KR20070091339A - 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인간 성장호르몬의 조제물 - Google Patents

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Abstract

변형된 인간 성장 호르몬 폴리펩티드의 조제물이 제공된다.
인간 성장 호르몬 폴리펩티드, hGH

Description

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인간 성장 호르몬의 조제물 {FORMULATIONS OF HUMAN GROWTH HORMONE COMPRISING A NON-NATURALLY ENCODED AMINO ACID}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, U.S. 가출원 특허 일련 제60/638,616호(2004년 12월 22일 출원), U.S. 가출원 특허 일련 제60/680,617호(2005년 5월 13일 출원), 및 U.S. 가출원 특허 제60/728,035호(2005년 10월 17일 출원)(이들의 각 명세서는 전체적으로 본원에 인용됨)에 대해 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)에 공유 결합된 비천연 아미노산을 포함하는 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩티드의 안정화된 hGH 조제물에 관한 것이다.
인간 성장 호르몬은 정상적 인간 성장 및 발달의 제어에 상당히 참여하고 있다. 이러한 천연 발생 단쇄 뇌하수체 호르몬은 191개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 대략 22 kDa의 분자량을 가진다. hGH는 무엇보다 선형 성장(체인성(somatogenesis)), 수유, 대식세포의 활성화 및 인슐린 유사 및 당뇨병 유발 효과를 비롯한 다수의 생물학적 효과를 나타낸다[Chawla, R., et al., Ann. Rev. Med. 34: 519-547(1983); Isaksson, O., et al., Ann. Rev. Physiol., 47: 483-499(1985); Hughes, J. 및 Friese, H., Ann. Rev. Physiol., 47:469-482(1985)].
hGH의 구조는 공지되어 있고[Goeddel, D., et al., Nature 281: 544-548(1979)], hGH의 3차원 구조는 X선 결정학에 의해 해석되었다[de Vos, A., et al., Science 255: 306-312(1992)]. 단백질은 루프에 의해 결합된, N-말단으로부터 시작하여 A-D로 명명되는 4개의 양친매성 알파 나선 다발을 포함하는 치밀한 구형 구조를 가진다. 자체 수용체 및 변종체를 포함하는 hGH, 및 기타 GH 초부류(superfamily) 구성원에 관한 추가 논의가 U.S. 특허 출원 제11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses"), 및 PCT 국제 특허 출원 제PCT/US05/03537호(발명의 명칭: "Modified Human Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses")(이들은 각기 본원에 전체적으로 참고로 인용됨)에 제공되어 있다.
재조합 hGH는 치료제로 사용되고, 다수의 적응증의 치료에 승인되었다. hGH 결핍은 예를 들어, 왜소증을 유발하며, 이는 십여년간 호르몬을 외인성 투여함으로써 성공적으로 치료되었다. 또한, hGH는 hGH 결핍 외에도 신부전(아동), 터너 증후군, 및 AIDS 환자의 악액질 치료에 승인되었다. 최근, 미국 식약청(Food and Drug Administration; FDA)은 hGH를 비-GH-의존성 저신장 치료에 승인하였다. 또한, hGH는 현재 노화, 노인의 쇠약, 단장 증후군 및 울혈성 심부전의 치료용으로 조사 중이다. hGH 치료에 대한 표적 집단은 특발성 단신(ISS)을 앓는 아동, 및 GHD-유사 증세를 앓는 성인을 포함한다.
재조합 hGH는 현재 매일 주사가능한 제품으로서 판매되고 있으며, 현재 시판 중인 5가지 주요 제품은 다음과 같다: 휴마트로프(Humatrope)TM(엘리 릴리 앤드 컴퍼니(Eli Lilly & Co.)), 뉴트로핀(Nutropin)TM(제넨테크(Genentech)), 노르디트로핀(Norditropin)TM(노보-노르디스크(Novo-Nordisk)), 제노트로핀(Genotropin)TM(화이자(Pfizer)) 및 사이젠/세로스팀(Saizen/Serostim)TM(세로노(Serono)). 그러나, 성장 호르몬을 치료제로 사용하는데 있어서 큰 어려움은, 단백질이 짧은 생체 내 반감기를 갖기 때문에, 최대 유효성을 위해서는 이를 매일 피하 주사해야 한다는 점이다[MacGillivray, et al., J Clin. Endocrinol. Metab. 81: 1806-1809(1996)]. 생산 비용을 낮추고, 환자에 대한 투여를 용이하게 하고, 효능 및 안전성 프로파일을 개선하고, 경쟁력 있는 이점을 제공하는 다른 성질을 생성함으로써 hGH 작동제 및 길항제의 투여를 개선하는 수단을 개발하기 위한 많은 노력이 집중되고 있다. 예를 들어, 제넨테크 및 알컴스(Alkermes)는 종래 소아 성장 호르몬 결핍용 hGH에 대한 데포(depot) 조제물인 뉴트로핀 데포(Nutropin Depot)TM를 판매하였다. 그 데포는 투여 빈도를 낮추었지만(일일 1회가 아닌 2-3 주마다 1회), 또한, 생체이용률 감소 및 주사 부위에서의 통증과 같은 바람직하지 못한 부작용이 연루되어, 2004년 시장에서 철수되었다. 또한, 또 다른 제품인 페그비소만트(Pegvisomant)TM(화이자)가 최근 FDA에 의해 승인을 받았다. 페그비소만트TM는 선단 비대증 치료에 처방되는 높은 선택성의 성장 호르몬 수용체 길항제로서 기능하는 hGH의 유전자 조작된 유사체이다[van der Lely, et al., The Lancet 358: 1754-1759(2001)]. 비록 페그비소만트TM의 수가지 아미노산 측쇄 잔기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 이용하여 유도체화되지만, 이 제품은 여전히 일일 1 회 투여되며, 이는 약제학적으로 성질이 최적화되지 않음을 시사한다. PEG화(PEGylation) 및 데포 조제물 외에, hGH의 흡입 및 경구 투여 형태를 비롯한 다른 투여 경로들이 임상 전 조기 단계 및 임상 개발 중에 있지만, 어떠한 것도 아직 FDA로부터 승인을 받은 것이 없다. 따라서, 성장 호르몬 활성을 나타내면서도 또한 보다 긴 혈청 반감기를 제공하여, 더욱 최적의 치료 수준을 갖는 hGH 및 증가된 치료 반감기를 나타내는 폴리펩티드에 대한 수요가 존재한다.
