KR102388499B1 - 클로로필 함유 천연물로부터 고순도 페오피틴의 제조방법 및 그 페오피틴을 이용한 클로린 e6, 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 페오피틴(pheophytin)의 제조방법에 있어서, 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액 중 어느 하나로 구성되는 추출용매에 용해시킨 후 산을 첨가하고, 교반하여 페오피틴(pheophytin) 추출물을 추출하는 단계; 페오피틴(pheophytin) 추출물에 헥산과 물을 넣고 혼합한 혼합물을 필터링 하는 단계; 필터링 한 용액에 카본블랙(carbon black)을 첨가하여 교반한 후, 소정의 시간 동안 보관하는 보관단계; 보관단계의 수행 결과물에서 헥산층을 분리하여 페오피틴(pheophytin)을 획득하는 단계; 를 포함하는 페오피틴(pheophytin) 제조방법이 개시된다.

Description

클로로필 함유 천연물로부터 고순도 페오피틴의 제조방법 및 그 페오피틴을 이용한 클로린 e6, 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법{Process for preparing high purity pheophytin, Chlorin e6, and Chlorin e6 and PVP complex from natural products containing chlorophyll}

본 발명은 클로로필 함유 천연물로부터 고순도 페오피틴의 제조방법 및 그 페오피틴을 이용한 클로린 e6, 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법에 관한 것이다.

클로린 e6는 악성종양의 광역적 치료(PDT; PhotoDynamic Therapy)에 이용되는 광민감제로 잘 알려져 있다. 광민감제는 종양조직과 정상조직에 있어 종양조직에만 선택적으로 축적되는 특성 즉, 선택성(selectivity)이 요구되며, 지금까지 상용화 되어있는 광민감제 물질 중 가장 선택성이 높고, PDT의 효능이 높아져 치료시간을 단축시킬 수 있으며, 체내에 주입된 약물의 부작용도 줄일 수 있게 된다.

종양 내에 축적된 클로린 e6는 660nm의 특정 파장의 빛을 조사하여 활성화시키면, 종양 내 산소를 갖는 분자와 반응하여 활성산소의 일종인 일중항산소(singlet oxygen)와 라디칼 종(radical species)을 발생된다. 이를 통해 직접적으로 종양세포를 죽이고, 면역염증반응을 일으키거나 종양의 미소혈관계에 손상을 시켜 종양을 제거한다.

종래 광민감제들은 대부분이 종양에 일정 정도는 선택적으로 축적되지만, 피부를 포함한 정상조직에도 일부 축적되는 것으로 알려져 왔지만, 클로린 e6는 종양치료에 사용되는 다른 광민감제들과 비교하여 악성세포에 대한 높은 선택성을 가지면서 정상적인 세포에는 독성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다.

다음과 같은 종래 특허들에 기술된 클로린 e6의 제조 방법은 스피루리나 또는 클로렐라 등에서 클로로필을 추출하고, 이들을 산처리를 통해 페오피틴을 얻은 후 아세톤 하에서 염기처리를 통해 클로린 e6를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

대한민국 등록 특허 제10-0628548호는 클로린 e6를 제조하는 방법을 살펴보면, 이 특허는 스피루리나 바이오매스에서 클로로필 추출, 산처리, 중화, 가수분해, 페오포비드 a의 추출, 아세톤에의 용해, 강염기 첨가, 중화, 및 재침전 등의 복잡한 과정을 통해 클로린 e6를 얻었다.

상기 특허는 오랜 반응 시간 및 복잡한 반응과정의 문제점이 있으며, 클로린 e6의 대량 생산에 부적합하다.

대한민국 등록 특허 제 10-0841959호에 파쇄되지 않는 인택트 클로렐라에 에탄올 추출 및 선택적으로 다이옥산을 처리하는 단계를 포함하는 클로로필 a의 제조방법과 상기 클로로필에 산을 처리하여 페오피틴을 제조한 후 클로린을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

상기 특허는 클로린 e6를 얻기 위하여 클로로필 추출/정제 과정을 거쳐 페오피틴을 제조한 후 클로린 e6를 만드는 복잡한 제조 공정을 개시하였다. 또한 클로로필의 정제를 위하여 인체에 유해한 발암물질로 알려진 1,2-Dioxane을 사용하여 클로로필을 수득하였다.

아울러 생클로렐라를 이용할 경우에 원재료 저장성, 여과 및 추출이 매우 힘들다는 단점이 있으며, 이것은 대량생산의 제약이 될 수 있다.

스피루리나로부터 클로로필 a 및 클로린 또는 포토디타진을 제조하는 방법에 관한 특허로 대한민국 등록 특허 제 10-0896327호와 제 10-0950441호는 물과 에탄올 또는 아세톤을 이용한 침전으로 클로로필을 수득하는 방법이나 저온 냉동침전을 이용하여 불순물을 제거하고, 글루카민 처리를 통해 선택적으로 클로로필을 얻는 방법을 제시하였으며, 이것을 산처리와 염기 처리 및 재결정을 통해 클로린을 얻었다.

물을 이용한 클로로필 결정화는 부피가 작은 양일 때에는 재현성이 높으나, 약 25L이상의 추출액에서는 결정이 형성이 잘 되지 않는 낮은 재현성을 갖는다. 또한 냉동침전의 경우도 양이 많아짐에 따라 그것의 불순물 제거에 대한 재현성을 실현하기가 힘들다.

