KR101180695B1

KR101180695B1 - 클로로필 추출물로부터 고순도 클로로필과 클로린 ｅ6의 제조방법

Info

Publication number: KR101180695B1
Application number: KR20100079485A
Authority: KR
Inventors: 김준; 이환석
Original assignee: 동성루맥스 주식회사
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2012-09-10
Also published as: KR20120021798A

Abstract

본 발명은 클로로필 추출물로부터 고순도 클로로필과 클로린 e6의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 클로로필을 함유하는 녹색식물이나 미세조류로부터 특정의 용매 및 조건에서 추출 및 정제하는 고순도 클로로필의 수득단계를 포함하는 고순도 클로로필의 제조방법과, 상기 클로로필을 산으로 처리하여 페오피틴으로 전환하는 단계, 및 페오피틴을 염기 존재하에서 가온 조건으로 이분자 친핵성 치환반응(SN2)을 수행하여 클로로 e6로 전환하는 단계를 포함하여 이루어지는 클로린 e6의 제조방법에 관한 것이다.

Description

클로로필 추출물로부터 고순도 클로로필과 클로린 ｅ6의 제조방법{Methods for Preparing high purity chlorophyll and Chlorin e6 from Chlorophyll extracts}

본 발명은 클로로필 추출물로부터 고순도 클로로필과 클로린 e6을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

클로로필(Chlorophyll)는 녹색식물의 잎이나 미세조류 등에 들어있는 화합물이다. 이러한 클로로필은 타원형의 구조물인 엽록체에 많이 들어 있는 녹색 색소로, 탄소동화작용에 중요한 역할을 하고 있다. 클로로필은 그 화학구조적 차이에 의해 클로로필 a, b, c, d, e와 박테리오 클로로필 a, b 등으로 구분하여 명명되고 있다. 이들 클로로필은 공통적으로 한 분자내에 하나의 마그네슘(Mg) 원자를 포함하고, 4개의 피롤이 메탄기에 의해 결합된 고리모양의 테트라피롤에 시클로펜탄고리가 연결되어 있는 포르빈 유도체이다. 이러한 클로로필의 분자구조가 헤모글로빈의 분자구조와 거의 비슷하여 일명 '푸른 혈액'이라고 불리며, 실제로 동물의 혈액과 비슷한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.

한편, 클로린 e6는 악성종양의 광역적 치료(PDT; PhotoDynamic Therapy)에 이용되어지는 광민감제로 잘 알려져 있다. 광민감제는 종양조직과 정상조직에 있어 종양조직에만 선택적으로 축적되는 특성 즉, 선택성(selectivity)이 요구된다. 선택성이 높은 광민감제는 PDT의 효능이 높아져 치료시간을 단축시킬 수 있으며, 체내에 주입된 약물의 부작용도 줄일 수 있게 된다. 광민감제에 특정 파장의 빛을 조사하여 활성화시키면 활성산소의 일종인 일중항산소(singlet oxygen)와 라디칼 종(radical species)을 발생시키게 되는데, 이를 통해 직접적으로 종양세포를 죽이고, 면역염증반응을 일으키거나 종양의 미소혈관계에 손상을 입히기도 한다. 종래 광민감제들은 대부분이 종양에 일정 정도는 선택적으로 축적되지만, 피부를 포함한 정상조직에도 일부 축적되는 것으로 알려져 왔다. 그러나, 클로린 e6는 종양치료에 사용되는 다른 광민감제들과 비교하여 악성세포에 대한 높은 선택성을 가지면서 정상적인 세포에는 독성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다.

현재까지 보고된 다수의 특허 및 논문에는 클로로필로부터 클로린 e6를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

대한민국 등록 특허 제628548호에는 스피루리나 바이오매스에서 클로로필 추출, 산 처리, 중화, 가수분해, 페오포비드 a의 추출, 아세톤에의 용해, 강염기 첨가, 중화, 및 재침전 등의 복잡한 과정을 통해 클로린 e6를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 오랜 반응시간과 복잡한 반응과정으로 인하여 상업적으로 이용하기에는 한계가 있고, 처리방법 등이 의약품 또는 식품산업분야에 적용되기에는 부적합하다.