친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG로 약칭됨)의 공유 결합은 수중 용해도를 증가시키거나, 생체이용율을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료적 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나 단백질, 펩티드 및 특히 소수성 분자를 비롯한 많은 생물학적 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 방법이다. PEG는 약제, 인공 이식물, 및 생체적합성, 독성 결여 및 면역원성 결여가 중요한 기타 적용분야에 광범위하게 사용되었다. PEG의 원하는 성질을 최대화시키기 위해, 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 중합체(들)의 총 분자량 및 수화 상태가 모 분자의 생체활성에 악영향을 미치지 않으면서 전형적으로 PEG 중합체 부착과 관련된 유리한 특성, 예를 들어 수 용해도 및 순환 반감기 증가 를 제공하도록 충분히 높아야 한다.
최근, 단백질 과학에서는 단백질의 부위-특이적 변형과 관련된 많은 한계를 극복할 수 있게 하는 완전히 신규한 기술이 보고되었다. 구체적으로, 신규한 성분을 원핵생물인 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli; E.coli)(예를 들어, [L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500] 참고) 및 비-유전적으로 코딩된 아미노산을 생체 내 단백질에 도입시킬 수 있게 진핵생물인 사카로마이세스 세레비지애(Sacchroniyces cerevisiae; S. cerevisiae)(예를 들어, [J. Chin et al., Science 301: 964-7(2003)] 참고)의 단백질 생합성 기전에 첨가하였다. 광친화성 표지 및 광이성화가능한(photoisomerizable) 아미노산(예를 들어, [Chin, J. W., et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 99:11020-11024; 및 Chin, J. W., et al., (2002) J. A. Chem. Soc. 124:9026-9027]), 케토 아미노산, 및 중 원자 함유 아미노산, 글리코실화된 아미노산을 비롯한 신규한 화학적, 물리적 또는 생물학적 성질을 갖는 다수의 신규한 아미노산을 이 방법론을 사용하여 엠버 코돈, TAG에 상응하여 대장균 및 효모 중 단백질에 효율적으로, 또한 높은 적합도(fidelity)로 도입시켰다. 예를 들어, [J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024; 및 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem . Comm ., 1-11]을 참고한다. 모든 참고 문헌은 본원에 전체적으로 참고로 인용된다. 이 연구들은 단백질 내에서 발견되지 않는, 20개의 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견 되는 작용기 모두에 화학적으로 불활성이고, 유효하게 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는 화학적 작용기, 예를 들어 케톤기, 알킨기 및 아지드 부분을 선택적으로 또한 통상적으로 도입시키는 것이 가능하다는 것을 입증하였다.
비-유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질에 혼입시키는 능력은 자연 발생 작용기, 예를 들어 리신의 엡실론 -NH2, 시스테인의 술프히드릴 -SH, 히스티딘의 이미노 기 등에 중요한 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기를 도입할 수 있게 한다.
인간 성장 호르몬 조제물은 재구성을 요하는 동결건조된 제제, 또는 수성 조제물일 수 있다. 바이얼 당, 프로트로핀(Protropin)TM hGH는 5 mg hGH, 40 mg 만니톨, 0.1 mg 일염기성 인산나트륨, 1.6 mg 이염기성 인산나트륨으로 구성된다(pH 7.8이 되도록 재구성됨)[Physician's Desk Reference, Medical Economics Co., Orawell, NJ., p. 1049, 1992]. 바이얼 당, 휴마트로프TM hGH는 5 mg hGH, 25 mg 만니톨, 5 mg 글리신, 1.13 mg 이염기성 인산나트륨으로 구성된다(pH 7.5가 되도록 재구성됨)[Physician's Desk Reference, p. 1266, 1992]. 수성 인간 성장 호르몬 조제물의 예들이 본원에 각기 참고로 인용되는, U.S. 특허 제5,763,394호; 제5,981,485호; 제6,448,225호; 및 U.S. 특허 공보 제2003/0013653호에 기재되어 있다.
성장 호르몬 조제물에 관한 일반 검토에 대해서는, 본원에 참고로 인용되는 [Pearlman et al., Current Communications in Molecular Biology, eds. D. Marshak and D. Liu, pp. 23-30, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]를 참고한다. 단백질의 안정화에 관한 해당 관련 기타 공보는 다음과 같다.
본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제4,297,344호는 선택된 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 히드록시프롤린, 글루타민 및 아미노부티르산, 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류 또는 당 알코올을 첨가함으로써, 열에 대한 응고 인자 II 및 VIII, 항트롬빈 III, 및 플라스미노겐의 안정화를 개시한다.
본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제4,783,441호는 pH 6.8 내지 8.0에서 교대의 약친수성 및 약소수성 구역의 사슬을 포함하는 500 ppm 이하의 표면 활성 물질을 첨가함으로써 계면에서 수용액 내 인슐린과 같은 단백질의 변성을 방지하는 방법을 개시한다.
본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제4,812,557호는 인간 혈청 알부민을 이용한 인터류킨-2의 안정화 방법을 개시한다.
