KR20070110561A - 허혈성 재관류의 치료 및 예방을 위한 제약 조성물 - Google Patents

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웬디 브이. 로드리게자
나렌드라 디. 랄와니
다니엘 하트만
얀 요한손
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Abstract

본 발명은 급성 관상동맥 증후군을 치료 및 예방하는 방법 및 제제를 제공한다. 본 발명의 방법은 안전하고 효과적인 용량의 아포리포프로테인 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 제공하여 아테롬성동맥경화증 플라크를 감소시키고 안정화시킨다. 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 제제도 또한 제공된다.
아포리포프로테인, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체, 허혈성 재관류

Description

허혈성 재관류의 치료 및 예방을 위한 제약 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF ISCHEMIC REPERFUSION}
본 발명은 급성 관상동맥 증후군의 치료 또는 예방을 위한 신규의 제제 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 제제는 명시된 pH, 삼투질농도 (osmolality) 및 순도를 갖는 단일의 단위 투약형이다. 바람직한 방법에서 제제는 투여당 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏의 용량 범위로 주 1회, 월 1회 또는 연 1회 투여된다. 추가로, 용량 및 투약 레지멘 (dosing regimen)과 이러한 용량 또는 투약 레지멘을 사용하고자 하는 특정의 질병이 기술된다. 제제 및 방법은 아포리포프로테인 A-I 밀라노 (Apolipoprotein A-I Milano):포스포리피드 복합체를 사용한다.
심근경색의 관리 및 치료는 20세기 전반부 이래로 누워서 요양하고 관찰하는 시대로부터 혈류역학적 모니터링 및 풍선 카테터 (balloon catheter)를 포함하는 기술에 대한 강조로, 그리고 혈전용해성 치료법에 대해 증가된 촛점을 맞추는 쪽을 진행하여 급격하게 변화되어 왔다 (Antman and Braunwald, "Acute Myocardial Infarction" in Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, 6th edition, vol. 2, Braunwald et al., eds, 2001, W.B. Saunders Company, Philadelphia). 심혈관 질병을 치료하기 위한 치료학적 접근방법은 원병변의 더 큰 이해를 수반하고 지난 100년에 걸쳐서 엄청나게 발전되어 왔다.
거의 모든 심근경색은 일반적으로 중첩된 관상동맥 혈전증을 갖는 관상동맥 아테롬성동맥경화증으로부터 유래한다. 느리게 축적하는 플라크 (plaque)는 부행혈관의 발생으로 인하여 무증후성일 수 있다. 그러나, 아테롬성동맥경화증 플라크, 특히 리피드가 풍부한 것은 갑작스러운 플라크 파괴를 일으키기 쉽다. 플라크 파괴 및 이와 연관된 내피 손상은 트롬복산 A2, 세로토닌, 아데노신 디포스페이트, 트롬빈, 혈소판 활성화 인자, 조직 인자 및 산소-유도된 유리 라디칼과 같은 매개체의 방출을 야기한다. 이들 매개체는 혈소판 응집 및 기계적 폐색을 촉진시켜 혈류 및 산소 공급을 저해하는 혈전 형성을 유도한다. 심근 산소 공급의 지속적이며 격심한 저해는 급성 심근경색을 야기할 수 있다 (참조: Rioufol et al., 2002, Circulation 106:804, Timmis, 2003, Heart 89: 1268-72).
주된 아테롬성동맥경화증 약물요법은 첫째로, 치료학적 종말점으로서 LDL 또는 "나쁜 콜레스테롤"을 저하시키는데 촛점을 둠으로써 아테롬성동맥경화증 플라크의 발생을 방지하거나 느리게 하는 만성적 치료법이었다. 스타틴 치료법은 예를 들어, 개선된 심혈관 건강에 크게 도움이 되지만, 횡문근변성과 같은 부작용이 장애요인으로 남아 있다. 또한, 스타틴은 급성 상황에서는 예를 들어, 허혈성 에피 소드 (episode) 과정에서 민감하고 불안정한 아테롬성동맥경화증 플라크를 감소시키는 작용을 거의 하지 않는다. 급성 치료는 대부분 혈전용해제 (예를 들어, tPA) 및 경피 경관 관상동맥 성형술 (PTCA) 및 관상동맥 우회로 이식술 (CABG)과 같은 외과적 개입을 기본으로 한다. 혈전용해제는 폐색성 혈전을 감소시키거나 제거함으로써 완화를 제공하지만, 이들은 원병변을 변화시키지는 않는다. PTCA와 같은 개입은 그들 자체의 위험을 수반하며, 급성 상태에서는 종종 환자에게 부적합하다. 따라서, 현행 약물학적 치료법은 일단 불안정한 플라크가 위험요소로 존재하면 환자에게 거의 도움을 주지 못한다 (참조: Newton and Krause 2002, Atherosclerosis S3:31-38).
HDL 치료법이 이상지질혈증 및 아테롬성동맥경화증을 위한 새로운 치료 레지멘으로서 알려졌다. 전술한 바와 같은 아포리포프로테인 A-I 밀라노 (아포 A-I 밀라노)는, 이 아포리포프로테인의 변이체 형태를 지닌 개체들이 낮은 HDL ("좋은 콜레스테롤") 레벨과 심혈관 질병의 감소된 위험성을 갖는다는 역설적인 사실로 인하여 관심의 대상이 되고 있다 (참조: Franceschini et al., 1980, J. Clin . Invest. 66:892-900, Weisgraber et al., 1983, J. Biol . Chem . 258: 2508-2513, Franceschini et al., 1985, Atherosclerosis 58:159-174, Franceschini et al., 1987, Arteriosclerosis 7:426-435). 아포 A-I 밀라노 호모다이머 (homodimer)는 콜레스테롤을 섭취한 토끼에서 혈관내막의 비후를 감소시키는 것으로 나타났다 (Ameli et al., 1994, Circulation, 90: 1935-41; 및 Soma et al., 1995, Cir . Res. 76:405-11). ApoE 결핍성 마우스에서, 아테롬성동맥경화증 병소는 수회의 저 용량 및 단일의 고용량 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체 모두에 의해서 감소되었다 (Shah et al., 1998, Circulation 97: 780-85; 및 Shah et al., 2001, Circulation 103:3047-50). 토끼에서 플라크 퇴행은 또한, 토끼당 단백질 500 ㎎ 및 1000 ㎎의 용량으로 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 1회 국소 주입함으로써 나타났다 (Chiesa et al., 2002, Cir . Res. 90:974-80). 토끼 모델에서 유도된 병소는 대부분 대식세포로 이루어지며, 인간에서의 더 복잡한 병소를 대표하는 것은 아니다. 따라서, 유사한 치료법이 인간 아테롬성동맥경화증에서 나타나는 복잡한 플라크에 대해서 효과적일 것인지 여부는 확실하지 않다 (Li et al., 1999, Arterioscler Thromb Vasc Biol 19:378-383; 및 Shah et al., 2001, Circulation 103:3047-50).
심근경색의 병태생리학의 개선된 이해 및 HDL 치료법에서의 발전에도 불구하고, 인간에서 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 예방적 및 치료학적 사용을 위한 안전하고 효과적인 용량, 투약 레지멘 및 제약 제제는 여전히 요구되고 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 아테롬성동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군, 허혈증, 허혈성 재관류 손상, 앙기나 (angina) 및 심근경색을 포함하는 심혈관 질병 또는 관련된 질환의 치료 및 예방, 및 아테롬성동맥경화증 플라크의 감소 또는 안정화, 폐색된 혈관 내의 플라크 감소 및 콜레스테롤 유출의 촉진을 위한 방법 및 제약 제제를 제공한다. 따라서, 본 발명은 아테롬성동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군, 허혈증, 허혈성 재관류 손상, 앙기나 및 심근경색을 포함하는 심혈관 질병 또는 관련된 질환의 치료 및 예방, 및 아테롬성동맥경화증 플라크의 감소 또는 안정화, 폐색된 혈관 내의 플라크 감소 및 콜레스테롤 유출의 촉진을 위한 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 사용을 위한 용량 및 투약 레지멘 및 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 제제를 포함한다. 본 발명에 기술된 방법 및 제제는, 치료되지 않고 놓아두거나 통상적인 방법에 의해서 치료되는 경우에 파괴에 의해 급성 관상동맥 증후군을 포함하는 허혈성 발작을 유도할 수 있는 불안정한 아테롬성동맥경화증 플라 크의 빠른 감소 또는 안정화를 야기한다.
본 출원인은 바람직하게는 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체로서의 아포 A-I 밀라노와 같은 외생적으로 생산된 HDL 유사체 (mimetic)가 아테롬성동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군, 허혈증, 허혈성 재관류 손상, 앙기나 및 심근경색을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 심혈관 질병 또는 관련된 질환의 치료 및 예방, 또는 좁아지거나 폐색된 혈관에서 아테롬성동맥경화증 플라크의 감소 또는 안정화를 위한 독특한 접근방법을 제공하는 것을 결정하였다. 본 발명의 용량 및 투약 레지멘 및 제약 제제를 포함하는 이 방법은 아테롬성동맥경화증 플라크로부터 콜레스테롤 유출 및 이동을 빠르게 촉진시키는 안전하고 효과적인 비-외과적 치료를 제공한다. 빠른 콜레스테롤 유출의 촉진은 병에 걸린 하나 또는 그 이상의 혈관에서 아테롬 (atheroma) 용적을 감소시킨다. 감소된 아테롬 (아테롬성동맥경화증 혈관에서 나타나는 변성된 비후 동맥 내막의 플라크의 매스)은 혈류를 더 크도록 하고, 불안정 앙기나, 심근경색 및 급성 관상동맥 증후군을 포함하는 허혈증의 위험을 감소시킨다.
아포 A-IM의 제약 제제, 및 급성 관상동맥 증후군, 아테롬성동맥경화증, 앙기나, 심근경색 및 허혈성 재관류 손상의 치료 및 예방을 위한 규정된 용량을 제공하는 본 발명 이전에, 통상적인 아테롬성동맥경화증 치료법은 치료학적 종말점으로서 LDL 또는 "나쁜 콜레스테롤"을 저하시키는데 촛점을 맞추었다. 이들 통상적인 LDL 치료법, 예를 들어, 스타틴에 의한 치료는 대상체에서 LDL 혈청 레벨이 저하되기 전에 몇 개월의 치료를 필요로 할 수 있다. 급성 또는 응급 심혈관 질환에서 통상적인 치료법은 대부분 경피 경관 관상동맥 성형술 (PTCA) 및 관상동맥 우회로 이식술 (CABG)과 같은 외과적 개입을 기본으로 한다. 그러나, 외과적 개입은 종종 응급 상황의 몇몇 환자, 특히 전반적 건강상태가 불량한 환자에서는 금기가 된다. 더구나, 이들 통상적인 방법은 급성 상황에서 효과적인 비-외과적 약물학적 치료를 제공하지 못한다. 또한, 통상적인 치료법은 특히 순환계에서 심혈관 질병 및 급성 관상동맥 증후군의 증상을 치료하는데 중점을 두었다. 상술하고, 이하에 더 상세히 기술되는 바와 같은 통상적인 치료법은 심혈관 질병 및 급성 관상동맥 증후군의 근원적 원인, 혈관벽 내에서의 플라크의 안정화, 감소 및 변형을 치료하거나 예방하지는 않고, 콜레스테롤을 감소시키고, 혈병 형성을 감소시키며, 혈압을 감소시키는데 중점을 두었다.
본 발명에서 제공된 용량 및 투약 스케쥴을 비롯한 제약 제제 및 방법은 안전하고 효과적이며, 아테롬성동맥경화증 플라크를 감소시키거나 안정화시키기 위해서 신속하게 작용한다. 본 발명에 기술된 용량은 신속 작용성으로, 콜레스테롤 이동을 촉진시킴으로써 몇 주일 정도로 단기간 내에 아테롬성동맥경화증 플라크의 감소를 제공한다. 특정의 구체예에서는, 본 발명에 기술된 용량을 사용하여 급성 관상동맥 증후군 또는 허혈증 또는 혈관 폐색과 연관된 질환을 앓고 있는 대상체를 치료할 수 있다. 특정의 구체예에서는, 본 발명에 기술된 용량을 사용하여 일단 아테롬성동맥경화증 플라크가 대상체에서 위험을 나타낸 경우에 질병의 진행을 방지할 수 있다. 방지된 질병의 진행은 더 나가서 혈관의 폐색일 수 있거나, 급성 관상동맥 증후군 및 허혈성 재관류 손상을 포함하는 허혈성 상태를 야기할 수 있는 불안정한 아테롬성동맥경화증 플라크의 파괴를 방지하는 것일 수 있다.
본 발명에 제공된 방법 및 제약 제제는 45 ㎎/㎏의 1회 용량이 아테롬성동맥경화증 플라크로부터 콜레스테롤의 이동을 촉진시킬 수 있을 정도로 효과적이다. 특정의 구체예에서, 1회 고용량, 예를 들어, 약 45 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제가 대상체에게 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서는, 하나 또는 그 이상의 고용량의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제를 대상체에게 투여하고, 이어서 하나 또는 그 이상의 동일 용량 (45 ㎎/㎏) 또는 저용량, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎏, 약 3 ㎎/㎏, 약 5 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏ 또는 약 15 ㎎/㎏를 투여할 수 있다. 예를 들어, 대상체에게는 2회 용량의 45 ㎎/㎏을 투여한 다음에, 10 ㎎/㎏의 추가 용량을 투여할 수 있다. 추가로, 저용량을 투여한 다음에 고용량을 투여하는 반대 레지멘이 사용될 수도 있다. 물론, 급성 질병 상태의 경우에 바람직하게는 더 고용량이 우선 사용된다. 특정의 구체예에서, 대상체는 수주일 동안 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제로 주 1회 치료된 다음에, 개방된 비-폐색 혈관을 유지시키고, 플라크 파괴 및 혈관성 부작용의 위험을 감소시키는데 필요한 바에 따라 간헐적 방식으로, 예를 들어, 연 2회, 연 3회, 연 1회, 또는 매 2년마다 치료될 수 있다.
특정의 구체예에서, 급성 관상동맥 증후군의 치료 또는 예방을 위한 방법은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제를 대략 매일, 대략 격일로, 대략 3일마다, 대략 4일마다, 대략 5일마다, 대략 6일마다, 대략 7일마다, 대략 8 내지 10일마다, 또는 대략 11 내지 14일마다 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 대략 매 7일마다 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 투여는 1회 투여일 수 있다. 특정의 구체예에서, 투여는 약 1주일, 약 2주일, 약 3주일, 약 4주일, 약 5주일, 약 6주일, 약 7-12주일, 약 13-24주일 또는 약 25-52주일 동안 계속될 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 투여는 약 5주일 동안 대략 매 7일마다 이루어진다. 특정의 구체예에서, 투여는 예를 들어, 대략 5주일 후에 간헐적일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 약 5주일 동안 주 1회 치료된 다음에, 그 다음 해에 걸쳐서 약 3 내지 약 4회 치료될 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명에 기술된 제약 제제는 혈관의 개방상태를 유지시키기 위해서 간헐적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 약 15 ㎎/㎏의 용량을 약 7주일 동안, 대략 매 10일마다 제약 제제 투여로 투여된 다음에, 예를 들어 약 26주일 후, 또는 약 52주일 후에 치료될 수 있다. 투약 스케쥴 및 통상적인 약물 치료법 및 외과적 개입과 조합된 방법의 사용을 포함하는 그 밖의 다른 구체예는 이하에 기술된다.
본 발명은 급성 관상동맥 증후군 및 허혈성 재관류 손상의 치료 또는 예방을 위해서 아포리포프로테인 A-I 밀라노 (아포 A-I 밀라노)을 투여하기 위한 제약 제제를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 본 발명에 기술된 방법을 위해서 리피드와 복합체를 형성한다. 예를 들어, 리피드는 포스포리피드, 바람직하게는 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (또한, 1-팔미토일-2- 올레오일-포스파티딜콜린 또는 POPC라 칭함)일 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:POPC 복합체는 제약 제제일 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 필요한 대상체에게 1 ㎏당 약 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 단백질의 용량으로 투여될 수 있다.
특정의 구체예에서, 이 방법은 급성 관상동맥 증후군의 치료를 위한 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 주사용 또는 액체 제약 제제의 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-IM:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 필요한 대상체에게 약 1 ㎎ (단백질)/㎏ 내지 약 100 ㎎ (단백질)/㎏의 용량으로 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제를 정맥내 주입으로 투여함으로써 급성 관상동맥 증후군을 예방 또는 치료하는 것을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 정맥내 급속주입 (intravenous push infusion)으로 투여될 수 있다. 정맥내 급속주입이란 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 또는 그의 제약 제제를 5분 내에, 예를 들어, 2-5분과 같은 짧은 시간의 기간에 걸쳐서 정맥내로 투여하는 것을 의미한다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 투여는 연속 정맥내 주입으로 이루어질 수 있다. 연속 정맥내 주입이란 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제가 2-5분보다 더 긴 시간, 예를 들어, 약 30분 내지 약 3시간의 기간에 걸쳐서 연속적으로 투여되는 것을 의미한다. 연속 정맥내 주입은 주입 펌프 또는 장치의 도움을 받아서 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 또는 그의 제 약 제제의 투여는 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 연속 정맥내 주입과 정맥내 급속주입 ("볼루스 용량 (bolus dose)")의 조합일 수 있다. 볼루스 용량은 연속 주입 전, 후 또는 중에 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노 또는 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 투여는 심혈관 질병, 수반성 또는 동반성 질병을 치료 또는 예방하거나, 증상적 완화를 제공하는 그 밖의 다른 약물과 함께 이루어질 수 있다.
이 방법은 본 발명에 기술된 제약 제제의 정맥내 주입을 제공한다. 주입을 위해서는 팔의 전주와 또는 흉부 내로 들어가는 중앙선 내의 혈관과 같은 말초혈관을 비롯한 어떤 적합한 혈관이라도 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 대상체의 팔의 전주와에서 요측피 또는 주정중 혈관 내로 주입된다.
특정의 구체예에서, 이 방법은 고용량 또는 저용량의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 제제, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 짧은 투약 간격에 걸친 고용량의 제약 제제는 부분적으로 또는 완전히 폐색된 혈관을 갖는 대상체에서 아테롬 용적을 안전하게 효과적으로 감소시킬 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 폐색된 혈관을 뚫기 위한 PTCA와 같은 외과적 개입을 하기 전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서는, 하나 또는 그 이상의 간헐적 용량을 이전에 폐색된 혈관의 개통을 유지시키기 위해서 대상체에게 투여할 수 있다 ("유지 용량 (maintenance dose)").
본 발명은 허혈성 재관류 손상을 치료 또는 예방하기 위한, 즉 허혈성 재관류의 치료를 위해 본 발명에 기술된 아포 A-I 밀라노 복합체의 제약 제제 또는 용 량을 사용하기 위한 신규의 방법을 제공한다. 이러한 치료에 유용한 용량은 필요한 대상체에게 투여된 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 100 ㎎/㎏ 이하의 용량을 포함한다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 조성물을 대상체의 체중 1 ㎏당 약 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특별한 구체예에서, 이 방법은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 조성물을 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏의 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 방법은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 조성물을 약 15 ㎎/㎏의 특정한 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 이 방법은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 조성물을 약 45 ㎎/㎏의 특정한 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 바람직하게는 15 ㎎/㎏를 단독으로, 또는 45 ㎎/㎏ 용량과 조합하여 사용하는 것을 포함한다. 유사하게, 허혈성 재관류 손상을 치료 또는 예방하기 위해서 45 ㎎/㎏ 용량을 단독으로, 또는 15 ㎎/㎏ 용량과 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 제공된 제약 제제는 대상체에게 안전하게 투여하는 것이 가능하도록 적합한 pH, 삼투질농도, 장성 (tonicity), 순도 및 무균성의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 포함한다. 제약 제제는 단일의 1회 사용을 위해서 제제화될 수 있거나, 제약 제제가 수회 용량에 적합하도록 후술하는 바와 같은 항균성 부형제를 함유하도록 제제화될 수도 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 동결되거나 냉장될 수 있는 전-충진된 멸균 시린지 또는 전-충진된 멸균 백에 들어있을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체는 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체는 아포 A-I 밀라노:POPC이다.
