KR20090032413A - 안정화된 클로로필 ａ 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 클로로필 a 및 (b) 상기 클로로필 a의 안정화제로서의 항산화제를 포함하는 안정화된 클로로필 a 조성물 및 클로로필 a의 안정화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 클로로필 a 함유 식품에서 클로로필 a의 안정화를 매우 성공적으로 달성하고 있다. 본 발명에서 이용되는 안정화제는 안정화 효능이 우수할 뿐만 아니라 영양학적으로도 우수한 식품 재료이다. 본 발명의 안정화된 클로로필 a 조성물은 비교적 간단한 공정에 따라 제조되며, 대량생산에 적합하다.
클로렐라, 클로로필 a, 엽록소, 안정화제, 항산화제, 흑대두, 에탄올

Description

안정화된 클로로필 ａ 조성물{Compositions Containing Stabilized Chlorophyll ａ}
본 발명은 클로로필 a의 안정화 방법 및 안정화된 클로로필 a 조성물에 관한 것이다.
엽록소, 즉 클로로필 a는 식물체의 잎, 조류 또는 해조류의 엽록체 내에 존재하는 광합성 색소로서 암과 당뇨병과 같은 성인병 그리고 위장병과 같은 일반 질환에까지 광범위하게 효과가 있는 것으로 알려지고 있으나 아직까지 그 자세한 효능 및 작용 기작은 알려져 있지 못한 상황이다.
클로로필 a를 생체 내에서 이용하기 위해 보통 엽록체가 다량으로 존재하는 식물체의 잎, 해조류(대표적인 예: 클로렐라)등을 다량으로 소화기관을 통해 섭취하는 방법이 주로 이용되어 왔으나 클로로필 a가 생체 내에서 흡수되는데 있어서 소화 과정에서 엽록체의 분해 효율이 그다지 높지 않기 때문에 직접적으로 클로로필 a의 효과를 보는데 있어서 한계가 있다고 하겠다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해서는 분리 정제된 형태의 클로로필 a를 섭취하는 것이 가장 효과적이다. 따라서 클로로필 a를 건강 보조 식품 및 기능성 식품으로 이용하기 위해서는 엽록소의 효과적인 추출 방법과 농축 방법의 개발이 필수적이며 또한 분리 정제된 엽록소를 일정한 보존 기간 동안에 안정화시키는 것이 중요하다.
클로로필 a를 천연 원료로부터 추출하는 방법으로는 에탄올 또는 아세톤과 같은 유기 용매를 이용하는 방법이 공정의 편의상 많이 사용되어 왔으나 유기 용매가 포함된 클로로필 a 추출액의 경우 건강식품으로 직접 이용할 수가 없으며 또한 공기와의 접촉 시 추출액 상에서 엽록소가 빠른 속도로 파괴되는 단점이 발견되었다.
이를 해결하기 위해 분리 정제된 클로로필 a를 당화 반응을 시켜 건강식품 및 식품재료에 침착이 가능하게 하거나 점차적으로 유기용매를 다량의 수용액으로 치환하여 안정성을 높이고 식품 음료로 응용 가능하도록 한 방법들이 개발되었다. 이러한 방법들은 분말 형태의 건강 보조 식품 및 기능성 식품에서 클로로필 a 단일 성분만을 첨가 또는 함유량을 높이고 보존 기간 동안의 안정성을 유지하는데 한계가 있기 때문에 새로운 형태의 고순도 엽록소 a 분리 정제 및 안정화 방법의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 클로로필 a를 제품화하기 위한 선결 과제로서 클로로필 a가 안정화될 수 있는 제형이 분말형태임을 확인하고, 일정 보존 기간 동안 클로로필 유효성을 유지하기 위해 필요한 방법을 개발하고자 노력한 결과, 클로로필 a에 안정화제로서 항산화제를 포함시켜 제조하는 경우에는 클로로필 a 제품의 안정성이 크게 증가함을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 안정화된 클로로필 a 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 클로로필 a의 안정화 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 안정성이 증가된 클로로필 a 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 클로로필 a 및 (b) 상기 클로로필 a의 안정화제로서의 항산화제를 포함하는 안정화된 클로로필 a 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 클로로필 a를 포함하는 조성물에 클로로필 a의 안정화제로서의 항산화제를 접촉(contacting)시키는 단계를 포함하는 클로로필 a의 안정화 방법을 제공한다.
