KR20070113561A

KR20070113561A - 단삼 정제 추출물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증 예방 및치료용 조성물

Info

Publication number: KR20070113561A
Application number: KR1020060046957A
Authority: KR
Inventors: 손동환; 김윤철; 박은전
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2006-05-25
Filing date: 2006-05-25
Publication date: 2007-11-29
Also published as: KR100827938B1

Abstract

본 발명은 단삼 (Salvia miltiorrhiza BUNGE) 정제 추출물의 제조방법 및 상기 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 3단계의 간단한 공정으로 구성된 제조방법으로 제조된 본 발명의 단삼 표준화 시료용 정제 추출물은 단삼의 주요 생리활성 성분인 크립토탄시논 (cryptotanshinone), 탄시논 I (tanshinone I) 및 탄시논 ⅡA (tanshinone ⅡA)를 고농도로 함유하고 있으며, 기존 알려진 단삼 추출물과 비교하여 탁월한 간 보호, 항섬유화 효능 및 담즙정체에 의한 자가 사멸로부터의 간 보호 효능을 가지므로, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 단삼 표준화시료용 정제 추출물 또는 이를 함유하는 조성물은 간 보호제, 간섬유화 또는 간경화증 예방 및 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

단삼, 정제 추출물, 간세포, 담즙정체, 자가사멸, 간 보호, 간섬유화, 간경화증

Description

단삼 정제 추출물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증 예방 및 치료용 조성물 {A purified extract isolated from Salvia miltiorrhiza, a method for preparing them and the composition comprising the same having hepato-protecting activity and protecting or treating activity from liver fibrosis and liver cirrhosis}

도 1은 단삼 물추출물의 크립토탄시논, 탄시논 I 및 탄시논 IIA의 함량을 보여주는 HPLC 크로마토그램이며,

도 2는 단삼 에탄올추출물의 크립토탄시논, 탄시논 I 및 탄시논 IIA의 함량을 보여주는 HPLC 크로마토그램이고,

도 3은 표준화시료로 이용 가능한 본 발명의 단삼 정제 추출물의 크립토탄시논, 탄시논 I 및 탄시논 IIA의 함량을 보여주는 HPLC 크로마토그램이며,

도 4는 담즙산염으로 자가사멸을 유도한 간세포에서 본 발명의 단삼 정제 추출물 처리에 의해 DNA 절편화 (DNA fragmentation)가 억제됨을 보여주는 도면이고,

도 5는 담즙산염으로 자가사멸을 유도한 간세포에서 본 발명의 단삼 정제 추출물 처리에 의해 폴리 ADP-리보스 중합효소 [poly(ADP-ribose) polymerase; PARP]의 분할 (cleavage)이 억제됨을 보여주는 도면이며,

도 6은 담즙산염으로 자가사멸을 유도한 간세포에서 본 발명의 단삼 정제 추출물 처리에 의해 c-jun-NH2-termial kinase (JNK) 인산화 (phosphorylation)가 억제됨을 보여주는 도면이고,

도 7은 활성화된 간성상세포에 특이적으로 발현되는 알파-평활근 액틴에 대한 면역염색한 간조직을 보여주는 사진으로서, 정상간조직 (A), 사염화탄소에 의해 손상된 간조직 (B), 사염화탄소와 본 발명의 단삼 정제 추출물을 처리한 간조직 (C) 및 사염화탄소와 단삼 에탄올추출물을 처리한 간조직 (D)의 면역염색사진이다.

본 발명은 단삼으로부터 목적하는 생리활성 성분들을 고농도로 함유하고 있는 단삼 표준화시료의 간단, 신속, 저렴한 공정이며 재현성 있는 제조방법, 이를 통해 수득 가능한 단삼 정제 추출물 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 소화기계로 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 장기이다. 일단 생체내로 들어온 생체 외 물질이 간을 통과하는 까닭에 간은 영양소 외에도 많은 독성물질에 대한 노출 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 다른 장기에 비해 높다.

간 조직 중에는 영양물질 흡수 및 대사, 저장, 혈장단백질 합성 등과 같은 간의 주요기능을 수행하는 간세포 (hepatocyte), 간 내 대식세포 (macrophage)인 쿠퍼세포 (Kupffer cell), 간 손상시 결합조직을 과다 합성함으로써 간섬유화를 초래하는 간성상세포 (hepatic stellate cell, lipocyte; HSC) 및 내피 세포 (Endothelial cell), 오목 세포 (Pit cell) 등이 존재한다. 이중 간세포는 간조직을 구성하는 전체 세포의 약 90 %이상을 차지하며, 간의 주요기능을 수행하는 실질 세포 (parenchymal cell)로써 간질환시 간기능 저하는 바로 이 간세포 손상으로 인해 초래되는 것이다.

여러 원인에 의한 만성 간 손상은 공통적으로 간섬유화를 초래하게 되며 그 기전을 요약하면 다음과 같다. 여러 원인에 의해 간세포가 손상되고, 쿠퍼 세포가 활성화되어 여러 사이토카인 (cytokines)을 분비하게 되면 이에 의해 간성상세포가 활성화되어 결합조직을 생성한다. 간 손상이 지속되게 되면 손상당한 간세포가 결합조직으로 대치되는 간질 복구가 유발되어 간 조직 내 결합조직 과다축적으로 인한 상처가 형성되고 간세포 손상으로 인해 간기능이 저하되면서 간섬유화 및 간경화가 초래되는 것이다 (Friedman SL et al., J. Hepatol ., 38(1), ppS38-53, 2003).

간섬유화 치료제는 간섬유화 시 가장 문제가 되는 과다한 결합조직을 생성하는 간성상세포 (hepatic stellate cell, HSC)를 중심으로 연구되고 있다. 기존에는 간섬유화 치료제의 개발을 위하여 간성상세포 활성 억제 또는 결합조직 합성 억제 및 분해 촉진에 초점을 맞추어 연구되어왔다 (Boker K et al., J. Hepatol ., 13(3), ppS35-40, 1991 ; Bataller R et al., Semin . Liver Dis ., 21, pp437-451, 2001). 그러나 최근 간섬유화 동물에서 정상간으로 회복기간중 간성상세포의 자가사멸이 유도됨이 보고되면서 새로운 간섬유화 치료법으로서 간성상세포의 자가사멸 유도가 부각되고 있다 (Wright MC et al., Gastroenterology, 121(3), pp685-98, 2001 ; Issa R et al., Gut., 48(4), pp548-57, 2001).

자가 사멸 (또는 고사, apoptosis, programmed cell death)은 1972년 케르 (Kerr)에 의해 소개된 명칭으로 1980년대 중반 이후 많이 연구되기 시작한 분야이다. 자가 사멸은 조직 항상성 (tissue homeostasis)을 유지하기 위한 필수 과정으로, 정상조직에서 세포의 신생과 사멸 사이의 균형을 유지하고 있는 세포의 손실 과정이다. 자가 사멸은 괴사와 함께 세포 사멸의 한 종류로 세포 사멸은 괴사 (necrosis) 및 자가 사멸로 나뉜다. 괴사는 과도한 산화적 스트레스 (oxidative stress) 등에 의해 유발되며 세포 손상 정도가 상당히 심하며 지속적이고 ATP가 고갈되는 경우에도 유발되며 이때 일련의 세포사멸과정이 급작스럽게 일어나며 핵붕괴 및 세포 내 물질의 유출로 조직 파괴 정도가 심하고 염증반응이 유발된다 (Ockner RK, J. Gastroenterol . Hepatol ., 16(3), pp248-260, 2001). 반면 자가 사멸은 조직 손상을 최소화하면서 서서히 단계적으로 사멸되는 과정이다. 자가 사멸 유도시 세포는 온전한 세포기관 (intact organelle)과 원형질막의 막-결합 (membrane-bound) 소체로 분리된다. DNA 단편화 (DNA laddering)는 자가사멸의 대표적인 특징으로, 활성화된 엔도뉴클레아제 (endonuclease)가 DNA를 50 내지 300-kb의 크기로 절단한 후 다시 180-200 염기쌍의 단편으로 조각낸다. 이러한 DNA 단편화는 자가 사멸되는 세포 (apoptotic cell) 대부분에서 관찰된다. 자가 사멸이 완전히 진행된 세포는 아폽토시스 소체 (apoptotic body)라 지칭되며 이러한 아폽토시스 소체는 생체 내에서 식세포 (phagocytes)에 의해 제거된다. 일반적으로, 자가 사멸되는 세포는 세포 내 구성요소 (intracellular constituent)가 세포 내에 그대로 존재하는 상태로, 세포 내 구성요소가 세포 외부로 유출되는 괴사와는 달리 염증반응을 유발하지 않고 제거되는 것이다. 즉, 염증의 유발 없이 세포를 제거할 수 있다는 점에서 자가 사멸 유도가 암세포 제거방법으로 각광받고 있다. 간섬유화시 활성화되고 증식이 유도되는 간성상세포에 대해서도 염증 없이 활성화된 간성상세포를 간에서 제거할 방법으로 자가 사멸이 활발히 연구되고 있다.

