리신-HCl를 함유한, 다양한 단백질 농도를 갖는 동결건조된 rhGDF-5 제형이 2 내지 8℃, 25℃/60% RH에서 6개월 이상 안정하였음을 나타낸다. 40℃/75% RH의 가속화된 저장 조건에서 저장된 생성물에서는 6개월 시점에서 rpHPLC 프로파일에서 약간의 변화가 나타났다.
실시예 14: 5% 트레할로즈를 함유한 pH 3 글리신 완충액 중에서 다양한 농도에서의 상이한 농도의 rhGDF-5의 안정성
본 연구에서는 rhGDF-5의 농도를 0.01, 0.03, 0.1, 2.5, 4.5 및 9.0 mg/ml로 하여 rhGDF-5를 5% (v/w) 트레할로즈 및 pH 3의 5 mM 글리신 완충액과 함께 제형화하였다. 추가로, 4.5 mg/ml rhGDF-5의 제형 1개를 비교를 위해 10% (w/v) 트레할로즈 및 5 mM 글리신 완충액(pH 3)으로 제조하였다. 이어서, 제형화된 용액들을 3mL 유리 바이알내로 1mL/바이알로 충전시키고 동결건조시켰다. 동결건조된 샘플을 안정성 챔버에 저장하였다.
5 mM 글리신-HCl 완충액, pH 3
3 x 0.75g 글리신 (MW 75.07g)을 3 x 2000-mL 비이커로 칭량해 넣고 약 1900ml의 탈이온수를 각 비이커에 부가하였다. 용액을 HCl 용액을 사용하여 pH 3으로 적정하였다. 추가의 물을 각 비이커마다 부가하여 최종 용적이 2000 mL가 되게하고 철저히 혼합하였다.
제형 제조
벌크 단백질 rhGDF-5(롯트 번호 2142131)를 2 내지 8℃에서 해동시켰다. 단백질 용액(3.8 mg/mL에서 96mL)을 4개의 원심분리 여과 장치(Pall Life Science, 카탈로그 번호 OD010C37, 10K MWCO)를 사용하여 합한 총 용적 약 24mL까지 농축시켰다. 약 3 x 8ml의 농축된 rhGDF-5 용액을 3 x 투석 카셋트(Pierce, Cat # 66380)로 옮기고 2 내지 8℃에서 글리신-HCl 완충액에 대해 밤새 투석하였다.
rhGDF-5 용액을 투석 카셋트로부터 소형 유리병으로 옮겼다. 단백질 농도를 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 단백질을 다양한 농도에서 5 또는 10% (w/v) 트레할로즈 및 5 mM 글리신 완충액과 함께 상기한 바와 같이 제형화하였다. 제형화된 용액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하고, 동결건조 전에 2 내지 8℃에서 저장하였다.
충전 및 동결건조
각각의 제형화된 용액을 3-mL 유리 바이알(West Pharmaceutical Services, Cat # 68000316)내로 1 mL/바이알로 충전시켰다. 마개(West Pharmaceutical Services, Cat # 99150630)를 바이알 위에 부분적으로 위치시켰다. 샘플 바이알을 동결건조기(FTS System, LyoStar II)로 옮겼다. 열전쌍을 플라시보 바이알에 위치시켜 동결건조 공정 동안의 온도 프로파일을 모니터링하였다.
사용된 분석 방법은 상기 실시예 11 및 12에 기술된 바와 유사하였다.
결과
동결건조 케이크의 온전성
모든 저장 조건하의 시험 샘플 케이크는 0시간째부터 6-개월 시점까지 고체이며 백색의 외관을 나타냈다. 케이크 주변에서 약간의 수축이 관찰되었거나, 케이크는 바이알의 유리 벽으로부터 다소 분리되었다. 이는 트레할로즈 또는 슈크로즈와 같은 당이 벌킹제로서 사용되는 경우에 매우 흔한 현상이다. 모든 시험 샘플에서 붕괴된 케이크는 나타나지 않았다.