본 발명자들은 클로로필 a를 제품화하기 위한 선결 과제로서 클로로필 a가 안정화될 수 있는 제형이 분말형태임을 확인하고, 일정 보존 기간 동안 클로로필 유효성을 유지하기 위해 필요한 방법을 개발하고자 노력한 결과, 클로로필 a에 안정화제로서 항산화제를 포함시켜 제조하는 경우에는 클로로필 a 제품의 안정성이 크게 증가함을 발견하였다.
본 명세서 클로로필 a를 언급하면서 사용되는 용어 “안정성”은 클로로필 a의 산화를 방지하여 생리활성이 우수한 형태의 클로로필 a가 장기간 유지되는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 바람직하게는, 상온에서의 저장 안정성을 의미한다. 일반적인 클로로필 a 제품들은 산화형 클로로필 a를 많이 포함하는 데, 본 발명에 따르면 산화형 클로로필 a의 생성을 크게 억제할 수 있는 새로운 전략을 제시할 수 있다. 산화된 엽록소 a는 엽록소 a의 생리학적 효능을 발휘하는 데 있어 불리하다.
본 발명에서 안정화제로 이용되는 것은 항산화제이다. 항산화제로서 본 발명에서 이용될 수 있는 것은, 당업계에서 항산화제로 공지된 어떠한 것도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 항산화제로는 천연 항산화제를 이용하며, 그 이유는 본 발명의 조성물이 식품으로 제품화 되는 경우 천연 항산화제를 이용하는 것이 매우 유리하기 때문이다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서 클로로필 a의 안정화제로 이용되는 것은 흑대두, 발아 현미, 효모, 표고버섯 또는 전분이다.
상기 흑대두, 발아 현미, 효모, 표고버섯 또는 전분은 식품 재료로서 매우 적합하면서도 다량의 항산화 물질들을 포함하고 있기 때문에 클로로필 a와 혼합하여 분말형태로 제품을 개발 시 클로로필 a의 안정성을 크게 증가시켜, 상온에서 장기간 클로로필 a를 보관하는 경우에도 클로로필 a의 산화를 효과적으로 억제한다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 안정화제로서 흑대두를 포함한다.
본 명세서 용어 “흑대두”는 흑대두 추출물 및 흑대두 분말을 포괄하는 의미를 갖는다. 용어 “흑대두 추출물”은 흑대두를 원료로 하여 통상적인 추출 과정을 통하여 얻은 추출물을 의미하며, 추출물은 액상 또는 고상(예컨대, 분말)의 제형을 가질 수 있다. “흑대두 분말”은 흑대두를 원료로 하여 통상적인 분말화 과정을 통하여 얻은 분말을 의미한다. 즉, 흑대두 분말은 추출 과정에서 얻은 것이 아닌, 고상의 분말을 의미한다.
본 명세서 용어 “발아 현미”는 발아 현미 추출물 및 발아 현미 분말을 포괄하는 의미를 갖는다. 용어 “발아 현미 추출물”은 발아 현미를 원료로 하여 통상적인 추출 과정을 통하여 얻은 추출물을 의미하며, 추출물은 액상 또는 고상(예컨대, 분말)의 제형을 가질 수 있다. “발아 현미 분말”은 발아 현미를 원료로 하여 통상적인 분말화 과정을 통하여 얻은 분말을 의미한다. 즉, 발아 현미 분말은 추출 과정에서 얻은 것이 아닌, 고상의 분말을 의미한다.
본 명세서 용어 “효모”는 효모 추출물 및 효모 분말을 포괄하는 의미를 갖는다. 용어 “효모 추출물”은 효모를 원료로 하여 통상적인 추출 과정을 통하여 얻은 추출물을 의미하며, 추출물은 액상 또는 고상(예컨대, 분말)의 제형을 가질 수 있다. “효모 분말”은 효모를 원료로 하여 통상적인 분말화 과정을 통하여 얻은 분말을 의미한다. 즉, 효모 분말은 추출 과정에서 얻은 것이 아닌, 고상의 분말을 의미한다.
안정화제로서 효모가 이용되는 경우에는, 가장 바람직하게는 맥주 효모가 이용된다.
