JP2008506398A - 植物の病原体防御を増大する活性物質及びそれらの検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物の病原体防御を誘導する化合物を検出する方法に関するものである。ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼ阻害物質、植物キシラナーゼ阻害物質、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び植物キチナーゼの群からの個々の又は複数の内因性の植物遺伝子の発現の増大は、かかる誘導の徴候とみなされる。また本発明は、植物病原体との関連において直接的に活性でありそして特異的である先行既知化合物と当該化合物とを一緒に又は組み合わせて使用することにも関する。この適用は同時に又は一時的に行うことができる。
Description
本発明は、植物の病原体防御を誘導する化合物を見出す方法であって、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び植物キチナーゼの群からの個々の又は複数の内因性の植物遺伝子の増大した発現がその誘導が引き起こされたサインとみなされる方法、並びにこれらの化合物を単独で又は植物病原体に対して特異的にそして直接的に作用する既知の化合物と組み合わせて、同時に又は交互に処理を行うことができる、使用に関するものである。
植物は、例えば寒冷、猛暑、干ばつ、傷害、病原体の攻撃（ウイルス、細菌、真菌、昆虫）等のような自然界のストレス状態、更には除草剤に対し、特異的な又は非特異的な防御機構を用いて応答することが知られている（Pflanzenbiochemie、393-462頁、Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, Hans W. Heldt, 1996；Biochemistry and Molecular Biology of Plants、1102-1203頁、American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland, eds. Buchanan, Gruissem, Jones, 2000）。このような状況において、シグナル物質、例えば傷害によって生成した細胞壁の構成物質、又は病原体に由来する特異的なシグナル物質が、ストレス源に対する防御分子の形成を結果的に導き出す植物シグナル誘導鎖の誘引因子として作用する。これらは、例えば、(ａ) 例えばフィトアレキシンのような低分子の物質、(ｂ)例えば病原体関連タンパク質（ＰＲタンパク質）のような非酵素的なタンパク質、 (ｃ) 例えばキチナーゼ、グルカナーゼのような酵素的なタンパク質、又は (ｄ) 例えばプロテイナーゼインヒビター、キシラナーゼインヒビターのような必須タンパク質の特異的な阻害因子の形態をとることができ、そしてこれらの物質は病原体を直接的に攻撃するか又は増殖を妨害する (Dangl 及び Jones、 2001, Nature 411: 826-833頁; Kessler 及び Baldwin、2003, Annual Review of Plant Biology, 53: 299-328頁)。
追加的な防御機構は、過敏反応(HR)として知られているものであり、それは酸化ストレスが介在しそして感染した斑点周囲の植物組織を枯死に至らせるものであるが、その結果として生細胞に依存する植物病原体の拡散を防止することができる（Pennazio, 1995, New Microbiol. 18、229-240頁）。
更なる感染経路においては、シグナルは植物メッセンジャー物質によって非感染組織中へと伝達され、そこにおいて再度、誘引された防御反応を引き起こしそして二次感染の形成を防止する(全身獲得性耐性、SAR) （Ryalsら、1996、The Plant Cell 8: 1809-1819頁）。
ストレス耐性又は病原体防御に関与する一連の内因性の植物シグナル物質は既に知られている。以下のものを言及することができる：サリチル酸、安息香酸、ジャスモン酸又はエチレン（Biochemistry and Molecular Biology of Plants、850-929頁、American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland, eds. Buchanan, Gruissem, Jones, 2000）。これらの物質のいくつか又はそれらの安定な合成誘導体及び誘導された構造は、植物又は種子粉衣として外的に処理した場合に有効であり、植物のストレス又は病原体の耐性を増強する結果となる（Sembdner及びParthier、1993, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44: 569-589頁）。サリチル酸塩介在の防御は、特に植物病原性の真菌、細菌及びウイルスに対して作用する（Ryalsら、1996, The Plant Cell 8: 1809-1819頁）。
サリチル酸の作用に匹敵する作用を有し、そして植物病原性の真菌、細菌及びウイルスに対して保護効果を引き引き起こすことができる既知の合成製品としては、ベンゾチアジアゾールがある (登録商標：Bion) （Achuoら、2004、Plant Pathology 53 (1): 65-72頁）。
例えば、ジャスモン酸のようなオキシリピン系に属する他の化合物、及びそれらが誘引となって起こる保護機構は、有害な昆虫に対し特に活性である（Walling, 2000, J Plant Growth Regul. 19, 195-216頁）。
このように植物が、広範囲の有害な生物及び／又は自然界の非生物的なストレスに対する有効な防御をもたらす能力のある複数の内因性の反応機構を利用できることが知られている。しかしながら有効成分の処理によってどの防御反応が特異的に引き起こされるかは今日でも知られていない。