본원에 참고로 인용되는 유럽 특허 출원 공보 제0 303 746호는 비환원 당, 당 알코올, 당 산, 펜타에리트리톨, 락토스, 수용성 덱스트란 및 피콜(Ficoll), 아미노산, 생리학적 pH에서 하전된 측기를 갖는 아미노산의 중합체, 및 콜린 염으로 구성된 폴리올을 이용한 성장 촉진 호르몬의 안정화 방법을 개시한다.
본원에 참고로 인용되는 유럽 특허 출원 공보 제0 211 601호는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단위를 함유하고, 평균 분자량이 약 1,100 내지 약 40,000인 블록 공중합체에 의해 형성된 겔 매트릭스 내 성장 촉진 호르몬의 안정화를 개시한 다.
본원에 참고로 인용되는 유럽 특허 출원 공보 제0 193 917호는 단백질과 탄수화물 간의 착체의 수 중 용액에 의해 특징화되는 서방성 생물 활성 조성물을 개시한다.
본원에 각기 참고로 인용되는 국제 특허 공보 WO 89/09614 및 호주 특허 출원 제30771/89호는 인간 성장 호르몬, 글리신 및 만니톨을 함유하는 안정한 약제학적 조제물을 개시한다. 그러한 제제는 재구성 후의 사용 기간뿐만 아니라, 정상적 가공 및 동결건조된 상태에서의 저장 중에 향상된 안정성을 나타낸다.
본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제5,096,885호는 글리신, 만니톨, 비이온성 계면활성제 및 완충액을 함유하는 동결건조를 위한 hGH의 조제물을 개시한다.
본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제4,876,568호는 동물 성장 호르몬이 각종 안정화제로서 안정화되어, 불용성 물질의 형성을 감소시키고, 수성 환경에서 가용성 활성을 보존할 수 있음을 개시한다. 그러한 안정화제는 특정 폴리올, 아미노산, 생리학적 pH에서 하전된 측기를 갖는 아미노산의 중합체, 및 콜린 염을 포함한다. 폴리올은 비환원 당, 당 알코올, 당 산, 펜타에리트리톨, 락토스, 수용성 덱스트란 및 핀콜로 구성된 군으로부터 선택되고; 아미노산은 글리신, 사르코신, 리신 또는 그의 염, 세린, 아르기닌 또는 그의 염, 베타인, N,N,-디메틸-글리신, 아스파르트산 또는 그의 염, 글루탐산 또는 그의 염으로 구성된 군으로부터 선택되며; 생리학적 pH에서 하전된 측기를 갖는 아미노산의 중합체는 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴 및 그것의 염으로부 터 선택될 수 있고; 콜린 유도체는 염화콜린, 시트르산이수소콜린, 중타르타르산콜린, 중탄산콜린, 시트르산삼콜린, 아스파르트산콜린, 붕산콜린, 글루콘산콜린, 인산콜린, 황산이(콜린), 및 이콜린 뮤케이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제4,876,568호는 폴리히스티딘이 동물 성장 호르몬에 대한 잠정적 안정화제로 사용될 수 있으나, 그것이 동물 성장 호르몬 또는 인간 성장 호르몬을 안정화하는지의 여부는 가리키고 있지 않다고 기재한다. 또한, U.S. 특허 제4,876,568호는 폴리-DL-리신 HBr이 바람직하다고 언급한다.
본원에 참고로 인용되는 EP 374120은 3개 히드록시기를 갖는 완충 폴리올 부형제, 및 성장 호르몬이 충분한시간 동안 생물활성을 보유하도록 하는 범위의 pH를 달성하게 하는 완충액을 포함하는 성장 호르몬의 안정화된 제제를 개시한다. 히스티딘은 3개 히드록시기를 갖는 폴리올을 위한 완충액으로 언급된다. 구체적으로, EP 374120은 히스티딘 염산염이 고농도의 성장 호르몬, 및 안정화제로서의 폴리올을 포함하는 용액 형태의 성장 호르몬 제제의 안정성을 향상시키기 위한, 3개 히드록시기를 갖는 폴리올을 완충하기 위한 완충액으로서 사용될 수 있음을 교시한다. 또한, 히스티딘 염산염은 히스티딘 염산염의 ~0.15 M 용액의 농도에 상응하는 약 3 중량%의 용액의 양으로 첨가되어야 한다. EP 374120은 또한 히스티딘 단독이 성장 호르몬 제제에 화학적 및 물리학적 안정성을 부여하지 않음을 교시한다.
본원에 참고로 인용되는 Sorensen 등의 WO 93/12812는 성장 호르몬이 히스티딘 또는 히스티딘 유도체의 존재에 의해 안정화될 수 있음을 교시한다. 성장 호르몬이 동결건조될 때, 조성물은 또한 벌크화제, 즉 당 알코올, 이당류, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원에 참고로 인용되는 Sorensen 등의 U.S. 특허 제5,849,704호는 성장 호르몬 내 펩티드 결합의 절단, 산화 또는 탈아미드화에 대한 안정성을 제공하기 위해 첨가되는 첨가제 또는 완충 물질로서 호르몬 및 히스티딘 또는 히스티딘의 유도체를 포함하는 약제학적 조제물을 개시한다. 또한, 히스티딘 또는 히스티딘의 유도체의 존재 하에서의 성장 호르몬의 결정화가 공지된 방법보다 높은 순도를 갖는 결정의 보다 큰 수율을 초래함도 개시한다. 인간 성장 호르몬 변종체의 조제물은 본원에 각기 참고로 인용되는 U.S. 특허 제6,136,563호 및 제5,849,535호에 기재되었다.
hGH는 탈아미드화, 응집, 펩티드 골격의 짧게 잘림(clipping), 및 메티오닌 잔기의 산화를 포함한 수가지 분해 경로를 통해 파괴를 겪는다. PEG와 같은 수용성 중합체에 공유 결합된 hGH의 접합체의 분해로부터 부가적 생성물이 수득된다. 분해 생성물의 허용가능한 조절을 제공하고, 연장된 기간에 걸쳐 hGH의 안정성을 유지시키며, 격렬한 교반(응집을 유도함)에 대해 안정한 hGH의 약제학적 조제물이 특히 유리할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 조제물을 제공한다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자에 연결된이다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 이작용성 중합체, 이작용성 링커, 또는 하나 이상의 부가적 hGH 폴리펩티드에 연결된이다.
