KR20070105958A - 식물에서의 병원성 방어 향상용 활성 물질 및 이의 검출법 - Google Patents

식물에서의 병원성 방어 향상용 활성 물질 및 이의 검출법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원체 방어를 유도하고, 유도가 발생하였다는 표시로 간주되는 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및 식물 키티나제로 구성되는 그룹으로부터 단독 또는 복수의 내인성 식물 유전자의 향상된 발현을 유도하는 화합물을 조사하는 방법 및 이들 화합물을 단독으로, 또는 식물 병원체에 대하여 특이적이고 직접적으로 작용하는 알려져 있는 화합물과의 조합으로 사용하는 것에 관한 것이고, 이는 동시적으로 또는 시차를 두고 수행될 수 있다.

Description

식물에서의 병원성 방어 향상용 활성 물질 및 이의 검출법{Active substances for increasing pathogenic defence in plants and methods for the detection thereof}
본 발명은 식물 병원체 방어를 유도한다는 표시로 간주되는 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및 식물 키티나제로 구성되는 그룹으로부터 단독 또는 복수의 내인성 식물 유전자의 향상된 발현을 발생시키는 것을 특징으로 하는 식물 병원체 방어를 유도하는 화합물을 조사하는 방법 및 이들 화합물을 단독으로, 또는 식물병원체에 대하여 특이적이고 직접적으로 작용하는 알려져 있는 화합물과의 조합으로 사용하는 것에 관한 것이고, 이는 동시적으로 또는 시차를 두고 수행될 수 있다.
식물은 자연적 스트레스 조건, 예를 들면, 추위, 열, 가뭄, 상처, 병원체 공격(바이러스, 박테리아, 곰팡이, 곤충) 등에, 또한 제초제에, 특이 또는 비특이 방어 메커니즘을 가지고 반응한다는 것이 공지되었다[Pflanzenbiochemie, pp.393-462, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, Hans W. Heldt, 1996.; Biochemistry and Molecular Biology of Palnts, pp. 1102-1203, American Sociey of Plant Physiologist, Rockville, Maryland, eds, Buchanan, Gruissem, Jones, 2001]. 본문에서, 신호물질, 예를 들면, 상처로부터 생성되는 세포 벽 물질, 또는 병원체로부터 기원하는 특이 신호 물질은 결국은 스트레스인자에 대항하는 방어 분자의 형성으로 인도하는 식물 신호 전달 사슬의 유도체로 작용한다. 이는 예를 들어, (a) 저분자량 물질, 예를 들어, 피토알렉신, (b) 비효소 단백질, 예를 들어, 병원체-연관 단백질(PR단백질), (c) 효소 단백질, 예를 들어, 키티나제, 글루카나제, 또는 (d) 필수 단백질의 특이 저해제, 예를 들어, 프로테아제 저해제, 자일라나제 저해제의 형태를 취할 수 있고, 이들 물질은 병원체를 직접적으로 공격하거나 또는 그의 증식을 방해한다(Dangl and Jones, 2001, Nature 411: 826-833; Kessler and Baldwin, 2003, Annual Review of Plant Biology, 53: 299-328).
부가적인 방어 메커니즘은 과민성 반응(HR)으로 알려진 것이고, 이는 산화성 스트레스를 통해 조정되며, 이는 감염 병소의 주변 식물 조직의 사멸을 유도하고, 이러한 메커니즘은 살아있는 세포에 의존하는 식물 병원체의 번짐을 예방한다[Pennazio, 1995, New Microbiol. 18, pp. 229-240].
감염의 추가 과정중, 신호는 식물 전령 물질에 의해 비감염 조직으로 전달되고, 여기에서, 다시, 이들은 방어 반응의 유발 및 이차 감염의 형성의 방해를 나타낸다(전신획득저항성, SAR, Systemic acquired resistance)[Ryals et al., 1996, The Plant Cell 8: 1809-1819].
스트레스 내성 또는 병원체 방어에 포함된 일련의 내인성 식물 신호 물질은 이미 알려져 있다. 하기 사항이 언급될 수 있다: 살리실산, 벤조산, 자스몬산 또는 에틸렌[Biochemistry and Molecular Biology of Plants, pp. 850-929, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland, eds. Buchanan, Gruissem, Jones, 2000]. 이들 물질의 일부 또는 이들의 안정한 합성 유도체 및 유도된 구조체는 식물의 향상된 스트레스 또는 병원체 내성을 야기시키는 활성 방어 작용 및 종자 피복으로서 식물에 외부적으로 적용되었을 때 또한 효과적이다[Sembdner, and Parthier, 1993, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44: 569-589]. 살리실레이트-조정 방어는 특별히, 식물병원성 곰팡이, 박테리아 및 바이러스에 대항하게 하였다[Ryals et al., 1996, The Plant Cell 8: 1809-1819].
살리실산의 작용과 양립할 수 있는 작용을 가지고, 식물병원성 곰팡이, 박테리아 및 바이러스에 대하여 보호 효과를 나타낼 수 있는 알려져 있는 합성 제품은 벤조티아디아졸(상업명 Bion®)[Achuo et al., 2004, Plant Pathology 53(1): 65-72]이다.
옥실리핀의 그룹에 속한 다른 화합물, 예를 들어, 자스몬산, 및 이들이 유발시키는 보호 메커니즘은 특히 유해 곤충에 대하여 활성이다[Walling, 2000, J Plant Growth Regul. 19, 195-216].