그러나 간세포 자가 사멸은 이러한 일반적인 자가 사멸 상태와는 차이점이 많은 것으로 보고되고 있다. 간세포 자가 사멸이 심각한 경우 간세포 내 여러 효소수치가 혈중증가되며 또 식세포에 의한 제거가 충분하지 못한 상태가 되어 결국에는 염증반응이 유발되며 간조직의 정상적인 구조가 파괴된다.

담즙정체 (cholestasis)는 여러 만성 진행성 간질환 (chronic progressive liver disease)에서 발견되는 특징으로 담즙정체시 글리코치노디옥시콜레이트 (glycochenodeoxycholate;GCDC), 치노디옥시콜레이트 (chenodeoxycholate)와 디옥시콜레이트 (deoxycholate)와 같은 소수성 담즙산염 (hydrophobic bile salt)에 의해 간손상이 유도된다 (Reinehr R et al., Gastroenterology, 127(5), pp1540-1557, 2004). 임상에서의 조직관찰 결과, 담즙정체에 의한 간손상시 간세포 괴사보다 간세포의 자가사멸이 더 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 간세포의 자가사멸 억제는 담즙정체에 의한 간손상 치료에 중요한 역할을 한다고 할 수 있겠다 (Canvay A et al., Hepatology, 39(2), pp273-278, 2004).

단삼 (丹蔘, Salvia miltiorrhiza BUNGE)은 한방에서 예로부터 널리 사용된 약재로 꿀풀과 (Labiatae)에 속하는 쌍떡잎식물 통화식물목의 여러해살이풀로 원산지는 중국이다. 단삼은 수염뿌리를 제거하고 햇볕에 말린 뿌리를 약용으로 하며 11월 상순부터 다음해 3월 상순까지 채취하는데 11월 상순에 캐낸 것이 가장 좋은 것으로 알려져 있다. 약효로는 活血 (활혈), 祛瘀 (거어), 淸心除煩 (청심제번), 凉血消癰 (양혈소옹), 排膿止痛 (배농지통)의 효능이 있으며 心絞痛 (심교통), 월경불순, 월경통, 월경폐지, 血崩 (혈붕), 帶下 (대하), 腹中 (복중)의 硬結 (경결), 積聚 (적취), 瘀血腹痛 [어혈복통; 鬱血腹痛(울혈복통)], 骨節疼痛 (골절동통; 관절통), 驚悸不眠 (경계불면), 惡瘡腫毒 (악창종독)을 치료하는데 널리 사용되어 왔다 (정보섭 및 신민교 저, 도해향약(생약)대사전(식물편), 영림사, pp860~862, 1990). 단삼의 뿌리에 함유된 성분으로는 탄시논 I (tanshinone I), 탄시논 ⅡA (tanshinone ⅡA), 탄시논 ⅡB (tanshinone ⅡB), 디히드로탄시논 (dihydrotanshinone), 메틸탄시노네이트 (methyl tanshinonate), 메틸렌 탄시퀴논 (methylene tanshinquinone), 베타-시토스테롤 (beta-sitosterol), 히드록시탄시논 (hydroxytanshinone), 네오탄시논 (neotanshinone) AㆍBㆍC, 살비올 (salviol), 이소탄시논 I (isotanshinone I), 이소탄시논 Ⅱ (isotanshinone Ⅱ), 이소크립토탄시논 (isocryptotanshinone), 밀티론 (miltirone), 탄시놀 I (tanshinol I), 탄시놀 Ⅱ (tanshinol Ⅱ) 및 비타민 E (vitamin E) 등이 보고되고 있다 (정보섭 및 신민교 저, 도해향약 대사전, 영림사, pp860-862, 1998).

이중 본 발명의 정제 추출물에 함유된 탄시논 I, 탄시논 IIA 및 크립토탄시논의 활성은 하기와 같이 알려진 바 있다. 탄시논 I은 활성화된 간성상세포의 자가사멸을 유도하여 항섬유화효과를 나타내는 효능이 본 발명자들에 의해 보고된 바 있으며 (Kim JY et al., Pharmacol . Toxicol ., 92(4), pp195-200, 2003), 탄시논 ⅡA는 사염화탄소에 의한 간손상 및 간섬유화에 대한 효능 (Liu Y et al., Zhong Yao Cai ., 26, pp415-417, 2003 ; Liu Y et al., Zhong Yao Cai ., 25, pp31-33, 2002) 및 간암세포에 대한 항암효과 (Yuan SL et al., World J. Gastroenterol ., 10(14), pp2024-2028, 2004)가 보고되었으며, 크립토탄시논은 시토크롬 P4501A2 (cytochrome p4501A2; CYP1A2)의 억제효능 (Ueng YF et al., Xenobiotica ., 33(6), pp603-613, 2003)이 보고되었다.

천연물을 이용한 치료제 개발시 원료의 산지 및 품질 등의 문제로 균일한 치료효과 및 규격화를 기대하기 어렵다. 또한 천연물로부터 단일성분을 분리하는 과정에서 분리시 소요되는 기간이 길며, 획득율이 낮고 천연물이 가지는 잠재적 독성 등의 요인들로 천연물 치료제 개발은 쉽지 않다. 이에 본 발명자들은 이러한 천연물 치료제 개발과정의 단점을 극복할 수 있는, 균일한 치료효과와 규격화가 가능한 천연물의 표준화시료 제조 및 산업화가 가능하도록 절차가 간단하고 신속하며 저렴한 제조공정을 연구하게 되었다. 본 발명자들에 의해 개발된 단삼 정제 추출물의 제조공정은 공업적인 생산공정에 접목 가능한 저렴하고도 간단한 방법으로 단삼으로부터 표준화시료를 제조할 수 있으며 이 표준화시료 중 효능물질을 지표로 하는 품질평가법을 확립함으로써 단삼으로부터 균일한 치료효과 및 규격화가 가능한 본 발명을 완성하게 되었다. 또한 본 발명에 의한 단삼 정제 추출물은 기존 단삼 추출물의 간보호 및 항섬유화 효과를 모두 나타내며, 새로이 담즙정체에 의한 간세포 자가 사멸을 억제하는 효능이 있음을 발견하여 간질환 치료제로 이용 가능함 또한 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 단삼으로부터 목적하는 생리활성 성분들을 고농도로 함유하고 있는 표준화시료를 간단, 신속, 저렴한 공정을 통해 재현성있게 제조할 수 있는 본 발명을 확립하게 되었으며, 상기 공정을 통해 수득가능한 단삼 정제 추출물의 단삼의 간보호 및 항섬유화 효과와 더불어 담즙정체에 의한 간세포 자가사멸 억제 효과를 새로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 치료제로 개발시 균일한 치료효과, 규격화 및 산업화하여 표준화시료로 적용 가능하도록 공정절차가 간단, 신속하며 경제적인 단삼 정제 추출물을 제조하는 제조방법, 또한 탁월한 간 보호 효과, 간섬유화 억제 효과 및 담즙정체에 의한 간세포 자가사멸 억제 효과를 지닌 상기 단삼 정제 추출물을 함유하는 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 수행하기 위해서, 본 발명은 건조한 단삼에 물 또는 저급 알콜 용매 및 이들의 용매 혼합물로 추출, 여과, 감압농축 및 건조과정을 통하여 조추출물을 얻는 제 1단계; 상기 조추출물에 물을 가하여 현탁, 여과하여 수불용성 잔사를 얻는 제 2단계; 상기 잔사에 저급 알콜 용매를 가하여 교반, 용해 및 여과과정을 통하여 여액을 얻는 제 3단계; 상기 여액의 잔류 용매를 제거하는 최종단계를 포함하며 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 또는 예방 활성을 갖는 단삼 정제 추출물을 제조하는 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 수득됨을 특징으로 하며, 표준화 시료로 이용가능하고, 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 또는 예방용 단삼 정제 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명의 단삼 정제 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 단삼 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 단삼 정제 추출물은 탄시논 I: 탄시논 ⅡA: 크립토탄시논을 7~15 : 37~45 : 16~24 중량%, 더욱 바람직하게는 탄시논 I: 탄시논 ⅡA: 크립토탄시논을 10~12 : 40~42 : 18~21 중량%, 매우 바람직하게는 탄시논 I: 탄시논 ⅡA: 크립토탄시논을 11.5 : 41 : 19.1 중량% 함유함을 특징으로 한다.