본 명세서 용어 “표고버섯”은 표고버섯 추출물 및 표고버섯 분말을 포괄하는 의미를 갖는다. 용어 “표고버섯 추출물”은 표고버섯을 원료로 하여 통상적인 추출 과정을 통하여 얻은 추출물을 의미하며, 추출물은 액상 또는 고상(예컨대, 분말)의 제형을 가질 수 있다. “표고버섯 분말”은 표고버섯를 원료로 하여 통상적인 분말화 과정을 통하여 얻은 분말을 의미한다. 즉, 표고버섯 분말은 추출 과정에서 얻은 것이 아닌, 고상의 분말을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 클로로필 a의 함량은 1-90 중량% 및 항산화제의 함량은 10-99 중량%이다. 보다 바람직하게는 클로로필 a의 함량은 10-70 중량% 및 항산화제의 함량은 30-90 중량%, 가장 바람직하게는 클로로필 a의 함량은 10-40 중량% 및 항산화제의 함량은 60-90 중량%이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 운지버섯자실체, 영지버섯자실체, 상황버섯자실체 및 표고버섯자실체로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 성분을 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는 상기 4가지 성분을 모두 포함한다. 상기 추가 성분들도 클로로필 a의 안정화에 어느 정도 기여를 하며, 본 발명의 조성물의 생리학적 활성을 크게 개선시키는 작용을 한다.
본 발명의 클로로필 a의 안정화 방법에 따르면, 항산화제의 양은 특별하게 제한적이지 않다. 바람직하게는, 항산화제 100 중량부에 대하여 클로로필 a 1-20 중량부, 보다 바람직하게는 1-10 중량부, 가장 바람직하게는 2-5 중량부가 사용된다.
본 발명에 따르면, 본 발명에서 이용되는 클로로필 a는 다양한 제형을 가질 수 있다. 예를 들어, 클로로필 a는 액상 또는 분말의 제형으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 클로로필 a의 안정화 효과를 높이기 위하여, 분말 제형으로 제조하도록 해야 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 안정성이 증가된 클로로필 a 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 클로렐라에 유기용매를 처리하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 클로로필 a 추출물에 항산화제를 접촉시키는 단계.
종래의 통상적인 방법에 따르면 클로렐라로부터 클로로필 a를 추출하는 경우, 클로렐라 세포를 우선 파쇄하고 이 파쇄물(cell lysate)로부터 클로로필 a를 추출하였다. 그러나 본 발명자들은 종래의 이러한 통념에서 벗어나서 파쇄 되지 않은 인택트 클로렐라를 이용하여 매우 높은 수율로 클로로필 a를 제조하는 데 성공하였다. 이러한 성공적인 클로로필 a의 추출은 종래 기술들을 고려하면, 예기치 않은 것으로서, 매우 놀라운 결과이다.
본 명세서에서, 용어 “인택트 클로렐라”는 파쇄하지 않은 클로렐라를 의미한다. 용어 “인택트 클로렐라”는 당업계에서 통상적으로 사용되는 용어 “생클로렐라(live chlorella)”와 동일한 의미를 갖는다.
세포 파괴 공정 없이, 클로렐라에 직접적으로 유기용매, 특히 에탄올을 처리하는 본 발명의 방법은 산업적 수준의 대량 공정에 매우 적합하다. 더욱이, 세포 파쇄는 일반적으로 초음파 처리(sonication)를 통하여 실시되는 데, 이러한 초음파 처리는 정제하고자 하는 엽록소 a의 산화를 유발하여 바람직하지 않다.
종래기술에 따르면, 분쇄된 클로렐라로부터 엽록소 a가 위치한 틸라코이드(thylakoid)막을 얻기 위하여 수크로스를 이용한 원심분리법을 사용하여 여러 과정을 거친 뒤, 얻어진 틸라코이드막에 알코올 또는 아세톤을 첨가하여 엽록소를 추출한다. 또한, 지질층을 제거하기 위하여 헥산을 첨가하여 교반한 뒤 에탄올을 첨가하여 엽록소를 분리하는 법이 사용되고 있다.
그러나 본 발명의 방법은 당업계의 기술상식을 뛰어넘어 세포 파쇄 공정 없이 직접적으로 클로렐라에 유기용매, 특히 에탄올을 처리하여 엽록소를 추출한다.
이와 같이 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하면, 클로로필 a의 추출 효율도 우수할 뿐만 아니라, 세포 파쇄 과정에서 발생되는 클로로필 a의 산화 등과 같은 문제점도 막을 수 있다.
본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 유기 용매는 당업계에 공지된 다양한 유기 용매를 포함한다. 예를 들어, (ⅰ) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (ⅱ) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용 매, (ⅲ) 아세톤, (ⅳ) 에틸 아세테이트, (ⅴ) 클로로포름, (ⅵ) 부틸아세테이트, (ⅶ) 1,3-부틸렌글리콜, (ⅷ) 헥산 및 (ⅸ) 디에틸에테르가 유기 용매로 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 유기용매는 메탄올 또는 에탄올이며, 보다 바람직하게는 에탄올이다. 에탄올은 다른 유기용매와는 다르게 인체에 안전한 장점을 갖으며, 에탄올을 이용하여 분리 및 정제된 엽록소 a는 식품 원료로 이용가능 하다는 장점을 갖는다.
