KR20200138110A - 클로로필 함유 추출물의 장기간 저장방법 - Google Patents

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임지환
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Abstract

본 발명은 주위 환경에 불안정한 클로로필을 장기간 저장하는 방법으로써, 사용되는 안정화제는 스쿠알렌으로 대표되는 사슬이 긴 불포화 지방 구조를 가지는 오일류를 사용하여 클로로필을 안정화하는 것이다.

Description

클로로필 함유 추출물의 장기간 저장방법 {LONG-TERM STORAGE METHOD OF EXTRACT INCLUDING CHLOROPHYLL}
본 발명은 주위 환경에 불안정한 클로로필을 장기간 저장하는 방법으로써, 사용되는 안정화제는 스쿠알렌으로 대표되는 사슬이 긴 불포화 지방 구조를 가지는 오일류를 사용하여 클로로필을 안정화하는 것이다.
독성 및 발암성을 내포하는 합성색소와는 달리 식품에서 유래된 천연 색소물질은 비타민, 미네랄, 폴리페놀 화합물을 비롯한 여러가지 생리활성성분을 보유할 뿐만 아니라 안전하기 때문에 이에 대한 선호도와 수요가 증가하고 있다. 채소나 과일 등에서 얻을 수 있는 천연색소로서 식품산업에서 많이 이용되는 클로로필은, 포피린 링 중앙에 마그네슘(Mg) 이온이 결합된 형태를 가지고 있으며 클로로필 a,b,c,d 등의 타입으로 분류될 수 있다. 또한, 클로로필은 추출하는 식물의 품종, 재배토양, 수확시기에 따른 함량의 차이가 있고, 열이나 빛, 산소, 산, 효소 등에 의해 변하기 때문에, 품질이나 소비자 만족도 측면에서 단점이 있다.
클로로필과 클로로필 유도체들은 다양한 생리활성을 보이고 있어 상처치료, 항염, 항암치료 등의 여러 분야에서 연구되고 있다. 클로로필 유도체 중 클로린 e-6는 광역학치료에서 광감작제로서 중요한 역할을 하며, 구리 클로로필린 나트륨 역시 체취제거 및 염증제거 등의 목적으로 사용되고 있다.
이러한 클로로필 유도체의 종류로는 중앙의 마그네슘 금속이 치환되거나 제거된 페오피틴과 파이로페오피틴 계열과, 마그네슘 금속과 피톨이 제거된 클로로필라이드와 페오포르바이드 계열, 비누화 반응을 통해 생성된 클로린 계열로 나눌 수 있다.
1960 년 17 명의 포스닥으로 구성된 우드워드 교수의 합성팀이 클로로필 a 전합성을 성공시킨 전례가 있으나, 그 과정이 대단히 복잡하고 길어 상업적으로 활용하기에는 무리가 있다.
기존 식물 내 클로로필 추출방법은 아세톤, 에탄올, 헥산, 다이옥산 등 다양한 유기용매로 추출하고 원심분리, 저온침지 등을 통하여 불순물을 제거하는 방법이 있었다. 그러나, 상기 방법은 식품 및 의약에 적용할 수 없는 용매를 사용하는 문제점이 있다. 이의 개선을 위해 에탄올을 사용하여 식품 등에 응용하려는 노력이 이어지고 있으나, 불순물 제거단계나 추출단계에서 과량의 에탄올을 사용해야 하는 문제점이 있다. 그리고, 추출 후 극성 불순물을 제거하기 위하여 아세톤 등 유기용매를 사용해야 하는 문제점도 여전히 존재한다.
한편, 초임계유체를 이용한 추출은 높은 용해력, 빠른 물질 이동과 열 이동, 낮은 점도, 높은 확산계수 그리고 낮은 표면장력으로 인한 미세공으로의 빠른 침투성 등과 같은 장점을 지니고 있으며, 기존의 반응 및 분해, 추출, 증류, 결정화, 흡수, 흡착, 건조, 세정 등의 공정에서의 저효율, 저품질, 저속, 환경에 대한 악영향 등과 같은 기술적 어려움을 해결할 수 있는 추출공법이다.
초임계유체 추출은 제품생산 공정 내에서 각종 오염원 (공기, 물, 땅)의 발생을 원천적으로 방지하거나 최소화할 수 있을 뿐 아니라 인간의 건강과 환경에 대한 유해성 또한 원천적으로 방지함으로써 전통적인 제품 생산기술에 대비하여 경제적 이득을 가져올 수 있다.
한국특허등록 제 1428486 호는 초임계유체 추출법을 이용한 클로렐라 추출물의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 초임계유체 추출법을 이용한 클로로필 함유 추출물의 제조방법과는 추출대상과 추출방법이 상이하다.
한편, 클로로필은 주위 환경에 대해 대단히 불안정한 특성을 가지고 있어 그 사용범위가 한정적일 수밖에 없으며 식품사업에 응용하기도 어려웠다. 낮은pH, 즉, 산성에서는 마그네슘이 떨어져 나가는 디메탈레이션이 일어나고, 높은pH, 즉, 염기성에서는 피톨이 떨어져 나가는 비누화 반응이 일어난다. 공기 중의 산소에 노출되면 산화 반응에 의해 포리린 링이 열리는 탈색반응이 일어나 그 구조가 파괴 된다. 또한 식물 내에 존재하는 클로로필을 분해하는 여러 효소에 의해 그 구조가 분해되어 파괴된다. 그리고, 용액에 녹아있는 클로로필 간의 광유도 전자 에너지 전이에 의해 스스로 불안정한 상태로 들떠 구조가 파괴되는 특성을 가지고 있다. 특히 고온일수록 그 반응속도는 더욱 빨라진다.
용액에 클로로필이 녹아있는 경우 빛에너지에 의해 유도된 전자전이로 인해 쉽사리 구조가 변성이 되는데 빛을 차단하더라도 자연 파괴되는 것을 관측할 수 있다. 고체 상태의 클로로필은 집합체를 형성하여 광유도전자전이가 일어나지 않는다고 알려져 있지만, 광유도전자전이 이외의 작용으로 인하여 그 역시 대단히 불안정하다.
이 때문에, 클로로필의 안정화 시키려는 다양한 노력들이 이어져왔다. 클로로필과 비슷한 생리활성을 보이며 수용액 상에서 비교적 안정성을 보이는 동클로로필린나트륨은 체취 제거등 다양한 건강보조수단으로 섭취되고 있다. 하지만 천연 클로로필로부터 여러 화학반응 경로를 통하여 합성하는 단점을 가지고 있다. 또한 한국공개특허 제 2009-0032413 호는 흑대두 등에 클로로필을 접촉시켜 안정화하는 방법이 보고되어 있으나, 안정화의 기간이 비교적 짧고, 클로로필을 콩류 및 그 가공식품에 첨가하지 못하는 현행 법규상 넓게 이용하지 못하고 있다.
따라서, 클로로필을 장기간 저장할 수 있는 간편한 안정화방법에 대한 업계의 요구가 지대한 실정이다.
한국특허등록 제101428486호 한국공개특허 제 2009-0032413 호