대한민국 등록 특허 제841959호에는 파쇄되지 않는 인택트 클로렐라에 에탄올 및 선택적으로 다이옥산을 처리하는 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 클로로필 a에 산을 처리하여 페오피틴 a 침전물을 수득하고, 이 침전물을 에탄올 용매 또는 아세톤 용매에 용해시킨 후 염기를 처리하여 클로린 e6을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법에서는 클로로필 a의 침전을 위하여 1,2-디옥산을 사용하고 있는데, 1,2-디옥산은 발암물질로 식품 및 의약품 제조분야에서는 이의 사용을 제한하고 있다. 또한, 클로로필 a로부터 클로린 e6를 제조하는 과정에서 분리 수득되는 클로로필 a와 페오피틴 a에 대한 정제과정을 별도로 수행하지 않는다. 따라서 클로로필 a와 페오피틴 a가 완전 정제된 상태가 아닌 추출액과 추출물 형태로 반응이 진행되므로, 최종물질인 클로린 e6의 순도는 클로로필과 페오피틴에 파생된 불순물의 혼재로 실질적인 순도가 낮아지는 결과를 초래한 것이다.

대한민국 등록 특허 제950441호에는 스피루리나를 에탄올 또는 에탄올 수용액을 이용하여 추출하는 단계, 상기 추출물을 저온 냉동침전시켜 클로로필 a를 얻는 단계, 및 상기 클로로필 a를 헥산에 용해시킨 후 글루카민으로 처리하여 정제된 클로로필 a를 얻는 단계로 이루어진 클로로필의 제조방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 고순도 클로로필을 수득하기 위하여 긴 반응시간이 소요되고, 글루카민 처리에 의한 불순물 제거공정을 수행하는 등 복잡한 공정으로 이루어져 있는 단점이 있다. 또한 냉동침전의 경우도 용량이 커짐에 따라 불순물 제거에 대한 재현성을 실현하기가 힘들다.

대한민국 등록 특허 제896327호에는 스피루리나를 에탄올 또는 에탄올 수용액을 이용하여 추출하는 단계, 상기 에탄올 추출물에 물 단독 또는 아세톤 수용액을 첨가하여 클로로필 침전물을 얻는 방법이 개시되어 있다. 또한, 클로로필 a에 산 처리하고 염기 처리하여 클로린을 형성하는 단계; 상기 클로린을 아세토니트릴과 1% 트리플루오로아세트산, 1% 포름산 또는 1% 아세트산을 50:50 부피비로 혼합한 용매로 처리하여 산 클로린을 분리하는 단계; 상기 산 클로린을 염기로 처리하여 클로린 염을 얻는 단계로 이루어진 클로린 염의 제조방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 클로로필 a의 추출을 위하여 물과 에탄올을 이용한 침전법 및 물과 아세톤을 이용한 침전법을 적용하고 있는데, 물을 이용한 클로로필 결정화는 실험실적으로는 재현성이 높다하겠지만, 대용량의 공정에서는 결정 형성이 어려워 낮은 재현성을 갖는다. 상기 특허에서는 스피루리나의 사용량 대비 클로로필 결정의 수율이 약 4.5% 이상인 것으로 기재되어 있다. 그러나, 스피루리나 1 g에 함유된 클로로필의 양이 약 10～20 mg(최고 수율 약 1～2%에 해당됨)임을 감안할 때, 상기 특허 방법에서 수득한 클로로필 결정은 다량의 불순물을 포함하고 있음을 간접적으로 시사한 것이라 판단된다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 현재까지 알려진 클로로필로부터 클로린 e6의 제조방법은 식품 또는 의약품 분야에서 사용이 제한된 유해 반응물질을 사용하고, 반응 시간도 길고 복잡할 뿐만 아니라 정제공정도 재현성이 떨어져 대량 생산공정에 적용하기에는 한계가 있다.

본 발명은 클로로필 추출물로부터 클로로필을 선택적으로 분리 정제하는 공정을 포함하는 고순도 클로로필의 제조방법을 제공하는 것을 발명의 목적으로 한다.

본 발명은 짧은 반응시간과 높은 재현성을 갖는 간소화된 정제공정을 포함하는 클로린 e6의 제조방법을 제공하는 것을 발명의 목적으로 한다.

본 발명은 식품 및 의약품 원료로 사용하기에 적합하도록 고순도로 정제된 클로린 e6의 제조방법을 제공하는 것을 발명의 다른 목적으로 한다.