또한 식물은 넓은 범위의 유해 유기체 및/또는 자연 비생물 스트레스에 대항하는 효과적인 방어를 야기할 수 있는, 가능한 복수의 내인성 반응 메커니즘을 가진 것으로 알려졌다. 그러나, 어떤 방어 반응이 활성 성분의 적용에 의해 특이적으 로 야기될 수 있는지에 대한 예측은 현재까지는 알려지지 않았다.
따라서, 해로운 유기체 및/또는 자연 비생물 스트레스(예를 들어, 열, 추위, 가뭄, 염도, 및 산/알칼리성 스트레스)에 대항하는 내인성 식물 방어 메커니즘의 분자 활성제의 특이적 발견에 대한 방법이 필요하고, 그리하여 새로운 활성 성분이 발견될 수 있고, 다른 유형의 활성을 가진 기타 알려져 있는 분자의 특성이 확인될 수 있거나, 다른 알려져 있는 분자 또는 앞선 구조가 내인성 방어 메커니즘의 유발체로 사용되기에 최적화될 수 있다.
이후 사용되는 용어의 정의
여기에서 용어 "Blast 분석"(Blast = Basic Local Alignment Search Tool)은 원하는 일치가 "유의성 기준"(점수평가기능)의 형태로 일어나는, 잠재적으로 동종인 시퀀스(sequence)의 분류, 및 조사용으로 적합하고, 의문의 시퀀스 및 발생하는 하나 이상의 데이터베이스의 모든 시퀀스간의 비교용으로 적합한 컴퓨터 프로그램의 사용을 기술한 것이다(R. Rauhut, Bioinformatik, pp. 38-107, Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001).
여기에서 용어 "cDNA(complementary DNA)"는 RNA에 상보적인 DNA 단일 가닥을 기술한 것이고, 이는 효소 역전사에 의해 시험관내에서 합성된다. cDNA는 RNA의 전체 길이에 상응하거나, 또는 주형(template)으로 작용하는 RNA의 부분-시퀀스를 구성할 수 있다.
여기에서 용어 "무리(cluster) 분석"은 결정된 각각의 데이터가 이러한 목적으로 개발된 컴퓨터 프로그램의 수단에 의해 유사한 기능을 가진 단백질을 코딩하는 유전자 그룹으로 또는 유사한 발현 패턴을 가진 다른 유전자로 무리화되고, 무리처럼 나타내어진 것을 의미한다. 계통수의 형태로 나타낼 수 있는 복잡한 데이터 패턴의 계통적 최소화는 그렇게 함으로서 성취되었다. 무리 분석은 수득된 데이터 세트의 평가를 분류하는 것을 가능하게 하고, 이는 상호 연관되지 않은 데이터의 단순한 축적 이상이다.
여기에서 동의어로 사용된 용어 "DNA 칩, "DNA 어레이", "DNA 마이크로어레이"는, 이의 기초가 예를 들어, 유리 또는 나일론을 포함하고, 그것에 부착된 DNA 조각을 가지고, 여기에서 DNA는 예를 들어, (a) 사진평판공정(DNA가 어레이의 지지체상에서 직접 합성됨), (b) 마이크로스포팅법(microspotting method)(외부적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 PCR 산물을 지지체에 적용, 여기에서 이들은 공유적으로 결합함) 또는 (c) 마이크로스프레잉법(microspraying method)(외부적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 또는 PCR 산물이 잉크-젯 프린터를 사용하여, 접촉 없이, 지지체상에 분사됨)에 의해 적용될 수 있다(R. Rauhut, Bioinformatik, pp. 197-199, Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001). 유기체의 게놈 시퀀스를 나타내는 DNA 칩은 "게놈 DNA 칩"으로 나타낸다. 이러한 "DNA 칩"의 공급으로 수득된 데이터의 평가는 "DNA 칩 분석"으로 나타낸다.
여기에서 용어 "DNA 칩 하이브리드화"는 두개의 단일-가닥 상보적 핵산 분자의 짝지음을 의미하고, 염기-짝지음 분자 파트너의 하나는 DNA 칩상에 DNA(데옥시리보핵산)로 국소화되었고, 바람직하게는 공유결합 형태이고, 나머지는 용액중 RNA(리보핵산)의 형태이거나 또는 상응하는 cDNA(상보 DNA)이다. 결합된 것 및 결합되지 않은 핵산의 하이브리드화는 수성 완충 용액내 DNA 칩상에서 일어나고, 만약 부가적인 변성 조건하에서 적절하다면, 예를 들어, 디메틸 설폭시드의 존재중, 계속 진탕하면서, 약 30-60℃의 온도에서, 바람직하게는 40-50℃의 온도에서, 특히 바람직하게는 45℃에서 10-20시간, 바람직하게는 14-18시간, 특히 바람직하게는 16시간이다. 하이브리드화 조건은 이들이 일정한 방법으로, 예를 들면 하이브리드화 오븐내에서 성립된다. 이러한 하이브리드화 오븐내에서, 60rpm(round per minute, 또는 revolutions per minute)에서의 진탕은 정기적으로 수행된다.
용어 "EST 시퀀스"(expressed sequence tag)가 사용되는, 여기에서의 핵산 시퀀스는, 200-500 염기 또는 염기쌍의 짧은 시퀀스를 의미한다.
