JP5408875B2 - 植物の病原体防御を増大する活性物質及びそれらの検出方法 - Google Patents
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Description
本明細書において用いる用語「Blast解析」(Blast = Basic Local Alignment Search Tool)とは、相同性を有する可能性のある配列(Altschul ら、J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410頁)の、分類、及び「有意性判定基準」(スコアリング関数)の形式で設定されている所望の一致を用いて、照会配列と一つ又はそれより多いデータベースの全配列との比較(アラインメント)を行うことによるその検出(R. Rauhut, Bioinformatik、38-107頁、Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001)に好適なコンピュータプログラムの使用をいう。
a) 試験植物を適当な量の試験物質に接触させ、
b) 対照植物は、試験物質に接触させないこと以外は、試験植物a)と同一の条件下であり、
c) 試験植物及び対照植物からRNAを抽出し、
d) RNAは直接的に放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又はRNAは対応するcDNA中に同時に酵素的に転写されるときに放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又は結果として得られた無標識のcDNAを対応する放射性標識された若しくは放射性標識されていないcRNA中に酵素的に転写し、
e) 植物DNA配列を含んでいるDNAアレイを工程d)で得られた物質とハイブリダイズさせ、
f) ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物PRタンパク質(病原体関連タンパク質)及び/又は植物キチナーゼの発現のための遺伝子の発現プロファイルを、工程a)及びb)の記載のように試験した植物に関して比較する様式で作成し、
g) 工程f)において測定した発現の差違を定量化し、そして
h) 工程g)に記載のように割り当てられた発現プロファイルを、クラスター解析を用いた最終的な体系的なグループ分けに付する。
(i) リパーゼ−類似タンパク質である、12−オキソフィトジエノエートレダクターゼ (EC 1.3.1.42)、アレン−オキシドシクラーゼ、12−オキソフィトジエン酸レダクターゼの遺伝子の発現プロファイル、及び/又は
(ii) PIR タンパク質データベースの登録番号S71555を付したプロテイナーゼインヒビターと有意の相同性を有する植物プロテイナーゼインヒビターの遺伝子の発現プロファイル、及び/又は
(iii) 植物キシラナーゼインヒビタータンパク質の遺伝子の発現プロファイル、及び/又は
(iv) PIR タンパク質データベースの登録番号T06168を付した大麦の病原体関連(PR)タンパク質と有意の相同性を有するタンパク質である、病原体誘導性植物ペロキシダーゼ(EC1.11.1.7) の遺伝子の発現プロファイル、及び/又は
(v) 植物キチナーゼの遺伝子の発現プロファイル
が、無処理対照植物に比較して例えば2倍又はそれより多く、好ましくは2〜100倍、好ましくは2〜20倍、特に好ましくは2〜10倍、極めて好ましくは2〜5倍増大し、そして個々の遺伝子が変化した遺伝子発現プロファイルの増大は、上記に言及した異なる範囲においてそれぞれ互いに独立に存在できる。
実施例1
遺伝子の発現プロファイル(GEP)による植物における防御機構に対する薬害軽減剤の効果の検出:
大麦植物 (品種:Baronesse) を、コンポスト(肥料混合培養土)を詰めたポット(直径:10cm) で10日間、環境調節キャビネット中で、所定の光量、湿度及び温度条件(白色光、70%大気湿度、24℃)の下で生育させた。噴霧処理の時点では、苗は約15cmの草丈であった。この試験のために選んだ試験物質は構造において著しく異なり、そしてよく実証された顕著な薬害軽減剤効果を有する分子であり、そして他の分子は文献により植物ストレスに対する効果及び病原体防御性を有する(表1)。これらの試験物質はDMSO(ジメチルスルホキシド、c=10mg/ml)の保存溶液として調製した。これを湿潤剤として0.2% アグロチン(Agrotin)(ポリビニルアルコール、シリコーン、多糖及びpH調節剤を含有、製造元:Bayer CropScience AG, Monheim, Germany)を添加した水で、表に示されている施用率となるように希釈するために使用した。噴霧処理の液量は、800l/haに対応して、ポット当り800μlであった。噴霧混合物800μlごとに、EC予備混合物:ジアセトンアルコール=1:6の16μlを製剤補助剤として追加的に添加した。表1に記載されている物質を、空気圧式噴霧ピストルを用いて葉面に処理した。各物質は2回適用で噴霧し、そして全ての試験は反復して行った(各物質当り2ポット)。有効成分を含んでいないブランク製剤の噴霧を対照として行った。6時間後に葉を収穫し、液体窒素中で凍結し、そして使用するまで−80℃で保存した。DNAチップハイブリダイゼーションのための標識RNAプローブは、アフィメトリックス(Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)からのプロトコール(発現解析、技術マニュアル)中に記載されているように、調製した。最初に、全RNAをそれぞれの場合に収穫した葉の500mgから単離した。それぞれの場合、全RNAの10μgを第一鎖及び第二鎖cDNAの合成に使用した。このcDNAを T7ポリメラーゼを用いて増幅し、そして同時にビオチン−UTPを用いて標識した。それぞれの場合、ビオチン化されたcDNAの20μgをアフィメトリックスからの大麦ゲノムアレイ(Gene Chip Barley1, order No.: 511012)のハイブリダイゼーションに使用した。このDNAマイクロアレイは、総計400 000個のEST配列から構成されている22 840個の遺伝子のDNA配列を含んでいる。それ故、このDNAマイクロアレイをアフィメトリックス フルイデイックス ステーション(Affymetrix Fluidics Station)で洗浄し、ストレプトアビジン/フィコエリトリン(Molecular Probes、P/N S-866)で染色し、そして適合するアジレント(Agilent)レーザースキャナー (Agilent 遺伝子アレイスキャナー)でスキャンした。得られた蛍光データはアフィメトリックスのソフトウエア、マイクロアレイスイート5( Microarray Suite 5)で解析した。品質検定を行った後に、全てのDNAチップ解析をデータベースに保存した。遺伝子の相対的な発現値(誘導係数、抑制係数)を決定するために、試験及び対照チップを互いに比較し、そしてアフィメトリックスソフトウエアによるスコアリング関数のセットを基準として用いた。それぞれの場合、1回の試験当り2回の生物的反復を、2つの対照チップ(ブランク構築物)と比較し、そして各遺伝子について得られた4回の発現値を中央値の計算に用いた。これらの中央値を誘導係数として結果の表の中に表示している。異なる試験からの発現プロファイルの類似性比較及びクラスター解析は、アプライドマス(Applied Maths, Keistraat 120, 9830 Sint-Martens-Latem, Belgium)のソフトウエア、ジーンマス(GeneMaths)1.5を用いて行った。
(a) 植物ジャスモン酸の生合成の遺伝子 (1.1−1.20)
(b) 植物プロテイナーゼインヒビターをコードする遺伝子 (2.1−2.4)
(c) 植物キシラナーゼインヒビターをコードする遺伝子(3.1)
Blast解析を用いて、他の注釈付き配列データベースから、最も可能性の高い対応する既知の配列を「プローブセット」番号に割り当てることができる。Blast解析において示されたこれらのデータは以下に表示している。
(a) 植物PRタンパク質をコードする遺伝子 (4.1−4.3)
(b) 植物キチナーゼをコードする遺伝子 (5.1−5.3)
Blast解析を用いて、他の注釈付き配列データベースから、最も可能性の高い対応する既知の配列を「プローブセット」番号に割り当てることができる。Blast解析において示されたこれらのデータは以下に表示している。
薬害軽減剤−処理した植物の植物病原性害虫に対する忌避効果:
大麦植物(品種:Baronesse)を実施例1に記載されているように生育させ、そして10日後にイソキサジフェン−エチル(S3)の150g a.i./ha、又は対照製剤を噴霧処理により施用した。この試験はそれぞれの場合10ポットごとの反復として行った。
試験物質を処理した6時間又は24時間後に、全てのポットを植物病原性のムギクビレアブラムシ(Rhopalosiphum padi)の個体集団を均一に群生させた。この試験の結果を7日及び14日後に、葉の上の昆虫の個体数を計測して評価した。薬害軽減剤−処理した植物のアブラムシの個体数は、7日後では平均して対照よりも50%少なく、そして14日後では70%少なかった。
アブラムシに対するイソキサジフェン−エチル(S3)の直接的毒性は、植物の無いサッシェ(Sachez)試験においては検出されなかった。
イソキサジフェン−処理の植物におけるオキソフィトジエノエート (OPDA) 及びジャスモネート (JA) の増大した濃度の検出
大麦植物(品種:Baronesse)を実施例1に記載されているように生育させ、そして10日後に薬害軽減剤のイソキサジフェン−エチル(S3)を噴霧処理により施用した。施用量は以下のように選択した。
(1) 30 [g a.i./ha] ; (2) 150 [g a.i./ha] ; (3) ブランク製剤(有効成分無し)
植物の葉を処理後異なる時間の時点、即ち、1h、2h、4h、6h、12h、24h及び48h(h=時間)で収穫した。全てのサンプルはそれぞれの場合3ポットの反復として計画した。
オクタデカノエート及びジャスモネートは、文献(Mueller A、Duchting P 及び Weiler EW (2002)、A multiplex GC-MS/MS technique for the sensitive and quantitative single-run analysis of acidic phytohormones and related compounds, and its application to Arabidopsis thaliana. Planta, 216, 44-56頁) に記載されている方法に基づいて、収穫した葉から加工処理を行った。
植物材料の300mgを各測定時点で抽出した。
[13C]2−JAの50pmol及び [17,17,17,18,18−2H]−cis−OPDAの100pmolを内部標準として適用した。抽出物は自家製の小型の固相交換カラムを用いたアミノプロピル陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
Claims (5)
- 無処理対照植物に比較して増大した発現プロファイルを有する、ジャスモン酸の生合成に関与するタンパク質の群からのタンパク質をコードする1より多い遺伝子により、植物中において、植物病原性の生物体に対する防御の増大に直接的又は間接的に貢献するための、メフェンピル−ジメチル、メフェンピル−ジエチル、メフェンピル類似体、イソキサジフェン−エチル、クロキントセト−メキシル、クロキントセト誘導体及びピリジンカルボキサミドからなる群から選択される化合物の単独での使用。
- 化合物が植物病原性の生物体に対する防御を増大するために、特異的にそして直接的に植物病原体に対して作用する先行技術化合物と組み合わせて、同時に又は交互に処理を行うことができる、有用植物の作物栽培において使用される、請求項1に記載の使用。
- メフェンピル誘導体又はイソキサジフェン誘導体を、有害な生物体に直接的に作用する殺虫剤と組み合わせて使用する、請求項2に記載の使用。
- メフェンピル誘導体の場合で、有害な生物体に直接的に作用する殺虫剤がケトエノール又はニトロメチレン/ニトロイミンに該当するものである、請求項3に記載の使用。
- 増大した発現プロファイルを有する、ジャスモン酸の生合成に関与するタンパク質の群からのタンパク質をコードする1より多い遺伝子により、植物病原性の生物体に対する防御を増大するために、植物に直接的に又は間接的に用いられる、メフェンピル−ジメチル、メフェンピル−ジエチル、メフェンピル類似体、イソキサジフェン−エチル、クロキントセト−メキシル、クロキントセト誘導体及びピリジンカルボキサミドからなる群から選択される化合物を単独で施用することによって、有用植物の作物栽培において有用植物の作物を植物病原性の生物体から保護する方法。
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