본 발명에서 이용되는 클로렐라로는 통상적인 어떠한 클로렐라도 가능하며, 바람직하게는 해수 클로렐라이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 클로렐라는 Chlorella ellipsoidea , Chlorella minutissima , Chlorella vulgaris , Chlorella fusca , Chlorella zofingiensis , Chlorella stigmataphora , Chlorella vulgaris 또는 Chlorella pyrenoidosa이며, 가장 바람직하게는, Chlorella ellipsoidea이다.
단계 (b)에서 사용되는 항산화제의 양은 특별하게 제한적이지 않다. 바람직하게는, 흑대두 추출물 또는 분말 100 중량부에 대하여 클로로필 a 1-20 중량부, 보다 바람직하게는 1-10 중량부, 가장 바람직하게는 2-5 중량부가 사용된다.
본 발명에 따라 최종적으로 제조되는 클로로필 a 조성물은 다양한 제형을 가질 수 있다. 예를 들어, 클로로필 a 조성물은 액상 또는 분말의 제형으로 존재할 수 있지만, 클로로필 a의 안정화 효과를 높이기 위해서는 분말 형태의 제형으로 제조되어야 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 안정성이 증가된 클로로필 a 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 클로렐라에 30-80% 에탄올을 처리하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계;
(b) 상기 클로렐라에 90-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 클로로필 a 추출물에 항산화제를 접촉시키는 단계.
본 발명의 방법은 상대적 저농도의 에탄올을 이용하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하고, 상대적 고농도의 에탄올을 이용하여 클로로필 a를 추출하는 과정으로 이루어져 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 클로렐라는 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포이다. 본 발명에서, 음파파쇄(sonication) 등으로 파쇄되지 않은 것으로서, 클로렐라 세포 그 자체를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. 일반적으로는, 세포 파쇄물(cell lysate)에 유기용매를 처리하여 클로로필 a를 추출하는 데, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용한다. 이와 같이 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하면, 클로로필 a의 추출 효율도 우수할 뿐만 아니라, 세포 파쇄 과정에서 발생되는 클로로필 a의 산화 등과 같은 문제점도 막을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 클로렐라는 해수 클로렐라이며, 보다 바람직하게는, Chlorella ellipsoidea , Chlorella minutissima , Chlorella vulgaris , Chlorella fusca, Chlorella zofingiensis , Chlorella stigmataphora , Chlorella vulgaris 또는 Chlorella pyrenoidosa이며, 가장 바람직하게는, Chlorella ellipsoidea이다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 클로렐라로부터 클로로필 a를 추출하기 전에 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 제거하는 전처리 과정을 실시하는 것이다. 이러한 전처리 과정은, 높은 순도(함량비율)로 클로로필 a를 추출할 수 있도록 한다.
상기 불순물 제거 과정은 클로렐라에 30-80% 에탄올을 처리하여 실시된다. 에탄올을 이용한 이유는, 첫째 에탄올이 불순물을 제거하는 데 가장 우수한 효율을 나타내기 때문이며, 두 번째, 최종적으로 제조되는 클로린 e6가 식품으로 이용될 것을 예상하면 인체에 무해한 에탄올을 이용하는 것이 바람직하기 때문이다. 상기 과정에서 이용되는 에탄올은 30-80%의 농도를 갖는다. 만일 30% 미만의 에탄올을 이용하면, 불순물 제거 효율이 너무 낮아지며, 80% 초과의 에탄올을 이용하면 불순물 이외의 클로로필 a도 제거되어, 클로로필 a 추출 효율이 크게 감소되는 문제점이 있다.
바람직하게는, 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 30-68%, 보다 바람직하게는 50-65%, 보다 더 바람직하게는 58-62%, 가장 바람직하게는 약 60%이다.
단계 (a)는 최소 1회 실시하며, 바람직하게는 2-7회, 보다 바람직하게는 3-6회, 가장 바람직하게는 5-6회 실시한다. 단계 (a)를 반복적으로 실시하는 경우, 예컨대, 클로렐라를 에탄올에 현탁시키고 원심분리하여 클로렐라를 침전시키는 방 식으로 클로렐라의 불순물을 제거한다.
상기 불순물을 제거하기 위한 전처리 과정을 거친 클로렐라에 90-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득한다. 이 과정에서, 에탄올의 농도가 90% 미만이면, 추출효율이 크게 감소되는 문제점이 있다.