それ故、有害な生物及び／又は自然界の非生物的なストレス（例えば猛暑、寒冷、干ばつ、塩害及び酸／アルカリ ストレスのような）に対する内因性の植物防御機構の分子活性因子を特異的に見つけ出すための方法が必要とされ、それによって新規な有効成分を見つけ出すことができ、既知の有効成分で異なる作用様式をもった新規な特性が同定でき、その他既知の分子又は先導的な構造が、内因性の植物防御機構の誘導源としての使用のために最適化することができる。
これより以下に使用する用語の定義
本明細書において用いる用語「Blast解析」(Blast = Basic Local Alignment Search Tool)とは、相同性を有する可能性のある配列(Altschul ら、J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410頁)の、分類、及び「有意性判定基準」（スコアリング関数）の形式で設定されている所望の一致を用いて、照会配列と一つ又はそれより多いデータベースの全配列との比較（アラインメント）を行うことによるその検出(R. Rauhut, Bioinformatik、38-107頁、Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001)に好適なコンピュータプログラムの使用をいう。
本明細書において用いる用語「Blast解析」(Blast = Basic Local Alignment Search Tool)とは、相同性を有する可能性のある配列(Altschul ら、J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410頁)の、分類、及び「有意性判定基準」（スコアリング関数）の形式で設定されている所望の一致を用いて、照会配列と一つ又はそれより多いデータベースの全配列との比較（アラインメント）を行うことによるその検出(R. Rauhut, Bioinformatik、38-107頁、Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001)に好適なコンピュータプログラムの使用をいう。
本明細書において用いる用語「ｃＤＮＡ」 (相補的ＤＮＡ)とは、ＲＮＡに相補的でありそして酵素的逆転写によってin vitroで合成される一本鎖ＤＮＡをいう。このｃＤＮＡは鋳型として作用する完全長ＲＮＡ又はＲＮＡの部分的配列だけの構成要素に対応することができる。
本明細書において用いる用語「クラスター解析」とは、測定されたそれぞれのデータを、クラスターとして表示される同様の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子群、又は同様の発現パターンを有する遺伝子群を用いて、この目的のために開発されたコンピュータプログラムによりクラスター分類することを意味する。系統樹の形式で表示することができる複合データパターンの階層的な最小限化を、それによって遂行することができる。得られたデータセットの分類的な評価が、相互関係のないデータの単なる集積以上であるクラスター解析によって可能となる。
本明細書において同義語として用いられる用語「ＤＮＡチップ」、「ＤＮＡアレイ」及び「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、ガラス又はナイロンをベースとして含んでいる支持体を意味し、そのベースにはＤＮＡフラグメントが付着しており、そこで、例えば（ａ）写真平版印刷工程（アレイの支持体の上でＤＡＮが直接的に合成される）、（ｂ）マイクロスポット法（外部で合成したオリゴヌクレオチド又はＰＣＲ生成物を支持体に適用し、共有結合させる）、又は（ｃ）マイクロスプレー法（外部で合成したオリゴヌクレオチド又はＰＣＲ生成物を支持体にインク−ジェットプリンターを用いて接触することなく噴霧する方法）(R. Rauhut, Bioinformatik、197-199頁、Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2001)によって、ＤＮＡを適用させることができる。生物体のゲノム配列を表わすＤＮＡチップは「ゲノムＤＮＡチップ」とよばれる。これらの「ＤＮＡチップ」を用いて得られたデータの評価は「ＤＮＡチップ解析」という。
本明細書において用いられる用語「ＤＮＡチップハイブリダイゼーション」とは、２本の一本鎖相補的核酸分子の対を意味し、塩基対分子の一方の相手はＤＮＡチップ上のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）として配置しており、これは好ましくは共有結合を形成しており、他方はＲＮＡ（リボ核酸）又は対応するｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）の形態で溶液中で存在している。結合している及び結合していない核酸のハイブリダイゼーションは水溶性緩衝液中においてＤＮＡチップ上で起こり、場合によっては、例えばジメチルスルホキシドの存在下、温度30〜60℃、好ましくは40〜50℃、特に好ましくは45℃で、10〜20時間、好ましくは14〜18時間、特に好ましくは16時間の定速撹拌のような追加的な変性条件下において起こる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えばハイブリダイゼーション オーブン中におけるような恒常的な状態において確立することができる。そのようなハイブリダイゼーション オーブン中では、60rpm (毎分の回転数)の振動で通常行われる。
本明細書における核酸配列として用いられる用語「ＥＳＴ配列」 (発現配列タグ：expressed sequence tag) とは、200−500塩基又は塩基対の短い配列を意味する。
本明細書において同義語として用いられる用語「発現パターン」、「誘導パターン」及び「発現プロファイル」とは、植物ｍＲＮＡの一時的な分化及び／又は組織特異的な発現を意味し、そのパターンは、ＤＮＡチップ技術の助けを得て、植物から得られるＲＮＡ又はそれに対応するｃＤＮＡのハイブリダイゼーションシグナルの発生強度によって直接的に得ることができる。測定された「発現値」とは、無処理対照植物のハイブリダイゼーション下の同義のチップを用いて得た対応するシグナルを用いて直接コンピュータ計算した結果である。