상기한 목적 달성을 위하여, 본 발명은 하기의 과정을 포함하는 고순도의 클로로필의 제조방법을 그 특징으로 한다:

ⅰ)클로로필 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 과정;

ⅱ)상기 클로로필의 추출물에 헥산과 물을 넣고 교반하는 과정;

ⅲ)상기 교반된 용액을 -20℃ 내지 0℃ 온도에서 정체한 후, 헥산층을 분리하여 고순도의 클로로필을 정제하여 수득하는 과정;

또한, 본 발명은 하기의 과정을 포함하는 클로린 e6의 제조방법을 그 특징으로 한다:

ⅳ)상기 정제된 클로로필을 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이의 혼합용매로부터 선택된 용매에 용해시킨 후, 산을 첨가하여 pH 1～3 범위로 산성화하는 과정;

ⅴ)상기 산성화된 용액에 물을 첨가한 후, -20℃ 내지 0℃ 온도에서 정체하여 생성된 페오피틴(pheophytin) 침전물을 수득하는 과정; 및

ⅵ)상기 페오피틴 침전물을 아세톤에 용해시키고 염기를 첨가하고 60℃ 내지 120℃ 온도에서 반응시켜 클로린 e6을 제조하는 과정.

본 발명은 클로로필 추출물로부터 클로린 e6을 제조하는 일련의 과정을 수행함에 있어, 클로로필 및 페오피틴의 정제과정을 필수 공정으로 포함하여 최종적으로 제조되는 클로린 e6의 순도를 크게 개선하는 효과를 얻는다.

본 발명은 클로로필에 대한 헥산과 물의 용해도 차이를 이용하여 클로로필 추출물로부터 고순도 클로로필을 침전물로 수득하는 효과를 얻는다.

본 발명은 클로로필을 산 처리하여 페오피틴으로 전환한 용액에, 물을 직접 투입하여 반응용액을 중화시킴은 물론이고 페오피틴의 침전속도 및 침전율을 향상시켜 고순도 페오피틴을 수득하는 효과를 동시에 얻는다.

본 발명은 페오피틴을 클로린 e6로 전환하는 과정을 염기 존재 및 가열 조건에서 수행하여, 반응시간의 단축 및 제조수율을 향상시키는 효과를 얻는다.

따라서, 본 발명의 제조방법은 광민감제인 클로린 e6의 대량생산이 가능한 효과를 얻는다.

도 1은 클로로필 추출물의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 클로로필 추출물을 헥산과 물에 대한 용해도 차이와 냉동침전법으로 분리 정제한 고순도 클로로필의 HPLC 분석 결과이다.
도 3은 클로로필 추출물을 헥산과 물에 대한 용해도 차이와 냉동침전법으로 분리 정제한 고순도 클로로필의 핵자기공명(NMR) 분석 결과이다.
도 4는 고순도 클로로필을 산 처리한 후 물을 첨가하여 냉동보관 후 침전시켜 얻어진 페오피틴의 HPLC 분석 결과이다.
도 5는 고순도 클로로필을 산 처리한 후 물을 첨가하여 냉동보관 후 침전시켜 얻어진 페오피틴의 핵자기공명(NMR) 분석 결과이다.
도 6은 페오피틴을 염기 존재하에 가열 반응한 후 냉동보관하여 얻어진 클로린 e6의 HPLC 분석 결과이다.
도 7은 페오피틴을 염기 존재하에 가열 반응한 후 냉동보관하여 얻어진 클로린 e6의 핵자기공명(NMR) 분석 결과이다.

본 발명은 클로로필 추출물로부터 고순도 클로로필과 클로린 e6를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 클로린 e6의 제조방법을 각 과정별로 구분하여 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

클로로필의 추출 및 정제

본 제조과정은 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 추출하여 클로로필을 수득하는 과정이다.

본 발명은 클로로필 수득에 사용된 녹색 식물 또는 미세조류의 선택에 특별한 제한을 두고 있지 않으며, 클로로필을 함유하는 모든 식물 또는 미세조류라면 모두 적용될 수 있다. 클로로필을 함유하는 녹색 식물 또는 미세조류를 구체적으로 예시하면, 뽕잎, 송잎, 대추, 칡뿌리, 다시마, 깻잎, 두충껍질, 시금치, 케일, 클로렐라, 스피루리나 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서는 녹색 식물 또는 미세조류로부터 클로로필을 추출하기 위해 사용하는 추출용매와 클로로필의 추출물로부터 고순도 클로로필을 수득하기 위해 사용하는 정제용매를 서로 구분하여 선택한데 그 특징이 있다. 상기한 추출용매와 정제용매는 식품 및 의약품 분야에서 통용되고 있는 용매 군으로부터 선택되며, 용매의 극성도와 클로로필에 대한 용해도 차이를 고려하여 선택한다.