바람직하게는, 단계 (b)에서의 에탄올의 농도는 95-100%, 보다 바람직하게는 98-100%, 가장 바람직하게는 약 100%이다.
프로토콜 A의 클로로필 a의 제조방법의 클로로필 a에 대한 수율은 5-15%, 바람직하게는 6-12%, 보다 바람직하게는 7-9%이다. 수율은 사용된 클로렐라의 건조 중량 1 g에 대한 수득한 클로로필 a의 중량비의 백분율로 계산된다.
프로토콜 A의 클로로필 a 정제도는 70-90%, 바람직하게는 70-85%, 보다 바람직하게는 72-80%이다.
단계 (c)에서 사용되는 항산화제의 양은 특별하게 제한적이지 않다. 바람직하게는, 바람직하게는, 항산화제 100 중량부에 대하여 클로로필 a 1-20 중량부, 보다 바람직하게는 1-10 중량부, 가장 바람직하게는 2-5 중량부가 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (c) 이후에 운지버섯자실체, 영지버섯자실체, 상황버섯자실체 및 표고버섯자실체로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 성분을 단계 (b)의 결과물에 첨가하는 단계를 추가적으로 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 4가지 성분을 모두 단계 (c)의 결과물에 첨가한다.
본 발명에 따라 최종적으로 제조되는 클로로필 a 조성물은 다양한 제형을 가질 수 있다. 예를 들어, 클로로필 a 조성물은 액상 또는 분말의 제형으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 클로로필 a의 안정화 효과를 높이기 위해서 분말 제형으로 제조하여야 한다.
본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 클로로필 a 함유 식품에서 클로로필 a의 안정화를 매우 성공적으로 달성하고 있다.
(ⅱ) 본 발명에서 이용되는 안정화제는 클로로필 a에 대한 안정화 효능이 우수할 뿐만 아니라 영양학적으로도 우수한 식품 재료이다.
(ⅲ) 본 발명의 안정화된 클로로필 a 조성물은 비교적 간단한 공정에 따라 제조되며, 대량생산에 적합하다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 본 발명은 클로로필 a 함유 식품에서 클로로필 a의 안정화를 매우 성공적으로 달성하고 있다. 본 발명에서 이용되는 안정화제는 안정화 효능이 우수할 뿐만 아니라 영양학적으로도 우수한 식품 재료이다. 본 발명의 안정화된 클로로필 a 조성물은 비교적 간단한 공정에 따라 제조되며, 대량생산에 적합하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 출발물질로서 적합한 클로렐라의 선택
최종적으로 클로린 e6을 얻기 위한 출발물질로서, 초음파 분쇄 클로렐라 및 초음파 분쇄 하지 않은 인택트(intact) 클로렐라[해수 클로렐라, 클로렐라 엘립소이데(Chlorella ellipsoidea), (주)클로랜드] 2개의 시료를 준비 하였다. 이어, 초음파 분쇄 클로렐라 및 인택트 클로렐라의 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는지 확인하였다. 초음파 분쇄 클로렐라 및 해수 클로렐라 각각 10 g을 취하여 에탄올을 100 ml를 첨가하여 30분, 1시간 30분, 3시간 및 12시간 동안 교반시킨 후 여과하여 추출용액을 얻었다. 추출용액에 대하여 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석을 하였고, HPLC는 SPD-M10AVP 컬럼이 장착된 동일시마즈 HPLC 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다. 레퍼런스(reference)로는, Fluka 회사의 클로로필 a를 사용하였다. 도 1a-1f에서, 머무름시간(retention time) 약 19.5분에 해당하는 피크가 클로로필 a에 해당하는 것이다.
도 1a-1f에서 볼 수 있듯이, 인택트 클로렐라를 이용하는 경우, 초음파 분쇄된 클로렐라를 이용하는 경우보다 약 20배 정도의 클로로필 a를 얻을 수 있다. 따라서 초음파 분쇄된 클로렐라보다는 인택트 클로렐라를 이용하는 것이, 클로로필 a 수율을 높이며, 결국 보다 많은 클로린 e6를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 클로렐라를 초음파분쇄하여 얻은 분쇄물을 이용한 에탄올 추출보다는 클로렐라 자체를 이용한 에탄올 추출이 클로로필 a 추출 효율이 더 우수하다는 놀라운 사실을 발견하였다. 이러한 신규 발견은, 클로로필 정제 과정을 단축할 수 있는 이점을 제공할 뿐만 아니라, 초음파파쇄 과정에서 클로로필 a가 산화되는 문제점을 회피할 수 있기 때문에 매우 중요한 것이다.