본 발명은 스쿠알렌으로 대표되는 사슬이 긴 불포화 지방 구조를 가지는 오일류를 사용하여 클로로필을 안정화함으로써, 주위 환경에 불안정한 클로로필을 장기간 저장하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기한 명확한 목적 이외에 이러한 목적 및 본 명세서의 전반적인 기술로부터 이 분야의 통상인에 의해 용이하게 도출될 수 있는 다른 목적을 달성함을 그 목적으로 할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 클로로필 저장방법은 불포화 지방 구조를 포함하는 오일에 클로로필을 포함시키는 클로로필 용해단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 불포화 지방 구조를 포함하는 오일은, 도코사헥산산(DHA), 에이코사펜타인(EPA), 스쿠알렌, 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 마카다미아유, 낙화생유, 포도씨유, 호박씨유, 아마씨유, 아마인유, 올리브유, 옥수수유, 홍화유, 참기름, 소인유, 공액 리놀렌산, 아몬드유, 복숭아씨유, 살구씨유, 호도유, 평지씨유, 라즈베리유, 빌베리씨유, 크린베리씨유, 석류씨유, 사차인치유 및 기타 과일의 종자유, 산자나무유, 치아유, 들깨기름, 디아글리세롤 (DAG)오일, 오메가 3의 식물 유래 공급원, 에이코사펜타인(EPA)의 발효 공급원, 도코사헥산산(DHA)의 발효 공급원, 어유와 크릴유를 비롯한 기타 오메가 3, 오메가 6, 오메가 9 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 기름의 발효 공급원, 감마-리롤렌산(GLA) 및/또는 스테아리돈산(SA)의 공급원, 코코넛유 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 DHA 또는 EPA의 공급원은 어유, 미생물, 단세포 공급원 및 식물성 기름으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 GLA의 공급원은 어유, 미생물, 단세포 공급원 및 식물성 기름으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
그리고, 상기 미생물은 효모일 수 있다.
그리고, 상기 식물성 기름은 아마씨유, 대두유 및 카놀라유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
그리고, 상기 식물성 기름은 달맞이꽃 기름, 블랙커런트씨유, 보지리유 및 에치움오일로 이루어진 군에서 선택될 수 있다
또한, 상기 클로로필 용해단계는,
(A) 클로로필 추출물을 감압 증류하여 용매를 제거하고 클로로필을 고체화 하는 단계; 및
(B) 불포화 지방 구조를 포함하는 오일에 고체화된 클로로필을 녹이는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 클로로필 용해단계는,
(C) 클로로필 추출물에 불포화 지방 구조를 포함하는 오일을 가하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
(D) 상기 혼합물의 층을 분리하여 분별 추출하는 단계;를 포함할 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 저장방법은 클로로필 용해단계 이후 오일에 용해된 클로로필을 암소에 저장할 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 저장방법은 클로로필 용해단계 이후 오일에 용해된 클로로필을 -100 내지 12 ℃, -90 내지 8 ℃, 또는 -80 내지 5 ℃에서 저장할 수 있다.
그리고, 안정화지수는 15000 내지 25315, 17000 내지 25310, 또는 18500 내지 25305일 수 있다.
한편, 본 발명의 클로로필 저장방법에 이용되는 클로로필 추출물은 클로로필을 함유하는 식물 또는 미생물을 복합 초임계추출하는 클로로필 추출단계를 포함한 클로로필 함유 추출물 제조방법을 통해 수득될 수 있다.
또한, 상기 식물 또는 미생물은 목본의 잎, 목본의 싹, 초본의 줄기, 초본의 잎, 초본의 싹; 남조식물(cyanophyta), 원녹조식물(prochlorophyta), 홍조식물(rhodophyta), 녹조식물(chlorophyta), 부등편모조식물(heterokontophyta), 트리보파이타(tribophyta), 회조식물(glaucophyta), 클로라라크니오파이트(chlorarachniophytes), 녹충식물(euglenophyta), 유글레나조류(euglenoids), 착편모조식물(haptophyta), 황갈조식물(chrysophyta), 은편모조식물(cryptophyta), 크립토모나즈(cryptomonads), 와편모조식물(dinophyta), 와편모충(dinoflagellata), 파이렘네시오파이타(pyrmnesiophyta), 규조류(bacillariophyta), 황조식물(xanthophyta), 유스티그마토파이타(eustigmatophyta), 침편모조식물(raphidophyta), 갈조식물(phaeophyta), 식물 플랑크톤; 스피룰리나와 같은 청남색균류 (blue-green bacteria); 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 두날리엘라(Dunaliella) 속, 클라미도모나스(Chlamydomonas) 속, 해마토코커스(Haematococcus) 속 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 미세조류; 및 그 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 클로로필 추출단계에서, 주용매는 이산화탄소이고, 보조용매는 에탄올일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출의 전체 유속은 20 내지 120 ㎖/분, 바람직하게는 30 내지 100 ㎖/분, 보다 바람직하게는 40 내지 85 ㎖/분일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출의 보조용매 유속은 1 내지 20 ㎖/분, 바람직하게는 2 내지 15 ㎖/분, 보다 바람직하게는 3 내지 12 ㎖/분일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출 온도는 30 내지 70 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃, 보다 바람직하게는 45 내지 55 ℃일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출 압력은 70 내지 650 bar, 바람직하게는 100 내지 500 bar, 보다 바람직하게는 150 내지 400 bar일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출 시간은 45 내지 300 분, 바람직하게는 60 내지 250 분, 보다 바람직하게는 70 내지 220 분일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 함유 추출물 제조방법은 상기 클로로필 추출단계 이전에, 식물 또는 미생물을 단순 초임계추출하는 불순물 제거단계를 추가로 포함할 수 있다.
그리고, 상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 용매는 이산화탄소일 수 있다.
그리고, 상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출의 용매 유속은 20 내지 120 ㎖/분, 바람직하게는 30 내지 100 ㎖/분, 보다 바람직하게는 40 내지 85 ㎖/분일 수 있다.
그리고, 상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 온도는 30 내지 70 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃, 보다 바람직하게는 45 내지 55 ℃일 수 있다.
