KR20080040547A - 클로로필 ａ 및 클로린 ｅ６의 제조방법 - Google Patents

클로로필 ａ 및 클로린 ｅ６의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 클로로필 a 및 클로린 e6의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 파쇄 되지 않은 인택트 클로렐라 세포 자체를 이용하여 클로로필 a를 추출하고 이로부터 클로린 e6를 제조하며, 본 발명에서 채택하고 있는 클로렐라 세포의 전처리 과정에 의해 높은 함량 비율의 클로로필 a를 얻을 수 있으며, 이로부터 높은 수율로 클로린 e6를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 비교적 간단한 공정에 따라 실시되며, 클로린 e6의 대량생산에 적합하다.
클로린 e6, 클로렐라, 클로로필 a

Description

클로로필 ａ 및 클로린 ｅ６의 제조방법{Methods for Preparing Chlorophyll ａ and Chlorin ｅ６}
도 1a-1c는 분쇄 클로렐라를 이용하여 클로로필 a에 대하여 에탄올 추출한 결과를 보여주는 HPLC(high pressure liquid chromatography) 크로마토그램이다. 도 1a-1c는 각각 30분, 1시간 30분 및 3시간 추출한 결과이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 1d-1f는 분쇄되지 않은 인택트 클로렐라를 이용하여 클로로필 a에 대하여 에탄올 추출한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 도 1d-1f는 각각 30분, 1시간 30분 및 3시간 추출한 결과이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 2a는 분쇄되지 않은 인택트 클로렐라에 포함되어 있는 성분들을 분석한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 2b-도 2g는 클로렐라를 60% 에탄올로 세척하여 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 제거한 결과를 보여주는 HPLC 분석 결과이다. 도 2b-도 2g는 60% 에탄올에 의한 반복적인 세척에서 각각 1회-6회째 분석 결과이다. HPLC 분석은, 세척 결과 형성된 상등액에 대한 것이다.
도 2h는 100% 에탄올로 클로로필 a를 추출한 결과를 보여주는 HPLC 분석 결 과이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 2i는 다이옥산을 이용하는 클로로필 a의 제조방법에 따라 제조된 클로로필 a에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 3a는 본 발명에 따라 형성된 페오피틴(pheophytin) a에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 페오피틴 a에 해당하는 피크이다.
도 3b는 본 발명의 프로토콜 A에 따라 제조된 클로린 e6에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로린 e6에 해당하는 피크이다.
도 3c는 본 발명의 프로토콜 B에 따라 제조된 클로린 e6에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로린 e6에 해당하는 피크이다.
본 발명은 클로로필 a 및 클로린 e6의 제조방법에 관한 것이다.
클로린 e6는 암의 광역학 치료(photodynamic therapy)에 이용되는 광민감성 물질이다.
미국특허 제5,330,741호는 클로린 e6를 제조하는 방법을 개시한다. 이 특허의 방법에 따르면, 바이오매스를 클로로필 a를 추출하기 위하여 아세톤으로 2-3 차례 처리한다. 이어, 바이오매스를 여과 또는 원심분리하고, 추출물을 증발시키 고, 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하고 프탈릴 에스테르기를 가수분해하기 위하여 산으로 처리한다. 동시에 에스테르화하기 위하여 메틸 알콜을 첨가하고, 반응 매스(reaction mass)를 물로 처리하고, 페오포비드α 유도체를 클로로메틸렌으로 추출하고, 추출물을 중화하고, 물로 세정하고, 증발시키고, 알루미나 상에서 크로마토그래피한다. 이어, 메틸페오포비드 α를 클로로메틸렌과 메탄올의 혼합물로부터 결정화하고, 얻어진 페오포비드 α 유도체를 산소가 존재하는 피리딘-디에틸에테르-n-프로판올 내에서 강한 무기 염기와 반응시키고, 반응 매스를 물로 처리한다. 수층을 pH 4가 될 때까지 산성화하고, 불안정한 클로린을 클로로메틸렌으로 추출하고, 추출물을 증발시키고, 불안정한 클로린을 테트라하이드로퓨란에 다시 용해시키고, 용액을 증발시키고, 이러한 절차를 700 nm에서의 흡광도 증가가 멈출 때까지 반복한다. 얻어진 퍼퓨린(purpurine) 18을 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, 디아조메탄으로 에스테르화하고, 퍼퓨린 18 메틸 에스테르를 피리딘 존재 하에서 클로로메틸렌 중의 리신 수용액과 혼합하고, 혼합물을 실온에서 12 시간 동안 교반한다. 용매를 고 진공 상태에서 제거한 다음, 얻어진 조(crude) 생성물을 역상 고성능액체 크로마토그리피(HPLC)로 정제하고, 용매를 동결건조(lyophilisation)로 제거한다. PS를 PDT용 주사액(injection solution)을 얻기 위하여 포스페이트 완충 용액에 용해시키고, 0.1 N NaOH 용액을 첨가하고, pH를 0.1 N HCl를 사용하여 생리적 값인 pH 7.35로 조절하고, 용액을 미세 기공 필터를 통과시켜 여과한다.