특정의 구체예에서, 제약 제제는 단위 용량 또는 사용-단위 패키지 (unit-of-use package)에 포함될 수 있다. 해당 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이, 단위 용량 패키지는 대상체에 대한 약물의 1회 용량 송달을 제공한다. 본 발명의 방법은 예를 들어, 패키지당 1050 ㎎의 아포 A-I 밀라노 단백질을 포함하는 제약 제제의 단위 용량 패키지를 제공한다. 예를 들어, 1050 ㎎의 아포 A-I 밀라노 단백질은 70 ㎏ 대상체에게 15 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노는 투여하는 양이다. 단위는 예를 들어, 1회 사용 멸균 바이알, 전-충진된 멸균 시린지, 전-충진된 멸균 백 (즉, 피기백 (piggyback)) 등일 수 있다.
특정의 구체예에서, 제약 제제는 사용-단위 패키지일 수 있다. 해당 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이, 사용-단위 패키지는 건강관리자 (health care provider)에 의한 직접 분배를 위해서 라벨을 붙인 편리한 처방 크기의 환자용 단위이다. 사용-단위 패키지는 제시된 적응증에 대한 대표적인 치료 간격 및 기간에 필요한 양으로 제약 제제를 함유한다. 본 발명의 방법은 예를 들어, 평균 크기의 성인 남자 또는 여자를 15 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노 단백질로 5주일 동안 주 1회 정맥내로 치료하기에 충분한 양으로 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 포함하는 제약 제제의 사용-단위 패키지를 제공한다. 따라서, 상술한 바와 같은 사용 패키지의 단위는 5 용량의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 (바이 알 또는 전-충진된 시린지로 이용할 수 있음)를 갖는다. 한가지 구체예에서, 사용-단위 패키지는 평균 크기의 성인 남자 또는 여자를 15 ㎎/㎏ 또는 45 ㎎/㎏의 용량으로 6주일 동안 주 1회 치료하기에 충분한 양으로 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 함유하는 제약 제제를 포함한다. 본 발명에 기술된 용량이 대상체의 체중을 기준으로 한 것임은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
제약 제제는 라벨을 붙일 수 있으며, 그 안에 함유된 제제, 및 사용지침, 용량, 투약 간격, 기간, 적응증, 금기사항, 경고, 주의사항, 취급 및 저장 지침 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않음) 급성 관상동맥 증후군의 치료시의 건강관리자 및 대상체에게 유용한 그 밖의 다른 정보를 확인하기 위한 첨부된 라벨링을 가질 수 있다.
본 발명에 기술된 아포 A-I 밀라노 복합체의 제약 제제 또는 용량을 사용하여, 허혈성 재관류 손상을 치료 또는 예방하기 위한, 즉 허혈성 재관류의 치료할 수 있다.
정의
본 명세서에서 사용된 것으로, 다음의 용어들은 다음의 의미를 갖는다:
용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 질병, 질환 및(또는) 그의 증상을 완화시키거나 제거하는 방법을 나타낸다.
용어 "치료학적 유효량"은 치료할 상태 또는 질환의 하나 또는 그 이상의 증 상을 어느 정도 완화시키는데 충분한 아포 A-I 밀라노 또는 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 양을 의미한다.
용어 "예방한다", "예방하는" 또는 "예방"은 대상체가 질병, 질환 및(또는) 그의 증상을 획득하는 것을 방지하는 방법을 나타낸다. 특정의 구체예에서, 용어 "예방한다", "예방하는" 또는 "예방"은 질병, 질환 및(또는) 그의 증상을 획득하는 위험을 감소시키는 방법을 나타낸다.
용어 "예방적 유효량"은 치료할 상태 또는 질환의 하나 또는 그 이상의 증상의 발현 또는 재발을 방지하는 작용을 하는데 충분한 아포 A-I 밀라노 또는 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 양을 의미한다.
용어 "급성 관상동맥 증후군은 불안정 앙기나, Q파 (wave) 또는 비-Q파 심근경색과 같거나, 질병의 국제분류 (International Classification of Disease) 10판 (ICD-10)으로 대체되는 9판 (ICD-9)에서 제공되는 것과 같은 허혈성 질환을 의미한다. 심근경색은 심전도 상에서 ST-절편 상승이 있거나 없이 나타날 수 있다.
용어 "허혈증"은 혈액 공급의 기계적으로 또는 생물학적으로 유도된 장애, 예를 들어, 경련, 혈전증, 협착 폐색 (주로 동맥이 좁아지거나 붕괴됨)으로 인한 국소 빈혈을 의미한다. 용어 "심근경색"은 통상적으로 관상동맥 질병의 결과로서 심근에 대한 혈액의 부적합한 순환을 의미한다.
용어 "허혈성 재관류"는 조직에 대한 산소화 혈액의 증가된 양이 복구되는 것을 의미한다.
용어 "심혈관 질병"은 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 아테롬성동맥경화 증, 앙기나, 허혈성 재관류 손상 및 관련된 질환과 같은 심장, 혈관 및 혈액순환 질병을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로 용어 "외과적 개입"은 수작업, 비-약물학적 또는 수술적 방법을 의미한다. 외과적 개입은 진단적, 방사선학적, 예방적 또는 치료 목적일 수 있다.
용어 "불안정 앙기나"는 턱과 팔로 퍼져나갈 수 있는 흉부의 통증 또는 상복부 통증과 같은 만성적인 안정한 앙기나의 증상의 빈도, 중증도 또는 기간에서의 변화를 나타낸다. 만성적인 안정한 앙기나는 대상체의 턱과 팔로 퍼져나갈 수 있으며, 운동, 식사 및(또는) 스트레스에 의해서 유도되고, 증상을 나타내는데 필요한 활동의 빈도 또는 중증도에 있어서의 새로운 변화가 없이 휴식에 의해서 경감되는 흉부에서의 통증이다.
용어 "제약 제제"는 대상체에게 투여하기에 적합한 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체 및 적합한 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 포함하는 조성물을 의미한다. 이 용어는 이하에 기술하는 바와 같은 경구, 비경구 및 국소용 조성물을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "약"은 이것이 나타내는 공칭값 (nominal value)의 ±20％ 근사치를 표시하는 상대적 용어를 의미한다. 본 발명의 분야의 경우에, 이러한 근사치의 레벨은 값이 더 엄격한 범위를 필요로 한다고 구체적으로 언급되지 않는 한 적절하다.
용어 "라벨"은 제품의 직접적인 용기 상에 필기되거나, 인쇄되거나, 또는 그림으로 그린 표시사항, 예를 들어, 제약 활성제를 함유하는 바이알 상에 표시된 필 기 사항을 의미한다.
용어 "라벨링"은 제품 상에, 또는 이러한 제품을 보유하는 그의 용기, 포장지 상의 모든 라벨 및 그 밖에 필기되거나, 인쇄되거나, 또는 그림으로 그린 사항, 예를 들어, 제약 활성제의 용기와 수반되거나 연관된 패키지 인서트 (insert), 설명서 비디오테이프 또는 설명서 DVD를 의미한다.
치료방법
본 발명은 불안정 앙기나, ST-절편 상승 심근경색 및 비-Q파 심근경색을 포함하는 급성 관상동맥 증후군의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 제제를 제공한다. 본 발명에 기술된 제약 제제에 대한 안전하고 효과적인 용량은 급성 관상동맥 증후군의 치료 및 예방을 위해서 출원인에 의해서 결정되었다.
현재 이해되고 있는 바를 기초로 하여, 현재 급성 관상동맥 증후군 ("ACS")이라고 불리는 임상적 발현을 인식하는 구성이 드러났다. 전술한 바와 같이, 급성 관상동맥 증후군은 불안정 앙기나, Q파 및 비-ST-절편 상승 심근경색을 포함하며, 특히 발현 후의 처음 24시간 이내에 이환율 및 사망율의 주원인이다 (Schoenhagen et al., 2000, Circulation 101: 598-603). ACS는 심전도 상에서 ST 절편 상승이 없이 나타나는 허혈성 불쾌감이다. 허혈증은 종종 불안정 앙기나, Q파 및 비-Q파 심근경색으로 발전한다 (Antman and Braunwald, "Acute Myocardial Infarction" in Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, 6th edition, vol. 2, Braunwald et al., eds, 2001, W.B. Saunders Company, Philadelphia).
본 발명의 방법 및 제제는 아테롬성동맥경화증 및 급성 관상동맥 증후군의 치료를 위한 독특하고 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 증상적 완화를 제공하기보다는 질병의 병태생리학적 기준을 반전시키는 비-외과적 치료법을 제공한다. 본 발명의 방법은 콜레스테롤 유출 및 역 콜레스테롤 수송을 촉진시키며 아테롬성동맥경화증 플라크를 감소시키는 HDL 요법을 제공하는 아포 A-I 밀라노, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 투여를 제공한다. 어떠한 이론에도 얽매임이 없이, 아포 A-I 밀라노, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 콜레스테롤 유출 및 역 콜레스테롤 수송을 촉진시키며, 아테롬 용적을 감소시키고, 아테롬성동맥경화증 플라크를 안정화시킬 수 있는 기능적 HDL을 모방한 것으로 믿어진다.
본 발명은 급성 관상동맥 증후군의 치료를 위한 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 후술하는 바와 같이 약 1 ㎎ (단백질)/㎏ 내지 약 100 ㎎ (단백질)/㎏의 용량, 바람직하게는 1 ㎎ (단백질)/㎏ 내지 50 ㎎ (단백질)/㎏의 용량, 가장 바람직하게는 15 ㎎/㎏ 또는 45 ㎎/㎏의 용량으로 투여될 수 있다. 본 출원인은 이들 용량이 안전하고, 효과적이며 본 발명에서 상세히 기술한 바와 같은 급성 관상동맥 증후군을 앓고 있거나 그럴 위험이 있는 대상체에게 잘 받아들여지는 것을 밝혀내었다.
본 발명은 급성 관상동맥 증후군의 징후 또는 증상을 경감 또는 개선시키는 것을 포함하여 급성 관상동맥 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특 정의 구체예에서, 이 방법은 관상동맥 아테롬성동맥경화증의 치료 또는 감소를 위해서 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 병에 걸린 혈관으로부터의 콜레스테롤 유출을 촉진시키기 위해서 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 역 콜레스테롤 수송을 촉진시키기 위해서 제공된다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 병에 걸린 혈관에서 감소된 아테롬 용적을 제공한다. 특정의 구체예에서, 병에 걸린 혈관은 관상동맥이다. 아테롬 용적은 본 명세서에 기술된 바와 같이 혈관내부 초음파 (intravascular ultrasound; IVUS)에 의해서 측정될 수 있다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 병에 걸린 혈관의 총 플라크 용적을 감소시키기 위해서 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 병에 걸린 혈관에서 평균 최대 플라크 두께를 감소시키기 위해서 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 평균 최대 아테롬 두께를 감소시키기 위해서 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 최소 퍼센트 플라크 면적에서 플라크 용적을 감소시키기 위해서 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 최대 퍼센트 플라크 면적을 감소시키기 위해서 제공된다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 병에 걸린 혈관에서 증가된 평균 관상동맥 내강 직경 (coronary luminal diameter)을 제공한다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 방법 및 제제를 적용받는 대상체는 본 발명의 방법 및 제제를 적용받지 않는 대상체에 비해서 감소된 혈관조영적 병소를 가질 수 있다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 기존에 존재하는 병소의 퇴행을 제공한다. 특정의 구체예에서, 이 방법 및 제약 제제는 폐색된 혈관의 개통을 획득하거나, 폐색된 혈관의 개통 상태를 유지시키기 위해서 제공된다.
특정의 구체예에서, 약 15 ㎎/㎏ 내지 약 45 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노:포스 포리피드 복합체의 용량은 약 2％, 약 1％ 또는 약 0.05％의 평균 아테롬 용적 감소 퍼센트를 제공한다. 특정의 구체예에서, 약 15 ㎎/㎏ 내지 약 45 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 용량은 약 20 ㎣, 약 15 ㎣, 약 10 ㎣ 또는 약 5 ㎣의 아테롬 용적 감소를 제공한다. 특정의 구체예에서, 약 15 ㎎/㎏ 내지 약 45 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 용량은 약 -0.039 ㎜ 내지 -0.044 ㎜만큼의 평균 최대 아테롬 두께의 감소를 제공한다.
한가지 구체예에서, 이 방법은 급성 관상동맥 증후군의 징후 또는 증상을 갖는 대상체에서 급성 관상동맥 증후군의 치료를 제공한다. 한가지 구체예에서, 대상체는 심근허혈증의 징후 및(또는) 증상, 예를 들어, 흉부, 턱, 팔 또는 상복부 부위의 통증, 심계항진, 숨가쁨 (shortness of breath), 발한, 오심 및(또는) 구토를 나타낼 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 ST 절편 상승, 반전과 같은 T파 변화, 크레아틴 키나아제 분획, 트로포닌 I 또는 C-반응성 단백질의 증가와 같은 심전도 ("ECG" 또는 "EKG")의 변화와 함께 급성 관상동맥 증후군의 징후 및 증상을 나타내는 대상체에서 급성 관상동맥 증후군의 치료를 제공한다.
한가지 구체예에서, 이 방법은 급성 관상동맥 증후군이 발생할 위험이 있는 대상체에서 급성 관상동맥 증후군의 예방을 제공한다. 위험이 있는 대상체에는 다양한 연령의 대상체 (예를 들어, 18-24, 약 25, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80 또는 약 90세), 심혈관 질병의 가족력 또는 심혈관 질병에 대한 유전적 소인을 갖는 대상체, 당뇨병, 고혈압, 다발성-혈관 (multiple-vessel) 또는 좌측-메인스템 (left-mainstem) 질병을 갖거나, 이전에 심근경색을 가졌었던 대상체가 포함될 수 있다.
본 발명의 제제의 실제 용량은 대상체의 키, 체중, 연령, 질병의 중증도, 수반되는 의료상태의 존재 등에 의해서 변화될 수 있음은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이해된다. 예를 들어, 손상된 신장 또는 간 기능을 갖는 노인 대상체는 약 1 ㎎/㎏ 용량의 하부 범위 (예를 들어, 0.8 ㎎/㎏ 또는 0.9 ㎎/㎏)의 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 용량으로 치료될 수 있다. 우수한 신장 및 간 기능을 가지고 비만이며 중증의 급성 관상동맥 증후군을 갖는 대상체는 예를 들어, 약 100 ㎎/㎏ 용량의 상부 범위 (예를 들어, 120 ㎎/㎏, 119 ㎎/㎏, 118 ㎎/㎏, 115 ㎎/㎏ 등)의 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 용량으로 치료될 수 있다. 본 발명에 기술된 제제의 투약량은 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 것으로 나타났다. 이들 용량은 유익한 프로필에 대해서 허용될 수 있는 위험을 갖는 유효량을 포함하는 순환농도의 범위를 획득한다.
본 발명은 치료가 필요한 대상체에서 급성 관상동맥 증후군을 치료하기에 충분한 투약량 투여 스케쥴로 급성 관상동맥 증후군을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정의 구체예에서, 이하에 기술하는 바와 같은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 대략 매일, 대략 격일로, 대략 매 3일마다, 대략 매 4일마다, 대략 매 5일마다, 대략 매 6일마다, 대략 매 7일마다, 대략 매 8-10일마다, 또는 대략 매 11-14일마다 투여될 수 있다. 이러한 기간은 또한 투약 간격 또는 간격이라 불린다. 특정의 구체예에서, 투약 간격은 매달, 매 6개월마다, 매 12개월마다, 매 18개월마다 또는 매 24개월마다일 수 있다. 바람직한 구체 예에서, 아포 A-I 밀라노, 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 대략 매 7일마다 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 투여는 1회 투여일 수 있다. 특정의 구체예에서, 투여는 약 1주일, 약 2주일, 약 3주일, 약 4주일, 약 5주일, 약 6주일, 약 7-12주일, 약 13-24주일, 약 52주일 동안 계속되거나, 또는 대상체의 생존기간 동안 계속될 수 있다. 이러한 기간은 또한, 투약 기간, 치료 기간 또는 기간이라 불린다. 따라서, 투약량 투여 스케쥴은 예를 들어, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 제제를 약 6주일 동안, 대략 매 7일마다 투여되는 것일 수 있다. 특정의 구체예에서, 투약 간격은 약 52주일 후에는 간헐적으로 계속될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 약 52주일 동안, 일주일에 한번 치료된 다음에, 다음 해에 걸쳐서는 약 3 내지 약 4회 치료될 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 함유하는 제약 제제의 투여는 약 5주일 동안, 대략 매 7일마다 이루어질 수 있다. 다양한 투약 간격 및 기간을 사용하는 그 밖의 다른 투약량 투여 스케쥴도 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 용량은 치료의 기간에 걸쳐서 변화할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 45 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 제제로 3주일 동안 1주일에 한번 치료된 다음에, 15 ㎎/㎏의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 제제로 매 4개월마다 한번 또는 대상체의 생존기간 동안에 1년에 한번 치료될 수 있다. 이러한 간헐적 용량은 혈관의 개통 상태를 유지시키기 위해서 투여될 수 있다. 감소된 아테롬 용적 및 증가된 혈관 내강을 유지시키기 위해서 대상체의 생존기간 중에 투여되는 간헐적 용량도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 방법 및 제제는 외과적 개입과 함께, 즉 수술 전, 중 또는 후에 사용될 수 있다. 외과적 개입에는 혈관성형술, 혈관내부 초음파, 관상동맥 우회로 이식술 (CABG), 관상동맥 성형술, 혈관 스텐트의 이식, 경피적 관상동맥 개입 (PCI) 및(또는) 플라크의 안정화가 포함될 수 있다. 특정의 구체예에서, 이 방법은 폐색된 혈관을 개방시키거나, 혈관 내의 아테롬성동맥경화증 플라크를 감소시키기 위해서 외과적 개입 전 또는 후에 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제를 투약하기 위해서 제공된다. 외과적 개입은 질병 또는 상태를 진단, 이미지화 (방사선학), 예방 또는 치료하기 위해서 사용되는 수작업, 비-약물학적 또는 수술적 방법을 의미한다. 예를 들어, 혈관내부 초음파 (IVUS) 및 관상동맥 혈관조영술은 플라크 부하의 정량적 평가를 제공할 수 있는 방법이고 (진단적 목적), 혈관조영술은 혈관의 이미지를 제공할 수 있으며 (방사선학적 목적), 혈관성형술은 폐색된 혈관을 개방시킬 수 있다 (치료 목적). 이들은 모두 본 발명에서 사용되는 외과적인 개입으로 포함된다.
아포리포프로테인 A-I 밀라노
한가지 관점에서, 본 발명은 아포 A-I 밀라노를 포함하는 제제를 투여함으로써 급성 관상동맥 증후군으로부터의 손상을 치료, 감소 또는 예방하기 위한 방법 및 제제를 제공한다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노 (Apo A-I Milano)는 리피드와 복합체를 형성할 수 있다.