그리고, 상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 압력은 70 내지 650 bar, 바람직하게는 100 내지 500 bar, 보다 바람직하게는 150 내지 400 bar일 수 있다.
그리고, 상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 시간은 30 내지 350 분, 바람직하게는 40 내지 300 분, 보다 바람직하게는 50 내지 250 분일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 함유 추출물의 제조방법은 상기 불순물 제거단계 이전에, 식물 또는 미생물을 오일과 혼합하는 전처리 단계를 추가로 포함할 수 있다.
그리고, 상기 전처리 단계의 오일은 식물성 오일일 수 있다.
그리고, 상기 전처리 단계의 오일은 씨앗유, 바람직하게는 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 마카다미아유, 낙화생유, 포도씨유, 호박씨유, 아마씨유, 아마인유, 올리브유, 옥수수유, 홍화유, 참기름, 아몬드유, 복숭아씨유, 살구씨유, 호도유, 평지씨유, 라즈베리유, 빌베리씨유, 크린베리씨유, 석류씨유, 사차인치유, 과일의 종자유, 산자나무유, 치아유, 들깨기름 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 오일일 수 있다.
그리고, 상기 전처리 단계에서 식물 또는 미생물 100 중량부에 대한 오일의 중량비는 1 내지 50 중량부, 바람직하게는 2 내지 10 중량부일 수 있다.
그리고, 상기 클로로필 함유 추출물의 제조방법은 상기 전처리 단계 이전에, 식물 또는 미생물을 동결건조하고 분쇄하는 분말화 단계를 추가로 포함할 수 있다.
그리고, 운전온도계수는 0.7 내지 1.15, 바람직하게는 0.75 내지 1.1, 보다 바람직하게는 0.9 내지 0.97일 수 있다.
불포화 지방 구조를 포함하는 오일에 클로로필을 용해시켜 보관하는 본 발명의 클로로필 저장방법은 장기간 보관에도 클로로필의 구조가 안정적으로 유지되며 특히 스쿠알렌에 녹인 경우 10 개월 이상 경과한 후에도 클로로필의 존재를 확인할 수 있었다. 저장기간은 저장온도가 낮을수록, 빛이 차단될수록 더욱 연장되는 것으로 나타났다. 본 발명의 클로로필 저장방법을 통해 장기간 안정성을 확보할 수 있고 식품과 기타 응용 분야에 유용하게 사용할 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명을 구성하는 클로로필 함유 추출물은 복합 초임계유체 추출공정을 통해 제조되고 그 제조과정에 유기용매가 도입된 바 없어, 별도의 후처리 없이 바로 식품 또는 의약에 적용할 수 있다. 그리고, 유기용매 제거공정이 불필요하여 이에 소요되는 설치비용 및 운전비용이 절감되는 효과가 있다. 뿐만 아니라, 에탄올이 추가된 복합 초임계유체 추출공정 이전에 초임계 이산화탄소만으로 원료를 추출함으로써 상기 원료 중의 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다. 나아가, 상기 불순물 제거 시 원료를 오일로 전처리함으로써 클로로필 함유 추출물 내 클로로필의 함량이 더욱 증가하는 장점이 있다.
도 1은 본 발명을 구성하는 클로로필 추출단계 이전 (A)과 이후 (B)의 밀싹 분말을 촬영한 사진이다.
도 2는 밀싹 분말에 대한 초임계추출 후 추출물 중 클로로필 함량 분석을 위한 HPLC 결과이다 {(A) 비교예 1, (B) 실시예 1, (C) 비교예 2, (D) 실시예 2 [ (a) 클로로필 a, (a') 클로로필 a 에피머, (b) 클로로필 b, (b') 클로로필 b 에피머, (c) 케로티노이드 ]}.
도 3은 동결건조된 밀싹 분말로부터 에탄올에 추출된 클로로필의 HPLC 그래프이다.
도 4는 도 3의 에탄올에 추출된 클로로필을 스쿠알렌으로 다시 추출한 HPLC 그래프이다.
도 5는 도 4의 스쿠알렌 대신 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 포도씨유, 올리브유, 코코넛 오일을 사용한 HPLC 그래프 및 추출효율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 스쿠알렌에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과를 나타낸 표 및 그래프이다.
도 7은 대두유에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과를 나타낸 표 및 그래프이다.
도 8은 카놀라유에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과를 나타낸 표 및 그래프이다.
도 9는 해바라기씨유에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과를 나타낸 표 및 그래프이다.
도 10은 포도씨유에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과를 나타낸 표 및 그래프이다.
도 11은 올리브유에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과를 나타낸 표 및 그래프이다.
도 12는 코코넛오일에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과를 나타낸 표 및 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다.
다만, 아래는 특정 실시예들을 예시하여 상세히 설명하는 것일 뿐, 본 발명은 다양하게 변경될 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있기 때문에, 예시된 특정 실시예들에 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 설명되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
그리고, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 출원에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, '포함하다', '함유하다' 또는 '가지다' 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 구성요소(또는 구성성분) 등이 존재함을 지칭하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 구성요소 등이 존재하지 않거나 부가될 수 없음을 의미하는 것은 아니다.
본 출원에서 안정화지수는 다음과 같이 정의된다 (저장온도 단위는 절대온도 K임):
안정화지수 = 100 × ( 후기 클로로필 질량 / 초기 클로로필 질량 ) × 저장온도.
본 출원에서, 운전온도계수는 다음과 같이 정의된다 (모든 온도 단위는 절대온도 K임):
운전온도계수 = ( 동결건조 온도 / 클로로필 추출단계 중 보조용매의 끓는점 ) × ( 전처리 단계 중 오일의 끓는점(의 저점) / 불순물 제거단계 중 용매의 임계온도 ).