여기에서 동의어로 사용된 용어 "발현 패턴", "유도 패턴" 및 "발현 프로필"은 일시적으로 분화되고/분화되거나 식물 mRNA의 조직-특이 발현을 기술하고, 패턴은 DNA 칩 기술의 공급으로, 식물로부터 수득된 RNA의 하이브리드화 신호의 생성된 강도 또는 그에 상응하는 cDNA에 의해 직접 수득된다. 측정된 "발현값(expression value)"은 같은 의미의 칩 및 처리되지 않은 대조군 식물의 하이브리드화를 사용하여 수득된 상응하는 신호로 직접 계산한 결과이다.
수행된 유전자 발현 프로파일링에 의해 수득된, 여기에서 사용된 용어 "발현 상태"는, DNA 칩의 공급으로 측정된 세포 유전자의 기록된 전사 활성의 전부를 기술한다.
여기에서, 용어 "전체 RNA"는 사용된 추출법의 결과로서 가능한, 예를 들어, 세포질 rRNA(리보솜 RNA), 세포질 tRNA(전이 RNA), 세포질 mRNA(전령 RNA), 및 이들의 각각의 핵 전구체, ctRNA(클로로플라스티딕 RNA(chloroplastidic RNA)) 및 mtRNA(미토콘드리아 RNA)와 같이 식물세포중 존재할 수 있는 다른 내인성 식물 RNA 그룹의 대표를 기술하지만, 이는 또한 외인성 유기체, 예를 들어, 바이러스 또는 기생 박테리아 및 곰팡이로부터 유래할 수 있는 RNA 분자를 또한 포함한다.
여기에서, 용어 "유용한 식물"은 식품, 사료를 얻기 위해, 또는 산업 목적용 식물로서 사용되는 농작물 식물을 의미한다.
여기에서, 용어 "독성완화제(safener)"는 내인성 식물 기원의 것이 아니고, 해로운 유기체, 예를 들어 위즈(weeds), 박테리아, 바이러스 및 곰팡이에 대한 살충 활성을 실질적으로 감소시킴 없이, 농작물 식물에 대한 살충제의 식물에 유해한 효과를 말소시키거나 감소시키는 화학적 화합물을 나타낸다.
본 발명은, 식물 병원체 방어를 유도한다는 표시로 간주되는 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체 연관 단백질) 및 식물 키티나제로 구성된 그룹으로부터 단독 또는 복수의 내인성 식물 유전자의 향상된 전사 또는 발현을 발생시키는 것을 특징으로 하는 식물 병원체 방어를 유도하는 화합물을 조사하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 내인성 식물 병원체-방어 효소에 대하여 코딩하는 유전자의 전사를 유도하는 화합물을 발견하는 방법에 관한 것이고, 여기에서:
a) 시험 식물을 적절한 양의 시험 물질(들)과 접촉시키고,
b) 그러나, 대조군 식물을, a)의 시험 식물과 동일한 조건하에서 시험 물질(들)과 접촉시키지 않고,
c) RNA를 시험 식물 및 대조군 식물에서 추출하고,
d) RNA를 직접 방사성표지화하거나 또는 방사성표지화하지 않거나, 또는 상응하는 cDNA내로 효소적으로 동시에 전사시키는 도중 RNA를 방사성표지화하거나 또는 방사성표지화하지 않거나, 또는 이전에 수득된, 비표지화된 cDNA를 상응하는 방사성표지화하거나 또는 방사성표지화하지 않은 cRNA내로 효소적으로 전사시키며,
e) 식물 DNA 시퀀스를 포함하는 DNA 어레이를 단계 d)에서 수득된 물질과 하이브리드화시키고,
f) 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 발현용 유전자의 발현 프로필을 a) 및 b)에서 기술한 바와 같이 시험된 식물에 대한 비교 방법으로 생성시키며,
g) f)에서 측정된 발현 차이를 정량화하고,
h) g)에 기술된 바와 같이 할당된 발현 프로필에 무리 분석 방법으로 최종 분류화하였다.
상기 언급된 단계 d)의 경우, 수득된 cDNA의 cRNA내로의 효소적 전사는 하이브리드화 프로브가 다시 증폭되도록 하기 때문에 바람직한 공정 단계로 고려되어야 한다. 마찬가지로, 바람직한 것은 비방사성 뉴클레오티드에 의해 표지화되는 것이고, 특히 바람직하게는 바이오티닐화된 UTP 및/또는 CTP에 의해 표지화되는 것이고, 여기에서, 일단 하이브리드화 반응이 일어나면, 스트렙타비딘-피코에리트린(streptavidin-phycoerythrin)이 형광단으로서, 바이오티닐화된 cRNA에 결합하는 것에 의해 검출이 일어난다. 하이브리드화 후, 측정된 발현 분화의 정량화에 대한 기초로 작용하는 특이 피코에리트린 형광은 레이저 스캐너의 공급으로 검출된다.