인간 아포 A-I 밀라노는 아포 A-I의 천연 변이체이다 (Weisgraber et al. 1980, J. Clin . Invest. 66:901-907). 아포 A-I 밀라노에서 아미노산 아르기닌 (Arg173)은 아미노산 시스테인 (Cys173)에 의해서 치환된다. 아포 A-I 밀라노는 폴리펩타이드 체인당 1개의 시스테인 잔기를 함유하기 때문에, 이것은 모노머, 호모다이머 또는 헤테로다이머 형태로 존재할 수 있다 (참조: 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된 미국 특허 제 5,876,968 호). 이들 형태는 화학적으로 상호교환이 가능하며, 용어 아포 A-I 밀라노는 이들 형태들을 서로 구분하지 않는다. DNA 레벨에서 변이체 형태는 유전자 서열에서 C를 T로 치환시킨, 즉 코돈 CGC를 TGC로 변화시킨 결과이며, 이렇게 하여 어미노산 위치 173에서 아르기닌 (Arg) 대신에 시스테인 (Cys)으로 해독이 되게 된다.
특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 변이체이거나 보존적으로 치환된 아포 A-I 밀라노일 수 있다. 보존적 치환이란, 아포 A-I 밀라노의 특정한 아미노산 잔기가 단백질의 활성에 유의적으로 해로운 영향을 미치지 않으면서 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있음을 의미한다. 따라서, 구조 내의 적어도 하나의 정의된 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 아포 A-I 밀라노의 변형되거나 치환된 형태도 또한 본 발명에 의해서 고려된다. 보존적 아미노산 치환을 측정할 목적으로, 아미노산은 편리하게는 주로 아미노산 체인의 물리적-화학적 특성에 따라서 두개의 주된 카테고리, 즉 친수성 및 소수성으로 분류될 수 있다. 이들 두개의 주된 카테고리는 아미노산 체인의 특징을 더 뚜렷하게 정의하는 서브카테고리로 더 분류될 수 있다. 예를 들어, 친수성 아미노산의 부류는 산성, 염기성 및 극성 아미노산으로 더 세분류될 수 있다. 소수성 아미노산의 부류는 비극성 및 방향족 아미노산으로 더 세분류될 수 있다. 구조 (I)을 정의하는 아미노산의 다양한 카테고리의 정의는 다음과 같다.
"친수성 아미노산"은 문헌 (Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142)의 기준화된 컨센서스 소수성 스케일 (normalized consensus hydrophobicity scale)에 따라서 0 미만의 소수성을 나타내는 아미노산을 의미한다. 유전자로 코딩된 친수성 아미노산에는 Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) and Arg (R)가 포함된다.
"산성 아미노산"은 7 미만의 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 산성 아미노산은 전형적으로 수소 이온의 손실로 인하여 생리학적 pH에서 음으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자로 코딩된 산성 아미노산은 Glu (E) 및 Asp (D)를 포함한다.
"염기성 아미노산"은 7보다 큰 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 염기성 아미노산은 전형적으로 하이드로늄 이온과의 결합으로 인하여 생리학적 pH에서 양으로 하전된 측쇄를 갖는다. 유전자로 코딩된 염기성 아미노산에는 His (H), Arg (R) 및 Lys (K)가 포함된다.
"극성 아미노산"은 생리학적 pH에서는 비하전되지만, 두개의 원자에 의해서 공통적으로 보유된 전자의 쌍이 원자들 중의 하나에 의해서 더 가깝게 당겨지는 적어도 하나의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 유전자로 코딩된 극성 아미노산에는 Asn (N), Gln (Q) Ser (S) 및 Thr (T)가 포함된다.
"수소성 아미노산"은 문헌 (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142)의 기준화된 컨센서스 소수성 스케일에 따라 0보다 큰 소수성을 나타내는 아미노산을 의미한다. 유전자로 코딩된 소수성 아미노산에는 Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) 및 Tyr (Y)가 포함된다.
"방향족 아미노산"은 적어도 하나의 방향족 또는 헤테로방향족 환을 갖는 측쇄가 있는 소수성 아미노산을 의미한다. 방향족 또는 헤테로방향족 환은 --OH, --SH, --CN, --F, --Cl, --Br, --I, --NO2, --NO, --NH2, --NHR, --NRR, --C(O)R, --C(O)OH, --C(O)OR, --C(O)NH2, --C(O)NHR, --C(O)NRR 등과 같은 하나 또는 그 이상의 치환체를 함유할 수 있으며, 여기에서 각각의 R은 독립적으로 (C1-C6) 알킬, 치환된 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐, 치환된 (C1-C6) 알케닐, (C1-C6) 알키닐, 치환된 (C1-C6) 알키닐, (C5-C20) 아릴, 치환된 (C5-C20) 아릴, (C6-C26) 알크아릴, 치환된 (C6-C26) 알크아릴, 5-20원 헤테로아릴, 치환된 5-20원 헤테로아릴, 6-26원 알크헤테로아릴 또는 치환된 6-26원 알크헤테로아릴이다. 유전자로 코딩된 방향족 아미노산은 Phe (F), Tyr (Y) 및 Trp (W)을 포함한다.
"비극성 아미노산"은 생리학적 pH에서는 비하전되며, 두개의 원자에 의해서 공통적으로 보유된 전자의 쌍이 일반적으로 두개의 원자 각각에 의해서 동등하게 당겨지는 결합을 갖는 측쇄 (즉, 측쇄가 극성이 아니다)를 갖는 소수성 아미노산을 의미한다. 유전자로 코딩된 비극성 아미노산에는 Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) 및 Ala (A)가 포함된다.
"지방족 아미노산"은 지방족 하이드로카본 측쇄를 갖는 소수성 아미노산을 의미한다. 유전자로 코딩된 지방족 아미노산에는 Ala (A), Val (V), Leu (L) 및 Ile (I)가 포함된다.
아미노산 잔기 Cys (C)는 다른 Cys (C) 잔기 또는 그 밖의 다른 설파닐-함유 아미노산과 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 특이한 것이다. 환원된 유리 -SH 또는 산화된 디설파이드-브릿지된 형태로 펩타이드 내에 존재하는 Cys (C) 잔기 (및 --SH 함유 측쇄를 갖는 다른 아미노산)의 능력은 Cys (C) 잔기가 펩타이드에 순수한 소수성인지 또는 친수성 특징을 제공하는지 여부에 영향을 미친다. Cys (C)는 아이젠버그 (Eisenberg, 1984, 상기 참조)의 기준화된 컨센서스 스케일에 따라 0.29의 소수성을 나타내지만, 본 발명의 목적에 따라 Cys (C)는 상기에서 규정된 일반적 분류에도 불구하고 극성 친수성 아미노산의 카테고리로 분류되는 것으로 이해된다.
본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인식되는 바와 같이, 상기-정의된 카테고리는 상호 배타적인 것은 아니다. 따라서, 두개 또는 그 이상의 물리-화학적 특성을 나타내는 측쇄를 갖는 아미노산은 다수의 카테고리에 포함될 수 있다. 예를 들어, Tyr (Y)과 같은 극성 치환체로 더 치환된 방향족 부위를 갖는 아미노산 측쇄는 방향족 소수성 특성 및 극성 또는 친수성 특성 둘 다를 나타낼 수 있으며, 따라서 방향족 및 극성 카테고리 둘 다에 포함될 수 있다. 아미노산의 적절한 카테고리 분류는 특히 본 명세서에 제공된 상세한 기술내용에 비추어 본 기술분야에 서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 특정한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노의 치환되거나 변형된 형태는 아포 A-I이 아니다.
본 발명에서 이용되는 아포 A-I 밀라노는 이용할 수 있는 어떤 공급원으로부터도 수득될 수 있다. 예를 들어, 아포 A-I 밀라노는 재조합체, 합성, 반합성 또는 정제된 아포 A-I 밀라노일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된 미국 특허 제 5,721,114 호 및 유럽 특허 제 EP 0 469 017 및 EP 0 267 703 호에 기술된 바와 같이 효모 또는 이. 콜라이 (E. coli) 내에서 발현된 재조합체 단백질 (rApo A-I Milano)일 수 있다. 본 발명에 의해서 이용되는 아포 A-I 밀라노를 수득하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 아포 A-I 밀라노는 예를 들어, 밀도 구배 원심분리에 이은 리포프로테인의 탈지질화, 환원, 변성 및 겔-여과 크로마토그라피, 이온-교환 크로마토그라피, 소수성, 예를 들어, 페닐 세파로즈 상호작용 크로마토그라피 또는 면역친화성 크로마토그라피에 의해서 혈장으로부터 분리될 수 있거나, 합성적으로, 반합성적으로 또는 본 기술분야에서 숙련딘 전문가에게 공지된 재조합 DNA 기술 및 이어서 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 친숙한 정제방법을 사용하여 생산될 수 있다 (참조, 예를 들어, 미국 특허 제 6,107,467; 6,559,284; 6,423,830; 6,090,921; 5,834,596; 5,990,081; 6,506,879 호, Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2): 83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109; 미국 특허 제 5,059,528, 5,834,596, 5,876,968 및 5,721,114 호; 및 PCT 공보 WO　86/04920 및 WO　87/02062).
아포 A-I 밀라노가 천연 공급원으로부터 수득된다면, 이것은 어떤 종의 동물 공급원으로부터도 수득될 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 포유동물 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 인간 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 아포 A-I 밀라노가 투여되는 대상체와 동일한 종으로부터 유도된다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 재조합체 아포 A-I 밀라노 단백질 (rApo A-I Milano)이다.
투여의 방법
아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 순환에서 생체이용율을 보장하는, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 적합한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 제제의 치료학적 유효량을 제공하는 어떠한 투여 경로라도 사용될 수 있다. 투여 경로는 제약 제제의 타입에 의해서 지시될 수 있다. 예를 들어, 주사용 제제는 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 피내, 피하 (SC), 관내, 동맥내, 심막내, 관절내 및 복강내 (IP) 주사를 포함하여 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 비경구적으로 투여될 수 있다 (참조예: Robinson et al., 1989, In: Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, Ch.2, pp.15-34; 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함되어 있음).
바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 비경구적으로 투여될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 비경구적 투여 는 정맥내이다. 정맥내 투여는 예를 들어, 약 2-3분에 걸쳐서 투여되는 볼루스 (bolus)로서, 또는 예를 들어, 약 1시간에 걸쳐서 펌프를 사용함으로써 연속 주입에 의해서 이루어질 수 있거나, 약 24시간에 걸쳐서 연속적으로 주입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 주입은 약 1 내지 약 3시간에 걸쳐서 이루어질 수 있다.
이 방법은 본 발명에 기술된 제약 제제의 정맥내 주입을 제공한다. 팔의 전주와 또는 흉부 내로 들어가는 중앙선에서와 같은 말초혈관을 포함하는 어떤 적합한 혈관이라도 주입 부위로 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 대상체의 팔의 전주와에서 요측피 또는 주정중 혈관 내로 주입된다.
특정의 구체예에서, 투여는 기계적 펌프 또는 송달장치, 예를 들어, 심막 송달장치 (PerDUCER®) 또는 심폐 우회로 장치에 의해서 수행될 수 있다.
리피드 복합체
특정의 구체예에서, 본 발명의 방법은 아포 A-I 밀라노의 리피드 복합체의 투여를 포함한다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 제약 제제를 제공한다. 효능은 아포 A-I 밀라노와 리피드를 복합체로 제조함으로써 증진될 수 있다. 일반적으로는 투여하기 전에 리피드를 아포 A-I 밀라노와 혼합시킨다. 아포 A-I 밀라노와 리피드는 수용액 중에서 적절한 비율로 혼합시킬 수 있으며, 동결-건조, 세제 가용화에 이어서 투석, 마이크로유체화 (microfluidization), 초음파처리, 및 균질화를 비롯하여 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 복합체를 형성할 수 있다. 복합체 효율은 예를 들어, 압력, 초음파 주파수 또는 세제 농도를 변화시킴으로써 최적화될 수 있다. 아포 A-I 밀라노:포 스포리피드 복합체를 제조하기 위해서 통상적으로 사용되는 세제의 예는 나트륨 콜레이트이다.
일부의 경우에는, 급성 관상동맥 증후군을 치료 또는 예방하기 위해서 필수적으로 리피드가 없이 아포 A-I 밀라노를 단독으로 투여하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서는, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여한다.
한가지 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체는 적절한 제약 희석제와 함께 용액으로 존재할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 동결-건조되거나 동결건조된 제제는 투여하기 전에 적절한 제약 희석제로 수화되거나, 재조제될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 전에 균질한 용액이 수득될 때까지 해동시키는 동결된 제제일 수 있다.
리피드는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 적합한 리피드라도 될 수 있다. 스테아릴아민, 도데실아민, 아세틸 팔미테이트, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세라이드, 아미노페닐글리코사이드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 글리코리피드, N-(2,3-di(9-(Z)-옥타데세닐옥시))-프로프-1-일-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 및 지방산 아미드를 포함하나 이들로 제한되지 않는 비-인 함유 리피드가 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 리피드는 포스포리피드이다.
포스포리피드는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 공급원으로 부터도 수득될 수 있다. 예를 들어, 포스포리피드는 상업적 공급원, 천연 공급원으로부터, 또는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 합성 또는 반합성 방법에 의해서 수득될 수 있다 (Mel'nichuk et al., 1987, Ukr. Biokhim . Zh . 59(6):75-7; Mel'nichuk et al., 1987, Ukr . Biokhim . Zh . 59(5):66-70; Ramesh et al., 1979, J. Am. Oil Chem . Soc . 56(5):585-7; Patel and Sparrow, 1978, J. Chromatogr. 150(2):542-7; Kaduce et al., 1983, J. Lipid Res. 24(10):1398-403; Schlueter et al., 2003, Org . Lett . 5(3):255-7; Tsuji et al., 2002, Nippon Yakurigaku Zasshi 120(1):67P-69P).
바람직한 구체예에서, 리피드는 포스포리피드일 수 있다. 포스포리피드는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 포스포리피드라도 될 수 있다. 예를 들어, 포스포리피드는 작은 알킬쇄 포스포리피드, 포스파티딜콜린, 난 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜글리세롤, 난 포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디라우릴포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-올레오일포스파티딜콜린, 1-올레오일-2-팔미틸포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글 리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 디미리스토일포스파티딘산, 디팔미토일포스파티딘산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 스핑고마이엘린, 스핑고리피드, 뇌 스핑고마이엘린, 디팔미토일스핑고마이엘린, 디스테아로일스핑고마이엘린, 갈락토세레브로사이드, 갱글리오사이드, 세레브로사이드, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 라이소레시틴, 라이소포스파티딜에탄올아민, 세팔린, 카디오리핀, 디세틸포스페이트, 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤 및 그의 유도체일 수 있다.
포스포리피드는 또한, 상기 포스포리피드 중의 어떤 것이나의 유도체 또는 유사체일 수도 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체는 두개 또는 그 이상의 포스포리피드의 조합물을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 투여를 제공한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 리피드는 포스포리피드, 바람직하게는 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린 ("POPC") 또는 ("1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린")이다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:POPC 복합체는 아포 A-I 밀라노:POPC의 중량을 기준으로 약 1:1의 비율로 이루어진다. 가장 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:POPC 복합체는 제약 제제이다. 아포 A-I 밀라노:POPC 복합체는 ETC-216으로 불린다.
아포 A-I 밀라노와 리피드로 이루어진 복합체는 급성 관상동맥 증후군을 치 료 또는 예방하는데 효과적인 어떤 양의 아포 A-I 밀라노, 및 어떤 양의 리피드, 바람직하게는 포스포리피드를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 아퍼 A-I 밀라노는 중량 기준으로 약 1 대 약 1의 비율로 된 아포 A-I 밀라노와 포스포리피드의 복합체로 이루어질 수 있다. 그러나, 아포 A-I 밀라노는 약 100:1, 약 10:1, 약 5:1, 약 3:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:5, 약 1:10 및 약 1:100 (단백질의 중량/리피드의 중량)과 같은 아포 A-I 밀라노에 대한 포스포리피드의 다른 비율로 된 복합체로 이루어질 수 있다. 약 1:0.5 내지 약 1:3 (단백질의 중량/리피드의 중량)의 중량비, 더욱 바람직하게는 약 1:0.8 내지 약 1:1.2 (단백질의 중량/리피드의 중량)의 비가 가장 균일한 집단을 생성시키고, 안정하며 재현가능한 배취를 생성시키는 목적에 바람직하다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 포스포리피드에 대한 아포 A-I 밀라노의 비는 1:0.95 (단백질의 중량/리피드의 중량)이다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 추가의 리피드는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 잘 알려져 있는 다양한 자료에 언급되어 있다 (예를 들어, McCutcheon's Detergents and Emulsifiers and McCutcheon's Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N.J.; 이들은 둘다 이 거명을 통해 본원에 포함된다). 일반적으로, 리피드는 37℃, 35℃, 또는 32℃에서 액체-결정성인 것이 바람직하다. 액체-결정성 상태의 리피드는 일반적으로 겔 상태인 리피드보다 더 효율적으로 콜레스테롤을 수용한다. 대상체들은 일반적으로 약 37℃의 코어 (core) 온도를 갖기 때문에, 37℃에서 액체-결정성인 액체는 일반적으로 치료 중에 액체-결정성 상태이다.
리피드 복합체의 제조
아포 A-I 밀라노:리피드 복합체는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 방법에 의해서라도 제조될 수 있다. 일부의 경우에는, 투여하기 전에 리피드와 아포 A-I 밀라노를 혼합시키는 것이 바람직하다. 리피드는 용액 상태이거나, 또는 균질화, 초음파처리 또는 압출과 같은 표준기술을 사용하여 형성된 리포좀 또는 에멀젼의 형태일 수 있다. 초음파처리는 일반적으로, 빙욕 중에서 브란손 팁 소니파이어 (Branson tip sonifier)와 같은 팁 소니파이어를 사용하여 수행된다. 일반적으로, 현탁액은 몇번의 초음파처리 사이클에 적용한다. 압출은 리펙스 바이오멤브레인 익스트루더 (Lipex Biomembrane Extruder®; Lipex Biomembrane Extruder, Inc. Vancouver, Canada)와 같은 생체막 (biomembrane) 압출기에 의해서 수행될 수 있다. 압출 필터에서 규정된 공극 크기는 규정된 크기의 단일박막 리포좀성 소낭 (unilamellar liposomal vesicle)을 생성시킬 수 있다. 피로좀은 또한, 노톤 컴패니 (Norton Company, Worcester Mass.)로부터 시판품을 이용할 수 있는 세라플로우 마이크로필터 (Ceraflow Microfilter®)와 같은 비대칭성 세라믹 필터를 통해서, 또는 폴리카보네이트 필터 또는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 중합된 물질 (즉, 플라스틱)의 다른 타입을 통해서 형성될 수 있다.
아포 A-I 밀라노:리피드 복합체는 소낭 (vesicle), 리포좀 또는 프로테오리포좀 (proteoliposome)를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 형태로 제조될 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 공지되어 있는 다양한 방법이 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 리포좀 또는 프로테오리포좀을 제조하는 다수의 이용가능한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 아포 A-I 밀라노는 적절한 리피드와 함께 공-초음파처리되어 (배스 (bath) 또는 프로브 (probe) 소니케이터를 사용) 리피드 복합체를 형성시킬 수 있다. 특정의 구체예에서는, 아포 A-I 밀라노를 미리 형성된 리피드 소낭과 조합하여 아포리포프로테인:리피드 복합체의 자발적인 형성을 유도할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 또한 세제 투석방법에 의해서 제조될 수도 있으며, 예를 들어, 아포 A-I 밀라노, 리피드, 및 콜레이트와 같은 세제의 혼합물을 투석하여 세제를 제거하고, 재조제하여 리피드 복합체를 제조할 수도 있다 (참조예: Jonas et al., 1986, Methods Enzymol . 128, 553-82).