本明細書において用いる用語、遂行した遺伝子発現プロファイルによって得られた「発現状態」とは、ＤＮＡチップの助けを得て測定された細胞遺伝子の全ての記録された転写活性をいう。
本明細書において用いる用語「総ＲＮＡ」とは、使用した抽出方法の結果として可能な、例えば細胞質ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、細胞質ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、細胞質ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、及びそれらのそれぞれの核前駆体であるctＲＮＡ(クロロプラストＲＮＡ) 及びmtＲＮＡ (ミトコンドリアＲＮＡ)のような植物細胞中に存在している可能性のある異なる内因性の植物ＲＮＡを意味するが、更に、例えばウイルス又は寄生的な細菌及び真菌のような外因性の生物体から由来するＲＮＡ分子も含んでいる。
本明細書において用いられる用語「有用な植物」とは、食物、飼料を得るための又は工業的な目的のための植物として使用される作物植物を意味する。
本明細書において用いられる用語「薬害軽減剤（safener）」とは、内因性の植物起源ではなく、そして例えば雑草、細菌、ウイルス及び真菌のような有害な生物体に対する有害生物防除効果を実質的に減じることなしに、作物植物への有害生物防除剤の植物毒性効果を除去する又は減少する化合物を意味する。
本発明は、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び植物キチナーゼの群から選択される内因性の個々の又は複数の植物遺伝子の転写又は発現を増大させることがその誘導が引き起こされたサインとみなされる、植物の病原体防御を誘導する化合物を見出す方法に関するものである。
本発明は、特に内因性の植物病原体防御酵素をコードする遺伝子の発現を誘導する化合物を見出す方法に関するものであり、ここにおいて：
ａ) 試験植物を適当な量の試験物質に接触させ、
ｂ) 対照植物は、試験物質に接触させないこと以外は、試験植物ａ）と同一の条件下であり、
ｃ) 試験植物及び対照植物からＲＮＡを抽出し、
ｄ) ＲＮＡは直接的に放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又はＲＮＡは対応するｃＤＮＡ中に同時に酵素的に転写されるときに放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又は結果として得られた無標識のｃＤＮＡを対応する放射性標識された若しくは放射性標識されていないｃＲＮＡ中に酵素的に転写し、
ｅ) 植物ＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡアレイを工程ｄ）で得られた物質とハイブリダイズさせ、
ｆ) ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼの発現のための遺伝子の発現プロファイルを、工程ａ）及びｂ）の記載のように試験した植物に関して比較する様式で作成し、
ｇ) 工程ｆ）において測定した発現の差違を定量化し、そして
ｈ) 工程ｇ）に記載のように割り当てられた発現プロファイルを、クラスター解析を用いた最終的な体系的なグループ分けに付する。
ａ) 試験植物を適当な量の試験物質に接触させ、
ｂ) 対照植物は、試験物質に接触させないこと以外は、試験植物ａ）と同一の条件下であり、
ｃ) 試験植物及び対照植物からＲＮＡを抽出し、
ｄ) ＲＮＡは直接的に放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又はＲＮＡは対応するｃＤＮＡ中に同時に酵素的に転写されるときに放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又は結果として得られた無標識のｃＤＮＡを対応する放射性標識された若しくは放射性標識されていないｃＲＮＡ中に酵素的に転写し、
ｅ) 植物ＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡアレイを工程ｄ）で得られた物質とハイブリダイズさせ、
ｆ) ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼの発現のための遺伝子の発現プロファイルを、工程ａ）及びｂ）の記載のように試験した植物に関して比較する様式で作成し、
ｇ) 工程ｆ）において測定した発現の差違を定量化し、そして
ｈ) 工程ｇ）に記載のように割り当てられた発現プロファイルを、クラスター解析を用いた最終的な体系的なグループ分けに付する。
上記に言及した工程ｄ）の場合、得られたcＤＮＡをcＲＮＡ中へ酵素的に転写されることは、そのことによってハイブリダイゼーション プローブが再び増幅できるために、好ましい製造工程として考慮されるべきである。同様に好ましいものは、非放射性核酸による標識、特に好ましくはビオチン化されたＵＴＰ及び／又はＣＴＰによる標識であり、ここにおいて一旦ハイブリダイゼーション反応が遂行されれば、蛍光体としてのストレプトアビジン−フィコエリトリンのビオチン化ｃＲＮＡへの結合によって検出が行われる。測定された発現の差違の定量化のための基礎として用いられる特異的なフィコエリトリン蛍光は、ハイブリダイゼーションの後にレーザースキャナーによって検出される。
本発明の好ましい主題は、上記に言及した工程ａ）〜ｈ）を厳守する方法であって、