본 발명의 클로로필 저장방법은 불포화 지방 구조를 포함하는 오일에 클로로필을 포함시키는 클로로필 용해단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 불포화 지방 구조를 포함하는 오일은, 도코사헥산산(DHA), 에이코사펜타인(EPA), 스쿠알렌, 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 마카다미아유, 낙화생유, 포도씨유, 호박씨유, 아마씨유, 아마인유, 올리브유, 옥수수유, 홍화유, 참기름, 소인유, 공액 리놀렌산, 아몬드유, 복숭아씨유, 살구씨유, 호도유, 평지씨유, 라즈베리유, 빌베리씨유, 크린베리씨유, 석류씨유, 사차인치유 및 기타 과일의 종자유, 산자나무유, 치아유, 들깨기름, 디아글리세롤 (DAG)오일, 오메가 3의 식물 유래 공급원, 에이코사펜타인(EPA)의 발효 공급원, 도코사헥산산(DHA)의 발효 공급원, 어유와 크릴유를 비롯한 기타 오메가 3, 오메가 6, 오메가 9 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 기름의 발효 공급원, 감마-리롤렌산(GLA) 및/또는 스테아리돈산(SA)의 공급원, 코코넛유 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 특히 스쿠알렌이 바람직하다.
특히, 상기 DHA, EPA 또는 GLA의 공급원은 어유, 미생물, 단세포 공급원 및 식물성 기름으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 상기 미생물은 효모일 수 있고, 상기 식물성 기름은 아마씨유, 대두유, 카놀라유, 달맞이꽃 기름, 블랙커런트씨유, 보지리유 및 에치움오일로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 클로로필 용해단계는,
(A) 클로로필 추출물을 감압 증류하여 용매를 제거하고 클로로필을 고체화 하는 단계; 및
(B) 불포화 지방 구조를 포함하는 오일에 고체화된 클로로필을 녹이는 단계;를 포함하거나,
(C) 클로로필 추출물에 불포화 지방 구조를 포함하는 오일을 가하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
(D) 상기 혼합물의 층을 분리하여 분별 추출하는 단계;를 포함할 수 있다.
여기서 고체화된 클로로필 또는 클로로필 추출물은 클로로필을 함유하는 식물 또는 미생물을 복합 초임계추출하는 하기 클로로필 추출단계를 포함한 클로로필 함유 추출물 제조방법을 통해 수득될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 클로로필의 안정성을 증대시키는 방법은 빛 에너지 또는 온도의 영향으로 들뜬 클로로필이 에너지를 방출할 때 이웃한 클로로필에 에너지를 전이하는 단계를 효과적으로 차단시키고 그 에너지를 안정화제의 분자 회전 운동과 진동 운동 등으로 상쇄시키기 위하여, 이중 결합을 포함한 불포화 구조의 오일류를 사용한다.
상기에 사용되는 오일류는 도코사헥산산(DHA), 에이코사펜타인(EPA), 스쿠알렌이 있으며 그 외에 사용가능한 오일은 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 마카다미아유, 낙화생유, 포도씨유, 호박씨유, 아마씨유, 아마인유, 올리브유, 오수수유, 홍화유, 참기름, 소인유, 공액 리놀렌산, 아몬드유, 복숭아씨유, 살구씨유, 호도유, 평지씨유, 라즈베리유, 빌베리씨유, 크린베리씨유, 석류씨유, 사차인치유 및 기타 과일의 종자유, 산자나무유, 치아유, 들깨기름, 디아글리세롤 (DAG)오일, 오메가 3의 식물 유래 공급원, 에이코사펜타인(EPA)의 발효 공급원, 도코사헥산산(DHA)의 발효 공급원, 어유와 크릴유를 비롯한 기타 오메가 3, 오메가 6, 오메가 9 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 기름의 발효 공급원, 감마-리롤렌산(GLA) 및/또는 스테아리돈산(SA)의 공급원, 분획화된 코코넛유 및 이들의 조합을 들수 있으나 이에 한정되지 않는다. DHA, EPA 및 GLA의 공급원으로는 어유, 효모 또는 기타 미생물 또는 단세포 공급원 및 식물성 기름, 주로 아마씨, 대두, 카놀라를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. GLA의 공급원으로는 달맞이꽃 기름. 블랙커런트씨유. 보지리유 및 에치움오일을 들수 있으나 이에 한정되지 않는다.
추출된 클로로필을 오일에 녹이는 방법은 추출 후 감압 증류하여 용매를 제거한 후, 고체화된 클로로필을 선택된 상기 오일류에 직접 녹이는 방법, 또는 추출물이 함유된 주정 등에 상기 오일을 가하여 층 분리하여 분별 추출하는 방법이 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 오일에 추출된 클로로필을 저장 보관하여 클로로필의 분해 정도를 확인한 결과, 스쿠알렌에 녹인 경우, 10 개월 이상 클로로필의 존재를 확인할 수 있었으며, 클로로필의 존재 정도는 온도가 낮을수록, 빛이 차단될수록 더욱 유리한 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 클로로필 저장방법은 클로로필 용해단계 이후 오일에 용해된 클로로필을 암소에 저장할 수 있고, -100 내지 12 ℃, -90 내지 8 ℃, 또는 -80 내지 5 ℃에서 저장할 수 있다. 저장온도가 상기 범위 미만이면 냉각에 소요되는 운전비용이 지나치게 증가하는 단점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하면 파괴되는 클로로필의 양이 증가하는 문제점이 있다.
본 출원에서는 특히 클로로필의 저장에 사용되는 오일의 선정을 위해 안정화지수라는 신규 파라미터를 도입하였으며, 상기 안정화지수는 다음과 같이 정의된다 (저장온도 단위는 절대온도 K임):
안정화지수 = 100 × ( 후기 클로로필 질량 / 초기 클로로필 질량 ) × 저장온도.
다양한 실험을 통해 안정화지수가 15000 내지 25315, 17000 내지 25310, 또는 18500 내지 25305인 오일을 선정하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 안정화지수가 상기 범위 미만이면 시간 경과에 따른 클로로필의 파괴가 지나치게 많이 발생하고, 반대로 상기 범위를 초과하면 물리적으로 극히 어려울 뿐만 아니라 경제성도 급격히 떨어지는 문제점이 있다.
상기와 같은 방법으로 클로로필을 저장 보관하여 장기간 안정성을 확보할 수 있고 식품과 기타 응용 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 클로로필 저장방법에 이용되는 클로로필 추출물은 클로로필을 함유하는 식물 또는 미생물을 복합 초임계추출하는 클로로필 추출단계를 포함한 클로로필 함유 추출물 제조방법을 통해 수득될 수 있다. 여기서, 복합 초임계추출이란 주용매 단독이 아니라 이에 보조용매를 결합하여 추출하는 것을 가리킨다.