또 다른 구체예에서, 리피드 복합체는 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된 미국 특허 제 6,287,590 및 6,455,088 호에 기술된 바와 같이 공-동결건조에 의해서 제조될 수 있다. 그 밖의 다른 방법은 예를 들어, 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된 미국 특허 제 6,004,925, 6,037,323 및　6,046,166 호에 기술되어 있다. 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체를 제조하는 그 밖의 다른 방법들은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
바람직한 구체예에서, 리피드 복합체는 균질화에 의해서 제조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제조는 재조합체 아포 A-I 밀라노를 주사용 물을 사용하여 용액 중에서 15 ㎎/㎖의 농도로 희석함으로써 시작된다. 나트륨 포스페이트는 9-15 mM 포스페이트의 최종 농도로 첨가하고, pH를 약 7.0 내지 약 7.8로 조정한다. 만니톨은 약 0.8％ 내지 약 1％ 만니톨 (w/v)의 농 도를 수득하도록 첨가한다. 그 후, POPC를 첨가하여 POPC에 대한 아포 A-I 밀라노의 약 1:0.95의 혼합물 (wt 단백질/wt 리피드)을 수득한다. 이 혼합물은 37℃ 내지 43℃의 온도를 유지시키면서 오버헤드 프로펠러 (overhead propeller) 및 울트라 투락스 (Ultra Turrax)를 사용하여 약 20분 동안, 5000 rpm으로 교반한다. 공급물 용기를 300 rpm에서 연속적으로 교반하면서 온도는 인-라인 열교환기 (in-line heat exchangers; Avestin, Inc.)를 사용하여 32℃ 내지 43℃ 사이에서 유지시킨다. 처음 30분 동안의 균질화는 50 MPa (7250 psi)에서 수행하고, 그 후에 압력은 겔투과 크로마토그라피에 의한 제조과정 중의 시험이 단백질 표준품들 사이에서 > 70％의 AUC ％를 나타낼 때까지 80-120 MPa (11600-17400 psi)에서 유지시킨다. 복합체는 또한 10 ㎎/㎖, 11 ㎎/㎖, 12 ㎎/㎖, 13 ㎎/㎖ 및 14 ㎎/㎖ 제제로 제조될 수도 있으며, 여기에서 중량은 단백질의 중량이다.
복합요법
아포 A-I 밀라노 또는 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 본 발명의 방법에서 단독으로 또는 다른 개입과의 복합요법으로 사용될 수 있다. 이러한 치료법은 다른 약물의 동시 또는 순차적 투여를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 방법 및 제제는 다른 약물과 조합하여 사용하여 본 발명에서 제공된 방법을 획득할 수 있다. 또 다른 약물과의 공-투여하여 수반되는 질병을 치료, 예방 또는 개선시킬 수 있으며, 예를 들어, 투여된 항부정맥제는 공존하는 부정맥을 치료한다. 특정의 구체예에서는 급성 관상동맥 증후군을 수반하는 통증을 치료 또는 예방하기 위하여 약물을 공-투여하는 방법이 제공된다.
상술한 바와 같이, 심근경색, 앙기나 및 급성 관상동맥 증후군을 포함하는 허혈성 발작을 위한 통상적인 치료법은 붕괴되거나 불안정한 아테롬성동맥경화증 플라크의 원병리학에 대해 표적화되지 않았다. 예를 들어, 심장 흉부 불쾌감 또는 그 밖의 다른 허혈성 증상을 나타내는 대상체는 아스피린, 클로피도그렐 (clopidogrel), 헤파린 (heparin), 엡티휘바타이드 (eptifibatide) 또는 압식시맙 (abciximab)와 같은 항응혈제 또는 항혈전제를 사용하는 응급 경피적 관상 개입 (percutaneous coronary intervention; PCI)을 준비할 수 있다. 베타-아드레날린성 차단제 (β-차단제)는 심박수를 감소시키기 위해서 투여될 수 있다. 안지오텐신 전환효소 억제제 (ACE 억제제)의 투여는 수반되는 울혈성 심부전증 (CHF) 또는 좌심실 (LV) 기능부전을 앓고 있는 대상체에게 추천된다. 돌연심장사로부터 소생되었던 대상체의 경우에는, 아미오다론 (amiodarone)의 투여가 추천된다. 산소는 종종, 일반적으로 마스크 (mask) 또는 비내 캐눌라 (nasal cannula)에 의해서 대상체에게 공급되며, 펄스 산소측정법 (pulse oxumetry)에 의한 산소 포화도를 포함한 바이탈 사인 (vital sign)은 엄밀하게 모니터된다. 장기간 치료를 위해서는, HMGCoA 리덕타제 억제제의 스타틴을 종종 대상체에게 투여하여 LDC 레벨을 감소시킨다.
예를 들어, 아포 A-I 밀라노 또는 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제는 알파베타 아드레날린성 길항제, 항아드레날린 작용제, 알파-1 아드레날린성 길항제, 베타 아드레날린성 길항제, AMP 키나아제 활성화제, 안지오텐신 전환효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 항부정맥제, 혈관이완제, 니트레이트, 혈관수축제, 변력제 (inotropic agent), 이뇨제, 항응고제, 항혈소판응집제, 혈전용해제, 항당뇨병제, 항산화제, 항염증제, 담즙산 격리제 (bile acid sequestrant), 스타틴, 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질 (CETP) 억제제, 콜레스테롤 환원제/리피드 조절제, 아라키돈산 전환 차단 약물, 에스트로젠 대체요법, 지방산 동족체, 지방산 합성 억제제, 피브레이트, 히스티딘, 니코틴산 유도체, 퍼옥시좀 증식 활성화제 수용체 작용제 또는 길항제, 지방산 산화 억제제, 탈리도마이드 또는 티아졸리딘디온 (Drug Facts and Comparisons, updated monthly, January 2003, Wolters Kluwer Company, St. Louis, MO; Physicians Desk Reference (56th edition, 2002) Medical Economics)을 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다)그 밖의 다른 제약 활성약물과 함께 투여될 수 있다.
단독으로 또는 조합물로 아포 A-I 밀라노, 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제에 첨가될 수 있거나, 그들의 유익한 특성을 상승시킬 수 있는 그 밖의 다른 약물에는 다음의 약물들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다: 알파/베타 아드레날린성 길항제 ("β-차단제"), 예를 들어, 카베디올 (코레그 (Coreg®)); 라베타롤 HCl (노르모다인 (Normodyne®)); 항아드레날린 작용제, 예를 들어, 구아나드렐 (하일로렐 (Hylorel®)); 구아네티딘 (이스멜린 (Ismelin®)); 레저핀, 클로니딘 (카타프레스 (Catapres®) 및 카타프레스-TTS®); 구안파신 (테넥스 (Tenex®)); 구아나벤즈 (와이텐신 (Wytensin®)); 메틸도파 및 메틸도페이트 (알도메트 (Aldomet®)); 알파-1 아드레날린성 길항제, 예를 들어, 독사조신 (카두라 (Cardura®)); 프라조신 (미니프레스 (Minipress®)); 테트라조신 (하이트린 (Hytrin®)); 및 펜톨아민 (레지틴 (Regitine®)); 베타 아드레날린성 길항제, 예를 들어, 소타롤 (베타페이스 AF (Betapace AF®) 및 베타페이스 (Betapace®)); 티모롤 (블로카드렌 (Blocadren®)); 프로프라노롤 (인데랄LA (InderalLA®) 및 인데랄 (Inderal®)); 베탁소롤 (케를론 (Kerlone®)); 아세부토롤 (섹트랄 (Sectral®)); 아테노롤 (테노르민 (Tenormin®)); 메토프로롤 (로프레서 (Lopressor®) 및 토프롤-XL (Toprol-XL®)); 비소프로롤 (제바타 (Zebata®)); 카르테오롤 (카트롤 (Cartrol®)); 에스모롤 (브레비블록 (Brevibloc®)); 날도롤 (코르가드 (Corgard®)); 펜부토롤 (레바톨 (Levatol®)); 및 핀도롤 (비스켄 (Visken®)); AMP 키나아제 활성화제, 예를 들어, ESP 31015, (ETC-1001); ESP 31084, ESP 31085, ESP 15228, ESP　55016 및 ESP 24232; 젬카벤 (PD 72953 및 CI-1027); 및 메디카 (MEDICA) 16; 안지오텐신 전환효소 (ACE) 억제제, 예를 들어, 퀴나프릴 (아큐프릴®)); 베나제프릴 (로텐신 (Lotensin®)); 캡토프릴 (캐포텐 (Capoten®)); 에나라프릴 (바소텍 (Vasotec®)); 라미프릴 (알타세 (Altace®)); 포시노프릴 (모노프릴 (Monopril®)); 모엑시프릴 (유니바스크 (Univasc®)); 리시노프릴 (프리니빌 (Prinivil®)) 및 제스트릴 (Zestril®)); 트란도라프릴 (매빅 (Mavik®)), 페린도프릴 (아세온 (Aceon®)); 및 안지오텐시온 II 수용체 길항제, 예를 들어, 칸데사아르탄 (아타칸드 (Atacand®)); 이르베사르탄 (아바프로 (Avapro®)); 로사르탄 (코자아르 (Cozaar®)); 발사르탄 (디오반 (Diovan®)); 텔미사르탄 (미카르디스 (Micardis®)); 에프로사르탄 (테베탄 (Tevetan®)); 및 올메사르탄 (베니카르 (Benicar®)); 칼슘 채널 차단제, 예를 들어, 니페디핀 (아달라트 (Adalat®), 아달라트 CC®, 프로카르디아 (Procardia®) 및 프로카르디아 XL®); 베라파밀 (칼란 (Calan®), 칼란SR®, 코베라(Covera)-HS®, 이소프틴 (Isoptin)SR®, 베레란 (Verelan®) 및 베레란PM®)); 딜티아젬 (카르디젬 (Cardizem®), 카르디젬CD® 및 티아작 (Tiazac®)); 니모디핀 (니모톱 (Nimotop®)); 암로디핀 (노르바스크 (Norvasc®)); 펠로디핀 (플렌딜 (Plendil®)); 니솔디핀 (술라르 (Sular®)); 베프리딜 (바스코르 (Vascor®)); 이스라디핀 (다이나서크 (DynaCirc®)); 및 니카르디핀 (카르덴 (Cardene®)); 항부정맥제, 예를 들어, 다양한 퀴니딘; 프로카인아미드 (프로네스틸 (Pronestyl®) 및 프로칸 (Procan®)); 리도카인 (자일로카인 (Xylocaine®)); 멕실리틴 (멕시틸 (Mexitil®)); 토카이니드 (토노카드 (Tonocard®)); 플레카이니드 (탐보코르 (Tambocor®)); 프로파페논 (리트몰 (Rythmol®)), 모리시진 (에트모진®)); 이부틸리드 (코버트 (Covert®)); 디소피라미드 (노르페이스 (Norpace®)); 브레틸륨 (브레티롤 (Bretylol®)); 아미오다론 (코르다론 (Cordarone®)); 아데노신 (아데노카드 (Adenocard®)); 도페틸리드 (티코신 (Tikosyn®)); 및 디곡신 (라녹신 (Lanoxin®)); 혈관확장제, 예를 들어, 디아족사이드 (하이퍼스타트 (Hyperstat) IV®)); 하이드랄라진 (아프레솔린 (Apresoline®)); 페놀도팜 (코롤팜 (Corolpam®)); 미녹시딜 (로니텐 (Loniten®)); 및 니트로프루시드 (니프라이드 (Nipride®)); 니트레이트, 예를 들어, 이소소르비드 디니트레이트 (이소르딜 (Isordil®) 및 소르비트레이트 (Sorbitrate®)); 이소소르비드 모노니트레이트 (임두르 (Imdur®), 이스모 (Ismo®) 및 모노케트 (Monoket® )); 니트로글리세린 페이스트 (니트롤 (Nitrol®)); 다양한 니트로글리세린 패취; 니트로글리세린 SL (니트로스타트 (Nitrostat®)), 니트로링구알 (Nitrolingual) 스프레이; 및 니트로글리세린 IV (트리딜 (Tridil®)); 혈관수축제, 예를 들어, 노르에피네프린 (레보페드 (Levophed®)); 및 페닐에프린 (네오-신에프린 (Neo-Synephrine®)); 변력제, 예를 들어, 암리논 (이노코르 (Inocor®)); 도파민 (인트로핀 (Intropine®)); 도부타민 (도부트렉스 (Dobutrex®)); 에피네프린 (아드레날린 (Adrenalin®)); 이소프로테레놀 (이수프렐 (Isuprel®)), 밀리논 (프리마코르 (Primacor®)); 이뇨제, 예를 들어, 스피로노락톤 (알닥톤 (Aldactone®)); 토르세마이드 (데마덱스 (Demadex®)); 하이드로플루메티아자이드 (디유카르딘 (Diucardin®)); 클로로티아자이드 (디유릴®)); 에타크린산 (에데크린 (Edecrin®)); 하이드로클로로티아지드 (하이드로디유릴 (hydroDIURIL®) 및 마이크로지드 (Microzide®)); 아밀로라이드 (미다모르 (Midamor®)); 클로르탈리돈 (탈리톤 (Thalitone®) 및 하이그로톤 (Hygroton®)); 부메타니드 (부멕스 (Bumex®)); 퓨로세미드 (라식스 (Lasix®)); 인다파미드 (로졸 (Lozol®)); 메톨라존 (자록솔린 (Zaroxolyn®)); 트리암테렌 (다이레늄 (Dyrenium ®)); 및 트리암테렌과 하이드로클로로티아지드의 조합물 (다이아지드 (Dyazide®) 및 맥스자이드 (Maxzide®)); 항혈전제/항응고제/항혈소판제, 예를 들어, 비발리루딘 (앤지오맥스 (Angiomax®)); 레피루딘 (레플루단 (Refludan®)); 다양한 헤파린; 다나파로이드 (오르가란 (Orgaran®)); 다양한 저분자량 헤파린; 달테파린 (프라그민 (Fragmin®)); 에녹사프린 (로베녹스 (Lovenox®)); 틴자파린 (인노헵 (Innohep®)); 와파린 (코우마딘 (Coumadin®)); 디큐마롤 (디코우마롤 (Dicoumarol®)); 아니신디온 (미라돈 (Miradone®)); 아스피린; 아르가트로반 (아르가트로반 (Argatroban®)); 애브시지아맵 (레오프로 (Reopro®)); 엡티피바티드 (인테그릴린 (Integrilin®)); 티로피반 (아그라스타트 (Aggrastat®)); 클로피도그렐 (플라빅스 (Plavix®)); 티클로피딘 (티클리드 (Ticlid®)); 및 디피리다몰 (페르산틴 (Persantine®)); 혈전용해제, 예를 들어, 알테플레이즈 (액티바제 (Activase®)); 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) (액티바제 (Activase®)); 애니스트레플레이즈, APSAC (에미나제 (Eminase®)); 레테플레이즈, rPA (레타바세 (Retavasae®)); 스텝토키네이즈, SK (스트렙타제 (Streptase®)); 유로키나아제 (아보키나아제 (Abbokinase®); 항당뇨병제, 예를 들어, 메트포르민 (글루코파지 (Glucophage®)); 글리피자이드 (글루코트롤 (Glucotrol®)); 클로로프로파마이드 (다이아비네스 (Diabinese®)); 아세토헥사마이드 (다이멜로르 (Dymelor®)); 톨라자마이드 (톨리나제 (Tolinase®)); 글리메프라이드 (아마릴 (Amaryl®)); 글리뷰라이드 (디아베타 (DiaBeta®) 및 마이크로나제 (Micronase®)); 아카르보즈 (프레코즈 (Precose®)); 미글리톨 (글리세트 (Glyset®)); 레파플리나이드 (프란딘 (Prandin®)); 네이트글리나이드 (스타릭스 (Starlix®)); 로시글리타존 (아반디아 (Avandia®)); 및 피오글리타존 (액토스 (Actos®)); 항산화제 및 항염증제; 담즙산 격리제, 예를 들어, 콜레스티라민 (로콜레스트 (LoCholest®), 프레발라이트 (Prevalite®) 및 퀘스트란 (Questran®)); 콜레스티폴 (콜레스티드 (Colestid®)); 및 콜레세벨람 (웰콜 (Welchol®)); 스타틴 (HMGCoA 리덕타제를 억제하는 약물), 예를 들어, 로바스타틴 (크레스토 (Crestor®)); 플루바스타틴 (레스콜 (Lescol®)); 아토르바스타틴 (리피토 (Lipitor®)); 로바스타틴 (메바코 (Mevacor®)); 프라바스타틴 (프라바콜 (Pravachol®)); 및 심바스타틴 (조코 (Zocor®)); CETP 억제제; 아라키돈산 전환을 차단하는 약물: 에스트로젠 대체요법; 지방산 동족체, 예를 들어, PD 72953, MEDICA 16, ESP 24232 및 ESP 31015; 지방산 합성 억제제; 지방산 산화 방지제, 라놀라진 (라넥사 (Ranexa®)); 피브레이트, 예를 들어, 클로피브레이트 (아트로미드 (Atromid)-S®); 젬피브로질 (로피드 (Lopid®)); 미립자화된 페노피브레이트 캅셀제 (트리코 (Tricor®)); 베자피브레이트 및 사이프로피브레이트; 히스티딘; 니코틴산 유도체, 예를 들어, 나이아신 서방형 정제 (나이아스판 (Niaspan®)); 퍼옥시좀 증식 활성화제 수용체 작용제 및 길항제; 탈리도마이드 (탈로미드 (Thalomid®)) 및 미국 특허 제 6,459,003 및 6,506,799 호 및 미국 출원공개 제 20030022865, 20030018013, 20020077316, 및 20030078239호 (이들의 내용은 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된다)에 기술된 화합물.
단독으로 또는 조합물로 아포 A-I 밀라노 또는 리피드 복합체 또는 그의 제약 제제에 첨가될 수 있거나, 그들의 유익한 특성을 상승시킬 수 있는 그 밖의 다른 약물에는 예를 들어, 파클리탁셀 및 토포테칸 등의 항증식성 약물 (Brehm et al. 2001, Biochemical Pharmacology, 61(1):119-127) 및 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제와 같은 항염증성 약물 (사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제 포함)이 포함된다.
제약 제제
한가지 관점에서, 본 발명은 아포 A-I 밀라노를 포함하는 제약 제제를 투여함으로써 급성 관상동맥 증후군으로 인한 손상을 치료, 감소 또는 예방하기 위한 제제를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노 (Apo A-I Milano)는 리피드와 복합체를 형성할 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노는 POPC와 복합체를 형성한다.
아포 A-I 밀라노 또는 그의 리피드 복합체는 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 기술된 바와 같은 제약 제제는 예를 들어, 허용되는 희석제, 부형제, 비히클 또는 담체의 첨가를 포함한다. 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 희석제, 부형제, 비히클 또는 담체의 첨가는 제제를 대상체에게 투여하기에 적합한 제제가 되도록 하며, 연장된 저장수명과 같은 그 밖의 다른 바람직한 특성을 부여한다.