(ｉ) リパーゼ−類似タンパク質である、12−オキソフィトジエノエートレダクターゼ (EC 1.3.1.42)、アレン−オキシドシクラーゼ、12−オキソフィトジエン酸レダクターゼの遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(ii) PIR タンパク質データベースの登録番号S71555を付したプロテイナーゼインヒビターと有意の相同性を有する植物プロテイナーゼインヒビターの遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(iii) 植物キシラナーゼインヒビタータンパク質の遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(iv) PIR タンパク質データベースの登録番号T06168を付した大麦の病原体関連(PR)タンパク質と有意の相同性を有するタンパク質である、病原体誘導性植物ペロキシダーゼ(EC1.11.1.7) の遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(ｖ) 植物キチナーゼの遺伝子の発現プロファイル
が、無処理対照植物に比較して例えば２倍又はそれより多く、好ましくは２〜100倍、好ましくは２〜20倍、特に好ましくは２〜10倍、極めて好ましくは２〜５倍増大し、そして個々の遺伝子が変化した遺伝子発現プロファイルの増大は、上記に言及した異なる範囲においてそれぞれ互いに独立に存在できる。
(ｉ) リパーゼ−類似タンパク質である、12−オキソフィトジエノエートレダクターゼ (EC 1.3.1.42)、アレン−オキシドシクラーゼ、12−オキソフィトジエン酸レダクターゼの遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(ii) PIR タンパク質データベースの登録番号S71555を付したプロテイナーゼインヒビターと有意の相同性を有する植物プロテイナーゼインヒビターの遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(iii) 植物キシラナーゼインヒビタータンパク質の遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(iv) PIR タンパク質データベースの登録番号T06168を付した大麦の病原体関連(PR)タンパク質と有意の相同性を有するタンパク質である、病原体誘導性植物ペロキシダーゼ(EC1.11.1.7) の遺伝子の発現プロファイル、及び／又は
(ｖ) 植物キチナーゼの遺伝子の発現プロファイル
が、無処理対照植物に比較して例えば２倍又はそれより多く、好ましくは２〜100倍、好ましくは２〜20倍、特に好ましくは２〜10倍、極めて好ましくは２〜５倍増大し、そして個々の遺伝子が変化した遺伝子発現プロファイルの増大は、上記に言及した異なる範囲においてそれぞれ互いに独立に存在できる。
更に本発明は、植物からの遺伝子情報、好ましくは有用な植物からの遺伝子情報、特に好ましくは例えば大麦、トウモロコシ、小麦、稲、エンバク、菜種、砂糖大根のような有用植物からの遺伝子情報に基づいて、変化した遺伝子発現パターンを見出すために利用される、或る種のＤＮＡマイクロアレイの使用に関するものである。この文脈において、試験化合物で処理した植物中で、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼの遺伝子の遺伝子パターンの無処理対照植物と比較した場合の相対的な変化が観察される。
更に、上記の方法において陽性、即ち、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼの遺伝子に対する誘導効果とみなされる発現を増大するものと同定された化合物の有用な植物でのストレス耐性及び／又は病原体防御を増大させるための活性成分としての使用に関するものである。
それ故本発明は、増大した発現プロファイルを有する、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び植物キチナーゼの群からのタンパク質の、少なくとも１つの遺伝子、好ましくは１つより多い遺伝子により、例えば昆虫、真菌、細菌又はウイルスのような植物病原性の生物体に対する増大した防御に、例えば情報伝達鎖によるような仕方でもって、植物中で直接的に又は間接的に貢献する化合物の使用に関するものである。
例えば、メフェンピル−ジメチル、メフェンピル−ジエチル、メフェンピル類似体、イソキサジフェン−エチル、クロキントセト−メキシル、クロキントセト誘導体及びピリジンカルボキサミドのような、作物保護における用途が薬害軽減剤として既に知られている化合物の使用は、本明細書において好ましいものである。
上記の化合物を適用することにより、植物病原性の生物体（害虫、真菌、細菌、ウイルス）に対して作物植物を有効に保護することが可能となり、また例えばより多い収穫への効果を有する。これらの生物体に対して直接的に作用する有効成分以上の有利な点は、有益な生物は問題としているような防御反応を誘発しないために、無傷のままに残るという点である。
それ故本発明は、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼの遺伝子の発現プロファイルを考慮に入れたＤＮＡアレイの助けを得て同定された化合物を、植物病原性の生物体、特に昆虫、真菌、細菌及びウイルスに対して適用することによって、有用植物の作物栽培における有用植物を保護する方法にも関するものである。極めて特に好ましいものは、植物病原性の生物体に対する、殊に昆虫、極めて殊には吸引昆虫に対する保護である。
例えば、既に薬害軽減剤として知られている化合物のような、ＤＮＡアレイの助けを得て同定された化合物によって誘発される上記の機構はまた、これらの化合物と、例えば殺虫剤及び殺菌剤のような植物病原性の生物体に対する特異的にそして直接的に作用するその他の化合物との間に相乗効果を導き出し、特に殺虫剤及び殺菌剤と同時に又は交互に適用するときに、殊に例えばケトエノール（例えば EP 528156; EP 596298）の群からの化合物のような殺虫剤、又はニコチン性アセチルコリン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのような化合物との間に相乗効果を導き出す。最後に言及した化合物の幾つかは、ニトロメチレン又はニトロイミン及び関連化合物の用語の下に分類される (例えば EP 464830)。