또한 클로로필의 정제도가 낮다는 것은 수율을 통해 확인할 수 있다. 스피루리나의 1g 중량에 함유하는 클로로필의 양은 약 10~20mg을 갖으며, 이는 약 1~2%에 해당하는 함량을 갖는 것은 여러 문헌에서 확인할 수 있다. 상기 특허에서는 약 4.5 % 이상의 수율을 갖는 다는 것은 스피루리나가 갖고 있는 클로로필보다 초과한 양을 갖는 것을 의미하며, 이것은 클로로필과 그 이외의 물질까지 공존하여 추출 또는 질량분석이 이루어졌음을 알 수 있다.

아울러 페오피틴과 클로린 e6의 수율을 보았을 때에는 얻어진 클로로필에 대비하여 이론적인 수율 보다 더 작은 양의 수율을 나타내는 것으로 보아 결정화가 일어날 때 불순물이 제거되었거나, 반응의 손실이 큼을 의미한다.

고순도 클로로필의 추출과 클로린 e6의 합성에서 긴 반응시간과 외부환경(습도, 온도 등)이 변화함에 따라 재현성이 떨어지고, 저온 보관과 글루카민 처리 등의 여러 공정으로 이루어져 있는 단점이 있다.

즉, 상기 종래 특허들의 방법은 클로로필 추출, 산처리, 염기처리, 가수분해, 중화, 재침전, 분리 및 정제 등의 여러 공정을 통해 염 클로린 e6를 얻은 복잡한 과정을 거쳐야 하며, 또한 그것의 정제도는 단일화합물로써 화장품, 식품 또는 의약품에 사용하기 부적합하다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 클로로필을 함유하는 식물이나 녹조류로부터 클로로필 추출 과정 없이 페오피틴을 획득하는 공정을 포함하는 고순도 페오피틴의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면 고순도 페오피틴을 활용하여 광민감제인 클로린 e6의 효율적인 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 짧은 제조 시간, 높은 재현성 및 정제도를 가지는 클로린 e6의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 고순도로 정제되어 화장품, 식품 및 의약품의 원료로 사용하기 적합한 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 페오피틴(pheophytin)의 제조방법에 있어서, 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액 중 어느 하나로 구성되는 추출용매에 용해시킨 후 산을 첨가하고, 교반하여 페오피틴(pheophytin) 추출물을 추출하는 단계; 상기 페오피틴(pheophytin) 추출물에 헥산과 물을 넣고 혼합한 혼합물을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 한 용액에 카본블랙(carbon black)을 첨가하여 교반한 후, 소정의 시간 동안 보관하는 보관단계; 상기 보관단계의 수행 결과물에서 헥산층을 분리하여 페오피틴(pheophytin)을 획득하는 단계; 를 포함하는 것인, 페오피틴(pheophytin) 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면 클로린 e6의 제조방법에 있어서, 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액 중 어느 하나로 구성되는 추출용매에 용해시킨 후 산을 첨가하고, 교반하여 페오피틴(pheophytin) 추출물을 추출하는 단계; 상기 페오피틴(pheophytin) 추출물에 헥산과 물을 넣고 혼합한 혼합물을 필터링 하는 단계; 상기 필터링 한 용액에 카본블랙(carbon black)을 첨가하여 교반한 후, 소정의 시간 동안 보관하는 보관단계; 상기 보관단계의 수행 결과물에서 헥산층을 분리하여 페오피틴(pheophytin)을 획득하는 단계; 상기 획득하는 단계의 수행 결과물인 페오피틴을 아세톤에 용해시킨 후, 염기를 첨가하여 염기성화 하는 단계; 및 상기 염기성화 하는 단계의 수행 결과물에 열을 가하면서 교반하는 단계; 상기 교반하는 단계의 수행 결과물에 pH를 7 내지 9로 조절하는 중화처리를 하여 화학식 3의 염 클로린 e6를 생성하는 단계;를 포함하는 것인, 클로린 e6의 제조방법이 제공될 수 있다.

(화학식 3)

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법에 있어서, 화학식 4를 가지는 산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)을 혼합하는 단계;

(화학식 4)

상기 혼합하는 단계의 수행 결과물에 염기를 첨가하여 pH를 조절하는 단계; 상기 pH를 조절하는 단계의 수행 결과물을 멤브레인 필터를 이용하여 여과시키는 단계; 및 상기 여과시키는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계; 를 포함하는, 산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 원재료의 제약 없이 클로로필을 함유하는 녹색식물이나 미세 조류로부터 클로로필 추출하는 별도의 공정을 거치지 않고, 염산의 첨가, 용매의 적절한 비율과 카본블랙(carbon black)의 첨가 및 저온보관처리를 통해 고순도의 페오피틴을 추출하고, 페오피틴 이외의 물질을 제거하는 정제 분리 과정을 통해 기존 방법보다 간단하고 높은 정제도 및 수율을 갖는 고순도 페오피틴의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면 고순도 페오피틴을 활용하여 광민감제인 클로린 e6의 효율적인 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 클로로필을 함유하는 천연물로부터 클로로필을 추출하는 별도의 공정을 거치지 않고 페오피틴을 곧바로 추출함으로써 보다 짧은 제조 시간 및 높은 재현성을 갖는 매우 간소화된 공정을 제시하여 대량생산에 적합하며, 높은 정제도를 가지는 페오피틴 및 클로린 e6의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시 예에 따르면, 고순도로 정제되어 화장품, 식품 및 의약품의 원료로 사용하기 적합한 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법이 제공된다.