이에, 본 발명에서는 상기 추출용매로서 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액으로부터 선택 사용하며, 상기 정제용매로는 헥산과 물을 선택 사용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에서는 녹색식물 또는 미세조류를 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이의 수용액과 같이 극성이 상대적으로 큰 용매로 추출하고 농축하여 클로로필 추출물을 얻는다. 그런 다음, 클로로필에 대한 용해도가 높고 극성이 비교적 낮은 헥산을 상기 클로로필 추출물에 첨가하고 교반하여 클로로필을 최대한 헥산 층으로 이동시킨 후, 여기에 물을 첨가하고 교반해주면 헥산 층에 포함될 수 있는 클로로필 이외의 불순물을 물 층으로 이동시키는 정제 과정을 통해 고순도의 클로로필을 헥산 층에서 얻는다.

본 발명이 클로로필의 추출 및 정제과정에서 선택 사용하고 있는 용매의 유전상수를 살펴보면, 물 78, 메탄올 32.7, 에탄올 24.5, 아세톤 21, 헥산 1.9 정도를 갖는다. 즉, 물이 가장 강한 극성을 나타내고, 물>메탄올>에탄올>아세톤>헥산의 순서로 극성이 적어진다. 헥산은 클로로필과 같은 비극성 특성을 가지고 있어 클로로필에 대한 용해도가 높을 뿐만 아니라, 헥산은 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액과 서로 섞이지 않고 층 분리되는 특성을 가지고 있다. 따라서, 클로로필 추출물을 헥산과 물을 사용하여 정제함에 의해 클로로필은 헥산 층에 용해되어 분포하게 되고, 클로로필 이외의 불순물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 아세톤 층으로 층 분리되어 분포하게 되므로, 고순도의 클로로필 수득이 가능하다.

클로로필의 추출용매로서 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액을 사용하는 경우, 추출용매 중의 물 함유량은 15 부피% 미만으로 조절하는 것이 보다 유리하다. 그 이유는 추출용매 중에 과량의 물이 존재하게 되면 클로로필의 분해 및 변성을 초래할 수 있기 때문이다. 또한, 상기 클로로필 추출액을 1 내지 10 부피% 범위로 농축하여 클로로필 추출물을 수득한다. 이때, 클로로필 추출물의 농축농도가 상기 범위 미만이면 헥산과 물을 사용한 정제과정에서의 정제효율이 저하됨은 물론이고 대용량의 추출용기를 필요로 하므로 공정 스케일이 커짐으로써 경제성이 떨어질 수 있다.

정제용매로 사용된 헥산은, 농축된 클로로필 추출물의 부피에 대하여 3 내지 10배, 바람직하기로는 4 내지 6배 범위로 사용한다. 만약 헥산의 사용량이 상기 범위 미만으로 소량 사용되면 클로로필이 헥산 층으로 쉽게 이동되지 못하여 결국엔 클로로필의 수율을 떨어뜨리는 원인이 될 수 있고, 상기 범위를 초과하여 과량 사용되면 헥산 부피가 커져 불순물이 헥산 층으로 이동하여 결국엔 클로로필의 순도를 떨어뜨리는 원인이 될 수 있다. 헥산에 위한 추출과정에서 교반시간은 1 내지 5시간이 가능하고, 바람직하게는 1 내지 3시간동안 교반한다. 만약 교반시간이 너무 짧으면 헥산 층으로의 클로로필 이동이 완결되지 않을 수 있으며, 지나치게 긴 시간 교반하면 클로로필 이외에 불순물이 헥산 층으로 이동할 수 있어 바람직하지 못하다.

또한, 본 발명에서는 클로로필의 정제를 위하여 헥산으로 추출한 후에, 추가로 물을 첨가하여 추출하게 되면 클로로필의 정제효과는 보다 극대화될 수 있다. 즉, 클로로필 추출물에 헥산을 첨가하고 교반한 후, 추가로 물을 첨가하여 불순물을 수층으로 이동시켜 헥산 층으로부터 고순도의 클로로필을 얻을 수 있다. 이때 첨가되는 물은, 헥산의 사용량에 대하여 10 내지 30 부피% 범위로 사용하는 것이 좋다. 또한, 물을 첨가하고 지나치게 긴 시간동안 교반하게 되면 에멀젼 형성으로 층 분리가 용이하지 않는 문제가 있을 수 있으므로 5분 내지 30분 이내로 짧은 시간 교반하는 것이 좋다.