それ故本発明はまた、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼの遺伝子の発現プロファイルを考慮に入れたＤＮＡアレイを手段として選抜して同定される化合物と、植物病原性の生物体に対して特異的にそして直接的に作用する先行技術化合物との組み合わせ、例えばメフェンピル誘導体（例えば、「The Pesticide Manual、１３版、2003」中にNo. 506として記載されている化合物）と有害な生物体に直接的に作用する殺虫剤、特に好ましくはケトエノールの群若しくはニトロメチレン／ニトロイミンの群からの殺虫剤との組み合わせとしての使用、又はイソキサジフェン誘導体（例えば、「The Pesticide Manual、１３版、2003」中のNo. 478として記載されている化合物のような）と有害な生物体に直接的に作用する殺虫剤との組み合わせとしての使用であって、その適用は同時に又は交互に行うことが可能である、該化合物の使用に関する。その適用が同時に行われない場合は、有害な生物に直接的に作用する殺虫剤は、本願に記載されているＤＮＡアレイを用いて同定された化合物の適用の前又は後のいずれにおいても適用することができ、その有害な生物に直接的に作用する殺虫剤の適用に続いて適用することが好ましい。
以下の実施例は本発明について詳細に説明している。
実施例１
遺伝子の発現プロファイル(ＧＥＰ)による植物における防御機構に対する薬害軽減剤の効果の検出：
大麦植物 (品種：Baronesse) を、コンポスト（肥料混合培養土）を詰めたポット（直径：１０cm) で１０日間、環境調節キャビネット中で、所定の光量、湿度及び温度条件(白色光、７０％大気湿度、２４℃)の下で生育させた。噴霧処理の時点では、苗は約１５cmの草丈であった。この試験のために選んだ試験物質は構造において著しく異なり、そしてよく実証された顕著な薬害軽減剤効果を有する分子であり、そして他の分子は文献により植物ストレスに対する効果及び病原体防御性を有する（表１）。これらの試験物質はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、ｃ＝10mg／ml)の保存溶液として調製した。これを湿潤剤として０.２％ アグロチン（Agrotin）(ポリビニルアルコール、シリコーン、多糖及びｐＨ調節剤を含有、製造元：Bayer CropScience AG, Monheim, Germany)を添加した水で、表に示されている施用率となるように希釈するために使用した。噴霧処理の液量は、800ｌ／haに対応して、ポット当り800μlであった。噴霧混合物800μlごとに、ＥＣ予備混合物：ジアセトンアルコール＝１：６の16μlを製剤補助剤として追加的に添加した。表１に記載されている物質を、空気圧式噴霧ピストルを用いて葉面に処理した。各物質は２回適用で噴霧し、そして全ての試験は反復して行った（各物質当り２ポット）。有効成分を含んでいないブランク製剤の噴霧を対照として行った。６時間後に葉を収穫し、液体窒素中で凍結し、そして使用するまで−80℃で保存した。ＤＮＡチップハイブリダイゼーションのための標識ＲＮＡプローブは、アフィメトリックス(Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)からのプロトコール(発現解析、技術マニュアル)中に記載されているように、調製した。最初に、全ＲＮＡをそれぞれの場合に収穫した葉の500mgから単離した。それぞれの場合、全ＲＮＡの10μgを第一鎖及び第二鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。このｃＤＮＡを Ｔ７ポリメラーゼを用いて増幅し、そして同時にビオチン−ＵＴＰを用いて標識した。それぞれの場合、ビオチン化されたｃＤＮＡの20μgをアフィメトリックスからの大麦ゲノムアレイ(Gene Chip Barley1, order No.: 511012)のハイブリダイゼーションに使用した。このＤＮＡマイクロアレイは、総計400 000個のＥＳＴ配列から構成されている22 840個の遺伝子のＤＮＡ配列を含んでいる。それ故、このＤＮＡマイクロアレイをアフィメトリックス フルイデイックス ステーション（Affymetrix Fluidics Station）で洗浄し、ストレプトアビジン／フィコエリトリン(Molecular Probes、P／N S-866)で染色し、そして適合するアジレント（Agilent）レーザースキャナー (Agilent 遺伝子アレイスキャナー)でスキャンした。得られた蛍光データはアフィメトリックスのソフトウエア、マイクロアレイスイート５（ Microarray Suite 5）で解析した。品質検定を行った後に、全てのＤＮＡチップ解析をデータベースに保存した。遺伝子の相対的な発現値（誘導係数、抑制係数）を決定するために、試験及び対照チップを互いに比較し、そしてアフィメトリックスソフトウエアによるスコアリング関数のセットを基準として用いた。それぞれの場合、１回の試験当り２回の生物的反復を、２つの対照チップ（ブランク構築物）と比較し、そして各遺伝子について得られた４回の発現値を中央値の計算に用いた。これらの中央値を誘導係数として結果の表の中に表示している。異なる試験からの発現プロファイルの類似性比較及びクラスター解析は、アプライドマス(Applied Maths, Keistraat 120, 9830 Sint-Martens-Latem, Belgium)のソフトウエア、ジーンマス（GeneMaths）1.5を用いて行った。
実施例１
遺伝子の発現プロファイル(ＧＥＰ)による植物における防御機構に対する薬害軽減剤の効果の検出：