추출의 원료가 되는 상기 식물 또는 미생물은 클로로필 a, 클로로필 b, 클로로필 c1, 클로로필 c2, 클로로필 d, 클로로필 f, 박테리오클로로필 및 그 혼합물을 포함하는 식물 또는 미생물이면 제한이 없으며, 예컨대 목본의 잎, 목본의 싹, 초본의 줄기, 초본의 잎, 초본의 싹; 남조식물(cyanophyta), 원녹조식물(prochlorophyta), 홍조식물(rhodophyta), 녹조식물(chlorophyta), 부등편모조식물(heterokontophyta), 트리보파이타(tribophyta), 회조식물(glaucophyta), 클로라라크니오파이트(chlorarachniophytes), 녹충식물(euglenophyta), 유글레나조류(euglenoids), 착편모조식물(haptophyta), 황갈조식물(chrysophyta), 은편모조식물(cryptophyta), 크립토모나즈(cryptomonads), 와편모조식물(dinophyta), 와편모충(dinoflagellata), 파이렘네시오파이타(pyrmnesiophyta), 규조류(bacillariophyta), 황조식물(xanthophyta), 유스티그마토파이타(eustigmatophyta), 침편모조식물(raphidophyta), 갈조식물(phaeophyta), 식물 플랑크톤; 스피룰리나와 같은 청남색균류 (blue-green bacteria); 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 두날리엘라(Dunaliella) 속, 클라미도모나스(Chlamydomonas) 속, 해마토코커스(Haematococcus) 속 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 미세조류; 및 그 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 클로로필 추출단계에서, 주용매는 이산화탄소이고, 보조용매는 에탄올일 수 있다.
상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출의 전체 유속은 20 내지 120 ㎖/분, 바람직하게는 30 내지 100 ㎖/분, 보다 바람직하게는 40 내지 85 ㎖/분일 수 있다. 전체 유속이 상기 범위 미만일 때 추출시간이 길어지는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과할 때 추출시간은 짧아지나 공정상 초임계 상태의 유지가 어려운 문제점이 있다.
상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출의 보조용매 유속은 1 내지 20 ㎖/분, 바람직하게는 2 내지 15 ㎖/분, 보다 바람직하게는 3 내지 12 ㎖/분일 수 있다. 보조용매 유속이 상기 범위 미만일 때 추출시간이 길어지는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과할 때 추출시간은 짧아지나 공정상 초임계 상태의 유지가 어려운 문제점이 있다.
상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출 온도는 30 내지 70 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃, 보다 바람직하게는 45 내지 55 ℃일 수 있다. 복합 초임계추출 온도가 상기 범위 미만일 때 클로로필 추출효율이 떨어지는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 불순물이 같이 추출되는 문제점이 있다.
상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출 압력은 70 내지 650 bar, 바람직하게는 100 내지 500 bar, 보다 바람직하게는 150 내지 400 bar일 수 있다. 복합 초임계추출 압력이 상기 범위 미만일 때 클로로필 추출효율이 떨어지는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 불순물이 같이 추출되는 문제점이 있다.
상기 클로로필 추출단계에서, 복합 초임계추출 시간은 45 내지 300 분, 바람직하게는 60 내지 250 분, 보다 바람직하게는 70 내지 220 분일 수 있다. 복합 초임계추출 시간이 상기 범위 미만일 때 클로로필의 추출이 완전히 이루어지지 않아 원료에 클로로필이 일부 남는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 이미 클로로필이 모두 추출됨으로써 추출 후반에는 클로로필이 전혀 추출되지 않아 경제성이 떨어지는 문제점이 있다.
본 발명의 클로로필 함유 추출물 제조방법은 상기 클로로필 추출단계 이전에, 식물 또는 미생물을 단순 초임계추출하는 불순물 제거단계를 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 단순 초임계추출은 주용매 단독으로 추출하는 것을 가리키는 것으로서, 이처럼 주용매와 보조용매를 결합하여 클로로필을 추출하기에 앞서 주용매만으로 불순물을 먼저 추출해내는 것이 본 발명의 주요한 특징이다.
상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 용매는 이산화탄소일 수 있다.
상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출의 용매 유속은 20 내지 120 ㎖/분, 바람직하게는 30 내지 100 ㎖/분, 보다 바람직하게는 40 내지 85 ㎖/분일 수 있다. 단순 초임계추출의 용매 유속이 상기 범위 미만일 때 추출시간이 길어지는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과할 때 추출시간은 짧아지나 공정상 초임계 상태의 유지가 어려운 문제점이 있다.
상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 온도는 30 내지 70 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃, 보다 바람직하게는 45 내지 55 ℃일 수 있다. 단순 초임계추출 온도가 상기 범위 미만일 때 불순물의 제거가 완전히 이루어지지 않는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 불순물과 함께 클로로필이 일부 제거되는 문제점이 있다.
상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 압력은 70 내지 650 bar, 바람직하게는 100 내지 500 bar, 보다 바람직하게는 150 내지 400 bar일 수 있다. 단순 초임계추출 압력이 상기 범위 미만일 때 불순물의 제거가 완전히 이루어지지 않는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 불순물과 함께 클로로필이 일부 제거되는 문제점이 있다.