그러나 상기 방법은 낮은 재현성, 수고스러움(고진공, 결정화, 칼럼 크로마 토그래피 및 HPLC의 사용, 리신과의 오랜 반응시간) 및 독성이 높고 가연성인 시약(디아조메탄, 피리딘, 메탄올, 테트라하이드로퓨란, 디에틸 에테르)을 사용하는 문제점이 있으며, 결국 의약 또는 식품 산업 분야에 부적합하게 한다.
대한민국 특허출원 공개 제2004-0025911호의 방법에 따르면, 스피룰리나 바이오매스를 클로로필 a가 완전히 추출될 때까지 아세톤으로 처리하고, 바이오매스를 여과하거나 또는 원심분리한다. 추출물을 클로로필 분자로부터 마그네슘 이온을 제거하기 위하여 산으로 처리하고, 추출물을 중화하고, 침전된 페오파이틴 a를 여과한 다음, 조 페오파이틴 1 g에 대하여 6-16 ml의 아세톤, 0.6-6 ml의 헥산 및 5-10 ml의 진한 염산으로 구성된 염산-아세톤-헥산 혼합물을 사용하여 페오파이틴 a를 가수분해한다. 이어, 혼합물을 40-60℃ 로 가열하면서 20분-1시간 동안 교반한 다음, 헥산 (6-16ml)을 가하고, 유기층을 아세톤과 염산의 혼합물 (2-10 : 1)로 세정하고, 수층을 헥산으로 세정한 다음, 페오포비드 a를 여과하고, 물로 세정하고, 아세톤- 물 혼합물로 재결정하고, 무게가 일정하게 될 때까지 공기 중에서 건조한다. 그 다음, 페오포비드 a를 아세톤에 용해시키고, 0.05-1.00% 농도의 무기 강염기 수용액을 가하고, 30-60℃에서 5-30분 동안 교반하고, 1-50% 농도의 무기 감염기 수용액을 추가로 가한다음, 혼합물을 40-60℃에서 20-90분 동안 가열하고, 묽은 염산으로 중화하고, 클로린 e6 침전을 원심분리하고, 산 반응이 사라질 때까지 증류수로 세정하여, 55-80% 클로린 e6를 얻는다.
상기 방법도 과정이 복잡하고, 식품 및 의약에 적용할 수 없는 시약을 사용하는 문제점이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 녹조류에 속하는 클로렐라로부터 높은 수율로 클로린(chlorin) e6를 제조하면서도, 비교적 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 클로린 e6를 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 클로렐라의 독특한 전처리 과정 등의 효율적인 제조 프로토콜을 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 클로로필 a의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 클로린 e6의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 클 로렐라에 유기용매를 처리하는 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 효율적으로 클로린 e6를 제조하기 위하여, 우선 클로로필 a를 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 하였고, 이러한 목적을 위하여 출발물질로서 적합한 클로렐라를 선별하였다.
종래의 통상적인 방법에 따르면 클로렐라로부터 클로로필 a를 추출하는 경우, 클로렐라 세포를 우선 파쇄하고 이 파쇄물(cell lysate)로부터 클로로필 a를 추출하였다. 그러나 본 발명자들은 종래의 이러한 통념에서 벗어나서 파쇄 되지 않은 인택트 클로렐라를 이용하여 매우 높은 수율로 클로로필 a를 제조하는 데 성공하였다. 이러한 성공적인 클로로필 a의 추출은 종래 기술들을 고려하면, 예기치 않은 것으로서, 매우 놀라운 결과이다.
본 명세서에서, 용어 “인택트 클로렐라”는 파쇄하지 않은 클로렐라를 의미한다. 용어 “인택트 클로렐라”는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용어 “생클로렐라(live chlorella)”와 동일한 의미를 갖는다. 통상적으로 세포 내에 있는 물질을 추출 또는 분리하는 경우, 세포 파쇄 과정(예컨대, 초음파 분쇄)이 반드시 수반된다. 그러나 본 발명에서는 파쇄 되지 않은 클로렐라 자체를 이용한다.
이와 같이 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하면, 클로로필 a의 추출 효율도 우수할 뿐만 아니라, 세포 파쇄 과정에서 발생되는 클로로필 a의 산화 등과 같은 문제점도 막을 수 있다.
본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 유기 용매는 당업계에 공지된 다양한 유기 용매를 포함한다. 예를 들어, (ⅰ) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (ⅱ) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (ⅲ) 아세톤, (ⅳ) 에틸 아세테이트, (ⅴ) 클로로포름, (ⅵ) 부틸아세테이트, (ⅶ) 1,3-부틸렌글리콜, (ⅷ) 헥산 및 (ⅸ) 디에틸에테르가 유기 용매로 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 유기용매는 메탄올 또는 에탄올이며, 보다 바람직하게는 에탄올이다.