또한, 본 발명에서는 클로로필의 선택적 이동과 불순물의 결정화를 위하여 1 내지 5시간 정도 정체된 상태를 유지한다. 상기 정체는 상온 조건에서도 클로로필의 선택적 이동과 불순물의 결정화를 유도할 수 있지만, 보다 신속한 이동과 침전 유도를 위해서는 -20℃ 내지 0℃의 저온 조건을 유지하는 것이 좋다. 하지만, 보관온도를 -20℃ 보다 더 낮게 유지하면 이동 및 침전물이 급속히 생성되어 불순물의 제거효율이 떨어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 클로로필의 추출 및 정제 과정을 수행함에 있어 용매추출 횟수에 대한 특별한 제한을 두지 않으나, 2회 이상의 반복적인 추출은 시간대비 추출효율이 현격하지 않아 비경제적이고, 또한 클로로필의 변성을 초래할 수 있어 바람직하지 않다.

이상의 추출 및 정제과정을 수행하여 얻은 고순도의 클로로필은 고농축액 또는 건조분말 형태로 수득되며, 수분을 최대한 함유하지 않는 건조분말 형태로 수득하여 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법으로 추출 및 정제된 클로로필은 85% 이상의 순도 바람직하기로는 90% 이상의 순도를 가지며, 녹색식물 또는 미세조류 중에 포함된 클로로필의 양에 대비하여 90% 이상의 수율로 추출이 가능하다. 즉, 스피루리나 1 g 중에 포함된 클로로필의 함량이 약 20 mg 정도이므로, 본 발명이 제안한 추출방법을 적용하게 되면 약 16 mg의 클로로필을 수득할 수 있다.

페오피틴 합성

본 제조과정은 하기 화학식 1로 표시되는 클로로필을 산으로 처리하여 마그네슘을 제거된 하기 화학식 2로 표시되는 페오피틴을 수득하는 과정이다.

좀 더 구체적으로 설명하면, 클로로필을 용매에 용해시킨 후에, 산을 첨가하고 교반하여 클로로필 분자내에 포함된 마그네슘 원자를 탈리시켜, 페오피틴으로 전환시킨다.

상기 클로로필을 용해시키는 용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이의 혼합용매로부터 선택되며, 바람직하기로는 아세톤을 사용하는 것이다. 아세톤은 클로로필에 대한 용해도가 우수하여 적은 양을 사용하더라도 클로로필의 용해가 용이하다는 장점이 있다. 마그네슘 탈리를 위해 첨가하는 산은 클로로필 한 분자당 3 당량 이상 바람직하기로는 3 내지 5 당량 사용하여, 반응용액의 pH를 1 내지 3의 범위로 조절한다. 이때 사용되는 산의 첨가량이 너무 과다하면 부반응으로 페오포리바이드 부산물을 형성할 수 있으므로, 산의 첨가량 조절에 주의가 필요하다. 마그네슘 탈리를 위해 첨가된는 산의 종류에 대해 특별한 제약은 없으며, 염산, 황산, 인산 등의 통상의 무기산 또는 아세트산 등의 통상의 유기산으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 염산 또는 황산 등의 무기산을 사용하는 것이다.

또한, 본 발명은 산을 첨가하여 생성된 페오피틴을 분리 정제하여 다음의 클로린 e6 제조과정에 사용하여 최종 산물의 순도를 높이는 것을 특징으로 한다. 이에, 본 발명에서는 페오피틴의 분리 및 정제를 위하여 반응용액에 물을 첨가하고 -20℃ 내지 0℃의 저온을 유지하면서 정체시켜 페오피틴 침전물을 형성시킨다. 물은 비극성의 페오피틴에 대한 용해도가 낮아 페오피틴의 침전을 촉진하기도 하지만, 반응용액 중에 포함된 극성 부산물 및 잉여 산을 제거하는 또 다른 효과가 기대된다. 물의 첨가량은 반응용액의 부피에 대하여 1 내지 3배 범위이며, 물을 첨가하고 10 내지 30분 정도 교반하면 페오피틴 침전물이 빠른 속도로 생성된다.

이상의 산처리 방법을 수행하여 얻은 페오피틴 침전물은 90% 이상의 순도를 가지며, 사용된 클로로필 중량에 대비하여 95% 이상의 수율로 수득된다.