도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따라 제조된 페오피틴에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시 예에 따라 제조된 페오피틴의 핵자기공명(NMR) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따라 제조된 클로린 e6의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시 예에 따라 제조된 클로린 e6의 질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 클로린 e6에서 UV-vis를 이용한 흡광도 비교 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따라 제조된 클로린 e6의 핵자기공명(NMR) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시 예에 따른 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone) 복합체에서 UV-vis를 이용한 흡광도 비교 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시 예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시 예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시 예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소는 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본원 명세서에서 용어 "암" 및 "종양"은 통상적으로 제어되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병증을 의미하거나 기술한다. 양성 및 악성 암, 및 휴면 종양 또는 미소전이가 이 정의에 포함된다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 암의 다른 예는 피부암, 구순암, 흑색종(피부전이), 유방암(피부전이), 피부기저세포암, 변형성 피부암, 피부편평상피세포암, 및 아랫입술의 편평세포암을 포함하지만, 이들로 제한 되지는 않는다. 또 다른 암의 예는 유방암, 편평세포암, 폐암(소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종 포함), 전신경 교모세포종, 신경 교모세포종, 전형적 교모세포종 및 중간엽 교모세포종, 복막의 암, 위장암,위암(위장관암 포함), 췌장암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 방광암, 대장암, 대장직장암, 자궁내 막암, 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암, B 세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 소림프성 (small lymphocytic: SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아 구성 NHL; 고등급 작은 비분할 세포 NHL; 벌키 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 포함), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), 급성 림프아구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL), 모발 세포 백혈병, 만성 골수아구성 백혈병, 이식 후 림프증식성 장 애(post-transplant lymphoproliferative disorder: PTLD), 모반증과 연관된 이상 혈관 증식, 부종(예컨대, 뇌 종양과 연관된 것), 및 메이그스 증후군(Meigs' syndrome)을 포함한다.

또한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "암" 및 "종양"은 모든 신생 세포 성장 및 증식(악성이든 또는 양성이든), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본 명세서에 언급되는 것으로 상호 배타적이지 않다.

본원 명세서에서 용어 “미세조류(microalgae)”는 뿌리, 줄기, 잎이 체계적으로 분화되지 않은 하등식물 중에서 엽록소로 광합성을 하는 식물, 즉 조류(algae)를 포함하는 개념이며, 바람직하게는 조류(algae) 중 육안으로 볼 수 없어 현미경을 통해서만 볼 수 있으며 물속에서 자유로이 부유하여 살아가는 생물로서, 크기가 50 ㎛ 이하의 단세포 조류를 의미한다.

본원 명세서에 용어 '클로린 e6'는 '염 클로린 e6' 와 '산 클로린 e6'를 모두 포함하는 의미이며, 구별의 실익이 있는 경우에만 '염 클로린 e6' 와 '산 클로린 e6'를 구별하여 사용하기로 한다.

본원 명세서에서 용어 '복합체'는 '산 클로린 e6'와 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)(이하, “PVP”)의 복합체를 의미하며, 복합체는 광역학적으로 암을 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시 예에 따른 '페오피틴(pheophytin)' 및 이를 이용한 '클로린 e6'를 제조하는 방법을 설명하기로 한다. 본 방법에 따라 제조된 클로린 e6는 후술할 '클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체'를 제조하는데 사용될 수 있다.

제1실시예

제1실시예에 따르면, 클로린 e6의 제조방법은, 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액 중 어느 하나로 구성되는 추출용매에 용해시킨 후 산을 첨가하고, 교반하여 페오피틴(pheophytin) 추출물을 추출하는 단계(S10); 상기 페오피틴(pheophytin) 추출물에 헥산과 물을 넣고 혼합한 혼합물을 필터링 하는 단계(S20); 상기 필터링 한 용액에 카본블랙(carbon black)을 첨가하여 교반한 후, 소정의 시간 동안 보관하는 보관단계(S30); 상기 보관단계의 수행 결과물에서 헥산층을 분리하여 페오피틴(pheophytin)을 획득하는 단계(S40); 상기 획득하는 단계의 수행 결과물인 페오피틴을 아세톤에 용해시킨 후, 염기를 첨가하여 염기성화 하는 단계(S50); 및 상기 염기성화 하는 단계의 수행 결과물에 열을 가하면서 교반하는 단계(S60); 상기 교반하는 단계의 수행 결과물에 pH를 7 내지 9로 조절하는 중화처리를 하여 화학식 3의 염 클로린 e6를 생성하는 단계(S70); 를 포함한다. 즉, 제1실시에 따르면 염 클로린 e6가 제조된다.

(화학식 3)

제1실시예에 따르면, S10단계에서 페오피틴을 추출하는데 출발물질로 사용되는 녹색식물 또는 미세조류의 선택에 특별한 제한을 두고 있지 않으며, 클로로필을 함유하는 모든 식물 또는 미세조류라면 모두 적용될 수 있다. 클로로필을 함유하는 모든 식물 또는 미세조류는, 예를 들면, 뽕잎, 솔잎, 대추, 칡뿌리, 다시마, 깻잎, 두충껍질, 시금치, 케일, 클로렐라, 스피루리나 등을 포함할 수 있다.

제1실시예에 따르면, 페오피틴(pheophytin) 추출물을 추출하는 단계(S10)에서 사용되는 추출용매는, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 이들 각각의 수용액 중 어느 하나를 사용할 수 있으며, 사용되는 추출용매의 농도는 85% 내지 100% 인 것을 사용한다.

제1실시예에 따르면, 페오피틴(pheophytin) 추출물을 추출하는 단계(S10)에서 사용되는 산은 염산(HCl)일 수 있다. S10 단계에서 산을 첨가하는 것은, 클로로필 분자 내에 포함된 마그네슘 원자를 탈리 시키기 위한 것으로서, 첨가하는 산의 종류에 대해 특별한 제약은 없으며, 염산, 황산, 인산 등의 통상의 무기산 또는 아세트산 등의 통상의 유기산 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.