본 발명의 바람직한 주제는 방법에 있어서, 상기 언급된 방법 단계 a)-h)가, 미처리된 대조군 식물과 비교해서 향상된
(i) 리파제-유사 단백질, 12-옥소피토디에노에이트 리덕타제(EC 1.3.1.42), 알렌-옥사이드 사이클라제, 12-옥소피토디엔산 리덕타제의 유전자의 발현 프로필, 및/또는
(ii) PIR 단백질 데이터베이스 엔트리(entry) S71555를 가진 프로테이나제 저해제와 상당한 상동성을 가진 식물 프로테이나제 저해제의 유전자의 발현 프로필, 및/또는
(iii) 식물 자일라나제 저해제 단백질의 유전자 발현 프로필, 및/또는
(iv) 병원체-유도 식물 퍼옥시다제(EC 1.11.1.7), PIR 단백질 데이터베이스중 T06168 번호를 가진 보리 병원체-연관(PR) 단백질과 상당한 상동성을 가진 단백질의 유전자의 발현 프로필, 및/또는
(v) 식물 키티나제 유전자의 발현 프로필
과 함께 고정된 것이고, 예를 들어, 2 배율 이상, 바람직하게는 2-100 배율, 바람직하게는 2-20, 특히 바람직하게는 2-10, 특히 매우 바람직하게는 2-5이고, 각기 다른 상기 언급된 범위중 서로 독립적으로 각 유전자의 변형된 발현 프로필의 향상 가능성을 가지는 방법이다.
본 발명은 추가로, 식물에서의 유전 정보, 바람직하게는 유용한 식물에서의 유전 정보, 특히 바람직하게는, 예를 들어, 보리, 옥수수, 밀, 쌀, 귀리, 오일시드 레이프(oilseed rape), 사탕무로부터 변형된 유전자 발현 패턴을 조사하는데 이용되는 임의의 DNA 마이크로어레이의 사용에 관한 것이다.본문에서, 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 유전자에 대한 유전자 패턴의 상대적 변형이, 처리되지 않은 대조군 식물과 비교하여 시험되도록 화합물로 처리된 식물중 관찰되었다.
본 발명은 추가로 또한 상기 언급된 방법중 양성으로, 즉, 유용한 식물중 스트레스 내성 및/또는 병원체 방어를 향상시키는 활성 성분으로서 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 유전자에 대한 이들의 유도성 효과에 관하여 발현을 향상시키는 것으로 확인된 화합물의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 유전자, 바람직하게는 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 단백질 그룹에서 단백질에 대한 하나 이상의 유전자가 향상된 발현 프로필을 갖는 식물에서, 예를 들면 곤충, 곰팡이, 박테리아 또는 바이러스와 같은 식물병원성 유기체에 대한 향상된 방어에 직접적으로 또는 간접적으로 기여하는 화합물의 용도에 관한 것이다.
용도가 독성완화제로 알려진 화합물은 농작물 보호에서 이미 알려져 있는, 예를 들어, 메펜피르-디메틸(mefenpyr-dimethyl), 메펜피르-디에틸, 메펜피르-유사체, 이속사디펜-에틸(isoxadifen-ethyl), 클로퀸토셋-멕실(cloquintocet-mexyl), 클로퀸토셋 유도체 및 피리딘카복스아미드가 본문에서 바람직하다.
상기 언급된 화합물을 적용함으로서, 농작물 식물을 식물병원성 유기체(곤충, 곰팡이, 박테리아, 바이러스)에 대하여 효과적으로 보호하는 것이 가능하고, 이는 또한, 예를 들면 더 높은 수율에도 영향을 미친다. 이들 유기체에 직접적으로 대항하는 활성 성분을 능가하는 장점은 문제의 방어 작용을 유발하지 않기 때문에 이로운 생물이 피해없이 남겨진다는 것이다.
본 발명은 또한 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 유전자의 발현 프로필을 고려하는 DNA 어레이의 공급으로 확인된 화합물의 적용에 의해 식물병원성 유기체, 특히, 곤충, 곰팡이, 박테리아 및 바이러스에 대항하는 이로운 식물의 농작물중 유용한 식물을 보호하는 방법에 관한 것이다. 매우 특별히 바람직한 것은, 식물병원성 유기체에 대한 보호이고, 특별히 곤충에 대하여, 매우 특별히는 흡입 곤충에 대한 것이다.
DNA 어레이의 공급으로 확인된 화합물에 의해 유발된 상기 언급된 메커니즘은, 예를 들어 또한 독성완화제와 같이 이미 알려져 있는 예의 화합물, 예를 들어 이들 화합물 및 특이적이고 직접적으로 식물병원체, 예를 들어 살충제 및 살진균제, 특히 살진균제 및 살충제와 같이 동시에 또는 시차를 두고 적용할 때, 특히 살충제, 예를 들어, 케토에놀[예: EP 528156; EP 596298], 또는 니코티네르직 아세틸콜린 수용체(nicotinergic acetylcholine receptor)의 작용제 또는 길항제의 그룹에서의 화합물간의 공동 효과로 이끈다. 마지막에 언급된 화합물의 일부는 용어 니트로메틸렌 또는 니트로이민 및 연관된 화합물하에서 그룹화되었다(예 : EP 464830)
본 발명은 또한, 메펜피르 유사체(예: "The Pesticide Manual, 13th Edition, 2003"중 No. 506으로 나열된 화합물)와 해로운 유기체에 직접적으로 작용하는 살충제의 조합, 특히 바람직하게는 케토에놀의 그룹, 또는 니트로메틸렌/니트로이민의 그룹으로부터 살충제와의 조합, 또는 이속사디펜 유도체(예: "The Pesticide Manual, 13th Edition, 2003"중 No. 478로 나열된 화합물)와 해로운 유기체에 직접적으로 작용하는 살충제의 사용과 같은 식물병원체에 대하여 특이적이고 직접적으로 활성하는 기존 기술의 화합물과 조합한 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 유전자의 발현 프로필을 고려한 DNA 어레이의 수단으로 스크리닝되어 확인된 화합물의 사용에 관한 것이고, 동시적으로 또는 시차를 두고 발생하도록 적용할 수 있다.