일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결된이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커를 통해 수용성 중합체에 연결되거나, 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 hGH 폴리펩티드의 단일 투약의 동결건조된 조제물이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 hGH 폴리펩티드의 액체 조제물이다.
일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분자량이 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분자량이 0.1 kDa 내지 50 kDa이다.
일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 일부 실시양태에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각 분지는 분자량이 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa이다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 약제학적 조제물은 완충액, 하나 이상의 담체, 부형제 또는 안정화제, 및 약제학적 양의 인간 성장 호르몬(hGH)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 담체, 부형제 또는 안정화제는 항산화제, 아미노산, 탄수화물, 킬레이트제, 당 알코올, 염 형성 짝이온, 및 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 hGH 분자의 조제물을 이용하여, hGH에 의해 조절되는 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 바람직하지 않은 응집된 종의 형성을 최소화하거나, 생물학적 활성을 감소시키거나 수용체 인식을 변경하는 화학적 변화를 유발하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 조제물이 제공된다. 그러한 조제물은 적당한 저장 기간 동안 활성을 유지할 수 있고, 용이하게 제형되며, 환자에게 투여하기에 허용가능하다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는, PEG화된 hGH를 포함하나 이에 한정되지 않는 hGH 폴리펩티드의 조제물은, 피하 주사용으로 사용하기 전에 재구성되는 동결건조된 조제물이다. 본 발명의 조제물은 약제학적 조제물, 특히 피하 투여용 조제물일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 조제물을 이용하여, PEG화된 hGH을 포함하나 이에 한정되지 않는 제형된 단백질에 의해 치료가능한 장애의 처리, 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 그러한 조제물은 피하 투여에 특히 유용하다.
본원에 개시된 조제물을 둘러싸는 용기, 및 예비충전된 주사기를 포함하는 제조 물품이 제공된다.
도 1은 4℃에서 6주 후, 조제물 완충액의 pH 안정성 분석을 나타낸다.
도 2는 Met Y35pAF hGH의 SDS-PAGE 환원성 겔(도 2C 및 2D) 및 비환원성 겔(도 2A 및 2B)을 나타낸다. 도 2A 및 2B에서의 겔은 하기와 같이 로딩된다: 레인 1: MW, 레인 2: WHO hGH, 레인 3: WHO hGH 1%; 레인 4: A1; 레인 5: A2; 레인 6: A3; 레인 7: A4; 레인 8: A5; 레인 9: A6; 레인 10: A7; 레인 11: A8; 레인 12: MW. 도 2C 및 2D에서의 겔은 하기와 같이 로딩된다: 레인 1: MW, 레인 2: WHO hGH, 레인 3: WHO hGH 1%; 레인 4: B1; 레인 5:B2; 레인 6: B3; 레인 7: B4; 레인 8: B5; 레인 9: B6; 레인 10: B7; 레인 11: B8; 레인 12: MW.
도 3A-F는 조제물 군 A-F의 시차 주사 열량계(DSC) 써모프로파일을 나타낸다.
도 4는 매트릭스의 군 B7(도 4A) 및 F2(도 4B)로부터의 DSC 써모프로파일을 나타낸다.
도 5는 전체 매트릭스에 대한 DSC 융점 및 Tm에 대한 변화를 요약한 표를 제공한다.
도 6은 전체 매트릭스에 대한 DSC 융점의 요약을 나타낸다.
도 7은 조제물 군의 ΔHv/ΔH의 비의 분석을 나타낸다.
도 8은 각 샘플의 엔탈피(AUC) 변화의 분석을 나타낸다.
도 9A-D는 WHO hGH 표준 대비, 군 B, C, E 및 F에서의 샘플의 RP-HPLC 데이터 세트를 나타낸다.
도 10A는 군 E5에 대한 상이한 Y35pAF 피크들의 분석(모든 피크의 상대 백분 율을 각 시점에 대해 플로팅하여, 주요 MetY35pAF hGH 피크에 대한 임의의 모든 변화를 가시화함)을 나타내고, 도 10B는 1차 탈아미드화/산화 피크의 확대(줌(zoom))(탈아미드화 피크의 확대(줌) - 시간 경과(t = 0 내지 4주)에 대한 탈아미드화의 증가)를 나타낸다. RP-HPLC 분석은 아질런트 켐스테이션(Agilent Chemstation) 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.
도 11은 매트릭스 전반에 있어 1차 탈아미드화/산화 피크의 분석을 나타낸다(4℃에서 4주 간의 Met Y35pAF hGH의 분석).
도 12는 조제물 군의 2차 탈아미드화/산화 피크의 분석을 나타낸다(4℃에서 4주 간의 Y35pAF hGH의 분석).
도 13은 조제물 군에 대한 주요 GH 피크의 분석을 나타낸다(4℃에서 4주 간 걸친 Met Y35pAF hGH의 분석).
도 14는 조제물 군 B 및 C에 있어 냉동-해동 사이클을 겪은 샘플에서의 1차 탈아미드화/산화 피크의 RP-HPLC 분석을 나타낸다(5회 냉동/해동 사이클에 걸친 Met Y35pAF hGH 피크의 분석).