실시예 2: 클로렐라로부터 클로로필 a의 수득
프로토콜 A
A-1: 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 불순물의 제거
(주)클로랜드에서 구입한 해수 클로렐라(Chlorella ellipsoidea)에서 우선 염분을 제거하기 위하여, 증류수로 세척한 다음 5000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 클로렐라를 침전시켰다. 이어, 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하였다. 증류수에 의한 세척 과정을 총 5회 실시한 다음, 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는 지 확인하였다. HPLC는 SPD-M10AVP 컬럼이 장착된 동일시마즈 HPLC 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다. 레퍼런스(reference)로는, Fluka 회사의 클로로필 a를 사용하였다. HPLC 결과는 도 2a에 나타나 있다.
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 머무름시간(retention time) 약 9.7 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰이 되었고, 머무름시간 2.5-7.5 min에서 다른 여러 성분에 해당되는 피크가 관찰되었다.
해수가 제거된 클로렐라(파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체) 100 g에 60% 에탄올 300 ml을 첨가하여 세척하고, 5000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 클로렐라를 침전시켜, 머무름시간 2.5-7.5 min에 있는 불순물을 제거하였다. 이와 같은 에탄올 세척 과정을 총 6회 반복 실시하였다. 도 2b-도 2g는 에탄올 세척 과정에서 원심분리한 후 형성된 상층액에 대한 HPLC 결과이다.
도 2b-도 2g에서 확인할 수 있듯이, 머무름시간 2.5-7.5 min에서 나타나는 불순물들이 60% 에탄올 세척 과정에서 다량 제거되고 있음을 알 수 있다.
한편, 80% 이상의 농도의 에탄올을 이용하여 세척 과정을 실시하면, 클로로필 a가 추출되어 세척, 즉 불순물의 제거를 할 수 없었다. 또한, 20%, 40% 및 50% 농도의 에탄올을 이용하여 세척 과정을 실시하였는데, 불순물의 제거가 60% 에탄올보다는 잘 되지 않았다.
따라서, 60% 에탄올이 가장 바람직한 세척 용액이라는 것을 알 수 있다. 즉, 60% 에탄올은 클로렐라로부터 클로로필 a를 추출시키지 않으면서도 클로렐라 세포에 포함되어 있는 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 효과적으로 추출하여, 세척된 클로렐라에 클로로필 a가 상대적으로 높은 함량으로 포함되도록 한다.
A-2: 불순물이 제거된 클로렐라로부터 클로로필 a의 추출 I
상기 불순물이 제거된 클로렐라 100 g에 100% 에탄올 1 L을 첨가하고, 3시간 동안 50-60 rpm으로 약 2시간 동안 교반하여 클로로필 a를 추출하였다. 추출과정에서 이용된 클로렐라는 음파파쇄(sonication) 등으로 파쇄되지 않은 것으로서, 클로렐라 세포 그 자체를 이용하여 추출을 하였다. 일반적으로는, 세포 파쇄물(cell lysate)에 유기용매를 처리하여 클로로필 a를 추출하는 데, 본 실시예에서는 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하였다. 추출 결과는 도 2h에 나타나 있다.
도 2h에서 볼 수 있듯이, 머무름시간(retention time) 약 8.4 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰이 되었고, 도 2a에서 관찰되었던 머무름시간 2.5-7.5 min의 불순물들이 상당량 제거되었음을 알 수 있었다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 함량(즉, 정제도)이 76.92%임을 확인할 수 있었다. 한편, 프로토톨 A의 클로로필 a에 대한 수율은 7.89% 이었다.
프로토콜 B
(주)클로랜드에서 구입한 해수 클로렐라에서 우선 염분을 제거하기 위하여, 증류수로 세척한 다음 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켰다. 이어, 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하였다. 증류수에 의한 세척 과정을 총 5회 실시한 다음, 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는 지 확인하였다. HPLC는 SPD-M10AVP 컬럼이 장착된 동일시마즈 HPLC 시스템을 이용하여 실 시하였고, 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다. 레퍼런스(reference)로는, Fluka 회사의 클로로필 a를 사용하였다. 해수가 제거된 클로렐라(파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체) 100 g에 100% 에탄올 500 ml를 첨가하여 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시키고, 상등액 클로로필 추출용액만 여과하였다. 상기 클로로필 추출물에 다이옥산(dioxane) 70 ml 및 증류수 70 ml를 첨가한 후 5시간 이상 -20℃ 냉동실에 보관하여 침전을 유도하였다. 이어, 침전물을 여과하고 물로 세척하여 클로로필 a를 수득하였다. 이어, 하기의 클로린 e6 제조를 위하여, 100% 에탄올에 상기 침전물을 용해시켰다.