본 발명에서 이용되는 클로렐라로는 통상적인 어떠한 클로렐라도 가능하며, 바람직하게는 해수 클로렐라이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 클로렐라는 Chlorella ellipsoidea , Chlorella minutissima , Chlorella vulgaris , Chlorella fusca , Chlorella zofingiensis , Chlorella stigmataphora , Chlorella vulgaris 또는 Chlorella pyrenoidosa이며, 가장 바람직하게는, Chlorella ellipsoidea이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법을 제공한다: (a) 클로렐라에 30-80% 에탄올을 처리하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계; 및 (b) 상기 클로렐라에 90-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 클로 로필 a의 제조방법을 제공한다: (a) 클로렐라에 80-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및 (b) 상기 추출액에 다이옥산을 첨가하여 클로로필 a의 침전을 유도하는 단계.
본 발명자들은 클로린 e6의 전구물질로서 클로로필 a를 클로렐라로부터 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 높은 수율 및 정제도로 클로로필 a를 제조할 수 있는 두 가지 프로토콜을 개발하였다.
클로로필 a-프로토콜 A
클로로필 a-프로토콜 A는 상대적 저농도의 에탄올을 이용하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하고, 상대적 고농도의 에탄올을 이용하여 클로로필 a를 추출하는 과정으로 이루어져 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 클로렐라는 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포이다. 본 발명에서, 음파파쇄(sonication) 등으로 파쇄되지 않은 것으로서, 클로렐라 세포 그 자체를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. 일반적으로는, 세포 파쇄물(cell lysate)에 유기용매를 처리하여 클로로필 a를 추출하는 데, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용한다. 이와 같이 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하면, 클로로필 a의 추출 효율도 우수할 뿐만 아니라, 세포 파쇄 과정에서 발생되는 클로로필 a의 산화 등과 같은 문제점도 막을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 클로렐라는 해 수 클로렐라이며, 보다 바람직하게는, Chlorella ellipsoidea , Chlorella minutissima , Chlorella vulgaris , Chlorella fusca , Chlorella zofingiensis , Chlorella stigmataphora, Chlorella vulgaris 또는 Chlorella pyrenoidosa이며, 가장 바람직하게는, Chlorella ellipsoidea이다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 클로렐라로부터 클로로필 a를 추출하기 전에 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 제거하는 전처리 과정을 실시하는 것이다. 이러한 전처리 과정은, 높은 순도(함량비율)로 클로로필 a를 추출할 수 있도록 한다.
상기 불순물 제거 과정은 클로렐라에 30-80% 에탄올을 처리하여 실시된다. 에탄올을 이용한 이유는, 첫째 에탄올이 불순물을 제거하는 데 가장 우수한 효율을 나타내기 때문이며, 두 번째, 최종적으로 제조되는 클로린 e6가 식품으로 이용될 것을 예상하면 인체에 무해한 에탄올을 이용하는 것이 바람직하기 때문이다. 상기 과정에서 이용되는 에탄올은 30-80%의 농도를 갖는다. 만일 30% 미만의 에탄올을 이용하면, 불순물 제거 효율이 너무 낮아지며, 80% 초과의 에탄올을 이용하면 불순물 이외의 클로로필 a도 제거되어, 클로로필 a 추출 효율이 크게 감소되는 문제점이 있다.
바람직하게는, 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 30-68%, 보다 바람직하게는 50-65%, 보다 더 바람직하게는 58-62%, 가장 바람직하게는 약 60%이다.
단계 (a)는 최소 1회 실시하며, 바람직하게는 2-7회, 보다 바람직하게는 3-6회, 가장 바람직하게는 5-6회 실시한다. 단계 (a)를 반복적으로 실시하는 경우, 예컨대, 클로렐라를 에탄올에 현탁시키고 원심분리하여 클로렐라를 침전시키는 방식으로 클로렐라의 불순물을 제거한다.
상기 불순물을 제거하기 위한 전처리 과정을 거친 클로렐라에 90-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득한다. 이 과정에서, 에탄올의 농도가 90% 미만이면, 추출효율이 크게 감소되는 문제점이 있다.
바람직하게는, 단계 (b)에서의 에탄올의 농도는 95-100%, 보다 바람직하게는 98-100%, 가장 바람직하게는 약 100%이다.
프로토콜 A의 클로로필 a의 제조방법의 클로로필 a에 대한 수율은 5-15%, 바람직하게는 6-12%, 보다 바람직하게는 7-9%이다. 수율은 사용된 클로렐라의 건조 중량 1 g에 대한 수득한 클로로필 a의 중량비의 백분율로 계산된다.
프로토콜 A의 클로로필 a 정제도는 70-90%, 바람직하게는 70-85%, 보다 바람직하게는 72-80%이다.