제1실시예에 따른 S20 단계는, 예를 들면 헥산의 양은 추출용매의 1/10 내지 2/10 부피배를 사용하고, 물의 양은 추출용매의 1/3 내지 1/2 부피배를 사용할 수 있다.

제1실시예에 따르면, 클로로필을 추출한 후 정제하는 별도의 공정을 거치지 않고, 클로로필을 함유하는 출발물질(원재료)로부터 바로 페오피틴을 추출하더라도 카본블랙(carbon black)에 의해 페오피틴의 정제도를 향상시킬 수 있는 특징이 있다.

즉, 카본블랙(carbon black)은 불순물의 응집을 통한 결정화를 형성하는 씨종자(seed) 역할을 하고 그로 인해 페오피틴 이외의 물질 제거 효율이 향상됨으로써 정제도를 높일 수 있다.

보관단계(S30)는, 예를 들면 녹색식물 또는 미세조류의 1/20 내지 1/10 부피배의 카본블랙(carbon black)을 첨가하여 1시간 내지 2시간 동안 교반한 후, 소정의 시간 동안 보관하는 단계일 수 있다. 본 실시 예에서 소정의 시간은, 카본블랙에 의해 불순물이 응집될 수 있을 정도의 시간을 의미한다.

다르게는, 보관단계(S30)는 -20℃ 내지 -10℃ 온도에서 적어도 4시간 이상 동안 보관하는 단계일 수 있다. 즉, -20℃ 내지 -10℃ 온도의 저온에서 보관단계(S30)를 수행함으로써 카본블랙(carbon black)에 의한 응집 효율을 향상시킬 수 있다.

제1실시예에 따르면, 페오피틴(pheophytin)을 획득하는 단계(S40)는, 보관단계(S30)의 수행 결과물을 에탄올로 세척하여 정제한 후, 정제 된 용액에서 헥산을 제거하는 과정을 포함한다. 예를 들면, 보관단계(S30)의 수행 결과물에 에탄올을 넣고 교반한 후, 층 분리가 일어날 때까지 방치하여 헥산 층에 잔존하는 불순물을 제거한 후, 헥산 층을 회전 진공 감압 농축하여 용매를 제거할 수 있다.

제1실시예에 따르면, 염기성화 하는 단계(S50)에서 첨가되는 염기는, 예를 들면, 수산화칼륨, 수산화칼슘 또는 수산화나트륨 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 수산화나트륨을 사용한다.

제1실시예에 따른 S60 단계는, 예를 들면 60℃ 이상의 열을 가하면서 약 4시간 내지 8시간 동안 교반하는 동작을 수행할 수 있다. 여기서, 60℃ 이상의 열을 가함으로써 반응속도를 촉진하고 수율을 높이는 효과를 얻을 수 있다. 본 실시 예에서 용매가 날라가지 않도록 냉각장치를 별도로 설치할 수 있다.

제1실시예에 따르면, S70 단계의 중화처리는 염 클로린 e6를 수득하기 위해서 약염기를 이용하여 pH를 7내지 9로, 바람직하게는 pH를 8 내지 9로 조절하는 것이다.

제1실시예에 따르면, S70 단계는, 중화처리 이후, 중화처리 수행 결과물을 아세톤으로 세척하는 단계 및 아세톤으로 세척하는 단계의 수행 결과물을 에탄올로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이로써, 염 클로린 e6 이외의 불순물이 제거되어 고순도의 염 클로린 e6를 수득할 수 있다.

제2실시예

제2실시예에 따르면, 제1실시예의 S10 단계 내지 S70 단계 이후에, 염 클로린 e6를 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 용해시킨 후, 산을 첨가하여 산성화하는 단계(S80); 상기 산성화 하는 단계의 수행 결과물을 감압 농축하여 상기 용매를 제거하는 단계(S90); 상기 용매를 제거하는 단계의 수행 결과물을 에틸아세테이트로 용해시킨 후, 물을 첨가하여 화학식 4의 산 클로린 e6를 생성하는 단계(S100); 를 더 포함한다. 즉, 제2실시에 따르면 산 클로린 e6가 제조된다.

(화학식 4)

제2실시예에 따르면, 산을 첨가하여 산성화하는 단계(S80)에서 첨가되는 산은, 반응 후 제거가 용이한 트리플루오르아세트산, 아세트산 중 어느 하나를 사용 할 수 있으며, 바람직하게는 트리플루오르아세트산을 사용한다.

제2실시예에 따르면, 산 클로린 e6를 생성하는 단계(S100)는, 물을 첨가한 후에 상기 에틸아세테이트를 감압 농축하여 제거하는 단계; 및 감압 농축하여 제거하는 단계의 수행 결과물을 진공 건조하는 단계; 를 더 포함하도록 구현될 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시 예에 따른 '산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체'를 제조하는 방법을 설명하기로 한다. 본 방법에 따른 '복합체'는 상술한 산 클로린 e6에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 복합체를 제조하는 방법은, 화학식 4를 가지는 산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)을 혼합하는 단계(S200);

(화학식 4)

상기 혼합하는 단계의 수행 결과물에 염기를 첨가하여 pH를 조절하는 단계(S210); 상기 pH를 조절하는 단계의 수행 결과물을 멤브레인 필터를 이용하여 여과시키는 단계(S220); 및 상기 여과시키는 단계의 수행 결과물을 동결 건조시켜 분말로 만드는 단계(S230); 를 포함한다.

본 실시 예에 따르면, S210 단계는, 염기 NaOH를 사용하여, pH를 8-9로 조절하는 단계일 수 있다.

본 실시 예에 따르면, S200 단계에서 산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)는 1:1의 무게비로 혼합하여 사용할 수 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시 예에 따른 '페오피틴(pheophytin)' 제조방법, '클로린 e6'를 제조하는 방법 및 '클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체' 제조방법을 구체적으로 설명하기로 한다.