도 15는 조제물 군 B 및 C에 있어 냉동-해동 사이클을 겪은 샘플에서의 2차 탈아미드화 피크의 RP-HPLC 분석을 나타낸다(5회 냉동/해동 사이클에 걸친 Met Y35pAF hGH 피크의 분석).
도 16은 조제물 군 B 및 C에 있어 냉동-해동 사이클을 겪은 샘플에서의 주요 GH 피크의 RP-HPLC 분석을 나타낸다(5회 냉동/해동 사이클에 걸친 Met Y35pAF hGH 피크의 분석).
도 17은 RP-HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 18은 SEC-HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 19는 cIEX-HPLC에 의한 분석 결과를 나타낸다.
도 20은 SEC-HPLC 적분의 한 예를 나타낸다.
도 21은 RP-HPLC 적분의 한 예를 나타낸다.
도 22는 조제물 연구에서 대조군 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다(t=0). 레인 1: 마크 12; 레인 2: 참고 기준물질; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS.
도 23은 조제물 연구에서 대조군 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다(t=0). 레인 1: 마크 12; 레인 2: 참고 기준물질; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 24은 조제물 연구에서 대조군 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다(t=0). 도 24에 있어, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 24에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 25는 1주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸 다(t=0). 도 25에 있어, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 25에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 26은 1주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 26에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 26에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 27은 2주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 27에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3:P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 27에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 28은 2주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 28에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 28에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 29는 4주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 29에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 29에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 30은 4주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 30에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3,: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 30에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 31은 6주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S5MT; 레인 5: S5GT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 32는 6주 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S5MT; 레인 5: S5GT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 33은 2개월 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 34는 2개월 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 35는 3개월 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(lμg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 36은 3개월 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet*(오염); 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 37은 1주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 37에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 37에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 38은 1주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 38에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 38에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 39는 2주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 39에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 39에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 40은 2주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 40에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 40에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 41은 4주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 41에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 41에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 42는 4주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 42에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 42에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 43은 6주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S5MT; 레인 5: S5GT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 44는 6주 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S5MT; 레인 5: S5GT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 45는 2개월 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 46은 2개월 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 47은 3개월 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 48은 3개월 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 49는 1주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 49에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 49에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 50은 1주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 50에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 50에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 51은 2주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 51에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 lO: P6MS. 도 51에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 52는 2주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 52에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 52에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 53은 4주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 53에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 53에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 54는 4주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 54에 있어서, 패널 A, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 lO: P6MS. 도 54에 있어서, 패널 B, 레인 1: 마크 12 표준; 레인 2: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 55는 6주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S5MT; 레인 5: S5GT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 56은 6주 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S5MT; 레인 5: S5GT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 57은 2개월 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT; 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 58은 2개월 동안 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: hGH(1 μg); 레인 5: P6MT; 레인 6: H6MT; 레인 7: P6GT; 레인 8: P6MS; 레인 9: P6MTMet; 레인 10: P6MT; 레인 11: P7GT; 레인 12: P6MGT;, 레인 13: P6MGT-P; 레인 14: P6MT-P; 레인 15: P6GT-P.
도 59는 1주 동안 4℃에서 저장된 재구성된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 59에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 59에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 60은 1주 동안 4℃에서 저장된 재구성된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 도 60에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레 인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 60에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 61은 조제물 연구(교반/UV 조절)에 있어 대조군 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 61에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S 5 MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 61에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 62는 조제물 연구(교반/UV 조절)에 있어 대조군 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 62에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 62에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 63은 상온에서 4시간 동안 교반된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 63에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 63에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 64는 상온에서 4시간 동안 교반된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 64에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 64에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 65는 상온에서 4시간 동안 UV 광에 노출된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 도 65에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 65에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 66은 상온에서 4시간 동안 UV 광에 노출된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 도 66에 있어서, 패널 A, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MT; 레인 4: S4MT; 레인 5: S5MT; 레인 6: S5GT; 레인 7: H6MT; 레인 8: P6GT; 레인 9: P6MA; 레인 10: P6MS. 도 66에 있어서, 패널 B, 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 3: P6MTMet; 레인 4: P7MT; 레인 5: P7GT; 레인 6: P6MGT; 레인 7: P6MGT-P; 레인 8: P6MT-P; 레인 9: P6GT-P.
도 67은 냉동/해동 조건에 적용한 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다(H7MT-P). 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: H7MT-P 8 mg/mL t = 0; 레인 4: H7MT-P 8 mg/mL F/T 1; 레인 5: H7MT-P 8 mg/mL F/T 2; 레인 6: H7MT-P 8 mg/mL F/T 3; 레인 7: H7MT-P 8 mg/mL F/T 4; 레인 8: H7MT-P 8 mg/mL F/T 5; 레인 10: H7MT-P 14 mg/mL t = 0; 레인 11: H7MT-P 14 mg/mL F/T 1; 레인 12: H7MT-P 14 mg/mL F/T 2; 레인 13: H7MT-P 14 mg/mL F/T 3; 레인 14: H7MT-P 14 mg/mL F/T 4; 레인 15: H7MT-P 14 mg/mL F/T 5.
도 68은 냉동/해동 조건에 적용한 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다(H7MT-P). 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: H7MT-P 8 mg/mL t = 0; 레인 4: H7MT-P 8 mg/mL F/T 1; 레인 5: H7MT-P 8 mg/mL F/T 2; 레인 6: H7MT-P 8 mg/mL F/T 3; 레인 7: H7MT-P 8 mg/mL F/T 4; 레인 8: H7MT-P 8 mg/mL F/T 5; 레인 10: H7MT-P 14 mg/mL t = 0; 레인 11: H7MT-P 14 mg/mL F/T 1; 레인 12: H7MT-P 14 mg/mL F/T 2; 레인 13: H7MT-P 14 mg/mL F/T 3; 레인 14: H7MT-P 14 mg/mL F/T 4; 레인 15: H7MT-P 14 mg/mL F/T 5.