클로로필 a-프로토콜 B
클로로필 a-프로토콜 B는 고농도의 에탄올 및 다이옥산을 이용하는 방법으로서, 이 프로토콜레 따르면 상술한 프로토콜 A에서의 불순물 제거 과정이 생략되어 간단한 공정을 통하여 높은 수율로 클로로필 a를 제조할 수 있다.
클로로필 a-프로토콜 B에 이용되는 클로렐라에 대한 내용은 상술한 프로토콜 A와 동일하다.
클로로필 a-프로토콜 B의 첫 번째 단계는 80-100% 에탄올을 이용하여 클로렐 라로부터 클로로필 a를 추출하는 단계이다. 이 과정에서, 에탄올의 농도가 80% 미만이면, 추출효율이 크게 감소되는 문제점이 있다. 바람직하게는, 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 90-100%, 보다 바람직하게는 98-100%, 가장 바람직하게는 약 100%이다.
클로로필 a-프로토콜 B의 두 번째 단계는 다이옥산을 이용하여 클로로필 a를 침전시키는 단계이다. 이 단계를 통하여, 클로로필 a를 침전시켜 고상의 클로로필 a를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 클로로필 a의 정제도를 높일 수 있다. 사용되는 다이옥산의 양은 특별히 제한되지 않으나, 클로로필 a 추출액 1 L에 대하여 바람직하게는 50-250 ml, 보다 바람직하게는 100-200 ml, 가장 바람직하게는 120-160 ml을 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우 사용되는 다이옥산은 100%의 다이옥산이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 다이옥산을 첨가한 다음 추가적으로 물을 추출액에 첨가한다. 물의 사용량은 특별히 제한되지 않으나, 클로로필 a 추출액 1 L에 대하여 바람직하게는 50-250 ml, 보다 바람직하게는 100-200 ml, 가장 바람직하게는 120-160 ml을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b) 이후에 단계 (b)의 반응물을 -10℃ 이하에서 저온 처리하여 클로로필 a의 침전이 더 잘 되도록 한다. 보다 바람직하게는, -15℃ - -30℃, 가장 바람직하게는 -18℃ - -25℃에서 저온 처리한다.
프로토콜 B의 클로로필 a의 제조방법의 클로로필 a에 대한 수율은 3-15%, 바람직하게는 4-10%, 보다 바람직하게는 4-6%이다. 프로토콜 B의 클로로필 a 정제 도는 70-98%, 바람직하게는 75-95%, 보다 바람직하게는 80-90%이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 클로린 e6의 제조방법을 제공한다: (a) 상술한 방법에 의해 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 페오피틴 a에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단계.
본 발명자들은 녹조류에 속하는 클로렐라로부터 높은 수율로 클로린(chlorin) e6를 제조하면서도, 비교적 간단한 공정으로 대량생산에 적합한 방식으로 클로린 e6를 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 연구하였고, 그 결과 효율적인 제조 과정을 개발하였다.
본 발명의 클로린 e6의 제조방법은 상술한 두 가지 클로로필 a 제조 방법에 의해 수득한 클로로필 a를 이용하여 클로린 e6를 제조하는 과정이다.
보다 상세하게는, 클로로필 a-프로토콜 A에 의해 제조된 클로로필 a를 출발물질로 하는 경우, 본 발명의 방법은 (a) 클로렐라에 30-68% 에탄올을 처리하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계; (b) 상기 클로렐라에 80-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득하는 단계; (c) 상기 클로로필 a 추출액에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 페오피틴 a에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단계를 포함한다.
보다 상세하게는, 클로로필 a-프로토콜 B에 의해 제조된 클로로필 a를 출발 물질로 하는 경우, 본 발명의 방법은 (a) 클로렐라에 80-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하는 단계; (b) 상기 추출액에 다이옥산을 첨가하여 클로로필 a의 침전을 유도하는 단계; (c) 상기 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 페오피틴 a에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단계를 포함한다.
한편, 본 발명의 클로린 e6의 제조방법은 기본적으로 산을 이용한 페오피틴 a의 제조단계 및 염기를 이용한 클로린 e6의 제조단계를 포함하지만, 보다 구체적으로는 크게 두 가지 프로토콜로 나눌 수 있다.
클로린 e6 -프로토콜 A
클로린 e6-프로토콜 A는 페오피틴 a로부터 클로린 e6를 제조함에 있어서 에탄올 용매 하에서 실시하는 것을 특징으로 한다.
클로린 e6-프로토콜 A에 따르면, 클로로필 a 추출액에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득한다. 클로로필 a 및 페오피틴 a의 화학식은 하기 화학식 1 및 2와 같다:
Figure 112007033211876-PAT00001
Figure 112007033211876-PAT00002
클로로필 a에 산을 처리하면 화학식 1로부터 마그네슘 이온이 제거되어 페오피틴(pheophytin) a가 제조된다. 바람직하게는, 단계 (a)는 클로로필 a 추출물에 산을 처리하여 클로로필 a 추출액의 pH를 1-5가 되도록 조정하여 실시된다. 이 경우, pH 5를 초과하면 마그네슘 이온 제거율이 크게 감소되는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는, 단계 (a)에서의 반응물의 pH는 1-3이며, 가장 바람직하게는 2-3이다.