페오피틴(pheophytin)의 추출 및 정제

본 방법은, 본 발명의 일 실시 예에 따른 '페오피틴(pheophytin)'의 제조방법이다. 본 방법의 페오피틴의 추출 및 정제 방법에 따라 획득된 페오피틴은 상술한 '클로린 e6' 및' 복합체'를 제조하는데 사용될 수 있다.

본 방법에 따르면, 페오피틴을 추출하는데 출발물질로 사용되는 녹색식물 또는 미세조류의 선택에 특별한 제한을 두고 있지 않으며, 클로로필을 함유하는 모든 식물 또는 미세조류라면 모두 적용될 수 있다. 클로로필을 함유하는 모든 식물 또는 미세조류는, 예를 들면, 뽕잎, 솔잎, 대추, 칡뿌리, 다시마, 깻잎, 두충껍질, 시금치, 케일, 클로렐라, 스피루리나 등을 포함할 수 있다.

본 방법에 따르면, 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 추출용매에 용해시킨 후 산을 첨가하고 교반 하면, 첨가된 산에 의해 클로로필 분자 내에 포함된 마그네슘 원자가 탈리 되면서 페오피틴으로 변환한다.

즉, 본 방법에 의해 녹색식물 또는 미세조류로부터 하기 화학식 1로 표시되는 클로로필을 추출하는 별도의 과정을 거치지 않고, 하기 화학식 2로 표시되는 고순도의 페오피틴을 추출할 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

본 방법에 따르면, 추출용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 유기용매 또는 이들 각각의 수용액 중 어느 하나를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용한다. 추출용매의 순도는 약 85% 이상의 농도를 갖는 것이 바람직한데, 이는 85% 미만의 농도를 사용할 경우 추출용매에 극성 용매인 물의 비율이 높아지면서 불순물의 함유량이 많아지며, 추출 교반 시에 과량의 물에 의해 페오피틴이 변성될 수 있기 때문이다.

본 방법에 따르면, 마그네슘 탈리를 위해 첨가하는 산의 종류에 대해 특별한 제약은 없으며, 염산, 황산, 인산 등의 통상의 무기산 또는 아세트산 등의 통상의 유기산 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 염산을 사용하는 것이다.

본 방법에 따르면, 마그네슘 탈리를 위해 첨가하는 산의 종류로 염산을 사용함으로써, 세포벽을 구성하는 펙틴을 녹여 세포벽을 무르게 하여 페오피틴의 추출 효율을 증대시키는 효과를 얻을 수 있다.

또한, 종래에는 녹색식물 또는 미세조류로부터 클로로필을 추출하는 별도의 공정을 거침으로써 페오피틴 추출까지 8시간 내지 12 시간 이상이 소요되었지만, 본 방법에 따른 염산의 첨가를 통해 클로로필을 추출하는 별도의 공정을 거치지 않으므로 페오피틴이 90% 이상의 수율로 추출되기까지 약 4시간이 소요되므로 추출 시간을 단축시킬 수 있다.

이후, 페오피틴 추출물에, 추출용매의 1/10 내지 2/10 부피배의 헥산과 추출용매의 1/3 내지 1/2 부피배의 물을 넣고 교반한 후 필터링 한다. 본 방법에 따르면, 용해도와 용매의 비중에 의한 층 분리를 통해 페오피틴은 최대한 헥산 층으로 이동하고, 헥산 층에 포함될 수 있는 페오피틴 이외의 불순물은 물 층으로 이동하게 된다.

이후, 필터링 과정이 적용된 결과물에, 녹색식물 또는 미세조류의 1/20 내지 1/10 부피배의 카본블랙을 첨가하여 약 1시간 내지 2시간 동안 교반한 후, -20℃ 내지 -10℃의 저온에서 4시간 이상 보관하는 보관단계를 수행한다. 이후, 실온에서 방치하여 카본블랙을 첨가한 용액의 온도가 실온이 될 때까지 방치하면, 헥산-추출용매 수용액으로 층 분리가 일어나며, 헥산 층만 분리할 수 있다.

즉, 보관단계에서 카본블랙(carbon black)은 불순물의 응집을 통한 결정화를 형성하는 씨종자(seed) 역할을 하며, 특히 -20℃ 내지 -10℃의 저온에서 보관함으로써, 페오피틴 이외의 불순물(예를 들면, 지질, 베타카로틴 등)의 흡착 효율이 향상되어 고순도의 페오피틴을 얻을 수 있다.

이와 같이 본 방법에 따르면, 클로로필을 추출한 후 정제하는 별도의 공정을 거치지 않고 클로로필을 함유하는 출발물질(원재료)로부터 바로 페오피틴을 추출하더라도 필터링 및 카본블랙(carbon black)에 의해 페오피틴의 정제도를 향상시킬 수 있는 특징이 있다.

본 방법에 따르면, 보관단계의 온도는 -20℃ 내지 -10℃, 보관시간은 4시간 이상, 바람직하게는 3시간 이상이 바람직하다. 보관단계의 온도가 -10℃ 보다 높은 경우, 용매의 냉각속도가 늦어 추출용매 및 물 층에 포함된 불순물과 헥산 층에 포함된 페오피틴이 분리되는 효율이 낮아지며, 추출용매 및 물 층에 포함된 불순물이 결정화되기 어려워 페오피틴의 수득에 장애가 될 수 있다. 또한, 보관단계의 온도가 -20℃ 보다 낮은 경우, 불순물 층과 헥산 층과의 분리 속도가 늦어져 불순물 제거 효율이 낮아질 수 있다.