상기 불순물 제거단계에서, 단순 초임계추출 시간은 30 내지 350 분, 바람직하게는 40 내지 300 분, 보다 바람직하게는 50 내지 250 분일 수 있다. 단순 초임계추출 시간이 상기 범위 미만일 때 불순물의 제거가 완전히 이루어지지 않아 원료에 불순물이 일부 남는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 이미 불순물이 모두 추출됨으로써 추출 후반에는 불순물이 전혀 추출되지 않아 경제성이 떨어지고, 오히려 클로로필이 일부 제거되는 문제점이 있다.
상기 클로로필 함유 추출물의 제조방법은 상기 불순물 제거단계 이전에, 식물 또는 미생물을 오일과 혼합하는 전처리 단계를 추가로 포함할 수 있다. 원료 분말을 오일과 혼합하면 원료 내의 불순물이 상기 오일에 용해된다. 이를 통해 상기 불순물 제거단계에서 원료 내의 불순물이 제거되는 효율이 현저히 상승했으며, 이러한 전처리 단계가 본 발명의 또 다른 주요 특징을 구성한다.
상기 전처리 단계의 오일은 식물성 오일일 수 있다.
상기 전처리 단계의 오일은 씨앗유, 바람직하게는 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 마카다미아유, 낙화생유, 포도씨유, 호박씨유, 아마씨유, 아마인유, 올리브유, 옥수수유, 홍화유, 참기름, 아몬드유, 복숭아씨유, 살구씨유, 호도유, 평지씨유, 라즈베리유, 빌베리씨유, 크린베리씨유, 석류씨유, 사차인치유, 과일의 종자유, 산자나무유, 치아유, 들깨기름 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 오일일 수 있다.
상기 전처리 단계에서 식물 또는 미생물 100 중량부에 대한 오일의 중량비는 1 내지 50 중량부, 바람직하게는 2 내지 10 중량부일 수 있다. 원료에 대한 오일의 중량비가 상기 범위 미만일 때 불순물의 제거가 완전히 이루어지지 않는 문제점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 불순물과 함께 클로로필이 일부 제거되는 문제점이 있다.
상기 클로로필 함유 추출물의 제조방법은 상기 전처리 단계 이전에, 식물 또는 미생물을 동결건조하고 분쇄하는 분말화 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 초임계추출과 같이 상온, 상압이 아닌 가혹한 조건에서 운전되므로 운전비용이 급격히 증가하지 않도록 공정을 설계할 필요가 있다. 그 중에서도 주요한 공정온도를 열거하면 동결건조 온도, 클로로필 추출단계 중 보조용매의 끓는점, 전처리 단계 중 오일의 끓는점, 불순물 제거단계 중 용매의 임계온도를 들 수 있다. 이 중 동결건조 온도는 높으면 높을수록 운전비용이 절감되고, 클로로필 추출단계 중 보조용매의 끓는점은 낮을수록 운전비용이 절감되고, 전처리 단계 중 오일의 끓는점은 높을수록 원료 분말과의 혼합이 용이해지고, 불순물 제거단계 중 용매의 임계온도는 낮을수록 운전비용이 절감된다.
이러한 개념에서 출발하여 본 발명에서는 운전온도계수라는 새로운 운전변수를 도입하였으며, 상기 운전온도계수는 다음과 같이 정의된다 (모든 온도 단위는 절대온도 K임):
운전온도계수 = ( 동결건조 온도 / 클로로필 추출단계 중 보조용매의 끓는점 ) × ( 전처리 단계 중 오일의 끓는점(의 저점) / 불순물 제거단계 중 용매의 임계온도 ).
다양한 재료에 대해 검토한 결과 상기 운전온도계수는 0.7 내지 1.15, 바람직하게는 0.75 내지 1.1, 보다 바람직하게는 0.9 내지 0.97일 수 있다. 운전온도계수가 상기 범위 미만이면 운전비용이 지나치게 증가하는 단점이 있고, 반대로 상기 범위를 초과하면 운전비는 감소하나 고가의 재료를 사용해야 해서 재료비가 증가하는 문제점이 있다.
상기의 방법으로 얻어진 클로로필을 사용하여 당 업계에 공지된 방법을 통하여 클로로필로부터 유도되는 다양한 클로로필 유도체를 얻을 수 있었다.
이하, 본 발명의 상세한 실시예를 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예를 한정하는 것은 아니다.
실시예
시험예 : 클로로필 a의 질량 측정
추출된 클로로필의 함량 분석을 위해 고성능액체크로마토그래피 (AGILENT, 미국)를 사용하였으며, 사용한 컬럼은 시마즈 Shim-pack C18 분석 컬럼(250 mm x 4.6 mm, 5 ㎛, 100)이었다. 피크(peak)는 다이오드 어레이 디텍터(diode array detector)를 이용한 자외선 흡수로서 검출하였다. 주입 부피는 20 ㎕, 유속은 1 ㎖/분로 하였다. 클로로필 a의 기준물질은 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI)에서 구입하였으며, 추가적인 정제과정 없이 사용하였다.
비교예 1: 주정추출 단계
밀싹 (드림스, 한국) 동결건조 분말 1 g을 에탄올(98%) 25 ㎖에 첨가하고 상온에서 2 시간 교반하여 추출하고 여과지를 이용하여 여과한 후, 여과액을 상기 시험예에 따라 분석하여 클로로필 a의 함량을 얻었다. 분석 결과 클로로필 a의 양은 3.8 mg이었고, 에탄올을 감압 증류하여 제거하고 남은 전체 고체의 질량은 165 ㎎으로 확인되었다.
실시예 1: 초임계추출 단계
350 bar, 50 ℃, 초임계 이산화탄소 유속 60 ㎖/분의 조건에서 밀싹 (드림스, 한국) 동결건조 분말 50 g을 60 분 동안 추출하여 불순물을 제거하고, 350 bar, 50 ℃, 초임계 이산화탄소 유속 60 ㎖/분, 보조용매 에탄올 유속 5 ㎖/분의 조건에서 120 분 동안 다시 추출하여 클로로필 a의 함량을 분석하였다. 분석 결과 클로로필 a의 양은 235 mg이었고, 에탄올을 감압 증류하여 제거하고 남은 전체 고체의 질량은 4250 ㎎으로 확인되었다.
제조예 1: 전처리 단계 + 불순물 제거단계
도 1의 (A)에 나타낸 바와 같은 밀싹 (드림스, 한국) 동결건조 분말 50 g과 포도씨유 2.5 g을 혼합기로 잘 버무려 준비하였다. 350 bar, 50 ℃, 초임계 이산화탄소 유속 60 ㎖/분의 조건에서, 상기 준비한 밀싹 및 포도씨유 혼합물을 120 분 동안 추출함으로써, 도 1의 (B)에 나타낸 바와 같이 불순물 제거로 녹색의 선명도가 증가된 밀싹 분말을 얻었다.
비교예 2: 제조예 1 + 비교예 1
상기 제조예 1의 단계를 거친 밀싹 분말에 대해 비교예 1의 단계를 거쳐 클로로필 a의 함량을 분석하였다. 분석 결과 클로로필 a의 양은 4.2 mg이었고, 에탄올을 감압 증류하여 제거하고 남은 전체 고체의 질량은 87.5 ㎎으로 확인되었다.
실시예 2: 제조예 1 + 실시예 1
상기 제조예 1의 단계를 거친 밀싹 분말에 대해 실시예 1의 단계를 거쳐 클로로필 a의 함량을 분석하였다. 분석 결과 클로로필 a의 양은 240 mg이었고, 에탄올을 감압 증류하여 제거하고 남은 전체 고체의 질량은 3116 ㎎으로 확인되었다.
비교예 1,2 및 실시예 1,2에서 분석된 클로로필 a의 양을 건조 상태의 밀싹 분말 1 g에 대해 환산한 결과 및 그 추출효율 (= 클로로필 a의 질량 / 전체 고체의 질량)을 하기 표 1에 나타내었다. 그리고, 각각의 고성능액체크로마토그래피 결과를 도 2에 나타내었다.