단계 (a)에서 이용되는 산으로는 당업계에 공지된 다양한 산을 이용할 수 있 으며, 바람직하게는 무기산, 보다 바람직하게는 황산 및 염산이며, 가장 바람직하게는 염산이다.
상기 과정에서 제조된 상기 페오피틴 a에 염기를 처리하여 최종적으로 화학식 3의 클로린 e6를 얻는다.
Figure 112007033211876-PAT00003
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)는 페오피틴 a에 염기성 용액을 처리하여 pH 11-16, 보다 바람직하게는 pH 13-14가 되도록 조정하여 실시한다. 단계 (b)에서 이용되는 염기로는, 당업계에 공지된 다양한 염기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 무기 염기이고, 가장 바람직하게는 NaOH이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b), 즉 클로린 e6를 수득하는 단계는 에탄올 용매 하에서 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (a)의 반응 결과물을 냉동실에 보관하여 침전을 유도한다.
페오피틴 a는 통상적으로 침전물 형태로 수득하게 된다. 에탄올 용매를 이 용하여 클로린 e6를 제조하는 경우, 페오피틴 a 침전물은 에탄올 용매에 직접적으로 잘 용해되지 않는다. 따라서, 페오피틴 a 침전물을 에탄올 용매에 용해하기 전에 페오피틴 a 침전물을 아세톤으로 용해하는 것이 바람직하다. 이어, 아세톤 용해물에서 아세톤을 제거(예컨대, 증발에 의해)한 다음 페오피틴 a에 에탄올을 첨가하여 페오피틴 a를 용해하고, 이어 염기와 반응시켜 클로린 e6를 제조한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 클로린 e6-프로토콜 A는 다음의 단계를 포함한다: (a) 상술한 방법에 의해 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a 침전물을 수득하는 단계; (b-1) 페오피틴 a 침전물에 아세톤 용매를 첨가하여 페오피틴 a 용액을 얻고 이어 아세톤 용매를 제거하는 단계; (b-2) 잔존의 페오피틴 a에 에탄올을 첨가하여 페오피틴 a 용액을 얻는 단계; 및 (b-3) 상기 페오피틴 a 용액에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b) 이후에 단계 (b)의 반응 결과물을 중화시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 이 경우, 다양한 염기를 이용하여 중화시킬 수 있으며, 예를 들어 HCl을 이용하여 중화시킬 수 있다.
클로린 e6를 제조한 다음, 적합한 염 형태를 갖도록 클로린 e6를 염으로 처리할 수 있다. 예컨대, NaHCO3 또는 NH4CO3와 같은 염을 처리하여, 클로린 e6의 -COOH 그룹에 소듐 또는 암모늄이 결합된 클로린 e6의 염을 얻을 수 있다.
클로린 e6-프로토콜 A의 클로린 e6에 대한 정제도는 80-99%, 바람직하게는 85-99%, 보다 바람직하게는 93-98%이다. 클로린 e6에 대한 수율은 클로렐라를 출발물질로 하는 경우, 3-10%, 바람직하게는 3-8%, 보다 바람직하게는 4-6%이다. 수율은 사용된 클로렐라의 건조 중량 1 g에 대한 수득한 클로린 e6의 중량비의 백분율로 계산된다.
클로린 e6 -프로토콜 B
클로린 e6-프로토콜 B는 페오피틴 a로부터 클로린 e6를 제조함에 있어서 아세톤 용매 하에서 실시하는 것을 특징으로 한다.
클로린 e6-프로토콜 B에서 단계 (a)에 대한 설명은 클로린 e6-프로토콜 A와 동일하다. 또한, 클로린 e6-프로토콜 B에서 단계 (b)도, 아세톤 용매 하에서 페오피틴 a에 염기를 처리한다는 것만 제외하고는 기본적으로 클로린 e6-프로토콜 A와 동일하다.
클로린 e6-프로토콜 B에 따르면, 단계 (a)에서 형성된 페오피틴 a 침전물을 아세톤 용매에 용해한 다음, 이 페오피틴 a 용액에 직접 염기를 처리하여 클로린 e6를 제조한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 클로린 e6-프로토콜 B는 다음의 단계를 포함한다: (a) 상술한 방법에 의해 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a 침전물을 수득하는 단계; (b-1) 페오피틴 a 침전물에 아세톤 용매를 첨가하여 페오피틴 a 용액을 얻는 단계; 및 (b-2) 상기 페오피틴 a 용액에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단 계.