제약 제제는 일반적으로 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함한다. 다수의 제약상 허용되는 담체 또는 비히클이 사용될 수 있다. 본 발명에 기술된 예에서는 슈크로즈-만니톨이 이용된다. 생리식염수가 종종 제약 담체 또는 비히클로 사용된다. 그 밖의 적합한 담체 또는 비히클에는 글루코즈, 트레할로즈, 슈크로즈, 멸균수, 완충된 물, 0.45％ 식염수 (반 생리식염수), 및 0.3％ 글리신이 포함되며, 추가로 알부민과 같이 증가된 안정성을 위한 글리코프로테인을 더 포함할 수 있다. 이들 제제는 통상적이며 잘 공지되어 있는 멸균기술에 의해서 멸균될 수 있다. 생성된 수용액은 사용을 위해서 포장되거나, 무균조건 하에서 여과하고 동결건조 (동결-건조)시킬 수 있다. 그 후, 동결건조된 제제는 투여하기 전에 멸 균 수용액과 조합시킬 수 있다.
제약 제제는 또한, 적절한 생리적 조건 하에서의 필요에 따라 pH 조정 및 완충제, 장성 조정제, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 및 칼슘 클로라이드와 같은 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 항균제, 예를 들어, 페놀, 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 첨가하여 생성물, 특히 수회-용량의 비경구적 사용을 목적으로 하는 제약 제제의 무균성을 유지시킬 수 있다. 본 발명의 제제에는 현탁화, 안정화 및(또는) 분산제가 사용될 수도 있다.
제약 제제는 염 형태의 아포리포프로테인 (아포 A-I 밀라노)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 산성 및(또는) 염기성 말단 및(또는) 측쇄를 포함할 수 있기 때문에, 아포 A-I 밀라노는 제약 제제에서 유리 산 또는 염기로서, 또는 제약상 허용되는 염으로서 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 염에는 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 인산 등과 같은 무기산; 및 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 안트라닐산, 신남산, 나프탈렌 설폰산, 설파닐산 등과 같은 유기산을 포함한, 아포 A-I 밀라노와 염을 형성할 수 있는 적합한 산이 포함될 수 있다. 아포 A-I 밀라노와 염을 형성할 수 있는 적합한 염기에는 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨 등과 같은 무기염기; 및 모노-, 디- 및 트리-알킬 아민 (예를 들어, 트리에틸 아민, 디이소프로필 아민, 메틸 아민, 디메틸 아민 등) 및 임의로 치환된 에탄올아민 (예를 들어, 에탄올아민, 디에탄올아민 등)과 같은 유기염기가 포함될 수 있다.
제약 제제는 비경구, 장내, 국소 또는 흡입을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 어떤 투여경로에도 적합한 다양한 형태를 가질 수 있다. 비경구 투여는 주사용 투여 (즉, 본 명세서에 기술된 바와 같은 정맥내, 근육내 등)를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 소화관을 통과하지 않는 어떤 투여 경로라도 나타낸다. 장내 투여는 본 명세서에 기술된 바와 같은 정제, 캅셀제, 경구 용액, 현탁액, 스프레이 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 소화관, 경구 또는 직장을 이용한 어떤 투여의 경로라도 나타낸다. 본 출원의 목적을 위해서, 장내 투여는 또한 투여의 질내 경로를 나타낸다. 국소 투여는 본 명세서에 기술된 바와 같은 크림, 연고, 겔 및 경피용 패취를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 피부를 통한 투여의 모든 경로를 의미한다 (참조: 또한 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition Gennaro et al., eds. Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania, 1990).
본 발명의 비경구용 제약 제제는 예를 들어, 정맥 (정맥내), 동맥 (동맥내), 근육 (근육내) 내로, 피부 아래로 (피하로 또는 데포 제제로), 심막, 또는 관상동맥에 주사에 의해서 투여될 수 있다. 주사용 제약 제제는 심장, 심막 또는 관상동맥에 직접 투여하기에 제약상 적절한 제제일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 대상체의 말초혈관 내에, 예를 들어, 팔 또는 전주와에 주입된다.
주사용 제약 제제는 수성 또는 유성 비히클 내의 멸균 현탁액, 용액 또는 에 멀젼일 수 있다. 주사용 제제는 예를 들어, 앰플 또는 수회용량 용기 내의 단위 투약형으로 존재할 수 있으며, 첨가된 보존제를 포함할 수 있다. 비경구용 제약 제제를 위한 바람직한 완충제는 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트이다.
또 다른 구체예에서, 제약 제제는 사용하기 전에 발열성 물질을 함유하지 않는 멸균수, 식염수 또는 덱스트로즈를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 적합한 비히클로 재조제하기 위한 분말 형태로 제공될 수 있다. 이를 위해서, 아포 A-I 밀라노는 필요에 따라서 동결건조시키거나, 리피드와 함께 공-동결건조시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제약 제제는 단위 투약형으로 공급되어 사용하기 전에 재조제될 수 있다.
장기간 송달을 위해서, 제약 제제는 이식에 의해, 예를 들어 피하, 피내 또는 근육내 주사에 의해서 투여하기 위한 데포 제제로 제공될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제약 제제는 적합한 폴리머성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온교환수지를 사용하거나, 난용성인 유도체로서, 예를 들어, 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 난용성 염 형태로 제제화될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 제약 제제는 경피 흡수를 위해서 활성성분을 서서히 방출시키는 접착 디스크 또는 패취로서 제조된 경피적 송달 시스템이다. 이러한 구체예에서, 침투 증진제 (permeation enhancer)를 사용하여 아포 A-I 밀라노의 경피적 침투를 촉진시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 경피적 제약 제제는 앙기나가 있는 환자에서 사용하기 위해 니트로글리세린을 더 함유할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해서, 제약 제제는 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 그 밖의 다른 적합한 가스를 사용하여 가압 팩 (pressurized pack)로부터의 스프레이에 의해서, 또는 분무기 (nebulizer)를 통해서 송달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투약량 유니트는 계량된 양을 송달하기 의한 밸브, 예를 들어, 계량 용량 흡입기 (metered dose inhaler)를 제공함으로써 결정될 수 있다. 아포 A-I 밀라노 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하는, 예를 들어, 흡입기 또는 통기기 (insufflator)에서 사용하기 위한 젤라틴의 캅셀제 및 카트리지가 제제화될 수 있다.
제제는 필요한 경우에, 아포 A-I 밀라노 제약 제제를 함유하는 하나 또는 그 이상의 단위 투약형을 포함할 수 있는 팩 (pack) 또는 디스펜서 (dispenser) 장치로 존재할 수 있다. 팩은 예를 들어, 블리스터 팩 (blister pack)과 같은 금속 또는 플라스틱 호일로 이루어질 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여를 위한 지침 또는 라벨링이 첨부될 수 있다.
특정의 구체예에서, 아포 AI-M 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 치료가 필요한 대상체를 치료하는데 충분한 농도의 아포 A-I 밀라노를 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 50 ㎎/㎖ 농도의 아포 A-I 밀라노를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제제는 아포 A-I 밀라노를 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 제제는 아포 A-I 밀라노를 약 13 ㎎/㎖ 내지 약 16 ㎎/㎖의 농도로 함유할 수 있다. 아포 A-I 밀라노의 농도는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 적합한 기술에 의해서라도 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노의 농도는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그라피 (SE-HPLC)에 의해서 측정된다.
특정의 구체예에서, 아포 AI-M 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 아포 A-I 밀라노와의 복합체를 형성하는데 충분한 농도의 리피드를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 50 ㎎/㎖ 농도의 POPC를 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제제는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 25 ㎎/㎖의 농도로 POPC를 함유할 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 제제는 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖의 농도로 POPC를 함유할 수 있다. 더 더욱 바람직한 구체예에서, 제제는 약 11 ㎎/㎖ 내지 약 17 ㎎/㎖의 농도로 POPC를 함유할 수 있다. POPC의 농도는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 적합한 기술에 의해서라도 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서, POPC의 농도는 고성능 액체 크로마토그라피에 의해서 측정된다.
바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약상 적합한 제제를 제조하기에 충분한 양으로 슈크로즈를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 0.5％ 내지 약 20％ 슈크로즈를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 3％ 내지 약 12％ 슈크로즈를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 5％ 내지 약 7％ 슈크로즈를 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 약 6.0％ 내지 약 6.4％ 슈크로즈를 함유할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 6.2％ 슈크로즈를 함유할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약상 적합한 제제를 제조하기에 충분한 양으로 만니톨을 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 0.01％ 내지 약 5％ 만니톨을 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 0.1％ 내지 약 3％ 만니톨을 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 0.5％ 내지 약 2％ 만니톨을 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 약 0.8％ 내지 약 1％ 만니톨을 함유할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 0.9％ 만니톨을 함유할 수 있다.
특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약상 적합한 제제를 제조하기에 충분한 양으로 완충제를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 포스페이트 완충제를 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 완충제 농도는 약 3 mM 내지 약 25 mM일 수 있다. 특정의 구체예에서, 완충제 농도는 약 5 mM 내지 약 20 mM일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 완충제 농도는 약 8 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 특정의 구체예에서는, 적절한 완충제를 첨가하여 제약 제제의 pH를 대상체에게 투여하기에 적합한 범위로 조정한다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 가질 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 7.0 내지 약 7.8의 pH를 가질 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 7.2 내지 약 7.5의 pH를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 약 7.5의 pH를 가질 수 있다.
특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체의 제약 제제는 대상체에게 투여하기에 적합한 삼투질농도를 갖는다. 특정의 구체예에서, 제제의 삼투질농도는 약 200 내지 약 400 mOsm일 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 220 내지 약 380 mOsm의 삼투질농도를 가질 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 260 mOsm 내지 약 340 mOsm의 삼투질농도를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 약 280 mOsm 내지 약 320 mOsm의 삼투질농도를 가질 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 약 290 mOsm의 삼투질농도를 가질 수 있다.
본 발명의 제제는 대상체에게 투여하도록 하는데 충분한 순도의 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체를 제공한다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 98％ 또는 그 이상, 약 96％ 또는 그 이상, 약 95％ 또는 그 이상, 약 93％ 또는 그 이상, 약 91％ 또는 그 이상 또는 약 90％ 또는 그 이상의 순도로 아포 A-I 밀라노를 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노의 순도는 약 90％ 또는 그 이상이다. 아포 A-I 밀라노의 순도는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 적합한 기술에 의해서라도 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노의 순도는 크기 배제 HPLC에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명의 제제는 대상체에게 투여하도록 하는데 충분한 순도의 POPC의 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체를 제공한다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 약 98％ 또는 그 이상, 약 96％ 또는 그 이상, 약 95％ 또는 그 이상, 약 93％ 또는 그 이상, 약 91％ 또는 그 이상 또는 약 90％ 또는 그 이상의 순도로 POPC를 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, POPC의 순도는 약 90％ 보다 크다. POPC의 순도는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 적합한 기술에 의해서라도 측정될 수 있다. 특정한 구체예에서, POPC의 순도는 HPLC에 의해서 측정될 수 있다.
특정의 바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체는 약 10％ 또는 그 미만, 약 8％ 또는 그 미만, 약 6％ 또는 그 미만, 약 4％ 또는 그 미만, 약 2％ 또는 그 미만, 약 1％ 또는 철(II) 산화/크실레놀 오렌지 분석방법 (Jiang, et al. 1992, Anal. Biochem 202: 384-389)에 의해서 측정된 바와 같은 검출가능한 한계 이하의 리피드 하이드로퍼옥사이드 양을 갖는다. 특정의 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체는 겔 투과 크로마토그라피에 의해서 측정된 것으로 85％ 보다 큰 순도 (총 피크면적의 ％로 측정됨)를 갖는다. 특정의 구체예에서, 제제는 엔도톡신을 거의 또는 전혀 함유하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 제제는 아포 A-I 밀라노 1 ㎎당 < 0.04 EU의 엔도톡신을 갖는다.
특정의 구체예에서, 제제는 크기가 10 ㎛보다 큰 미립자의 양이 광감쇄 (light obscuration)에 의해서 측정된 것으로서 50 ㎖ 바이알당 < 약 6,000일 수 있다. 특정의 구체예에서, 크기가 25 ㎛보다 큰 미립자의 양은 광감쇄에 의해서 측정된 것으로 50 ㎖ 바이알당 < 약 600이다.
바람직한 구체예에서, 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체 제약 제제는 재조합 아포 A-I 밀라노를 주사용 물을 사용하여 용액 중에서 15 ㎎/㎖의 농도로 희석함으로써 제조된다. 나트륨 포스페이트를 9-15 mM의 최종 농도로 첨가하고, pH를 약 7.0 내지 약 7.8 사이로 조정한다. 만니톨을 첨가하여 약 0.8％ 내지 약 1％ 만니톨 (w/v)의 농도를 수득한다. 그 후, POPC를 첨가하여 1:0.95 (wt 단백질/wt 리피드)의 아포 A-I 밀라노 대 POPC의 비를 수득한다. 혼합물은 온도를 37℃ 내지 43℃ 사이로 유지시키면서 오버헤드 프로펠러 및 울트라 투락스를 사용하여 5000 rpm에서 약 20분 동안 교반한다. 공급물 용기를 300 rpm에서 연속적으로 교반하면서 온도는 인-라인 열교환기 (Avestin, Inc.)를 사용하여 32℃ 내지 43℃ 사이에서 유지시킨다. 처음 30분 동안의 균질화는 50 MPa (7250 psi)에서 수행하고, 그 후에 압력은 겔투과 크로마토그라피에 의한 제조과정 중의 시험이 단백질 표준품들 사이에서 약 70％보다 큰 AUC ％를 나타낼 때까지 80-120 MPa (11600-17400 psi)에서 유지시킨다. 그 후, 6.0％ 내지 6.4％ 슈크로즈를 첨가함으로써 복합체의 삼투질농도를 조정한다. 그 후, 아포 A-I 밀라노:POPC 복합체는 0.22 μM 필터를 통해서 여과함으로써 멸균시킨다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 제약 제제는 약 280 mOsm 내지 약 320 mOsm의 삼투질농도를 가지고 약 12 내지 약 18 ㎎/㎖의 재조합체 아포 A-I 밀라노, pH 7.4의 약 11 내지 약 17 ㎎/㎖의 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린과 함께 6.2％ 슈크로즈 및 0.9％ 만니톨을 함유한다. 제약 제제는 약 90％ 순도의 r아포 A-I-M, 약 97％ 순도의 POPC를 가질 수 있다. 특정의 구체예에서, 어떤 단일 불순물도 약 2％보다 클 수는 없다.
제약 제제는 동결하여 (약 -15℃ 내지 약 -25℃) 저장할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제제는 냉용액, 동결된 용액 또는 동결건조된 용액일 수 있다. 이러한 제제는 대상체에게 투여하기 전에 해동시키고 실온으로 가온하는 것이 바람직하다. 단백질의 변성을 피하기 위해서 온화한 해동 및 가온이 추천된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 제제는 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 포함하는 제약 제제를 함유하는 약 2 ㎖ 내지 약 250 ㎖, 바람직하게는 약 10 ㎖ 내지 약 100 ㎖, 가장 바람직하게는 약 50 ㎖의 멸균 유리 바이알 중에 존재할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 바이알당 약 39 내지 41 ㎖의 최종 충진 용량에서 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 15 ㎎/㎖의 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 포함할 수 있다. 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체의 양은 50 ㎖ 바이알당 약 500 ㎎ 내지 750 ㎎일 수 있다.
제약 제제는 단일의 1회 사용을 위한 것일 수 있거나, 수회 사용에 적합한 제약 제제, 예를 들어, 수회-사용 바이알을 제공하도록 상술한 바와 같은 항균성 부형제를 함유할 수 있다. 특정의 구체예에서, 제약 제제는 사용-유니트 패키지 (unit-of-use package)로 존재할 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 바와 같이 사용-유니트 패키지는 건강관리 제공자 (health care provider)에 의한 직접적인 분배를 위해 라벨을 붙인 편리한 처방 크기의 환자 즉시사용형 유니트이다. 사용-유니트 패키지는 소정의 적응증에 대한 대표적인 치료 간격 및 기간에 필요한 양으로 제약 제제를 함유한다. 본 발명의 방법 및 제제는 예를 들어, 평균 크기의 성인 남성 또는 여성을 5주일 동안 매주 1회씩 15 ㎎/㎏로 치료하기에 충분한 양으로 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 포함하는 제약 제제의 사용-유니트 패키지로 제공된다. 한가지 구체예에서, 사용-유니트 패키지는 평균 크기의 성인 대상체를 6주일 동안 매주 1회씩 45 ㎎/㎏로 치료하기에 충분한 양으로 아포 A-I 밀라노:포스포리피드 복합체를 포함하는 제약 제제를 함유할 수 있다. 본 명세서에 기술된 용량이 대상체의 체중을 기준으로 한다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
제약 제제는 함유된 제제, 및 사용 지침, 용량, 투약 간격, 기간, 적응증, 조합금기, 경고, 주의사항, 취급 및 저장 지침 등을 포함하여 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 심혈관 및 혈관 질환, 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 질환의 치료 및 예방 및 플라크의 안정화를 위해 건광관리 제공자 및 대상체에게 유용한 그 밖의 다른 정보를 확인하기 위한 라벨을 붙이거나, 첨부된 라벨을 가질 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 심혈관 및 혈관 질환, 급성 관상동맥 증후군, 허혈성 질환을 치료 또는 예방하고, 플라크를 안정화시키기 위한 키트 (kit)를 제공한다. 이 키트는 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체 또는 그의 제약 제제의 하나 또는 그 이상의 유효량과 함께 본 발명의 빙법에 따라 급성 관상동맥 증후군을 치료 또는 예방하기 위해서 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체 또는 그의 제약 제제를 사용하는 지침을 갖는 라벨 또는 라벨링을 포함한다. 특정의 구체예에서, 키트는 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체 또는 그의 제약 제제를 송달하기 위한 장치와 같이 이 방법을 수행하는데 유용한 구성요소, 및 이들 장치의 안전한 처리를 위한 구성요소, 예를 들 어, 샵스 용기 (sharps container)를 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 키트는 전-충진된 시린지, 유니트-용량 또는 사용-유니트 패키지에 아포 A-I 밀라노 또는 아포 A-I 밀라노:리피드 복합체 또는 그의 제약 제제를 포함할 수 있다.
본 발명은 이하의 비-제한적 실시예를 참고로 하여 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
실시예 1: ETC-216의 관용성
본 실시예는 건강한 지원자에서의 ETC-216의 안전성 및 관용성 (tolerability)를 입증하는 것이다.
이중-맹검 위약-조절시험을 수행하여 아포 A-I 밀라노 및 포스포리피드의 안전성 및 관용성을 측정하였다. 아포 A-I 밀라노는 포스포리피드 (POC)와 1:1 중량비로 복합체를 형성하며, ETC-216이라 불린다. 본 시험은 건강한 남성 지원자에게 ETC-216을 1회 정맥내 주입의 5개의 점증적 용량 및 건강한 여성 지원자에서의 두개의 상이한 용량의 안전성 및 관용성을 평가하는 것이다. 시험을 하기 전에 모든 지원자로부터 고지에 의한 동의 (informed consent)를 받았다.
연령이 18-50세 사이인 32명의 건강한 지원자 ("대상체")에게 정맥내 용량의 ETC-216을 투여하였다. 남성 대상체에게는 100 ㎎/㎏ 이하의 용량이 투여되었다. 여성 대상체에게는 50 ㎎/㎏ 이하의 용량이 투여되었다. 대상체의 성별, 용량 및 속도는 이하의 표 1에 제시하였다.