적용이 동시적으로 발생하지 않을 때, 해로운 유기체에 직접적으로 작용하는 살충제는, 본원에서 기술된 DNA 어레이의 수단에 의해 확인된 화합물의 적용 전 또는 후에 적용될 수 있고, 해로운 유기체상에 직접적으로 작용하는 살충제의 연속 적용이 바람직하다.
하기 실시예는 본 발명을 상세히 기술한다.
실시예 1
유전자 발현 프로파일링(GEP)에 의한 식물중 방어 메커니즘에 대한 독성완화제 효과의 검출:
보리(품종 바로네세(Baronesse))를 한정된 빛, 습도 및 온도 조건(백색광선, 70% 대기 습도, 24℃)하, 조절-환경 캐비넷내에서 10일간 퇴비가 충전된 단지(직경: 10cm)에서 성장시켰다. 분사 적용시, 묘목은 약 15cm 크기였다. 이 실시예에서 선택된 시험 물질은 그들의 구조가 현저히 다르고, 제대로 증명되는 현저한 독성완화제 효과를 가지는 분자이며, 다른 분자는 문헌에서 식물 스트레스 및 병원성 내성에 대한 효과를 갖는 것으로 알려져 있다(표 1). 물질을 DMSO(디메틸 설폭시드)중 c = 10mg/ml 원액으로 제조하였다. 이것을 0.2% Agrotin(폴리비닐 알콜, 실리콘, 다당류 및 pH 조절제를 포함, 제조: Bayer CropScience AG, Monheim, Germany)을 침윤제로 보충한 물중 희석 용액을 제조하는데 사용하였고, 표중 나타낸 적용 속도를 나타내었다. 분사 적용용 액체량은 800 l/ha에 상응하는, 단지당 800 μl이다. 분사 혼합물의 각각의 800μl에 대하여, 16μl의 EC 사전혼합물 : 디아세톤 알콜 = 1 : 6을 제제 보조제로서 부가적으로 첨가하였다. 표 1에 나열된 물질을 압축식 분사 피스톨을 사용하여 잎에 적용하였다. 각 물질을 2 용량으로 분사하였고, 모든 실험을 반복 수행하였다(물질당 2 단지). 대조군으로서 활성 성분 없이, 공제제(blank formulation)로 분사하였다. 6시간 후, 잎을 수확하고, 액체 질소내에서 냉각시키고, 추가 사용이 있을 때까지, -80℃에서 저장하였다. DNA 칩 하이브리드화용 표지된 RNA 프로브(probe)를 Affymetrix(Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)에서의 프로토콜에 기술된 대로(Expression Analysis, Technical Manual) 제조하였다. 우선, 수확된 잎의 각각의 경우 500mg에서 전체 RNA를 분리하였다. 각 경우, 전체 RNA의 10μg을 첫번째-가닥 및 두번째-가닥 cDNA 합성용으로 사용하였다. cDNA를 T7 폴리머라제로 증폭시키고, 동시에 바이오틴-UTP로 표지하였다. 각 경우, 이러한 바이오티닐화된 cDNA 20μg을 Affymetrix의 보리 게놈 어레이(유전자 칩 보리1, 주문번호: 511012) 하이브리드화에 사용하였다. 이 DNA 마이크로어레이는 전체 400 000 EST 시퀀스를 포함하는 22 840 유전자의 DNA 시퀀스를 포함한다. 그 후, DNA 마이크로어레이를 Affymetrix Fluidics Station에서 세척하고, 스트렙타비딘/피코에리트린(Molecular Probes, P/N S-866)으로 착색시키고, 알맞는 Agilent Laser Scanner(Agilent Gene Array Scanner)로 스캔하였다. 수득된 형광 데이터를 Affymetrix의 Microarray Suite 5 소프트웨어로 분석하였다. 품질 조사 후, 모든 DNA 칩 분석을 데이터베이스내에 저장하였다. 유전자에 대한 상대적 발현 값을 결정하기 위해(유도 인자, 억제 인자), 시험 및 대조군 칩을 서로 비교하고, Affymetrix 소프트웨어에 의해 설정된 점수 평가 기능을 기본으로 사용하였다. 한 실험의 두 개의 생물학적 복제를 두 개의 대조군 칩(공제제)과 각 경우 비교하고, 각 유전자에서 수득된 4개의 발현 값을 정 중(median) 계산에 사용하였다. 이들 정중은 수득된 표에 유도 인자로서 나타내었다. 다른 실험에서의 발현 프로필의 유사성 비교 및 무리 분석은 Applied Maths의 소프트웨어 GeneMaths 1.5(Applied Maths, Keistraat 120, 9830 Sint-Martens-Latem, Belgium)를 사용하여 수행하였다.
특이 대사경로 및 신호 전달 사슬에서의 유전자 그룹을 유전자 주석중 핵심어 찾기에 의해 모았고, 이는 또한 Affymetrix에 의해 제공되었고, DNA 표적 시퀀스 즉, 특성화된 기능을 가진 다른 유기체, 바람직하게는 식물 유기체에서의 유전자 시퀀스를 사용하여 DNA 칩상에서 확인된 양성 시퀀스(변형된 발현 프로필을 기초로 하여 규명)의 Blast 분석(상동성 비교)에 의해 제공되었다.