클로린 e6-프로토콜 B에 따르면, 염기로서 NaOH를 이용하면 최종적으로 제조되는 클로린 e6가 소듐 염 형태를 갖게 된다. 클로린 e6-프로토콜 A에 따르면, 클로린 e6의 염을 얻기 위하여 별도의 처리를 하여야 하지만, 프로토콜 B는 이러한 과정이 생략될 수 있다.
클로린 e6-프로토콜 B는 프로토콜 A보다 단축된 공정을 통하여 효율적으로 클로린 e6를 제조한다. 또한, 클로린 e6-프로토콜 B는 프로토콜 A보다 단축된 공정으로 이루어져 있지만, 최종적으로 제조된 클로린 e6의 정제도는 프로토콜 A보다 크다.
클로린 e6-프로토콜 B의 클로린 e6에 대한 정제도는 90-99.99%, 바람직하게는 92-99.95%, 보다 바람직하게는 95-99.90%, 가장 바람직하게는 99.0-99.90%이다. 클로린 e6에 대한 수율은 클로렐라를 출발물질로 하는 경우, 2-8%, 바람직하게는 3-8%, 보다 바람직하게는 3-5%이다.
본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하여 클로로필 a를 추출하고 이로부터 클로린 e6를 제조한다.
(ⅱ) 본 발명에서 채택하고 있는 클로렐라 세포의 전처리 과정에 의해 높은 함량 비율의 클로로필 a를 얻을 수 있으며, 이로부터 높은 수율로 클로린 e6를 제조한다.
(ⅲ) 본 발명의 방법은 비교적 간단한 공정에 따라 실시되며, 클로린 e6의 대량생산에 적합하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 출발물질로서 적합한 클로렐라의 선택
최종적으로 클로린 e6을 얻기 위한 출발물질로서, 초음파 분쇄 클로렐라 및 초음파 분쇄 하지 않은 인택트(intact) 클로렐라[해수 클로렐라, 클로렐라 엘립소이데(Chlorella ellipsoidea), (주)클로랜드] 2개의 시료를 준비 하였다. 이어, 초음파 분쇄 클로렐라 및 인택트 클로렐라의 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. 초음파 분쇄 클로렐라 및 해수 클로렐라 각각 10 g을 취하여 에탄올을 100 ml를 첨가하여 30분, 1시간 30분, 3시간 및 12시간 동안 교반시킨 후 여과하여 추출용액을 얻었다. 추출용액에 대하여 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석을 하였고, HPLC는 SPD-M10AVP 컬럼이 장착된 동일시마즈 HPLC 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다. 레퍼런스(reference)로는, Fluka 회사의 클로로필 a를 사용하 였다. 도 1a-1f에서, 머무름시간(retention time) 약 19.5분에 해당하는 피크가 클로로필 a에 해당하는 것이다.
도 1a-1f에서 볼 수 있듯이, 인택트 클로렐라를 이용하는 경우, 초음파 분쇄된 클로렐라를 이용하는 경우보다 약 20배 정도의 클로로필 a를 얻을 수 있다. 따라서 초음파 분쇄된 클로렐라보다는 인택트 클로렐라를 이용하는 것이, 클로로필 a 수율을 높이며, 결국 보다 많은 클로린 e6를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 클로렐라를 초음파분쇄하여 얻은 분쇄물을 이용한 에탄올 추출보다는 클로렐라 자체를 이용한 에탄올 추출이 클로로필 a 추출 효율이 더 우수하다는 놀라운 사실을 발견하였다. 이러한 신규 발견은, 클로로필 정제 과정을 단축할 수 있는 이점을 제공할 뿐만 아니라, 초음파파쇄 과정에서 클로로필 a가 산화되는 문제점을 회피할 수 있기 때문에 매우 중요한 것이다.
실시예 2: 클로렐라로부터 클로로필 a의 수득
프로토콜 A
A-1: 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 불순물의 제거
(주)클로랜드에서 구입한 해수 클로렐라(Chlorella ellipsoidea)에서 우선 염분을 제거하기 위하여, 증류수로 세척한 다음 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켰다. 이어, 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하였다. 증류수에 의한 세척 과정을 총 5회 실시한 다음, 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마 나 함유되어 있는 지 확인하였다. HPLC는 SPD-M10AVP 컬럼이 장착된 동일시마즈 HPLC 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다. 레퍼런스(reference)로는, Fluka 회사의 클로로필 a를 사용하였다. HPLC 결과는 도 2a에 나타나 있다.
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 머무름시간(retention time) 약 9.7 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰이 되었고, 머무름시간 2.5-7.5 min에서 다른 여러 성분에 해당되는 피크가 관찰되었다.
해수가 제거된 클로렐라(파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체) 100 g에 60% 에탄올 300 ml을 첨가하여 세척하고, 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켜, 머무름시간 2.5-7.5 min에 있는 불순물을 제거하였다. 이와 같은 에탄올 세척 과정을 총 6회 반복 실시하였다. 도 2b-도 2g는 에탄올 세척 과정에서 원심분리한 후 형성된 상층액에 대한 HPLC 결과이다.