필요하다면, 상기 방법을 수행하여 얻은 페오피틴 침전물을 메탄올과 헥산을 이용한 결정화를 수행하여 페오피틴 결정을 얻을 수 있다. 즉, 페오피틴 침전물을 메탄올에 용해시킨 후, 헥산을 첨가하고 교반하여 완전히 용해시킨 후, -20℃ 내지 0℃의 저온 조건을 유지하면서 5분 내지 30분 정도 보관하면 페오피틴 결정이 생성된다. 상기 결정화에 사용되는 용매로서 메탄올과 헥산은 1 : 3 내지 6 부피비를 유지하는 것이, 결정화 효율 및 페오피틴의 순도 향상에 보다 바람직하다.

클로린 e6 합성

본 제조과정은 페오피틴에 염기를 넣고 가열반응시켜, 하기 화학식 3으로 표시되는 클로린 e6을 수득하는 과정이다.

본 발명의 클로린 e6의 합성과정은 '이분자 친핵성 치환반응(SN2)'에 의해 이루어진다. 이분자 친핵성 치환반응은 페오피틴을 용해시킨 용액에 페오피틴 한 분자당 2 내지 3 당량의 염기를 첨가된 조건하에서 수행된다. 이때, 염기는 당분야에서 통상적으로 사용되는 것으로 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 수산화물 등의 무기염기, 또는 암모늄염 등의 유기염기를 사용할 수 있으며, 본 발명의 염기의 선택에 있어 특별한 제약은 없으나 바람직하게는 수산화나트륨을 사용하는 것이다. 반응용매로는 메탄올, 에탄올, 아세톤 등을 사용할 수 있다. 본 발명은 상기한 이분자 친핵성 치환반응(SN2)을 60℃ 내지 120℃로 가열하는 조건을 유지한데 특징이 있는 바, 가온 조건을 유지함으로써 반응속도 및 수율을 촉진하는 효과를 얻는다.

상기 SN2 반응이 종료되면 생성된 클로린 e6 결정을 여과하여 수득한다. 수득한 클로린 e6 결정은 에탄올에 넣고 교반하면 클로린 e6 이외의 불순물이 제거되어 고순도 제품으로써 클로린 e6를 수득할 수 있으며, 또한 결정내에 잔류하는 염기를 중화시키는 효과를 얻을 수 있다.

이상의 방법으로 수득한 클로린 e6는 95% 이상, 바람직하기로는 98% 이상의 순도를 가지며, 사용된 페오피틴 중량에 대비하여 90% 이상의 수율로 수득된다.

필요하다면, 상기 방법을 수행하여 얻은 클로린 e6는 HPLC 등의 통상의 정제공정을 추기로 수행하여 그 순도를 높일 수도 있다. 특히, 원료물질로 사용된 클로로필은 대부분 클로로필 a와 b가 3:1～5:1 몰비로 공존하게 되는데, 이들 화합물은 컬럼을 이용한 고도의 분리법 이외에는 완전히 분리하기가 힘든 것으로 알려져 있다. 본 발명의 제조방법을 통해 수득된 고순도 클로로필은 클로로필 a 또는 b, 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 굳이 클로로필 a 또는 b로 분리하고자 하는 경우는 통상의 정제방법 예를 들면 HPLC 등에 의해 분리하는 것도 가능하다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 특정 원재료의 제약이 없이 클로로필을 함유하는 출발 물질로부터 클로로필을 추출하고, 저온에서 용매의 용해도 차이와 극성도를 이용하여 클로로필 이외의 물질을 제거하는 간단하고 효율적인 방법으로 고순도의 클로로필을 얻을 수 있으며, 이를 통해 페오피틴과 클로린 e6 합성에서는 반응 시간을 단축하고, 정제도를 향상할 수 있는 매우 효과적인 방법을 개발하였다. 또한 본 발명은 기존의 방법보다 비교적 간단한 공정으로 반응 속도와 정제도를 향상시키고, 수율을 향상시킴으로써 대량생산에 적합한 방식으로 합성 및 제조하는 공정을 가진다.

[실시예]

실시예 1. 클로로필 추출물의 수득

클로렐라 20 g에 추출용매로서 아세톤 2 L을 넣고 4시간동안 교반하고 여과하여 클로로필 추출물을 얻었다. 상기에서 수득한 클로로필 추출물은 하기 조건에서 HPLC(High Pressure Liquid Chromatography) 분석하였다.