도 69는 냉동/해동 조건에 적용한 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다(H7MGT-P). 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: H7MGT-P 8 mg/mL t = 0; 레인 4: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 1; 레인 5: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 2; 레인 6: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 3; 레인 7: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 4; 레인 8: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 5; 레인 10: H7MGT-P 14 mg/mL t = 0; 레인 11: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 1; 레인 12: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 2; 레인 13: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 3; 레인 14: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 4; 레인 15: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 5.
도 70은 냉동/해동 조건에 적용한 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다(H7MGT-P). 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: H7MGT-P 8 mg/mL t = 0; 레인 4: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 1; 레인 5: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 2; 레인 6: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 3; 레인 7: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 4; 레인 8: H7MGT-P 8 mg/mL F/T 5; 레인 10: H7MGT-P 14 mg/mL t = 0; 레인 11: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 1; 레인 12: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 2; 레인 13: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 3; 레인 14: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 4; 레인 15: H7MGT-P 14 mg/mL F/T 5.
도 71은 대조군 샘플 및 6시간 동안 교반하고 4시간 동안 UV 광에 노출한 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 4: 보어텍스/UV 조절 H7MT-P 8 mg/mL; 레인 5: 보어텍스/UV 조절 H7MT-P 14 mg/mL; 레인 6: 보어텍스/UV 조절 H7MGT-P 8 mg/mL; 레인 7: 보어텍스/UV 조절 H7MGT-P 14 mg/mL; 레인 8: 보어텍스 H7MT-P 8 mg/mL; 레인 9: 보어텍스 H7MT-P 14 mg/mL; 레인 10: 보어텍스 H7MGT-P 8 mg/mL; 레인 11: 보어텍스 H7MGT-P 14 mg/mL; 레인 12: UV H7MT-P 8 mg/mL; 레인 13: UV H7MT-P 14 mg/mL; 레인 14: UV H7MGT-P 8 mg/mL; 레인 15: UV H7MGT-P 14mg/mL.
도 72는 6시간 동안 교반하고 4시간 동안 UV 광에 노출한 샘플, 및 대조군 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 4: 보어텍스/UV 조절 H7MT-P 8 mg/mL; 레인 5: 보어텍스/UV 조절 H7MT-P 14 mg/mL; 레인 6: 보어텍스/UV 조절 H7MGT-P 8 mg/mL; 레인 7: 보어텍스/UV 조절 H7MGT-P 14 mg/mL; 레인 8: 보어텍스 H7MT-P 8 mg/mL; 레인 9: 보어텍스 H7MT-P 14 mg/mL; 레인 10: 보어텍스 H7MGT-P 8 mg/mL*(오염); 레인 11: 보어텍스 H7MGT-P 14 mg/mL; 레인 12: UV H7MT-P 8 mg/mL; 레인 13: UV H7MT-P 14 mg/mL; 레인 14: UV H7MGT-P 8 mg/mL; 레인 15: UV H7MGT-P 14mg/mL.
도 73은 1주 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 샘플, 및 열 풀림(thermal unfolding) 조건에 노출된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 4: H7MT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 5: H7MT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 6: H7MGT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 7: H7MGT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 8: H7MT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 9: H7MT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 10: H7MGT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 11: H7MGT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 12: H7MT-P 8 mg/mL 열 풀림; 레인 13: H7MT-P 14 mg/mL 열 풀림; 레인 14: H7MGT-P 8 mg/mL 열 풀림; 레인 15: H7MGT-P 14 mg/mL 열 풀림.
도 74는 1주 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 샘플, 및 열 풀림 조건에 노출된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 4: H7MT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 5: H7MT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 6: H7MGT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 7: H7MGT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 8: H7MT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 9: H7MT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 10: H7MGT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 11: H7MGT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 12: H7MT-P 8 mg/mL 열 풀림; 레인 13: H7MT-P 14 mg/mL 열 풀림; 레인 14: H7MGT-P 8 mg/mL 열 풀림; 레인 15: H7MGT-P 14 mg/mL 열 풀림.
도 75는 2주 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원) 을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: H7MT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 4: H7MT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 5: H7MGT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 6: H7MGT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 7: H7MT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 8: H7MT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 9: 8 mg/mL 40℃; 레인 10: H7MGT-P 14 mg/mL 40℃.
도 76은 2주 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: H7MT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 4: H7MT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 5: H7MGT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 6: H7MGT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 7: H7MT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 8: H7MT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 9: H7MGT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 10: H7MGT-P 14 mg/mL 40℃.
도 77은 4개월 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 4: P6MT; 레인 5: H6MT; 레인 6: P6GT; 레인 7: P6MS; 레인 8: P6MTMet; 레인 9: P6MT; 레인 10: P7GT; 레인 11: P6MGT; 레인 12: P6MGT-P; 레인 13: P6MT-P; 레인 14: P6GT-P.
도 78은 4개월 동안 4℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 4: P6MT; 레인 5: H6MT; 레인 6: P6GT; 레인 7: P6MS; 레인 8: P6MTMet; 레인 9: P6MT; 레인 10: P7GT; 레인 11: P6MGT; 레인 12: P6MGT-P; 레인 13: P6MT-P; 레인 14: P6GT-P.