본 발명의 단삼 정제 추출물은 일정 TLC 양상 (담체; 실리카겔 F254, 전개용매; 클로로포름:메탄올 = 30:1, Rf; 0.39 ~ 0.57, 검출방법; UV 254 nm)을 나타냄 을 특징으로 한다.

본 발명의 단삼 정제 추출물은 간세포 보호 효과, 항섬유화 효과, 간성상세포의 자가사멸 유도 효과 및 소수성 담즙산염으로 인한 간세포 자가사멸 억제 효과를 나타냄을 특징으로 한다.

본 발명의 저급 알콜 용매로는 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 C₁ 내지 C₄의 저급알콜 용매를 포함한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 건조한 단삼 중량의 약 1 내지 1000배, 바람직하게는 약 10 내지 100배 부피의 물 또는 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 저급 알콜 용매 및 이들의 용매 혼합물로 1 내지 24시간, 바람직하게는 2 내지 12시간 동안, 10 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 80℃에서, 환류냉각추출법, 초음파추출법, 온침, 냉침 등의 추출방법을 통하여 추출, 여과, 감압농축 및 건조과정을 통하여 조추출물을 얻는 제 1단계; 상기 조추출물 중량의 1 내지 10배, 바람직하게는 3 내지 6배 부피의 물을 넣어 현탁시켜 여과하여 수불용성 잔사를 얻는 제2단계; 상기 잔사에 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 저급 알콜용매, 바람직하게는 에탄올 용매를 가하여 교반, 용해 및 여과과정을 통하여 여액을 얻는 제 3단계; 상기 여액의 잔류 용매를 제거하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 표준화 시료로 이용가능하고 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증 치료 및 예방 효과가 탁월한 본 발명의 단삼 정제 추출물 (이하, “SM-1"이라 명명함)을 얻는 제조 방법을 제공한다.

상기 제조 방법은 단삼의 표준화 시료로서 사용가능하도록, 단삼의 생리활성 성분인 크립토탄시논, 탄시논 I, 또는 탄시논 IIA의 함량을 극대화할 수 있으며, 바람직하게는 상기의 제조 방법으로 본 발명의 도 3의 HPLC 크로마토그램에 나타낸 바와 같은 성분상을 갖는 단삼 정제 추출물을 수득할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조공정으로부터 얻어진 단삼 정제 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 단삼 정제 추출물은 기존 단삼 추출물의 간보호효과, 항섬유화 효과와 비교하여 탁월한 효과를 나타내며, 더불어 담즙에 의한 간세포 자가사멸을 억제하는 효능을 부가적으로 나타낸다. 3차-부틸 하이드로퍼록사이드 (tertiary-butyl hydroperoxide ; t-BH)에 의한 산화적 간세포 손상 및 D-갈락토사민 (D-Galactosamine ; GalN)에 의한 비산화적 간세포 손상 유도시 배양액 내로 젖산 탈수소효소 (Lactate dehydrogenase ; LDH)의 유출을 억제함으로써 간세포 괴사를 억제하는 효과가 있음을 확인하였으며, 이는 기존 단삼 물추출물 및 에탄올추출물과 비교하였을 때 더욱 탁월한 간보호 효과임을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 단삼 정제 추출물은 간 손상시 결합조직을 과다생성함으로써 간섬유화 또는 간경화 유발의 결정적 원인이 되는 간성상세포의 자가사멸을 유도하였다. 또한 소수성 담즙산염인 글리코치노디옥시콜산 (glycochenodeoxycholic acid)으로 간세포 자가 사멸 유도시 자가 사멸 억제효과를 보였으며, 이 또한 기존 단삼 물추출물 및 에탄올추출물과 비교하였을 때 더욱 탁월한 자가사멸 억제능임을 확인하였다. 또한, 사염화탄소로 유도한 급성 간손상 및 아급성 간손상 동물모델에서 간세포 보호활성 및 간성상세포 증식억제 활성을 확인하였다.

본 발명의 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 및 예방용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 정제 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 정제 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 정제 추출물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 정제 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 정제 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상 기 정제 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 정제 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 정제 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 정제 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 단삼 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증 예방 및 개선용 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단삼 정제 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.

또한, 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학투여형태 또는 건강음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트 린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1~ 20 g, 바람직하게는 약 5~ 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

비교예 1. 단삼 물추출물 및 에탄올추출물의 제조

1-1. 단삼 물추출물의 제조

건조한 단삼 600g을 경동시장에서 구입하여 10배량의 증류수를 가한 후 2시간 동안 가열 환류 추출하고, 진공 여과하여 여액을 얻은 후, 감압 농축(EYELA사, N-1000, 일본)하여 단삼 물추출물 100.4g을 수득하였다 (이하, "CE-A"이라 명명함).

1-2. 단삼 에탄올추출물의 제조

건조한 단삼 600g을 경동시장에서 구입하여 10배량의 에탄올을 가한 후 2시간 동안 가열 환류 추출하고, 진공 여과하여 여액을 얻은 후, 감압 농축(EYELA사, N-1000, 일본)하여 단삼 에탄올추출물 74.9g을 수득하였다 (이하, "CE-B"라 명명함).

실시예 1. 단삼 표준화시료인 단삼 정제 추출물의 제조

1-1. 단삼 조추출물의 제조

건조한 단삼 600 g을 경동시장에서 구입하여 동일량의 증류수를 가한 후 12시간 실온에서 방치하여 수분을 흡수시키고 여기에 에탄올 5 ℓ를 가하여 2시간 동안 가열 환류 추출하고, 진공 여과하여 여액을 얻은 후, 감압 농축 (EYELA사, N-1000, 일본)하여 단삼 조추출물 110 g을 수득하였다.

1-2. 단삼 정제 추출물의 제조

상기 실시예 1-1 단계에서 얻은 단삼 조추출물 110 g에 증류수 400 ㎖를 가하고 진탕 교반하여 균질하게 현탁시킨 후 여과하여 증류수에 불용부분인 잔사를 얻었다. 얻어진 잔사에 에탄올 1 ℓ를 가하여 교반하여 용해시킨 다음 여과하여 여액을 얻은 다음, 여액을 감압농축하여 에탄올용매를 제거한 고형물 8.69 g (수득률: 원료 단삼으로부터 1.45 %)을 얻었다 (이하, "SM-1"이라 명명함).

1-3. 고성능액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography; HPLC )를 이용한 단삼 표준화시료의 함유성분의 조성 및 함량 확인

1-3-1. HPLC 용 표준용액 조제

크립토탄시논, 탄시논 I, 탄시논 ⅡA 표준품은 원광대학교 약학대학 생약학연구실에서 단삼 에탄올추출물로부터 순수하게 분리한 후 기기분석 결과를 검토하여 각각의 구조를 확인하여 실험에 사용하였다. 각각의 표준품 4 mg을 정밀하게 달아 HPLC용 메탄올에 녹이고 이것을 스톡(stock) 용액으로 하여 25, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 검액을 만들어 검량선용 표준용액으로 하였다.