大麦植物 (品種：Baronesse) を、コンポスト（肥料混合培養土）を詰めたポット（直径：１０cm) で１０日間、環境調節キャビネット中で、所定の光量、湿度及び温度条件(白色光、７０％大気湿度、２４℃)の下で生育させた。噴霧処理の時点では、苗は約１５cmの草丈であった。この試験のために選んだ試験物質は構造において著しく異なり、そしてよく実証された顕著な薬害軽減剤効果を有する分子であり、そして他の分子は文献により植物ストレスに対する効果及び病原体防御性を有する（表１）。これらの試験物質はＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、ｃ＝10mg／ml)の保存溶液として調製した。これを湿潤剤として０.２％ アグロチン（Agrotin）(ポリビニルアルコール、シリコーン、多糖及びｐＨ調節剤を含有、製造元：Bayer CropScience AG, Monheim, Germany)を添加した水で、表に示されている施用率となるように希釈するために使用した。噴霧処理の液量は、800ｌ／haに対応して、ポット当り800μlであった。噴霧混合物800μlごとに、ＥＣ予備混合物：ジアセトンアルコール＝１：６の16μlを製剤補助剤として追加的に添加した。表１に記載されている物質を、空気圧式噴霧ピストルを用いて葉面に処理した。各物質は２回適用で噴霧し、そして全ての試験は反復して行った（各物質当り２ポット）。有効成分を含んでいないブランク製剤の噴霧を対照として行った。６時間後に葉を収穫し、液体窒素中で凍結し、そして使用するまで−80℃で保存した。ＤＮＡチップハイブリダイゼーションのための標識ＲＮＡプローブは、アフィメトリックス(Affymetrix Inc., 3380 Central Expressway, Santa Clara, CA, USA)からのプロトコール(発現解析、技術マニュアル)中に記載されているように、調製した。最初に、全ＲＮＡをそれぞれの場合に収穫した葉の500mgから単離した。それぞれの場合、全ＲＮＡの10μgを第一鎖及び第二鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。このｃＤＮＡを Ｔ７ポリメラーゼを用いて増幅し、そして同時にビオチン−ＵＴＰを用いて標識した。それぞれの場合、ビオチン化されたｃＤＮＡの20μgをアフィメトリックスからの大麦ゲノムアレイ(Gene Chip Barley1, order No.: 511012)のハイブリダイゼーションに使用した。このＤＮＡマイクロアレイは、総計400 000個のＥＳＴ配列から構成されている22 840個の遺伝子のＤＮＡ配列を含んでいる。それ故、このＤＮＡマイクロアレイをアフィメトリックス フルイデイックス ステーション（Affymetrix Fluidics Station）で洗浄し、ストレプトアビジン／フィコエリトリン(Molecular Probes、P／N S-866)で染色し、そして適合するアジレント（Agilent）レーザースキャナー (Agilent 遺伝子アレイスキャナー)でスキャンした。得られた蛍光データはアフィメトリックスのソフトウエア、マイクロアレイスイート５（ Microarray Suite 5）で解析した。品質検定を行った後に、全てのＤＮＡチップ解析をデータベースに保存した。遺伝子の相対的な発現値（誘導係数、抑制係数）を決定するために、試験及び対照チップを互いに比較し、そしてアフィメトリックスソフトウエアによるスコアリング関数のセットを基準として用いた。それぞれの場合、１回の試験当り２回の生物的反復を、２つの対照チップ（ブランク構築物）と比較し、そして各遺伝子について得られた４回の発現値を中央値の計算に用いた。これらの中央値を誘導係数として結果の表の中に表示している。異なる試験からの発現プロファイルの類似性比較及びクラスター解析は、アプライドマス(Applied Maths, Keistraat 120, 9830 Sint-Martens-Latem, Belgium)のソフトウエア、ジーンマス（GeneMaths）1.5を用いて行った。
特異的な代謝経路からの遺伝子群及び情報伝達鎖は、アフィメトリックスによって提供された、遺伝子のアノテーション中のキーワード検索、及びＤＮＡ標的配列、即ち、特徴付けられた機能を有する他の生物、好ましくは植物からの遺伝子配列を用い、ＤＮＡチップ上で同定されたポジティブ配列（改変した発現プロファイルに基づいて同定された）のBlast 解析 (相同性比較)によって、統合化された。
上記の表１において表示した、使用した試験物質の構造式：
ストレス耐性及び病原体防御において役割を果たすシグナル伝達系及び代謝経路の遺伝子群のスクリーニングの結果、とりわけ、薬害軽減剤効果として既に知られている一群の化合物 (S1-S6)に関してプロテアーゼ及びキシラナーゼインヒビターの遺伝子及びジャスモン酸の生合成遺伝子(表２ａ)、並びに ＰＲタンパク質及びキチナーゼの遺伝子(表２ｂ)に対する、高いレベルの遺伝子誘導が明らかとなった。
下記について測定した発現値（無処理対照の値よりもｘ倍以上）：
(ａ) 植物ジャスモン酸の生合成の遺伝子 (1.1−1.20)
(ｂ) 植物プロテイナーゼインヒビターをコードする遺伝子 (2.1−2.4)
(ｃ) 植物キシラナーゼインヒビターをコードする遺伝子(3.1)
(ａ) 植物ジャスモン酸の生合成の遺伝子 (1.1−1.20)
(ｂ) 植物プロテイナーゼインヒビターをコードする遺伝子 (2.1−2.4)
(ｃ) 植物キシラナーゼインヒビターをコードする遺伝子(3.1)
アフィメトリックスチップの各ＤＮＡチップ位置に対応する「プローブセット」番号
Blast解析を用いて、他の注釈付き配列データベースから、最も可能性の高い対応する既知の配列を「プローブセット」番号に割り当てることができる。Blast解析において示されたこれらのデータは以下に表示している。
Blast解析を用いて、他の注釈付き配列データベースから、最も可能性の高い対応する既知の配列を「プローブセット」番号に割り当てることができる。Blast解析において示されたこれらのデータは以下に表示している。
下記について測定した発現値（無処理対照の値よりもｘ倍以上）：
(ａ) 植物ＰＲタンパク質をコードする遺伝子 (4.1−4.3)
(ｂ) 植物キチナーゼをコードする遺伝子 (5.1−5.3)
(ａ) 植物ＰＲタンパク質をコードする遺伝子 (4.1−4.3)
(ｂ) 植物キチナーゼをコードする遺伝子 (5.1−5.3)
アフィメトリックスチップの各ＤＮＡチップ位置に対応する「プローブセット」番号