도 79는 4개월 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: P6MT; 레인 4: H6MT; 레인 5: P6GT; 레인 6: P6MS; 레인 7: P6MTMet; 레인 8: P6MT; 레인 9: P7GT; 레인 10: P6MGT; 레인 11: P6MGT-P; 레인 12: P6MT-P; 레인 13: P6GT-P.
도 80은 4개월 동안 25℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(1 μg); 레인 3: P6MT; 레인 4: H6MT; 레인 5: P6GT; 레인 6: P6MS; 레인 7: P6MTMet; 레인 8: P6MT; 레인 9: P7GT; 레인 10: P6MGT; 레인 11: P6MGT-P; 레인 12: P6MT-P; 레인 13: P6GT-P.
도 81은 4주 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(0.5 μg); 레인 3: H7MT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 4: H7MT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 5: H7MGT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 6: H7MGT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 7: H7MT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 8: H7MT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 9: H7MGT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 10: H7MGT-P 14 mg/mL 40℃.
도 82는 4주 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장된 샘플의 SDS-PAGE 분석(비환원)을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준; 레인 2: hGH(0.5 μg); 레인 3: H7MT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 4: H7MT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 5: H7MGT-P 8 mg/mL 4℃; 레인 6: H7MGT-P 14 mg/mL 4℃; 레인 7: H7MT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 8: H7MT-P 14 mg/mL 40℃; 레인 9: H7MGT-P 8 mg/mL 40℃; 레인 10: H7MGT-P 14 mg/mL 40℃.
도 83은 샘플의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 레인 1: PEG-hGH 표준(배치 2); 레인 2: hGH(1 μg); 레인 4: 39.9 mg/mL 비환원; 레인 5: 24.3 mg/mL 비환원; 레인 6: 1.1 mg/mL 비환원; 레인 8: 39.9 mg/mL 환원; 레인 9: 24.3 mg/mL 환원;레인 10: 1.1 mg/mL 환원.
정의
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구축물(construct) 및 시약에 한정되지 않으며 변화할 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 오직 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 오직 첨부되는 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
본 명세서와 청구범위에서 사용된 단수 형태의 표현은 달리 명시하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "hGH"이라고 하는 것은 이러한 단백질 하나 이상을 지칭하며, 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 임의의 방법, 장치 및 물질들을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 이하 바람직한 방법, 장치 및 물질을 기재한다.
본원에 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들어, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공보에 기재되는 구축물 및 방법론을 기재하고 개시할 목적으로 본원에 참고로 인용된다. 본원에서 논의되는 공보는 오직 본 출원의 출원일 전 그의 개시 내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서 중 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시 내용을 선행할 권리가 없음을 용인하는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.
U.S. 특허 출원 일련 제11/046,432호가 전체적으로 참고로 인용된다. 따라 서, U.S. 특허 출원 일련 제11/046,432호의 문단 번호 79-153에 제공된 개시 내용은 그 개시 내용이 본원에 전부 제시된 것과 같은 정도로, 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 hGH 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 hGH 폴리펩티드의 제조, 정제, 특징화 및 이용과 관련된 방법, 조성물, 기법 및 전략에 전분 적용된다.
본원에 사용되는 "성장 호르몬" 또는 "GH"는 해당 물질의 생물학적 활성에 상관없이, 또한 재조합(cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 핵산의 다른 형태로부터 생산되는지의 여부와 상관없이), 시험관 내, 생체 내, 핵산 분자의 마이크로주입, 합성, 유전자도입(transgenic) 및 유전자 활성화 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 합성 또는 제조 방법에 관계없이 인간 성장 호르몬, 및 GH 유사체, GH 아형태(isoform), GH 모사체, GH 단편, 혼성 GH 단백질, 융합 단백질 올리고머 및 다량체, 그의 동족체, 글리코실화 패턴 변종체, 변종체, 스플라이스 변종체, 및 뮤테인의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 용어 "hGH 폴리펩티드"는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 포괄한다.
완전 전장 천연 발생 GH 아미노산 서열, 및 성숙 천연 발생 GH 아미노산 서열 및 천연 발생 변종체에 대해, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호의 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3을 각기 참고한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 성장 호르몬 폴리펩티드의 상기 서열 또는 임의의 다른 서열과 실질적으로 일치한다.
용어 "hGH 폴리펩티드"는 또한 약제학적으로 허용되는 염 및 이러한 염의 전구 약물, 천연 발생 hGH의 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변종체 및 입체이성체, 및 천연 발생 hGH의 작동제, 모사체 및 길항제 변종체 및 그것의 폴리펩티드 융합체를 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 양쪽 모두에서 추가적인 아미노산을 포함하는 융합체는 용어 "hGH 폴리펩티드"에 포괄된다. 예시적인 융합체는 예를 들어, 메티오닌이 재조합 발현으로부터 유도되는 것인 hGH의 N-말단에 결합되는 메티오닐 성장 호르몬, 정제용 융합체(폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함하나 이에 한정되지 않음), 혈청 알부민 결합 펩티드를 갖는 융합체, 및 혈청 단백질, 예를 들어 혈청 알부민을 갖는 융합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제5,750,373호는 각각의 수용체 분자에 대한 결합 성질이 변경된 성장 호르몬 및 항체 단편 변종체와 같은 신규 단백질을 선택하는 방법을 기재한다. 그 방법은 필라멘트성 파지 M13의 유전자 III 코트 단백질의 카르복시 말단 도메인에 관심 단백질을 코딩하는 유전자를 융합시키는 것을 포함한다.