용량 (㎎ 단백질/㎏ 체중) 대상체의 수 성별 주입속도 (㎎/㎏/분)
0 (위약) 3 남성 1.67
0 (위약) 2 남성 1.25
5 3 남성 1.67
15 3 남성 1.67
50 3 남성 1.67
75 3 남성 1.25
100 3 남성 1.25
0 (위약) 1 여성 1.67
0 (위약) 2 여성 0.83
15 3 여성 1.67
15 3 여성 0.83
50 3 여성 0.83
부작용 모니터링 (monitoring)에는 임상적 실험실 평가, 신체검사 및 바이탈 사인 (vital sign)이 포함된다. 대상체는 투약한 후에 27일 동안 모니터되었다.
본 시험에서는 32명의 대상체 중의 20명이 부작용을 보고하였으며, 이들은 모두 경미 내지는 중등도였다. 2명 또는 그 이상의 대상체에서 나타난 부작용은 아마도 시험약물 치료와 관련되는 것으로 생각되었다. 이들 부작용 및 이들 부작용을 경험한 대상체의 수는 림프구감소증 (대상체 11명), 백혈구증가 (대상체 10명), 오심 (대상체 6명), 두통 및 설사 (대상체 4명), 구토 (대상체 3명) 및 복통 및 고트리글리세라이드혈증 (대상체 2명)이었다. 관련 가능성이 있는 부작용 (위장관 및 백혈구 질환)의 대부분은 남성 대상체에게 50 ㎎/㎏ 또는 100 ㎎/㎏의 ETC-216을 주입한 후에 보고되었다. 위약-처리 대상체에서 나타난 두가지 부작용 (저단백혈증 및 비정상적인 간기능)은 시험 처리와 관련 가능성이 있는 것으로 생각되었다. 여기에서는 사망, 심각한 부작용, 또는 부작용으로 인한 중지는 없었다.
도 1에 제시된 바와 같이, ETC-216의 단일 용량을 투여한 지 30분 후에 남성 대상체에서 HDL 비에스테르화된 콜레스테롤의 혈청 레벨은 15 ㎎/㎏ 및 그 이상의 용량에서 증가하였다.
아포 A-I 밀라노에 대한 항체 역가는 주입하기 전, 및 주입한 후 27일까지 혈청에서 시험하였다. 1회 용량을 투여한 후에 어떤 대상체에서도 유의적인 항체반응은 없었다.
약 100시간의 말기 반감기 (terminal half-life)는 매 7일의 투약 레지멘을 사용하여 인간에서 초기 수회 용량 시험을 수행하는 이론적 근거를 지지한다.
이들 결과는 ETC-216이 모든 용량에서 안전하고 잘 허용되었으며, 심각 부작용은 나타나지 않았음을 시사한다.
실시예 2: 아테롬성동맥경화증을 퇴행시키는데 있어서 다양한 용량의 ETC-216의 효능
본 실시예는 급성 관상동맥 증후군이 있는 대상체에서 관상동맥 아테롬성동맥경화증을 퇴행시키는데 있어서 15 ㎎/㎏ 및 45 ㎎/㎏ 용량의 ETC-216의 효능을 입증하는 것이다.
이 시험은 혈관내부 초음파에 의해서 평가되는 것으로서, 급성 관상동맥 증후군이 있는 대상체에서 ETC-216의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 무작위 이중-맹검 위약 조절된 수회-용량 시험이었다. 어떤 시험-특이적 절차를 시작하기 전에 모든 대상체들은 각각의 참여기관의 IRB (Institutional Review Board)에 의해서 승인된 고지에 의한 동의를 받았다.
적격의 대상체들은 스크리닝하기 전에 14일 이내에 급성 관상동맥 증후군 (불안정 앙기나, 비 Q파 심근경색 또는 ST 상승 심근경색)으로 진단되고, 관상동맥조영 및(또는) 경피적 관상 개입 (PCI)을 수행하기로 예정되어 있으며, 이 절차에 이어서 24-시간 입원이 예상된 대상체였다. 이러한 판정기준에 부합하는 대상체들은, 만일 이들의 절차가 응급상태인 것으로 생각되고(되거나), 진료의에 의해서 결정되는 것으로 급성 합병증의 높은 위험이 동반되는 것으로 생각되는 경우에는 제외시켰다.
일차 효능 평가항목 (primary efficacy endpoint)은 혈관내부 초음파 (IVUS)에 의해서 평가된 하나의 표적화된 (이미지화된) 관상동맥의 30-80 ㎜ 절편에서의 아테롬 용적 퍼센트의 변화 (치료의 종료시 - 전치료)였다. 양성 (positive) 결과는 0을 포함하지 않는 신뢰구간 (CI)을 갖는 아테롬 용적 퍼센트에서의 음성 (negative) 변화로 정의되었다.
이차 효능 평가항목은 총 아테롬 용적 및 평균 최대 아테롬 두께에 있어서의 평균 변화였다. 이차 효능 평가항목은 IVUS 및 혈관조영술을 위해서 설정되었다. IVUS의 경우에, 이차 효능 평가항목은 다음과 같았다:
1) 표적 관상동맥의 해부학적으로 동등한 절편의 모든 슬라이스에 대한 플라크 면적의 평균에 의해서 측정된 것으로서, 총 플라크 "용적"에 있어서의 공칭 변화 (치료의 종료시 - 전치료);
2) 표적 관상동맥의 해부학적으로 동등한 절편의 모든 슬라이스에 대한 평균 최대 플라크 두께에 있어서의 공칭 변화 (치료의 종료시 - 전치료);
3) 최소 및 최대의 병에 걸린 절편 "용적";
a) 최소 퍼센트 플라크 면적 (최소의 병에 걸린 절편으로 정의됨)을 함유하는 기준선에서 10 ㎜의 인접한 슬라이스들에 대한 절편 플라크 "용적"에 있어서의 공칭 변화 (치료의 종료시 - 전치료);
b) 최대 퍼센트 플라크 면적 (최대의 병에 걸린 절편으로 정의됨)을 함유하는 기준선에서 10 ㎜의 인접한 슬라이스들에 대한 절편 플라크 "용적"에 있어서의 공칭 변화 (치료의 종료시 - 전치료).
혈관조영술에 관한 이차 효능 평가항목은 다음과 같았다:
1) 모든 측정된 관상동맥 절편 내에서의 평균 관상동맥 내강 직경;
2) 각각의 치료 서브그룹에서 새로운 혈관조영상의 병소의 수;
3) 치료의 종료시에 하나 또는 그 이상의 새로운 혈관조영상의 관상동맥 병소를 갖는 대상체의 비율;
4) 퇴행을 나타내는 기존의 병소를 갖는 부위의 수;
5) 진행을 나타내는 기존의 병소를 갖는 부위의 수;
6) 어떤 기존의 병소에서 "퇴행"을 나타내는 대상체의 비율;
7) 기존의 모든 병소에서 "진행 또는 불변"을 나타내는 대상체의 비율;
8) 기존의 모든 병소에서 "퇴행 또는 불변"을 나타내는 대상체의 비율.
IVUS를 위한 방법은 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된 문헌 (Nissen 2001, Am. J. Cardiol . 87: 15A-20A)에 기술된 바와 같이 분석되었다. 간략하면, 작업자 (operator)는 IVUS 비디오테이프를 디지탈화하고, 풀백 (pullback)을 검토하고, 도 2(A)에 나타낸 바와 같이 분석을 위한 개시점으로서 가장 원위의 사이드-브랜치 (side-branch)의 기원을 선택하였다. 이어서, 매 30번째의 이미지를 분석을 위해서 선택하였으며, 이것은 정확히 0.5 ㎜ 간격으로 떨어져 있는 일련의 단면을 나타낸다. 최종 분석된 단면이 도 2(B)-2(D)에 나타낸 바와 같이 좌측주관상동맥 또는 우측 관상동맥구 (근위 기준부위 (proximal fiduciary site))가 출현하기 전에 순서에서 가장 근위의 이미지였다. 이 방법은 동일한 절편이 두가지 시점 모두에서 분석되는 것을 보장하도록 동일한 경계표를 사용하여 추적 검사를 위해서 반복되었다.
지시 및 유도된 IVUS 측정 둘 다를 수행하였다. 직접 IVUS 측정은 미국심장학회 (American College of Cardiology)와 유럽심장학회 (European Society of Cardiology)의 기준에 따라서 수행되었다 (Mintz et al. 2001, J. Am. Coll . Cardiol. 37: 1478-92; 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함됨). 미국국립보건원 이미지 (National Institute of Health Image) 1.62 (NIH 공공 소프트웨어 (public domain software))를 사용하여, 작업자는 스캐너에 의해서 IVUS 이미지로 코드화된 1-㎜ 그리드 마크 (grid mark)를 측정함으로써 검정절차 (calibration procedure)를 수행하였다. 각각의 단면에 대하여 작업자는 수동으로 면적 측정을 수행하여 내강 및 외부 탄성막연 (elastic membrane border)의 리딩 에지 (leading egde)를 추적하였다 (도 3(A)-㎟3(D)). 또한, 최대 아테롬 두께를 직접적으로 측정하였다. 이들 방법의 정확성 및 재현성은 이미 보고되었으며, 이는 검정한 후에 평균 IVUS 단면적 측정치가 3.24 ㎟ 내지 27.99 ㎟ 면적 범위의 정밀-드릴링된 루사이트 팬텀 (precision-drilled Lucite phantom)에 대한 실제 디멘션 (dimension)의 0.5％ 이내였음을 입증하였다 (Schoenhagen et al. 2003, J. Am. Soc . Echocardiogr. 16:277-84; 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함됨). 다수의 관찰자에 의한 측정치의 가변성은 2.9％의 표준편차를 나타내었다.
유도된 IVUS 측정에는 외부 탄성막 (EEM) 면적에서 내강 면적을 뺀 것으로서 아테롬 면적의 계산이 포함되었다. 이미지 단면은 0.5-㎜ 간격으로 수득되었기 때문에, 총 아테롬 용적은 심슨 규칙 (Simpson rule)을 사용하여 평균 아테롬 면적을 ㎜로 나타낸 풀백 길이와 곱한 것으로 계산될 수 있었다. 아테롬 용적 퍼센트는 다음과 같이 계산되었다: (아테롬 면적/EEM 면적)×100 (참조예: Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300). 관상동맥조영법의 분석은 측정 가변성을 감소시키도록 디자인된 표준화된 방법을 사용하여 클리블렌드 클리닉재단 (Cleveland Clinic Foundation)의 코어 실험실 (core laboratory)에서 수행되었다. 혈관조영 카테터 팁의 직경을 그의 공지된 디멘션과 비교하여 시스템을 검정하였다. 혈관조영 평가항목은 기준선으로부터 추적시까지의 평균 관상동맥 내강 직경에 있어서의 변화였다.
57명의 대상체들은 무작위적으로 15 ㎎/㎏의 ETC-216, 45　㎎/㎏의 ETC-216 또는 동등한 용적의 위약을 최대 5까지의 정맥내 용량으로 매 7일마다 투여하였다. 대상체들은 15 ㎎/㎏의 ETC-216, 45 ㎎/㎏의 ETC-216 또는 위약에 대해 2:2:1의 비율로 무작위 분류하였다. 47명의 대상체가 시험을 완료하였다.
15 ㎎/㎏ 용량은 약 50분에 걸쳐서 정맥내로 주입하였으며, 45 ㎎/㎏ 용량은 약 150분에 걸쳐서 정맥내로 주입하였다. 주입속도는 오심의 발생으로 인하여 몇명의 대상체들에 대해서는 증가시켰다. 모든 정맥내 주입은 말초적으로 이루어졌다.
대상체들은 ETC-216에 대한 항체 레벨, 신체검사, 바이탈 사인, 심전도 (EKG) 및 임상적 부작용의 빈도 및 강도를 포함하는 임상실험실적 파라메터에 의해서 모니터되었다. 혈관조영술 및 IVUS는 각각의 환자에 대해서 두번 수행되었다. 첫번째 시기는 초기 스크리닝 방문을 완료한 후이며, 두번째는 시험약물을 최종 투약한 지 약 2주일 (±7일) 후에 행하였다.
양성 결과는 이하의 표 2에 요약한 바와 같이 일차 평가항목에 관하여 수득되었다. 전체 치료그룹 (15 ㎎/㎏ 또는 45 ㎎/㎏ 용량의 ETC-216을 투여한 환자)에서, 아테롬 용적의 평균 (표준편차 또는 SD) 퍼센트에서의 변화는 -1.06％ (3.17％)였다. 중앙값은 -0.81％였다 (95％ CI, -1.53％ 내지 -0.34％; 기준선과 비교하여 p=0.02). 위약그룹의 경우에, 평균 (SD) 변화는 0.14％ (3.09％)였다. 중앙값은 0.03％였다 (95％ CI, -1.11％ 내지 1.43％; 기준선과 비교하여 p-0.97).
표적 관상동맥 절편에서의 아테롬 용적 퍼센트
기준선 추적 기준선으로부터의 변화
치료 그룹 대상체의 수 평균 (SD1) 중앙값 (IQR2) 평균 (SD) 중앙값 (IQR) 평균 (SD) 중앙값 (95％ CI3) P 값4
위약 11 34.80 (8.44) 35.29 (26.99- 39.81) 34.94 (9.74) 33.59 (27.07- 41.09) 0.14 (3.09) 0.03 (-1.11- 1.43) .97
ETC-216 15 ㎎/㎏ 21 39.71 (7.04) 40.55 (34.16- 44.97) 38.42 (6.5) 38.84 (32.78- 42.87) -1.29 (3.48) -1.14 (-2.24- -0.56) .03
ETC-216 45 ㎎/㎏ 15 37.92 (7.83) 41.22 (31.92- 44.10) 37.19 (7.71) 36.62 (32.81- 44.02) -0.73 (2.75) -0.34 (-01.21- 0.43) .45
ETC-216 전체 36 38.96 (7.32) 40.88 (34.01- 44.53) 37.91 (6.95) 38.17 (32.79- 43.53) -1.06 (3.17) -0.81 (-1.53- -0.34) .025
1 표준편차 2 사분위수 범위 3 신뢰구간 4 윌콕슨 부호 순위 검정 (Wilcoxon signed rank test)으로부터 그룹내 비교를 위한 P 값. 공변량으로서 기준선 값과 함께 기준선으로부터의 변화의 등급의 공분산의 분석으로부터 ETC-216, 아포 A-I 밀라노:POPC 조합 대 위약의 그룹-간 비교를 위함, P=0.29. 5 미리 명시된 일차 효능 평가항목
이차 평가항목에 관하여, 이하의 표 3에 제시된 바와 같이 양성 결과가 또한 수득되었다. 기준선과 비교하여, 전체 치료그룹에서 총 아테롬 용적에서의 평균 (SD) 변화는 -14.1 ㎣였다 (39.5 ㎣; 중앙값 -13.3 ㎣; 95％ CI, -20.7 to -7.2; p<0.001). 위약그룹의 경우에, 상응하는 변화는 -2.9 ㎣ (23.3 ㎣)였다. 중앙값은 -2.9 ㎣였다 (95％ CI, -8.6 내지 8.2; p=0.97). 전체 치료그룹의 경우에 최대 아테롬 두께에서 기준선으로부터의 평균 (SD) 변화는 -0.042 ㎜ (0.080 ㎜)였다. 중앙값은 -0.035 ㎜였다 (95％ CI, -0.058 내지 -0.020; p<0.002). 위약그룹의 경우에, 상응하는 변화는 -0.008 ㎜였다 (0.061 ㎜; 중앙값 -0.009 (95％ CI, -0.035 내지 0.026; p= 0.83). 이하의 표 4를 참고로 한다.
표적 관상동맥 절편에서의 총 아테롬 용적
기준선, ㎣ 추적, ㎣ 기준선으로부터의 변화, ㎣
치료 그룹 대상체의 수 평균 (SD) 중앙값 (IQR) 평균 (SD) 중앙값 (IQR) 평균 (SD) 중앙값 (95％ CI) P 값1
위약 11 172.6 (113.2) 149.0 (58.6- 216.5) 169.8 (118.0) 145.1 (58.4- 217.8) -2.9 (23.3) -0.2 (-8.6- 8.2) .97
ETC-216 15 ㎎/㎏ 21 295.5 (166.5) 279.7 (173.6- 370.7) 280.4 (155.6) 265.5 (161.1- 351.6) -15.1 (50.6) -15.0 (-29.6- -4.9) .02
ETC-216 45 ㎎/㎏ 15 230.6 (156.7) 195.8 (90.9- 332.9) 218.0 (145.6) 183.8 (89.4- 311.1) -12.6 (15.3) -12.0 (-20.6- -2.9) .007
ETC-216 전체 36 268.4 (163.5) 263.7 (129.4- 359.3) 254.4 (152.6) 244.8 (131.0- 337.6) -14.1 (39.5) -13.3 (-20.7- -7.2) <0.0012
1 윌콕슨 부호 순위 검정 (Wilcoxon signed rank test)으로부터 그룹내 비교를 위한 P 값. 공변량으로서 기준선 값과 함께 기준선으로부터의 변화의 등급의 공분산의 분석으로부터 ETC-216, 아포 A-I 밀라노:POPC 조합 대 위약의 그룹-간 비교를 위함, P=0.18. 2 미리 명시된 일차 효능 평가항목
표적 관상동맥 절편에서의 평균 최대 아테롬 두께
기준선, ㎜ 추적, ㎜ 기준선으로부터의 변화, ㎜
치료 그룹 대상체의 수 평균 (SD) 중앙값 (IQR) 평균 (SD) 중앙값 (IQR) 평균 (SD) 중앙값 (95％ CI) P 값1
위약 11 0.649 (0.317) 0.683 (0.402- 0.846) 0.641 (0.332) 0.584 (0.392- 0.827) -0.008 (0.061) -0.009 (-0.035- 0.026) .83
ETC-216 15 ㎎/㎏ 21 0.815 (0.194) 0.830 (0.683- 0.953) 0.771 (0.168) 0.824 (0.646- 0.865) -0.044 (0.094) -0.049 (-0.079- -0.015) .03
ETC-216 45 ㎎/㎏ 15 0.738 (0.280) 0.792 (0.531- 0.992) 0.699 (0.269) 0.758 (0.457- 0.963) -0.039 (0.059) -0.029 (-0.056- -0.007) .02
ETC-216 전체 36 0.783 (0.233) 0.816 (0.578- 0.963) 0.741 (0.216) 0.814 (0.552- 0.895) -0.042 (0.080) -0.035 (-0.058- -0.020) <0.0012
1 윌콕슨 부호 순위 검정 (Wilcoxon signed rank test)으로부터 그룹내 비교를 위한 P 값. 공변량으로서 기준선 값과 함께 기준선으로부터의 변화의 등급의 공분산의 분석으로부터 ETC-216, 아포 A-I 밀라노:POPC 조합 대 위약의 그룹-간 비교를 위함, P=0.23. 2 미리 명시된 일차 효능 평가항목
결과는 ETC-216이 플라크 크기를 감소시키는데 효과적임을 나타내었다. 아테롬성동맥경화증의 통계학적으로 유의적인 퇴행은 두가지 치료그룹 모두에서 입증되었다.
실시예 3: 생체외 랑겐도르프 (Ex vivo Langendorff )
본 실시예는 재관류 단리된 허혈성 토끼 심장에서 예방적 ETC-216의 심장보호 효과를 입증한다. 챨스 리버 (Charles River)로부터 수득된 체중 약 2-3 ㎏의 수컷 뉴질랜드 흰토끼를 본 시험에서 사용하였다. 수컷 뉴질랜드 흰토끼가 본 시험의 목적을 위한 적절한 시험 시스템으로서 선택되었다. 단리된 허혈성-재관류 토끼 심장은 인간 심근경색의 모델이다. 도착시에 동물은 독특한 확인번호를 지정하였다.