표 1
시험 물질(번호): 적용 속도[g a.i./ha]: 알려져 있는 특성
메펜피르-디메틸(1) 150 독성완화제
메펜피르 유사체(2) 150 독성완화제
이속사디펜-에틸(3) 150 독성완화제
클로퀸토셋-멕실(4) 150 독성완화제
클로퀸토셋 유도체(5) 150 독성완화제
피리딘카복스아미드(6) 150 독성완화제
살리실 히드록사메이트(7) 500 저항 유도제
Bion®(=아시벤졸라-S-메틸)(8) 150 저항 유도제
디클로로이소니코틴산(9) 150 저항 유도제
디클로로살리실산(10) 150 저항 유도제
상기 표 1에 나타낸, 사용된 시험 물질의 구조식:
Figure 112007004248683-PCT00001
Figure 112007004248683-PCT00002
Figure 112007004248683-PCT00003
Figure 112007004248683-PCT00004
Figure 112007004248683-PCT00005
Figure 112007004248683-PCT00006
Figure 112007004248683-PCT00007
Figure 112007004248683-PCT00008
Figure 112007004248683-PCT00009
Figure 112007004248683-PCT00010
스트레스 내성 및 병원체 방어에서 역할을 맡고 있는 신호 전달 사슬 및 대사 경로에서의 스크리닝 유전자 그룹은 특히 높은 레벨의 프로테아제 및 자일라나제 저해제용 유전자 및 자스몬산 생합성 유전자(표 2a), 및 PR 단백질 및 키티나제용 유전자(표 2b), 그들의 독성완화제 효과로 이미 알려진 한 무리의 화합물의 유도를 나타내었다(S1-S6).
표 2a
Figure 112007004248683-PCT00011
Figure 112007004248683-PCT00012
발현 값(처리되지 않은 대조군의 값의 x 배 이상)은:
(a) 식물 자스몬산 생합성의 유전자(1.1-1.20)
(b) 식물 프로테이나제 저해제에 대해 코딩하는 유전자(2.1-2.4)
(c) 식물 자일라나제 저해제에 대해 코딩하는 유전자(3.1)
에 대하여 측정되었다.
"프로브 세트" 번호는 Affymetrix 칩의 각각의 DNA 칩 위치에 상응한다.
Blast 분석을 사용하여, 기타 주석이 달린 시퀀스 데이터베이스로부터 가장 가능성있는, 상응하는 알려져 있는 시퀀스는 "프로브 세트" 번호로 할당될 수 있다. Blast 분석에서 나타난 이들 데이터는 하기에 나타내었다.
"프로브 세트" 번호 공개적으로 접근가능한 DNA 또는 단백질 데이터베이스로부터 주석이 달린 기능을 가진 상응하는 시퀀스
1.1. 리파제-유사 단백질(오리자 사티바(Oryza sativa); 자포니카(japonica) 품종군
1.2 리폭시게나아제(lipoxygenase)(EC 1.13.11.12) 보리 gbAAB70865
1.3 알렌(Allene) 옥사이드 신타제(호레데움 불가레 아종 불가레(Horedeum vulgare subsq . vulgare))
1.4 유망한 12-옥소피토디에노에이트 리덕타제(EC 1.3.1.42)
1.5 알렌 옥사이드 시클라아제(오리자 사티바: 자포니카 품종군)
1.6 알렌 옥사이드 시클라아제(오리자 사티바: 자포니카 품종군)
1.7 12-옥소피토디엔산 리덕타제(오리자 사티바)
1.8 12-옥소피토디에노에이트 리덕타제 3(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum))
1.9 GDSL-모티프 리파제(motif-lipase)/하이드로라제-유사 단백질, At5g55050.1
1.10 리폭시게나제 1 pir T05941(EC 1.13.11.12) 보리
1.11 잠정적 리폭시게나제(오리자 사티바, 자포니카 품종군)
1.12 유사한 리파제(아라비도프시스 타리아나(Arabidopsis thaliana); gb AAM20450.1)
1.13 잠정적 리파제 동종(오리자 사티바; 자포니카 품종군)
1.14 메틸자스모네이트 유도성 리폭시게나제 gbAAC12951.1
1.15 유망한 리폭시게나제 gbAAB60715.1
1.16 알렌 옥시드 신타제(호레데움 불가레 아종 불가레)
1.17 유사한 리파제(아라비도프시스 타리아나; gb AAM20450.1)
1.18 12-옥소피토디엔산 리덕타제(오리자 사티바)
1.19 12-옥소피토디엔산 리덕타제(오리자 사티바)
1.20 12-옥소피토디엔산 리덕타제(OPR1) At1g76680.1
"프로브 세트" 번호 공개적으로 접근가능한 DNA 또는 단백질 데이터베이스로부터 주석이 달린 기능을 가진 상응하는 시퀀스
2.1 Browman-Birk형 트립신 저해제
2.2 잠정적 프로테이나제 저해제(호레데움 불가레 아종 불가레)
2.3 잠정적 프로테이나제 저해제(호레데움 불가레 아종 불가레)
2.4 프로테이나제-저해제(pir S71555, 보리)
3.1 자일라나제 저해제 단백질(트리티큠 아에스티븀(Triticum aestivum))
표 2b
Figure 112007004248683-PCT00013
발현 값(처리되지 않은 대조군의 값의 x 배 이상)은:
(a) 식물 PR 단백질을 코딩하는 유전자(4.1-4.3)
(b) 식물 키티나제를 코딩하는 유전자(5.1-5.3)
에 대하여 측정하였다.