재구성 시간
1mL의 물을 각 시험 시점에서 각 샘플 바이알에 부가하였다. 바이알을 온화하게 혼합하고 재구성 시간을 기록하였다. 케이크가 용액이 되기까지 약 30 내지 40초가 소요되었다.
용액 청정도
모든 재구성된 샘플은 단백질 용액을 검은색 배경에 대고 수직 광으로 조사하였을 때 청정하고 무색인 것으로 나타났다.
pH
재구성된 용액을 사용하여 pH를 측정하였다. 연구 과정 동안 모든 샘플에서 pH의 유의적 변화는 관찰되지 않았다. 제형의 pH 값은 3.0 내지 3.3의 범위였다.
UV 분광분석법
단백질 농도를 UV 분광분석법을 사용하여 측정하였다. UV 스펙트럼은 단백질 응집에 관한 정보(기준선 광 산란)를 또한 제공할 수 있다. 0.01 내지 0.1 mg/mL의 단백질 농도의 경우, 10-mm 큐벳을 사용하였다. 2 내지 9 mg/mL의 단백질 농도의 경우, 희석하지 않거나 샘플을 분쇄하지 않고 1-mm 큐벳을 사용하였다. 안정성 연구 과정 동안 0.1 내지 9 mg/mL의 샘플에서 단백질 농도의 유의적 변화가 관찰되지 않았다. 0.01 및 0.03 mg/ml의 저 농도 샘플의 경우, 흡광도가 너무 낮았기 때문에 보다 많은 변동이 나타났다. 저 농도 샘플의 경우에 추가의 연구를 위해 새로운 샘플 제조 방법이 요구된다.
비환원된 rhHPLC 결과
비환원된 rhHPLC를 사용하여 메티오닌 산화 및 탈아미드화와 같은 rhGDF-5의 분해된 종을 모니터링하였다. 6개월의 저장 기간 동안 2-8℃, 25℃ 및 40℃에서 저장된 모든 샘플에서 주 피크의 백분율에서의 유의적 변화는 관찰되지 않았다. 6개월 동안 저장된 샘플의 rhGDF-5의 주 피크는 여전히 96% 이상으로 회수되었으며, 이는 0시간째 샘플로부터 수득된 데이타와 유사하였다. 0.01 및 0.03 mg/mL의 저 농도 샘플은 HPLC 방법으로 분석하기가 곤란하였다. 추가의 연구를 위해 새로운 샘플 제조법이 요구된다.
SEC
SEC를 사용하여 단백질 응집을 모니터링하였다. 6개월간의 안정성 연구 동안 시험된 모든 샘플에서 유의적 변화는 발견되지 않았다. 0.01 및 0.03 mg/mL의 저 농도 샘플은 분석하지 않았다.
겔 전기영동
겔 전기영동을 이용하여 단백질 응집 및 분해 종을 또한 모니터링하였다. 6개월 간의 저장 동안에 모든 샘플에서 유의적 변화는 발견되지 않았다.
단백질의 소형 단편이 환원된 SDS-PAGE에서 발견되지 않았기 때문에 단백질의 소형 단편은 저장 동안에 어떠한 샘플에서도 형성되지 않은 것이다
함수량
샘플의 함수량은 0.19 내지 0.32% 범위로 낮았다. 단백질 농도와 함수량 사이에 상관관계나 경향은 나타나지 않았다.
본 결과는 rpHPLC 및 SEC 크로마토그래피로 입증된 바와 같이 트레할로즈 및 글리신 완충액의 존재하에 동결건조된 rhGDF-5 생성물이 2 내지 8℃, 25℃/60%RH 및 40℃/75%RH에서 6개월 이상 안정함을 나타낸다. 단백질을 0.1 내지 9 mg/mL 범위의 다양한 농도에서(예비-동결건조) 5%(w/v) 트레할로즈/5 mM 글리신-HCl 완충액(pH 3)과 함께 제형화하여 동결건조시킬 수 있다. 단백질을 0.01 mg/mL 및 0.03 mg/mL와 같은 저 농도에서 제형화한 경우, 기존의 방법은 변화를 검출하는데 다소 제약이 있었다.