동물은 미시간 대학의 동물 사용 및 보호 위원회 (University of Michigan Committee on the Use and Care of Animals)의 지침에 따라서 스테인레스 스틸 케이지에 수용하였다. 수의과적 보호는 미시간 대학의 실험실 동물의약을 위한 유니트 (Unit for the Laboratory Animal Medicine)에 의해서 제공되었다. 미시간 대학은 미국 실험동물 건강 보호 인가협회 (American Association of Accreditation of Laboratory Animal Health Care)에 의해서 승인되었으며, 동물 보호 사용 프로그램은 실험동물의 보호 및 사용을 위한 가이드에서의 표준 (DHEW (NIH) Publ. No. 86-23)에 따른다.
ETC-216은 1:1 중량비로 된 재조합 아포리포프로테인 A-I 밀라노/1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린 복합체이다. ETC-216의 원액은 슈크로즈 만니톨 완충제 중에 14 ㎎ 단백질/㎖를 함유하였다. 슈크로즈-만니톨 완충제는 크렙스-헨셀라이트 완충제 (Krebs-Henseleit buffer)와 비화합성이기 때문에, 그리고 만니톨 단독인 경우의 어떤 독립적인 영향에 대해서도 조절하기 위해, ETC-216을 투석하여 4 mM 나트륨 포스페이트 중의 2％ 글루코즈로 구성된 백그라운드 (background) 완충제 (pH 7.4)를 수득하였다. ETC-216은 크렙스-헨셀라이트 완충제로 희석하여 0.45 ㎎/㎖의 약물 농도를 수득하였다. 비히클은 유사하게 희석하였다.
용량 선택은 에스페리온의 인간 I상 (Esperion's Human Phase I) 단일 용량 안전성 임상실험에서 사용된 용량에 대한 역사적 데이타를 기준으로 하였으며, 여기에서는 100 ㎎/㎏ 이하 용량의 ETC-216을 인간에게 투여하였다. 이러한 프로토콜에서 개략적으로 나타낸 시험의 경우에, 0.5 ㎎/㎖의 농도는 대략, 인간에게 투여된 25 ㎎/㎏의 정맥내 용량에 상응한다.
실험은 토끼 심장을 관류시키기 위해 랑겐도르프 장치를 사용하여 수행하였다. 토끼는 경부 탈구시켜 무의식 상태가 되도록 하고, 심장을 신속하게 제거하여 대동맥을 통한 관류를 위해서 캐눌라 (cannula)에 부착시켰다. 관류 매질은 95％ O2/5％ CO2의 혼합물에 연속적으로 노출되고, 20-25 ㎖/분의 일정한 속도로 송달되는 순환 크렙스-헨셀라이트 완충제 (pH 7.4, 37℃; "KH")로 구성되었다. 심장은 프로토콜 전체에 걸쳐 우심방에 부착된 전극을 통해서 조율되었다. 조율성 자극은 실험실 방형파 발생기 (laboratory square wave generator) (생리학적 조율 10％ 이상, 1 msec 기간, 그라스 (Grass) 588, Quincy, MA)로부터 송달되었다. 폐동맥은 실라스틱티엠 배관 (SilasticTM tubing)에 의해서 캐눌라를 삽입하여 관상정맥동으로의 관상정맥 복귀를 나타내는 폐동맥 유출물의 수집을 촉진시켰다. 상대정맥과 하대정맥 및 폐정맥을 결찰하여 다른 식으로 절단된 혈관으로부터의 관류액의 손실을 방지하였다. 좌심실 배액관, 서미스터 프로브 (thermistor probe), 및 라텍스 풍선 (latex balloon)을 좌심방을 통해서 삽입하여, 좌심실 내에 배치시켰다. 체액 충진된 라텍스 풍선을 강성 배관 (rigid tubing)에 의해서 밀러 카테터 압력변환기 (Miller Catheter pressure transducer)에 연결하여 좌심실 발생 압력의 측정이 가능하도록 하였다. 심실내 풍선을 증류수로 팽창시켜 약 10 ㎜Hg의 초기 기준선 좌심실 확장말기 압력을 수득하였다. 관상동맥 관류압은 대동맥 캐눌라의 사이드-암 (side-arm)에 연결된 압력변환기로 측정하였다. 관상동맥 관류의 속도는 일정하게 유지되었기 때문에, 관상동맥 관류압에 있어서의 변화는 관상동맥 저항성에 있어서의 변화의 지표로 작용하였다. 모든 혈류역학적 변수는 폴리뷰 소프트웨어 데이타 획득 시스템 (Polyview Software Data Acquisition System)에 접속되어 있는 그래스 폴리그라프 (Grass Polygraph) 79D (Quincy, MA)와 같은 멀티채널 기록계를 사용하여 계속해서 모니터되었다. 심장은 심장을 온도 조절된 이중 내강 유리챔버에 봉입시키고 가열된 저장소와 송달 시스템을 통해서 관류매질을 통과시킴으로써 실험기간 전체에 걸쳐서 37℃에서 유지되었다.
실험과정을 위해서 이하에 나타낸 바와 같은 두개의 처치그룹을 사용하였다.
그룹 처치 시험물질 농도 (㎎/㎖)
1 허혈증 및 재관류 비히클 0
2 허혈증 및 재관류 ETC-216 0.45
심장은 도 5에 나타낸 바와 같이 실험적으로 처리하였다. 단리된 심장은 전체 허혈을 유도하기 전에 20분 동안 정상산소 (normoxic)(산소의 정상 레벨) 조건 하에서 안정화시켰다. 이 기간의 처음 10분 동안, 심장은 KH 완충제에만 노출시키고, 그 후에 추가로 10분 동안은 비히클 (그룹 1) 또는 ETC-216 (그룹 2)을 함유하는 KH 완충제에 노출시켰다. 그 후, 심장을 30분의 허혈증 기간에 이어서 비히클 (그룹 1) 또는 ETC-216 (그룹 2)을 함유하는 KH 완충제에 의한 60분의 재관류 기간에 적용하였다. 총 전체 허혈증의 유도는 심장에 대한 관류액의 흐름을 중지시킴으로써 이루어졌으며, 심장의 재관류는 펌프를 가동시켜 원래의 유속을 회복시킴으로써 이루어졌다.
폐동맥 유출액의 분취량을 모든 그룹의 심장으로부터 기준선에 (전-허혈증), 그리고 일차적으로 5분까지는 매 분마다, 그 후 재관류 기간 중에는 매 5분마다 수집하였다. 유출액은 크레아틴 키나아제 농도 (도 6) 및 조직 손상지수에 대하여 분석하였다. 크레아틴 키나아제는 비가역적으로 손상된 세포로부터 방출된 사이토솔 효소이다. 심장 기능은 연속적으로 모니터되었다 (도 7).
심장 평가항목 측정은 다음에 대하여 이루어졌다:
1-부정맥의 존재 또는 부재에 대하여 검출하기 위한 심전도-심박수 (조율됨);
2-좌심실 발생 압력 (도 8) (데이타는 각각의 그룹에서 심장의 지정된 수에 대한 평균±평균의 표준오차로 나타내었다);
3-좌심실 dP/dt
4-좌심실 확장말기압 (도 9) (데이타는 각각의 그룹에서 심장의 지정된 수에 대한 평균±평균의 표준오차로 나타내었다);
5-관상동맥 관류압 (도 10) (데이타는 각각의 그룹에서 심장의 지정된 수에 대한 평균±평균의 표준오차로 나타내었다);
6-재관류 전 및 후의 조직 크레아틴 키나아제 방출을 측정하기 위한 림프관 배액 (lymphatic drainage)의 수집 (도 6).
실험적 프로토콜의 마지막에, 각각의 처치그룹으로부터 5개 이하의 심장으로부터 수득한 심장 조직생검을 즉시 액체 질소 내에 액침시키고, 후속 액체 하이드로퍼옥사이드 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 균질액 (homogenate) 샘플은 리피드 퍼옥사이드에 대한 분석을 수행하기 전에 단백질 함량에 대하여 표준화시켰다 (도 11). ETC-216은 본 실시예에서 심장 리피드 하이드로퍼옥사이드를 46％만큼 감소시켰다.
지정된 프로토콜이 완료되면, 각각의 그룹으로부터 두 개의 심장을 3분 동안 0.1 M 나트륨 칼토딜레이트 완충제 (pH 7.4) 중의 2.5％ 글루타르알데히드 및 1％ LaCl3로 관류시켰다. 정상조건 하에서 고삼투압친화성 LaCl3는 혈관벽에 결합된 혈관열공 내에 유지되며, 혈관 완전성 (integrity)의 지표로서 제공된다. 혈관외 공간 내로의 LaCl3의 유출을 사용하여 혈관 손상의 존재를 나타내었다. 좌심실 심근층으로부터 조직 샘플을 분리하여 한 면 상에서 약 1 ㎜ 크기의 절편으로 절단하였다. 샘플은 상기 언급된 완충제 중에서 4℃에서 추가로 2시간 동안 고정시켰다. 그 후에, 샘플을 에탄올 시리즈 중에서 탈수시키고, EM 베드-812 (Electron Microscopy Sciences, Ft, Washington, PA)에 포매시켰다. 조직 블록 (bloc)을 라이헤르트 울트라마이크로톰 (Reichert ultramicrotome)으로 절단하고, 포름바 (formvar)-코팅된 구리 그리드 상에 배치시키고, 이어서 4％ 유라닐 아세테이트로 염색하였다. 단면을 필립스 (Phillips) CM-10 전자현미경으로 관찰하였다.
투과전자현미경을 사용하여 시험그룹 각각으로부터의 심근 검체를 검사하였다. 이미지는 비히클-처리된 심장의 근절 구조적 특징이 소실되고, 구축 밴드 (contracture band)가 존재함을 나타내었다. 미토콘드리아는 붕괴된 크리스탈 및 고삼투압친화성 봉입체에 의해서 현저하게 팽윤된다. ETC-216 처리된 심장에서, 근절 구조는 비교적 정상적이며, 미토콘드리아는 단지 최소의 팽윤을 가지고 온전한 상태이다. 구축 밴드의 실질적인 부재가 대조 심장에서 관찰되는 것과 명백하게 대비되는 것이다. 구축 밴드 괴사를 방지하는 ETC-216의 능력은 ETC-216에 의해서 전처리된 심장이 재관류시에 LVEDP에서 증가를 나타내지 않았다는 관찰결과와 일치하는 것이다. 구축 밴드 괴사와 LVEDP의 지속적인 증가 둘 다는 세포내 칼슘 과부하 (overload) 및 비가역적인 세포 손상과 연관된다. Z-밴드의 근원섬유 오염의 존재, 및 근원섬유 구조의 붕괴는 광범한 손상을 나타내는 것이다. 그 밖의 예상되는 형태학적 손상에는 미토콘드리아의 붕괴된 크리스타와 매트릭스, 및 미토콘드리아 내의 큰 전자 농염체 (dense body)가 포함되었다. 두 가지 현미경사진에서 배율은 7900×이었다 (도 12).
크레아틴 키나아제 농도의 분석 (도 6)은 정맥성 유출물 내로의 효소 방출의 고속상은 재관류의 시기에 나타나는 것을 시사하였다. 대조 심장 (비히클로 처리됨)은 ETC-216 처리된 심장에 비해서 크레아틴 키나아제의 현저한 방출을 나타내었다. 또한, ETC-216 처리된 심장은 감소된 좌심실 확장말기압 (도 7 및 9), 상승된 좌심실 발생 압력 (도 8), 저하된 관상동맥 관류압 (도 10) 및 저하된 액체 하이드로퍼옥사이드 (LHP) (도 12)를 나타내었다. 또한, ETC-216은 심근층에서의 형태학적 변화에 대해서 보호하였다 (도 12). 이들 결과는 허혈성 발작 전에 투여한 경우의 ETC-216의 심장보호성 효과를 입증한다.
실시예 4: LAD 폐색- 재관류된 토끼 심장에서 100 ㎎/㎏에 의한 급성 및 만성 투여
본 실시예는 국소적 심근허혈 및 재관류의 생체내 모델에서의 ETC-216의 심장보호효과를 입증하는 것이다. 수컷 뉴질랜드 흰토끼는 심장에 대한 측부 혈액공급이 결여되어 있어서 심근 혈류 측정을 사용하는 것을 불필요하게 만들기 때문에, 이것이 적절한 시험 시스템으로 사용되었다. 본 시험에서, 상이한 투약 레지멘이 관상동맥 결찰 및 재관류에 의한 30분의 국소적 심근허혈에 적용된 토끼의 상이한 그룹에서 사용되었다. 두가지 투약 레지멘이 사용되었다. 첫번째 프로토콜에서는, ETC-216을 단일 전처리로 시험하였으며, 여기에서는 심장을 국소 허혈의 발현이 있기 직전에 100 ㎎/㎏의 약제에 노출시키는 반면에, 두번째 프로토콜에서는 국소 허혈의 발현의 하루 전 및 직전에 두번의 100 ㎎/㎏ 전처리를 투여하였다. 이들 프로토콜은 도 13에 나타내었다. 본 시험은 토끼 심장을 30분의 기간 동안 국소 심근허혈에 적용시키고 이어서 최소 4시간 동안 재관류에 적용시키는 생체내 시험에서 심장보호제로서의 ETC-216의 효과에 중점을 두었다. 본 실시예는 ETC-216이 허혈성 발작 후에 투여되는 경우에 심장보호제임을 입증하는 것이다.
본 시험에서 사용된 방법은 미시간 대학의 동물 사용 및 보호 위원회 (University of Michigan Committee on the Use and Care of Animals)의 지침에 따른다. 수의과적 보호는 미시간 대학의 실험실 동물의약을 위한 유니트 (Unit for the Laboratory Animal Medicine)에 의해서 제공되었다. 미시간 대학은 미국 실험동물 건강 보호 인가협회 (American Association of Accreditation of Laboratory Animal Health Care)에 의해서 승인되었으며, 동물 보호 사용 프로그램은 실험동물의 보호 및 사용을 위한 가이드에서의 표준 (DHEW (NIH) Publ. No. 86-23)에 따른다.
챨스 리버 (Charles River)로부터 수득된 체중 약 2-3 ㎏의 수컷 뉴질랜드 흰토끼를 본 시험에서 사용하였다. 도착시에 동물은 독특한 확인번호를 지정하였다. 토끼는 크실라진 (3.0 ㎎/㎏) 및 케타민 (35 ㎎/㎏)의 혼합물을 근육내 투여하고, 이어서 나트륨 펜토바르비탈 용액 (30 ㎎/㎖)을 정맥내 주사함으로써 마취시켰다. 마취상태는 펜토바르비탈 용액 (30 ㎎/㎖)을 정맥내 주사함으로써 유지시켰다. 커프처리된 (cuffed) 기관내 튜브를 삽입하고, 동물을 실내 공기에 의한 양압 환기 상태로 유지시켰다. 우경정맥을 단리하고, ETC-216 또는 동등한 용량의 비히클을 투여하기 위해서 캐눌라를 삽입하였다. 우경동맥을 단리하고, 대동맥 혈압을 모니터하고 압력 펄스 (pulse)의 유도된 첫번째 유도체 (dP/dt)를 수득하기 위해서 대동맥판 바로 위에 배치된 밀라르티엠 카테터 마이크로팁 (MillarTM catheter micro-tip) 압력 변환기의 기기를 장치하였다. 실험의 전과정을 통해서 유도 (lead) II 심전도를 모니터하였다. 좌측 흉강절개술 및 심낭절개술을 수행하고, 이어서 좌전하행 (left anterior descending; LAD) 관상동맥을 식별하였다. 실크 봉합사 (3.0; Deknatel, Fall River, MA)를 동맥의 뒤를 통과시키고, 봉합사의 양 말단을 짧은 길이의 폴리에틸렌 배관 내에 삽입하였다. 봉합사의 자유 말단 상에는 상향 장력을 가하면서 폴리에틸렌 튜브 상의 하향 압력은 원 관상동맥을 압축시켜 혈관의 폐색 및 국소 심근허혈을 야기시킨다. 폐색은 30분 동안 유지시켰으며, 그 후에 봉합사에 대한 장력을 해지시키고 폴리에틸렌 배관을 이탈시켜 재관류가 일어나도록 하였다. 국소 심근허혈은 폐색된 혈관의 분포 영역에서의 부위의 존재에 의해서, 그리고 경벽 국소 심근허혈의 존재와 일치하는 심전도에서의 변화 (ST-절편 상승)에 의해서 입증되었다.
주요 평가항목 측정은 좌심실의 퍼센트로서, 및 위험이 있는 영역의 퍼센트로서 경색 크기를 측정하는 것으로 구성되었다 (도 14 및 15). 시험의 종료시에, 마취된 상태의 토끼에게 헤파린 (1,000 U, 정맥내)을 투여하고, 그 후에 이들을 안락사시켰다. 심장을 절제한 다음에, 랑겐도르프 장치 상에서 대동맥을 통해서 22-24 ㎖/분의 일정한 유속으로 크렙스-헨셀라이트 완충제로 재관류되도록 준비하였다. 심장을 10분 동안 완충제로 세척하여 조직이 깨끗하도록 하였다. 45 ㎖의 포스페이트 완충제 (pH 7.4) 중의 트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC) 1％ 용액을 심장을 통해서 관류시켰다. TTC는 위험이 있는 영역 내에서 비-경색 심근층을 붉은벽돌색으로 구분함으로써 생존가능한 심근조직에 존재하는 조효소에 의한 TTC의 환원으로부터 생성된 포르마잔 침전물의 존재를 시사한다. 사이토솔성 데하이드로게나제가 결여된 비가역적으로 선상된 조직은 포르마잔 침전물을 형성할 수 없으며, 연한 황색을 나타낸다. 좌전하행 (LAD) 동맥은 국소 심근허혈의 유도 중에 결찰된 영역과 동일한 위치에서 결찰되었다. 관류펌프를 중지시키고, 2 ㎖의 에반스 블루 0.25％ 용액을 대동맥 캐눌라에 연결된 사이드-암 포트를 통해서 서서히 주입하였다. 염료를 10초 동안 심장을 통해서 통과시켜 염료의 균일한 분포를 보장하였다. 에반스 블루의 존재를 사용하여 위험 부위에 반대되는 것으로 국소 허혈을 일으키지 않은 좌심실 조직을 구분하였다. 심장을 관류장치로부터 분리하고, 수직축에 대해서 오른쪽에서 비스듬히 횡단면으로 절단하였다. 우심실, 아펙스 (apex), 및 동맥 조직은 폐기되었다. 각각의 횡단면의 양 표면은 깨끗한 아세테이트 쉬트 상에서 추적되었다. 이미지를 복사하고 확대시켰다. 복사물은 아도베 포토샵 (Adobe PhotoShop; Adobe Systems Inc., Seattle, WA)으로 스캐닝하고 다운로드하였다. 정상 좌심실 (NLV) 비-위험 부위, 위험 부위 및 경색의 면적은 아도베 포토샵 소프트웨어를 사용하여 각각의 영역을 점유하는 픽셀의 수를 계산함으로써 측정된다. 총 위험 영역은 좌심실의 백분율로서 표현된다. 경색 크기는 위험 영역 (ARR)의 백분율로서 표현된다 (도 14 및 15).