"프로브 세트" 번호는 Affymetrix 칩의 각각의 DNA 칩 위치에 상응한다.
Blast 분석을 사용하여, 기타 주석이 달린 시퀀스 데이터베이스로부터 가장 가능성있는, 상응하는 알려져 있는 시퀀스는 "프로브 세트" 번호로 할당될 수 있다. Blast 분석에서 나타난 이들 데이터는 하기에 나타내었다.
"프로브 세트" 번호 공개적으로 접근가능한 DNA 또는 단백질 데이터베이스로부터 주석이 달린 기능을 가진 상응하는 시퀀스
4.1 퍼옥시다제(EC 1.11.1.7), 병원체-유도 (보리)
4.2 병원체-연관 단백질; (오리자 사티바; gbAAL74406.1)
4.3 병원체-연관 단백질(보리; PirT06168)
5.1 키티나제(EC 3.2.1.14)(보리; embCAA55344.1)
5.2 키티나제(EC 3.2.1.14)(보리; embCAA55344.1)
5.3 분류 III 키티나제(오리자 사티바 아종 자포니카; gbAAM08773.1)
이들 표에서 유래되었고, 발현 값에 의해 직접적으로 나타내어진 수득된 유 도 패턴은 이속사디펜의 경우에서 가장 명백한 자스몬산 생합성에 대한 효과와 함께, 독성완화제 및 저항 유도체간의 특성 차이를 나타낸다. 조사된 발현 패턴은 유사한 기호(signature)를 가진 물질을 발견할 수 있도록 허용하고, 이들 물질이 식물 병원체 방어 활성에서 유사한 형태의 효과를 갖는다는 것을 제시한다.
실시예 2
독성완화제-처리된 식물의 식물병원성 곤충에 대한 퇴치 효과
보리 식물(cv. 바로네세(Baronesse))를 상기 실시예 1에서 기술한대로 성장시키고, 10일 후, 150 g a.i./ha의 이속사디펜-에틸(S 3) 또는 공제제로 분사 적용하여 처리하였다. 실험은, 각 경우 10 단지로 반복 수행하였다.
물질이 적용된 6시간 또는 24시간 후, 모든 단지를 균일하게 한 집단의 식물병원성 진디 로파로시퓸 파디(Rhopalosiphum padi)로 감염시켰다. 7일 후 및 14일 후 잎상의 동물 수를 세어, 실험을 평가하였다.
7일 후, 독성완화제-처리 식물상의 진디 개체수는 평균하여 대조군에 비해, 50% 보다 적었고, 14일 후에는 70% 보다 적었다.
진디에 대한 이속사디펜-에틸(S 3)의 직접적인 독성은 식물이 없는 Sachez 시험에서 감지되지 않았다.
실시예 3
이속사디펜-처리 식물중 상승한 옥소피토디에노에이트(OPDA) 및 자스모네이 트(JA) 농도의 검출
보리 식물(cv. 바로네세)을 상기 실시예 1에서 기술된 조건 하에서 성장시키고, 독성완화제 이속사디펜-에틸(S 3)로 분사 적용 처리하였다.
적용 속도는 하기와 같이 선택하였다:
(1) 30 [g a.i./ha]; (2) 150 [g a.i./ha] (3) 공제제(활성 성분 없음)
처리 후, 다른 시점에서, 바꿔 말하면, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간 및 48시간 후 식물 잎을 수확하였다. 모든 시료는 각 경우에 3 단지 반복으로 계획하였다.
문헌(
Figure 112007004248683-PCT00014
, 산성 식물호르몬 및 연관된 화합물의 민감하고 정량적인 단일-시행 분석용 복합 GC-MS/MS 기술 및 이의 아라비도프시스 타리아나(Arabidopsis thaliana)에 대한 응용, Planta, 216, 44-56)중 기술된 방법에 따라, 잎에서 옥타데카노에이트 및 자스모네이트를 가공처리하였다.
각 측정점에서 300mg의 식물 물질을 추출하였다.
50pmol[13C]2-JA 및 100pmol[17,17,17,18,18-2H]-cis-OPDA를 내부 표준으로 적용하였다. 추출물을 집에서 제조할 수 있는 미니 고체상 교환 컬럼으로 아미노프로필 음이온-교환 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
결과는 표 3a에서 3d에 나타내었고, 나타낸 값은 각 경우 3회 반복의 평균이다.
표 3a
pmol/g 잎 조직으로 측정된 옥소피토디에노에이트(OPDA) 농도
Figure 112007004248683-PCT00015
표 3b
pmol/g 잎 조직으로 측정된 옥소피토디에노에이트(OPDA) 농도
Figure 112007004248683-PCT00016
표 3c
pmol/g 잎 조직으로 측정된 자스모네이트(JA) 농도
Figure 112007004248683-PCT00017
표 3d
pmol/g 잎 조직으로 측정된 자스모네이트(JA) 농도
Figure 112007004248683-PCT00018
옥소피토디에노에이트(OPDA) 농도는 1800-9000 pmol/g 잎 조직 범위이고, 자스모네이트(JA)의 경우 70-800 pmol/g 잎 조직 범위이다. 이속사디펜-에틸(S 3) 처리 후, 두 물질 모두의 농도가 활성 성분이 없는 공제제에서의 값보다 약 5배까지 명백하게 증가한 것으로 측정되었다.