[HPLC 분석조건]

- 분석기기: agilent 1200 시스템

- 샘플 주입량: 10 ㎕

- 전개용매: 메탄올/아세토나이트릴/디클로로메탄/물=67.5/9.5/22.5/0.5 부피비

- 용매유속: 1 mL/min

- 분석파장: 450 nm

상기에서 수득한 클로로필 추출물에 대한 HPLC 분석 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 HPLC 분석결과에 의하면, 머무름 시간(retention time) 3～4분에서 클로로필에 해당하는 피크를 관찰할 수 있었으며, 0～3분 사이에서 불순물들이 상당량 존재하는 것으로 확인되었다. 이때 레퍼런스(reference)로는, Sigma-aldrich 회사의 클로로필을 사용하였다.

실시예 2. 고순도 클로로필의 수득

상기 실시예 1에서 얻은 클로로필 추출액의 부피가 약 5%가 되도록 농축하고, 농축된 클로로필 추출물 100 mL에 헥산 500 mL를 넣고 1시간동안 교반하였다. 추가로 물 200 mL를 첨가하고 10분 동안 계속 교반하였다. -10℃ 조건에서 3시간동안 정체시킨 후, 반응용액을 층분리하여 유기층을 수득하였다. 유기층을 감압 증류하여 고순도 클로로필 (HPLC 순도 85%, 수율 90%)을 수득하였다.

상기에서 수득한 고순도 클로로필에 대해서는 상기 실시예 1의 조건으로 HPLC 분석 및 NMR 분석하였으며, 그 결과는 도 2와 도 3에 각각 나타내었다.

도 2에 나타낸 HPLC 분석결과에 의하면, 머무름 시간(retention time) 3～4분에서 클로로필의 해당피크를 확인할 수 있었으며, 0～3분 사이의 불순물은 거의 제거되었음을 확인할 수 있었다. 또한 클로로필의 정제도는 약 85%임을 확인할 수 있었다. 이것의 수득율은 클로로필을 함유한 해당 출발물질이 함유하는 클로로필의 양에 대비하여 90% 이상 추출되었다. 도 3에 나타낸 NMR 분석을 통해 정성분석을 하였다.

실시예 3. 클로로필로부터 고순도 페오피틴의 수득

상기의 실시예 2에서 얻어진 고순도 클로로필 1 g을 아세톤 50 mL에 용해시킨 후, 첨가하는 염산의 양은 약 3당량이 되도록 1M 염산 용액 3.365 mL를 첨가(용액의 pH는 2가 됨)하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면, 상기 용액에 물 100 mL를 첨가하고 10분 동안 교반한 후, -10℃에서 3시간동안 정체하여 침전시켰다. 침전물을 여과하여 페오피틴(HPLC 순도 90%, 수율 95%)을 수득하였다.

상기에서 수득한 페오피틴에 대해서는 상기 실시예 1의 조건으로 HPLC 분석 및 NMR 분석 하였으며, 그 결과는 도 4와 도 5에 각각 나타내었다.

도 4에 나타낸 HPLC 분석결과에 의하면, 머무름 시간(retention time) 7.5～8.5분에서 페오피틴의 해당피크를 확인할 수 있었으며, 다른 시간대에서 불순물은 거의 확인되지 않았다. HPLC 분석을 통해 확인된 페오피틴의 순도는 약 90% 이었다. 페오피틴의 수득율은 고순도 클로로필의 양에 대비하여 95% 이상이었다. 도 5에 나타낸 NMR 분석을 통해 정성분석을 하였다.

상기에서 수득한 1 g을 메탄올 50 mL에 용해한 다음, 헥산 250 mL를 첨가하고 10분 동안 교반하였다. 교반 후에 -10℃에서 3시간동안 정체하여 부분적으로 결정화된 페오피틴 0.9 g(HPLC 순도 92.5%)을 수득하였다

실시예 4. 페오피틴으로부터 클로린 e6의 합성

상기 실시예 3에서 얻어진 페오피틴 1 g을 아세톤 50 mL에 용해한 후, 1M 수산화나트륨 수용액을 약 2 당량에 해당하는 2.297 mL를 첨가하면, 용액의 pH는 12 정도가 된다. 그런 다음, 80℃ 온도로 가열하는 조건에서 1시간동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 여과하여 클로린 e6의 결정 0.653 g (HPLC 순도 90 %, 수율 90 % 이상)을 수득하였다.