밀싹 분말
비교예 1
실시예 1
비교예 2
실시예 2

클로로필 (mg)
3.8
4.7
4.2
4.8

추출효율 (%)
2.3
5.5
4.8
7.2
상기 도 2에 의하면, 17 분 대의 클로로필 b와 18 분 대의 클로로필 a의 특징적인 피크가 관측되고, 그 외 22 분 대의 케로티노이드의 특징적인 피크가 관측 되었다.
비교예 1의 도면 (도 2 (A))에서 15 분 전의 다양한 불순물 피크를 관측할 수 있었고, 실시예 1 (도 2 (B))의 도면에서 일부 불순물이 제거되는 것을 확인할 수 있었다.
비교예 2 (도 2 (C))와 실시예 2 (도 2 (D))의 경우 대부분의 불순물이 제거된 것을 확인할 수 있었으며, 다만 분술물 제거 후 주정추출보다 보조용매를 사용한 초임계추출의 경우 클로로필 함량과 추출효율 측면에서 더 우수한 것으로 확인되었다.
비교예 3,4 및 실시예 3,4: 보리싹 분말
비교예 1,2 및 실시예 1,2와 동일한 과정을 거치되, 밀싹 분말 대신 보리싹 분말 (드림스, 한국)을 사용하였다. 분석된 클로로필 a의 양을 건조 상태의 보리싹 분말 1 g에 대해 환산한 결과 및 그 추출효율 (= 클로로필 a의 질량 / 전체 고체의 질량)을 하기 표 2에 나타내었다.

보리싹 분말
비교예 3
실시예 3
비교예 4
실시예 4

클로로필 (mg)
3.75
4.3
4.1
4.7

추출효율 (%)
2.5
4
3.2
6
비교예 5,6 및 실시예 5,6: 스피룰리나 분말
비교예 1,2 및 실시예 1,2와 동일한 과정을 거치되, 밀싹 분말 대신 스피룰리나 분말 (뉴트리비타샵. 미국)을 사용하였다. 분석된 클로로필 a의 양을 건조 상태의 스피룰리나 분말 1 g에 대해 환산한 결과 및 그 추출효율 (= 클로로필 a의 질량 / 전체 고체의 질량)을 하기 표 3에 나타내었다.