ETC-216 (100 ㎎/㎏) 또는 동등한 용적의 비히클로 1회 처리 (즉, 급성 처리) 또는 2회 처리 (즉, 만성 처리)된 토끼에서 위험 영역의 경색 퍼센트, 좌심실의 경색 퍼센트, 및 좌심실의 위험 영역 퍼센트를 나타내었다. 데이타는 그룹당 n=6 동물에 대한 평균±평균의 표준오차이다. 도 14에서 별표는 각각의 대조군으로부터의 유의적인 차이를 나타내는 것이다.
그 밖의 다른 평가항목 측정이 이루어졌다. 궁극적인 경색 크기는 심근 산소 이용에 있어서의 증가 또는 감소에 의해서 영향을 받을 수 있다. 심근 산소 보상의 두가지 중요한 결정인자는 심박수 및 압력 부하 (pressure load)이다. 심박수-압력 곱 (심박수 × 평균 동맥 혈압)은 심장에 의한 심근 산소 필요량의 변화의 근사치를 제공한다. 따라서, 심박수-압력 곱을 계산하여 경색 크기에서의 관찰된 감소가 심박수-압력 곱의 변화와 연관되는지 여부를 결정하였다. 심박수와 평균 동맥압은 실험 프로토콜 전체에 걸쳐서 연속적으로 모니터되었으며, 이 데이타를 사용하여 실험그룹 각각에 대한 시험에서 특정한 시험에서의 심박수-압력 곱을 계산하였다.
좌심실의 위험 영역 퍼센트는 급성 및 만성 처리 둘 다의 경우에 대조군에 비해서 ETC-216 처리된 심장에서 감소하였지만, 결과는 통계학적으로 유의적이지 않았다. 위험 영역의 경색 퍼센트 및 좌심실의 경색 퍼센트는 급성 및 만성 처리 둘 다의 경우에 대조군에 비해서 ETC-216 처리된 심장에서 유의적으로 감소하였다. 이들 결과는 ETC-216이 급성적으로 및 만성적으로 투여되는 경우에 모두 심장보호적임을 나타내는 것이다.
위험 및 비-위험 부위에서 심근조직의 크레아틴 키나아제 활성이 비교될 수 있다. 측정검사의 원리는 NAD의 NADH로의 동몰 환원의 결과인 340 ㎚에서의 반응혼합물의 흡광도 증가를 기준으로 한다. 흡광도 변화율은 크레아틴 키나아제 활성에 대하여 정비례한다. 1 유니트는 측정검사 방법의 조건 하에서 분당 1 마이크로몰의 NADPH를 생성하는 효소의 양으로 정의된다.
재관류가 없이 장기간의 혈류 결핍에 적용된 심근 조직은 염증세포의 존재와 함께 괴사의 특징적인 형태학적 변화를 겪을 수 있다. 허혈-유도된 세포사멸의 형태학적 외관은 재관류의 결과로 나타나는 것과는 상이하다. 후자는 구축 밴드를 특징으로 하며, 구축 밴드 괴사로 불린다. 각각의 그룹으로부터의 심장 조직은 전자현미경에 의한 검사를 위해서 보존 및 준비되었다.
허혈성 재관류 손상은 위험 영역에서의 염증세포, 주로 호중구의 축적과 연관된다. 마이엘로퍼옥시다제 (MPO)는 호중구 내에 거의 독점적으로 존재하는 효소이다 (Liu et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 287:527-537, 1998). 따라서, 심장의 각각의 부위로부터의 조직은 손상의 지표로서 MPO 활성에 대하여 측정검사될 수 있는 것으로 예상된다. 또한, 염증반응을 감소시킬 수 있는 개입은 비-처리된 동물의 위험 부위로부터의 심장 조직과 비교하는 경우에 재관류된 위험 부위에서 MPO 활성의 감소와 연관될 수 있는 것으로도 예상된다. 즉, MPO 활성에서의 변화 퍼센트 (위험 부위/비-위험 부위)는 비히클 처리된 대조 심장에 비해서 약물-처리된 심장에서 감소될 수 있다.
실험의 종료시에, 조직 마이엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성은 예비의 조절되지 않은 비-인증된 측정검사에서 측정될 수 있다. 심장 조직 샘플은 위험 부위 및 비-위험 부위로부터 수득되었으며, 0.5％ 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드 내에서 균질화시키고 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제 (pH 6.0)에 용해시켰다 (또한, 참조 Liu et al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 287:527-537). 균질액은 4℃에서 12.500 g으로 30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 수집하여 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제 (pH 6.0) 중의 0.167 ㎎/㎖ o-디애니시딘 디하이드로클로라이드 (Sigma) 및 0.0005％ H2O2와 반응시켰다. 흡광도의 변화는 460 ㎚에서 분광광도법에 의해서 측정하였다. 1 유니트의 MPO는 25℃에서 분당 1 mmol의 H2O2를 가수분해시키는 효소의 양으로 정의되었다. 본 명세서에 제시되지는 않았지만 이 예비실험으로부터의 결과는 허혈성 재관류 손상의 관점에서 ETC-216 및 비히클 처리된 심장 사이에 차이는 없는 것으로 나타난 것으로 보이지만, 이 결과는 예를 들어, 허혈성 재관류 손상 이전의 MPO 레벨을 비교함으로써는 아직 인증되지 않았다.
감소된 위험 영역의 경색 퍼센트 및 좌심실의 경색 퍼센트에 의해서 입증되는 바와 같이, ETC-216 처리된 심장은 허혈성 재관류 손상으로부터 보호되었다. 심장보호는 두가지 투약 프로토콜, 즉 허혈증의 발현 전에 100 ㎎/㎏ 단일 용량으로 투여된 ETC-216 또는 100 ㎎/㎏ 2회 용량으로 투여된 ETC-216 (한번의 용량은 허혈증 하루 전에 투여되고, 두번째 용량은 허혈증 직전에 투여된다) 둘 다에 의해서 제공되었다.
실시예 5: LAD-폐색된 재관류 토끼 심장에서 급성 투여를 위한 최소 유효량의 결정
본 실시예는 국소 허혈증의 발현 직전에 단일 전처리 방법으로 투여되는 경우의 ETC-216의 다양한 용량의 예방적 효능을 입증하는 것이다. 실시예 2에서의 시험은 토끼 심장을 30분의 기간 동안 국소 심근허혈에 적용시키고 이어서 최소 4시간의 재관류를 적용한 생체내 시험에서 심장보호제로서의 ETC-216의 효과에 촛점을 맞춘 것이었다. 두가지 투약 레지멘이 사용되었다. 첫번째 프로토콜에서, ETC-216은 대순환을 국소 허혈증의 발현 직전에 100 ㎎/㎏의 약제에 노출시키는 단일 전치료로서 시험되었으며, 그 반면에 두번째 프로토콜에서는 국소 허혈증의 발현 전 (1일 전 및 직전)에 2회의 100 ㎎/㎏ 전처리를 투여하였다. 두가지 레지멘 모두는 100 ㎎/㎏의 ETC-216에 의한 1회 또는 2회 처리가 심장보호성임을 나타내었다.
따라서, ETC-216은 심장을 국소 허혈증의 발현 직전에 단일 용량의 약제 또는 동등한 용적의 비히클에 노출시키는 단일 전처리 방법으로 시험되어 심장보호에 대한 효과를 결정하였다. 심장은 실시예 2에서 사용된 것과 동일한 방법에 의해서 분석되었다. 또한, 이 프로토콜은 허혈증으로부터의 보호를 위해서 토끼 심장을 처리하는 ETC-216의 최소 유효량을 찾아내도록 디자인되었다.
ETC-216의 최소 유효량을 찾아내기 위해서는, 도 16에 나타낸 바와 같이 동물에게 10, 3 또는 1 ㎎/㎏의 ETC-216 또는 동등한 용적의 비히클로 단일 처리하는 급성 처리를 위한 동일한 프로토콜 (참조: 도 13)이 사용되었다. 10 ㎎/㎏ 치료그룹의 경우에 총 좌심실의 퍼센트로 표현되는 위험 영역 (AAR) 또는 허혈성 부위는 대조그룹 및 처리그룹에서 유사하였다 (도 17). 10 ㎎/㎏의 ETC-216으로 처리된 토끼는 비히클로 처리된 토끼와 비교한 AAR의 퍼센트로서 표현된 경색을 더 작게 (p < 0.0005) 나타내었다 (도 18). 심근경색 크기에서의 감소 (p < 0.0001)는 데이타를 총 좌심실의 퍼센트로서 표현하는 경우에도 또한 관찰되었다 (도 17).
유사한 결과는 3 ㎎/㎏의 용량에 의해서 관찰되었다. 총 좌심실의 퍼센트로서 표현된 AAR은 ETC-216-처리 및 비히클-처리된 그룹에서 유사하였다 (도 17). 3 ㎎/㎏ ETC-216으로 처리된 토끼는 비히클로 처리된 토끼와 비교한 위험 영역의 퍼센트로서 표현된 경색을 더 작게 (p < 0.05) 나타내었다 (도 17). 심근경색 크기에서의 감소 (p < 0.05)는 데이타를 총 좌심실의 퍼센트로서 표현하는 경우에도 또한 관찰되었다 (도 17).
좌심실의 퍼센트로 표현한 경우에 1 ㎎/㎏의 용량에서 ETC-216과 비히클 사이에는 AAR의 크기에 있어서 유의적인 차이가 나타나지 않았다 (도 17). 1 ㎎/㎏에서는, AAR의 퍼센트 (도 17), 및 총 좌심실의 퍼센트로 표현된 심근경색 크기 (도 17)에 있어서 그룹들 사이에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
4개의 급성 처리그룹 (즉, 100, 10, 3 및 1 ㎎/㎏) 각각 및 그들의 각각의 대조군으로부터 수득한 데이타의 요약은 도 17에 나타내었다. 경색의 AAR은 4개의 그룹 각각에서 유사하였다. 4가지 투약 레지멘 중에서, 위험 부위의 퍼센트로 표현하든 또는 좌심실의 퍼센트로서 표현하든 경색 크기는 각각의 대조군과 비교하여 100, 10 및 3 ㎎/㎏의 ETC-216 용량에 의해서 감소되었다. 이와는 반대로, 1 ㎎/㎏를 투여한 동물의 그룹에서의 경색 크기는 각각의 비히클-처리된 그룹에서 관찰된 것과 상이하지 않았다.
도 18은 리포프로테인 비에스테르화된 콜레스테롤에서의 일시적인 변화의 예를 나타낸 것이다. 혈액 샘플은 1, 3, 10 또는 100 ㎎/㎏의 ETC-216 또는 비히클의 투여 직전에 및 투여 후에 주기적으로 토끼로부터 수득하였다. 혈청 리포프로테인이 온-라인 비에스테르화 콜레스테롤 분석과 함께 겔-여과 크로마토그라피에 의해서 크기를 기준으로 분리되는 대표적인 일시적 혈청 샘플에서 수득된 비에스테르화 콜레스테롤 프로필을 나타내었다. 정맥내로 투여된 ETC-216 시험약제 내에 비에스테르화 콜레스테롤이 실질적으로 부재함에도 불구하고, ETC-216을 투여한 지 45분 후에, 특히 100 ㎎/㎏에서 고밀도 콜레스테롤 비에스테르화 콜레스테롤에서의 상승 또는 10 ㎎/㎏에서는 더 적은 정도의 상승이 나타났다. 또한, 10 ㎎/㎏ 또는 100 ㎎/㎏ ETC-216을 투여한 지 210 및 270분 후에 매우 저밀도 리포프로테인 비에스테르화 콜레스테롤에 있어서 지연된 현저한 상승이 나타났다. 또한, 리포프로테인 비에스테르화 콜레스테롤에서의 변화는 평가된 시점에서 3 ㎎/㎏ ETC-216 처리용량으로는 명백하지 않은 것으로 나타났지만, 이 용량은 도 17에서 나타낸 바와 같이 심장보호성이었다.
이 결과는 100 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 및 3 ㎎/㎏ 용량이 ETC-216의 효과적인 예방적 용량임을 입증한다.
실시예 6: ETC-216은 폐색된- 재관류 토끼 심장에서 LAD 폐색의 발현 후에 투여되는 경우에 허혈-재관류 손상을 예방한다.
본 실시예는 허혈성 또는 폐색성 발작이 일어난 후에 투여된 경우에 허혈성 재관류 손상을 예방 또는 감소시키는 ETC-216의 효능을 입증하는 것이다. 실시예 2 및 3에서의 시험은 허혈증의 발현 전에 심장 근육을 치료하는 예방적 효과를 예시하는 것이다. 따라서, ETC-216이 허혈증이 발현한 후에 심장 근육을 보호할 수 있는지 여부를 측정하기 위해서, LAD는 시험약제 또는 비히클을 투여하기 전에 폐색되었다. 이 프로토콜에서 ETC-216은 심장을 국소 허혈증의 마지막 5분 동안 투여되고 재관류의 처음 55분에 걸쳐서 계속되는 10 ㎎/㎏의 약제 또는 동등한 용적의 비히클에 노출시키는 단일 전처리 방법으로 시험하였다 (도 19). 10 ㎎/㎏ 처리그룹의 경우에 총 좌심실의 퍼센트로서 표현된 AAR 또는 허혈성 부위는 대조군에서 유사하였다 (도 20). ETC-216으로 처리된 토끼는 비히클로 처리된 토끼에 비해서 AAR의 퍼센트로 표현된 경색을 더 작게 (p < 0.001) 나타내었다 (도 20). 심근경색 크기에 있어서의 감소 (p < 0.0005)는 데이타를 총 좌심실의 퍼센트로 표현하는 경우에도 관찰되었다 (도 20).
본 실시예는 허혈성 발작 후에 투여된 단일 처리가 허혈성 재관류 손상을 완화시키거나 감소시키는 것을 입증한다.
본 발명의 다양한 구체예가 기술되었다. 설명 및 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 것이며, 제한적인 것은 아니다. 실제로, 본 발명의 의의 또는 후술하는 첨부된 특허청구의 범위의 범위를 벗어나지 않으면서 기술된 발명의 다양한 구체예에 대한 변형이 이루어질 수 있음을 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 각각의 거명을 통해 그 전문이 본원에 포함된 것으로 한다.
도 1은 정상 남성 대상체에서 혈청 HDL에 대한 단일 용량의 ETC-216의 급성 효과를 제공한 것이다.
도 2(A)는 원위 기준 브랜치 (distal fiduciary branch)(부위 C)에서 시작하여 근위 브랜치 (proximal branch)(부위 A)에서 끝나는 IVUS 이미지 카테터 (imaging catheter)의 동력화된 풀백 (pullback)을 제공한다. 카테터의 경로는 혈관조영사진으로 나타낸다.
도 2(B)는 근위 브랜치에 도달할 때까지 매 0.5 ㎜마다 수득된 혈관의 대표적인 단면도를 제공한다.
도 2(C)는 혈관의 중간 단면도를 제공한다.
도 2(D)는 IVUS 이미지에서의 원위 브랜치를 제공한다.
도 3(A)는 분석을 위한 단면도를 제공한다.
도 3(B)는 외탄력막 (EEM)을 제공한다.
도 3(C)는 내강 (lumen) 영역을 제공한다.
도 3(D)는 EEM의 영역으로부터 내강의 단면적을 빼어줌으로써 측정된 최대 아테롬 두께의 계산을 제공한다.
도 4(A)는 ETC-216을 투여하기 전의 환자에서 혈관의 기준 이미지를 제공한다.
도 4(B)는 ETC-216을 투여한 후의 환자에서 혈관의 추적 이미지를 제공한다.
도 5는 단리된 토끼 심장을 허혈증이 발현하기 전에 비히클 또는 본 발명의 단백질/리피드 복합체 (ETC-216)로 처리하는 프로토콜의 예를 제공한다.
도 6은 관상 정맥 유출물에서의 크레아틴 키나아제 활성을 제공한다.
도 7은 랑겐도르프 장치 (Langendorff Apparatus)에서 비히클 및 ETC-216 처리된 단리된 토끼 심장으로부터 수집된 심장 기능의 실시간 모니터링 (monitoring)을 제공한다.
도 8은 30분의 전체 허혈성 정지 및 60분의 재관류 전, 중 및 후에 단리된 토끼 심장에서의 좌심실 발생 압력 (LVDP)의 일시적 변화를 제공한다.
도 9는 30분의 전체 허혈성 정지 및 60분의 재관류 전, 중 및 후에 단리된 토끼 심장에서의 좌심실 확장말기압 (LVEDP)의 일시적 변화를 제공한다.
도 10은 30분의 전체 허혈성 정지 및 60분의 재관류 전, 중 및 후에 단리된 토끼 심장에서의 관상동맥 관류압의 일시적 변화를 제공한다.
도 11은 30분 동안 전체 허혈성 정지를 일으키고, 이어서 60분 동안의 재관류를 일으킨 비히클 및 ETC-216 처리된 토끼 심장으로부터의 조직 균질물 내의 리피드 하이드로퍼옥사이드 함량을 제공한다.
도 12는 비히클 및 ETC-216 처리된 토끼 심장으로부터의 심장 근육 샘플의 전자현미경 이미지를 제공한다.
도 13은 하나의 전처리는 급성 투여그룹에서 허혈증이 발현하기 전에 투여되고, 두개의 전처리는 만성 투여그룹에서 허혈증이 발현하기 전에 투여되는 본 발명의 추가의 프로토콜을 제공한다.
도 14는 경색 크기의 측정을 위한 프로토콜을 제공한다.
도 15는 ETC-216 (100 ㎎/㎏) 또는 등용적의 비히클로 1회 처리 (즉, 급성 처리)되거나, 2회 처리 (즉, 만성 처리)된 토끼에서 위험영역의 경색 ％, 좌심실의 경색 ％, 및 좌심실의 위험영역 ％를 제공한다.
도 16은 토끼를 허혈증이 발현하기 전에 비히클 (그룹 1) 또는 10, 3 또는 1 ㎎/㎏의 ETC-216 (그룹 2)로 전처리하는 본 발명의 추가의 프로토콜을 제공한다.
도 17은 각각의 그룹에 대해서 10, 3 또는 1 ㎎/㎏의 ETC-216 또는 등용적의 슈크로즈-만니톨 비히클로 1회 처리 (즉, 급성 처리)된 토끼에서 측정된 위험영역의 경색 ％, 좌심실의 경색 ％, 및 좌심실의 위험영역 ％를 제공한다.
도 18은 리포프로테인 비에스테르화된 콜레스테롤에서의 일시적인 변화를 제공한다.
도 19는 비히클 또는 ETC-216의 1회 처리량을 30분의 허혈성 기간 중의 마지막 5분 동안에 투여하는 본 발명의 추가의 프로토콜을 제공한다.
도 20은 토끼에서 측정된 위험영역의 경색 ％, 좌심실의 경색 ％, 및 좌심실의 위험영역 ％를 제공한다.

Claims (2)

  1. 체중 1 ㎏당 15 ㎎의 단백질 용량으로 투여하는, 아포리포프로테인 A-I 밀라노:1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 복합체 (아포 A-IM:POPC 복합체), 및 제약상 허용되는 희석제, 부형제, 비히클 또는 담체를 포함하는, 대상체에서 허혈성 재관류를 치료하기 위한 제약 조성물.
  2. 체중 1 ㎏당 45 ㎎의 단백질 용량으로 투여하는, 아포리포프로테인 A-I 밀라노:1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 복합체 (아포 A-IM:POPC 복합체), 및 제약상 허용되는 희석제, 부형제, 비히클 또는 담체를 포함하는, 대상체에서 허혈성 재관류를 치료하기 위한 제약 조성물.
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