도 2i에서 확인할 수 있듯이, 머무름 시간 약 4.3분에서 클로로필 a에 해당하는 주피크가 관찰이 되었고, 다른 피크는 거의 생성되지 않았다. 또한, HPLC 크로마토그램에서 클로로필 a의 함량(즉, 정제도)이 84.93%임을 확인할 수 있었다. 한편, 프로토톨 B의 클로로필 a에 대한 수율은 4.26% 이었다.
실험 결과, 다이옥산을 이용하는 경우에는, 보다 단축된 공정을 통하여 높은 수율로 클로로필 a를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 클로로필 a 분말의 안정화
상기 실시예 2의 프로토콜 A에 따라 수득한 클로포릴 a 추출액을 0.2 ㎛ 여과 장치를 이용하여 여과하였다. 이어, 진공증류농축장치(Buchi Rotavapor R-250, 국내 판매처 (주)화신과학 국외 판매처 Buchi)에 클로로필 a 안정화 후보물질(검정콩(흑대두) 분말, 발아현미 분말, 맥주효모 분말, 표고버섯 분말 또는 전 분)과 여과된 클로로필 a 추출액을 중량비로 40:1로 혼합하고, 50-60 rpm, 진공압 20 mbar 및 35℃ 이하를 유지하면서 교반 및 농축하였으며, 이 과정에서 에탄올이 제거된다. 에탄올이 제거된 분말을 진공 동결건조기(biocryos vacuum freeze dryer VFDL 12-85, (주) 바이오크라이오스)에 넣고, 냉각온도 -84℃, 진공압 1000 mbar 이하로 하여 3-4일 동안 잔재한 용매와 수분을 완전히 제거하여 안정화된 클로로필 a 분말을 얻었다.
상기 과정에서 이용된 클로로필 a 안정화 후보물질들의 클로로필 a에 대한 저장 안정성을 조사하였다. 보관 기간 별로 시료를 채취하고, 상기 실시예 2에 기재된 HPLC 시스템을 이용하여 클로로필 a 함량을 분석하였다. 실험 결과는 도 3-도 8에 나타나 있다.
도 3은 해수 클로렐라에서 추출한 클로로필 a 함유 추출액을 상온에서 일정 기간 보관시 클로로필 a의 함량이 급격히 감소하는 것을 보여준다. 상온에서의 클로로필 a의 반감기는 약 14일 정도로 분석되었다.
한편, 도 4는 안정화제로서 검정콩 추출물이 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과이다. 검정콩 추출물 식품재료가 첨가되어 분말화된 클로로필 a의 경우, 상당 기간 안정화가 되었으며 반감기는 약 70 여일 정도로 크게 증가하였다. 도 5-도 8은 각각 발아현미, 맥주효모, 표고버섯 및 전분이 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과이다. 도 5-도 8에서 볼 수 있듯이, 발아현미, 맥주효모, 표고버섯 및 전분 각각도 클로로필 a에 대한 안정성을 증가시킨다. 도 4의 결과와 도 5-도 8의 결과를 비교하여 보면, 검정콩 추출물이 다른 안정화제보다 클로로필 저장 안정성을 가장 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 클로로필 a 분말 제품의 제조
상기 실시예 3에서 안정화제로 흑대두 추출물이 첨가된 클로로필 a 분말을 세분말(細粉末) 시킬 수 있는 분쇄기로 세분말화시켰다. 이를 캡슐포장 가능토록 하는 세분말 혹은 과립형태 중 어느 하나를 선택하여 포장할 수 있으나 캡슐 포장 시 빛, 공기 및 수분에 의해 파괴되는 클로로필 a의 안정성을 위해서는 캡슐 포장이 바람직하다. 캡슐의 구성물은 안정화된 클로로필 a 분말 20 중량%, 운지버섯자실체 55 중량%, 영지버섯자실체 5 중량%, 상황버섯자실체 5 중량%, 표고버섯자실체 5 중량%, 기타 부형 및 활택제 10 중량%를 믹서기에서 혼합하고, 이어 충진 및 포장하여 안정화된 클로로필 a를 포함하는 캡슐을 최종적으로 제조하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1a-1c는 분쇄 클로렐라를 이용하여 클로로필 a에 대하여 에탄올 추출한 결과를 보여주는 HPLC(high pressure liquid chromatography) 크로마토그램이다. 도 1a-1c는 각각 30분, 1시간 30분 및 3시간 추출한 결과이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 1d-1f는 분쇄되지 않은 인택트 클로렐라를 이용하여 클로로필 a에 대하여 에탄올 추출한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다. 도 1d-1f는 각각 30분, 1시간 30분 및 3시간 추출한 결과이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 2a는 분쇄되지 않은 인택트 클로렐라에 포함되어 있는 성분들을 분석한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 2b-도 2g는 클로렐라를 60% 에탄올로 세척하여 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 제거한 결과를 보여주는 HPLC 분석 결과이다. 도 2b-도 2g는 60% 에탄올에 의한 반복적인 세척에서 각각 1회-6회째 분석 결과이다. HPLC 분석은, 세척 결과 형성된 상등액에 대한 것이다.