또한, 상기에서 수득한 클로린 e6 결정을 고순도로 정제하기 위하여, 클로린 e6 1 g에 대하여 에탄올 100 mL에 넣고 2시간 동안 교반하고 여과하여 고순도의 클로린 e6 결정 0.95 g (HPLC 순도 95%, 수율 95% 이상)을 수득하였다.

상기에서 수득한 클로린 e6 결정에 대해서는 상기 조건으로 HPLC 분석 및 NMR 분석 하였으며, 그 결과는 도 6와 도 7에 각각 나타내었다.

[HPLC 분석조건]

- 분석기기: agilent 1200 시스템

- 샘플 주입량: 10 ㎕

- 전개용매: 아세토나이트릴/0.1% 트리플루오르아세트산=50/50 부피비

- 용매유속: 1 mL/min

- 분석파장: 407 nm

도 6에 나타낸 HPLC 분석결과에 의하면, 머무름 시간(retention time) 3～4분에서 클로로필에 해당하는 피크를 관찰할 수 있었으며, 다른 시간대에서 불순물은 거의 확인되지 않았다. 또한 클로린 e6의 정제도는 약 95% 이상임을 확인할 수 있었다. 이것의 수득율은 페오피틴 1 g을 반응한 후 이론적인 수득율과 비교하여 약 90% 이상의 수득율을 보였다. 얻어진 클로린 e6은 도 7에서 보는 바와 같이 NMR을 통해 정성분석을 완료하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 수득된 클로린 e6는 순도가 높아 식품 및 의약품으로 직접 사용이 가능하다.

따라서, 본 발명은 식품 및 의약품으로 이용되는 클로린 e6의 대량 생산방법으로 유용하다.

Claims

ⅰ)클로로필 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 과정;
ⅱ)상기 클로로필의 추출물에 헥산과 물을 넣고 교반하는 과정; 및
ⅲ)상기 교반된 용액을 -20℃ 내지 0℃ 온도에서 정체한 후, 헥산층을 분리하여 클로로필을 정제하여 수득하는 과정;
을 포함하는 클로로필의 제조방법.
ⅰ)클로로필 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액으로부터 선택된 추출용매로 추출하는 과정;
ⅱ)상기 클로로필의 추출물에 헥산과 물을 넣고 교반하는 과정;
ⅲ)상기 교반된 용액을 -20℃ 내지 0℃ 온도에서 정체한 후, 헥산층을 분리하여 클로로필을 정제하여 수득하는 과정;
ⅳ)상기 정제된 클로로필을 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이의 혼합용매로부터 선택된 용매에 용해시킨 후, 산을 첨가하여 pH 1～3 범위로 산성화하는 과정;
ⅴ)상기 산성화된 용액에 물을 첨가한 후, -20℃ 내지 0℃ 온도에서 정체하여 생성된 페오피틴(pheophytin) 침전물을 수득하는 과정; 및
ⅵ)상기 페오피틴 침전물을 아세톤에 용해시키고 염기를 첨가하고 60℃ 내지 120℃ 온도에서 반응시켜 클로린 e6을 제조하는 과정;
을 포함하는 클로린 e6의 제조방법.
청구항 1 또는 2항에 있어서,
ⅰ)과정에서 사용된 추출용매는 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 1 또는 2항에 있어서,
ⅱ)과정에서 사용된 클로로필 추출물은 1～10 부피% 농도의 농축액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 1 또는 2항에 있어서,
ⅱ)과정은 상기 클로로필의 추출물에 헥산을 첨가하고 교반한 후에, 물을 추가로 첨가하고 교반하는 과정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 1 또는 2항에 있어서,
ⅲ)과정에서의 클로로필은 건조분말 또는 농축액으로 수득되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 2에 있어서,
ⅴ)과정에서 수득한 페오피틴 침전물에 물을 첨가하고 -20℃ 내지 0℃ 온도에서 정체하여 생성된 페오피틴 결정을 수득하는 과정이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 7에 있어서,
ⅴ)과정에서 수득한 페오피틴 침전물을 메탄올에 용해시킨 후, 헥산을 첨가하고 교반하여 용해시킨 후, -20℃ 내지 0℃ 온도에서 정체하여 생성된 페오피틴 결정을 수득하는 과정이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 8에 있어서,
메탄올과 헥산은 1 : 3 내지 6 부피비 범위로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 2에 있어서,
ⅵ)과정에서 사용되는 염기가 수산화나트륨인 것을 특징으로 하는 제조방법.
청구항 2에 있어서,
ⅵ)과정에서 수득된 클로린 e6을 에탄올로 세척하여 정제하는 과정이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.