1-3-2. 검액의 조제

상기 비교예 1 및 실시예 1-2에서 수득한 CE-A, CE-B 및 SM-1를 각각 4 mg씩 정확히 칭량하여 HPLC용 메탄올에 용해시켜 0.45 ㎛ 막여과기로 여과하고 여액을 10 ㎖로 조정하여 검액으로 하였다.

1-3-3. HPLC 의 분석조건

HPLC는 Sykam S-2100(Sykam, Germany), 컬럼은 Inertsil ODS-3(GL Sciences, Inc., Japan)을 사용하였으며, 검출 스펙트럼은 UV 210 과 270 nm를 사용하였다. 이동상은 물:아세토니트릴 혼합용액 (35:65)를 사용하였고, 유속은 1.0 ㎖/min으로 하였다.

1-3-4. 각 시료의 크립토탄시논 , 탄시논 I, 탄시논 IIA 의 함량 측정

상기 실시예 1-3-2에서 조제된 각 시료 검액을 10 ㎕씩 취하여 3회 반복 HPLC를 실시하고 얻어진 크로마토그람의 면적을 구하고 검량선을 작성하여 얻은 각각의 회귀방정식으로부터 크립토탄시논, 탄시논 I, 탄시논 ⅡA의 함량을 구하였다.

1-3-5. HPLC 를 이용한 SM-1의 함유성분의 조성 및 함량 확인

상기 실시예 1-3-1의 크립토탄시논, 탄시논 I, 탄시논 ⅡA 각각의 표준용액 10 ㎕를 취하여 HPLC를 실시하여 얻은 검량선을 작성하여 얻은 회귀직선 방정식은 각각 y = 8522.6567x + 30.9246 (r=0.9995), y = 5448.8166x + 69.6284 (r=0.9974), y = 9377.5351x + 3.4943 (r=0.9995)이었다. 상기 실시예 1-3-3에서 조제한 CE-A, CE-B 및 SM-1 3종의 검액에 대한 HPLC를 실시한 결과 하기 도 1 내지 도 3의 HPLC 크로마토그람을 얻을 수 있었다. 상기 3종 각각의 크립토탄시논, 탄시논 I, 탄시논 ⅡA은 각각 12.683, 15.600, 24.483분의 정체 시간 (retention time)을 나타냈으며, 각 피크는 표준품과 스파이크 시험을 이용하여 확인하였다. 상기 3 종의 검액을 10 ㎕씩를 취하여 HPLC를 실시하여 얻은 크로마토그람에서 면적을 구하여 상기 3종의 검액 중의 크립토탄시논, 탄시논 I, 탄시논 ⅡA의 함량을 구한 결과는 하기 표 1에 나타냈으며, 단삼 표준화시료 (SM-1)의 크립토탄시논, 탄시논 I, 탄시논 ⅡA 함량이 탁월함을 알 수 있었다.

시료명	함량 (mg/㎖)
시료명	크립토탄시논	탄시논 I	탄시논 ⅡA
CE-A	0	0	0
CE-B	10.91 ± 0.03	33.23 ± 0.05	4.98 ± 0.02
SM-1	31.25 ± 0.02	49.75 ± 0.06	55.15 ± 0.05

참고예 1. 간세포 분리 및 배양

세글렌 등의 방법 (Seglen et al., Exp Cell Res., 82, pp391-398, 1973)에 따라 웅성 SD랫트 (Sprague-Dawley rat, 대한실험동물센터, 경기도)로부터 간세포를 분리하였다. SD랫트를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO₂ 및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣고, 37 ℃의 칼슘이온과 마그네슘이온이 없는 행크의 균형염 용액(Ca² ⁺, Mg² ⁺-free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그 후, 0.05 % Ⅳ형 콜라게나아제 (collagenase type IV, Sigma, 미국) 및 1 mM 염화칼슘 (CaCl₂, Sigma, 미국) 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 후 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리하고 침전된 간세포를 취해 칼슘이온과 마그네슘이온이 없는 행크의 균형염 용액으로 2회 세척한 후 1형 콜라겐 (collagen type I, Sigma, 미국)으로 코팅된 배양용기에 10 %(v/v) 우태아 혈청 (FBS; fetal bovine serum, GibcoBRL), 10^-8 M 인슐린, 50 U/㎖의 페니실린 및 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 (Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E (WME; Williams’Medium E, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여 세포수가 1× 10⁶ 세포수/㎖ 되도록 한 후, 5 % CO₂, 37 ℃의 조건에서 배양하였다. 2시간 배양 후 세포를 Ca² ⁺, Mg² ⁺이 첨가되어 있는 행크의 균형염 용액 (HBSS)으로 세척하여 붙지 않은 간세포는 제거하고 새 배양액으로 교체한 후 5% CO₂, 37℃의 조건에서 16시간동안 배양시킨 후 실험에 사용하였다.

참고예 2. 1차 배양 간세포에서 간손상 유도 및 단삼표준화시료 또는 단삼추출물 처리

2-1. 3차-부틸 하이드로퍼록사이드 ( t- BH)에 의한 간손상 유도

참고예 1에서 분리배양한 간세포에 산화적 손상을 유발하기 위하여 1.5 mM 3차-부틸 하이드로퍼록사이드 (t-butyl hydroperoxide ; t-BH, Sigma, USA)를 처리하였다. 간세포에 SM-1, CE-A 또는 CE-B을 함유한 배양액을 가한 후 1.5 mM t-BH를 1시간 동안 처리하였다. t-BH는 HBSS로 희석하여 150 mM의 스톡을 사용하였으며, 배양액에 가하여 최종 1.5 mM이 되도록 처리하였다. 실험군은 하기 표 2과 같이 설정하였다.

실험군	처리 조성물
1군	정상 배양액
2군	t-BH (1.5 mM) 함유 배양액
3군	t-BH (1.5 mM) 및 SM-1 (200 ㎍/㎖) 함유 배양액
4군	t-BH (1.5 mM) 및 SM-1 (50 ㎍/㎖) 함유 배양액
5군	t-BH (1.5 mM) 및 SM-1 (12.5 ㎍/㎖) 함유 배양액
6군	t-BH (1.5 mM) 및 SM-1 (3.125 ㎍/㎖) 함유 배양액
7군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-B (200 ㎍/㎖) 함유 배양액
8군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-B (50 ㎍/㎖) 함유 배양액
9군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-B (12.5 ㎍/㎖) 함유 배양액
10군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-B (3.125 ㎍/㎖) 함유 배양액
11군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-A (200 ㎍/㎖) 함유 배양액
12군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-A (50 ㎍/㎖) 함유 배양액
13군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-A (12.5 ㎍/㎖) 함유 배양액
14군	t-BH (1.5 mM) 및 CE-A (3.125 ㎍/㎖) 함유 배양액

2-2. D- 갈락토사민 ( GalN ; D- galactosamine )에 의한 간손상 유도

단삼 표준화시료의 간세포 보호효과가 비산화적 손상에 대해서도 유효한지 여부를 알아보기 위하여 D-갈락토사민 (D-galactosamine; GalN, Sigma, USA)으로도 비산화적 간세포 손상을 유발하여 그 보호효과를 확인하였다. D-갈락토사민은 사람에서의 바이러스성 간염과 유사한 간손상을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 우리딘 뉴클레오티드 (uridine nucleotide)를 고갈시킴으로써 원형질막 단백질 (plasma membrane protein)과 리보핵산 (RNA; ribonucleic acid) 합성을 저해함으로써 간세포 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Wu et al., Hepatology, 23(2), pp359-65, 1996).

참고예 1에서 분리 배양한 간세포에 비산화적 손상을 유발하기 위하여 30 mM D-갈락토사민을 처리하였다. 간세포에 SM-1, CE-A 또는 CE-B를 함유하는 배양액을 가하여 10분 동안 전처리한 후 30 mM GalN를 가하여 24시간 동안 배양하였다. D-갈락토사민은 HBSS로 희석하여 사용하였으며, 배양액에 가하여 최종 30 mM이 되도록 처리하였다. 실험군은 하기 표 3과 같이 설정하였다.