도 2h는 100% 에탄올로 클로로필 a를 추출한 결과를 보여주는 HPLC 분석 결과이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 2i는 다이옥산을 이용하는 클로로필 a의 제조방법에 따라 제조된 클로로필 a에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 화살표는 클로로필 a에 해당하는 피크이다.
도 3은 안정화제가 없는 클로로필 a 추출액의 저장 안정성을 보여주는 그래 프이다. 그래프에서, y = -3.0708x + 87.252이고, R2 = 0.9792이다.
도 4는 안정화제로서 흑대두 분말이 첨가되어 제조된 클로로필 a 분말의 저장 안정성을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, y = -0.4283x + 63.557이고, R2 = 0.5107이다.
도 5는 안정화제로서 발아현미가 첨가되어 제조된 클로로필 a 분말의 저장 안정성을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, y = -0.5754x + 44.713이고, R2 = 0.7105이다.
도 6은 안정화제로서 맥주효모가 첨가되어 제조된 클로로필 a 분말의 저장 안정성을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, y = -0.4743x + 49.231이고, R2 = 0.56이다.
도 7은 안정화제로서 표고버섯이 첨가되어 제조된 클로로필 a 분말의 저장 안정성을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, y = -1.1606x + 72.132이고, R2 = 0.8301이다.
도 8은 안정화제로서 전분이 첨가되어 제조된 클로로필 a 분말의 저장 안정성을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, y = -0.8418x + 61.316이고, R2 = 0.8494이다.

Claims (19)

  1. (a) 클로로필 a 및 (b) 상기 클로로필 a의 안정화제로서의 항산화제를 포함하는 안정화된 클로로필 a 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 안정화제는 흑대두, 발아 현미, 효모, 표고버섯 또는 전분인 것을 특징으로 하는 안정화된 클로로필 a 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 안정화제는 흑대두인 것을 특징으로 하는 안정화된 클로로필 a 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 클로로필 a의 함량은 1-90 중량% 및 안정화제의 함량은 10-99 중량%인 것을 특징으로 하는 안정화된 클로로필 a 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 운지버섯자실체, 영지버섯자실체, 상황버섯자실체 및 표고버섯자실체로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 성분을 추 가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안정화된 클로로필 a 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 클로로필 a는 분말 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 클로로필 a 조성물.
  7. 다음의 단계를 포함하는 안정성이 증가된 클로로필 a 조성물의 제조방법:
    (a) 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 클로렐라에 유기용매를 처리하여 클로로필 a를 추출하는 단계; 및
    (b) 상기 클로로필 a 추출물에 안정화제로서의 항산화제를 접촉시키는 단계.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 클로렐라는 해수 클로렐라인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 안정화제는 흑대두, 발아 현미, 효모, 표고버섯 또는 전분인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 안정화제는 흑대두인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 다음의 단계를 포함하는 안정성이 증가된 클로로필 a 조성물의 제조방법:
    (a) 클로렐라에 30-80% 에탄올을 처리하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계;
    (b) 상기 클로렐라에 90-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 클로로필 a 추출물에 안정화제로서의 항산화제를 접촉시키는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 클로렐라는 파쇄 되지 않은 인택트(intact) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 클로렐라는 해수 클로렐라인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 에탄올의 농도는 50-65%인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 에탄올의 농도는 98-100%인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12 항에 있어서, 상기 안정화제는 흑대두, 발아 현미, 효모, 표고버섯 또는 전분인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 안정화제는 흑대두인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 12 항에 있어서, 상기 단계 (c) 이후에 운지버섯자실체, 영지버섯자실체, 상황버섯자실체 및 표고버섯자실체로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 성분 을 단계 (c)의 결과물에 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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