이상 설명한 본 발명의 방법으로 추출 및 정제된 페오피틴은 85% 이상의 순도를 가지며, 녹색식물 또는 미세조류에 포함된 클로로필의 양에 대비하여 90% 이상의 수율로 추출이 가능하다.

염 클로린 e6의 변환

본 방법은, 본 발명의 일 실시 예에 따른 '염 클로린 e6'의 제조방법이다.

본 방법에 따르면, 아세톤에 용해된 페오피틴에 염기를 넣고 가열 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 염 클로린 e6를 수득한다.

<화학식 3>

본 발명의 염 클로린 e6의 제조과정은 '이분자 친핵성 치환반응(SN2)'에 의해 이루어진다. 이분자 친핵성 치환반응은 페오피틴을 아세톤으로 용해시킨 용액에 페오피틴 한 분자당 2 내지 3 당량의 염기가 첨가된 조건 하에서 수행된다.

본 방법에 따른 염기는 예를 들면, 수산화칼륨, 수산화칼슘 또는 수산화나트륨 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 수산화나트륨을 사용한다.

본 방법에 따르면, 페오피틴을 아세톤으로 용해시킨다. 용해된 아세톤 용액에 수산화나트륨을 첨가한 후, 60℃ 이상의 열을 가하면서 약 4시간 내지 8시간 동안 교반한다. 60℃ 이상의 열을 가함으로써 반응속도를 촉진하고 수율을 높이는 효과를 얻을 수 있다.

상기 반응이 종료된 후, 염 클로린 e6를 수득하기 위해서 약염기를 이용하여 pH를 7내지 9로 조절하는 중화처리를 하며, 바람직하게는 pH를 8 내지 9로 조절한다. pH8 미만의 경우, 클로린 e6의 카복실기(carboxyl group) 에 Na 치환이 2개 이하가 되며, pH9 이상의 경우 클로린 e6의 포르피린(porphyrin) 중앙 자리에 Na가 치환되어 정제도가 떨어질 수 있다.

중화처리가 종료되면 생성된 염 클로린 e6 결정을 수득한다. 수득한 염 클로린 e6를 아세톤, 에탄올 순으로 세척하면 염 클로린 e6 이외의 불순물이 제거되어 고순도의 염 클로린 e6를 수득할 수 있다.

이상의 방법으로 수득한 염 클로린 e6는 90% 이상의 순도를 가지며, 이론적 수득률과 비교하여 90% 이상의 수율로 수득된다.

필요에 따라, 이상의 방법으로 수득한 염 클로린 e6는 HPLC 등의 통상의 정제공정을 추가로 수행하여 그 순도를 높일 수 있다. 특히 원료물질에 포함된 클로로필은 대부분 클로로필 a와 b가 3:1~5:1의 몰 비로 공존하게 되는데, 이들 화합물은 컬럼을 이용한 고도의 분리법 이외에는 완전히 분리하기가 힘든 것으로 알려져 있다. 따라서, 원료물질에 포함된 클로로필이 클로린 반응까지 공존하면서 반응하게 되므로, 클로린의 정제도를 향상시키기 위해서는 컬럼을 하여야 한다.

산 클로린 e6의 변환

본 방법은, 본 발명의 일 실시 예에 따른 '산 클로린 e6'의 제조방법이다.

본 방법에 따르면, 반응용매에 용해시킨 염 클로린 e6에 산을 넣은 후, 에틸아세테이트와 물을 첨가하여 하기 화학식 4로 표시되는 산 클로린 e6를 수득한다.

<화학식 4>

예를 들면, 반응용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아세톤을 사용한다.

예를 들면, 산은 트리플루오르아세트산, 아세트산 중 어느 하나를 사용 할 수 있으며, 바람직하게는 트리플루오르아세트산을 사용한다. 이들은 반응 완료 후 진공 감압, 추출 등으로 제거가 용이하기 때문이다. 만약 염산이나 황산을 사용할 경우 클로린 e6의 포르피린 분자의 NH에 염을 생성하여 정제도를 떨어트릴 수 있다.

본 방법에 따르면, 염 클로린 e6를 아세톤에 용해시킨 후, 용해된 아세톤 용액에 트리플루오르아세트산을 첨가하여 산 클로린 e6를 수득한다. 이후, 산 클로린 e6에 에틸아세테이트와 물을 첨가하여 불순물을 제거함으로써 고순도의 산 클로린 e6를 수득할 수 있다.

이상의 방법으로 수득한 산 클로린 e6는 95% 이상의 순도를 가지며, 이론적 수득률과 비교하여 90% 이상의 수율로 수득된다.

산 클로린 e6와 PVP의 복합체 제조

본 방법은, 본 발명의 일 실시 예에 따른 '산 클로린 e6와 PVP 복합체' 제조방법이다. 본 발명의 산 클로린 e6와 PVP 복합체 제조는 산 클로린 e6와 PVP의 분자-분자 배위 결합을 유도함을 의미한다. 산 클로린 e6는 수용액 상에서 응집 형성(aggregation)에 의한 광활성도가 떨어지는 문제가 있으며, 이를 위해 PVP를 사용하여 응집 형성을 막고, 산 클로린 e6와의 배위 결합을 통해 안정성을 증대하는 효과를 유도할 수 있다. 여기서 응집 형성을 억제하기 위해 사용되는 고분자로 PVP를 사용하였지만, 이에 한정되지 않으며 수용성을 갖는 고분자와 cyclodextrin류와 같은 배위 결합이 용이한 물질의 사용이 가능하다.