도 2b-도 2g에서 확인할 수 있듯이, 머무름시간 2.5-7.5 min에서 나타나는 불순물들이 60% 에탄올 세척 과정에서 다량 제거되고 있음을 알 수 있다.
한편, 80% 이상의 농도의 에탄올을 이용하여 세척 과정을 실시하면, 클로로필 a가 추출되어 세척, 즉 불순물의 제거를 할 수 없었다. 또한, 20%, 40% 및 50% 농도의 에탄올을 이용하여 세척 과정을 실시하였는데, 불순물의 제거가 60% 에탄올보다는 잘 되지 않았다.
따라서, 60% 에탄올이 가장 바람직한 세척 용액이라는 것을 알 수 있다. 즉, 60% 에탄올은 클로렐라로부터 클로로필 a를 추출시키지 않으면서도 클로렐라 세포에 포함되어 있는 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 효과적으로 추출하여, 세척된 클로렐라에 클로로필 a가 상대적으로 높은 함량으로 포함되도록 한다.
A-2: 불순물이 제거된 클로렐라로부터 클로로필 a의 추출 I
상기 불순물이 제거된 클로렐라 100 g에 100% 에탄올 1 L을 첨가하고, 3시간 동안 교반하여 클로로필 a를 추출하였다. 추출과정에서 이용된 클로렐라는 음파파쇄(sonication) 등으로 파쇄되지 않은 것으로서, 클로렐라 세포 그 자체를 이용하여 추출을 하였다. 일반적으로는, 세포 파쇄물(cell lysate)에 유기용매를 처리하여 클로로필 a를 추출하는 데, 본 실시예에서는 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하였다. 추출 결과는 도 2h에 나타나 있다.
도 2h에서 볼 수 있듯이, 머무름시간(retention time) 약 8.4 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰이 되었고, 도 2a에서 관찰되었던 머무름시간 2.5-7.5 min의 불순물들이 상당량 제거되었음을 알 수 있었다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 함량(즉, 정제도)이 76.92%임을 확인할 수 있었다. 한편, 프로토톨 A의 클로로필 a에 대한 수율은 7.89% 이었다.
프로토콜 B
(주)클로랜드에서 구입한 해수 클로렐라에서 우선 염분을 제거하기 위하여, 증류수로 세척한 다음 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켰다. 이어, 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하였다. 증류수에 의한 세척 과정을 총 5회 실시한 다음, 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는 지 확인하였다. HPLC는 SPD-M10AVP 컬럼이 장착된 동일시마즈 HPLC 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다. 레퍼런스(reference)로는, Fluka 회사의 클로로필 a를 사용하였다. 해수가 제거된 클로렐라(파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체) 100 g에 100% 에탄올 500 ml를 첨가하여 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시키고, 상등액 클로로필 추출용액만 여과하였다. 상기 클로로필 추출물에 다이옥산(dioxane) 70 ml 및 증류수 70 ml를 첨가한 후 5시간 이상 -20℃ 냉동실에 보관하여 침전을 유도하였다. 이어, 침전물을 여과하고 물로 세척하여 클로로필 a를 수득하였다. 이어, 하기의 클로린 e6 제조를 위하여, 100% 에탄올에 상기 침전물을 용해시켰다.
도 2i에서 확인할 수 있듯이, 머무름 시간 약 4.3분에서 클로로필 a에 해당하는 주피크가 관찰이 되었고, 다른 피크는 거의 생성되지 않았다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 함량(즉, 정제도)이 84.93%임을 확인할 수 있었다. 한편, 프로토톨 B의 클로로필 a에 대한 수율은 4.26% 이었다.
실험 결과, 다이옥산을 이용하는 경우에는, 보다 단축된 공정을 통하여 높은 수율로 클로로필 a를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 클로로필 a로부터 클로린 e6 의 제조
실시예 3-1: 페오피틴 ( pheophytin ) a의 생성
실시예 2의 프로토콜 A에서 얻은 클로로필 a를 포함하는 에탄올 추출물 1 L 당 5-10 ml의 1 N HCl을 처리하여 추출물의 pH를 2-3이 되도록 조정하고, 3시간 동안 교반하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써, 페오피틴(pheophytin) a를 수득하였다(도 3a). 이어, 검은색의 페오피틴 a 용액을 -23℃ 냉동실에 3-6시간 보관하여 침전이 형성되게 하고, 여과하였다.
실시예 3-2: 클로린 e6 의 생성
프로토콜 A
상기 실시예 3-1의 페오피틴 a 침전물을 아세톤으로 녹여낸 후 아세톤을 증발(evaporation)으로 제거하였다. 이어, 100% 에탄올 1 L에 페오피틴 a를 용해하고, 여기에 1 N NaOH 5-10 ml을 첨가하여 페오피틴 a 용액를 포함하는 여과액의 pH를 13-14로 조정하고, 12시간 동안 교반시켜 페오피틴 a로부터 클로린 e6를 형성시켰다. 그런 다음, 반응 결과물에 1 N HCl을 첨가하여 중화시키고, 여과를 한 후 에탄올을 완전히 제거하였다(도 3b). 도 3b의 그래프에서 확인할 수 있듯이, 머무름 시간 약 4.987분에서 클로린 e6에 해당하는 피크가 관찰되었고, 클로린 e6의 함량(정제도)은 97.66% 이었다.