Blast解析を用いて、他の注釈付き配列データベースから、最も可能性の高い対応する既知の配列を「プローブセット」番号に割り当てることができる。Blast解析において示されたこれらのデータは以下に表示している。
Blast解析を用いて、他の注釈付き配列データベースから、最も可能性の高い対応する既知の配列を「プローブセット」番号に割り当てることができる。Blast解析において示されたこれらのデータは以下に表示している。
これらの表から導き出され、そして得られた発現値によって直接的に示された誘導パターンは、薬害軽減剤と耐性誘導剤との間の特徴的な相異を明らかにし、ここでイソキサジフェンの場合に効果が最も増大しているジャスモン酸の生合成に対する効果も示されている。この観察された発現パターンによって、同様のサインを示す化合物を見出すことができ、そしてこのことより、これらの化合物は植物病原体防御の活性化において同種の効果を有することが示唆される。
実施例２
薬害軽減剤−処理した植物の植物病原性害虫に対する忌避効果：
大麦植物（品種：Baronesse)を実施例１に記載されているように生育させ、そして１０日後にイソキサジフェン−エチル(S3)の150g a.i.／ha、又は対照製剤を噴霧処理により施用した。この試験はそれぞれの場合１０ポットごとの反復として行った。
試験物質を処理した６時間又は２４時間後に、全てのポットを植物病原性のムギクビレアブラムシ（Rhopalosiphum padi）の個体集団を均一に群生させた。この試験の結果を７日及び１４日後に、葉の上の昆虫の個体数を計測して評価した。薬害軽減剤−処理した植物のアブラムシの個体数は、７日後では平均して対照よりも５０％少なく、そして１４日後では７０％少なかった。
アブラムシに対するイソキサジフェン−エチル(S3)の直接的毒性は、植物の無いサッシェ（Sachez）試験においては検出されなかった。
薬害軽減剤−処理した植物の植物病原性害虫に対する忌避効果：
大麦植物（品種：Baronesse)を実施例１に記載されているように生育させ、そして１０日後にイソキサジフェン−エチル(S3)の150g a.i.／ha、又は対照製剤を噴霧処理により施用した。この試験はそれぞれの場合１０ポットごとの反復として行った。
試験物質を処理した６時間又は２４時間後に、全てのポットを植物病原性のムギクビレアブラムシ（Rhopalosiphum padi）の個体集団を均一に群生させた。この試験の結果を７日及び１４日後に、葉の上の昆虫の個体数を計測して評価した。薬害軽減剤−処理した植物のアブラムシの個体数は、７日後では平均して対照よりも５０％少なく、そして１４日後では７０％少なかった。
アブラムシに対するイソキサジフェン−エチル(S3)の直接的毒性は、植物の無いサッシェ（Sachez）試験においては検出されなかった。
実施例３
イソキサジフェン−処理の植物におけるオキソフィトジエノエート (OPDA) 及びジャスモネート (JA) の増大した濃度の検出
大麦植物（品種：Baronesse)を実施例１に記載されているように生育させ、そして１０日後に薬害軽減剤のイソキサジフェン−エチル(S3)を噴霧処理により施用した。施用量は以下のように選択した。
(1) 30 [g a.i.／ha] ; (2) 150 [g a.i.／ha] ; (3) ブランク製剤(有効成分無し)
植物の葉を処理後異なる時間の時点、即ち、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、12ｈ、24ｈ及び48ｈ（ｈ＝時間）で収穫した。全てのサンプルはそれぞれの場合３ポットの反復として計画した。
オクタデカノエート及びジャスモネートは、文献(Mueller A、Duchting P 及び Weiler EW (2002)、A multiplex GC-MS/MS technique for the sensitive and quantitative single-run analysis of acidic phytohormones and related compounds, and its application to Arabidopsis thaliana. Planta, 216, 44-56頁) に記載されている方法に基づいて、収穫した葉から加工処理を行った。
植物材料の300mgを各測定時点で抽出した。
[13C]2−JAの50pmol及び [17,17,17,18,18−2H]−cis−OPDAの100pmolを内部標準として適用した。抽出物は自家製の小型の固相交換カラムを用いたアミノプロピル陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
イソキサジフェン−処理の植物におけるオキソフィトジエノエート (OPDA) 及びジャスモネート (JA) の増大した濃度の検出
大麦植物（品種：Baronesse)を実施例１に記載されているように生育させ、そして１０日後に薬害軽減剤のイソキサジフェン−エチル(S3)を噴霧処理により施用した。施用量は以下のように選択した。
(1) 30 [g a.i.／ha] ; (2) 150 [g a.i.／ha] ; (3) ブランク製剤(有効成分無し)
植物の葉を処理後異なる時間の時点、即ち、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、12ｈ、24ｈ及び48ｈ（ｈ＝時間）で収穫した。全てのサンプルはそれぞれの場合３ポットの反復として計画した。
オクタデカノエート及びジャスモネートは、文献(Mueller A、Duchting P 及び Weiler EW (2002)、A multiplex GC-MS/MS technique for the sensitive and quantitative single-run analysis of acidic phytohormones and related compounds, and its application to Arabidopsis thaliana. Planta, 216, 44-56頁) に記載されている方法に基づいて、収穫した葉から加工処理を行った。
植物材料の300mgを各測定時点で抽出した。