본 방법에 따르면, 멸균수-세균을 전기증기소각약물 등에 의해 사멸시킨 물-에 산 클로린 e6와 PVP를 무게 비 1:1로 넣고 1N의 NaOH를 pH8-9가 되도록 조절하여 약 2시간 동안 교반 한다. 복합체는 0.22㎛ 멤브레인 필터로 멸균 여과된다. 이후, 멸균 여과된 복합체는 동결 건조하여 분말 상태로 만든다.

예를 들면, 동결건조 방법은 -20℃ 내지 -40℃의 저온과 20mba의 저압을 유지하면서 냉각시키고 콜드트랩(-70℃ 내지 -80℃)을 이용하여 수분을 제거하는 방법일 수 있다. 상술한 저온 및 저압에서는 수분이 증기상태로 승화되어 제거될 수 있는 진공상태가 된다. 동결상태에서 승화 건조되므로 복합체의 표면이 경화되거나 수축되지 않는다. 과도한 건조에 의해 피해를 입을 수 있으므로 최종 수분의 양이 1.5% 내지 2% 사이에서 건조되도록 유지한다.

본 발명에서 복합체 형성률은 산 클로린 e6의 정제도에 따라 다르며, 복합체의 형성이 100%에 도달하기 위해서는 산 클로린 e6의 정제도가 95% 이상이어야 한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시 예들에 따르면, 클로로필을 정제하지 않고 클로로필을 함유하는 출발물질로부터 바로 페오피틴을 추출함으로써 대량 생산에 적합할 수 있다. 즉, 본 발명은 기존의 방법보다 간단한 공정으로 반응속도와 정제도를 향상시키고, 수율을 향상시킴으로써, 대량생산에 적합한 방식으로 합성 및 제조하는 공정을 가지며, 페오피틴의 정제도와 수율이 높을수록 클로린 e6의 수율 및 정제도도 높아지게 된다.

또한, 본 발명의 실시 예들에 따르면, 추출용매와 염산을 이용하여 특정 원재료의 제약 없이 클로로필을 함유하는 출발물질로부터 페오피틴을 추출하고, 이후 카본블랙의 첨가, 용매의 용해도와 극성도 차이 활용, 저온보관처리를 통해 페오피틴 이와의 물질을 제거하는 간단하고 효율적인 방법으로 고순도의 페오피틴을 얻을 수 있으며, 이를 통해 염 클로린 e6의 합성에서는 반응시간이 단축되고, 정제도가 향상되었다.

따라서, 본 발명에 의해 제조된 페오피틴을 이용함으로써 클로린 e6의 수율 및 정제도를 향상시킬 수 있으며, 이에 따라 고순도의 복합체 제조가 가능하다.

이하에서는 본 발명의 실시 예들에 따라서 실험한 예들을 설명한다.

실험 1. 페오피틴의 추출 및 정제

클로로필을 함유한 천연물질(스피루리나, 클로렐라, 뽕잎의 분말 상태)1kg에 10L 에탄올과 1L의 염산 용액을 첨가하고, 4시간 교반한다. 교반 후 2L의 헥산을 첨가하고, 물을 2L를 첨가한 후 약 1시간 교반 후 필터링 하여 스피루리나 찌꺼기를 제거한다. 이 용액에 카본블랙 약 100g을 첨가하고, 약 1시간 교반하여 -20℃의 저온에서 약 4시간동안 보관하는 보관단계를 수행한다. 보관단계 수행 후에 용액이 실온이 될 때까지 방치하면, 헥산-에탄올수용액으로 층 분리가 일어나며, 헥산 층만 분리한다.

분리 된 헥산 용액에 70% 에탄올 1L를 넣고, 약 30분간 교반하여 층 분리가 일어날 때까지 방치하여 헥산 층의 잔존해 있는 불순물을 제거한 후 헥산층을 회전 진공 감압 농축으로 용매를 제거한다.

상기의 과정을 통해 얻어지는 페오피틴은 스피루리나의 경우 약 40g을 얻을 수 있으며, 클로렐라의 경우는 약 35g, 뽕잎의 경우는 20g을 얻을 수 있다. 이것의 수득률은 클로로필을 함유한 해당 출발물질이 함유하는 클로로필의 양에 대비하여 약 90%이상의 추출이 됨을 확인할 수 있었다.

얻어진 페오피틴을 소량 취한 후 하기 조건에서 HPLC(High Pressure Liquid Chromatography)를 이용하여 페오피틴 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다.

[HPLC 분석조건]

- 분석기기: agilent 1200 시스템

- 샘플 주입량: 10㎕

- 전개액: 메탄올: 아세토나이트릴: 디클로로메탄: 물 = 67.5: 9.5: 22.5: 0.5(부피비)

- 용매유속: 1ml/min

- 분석파장: 450nm

상기 조건에 의해 수득한 페오피틴에 대한 HPLC 분석 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이 머무름 시간(retention time)이 약 15~25분에서 페오피틴을 확인할 수 있었으며, 0~15분의 불순물은 거의 제거되었음을 확인할 수 있었다. 또한 페오피틴의 정제도는 약 85% 이상임을 확인할 수 있었다.

또한 얻어진 페오피틴은 도 2에 나타낸 바와 같이 NMR을 통해 정성분석을 하였고, 페오피틴의 정제를 기존 방법과 달리 클로로필 추출 과정 없이 보다 더 간단한 공정을 통해 높은 정제도와 수득률을 갖는 제조방법으로 고순도 페오피틴을 얻었다.

실험 2. 염 클로린 e6의 변환

실험 1에서 얻은 페오피틴 10g을 아세톤 500ml에 용해한 후 염기시약인 1M 수산화나트륨용액을 처리하여 용액의 pH를 약 12 이상이 되도록 만들고, 동시에 약 60℃의 열을 가해주면서 약 4시간동안 교반한다. 이때 첨가된 염기시약은 페오피틴 한 분자에 염기는 세 분자가 반응할 수 있도록 염기 시약은 페오피틴의 양에 대비하여 충분한 양인 약 3~5당량 염기용액에 해당하는 1N의 NaOH 35ml~55ml를 첨가한다.