Claims (12)

  1. 식물 병원체 방어를 유도한다는 표시로 간주되는 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및 식물 키티나제로 구성되는 그룹으로부터 단독 또는 복수의 내인성 식물 유전자의 향상된 발현을 발생시키는 것을 특징으로 하는 식물 병원체 방어를 유도하는 화합물을 조사하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    a) 시험 식물을 적절한 양의 시험 물질(들)과 접촉시키고,
    b) 그러나, 대조군 식물을, a)의 시험 식물과 동일한 조건하에서, 시험 물질(들)과 접촉시키지 않고,
    c) RNA를 시험 식물 및 대조군 식물에서 추출하고,
    d) RNA를 직접 방사성표지화하거나 또는 방사성표지화하지 않거나, 또는 상응하는 cDNA내로 효소적으로 동시에 전사시키는 도중 RNA를 방사성표지화하거나 또는 방사성표지화하지 않거나, 또는 이전에 수득된, 비표지화된 cDNA를 상응하는 방사성표지화하거나 또는 방사성표지화하지 않은 cRNA내로 효소적으로 전사시키며,
    e) 식물 DNA 시퀀스를 포함하는 DNA 어레이를 단계 d)에서 수득된 물질과 하이브리드화시키고,
    f) 자스몬산 생합성, 식물 자일라나제 저해제, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 발현용 유전자의 발현 프로필을 a) 및 b)에서 기술된 바와 같이 시험된 식물에 대한 비교 방법으로 생성시키며,
    g) f)에서 측정된 발현 차이를 정량화하고,
    h) g)에 기술된 바와 같이 할당된 발현 프로필에 무리 분석(cluster analysis) 방법으로 최종 분류화하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    (i) 리파제-유사 단백질, 12-옥소피토디에노에이트 리덕타제(EC 1.3.1.42), 알렌-옥사이드 사이클라제, 12-옥소피토디엔산 리덕타제의 유전자의 발현 프로필, 및/또는
    (ii) PIR 단백질 데이터베이스 엔트리(entry) S71555를 가진 프로테이나제 저해제와 상당한 상동성을 가진 식물 프로테이나제 저해제의 유전자의 발현 프로필, 및/또는
    (iii) 식물 자일라나제 저해제 단백질의 유전자 발현 프로필, 및/또는
    (iv) PIR 단백질 데이터베이스중 T06168 번호를 가진 보리 병원체-연관(PR) 단백질과 상당한 상동성을 가진 단백질인, 병원체-유도 식물 퍼옥시다제 유전자의 발현 프로필(EC 1.11.1.7), 및/또는
    (v) 식물 키티나제 유전자의 발현 프로필
    은 처리되지 않은 대조군 식물과 비교해서 2배 이상 향상되는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, (i)-(v)하에서 나타낸, 하나 이상의 유전자의 발현 프로필은 2-20배 향상되는 방법.
  5. 적어도 하나의 유전자, 바람직하게는 자스몬산 생합성, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 자일라나제 저해제, 식물 PR 단백질, (병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 단백질 그룹에서의 단백질에 대하여 코딩한 하나 이상의 유전자가 향상된 발현 프로필을 갖는 식물에서, 식물병원성 유기체에 대한 향상된 방어에 직접적으로 또는 간접적으로 기여하는 화합물의 용도.
  6. 제 5항에 있어서, 독성완화제로 알려져 있는 화합물의 용도가 이미 농작물 보호에서 알려져 있는 화합물의 용도.
  7. 제 5항 또는 6항에 있어서, 제 2항에서 4항중 어느 한 항에 따른 화합물이 확인되는 용도.
  8. 제 6항에 있어서, 메펜피르-디메틸, 메펜피르-디에틸, 메펜피르 유사체, 이속사디펜-에틸, 클로퀸토셋-멕실, 클로퀸토셋 유도체 및 피리딘 카복스아미드인 화합물의 용도.
  9. 제 5항 내지 8항중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 유용한 식물의 농작물중 식물병원성 유기체에 대한 방어를 향상시키기 위해 식물병원체에 특이적이고 직접적으로 작용하는 기존-기술의 화합물과 조합되어 사용되고, 이는 동시적으로 또는 시차를 두고 발생하도록 적용할 수 있는 용도.
  10. 제 9항에 있어서, 메펜피르 유도체 또는 이속사디펜 유도체는 해로운 유기체에 직접적으로 작용하는 살충제와 결합되는 용도.
  11. 제 10항에 있어서, 메펜피르 유도체의 경우, 해로운 유기체에 직접적으로 작용하는 살충제는 케토에놀 또는 니트로메틸렌/니트로이민에 상응하는 용도.
  12. 향상된 발현 프로필을 갖는 적어도 하나의 유전자, 바람직하게는 자스몬산 생합성, 식물 자일라나제 저해제, 식물 프로테이나제 저해제, 식물 PR 단백질(병원체-연관 단백질) 및/또는 식물 키티나제의 단백질 그룹에서의 단백질에 대하여 코딩한 하나 이상의 유전자를 가진, 식물병원성 유기체에 대한 방어를 향상시키는데 직접적으로 또는 간접적으로 사용되는 화합물을 적용하여, 유용한 식물의 농작물중 식물병원성 유기체에 대하여 유용한 식물을 보호하기 위한 방법.
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