실험군	처리 조성물
1군	정상 배양액
2군	GalN (30 mM) 함유 배양액
3군	GalN (30 mM) 및 SM-1 (40 ㎍/㎖) 함유 배양액
4군	GalN (30 mM) 및 SM-1 (10 ㎍/㎖) 함유 배양액
5군	GalN (30 mM) 및 SM-1 (2.5 ㎍/㎖) 함유 배양액
6군	GalN (30 mM) 및 SM-1 (0.625 ㎍/㎖) 함유 배양액
7군	GalN (30 mM) 및 CE-B (40 ㎍/㎖) 함유 배양액
8군	GalN (30 mM) 및 CE-B (10 ㎍/㎖) 함유 배양액
9군	GalN (30 mM) 및 CE-B (2.5 ㎍/㎖) 함유 배양액
10군	GalN (30 mM) 및 CE-B (0.625 ㎍/㎖) 함유 배양액
11군	GalN (30 mM) 및 CE-A (40 ㎍/㎖) 함유 배양액
12군	GalN (30 mM) 및 CE-A (10 ㎍/㎖) 함유 배양액
13군	GalN (30 mM) 및 CE-A (2.5 ㎍/㎖) 함유 배양액
14군	GalN (30 mM) 및 CE-A (0.625 ㎍/㎖) 함유 배양액

2-3. 소수성 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸 유도

참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포에 담즙울체 (Cholestasis with hepatocyte injury)와 같은 조건을 형성하여 자가사멸 (apotosis)을 유발하기 위하여, 담즙울체시 간독성을 나타내는 소수성 담즙산염인 글리코치노디옥시콜레이트(GCDC; glycochenodeoxycholate)를 간세포에 처리한다. 간세포에 SM-1, CE-A 또는 CE-B를 함유하는 배양액을 가하여 10분 동안 전처리한 후 100 μM GCDC를 가하여 4시간 동안 배양하였다. GCDC은 HBSS로 희석하여 0.22 ㎛ 필터로 여과한 것을 사용하였으며, 배양액에 가하여 최종 100 μM이 되도록 처리하였다. 실험군은 하기 표 4과 같이 설정하였다.

실험군	처리 조성물
1군	정상 배양액
2군	GCDC (100 μM) 함유 배양액
3군	GCDC (100 μM) 및 SM-1 (40 ㎍/㎖) 함유 배양액
4군	GCDC (100 μM) 및 SM-1 (20 ㎍/㎖) 함유 배양액
5군	GCDC (100 μM) 및 CE-B (100 ㎍/㎖) 함유 배양액
6군	GCDC (100 μM) 및 CE-A (100 ㎍/㎖) 함유 배양액

참고예 3. 간성상세포 분리배양 및 단삼 표준화시료 또는 추출물 처리

프리드만 등의 방법 (Friedman et al., Hepatology, 15(2), pp234-243, 1992)을 수정하여 웅성 SD 랫트 (Sprague-Dawley rat, 대한실험동물센터, 경기도)로부터 간성상세포를 분리하였다. 랫트를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO₂ 및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣고, 37℃의 칼슘이온과 마그네슘이온이 없는 행크의 균형염 용액(Ca² ⁺, Mg² ⁺-free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거한 후, 0.05 % Ⅳ형 콜라게나아제 (collagenase type IV) 및 1 mM 염화칼슘 (CaCl₂) 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 후, 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리한 후, 상층액만 따로 모으고 침전된 간세포를 제거한다. 상기 상층액을 11.5 % 및 17 % 메트리자마이드 (metrizamide, Sigma)층 위에 쌓고, 1,700×g에서 15분간 원심분리하여 간성상세포층을 획득하였다. 상기 간성상세포층을 행크의 균형염 용액으로 세척한 후, 코팅되지 않은 배양용기에 10 %(v/v) 우태아 혈청(FBS; fetal bovine serum, GibcoBRL), 50U/㎖의 페니실린 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E (WME; Williams' Medium E, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여 세포수가 5×10⁵ 세포수/㎖ 되도록 하여, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 계대배양한 간성상세포를 10 % 대신 1 %의 FBS가 첨가된 배양액으로 바꿔 24시간동안 배양한 후 SM-1, CE-B 또는 CE-A을 200, 50, 12.5, 3.125 ㎍/㎖로 24시간 처리하였다.

참고예 4. 사염화탄소에 의한 급성 간손상 유도 및 단삼 표준화시료 또는 추출물 처리

체중 200-220 g의 웅성 SD 랫트 (Sprague-Dawley rat, 대한 실험동물센터, 충북 음성)를 1주간 실험실 환경에 적응시키고, 사료와 물을 충분히 공급하였다. SM-1 또는 CE-B를 정제수에 혼탁시켜 쥐에 4일간 경구투여한 후 사염화탄소 (CCl₄; Carbon chloride)를 콩기름에 혼합하여 0.75 ㎖/kg의 용량으로 1회 경구투여하여 급성 간손상을 유발하였다. 실험군은 하기 표 5와 같이 설정하였다.

실험군	투여 조성물
1군	정제수 투여
2군	정제수 +사염화탄소 투여
3군	SM-1 (200 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
4군	SM-1 (100 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
5군	SM-1 (50 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
6군	SM-1 (25 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
7군	CE-B (200 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
8군	CE-B (100 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
9군	CE-B (50 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
10군	CE-B (25 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여

1, 2군은 대응량의 정제수를, 다른 군은 SM-1 또는 CE-B를 4일간 경구투여하고 마지막 경구투여 1시간 경과 후 1군에는 대응량의 콩기름(동방유량 제품)을, 2-10군은 콩기름에 혼합한 사염화탄소를 1회 경구투여하고 24시간 경과 후 마취하여 심장천자로 혈액을 취하고, 상온에서 1시간 이상 방치한 뒤 원심분리하여 혈청을 얻고, 혈청은 영하 20℃에서 보관하였다.

참고예 5. 사염화탄소에 의한 아급성 간손상 유도 및 단삼 표준화시료 또는 추출물 처리

체중 200-220 g의 웅성 SD 랫트 (Sprague-Dawley rat, 대한 실험동물센터, 충북 음성)를 1주간 실험실 환경에 적응시키고, 사료와 물을 충분히 공급하였다. SM-1 또는 CE-B를 정제수에 혼탁시켜 쥐에 15일간 경구투여한 후 사염화탄소를 콩기름에 혼합하여 사염화탄소로서 0.75 ㎖/kg으로 단삼시료를 경구투여하는 동안 3일마다 각 1회, 즉 15일간 총5회 경구투여하여 아급성 간손상을 유발하였다. 실험군은 하기 표 6과 같이 설정하였다.

실험군	투여 조성물
1군	정제수 투여
2군	정제수 +사염화탄소 투여
3군	SM-1 (50 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
4군	SM-1 (25 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
5군	SM-1 (50 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여
6군	SM-1 (25 mg/kg/day) 및 사염화탄소 투여

1, 2군은 대응량의 정제수를, 다른 군은 SM-1 또는 CE-B를 15일간 경구투여하였다. 시료의 마지막 경구투여 1시간 경과 후 1군에는 대응량의 콩기름(동방유량 제품)을, 2-10군은 콩기름에 혼합한 사염화탄소를 경구투여하고 24시간 경과 후 마취한 후 심장천자로 혈액을 취하고, 상온에서 1시간 이상 방치한 뒤 원심분리하여 혈청을 얻고, 혈청은 영하 20℃에서 보관하였다. 심장천자후 즉시 간을 적출하여 일부는 10% 중성 포르말린에 냉장보관하고 일부는 -70℃에 보관하였다.

실험예 1. 3차-부틸 하이드로퍼록사이드 ( t- BH)에 의한 산화적 괴사 유도시 단삼 표준화시료의 간세포 보호효과 측정

참고예 2-1에서와 같이 간세포에 t-BH를 처리한 후 산화적 괴사에 의해 간세포로부터 배양액 중으로 흘러나온 젖산 탈수소효소 (LDH; Lactate dehydrogenase) 수치를 자동건조 화학 분석기 (autodry chemistry analyzer; SPOTCHEM^TM SP4410, Arkray, Japan)를 이용하여 측정하였다.