반응이 종결된 후 pH 8~9를 맞추고 약 1시간동안 pH 변화가 없음을 관찰한다.

용액 내 염 클로린 e6 결정을 수득하여 이를 에탄올, 아세톤으로 세척하고, 얻어진 결정을 에탄올 용액에 약 2시간 동안 교반을 진행하여 주면 클로린 이외의 불순물을 제거하고, 잔존해 있는 수산화나트륨을 제거하여 pH를 낮출 수 있다.

상기에서 얻어진 염 클로린 e6를 소량 취한 후 HPLC로 염 클로린 e6 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

[HPLC 분석조건]

- 분석기기: agilent 1200 시스템

- 샘플 주입량: 10㎕

- 전개액: 메탄올: 아세토나이트릴: 0.1% 트리플루오르아세트산 = 50: 50 (부피비)

- 용매유속: 1ml/min

- 분석파장: 407nm

상기 조건에 의해 수득한 염 클로린 e6 대한 HPLC 분석결과에 의하면, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 머무름 시간이 약 4분 정도에서 클로린의 해당피크를 확인할 수 있었으며, 다른 시간대에서 불순물은 거의 확인되지 않았다.

또한, 염 클로린 e6의 정제도는 약 90%이상임을 확인할 수 있었으며, 페오피틴 10g을 반응시켜 클로린 e6 약 7.54g을 수득했다. 이는 이론적인 수득률과 비교하여 약 90%이상의 수득률에 해당한다.

상기에서 수득한 고순도 염 클로린 e6의 Mass spectrum을 통한 정성분석을 도 4에 나타내었다.

실험 3. 산 클로린 e6의 변환

실험 2에서 얻은 염 클로린 e6 5g을 아세톤 250ml와 트리플루오르아세트산 25ml를 넣고, 약 4시간 이상 교반 한다. 교반 후 회전 진공 감압 농축으로 용매와 산을 제거한다. 이를 에틸아세테이트 500ml 정도로 용해하고, 물 500ml를 첨가하여 세척한다. 약 1시간 교반한 후 층 분리가 이루어질 때까지 방치한다. 물 층은 버리고, 에틸아세테이트 층을 모아 용매를 제거한다.

얻어진 산 클로린 e6의 정제도를 확인하기 위하여 UV-vis spectrometer를 활용하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

기준 물질은 Frontier 사에 판매하는 >95%의 클로린 e6를 활용하였다. 기준 물질을 8, 10, 12 ppm 농도에서의 검량선을 통해 제조한 산 클로린 e6의 10ppm 용액을 절대 비교를 통해 정제도를 확인하였다.

그 결과, 산 클로린 e6의 정제도는 95%이상이며, 산 클로린 e6 약 4.15g을 수득했다. 이는 이론적 수득양의 90%에 해당한다.

또한 이것의 정성 분석을 위해 NMR을 분석하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

실험 4. 산 클로린 e6와 PVP의 복합체 제조

물 50ml에 얻어진 산 클로린 e6 5g과 PVP 5g을 넣고, 교반 하면서 1N NaOH를 가하여 pH 8~9 사이가 되도록 맞춘다. 약 2시간 교반한 후 0.22um 멤브레인 필터에 필터 한다. 필터 한 용액을 동결 건조하여 물을 제거한다.

복합체(착물)를 형성한 화합물의 정량 분석을 위하여 UV-vis spectrometer를 활용하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 기준 물질은 Fronter 사에서 판매하는 >95%의 트리소오듐 클로린 e6를 활용하였다. 기준 물질의 검량선을 위하여 6, 8, 10 ppm 농도에서 확인하였으며, 기준 물질과 제조한 착물 형성 화합물을 각각 클로린 e6가 8ppm이 되도록 용액을 만들어 절대 비교를 통해 정제도를 확인하였다.

그 결과, 복합체의 정제도는 95% 이상이며, 복합체 약 9.5g을 수득했다. 이는 이론적 수득양의 약 95%에 해당된다.

상기와 같이 본 발명은 비록 한정된 실시 예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명은 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims (2)

1. 클로로필을 함유하는 녹색식물 또는 미세조류를 에탄올 용매에 용해시킨 후 염산을 첨가하고, 교반하여 페오피틴(pheophytin) 추출물을 추출하는 단계;
   상기 페오피틴(pheophytin) 추출물에 헥산과 물을 넣고 혼합한 혼합물을 필터링하여 고순도의 페오피틴(pheophytin)을 제조하는 단계;
   상기 고순도 페오피틴(pheophytin)을 아세톤에 용해한 후 수산화나트륨 용액을 넣고 가열 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 염 클로린 e6를 수득하는 단계;
   <화학식 3>
   

   

   
   상기 수득된 염 클로린 e6에 아세톤 및 트리플루오르아세트산을 넣고 교반한 후 회전 진공 감압 농축으로 용매와 산을 제거하고, 에틸아세테이트와 물을 첨가하여 하기 화학식 4로 표시되는 산 클로린 e6를 수득하는 단계; 및
   <화학식 4>
   

   

   
   상기 화학식 4를 가지는 산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 무게 비 1:1로 넣고 혼합한 후 1N의 NaOH를 pH 8-9가 되도록 조절하여 2시간 동안 교반 한 후 0.22㎛ 멤브레인 필터로 멸균 여과하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 산 클로린 e6와 PVP(polyvinylpyrrolidone)의 복합체 제조방법.
2. 삭제

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