스피룰리나 분말
비교예 5
실시예 5
비교예 6
실시예 6

클로로필 (mg)
2.8
3.2
2.8
4

추출효율 (%)
1.9
3.5
3.1
4.7
실시예 7: 안정성이 우수한 저장방법
추출된 클로로필a의 함량 분석을 위해 고성능액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용하였다. 정제는 에질런트(AGILENT)사의 Agilent 1100 Series HPLC 시스템을 사용하였으며, 시마즈 Shim-pack C18 분석 컬럼(250 mm x 4.6 mm, 5 ㎛, 100 )을 사용하였다. 피크(peak)는 다이오드 어레이 디텍터(diode array detector)를 이용한 자외선 흡수로서 검출하였다. 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다.
분리하는 용매는 아래 표와 같이 그라디에이션법을 이용하여 분리하였다. 클로로필 a의 기준물질은 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI)에서 구입하였으며, 추가적인 정제과정 없이 사용하였다. 도 2 내지 도 4에서, 머무름시간(retention time) 약 18.5 분에 해당하는 피크가 클로로필 a에 해당하는 것이다.

시간
MeOH 80% +
0.5 M NH4Ac 20%
ACN 90% +
물 10%
Ea

0
100%




4


100%

18


20%
80%

21


100%


24
100%



클로로필 a의 추출
클로로필 a을 추출하기 위한 물질로는 어린 밀싹, 어린 보리싹, 어린 벼싹 등이 있으며 스피루리나, 클로렐라 등이 포함된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 유기용매는 당업계에 공지된 다양한 유기용매를 포함한다. 예를 들어, (ⅰ) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (ⅱ) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (ⅲ) 아세톤, (ⅳ) 에틸 아세테이트, (ⅴ) 클로로포름, (ⅵ) 부틸아세테이트, (ⅶ) 1,3-부틸렌글리콜, (ⅷ) 헥산 및 (ⅸ) 디에틸에테르가 유기용매로 이용될 수 있다. 바람직하게는, 메탄올 또는 에탄올이며, 보다 바람직하게는 에탄올이다.
동결건조된 밀싹 분말 1 g을 에탄올(98%) 25 ㎖에 침지하여 2 시간 교반한 후, 여과지를 이용하여 여과하고 여과된 에탄올의 부피를 50 ㎖로 맞추었다. 상기 방법으로 추출된 클로로필의 HPLC 그래프는 도 3과 같다.
상기 추출된 에탄올 (50 ㎖)에 스쿠알렌 50 ㎖을 첨가하여 강하게 교반한 후 2 분 동안 층 분리시키고 이 중 스쿠알렌 층을 취해서 측정한 HPLC 그래프는 도 4와 같다. 머무름시간 10 분 전의 피크가 사라진 것이 특징이며 클로로필 a가 약 80% 이상 스쿠알렌 층으로 넘어온 것을 확인할 수 있었다.
안정화제로 사용될 수 있는 후보물질인 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 포도씨유, 올리브유, 코코넛 오일 등을 사용하여 추가 실험한 결과, 각각 93%, 85%, 90%, 84%, 83%, 67% 의 클로로필 a가 각각의 오일 상에 녹는 것을 도 5로부터 확인할 수 있었다.
클로로필 안정성
상기 과정에서 이용된 클로로필 a 안정화 후보물질들의 클로로필 a에 대한 저장 안정성을 조사하였다. 다양한 온도조건에서 저장기간 별로 시료를 채취하여, 상기 기재된 HPLC 시스템을 이용하여 클로로필 a 함량을 분석하였다.
온도 조건은 각각 냉동(-20 ℃), 냉장(4 ℃), 상온(25 ℃), 고온(50 ℃), 그리고 실온 방치로 나누어 조사하였다.
상기 클로로필 a 안정화 후보물질 (스쿠알렌, 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 포도씨유, 올리브유, 코코넛오일)과 여과된 클로로필 a 에탄올 추출액을 부피비로 1:1로 혼합하고, 강하게 교반한 후 2 분 간 층분리시킨 후 오일층을 분리했다. 이 과정에서 에탄올이 제거된다. 이후 상기 각각의 온도 별로 암소에서 정해진 기간 동안 저장 후 저장기간 별로 시료를 채취하고, 상기 기재된 HPLC 시스템을 이용하여 클로로필 a 함량을 분석하였다.
안정화제로서 오일에 첨가된 클로로필 a 분말에 대한 저장 안정성 실험 결과 식품재료로 사용가능한 다양한 오일에 첨가된 클로로필 a의 경우, 상당 기간 안정화가 되었으며 반감기는 스쿠알렌, 대두유, 카놀라유, 해바라기씨유, 포도씨유, 올리브유, 코코넛오일 각각 실온 보관에서 7 개월, 2.5 개월, 4 개월, 6 개월, 5 개월, 3 개월, 1.5 개월 정도로 크게 증가하였다. 도 6 내지 도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이 보관 온도가 낮을수록 반감기는 크게 증가하였다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (1)

  1. 불포화 지방 구조를 포함하는 오일에 클로로필을 포함시키는 클로로필 용해단계를 포함하고,
    상기 불포화 지방 구조를 포함하는 오일은, 도코사헥산산(DHA), 에이코사펜타인(EPA), 스쿠알렌, 카놀라유, 낙화생유, 호박씨유, 아마씨유, 아마인유, 옥수수유, 홍화유, 참기름, 소인유, 복숭아씨유, 살구씨유, 평지씨유, 라즈베리유, 빌베리씨유, 크린베리씨유, 석류씨유, 사차인치유 및 기타 과일의 종자유, 산자나무유, 치아유, 들깨기름, 디아글리세롤 (DAG)오일, 오메가 3의 식물 유래 공급원, 에이코사펜타인(EPA)의 발효 공급원, 도코사헥산산(DHA)의 발효 공급원, 어유와 크릴유를 비롯한 기타 오메가 3, 오메가 6, 오메가 9 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 기름의 발효 공급원, 감마-리롤렌산(GLA) 및/또는 스테아리돈산(SA)의 공급원, 코코넛유 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되고,
    상기 DHA, EPA 또는 GLA의 공급원은 어유, 미생물, 단세포 공급원 및 식물성 기름으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 클로로필의 저장방법.
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