또한, 간세포의 생존율을 측정하기 위하여 t-BH와 각 시료 함유 배양액을 걷어내고 3-(4,5-디메틸티아졸-1-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-1-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide ; MTT)를 0.5 ㎎/㎖ 함유하는 배양액을 처리하여 2시간 동안 배양한 후 살아있는 간세포에 의하여 생성된 포르마잔 (formazan)을 디메틸술폭시화물 (dimethylsulfoxide; DMSO)에 용해하여 540nm에서의 흡광도값를 구하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

실험군	LDH (1군에 대한 %)	생존율 (1군에 대한 %)
1군	100±5	100±1
2군	369±9^a	17±3^a
3군	96±4^b	54±5^a,b
4군	102±4^b	61±3^a,b
5군	96±14^b	34±1^a,b
6군	295±21^a,b	22±0^a,b
7군	110±1^a,b	39±6^a,b
8군	315±14a,^b	18±5^a
9군	357±3^a	15±1^a
10군	368±11^a	16±4^a
11군	350±5^a	17±2^a
12군	361±3^b	16±2^a
13군	369±17^a	16±3^a
14군	367±14^a	17±3^a
[주] ^aP< 0.01, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 ^bP< 0.01, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

상기 표 7의 결과로부터, 본 발명의 SM-1은 산화적 손상에 의한 간세포 손상 유도시 LDH 유출 억제 및 세포 사멸을 억제함으로써 간세포 괴사로부터 보호효과가 있음을 확인할 수 있었으며 SM-1의 간세포 보호효과는 CE-B 및 CE-A와 비교시 탁월함을 알 수 있었다.

실험예 2. D- 갈락토사민 ( GalN )에 의한 비산화적 괴사에 대한 단삼 표준화시료의 간세포 보호효과 측정

참고예 2-2에서와 같이 간세포에 30 mM GalN를 처리하여 발생한 손상에 의해 간세포로부터 배양액 중으로 흘러나온 LDH 수치를 자동건조 화학 분석기를 이용하여 측정하였다.

또한, 간세포의 생존율을 측정하기 위하여 GalN과 각 시료 함유 배양액을 걷어내고 MTT를 0.5 ㎎/㎖ 함유하는 배양액을 처리하여 2시간 동안 배양한 후 살아있는 간세포에 의하여 생성된 포르마잔을 DMSO에 용해하여 540 nm에서의 흡광도 값을 구하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.

실험군	LDH (1군에 대한 %)	생존율 (1군에 대한 %)
1군	100±6	100±5
2군	167±11^a	38±4^a
3군	110±8^b	54±6^a,b
4군	109±7^b	75±6^a,b
5군	120±13^b	59±4^a,b
6군	163±6^a	41±4^a
7군	108±9^b	64±5^a,b
8군	138±10^a,b	45±2^a
9군	183±21^a	37±5^a
10군	182±17^a	39±4^a
11군	174±7^a	35±4^a
12군	193±20^b	37±3^a
13군	187±15^a	35±4^a
14군	184±16^a	36±2^a
[주] ^aP< 0.01, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 ^bP< 0.01, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

상기 표 8의 결과로부터, 본 발명의 SM-1은 비산화적 손상에 의한 간세포 손상 유도시에도 LDH 유출 억제 및 세포 사멸을 억제함으로써 간세포 보호효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 보호효과는 CE-B 및 CE-A와 비교시 탁월함을 알 수 있었다.

실험예 3. 소수성 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸에 대한 단삼 표준화시료의 억제효과 측정

3-1. 단삼 표준화시료의 DNA 절편화 (DNA fragmentation) 억제 효과 측정

자가사멸에 의한 간세포내 DNA 절편화에 미치는 SM-1의 효과는 참고예 2-3에서 준비된 간세포를 사용하여 하기와 같이 측정하였다. 키트 (Wizard　 Genomic DNA purifiction kit, Promega, USA)를 이용하여 간세포 내 DNA를 추출하여 정량한 다음, 30 ㎍의 DNA를 2% agarose gel에서 50 mV, 40분간 전기영동하여 UV하에서 DNA 절편화를 확인하였으며 결과는 도 4과 같다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 100 μM GCDC 처리시 간세포의 DNA 절편화가 유도되었으나, SM-1과 100 μM GCDC를 함께 처리한 간세포의 경우 DNA 절편화 유도가 억제됨을 확인하였다. 반면 CE-A 또는 CE-B는 100 μM GCDC 처리시 유도되는 간세포의 DNA 절편화를 억제하는 효과를 나타내지 않았다.

3-2. 단삼 표준화시료의 카스파제 ( caspase ) 활성 억제 효과 측정

간세포 자가사멸 과정 중 활성이 증대되는 카스파제-3 (caspase-3), 카스파제-8 (caspase-8) 및 카스파제-9 (caspase-9)의 활성은 참고예 2-3에서 처리한 간세포 실험군을 대상으로 시판되는 각각의 카스파제 활성 착색 검정 키트 (activity colorimetric assay kit; R&D Systems, Inc., USA)와 면역블롯 어세이 (immunoblot assay)를 이용하여 측정하였다. 하기 표 9에 나타난 바와 같이, SM-1은 100 μM GCDC 처리시 활성이 증대되는 카스파제-3, -8 및 -9의 활성을 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었으며 이러한 보호효과는 CE-B 및 CE-A과 비교시 탁월함을 알 수 있었다.

실험군	카스파제-3 활성 (%)	카스파제-8 활성 (%)	카스파제-9 활성 (%)
1군	11±4	13±5	21±6
2군	100±14^a	100±12^a	100±15^a
3군	47±9^a,b	39±9^a,b	47±7^a,b
4군	89±5^a	81±8^a	82±10^a
5군	92±10^a	85±9^a	87±9^a
6군	99±13^a	103±13^a	105±9^a
[주] ^aP< 0.01, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 ^bP< 0.01, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

3-3. 단삼 표준화시료의 간세포 내 PARP 분할 억제 효과 측정

자가사멸에 의한 간세포 내 폴리 ADP-리보스 중합효소 [poly(ADP-ribose) polymerase; PARP]의 분할 (cleavage)에 미치는 SM-1의 효과는 참고예 2-3의 간세포 실험군을 사용하여 하기와 같이 실시하였다. 간세포를 용해완충액 (lysis buffer; 10mM Tris, pH 8.0, 120 mM NaCl, 0.5 % NP-40, 1 mM EDTA, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM dithiothreitol, 1 ㎍/㎖ aprotinin)로 용해하고 14000 rpm, 4 ℃에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리후 수득한 상층액 내 단백질 농도를 바이오라드 DC 단백질 검사 키트 (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 측정하고 각 실험군의 단백질 100 ㎍을 각각 12 %(w/v) SDS 겔(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 200 V로 1시간동안 전기영동 하였다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량크기에 따라 분리되었으며, 이 상태로 30 mA로 16시간동안 니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane, Millipore)으로 트랜스퍼 (transfer) 하였다. 니트로셀룰로오스막을 5 % 탈지유(skim milk)로 블로킹하고, 200배 희석된 마우스 항-PARP 항체 (purified mouse anti-human PARP monoclonal antibody, Cell Signaling Technology)를 1차 항체로 사용하여, 16시간동안 4 ℃에서 반응시켰으며, 2,000배 희석된 양고추냉이 퍼록시다제가 결합된 항-토끼 면역글로블린 G (horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG; Santacruz사)를 2차 항체로 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 강화된 화학발광 웨스턴 블랏 검출 시스템 키트 [Enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection system kit, KPL사)를 이용하여 발광반응하였으며, 발광정도는 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름 (Agfa사, EC)에 노출시켜 확인하였으며 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 100 μM GCDC에 의한 PARP 분할유도는 SM-1 처리에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. 반면, CE-B 또는 CE-A은 PARP 분할을 억제하는 효과가 없음을 확인할 수 있었다.