최종적으로 클로렐라 1000 g으로부터 48.6 g의 클로린 e6를 수득하였다(수율: 4.86%).
또한, 클로린 e6의 염 형태를 제조하기 위하여, NaHCO3 또는 NH4HCO3 3 당량을 얼음물에 용해한 다음 클로린 e6에 첨가하고, 물을 여과한 후 동결건조를 하여 염 형태의 클로린 e6를 제조하였다.
프로토콜 B
상기 실시예 3-1의 페오피틴 a 침전물을 1 L의 아세톤에 녹인 후 1 N NaOH 수용액 5-10 ml을 가하여 pH를 13-14로 조정하고, 12시간 동안 교반하여, 페오피틴 a로부터 클로린 e6를 형성시켰다. 생성된 클로린 e6의 Na 염의 침전물을 여과한 후 아세톤 및 헥산으로 순차적으로 세척한 후, 소량의 물에 용해시키고 수용성 막 필터를 이용하여 클로린 e6 용액을 여과한 후 동결건조 하여 최종 클로린 e6 Na 염을 수득하였다(도 3c). 최종 클로린 e6 Na 염은 분말 형태를 나타내었다. 최종 Na 염 클로린 e6 의 수율은 클로렐라 10 L 처리 시(원심분리 후 1-1.5 kg), 25-30 g 으로 2.5-3.0%이다. 또한, 클로로 e6에 대한 정제도는 99.83%이었다.
프로토콜 B에 따르면, NaOH 처리에 의한 클로린 e6의 생성 과정에 의해 클로린 e6의 Na 염이 직접 형성된다. 이러한 측면도 프로토콜 A와 크게 차이가 있는 것이다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 파쇄 되지 않은 클로렐라 세 포 자체를 이용하여 클로로필 a를 추출하고 이로부터 클로린 e6를 제조하며, 본 발명에서 채택하고 있는 클로렐라 세포의 전처리 과정에 의해 높은 함량 비율의 클로로필 a를 얻을 수 있으며, 이로부터 높은 수율로 클로린 e6를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 비교적 간단한 공정에 따라 실시되며, 클로린 e6의 대량생산에 적합하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (28)

  1. 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 클로렐라에 유기용매를 처리하는 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 클로렐라는 해수 클로렐라인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 다음의 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법:
    (a) 클로렐라에 30-80% 에탄올을 처리하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계; 및
    (b) 상기 클로렐라에 90-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득하는 단계.
  5. 다음의 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법:
    (a) 클로렐라에 80-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및
    (b) 상기 추출액에 다이옥산을 첨가하여 클로로필 a의 침전을 유도하는 단계.
  6. 다음의 단계를 포함하는 클로린 e6의 제조방법:
    (a) 상기 제 4 항 또는 제 5 항에 의해 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 페오피틴 a에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단계.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 클로렐라는 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 클로렐라는 해수 클로렐라인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 50-65%인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 58-62%인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 3-6회 반복 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 에탄올의 농도는 98-100%인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 90-100%인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 98-100%인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 다이옥산을 첨가한 다음 추가적으로 물을 추출액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 이후에 단계 (b)의 반응물을 -10℃ 이하에서 저온 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 4 항에 있어서, 상기 방법의 클로로필 a에 대한 수율은 7-9%이고, 정제도는 72-80%인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 5 항에 있어서, 상기 방법의 클로로필 a에 대한 수율은 4-6%이고, 정제도는 80-90%인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 클로로필 a 추출액에 산을 처리하여 클로로필 a 추출액의 pH를 1-5가 되도록 조정하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 pH는 1-3인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 페오피틴 a에 염기성 용액을 처리하여 pH 11-16이 되도록 조정하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 pH는 13-14인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에 단계 (b)의 반응 결과물을 중화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 에탄올 용매 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 6 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 아세톤 용매 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 방법은 (a) 상기 제 4 항 또는 제 5 항에 의해 수득한 클로로필 a에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a 침전물을 수득하는 단계; (b-1) 페오피틴 a 침전물에 아세톤 용매를 첨가하여 페오피틴 a 용액을 얻는 단계; 및 (b-2) 상기 페오피틴 a 용액에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 방법의 클로린 e6에 대한 정제도는 93-98%이고, 클로린 e6에 대한 수율은 4-6%인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 방법의 클로린 e6에 대한 정제도는 95-99.9%이고, 클로린 e6에 대한 수율은 3-5%인 것을 특징으로 하는 방법.
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