[13C]2−JAの50pmol及び [17,17,17,18,18−2H]−cis−OPDAの100pmolを内部標準として適用した。抽出物は自家製の小型の固相交換カラムを用いたアミノプロピル陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
測定結果は表３ａから３ｄに示しているが、それぞれの場合に示した数値は３連の平均値である。
オキソフィトジエノエート(OPDA)濃度は、葉組織１ｇ当り1800〜9000pmolの範囲であり、ジャスモネート(JA)の場合は、葉組織１ｇ当り70〜800pmolの範囲であった。イソキサジフェン−エチル(S3) 処理後、有効成分の無いブランク製剤サンプルでの数値の約５倍までの顕著な増大が上記双方の物質の濃度において測定された。
Claims (12)
- 植物の病原体防御を誘導する化合物を見出す方法であって、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び植物キチナーゼの群からの個々の又は複数の内因性の植物遺伝子の発現増大がその誘導が引き起こされたサインとみなされる、上記方法。
- ａ) 試験植物を適当な量の試験物質に接触させ、
ｂ) 対照植物は、試験物質に接触させないこと以外は、試験植物ａ）と同一の条件下であり、
ｃ) 試験植物及び対照植物からＲＮＡを抽出し、
ｄ) そのＲＮＡは直接的に放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又はそのＲＮＡは対応するｃＤＮＡ中に同時に酵素的に転写されるときに放射性標識するか若しくは放射性標識せず、又は結果として得られた無標識のｃＤＮＡを対応する放射性標識された若しくは放射性標識されていないｃＲＮＡ中に酵素的に転写し、
ｅ) 植物ＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡアレイを、工程ｄ）で得られた物質とハイブリダイズさせ、
ｆ) ジャスモン酸の生合成、植物キシラナーゼインヒビター、植物プロテイナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼの発現のための遺伝子の発現プロファイルを、工程ａ）及びｂ）の記載のように試験した植物に関して比較する様式で作成し、
ｇ) 工程ｆ) において測定した発現の差違を定量化し、
ｈ) 工程ｇ) に記載のように割り当てられた発現プロファイルを、クラスター解析を用いた最終的な体系的グループ分けに付す、
工程からなる、請求項１に記載の方法。 - (ｉ) リパーゼ−類似タンパク質である、12−オキソフィトジエノエートレダクターゼ (EC 1.3.1.42)、アレン−オキシドシクラーゼ、12−オキソフィトジエン酸レダクターゼの遺伝子発現プロファイル、及び／又は
(ii) PIR タンパク質データベースの登録番号S71555を付したプロテイナーゼインヒビターと有意な相同性を有する植物プロテイナーゼインヒビターの遺伝子発現プロファイル、及び／又は
(iii) 植物キシラナーゼインヒビタータンパク質の遺伝子発現プロファイル、及び／又は
(iv) PIRタンパク質データベースの登録番号T06168を付した大麦の病原体関連(PR)タンパク質と有意な相同性を有するタンパク質である、病原体誘導性植物ペロキシダーゼ(EC1.11.1.7) の遺伝子発現プロファイル、及び／又は
(ｖ) 植物キチナーゼの遺伝子発現プロファイル
が、無処理対照植物に比較して２倍又はそれ以上に増大している、請求項２に記載の方法。 - (ｉ)−(ｖ)の下で記載されている一つ又はそれより多い遺伝子の発現プロファイルが、２−２０倍増大している、請求項３に記載の方法。
- 増大した発現プロファイルを有する、ジャスモン酸の生合成、植物プロテイナーゼインヒビター、植物キシラナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体-関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼのタンパク質の群からのタンパク質をコードする少なくとも１遺伝子、好ましくは１より多い遺伝子により、植物中において、植物病原性の生物体に対する防御の増大に直接的又は間接的に貢献する化合物の使用。
- 作物保護における薬害軽減剤としての使用が既に知られている、請求項５に記載の化合物の使用。
- 化合物が請求項２〜４のいずれか１項に記載されたように同定される、請求項５又は６に記載の使用。
- 化合物がメフェンピル−ジメチル、メフェンピル−ジエチル、メフェンピル類似体、イソキサジフェン−エチル、クロキントセト−メキシル、クロキントセト誘導体及びピリジンカルボキサミドである、請求項６に記載の化合物の使用。
- 化合物が植物病原性の生物体に対する防御を増大するために、特異的にそして直接的に植物病原体に対して作用する先行技術化合物と組み合わせて、同時に又は交互に処理を行うことができる、有用植物の作物栽培において使用される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の使用。
- メフェンピル誘導体又はイソキサジフェン誘導体を、有害な生物体に直接的に作用する殺虫剤と組み合わせて使用する、請求項９に記載の使用。
- メフェンピル誘導体の場合で、有害な生物体に直接的に作用する殺虫剤がケトエノール又はニトロメチレン／ニトロイミンに該当するものである、請求項１０に記載の使用。
- 増大した発現プロファイルを有する、ジャスモン酸の生合成、植物キシラナーゼインヒビター、植物プロテイナーゼインヒビター、植物ＰＲタンパク質（病原体関連タンパク質）及び／又は植物キチナーゼのタンパク質の群からのタンパク質をコードする少なくとも１遺伝子、好ましくは１より多い遺伝子により、植物病原性の生物体に対する防御を増大するために、植物に直接的に又は間接的に用いられる化合物を施用することによって、有用植物の作物栽培において有用植物の作物を植物病原性の生物体から保護する方法。
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