3-4. 단삼 표준화시료의 간세포 c- jun - NH2 - termial kinase ( JNK ) 인산화에 미치는 효과 측정

자가사멸에 의한 간세포 내 JNK (c-jun-NH2-termial kinase) 인산화 (phosphorylation)에 미치는 SM-1의 효과는 참고예 2-3의 간세포 실험군을 사용하여 하기와 같이 실시하였다. 간세포 단백질은 실시예 3-3과 같이 준비하였으며, 수득한 각 실험군의 단백질 100 ㎍을 각각 12 %(w/v) SDS 겔에서 200 V로 1시간동안 전기영동 하였다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량크기에 따라 분리되었으며, 이 상태로 30 mA로 16시간동안 니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane, Millipore)으로 트랜스퍼 (transfer) 하였다. 니트로셀룰로오스막을 5 % 탈지유(skim milk)로 블로킹하고, 1000배 희석된 phospho-JNK 항체 (phospho-JNK polyclonal antibody; Cell Signaling Technology)를 1차 항체로 사용하여, 16시간동안 4 ℃에서 반응시켰으며, 2000배 희석된 양고추냉이 퍼록시다제가 결합된 항-토끼 면역글로블린 G (horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG; Santacruz)를 2차 항체로 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 강화된 화학발광 웨스턴 블랏 검출 시스템 키트 [Enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection system kit, KPL)를 이용하여 발광반응하였으며, 발광정도는 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름 (Agfa, EC)에 노출시켜 확인하였으며 그 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 100 μM GCDC에 의해 간세포 자가사멸에 주요한 작용을 하는 JNK의 인산화가 유도되나 SM-1에 의해 JNK 인산화는 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다. 반면, CE-A 또는 CE-B는 JNK 인산화 억제작용을 나타내지 않았다.

상기 결과로부터 SM-1은 100 μM GCDC에 의해 유도된 카스파제 활성, DNA 절편화 및 PARP 분할을 억제하며, 또한 간세포 자가사멸의 주요역할을 하는 것으로 알려진 JNK 인산화를 억제함으로써 자가사멸로부터 간세포 보호 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 반면, CE-A 또는 CE-B는 SM-1의 농도보다 높은 100 ㎍/㎖의 농도에서도 GCDC에 의한 간세포 자가사멸을 억제하는 효과가 없음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에 의한 SM-1은 치료제로 개발이 가능한 저농도의 처리로 담즙산에 의한 간세포 자가사멸에 효과적으로 작용함을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 단삼 표준화시료 처리에 의한 간성상세포의 카스파제 활성 억제 효과 측정

SM-1, CE-B 또는 CE-A에 의한 간성상세포의 자가사멸 억제 효과를 카스파제-3 (caspase-3) 활성을 측정하여 알아보았다. 카스파제-3 (CPP-32, Yama, Apogain)은 자가사멸과정의 주효소로 세포내 전효소형태로 존재하다가 세포사멸과정 중 활성화되어 폴리 ADP-리보스 중합효소 (poly ADP-ribose polymerase; PARP)등을 분해하는 것으로 알려져 있다 (Allen et al., Pharmacol . Toxicol . Methods, 37, pp215-228, 1997; Duriez et al., Biochem . Cell Biol ., 75, pp337-349, 1997).

자가사멸과정 중 활성이 증대되는 카스파제의 활성은 시판되는 키트 (caspase-3 activity colorimetric assay kit; R&D Systems,Inc.,USA)를 이용하여 참고예 3의 간성상세포 실험군을 대상으로 측정하였으며 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 표 10에 나타난 바와 같이, SM-1 200, 50, 12.5 ㎍/㎖을 24시간동안 간성상세포에 처리하였을 경우 카스파제-3이 유의성있게 활성화됨을 확인하였다. CE-B의 경우 200 ug/mL을 24시간동안 처리하였을 경우 카스파제-3이 유의성있게 활성화되었으나 50 ug/mL의 농도에서는 카스파제-3 활성에 영향을 미치지 않았으며 CE-A의 경우 전 농도에서 카스파제-3에 영향을 미치지 않았다. 이로부터 본 발명에 의한 SM-1은 CE-B 및 CE-A에 비하여 우수한 간성상세포 자가사멸 유도효과가 있음을 확인하였다.

	군 분류	카스파제-3 활성(%)
1군	정상군	100±7
2군	SM-1 200 ㎍/㎖	823±32^a
3군	SM-1 50 ㎍/㎖	575±32^a
4군	SM-1 12.5 ㎍/㎖	253±28^a
5군	SM-1 3.125 ㎍/㎖	113±15
6군	CE-B 200 ㎍/㎖	324±33^a
7군	CE-B 50 ㎍/㎖	122±18
8군	CE-B 12.5 ㎍/㎖	98±10
9군	CE-B 3.125 ㎍/㎖	105±9
10군	CE-A 200 ㎍/㎖	99±10
11군	CE-A 50 ㎍/㎖	103±9
12군	CE-A 12.5 ㎍/㎖	94±8
13군	CE-A 3.125 ㎍/㎖	103±9
[주] ^aP< 0.01, 정상군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

실험예 5. 사염화탄소에 의한 급성 간손상 유도시 단삼 표준화시료 및 단삼 에탄올추출물의 혈중 아스파테이트 트랜스아미나제 ( AST ) 및 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 에 미치는 영향

급성 간손상시 본 발명의 단삼 시료의 간보호 효과를 확인하기 위하여, 참고예 4 실험군의 혈청을 취하여 혈청중 AST 및 ALT 수치를 자동건조 화학 분석기 (autodry chemistry analyzer; SPOTCHEM^TM SP4410, Arkray, Japan)를 이용하여 측정하여 하기 표 11에 나타내었다.

표 11에 나타난 바와 같이, SM-1의 경우 50-200 mg/kg/day의 용량에서 AST 및 ALT 수치가 유의적으로 감소하였으나, CE-B의 경우 200 mg/kg/day의 용량에서만 ALT 수치가 유의적으로 감소하였다. 상기 결과로부터 본 발명에 의한 SM-1의 급성 간손상에 대한 간보호효과가 CE-B와 비교시 탁월함을 확인하였다.

군	AST (1군에 대한 %)	ALT (1군에 대한 %)
1군	100 ± 15	100 ± 13
2군	364 ± 32^a	669 ± 70^a
3군	214 ± 26^a,b	364 ± 45^a,b
4군	233 ± 25^a,b	375 ± 44^a,b
5군	264 ± 27^a,b	418 ± 51^a,b
6군	356 ± 36^a	657 ± 86^a
7군	312 ± 34^a	435 ± 56^a,b
8군	350 ± 32^a	643 ± 51^a
9군	375 ± 35^a	639 ± 62^a
10군	363 ± 41^a	651 ± 68^a
[주] ^aP< 0.01, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 ^bP< 0.01, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

실험예 6. 사염화탄소에 의한 아급성 간손상 유도시 단삼 표준화시료 및 단삼 에탄올추출물의 간보호 및 간성상세포 활성화에 미치는 효과 측정

6-1. 단삼 표준화시료의 간보호 효과 측정

아급성 간손상시 본 발명의 단삼 시료의 간보호 효과를 확인하기 위하여, 참고예 5 실험군의 혈청을 취하여 혈청중 AST 및 ALT 수치를 자동건조 화학 분석기 (autodry chemistry analyzer; SPOTCHEM^TM SP4410, Arkray, Japan)를 이용하여 측정하여 하기 표 12에 나타내었다.

표 12에 나타난 바와 같이, SM-1의 경우 50 mg/kg/day의 용량에서 AST 및 ALT 수치가 유의적으로 감소하였으나, CE-B의 경우 유의성이 없었다. 상기 결과로부터 본 발명에 의한 SM-1의 아급성 간손상에 대한 간보호효과가 CE-B와 비교시 탁월함을 확인하였다.

군	AST (1군에 대한 %)	ALT (1군에 대한 %)
1군	100 ± 15	100 ± 13
2군	289 ± 31^a	568 ± 62^a
3군	203 ± 20^a,b	345 ± 32^a,b
4군	232 ± 26^a	351 ± 36^a,b
5군	279 ± 33^a	521 ± 54^a
6군	302 ± 32^a	544 ± 56^a
[주] ^aP< 0.01, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 bP< 0.01, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

6-2. 단삼 표준화시료의 간성상세포의 활성화 및 증식 억제 효과 측정

반복적인 간세포 손상에 의해 간성상세포 (hepatic stellate cells)가 활성화되며, 활성화된 간성상세포의 증식과다에 의해 간섬유화가 진행된다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 간조직에서의 간성상세포의 활성화 정도는 간조직 내 알파-평활근 액틴 (alpha-smooth muscle actin ;alpha-SMA)의 형성 정도로 파악할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다 (Rockey DC et al., J. Submicrosc . Cytol . Pathol ., 24(2), pp193-203, 1992).