본 발명을 에시적 양태와 관련해 설명하였다. 본 발명의 범주 및 목적에서 벗어남이 없이 상기한 제형에서 특정 변화가 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명에 함유되거나 첨부된 도면에 도시된 모든 내용들은 단지 예시적인 것이며 제한하는 의미로 해석되지 않는다. 예를 들면, 당업자는 본 발명의 예시적 양태의 제형이 BMP와의 사용으로 제한되지 않으며 어떠한 적합한 생물학적 시스템을 위해서라도 기타 분자와 함께 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
또한, 하기 특허청구범위는 본원에 기재한 본 발명의 모든 포괄적이고 구체적인 특징 및 표현상 동일하다고 언급될 수 있는 본 발명의 범주의 모든 진술을 포함하기 위한 것임을 이해할 것이다.
도 1은 실시예 6에 기재된 rhGDF-5의 트레할로즈 제형의 DSC 프로파일을 도시한 것이다. 도 2는 실시예 7에 기재된 rhGDF-5의 만니톨 제형의 DSC 프로파일을 도시한 것이다. 도 3은 rhGDF-5 천연 단백질의 DSC 프로파일을 도시한 것이다. 도 4는 실시예 6에 기재된 rhGDF-5의 트레할로즈 제형의 편광 현미경 사진을 도시한 것이다. 도 5는 실시예 7에 기재된 rhGDF-5의 만니톨 제형의 편광 현미경 사진을 도시한 것이다. 도 6은 실시예 12에 기재된 40℃/75% RH에서 6개월 후의 rhGDF-5/트레할로즈/글리신 제형의 rpHPLC 프로파일을 도시한 것이다. 도 7은 실시예 12에 기재된 40℃/75% RH에서 6개월 후의 rhGDF-5/트레할로즈/HCl 제형의 rpHPLC 프로파일을 도시한 것이다. 도 8, 9 및 10은 실시예 12에 기재된 바와 같은 다양한 시점에서 5℃, 25℃ 및 40℃에서 저장시의, 시험된 다양한 완충용액의 단백질 회수율(%)를 도시한 것이다. 도 11은 실시예 14에 기재된 바와 같은 pH 3 글리신 완충액 중에서 5% 또는 10% 트레할로즈와 함께 동결건조된, 선택된 온도에서의 다양한 농도의 rhGDF-5의 안정성을 도시한 것이다.

Claims (13)

  1. 하나 이상의 골형성 단백질(bone morphogenetic portein; BMP) 및 당해 BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, pH가 약 2.5 내지 약 3.5인 글리신 완충용액을 추가로 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, BMP가 rhGDF-5인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, BMP가 rhGDF-5인 조성물.
  5. a) 하나 이상의 BMP 및 당해 BMP를 안정화시키기에 충분한 양의 트레할로즈를 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및
    b) 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, BMP를 안정화시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, pH가 약 2.5 내지 약 3.5인 글리신 완충용액을 부가함을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, BMP가 rhGDF-5인 방법.
  8. 제5항의 방법에 따라 동결건조된 하나 이상의 동결건조된 BMP를 포함하는, 포유동물에 이식하기 위한 장치.
  9. 제8항에 있어서, 생체분해성 콜라겐 매트릭스를 추가로 포함하는 장치.
  10. 제8항에 있어서, BMP가 rhGDF-5인 장치.
  11. 제6항의 방법에 따라 동결건조된 하나 이상의 동결건조된 BMP를 포함하는, 포유동물에 이식하기 위한 장치.
  12. 제11항에 있어서, 생체분해성 콜라겐 매트릭스를 추가로 포함하는 장치.
  13. 제11항에 있어서, BMP가 rhGDF-5인 장치.
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