따라서, 하기 실시예에서는 사염화탄소 및/또는 단삼시료를 처리한 간조직에서 α-SMA를 면역조직학적으로 염색하여, 그 분포 및 형성정도를 파악함으로써 활성화된 간성상세포의 양태를 확인하여, 단삼 시료 투여의 사염화탄소에 의해 활성화된 간성상세포의 증식 및 간섬유화 억제 여부, 이로 인한 간섬유증 치료 및 예방제로의 가능성을 확인하고자 하였다.

상기 참고예 5의 표 6과 같이 사염화탄소 및/또는 단삼시료를 처리하고, 각 군의 실험동물들로부터 간을 추출하여 10 % 중성 포르말린에 넣어 24시간동안 고정시킨 후, 간조직으로 파라핀 블록을 만들고 3 ㎛로 절편화하여 슬라이드글라스에 부착시킨 후, 일반적인 방법에 따라 자일렌 (xylene) I 및 II을 사용하여 탈파라핀 (deparaffinization)하고, 100%, 95% 에탄올을 순차적으로 처리하여 탈수(rehydration)한 다음 증류수로 세척하였다. 그런 후, LSAB^®2 키트(Labeled Streptavidin Kit, Dako)를 사용하여, 키트에 부착된 사용자 설명서에 따라 스트렙타비딘-바이오틴-퍼록시다아제 복합체 (streptavidin-biotin- peroxidase complex) 형성 방법 (Guesdon et al., J. Histochem. Cytochem ., 27, p1131, 1979; Warnke and Levy, J. Histochem . Cytochem., 28, p771, 1980)을 이용하여 간조직중 α-SMA의 염색을 수행하였다. 즉, 내생적인 퍼록시다제 (peroxidase)를 제거하기 위해 간조직 절편에 3 % 과산화수소를 처리한 후, 1차 항체의 비특이적 결합을 억제하기 위해 1 % 소혈청알부민 (BSA)으로 10분간 블로킹하고, 200배 희석된 α-SMA 항체 (Sigma, 미국)를 1차 항체로 사용하여 실온에서 2시간 반응시켜 간조직 중 α-SMA와 결합시켰다. 그 후, 비오틴화된 항-토끼/항-마우스 면역글로블린 (biotinylated anti-rabbit/anti-mouse immunoglobulin)을 키트에 부착된 사용자 설명서에 따라 처리하고, 스트렙타비딘이 결합된 서양고추냉이 퍼록시다아제(streptavidin conjugated horse radish peroxidase)를 처리하고, 3 %의 3-아미노-9-에틸카바졸 (3-amino-9-ethylcarbazole; AEC)을 사용하여 염색하였다. 그런 후, 메이어의 헤마톡실린 (Mayer's hematoxylin)으로 핵염색을 하고, 0.25 % 암모니아수를 부가한 후, 증류수로 세척하고 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 정상군의 간조직은 혈관 평활근 세포 (smooth muscle cell)와 그 주변의 세포일부에서만 α-SMA가 염색되어 있지만 (도 7A 참조), 사염화탄소를 투여한 군의 간조직에서는 섬유화된 격막을 따라 상당한 부분에서 α-SMA가 검출되어, 활성화된 간성상세포가 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다 (도 7B 참조). 한편, 사염화탄소와 함께 SM-1을 25 ㎎/㎏/day 투여한 군의 간 조직에서는 α-SMA가 도 1B에 비해 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 7C 참조). 반면에 CE-B을 투여한 군의 경우에는 활성화된 간성상세포의 증식이 사염화탄소 투여군과 유사함으로써 CE-B는 아급성 간손상시 간성상세포에는 영향을 미치지 못함을 확인하였다 (도 7D 참조). 즉, 본 발명에 의한 SM-1은 간손상시 활성화된 간성상세포의 수를 감소시킴을 알 수 있었다.

이하, 본 발명의 단삼 정제물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

SM-1 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

SM-1 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

SM-1 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

SM-1 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

SM-1 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

SM-1 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제제예 6으로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

SM-1 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조 방법으로 수득한 단삼 표준화시료용 정제 추출물의 간세포 보호, 항섬유화, 간성상세포의 자가사멸 유도 및 소수성 담즙산염으로 인한 간세포 자가사멸 억제 효과는 기존에 보고된 바 있는 단삼 물추출물 및 단삼 에탄올 추출물의 효과와 비교하여 탁월하므로 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 및 예방을 위한 약학조성물 및 건강보조식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

건조한 단삼에 저급 알콜 용매 및 이들의 용매 혼합물로 추출, 여과, 감압농축 및 건조과정을 통하여 조추출물을 얻는 제 1단계; 상기 조추출물에 물을 가하여 현탁, 여과하여 수불용성 잔사를 얻는 제 2단계; 상기 잔사에 저급 알콜 용매를 가하여 교반, 용해 및 여과과정을 통하여 여액을 얻는 제 3단계; 상기 여액의 잔류 용매를 제거하는 최종단계를 포함하며 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 또는 예방 활성을 갖는 단삼 정제 추출물을 제조하는 제조 방법.
제 1항에 있어서, 건조한 단삼 중량의 10~ 100배 부피의 물 또는 메탄올, 에탄올인 저급 알콜 용매 및 이들의 용매 혼합물로 2~ 12시간 동안, 10~ 100℃에서, 환류냉각추출법, 초음파추출법, 온침, 냉침 등의 추출방법을 통하여 추출, 여과, 감압농축 및 건조과정을 통하여 조추출물을 얻는 제 1단계; 상기 조추출물 중량의 3~ 6배 부피의 물을 넣어 현탁시켜 여과하여 수불용성 잔사를 얻는 제2단계; 상기 잔사에 에탄올 용매를 가하여 교반, 용해 및 여과과정을 통하여 여액을 얻는 제 3단계; 상기 여액의 잔류 용매를 제거하는 최종 단계를 포함함을 특징으로 하는 단삼 정제 추출물을 제조하는 제조 방법.
제 1항에 있어서, 탄시논 I: 탄시논 ⅡA: 크립토탄시논을 7~15 : 37~45 : 16~24 중량% 함유함을 특징으로 하는 단삼 정제 추출물을 제조하는 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 정제 추출물은 일정 TLC 양상 (담체; 실리카겔 F254, 전개용매; 클로로포름:메탄올 = 30:1, Rf; 0.39 ~ 0.57, 검출방법; UV 254 nm)을 나타냄을 특징으로 하는 단삼 정제 추출물을 제조하는 제조 방법.
제 1항의 제조 방법으로 수득됨을 특징으로 하며, 표준화 시료로 이용가능하고, 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 또는 예방용 단삼 정제 추출물.
제 5항에 있어서, 탄시논 I: 탄시논 ⅡA: 크립토탄시논을 7~15 : 37~45 : 16~24 중량% 함유함을 특징으로 하는 단삼 정제 추출물.
제 5항에 있어서, 상기 정제 추출물은 일정 TLC 양상 (담체; 실리카겔 F254, 전개용매; 클로로포름:메탄올 = 30:1, Rf; 0.39 ~ 0.57, 검출방법; UV 254 nm)을 나타냄을 특징으로 하는 단삼 정제 추출물.
제 5항의 단삼 정제 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 간 보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 치료 및 예방용 약학조성물.
제 8항에 있어서, 상기 단삼 정제 추출물은 간세포 보호 효과, 항섬유화 효과, 간성상세포의 자가사멸 유도 효과 및 소수성 담즙산염으로 인한 간세포 자가사멸 억제 효과를 나타냄을 특징으로 하는 약학조성물.
제 5항의 단삼 정제 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간섬유화 또는 간경화증의 개선 및 예방용 건강기능식품.
제 10항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인 건강기능식품.