다양한 참고 문헌들이 중합체 접합(conjugation) 또는 글리코실화에 의한 폴리펩티드의 변형을 개시한다. 용어 "hGH 폴리펩티드"는 중합체, 예를 들어 PEG에 접합되는 폴리펩티드를 포함하고, 시스테인, 리신 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가적인 유도체화로 이루어질 수 있다. 또한, hGH 폴리펩티드는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있고, 여기에서 상기 링커 또는 중합체가 접합된 아미노산이 본 발명에 따른 비천연 아미노산이거나 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 리신 또는 시스 테인의 결합(coupling)을 사용하여 천연적으로 코딩된 아미노산에 접합시킬 수 있다.
hGH 폴리펩티드의 중합체 접합이 보고되었다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제5,849,535호, 제6,136,563호 및 제6,608,183호를 참고한다. 미국 특허 제4,904,584호는 하나 이상의 리신 잔기가 결실되거나 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된, PEG화된 리신이 결여된 폴리펩티드를 개시한다. WO 99/67291은 단백질을 PEG와 접합시키는 방법으로서, 단백질 상의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되고, 단백질이 단백질에 접합시키기에 충분한 조건 하에서 PEG와 접촉하는 방법을 개시한다. WO 99/03887은 성장 호르몬 초부류에 속하는 폴리펩티드의 PEG화된 변종체를 개시하고 있으며, 여기에서 시스테인 잔기는 폴리펩티드의 특수 영역에 위치한 비본질적 아미노산 잔기로 치환되었다. WO 00/26354는 상응하는 모 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 추가적인 글리코실화 부위를 포함하는, 감소된 알레르기항원성을 갖는 글리코실화된 폴리펩티드 변종체를 생산하는 방법을 개시한다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제5,218,092호는 본연의 폴리펩티드 대비, 하나 이상의 부가적 탄수화물 사슬을 도입하기 위한 과립구 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 기타 폴리펩티드의 변형을 개시한다.
용어 "hGH 폴리펩티드"는 폴리펩티드의 N-결합 또는 O-결합 글리코실화 형태인, 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는 글리코실화 hGH를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 변화를 보유하는 변종체는 hGH 폴리펩티드의 생물 활성 변종체로도 간주된다. 또한, 스플라이스 변종체 또한 포함된다. 또한, 용어 "hGH 폴리펩티드"는 화학적 수단에 의해 연결되어 있거나 융합 단백질로서 발현되어 있는, 임의의 하나 이상의 hGH 폴리펩티드 또는 임의의 다른 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 리간드 또는 임의의 유형의 다른 활성 분자의 이형이량체, 동형이량체, 이형다량체, 또는 동형다량체뿐만 아니라 예를 들어, 생물 활성을 여전히 유지하는 특정한 결실 또는 다른 생물학적 변형을 보유하는 폴리펩티드 동족체를 포함한다.
본원에 기재된 hGH에서의 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 달리 명시하지 않는 한(즉, 서열 번호 1 및 서열 번호 3과 같은 또 다른 hGH 서열을 기준으로 비교하는 것으로 언급되는 경우), 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")에 열거된 서열 번호 2에서의 위치를 기준으로 한다. 당업자는 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호에 열거된 서열 번호 1, 2, 3 또는 임의의 다른 GH 서열 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치를 임의의 다른 hGH 분자, 예를 들어 hGH 융합체, 변종체, 단편 등에서 용이하게 동정할 수 있다는 점을 명확히 이해할 것이다. 예를 들어, 서열 정렬 프로그램, 예를 들어 BLAST는 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호에 열거된 서열 번호 1, 2, 3, 또는 다른 GH 서열 중의 위치에 상응하는 단백질에서 특정 위치를 정렬하고 동정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호에 열거된 서열 번호 1, 2, 3 또는 다른 GH 서열을 기준으로 본원에 기재된 아미노산의 치환, 결실 또는 부가도 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 hGH 융합체, 변 종체, 단편 등에서의 상응하는 위치에서의 치환, 결실 또는 부가를 지칭하는 것으로 의도되며, 본 발명에 명백히 포괄된다.
용어 "hGH 폴리펩티드" 또는 "hGH"는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산 변형물과 함께 하나 이상의 천연 아미노산을 사용한 변형물로 이루어질 수 있다. 자연 발생 hGH 폴리펩티드 중 매우 다양한 아미노산 위치에서의 예시적인 치환은 예를 들어, 작동자 활성을 증가시키거나, 폴리펩티드의 용해도를 증가시키거나, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키는 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 조절하는 치환을 포함하나 이에 한정되지 않고, 이는 용어 "hGH 폴리펩티드"에 위해 포괄된다.
일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 hGH의 하나 이상의 성질 또는 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 친화성을 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절하거나(증가 또는 감소를 포함하나 이에 한정되지 않음), 수용체 이량체를 안정화시키거나, 순환 반감기를 조절하거나, 치료적 반감기를 조절하거나, 폴리펩티드의 안정성을 조절하거나, 프로테아제에 의한 분절을 조절하거나, 투여량을 조절하거나, 방출 또는 생체이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 특정 투여 경로를 개선하거나 변화시킬 수 있다. 유사하게, hGH 폴리펩티드는 프로테아제 분절 서열, 분비 신호 서열, 반응성 기, 항체 결 합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성 기재 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하나 이에 한정되지 않음), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 연결된 분자(비오틴을 포함하나 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.
또한, 용어 "hGH 폴리펩티드"는 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해 동일하거나 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄, 또는 천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접 결합되거나 링커를 통해 간접적으로 결합된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 동형이량체, 이형이량체, 동형다량체 및 이형다량체를 포함한다. 예시적인 링커는 작은 유기 화합물, 다양한 길이의 수용성 중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란, 또는 다양한 길이의 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 일반 아미노산 중 하나 피로리신 또는 셀레노시스테인(selenocysteine)이 아닌 아미노산을 지칭한다. 용어 "비천연적으로 코딩된 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들로는 "비천연 아미노산," "비천연 아미노산," "비천연 발생 아미노산" 및 그들의 다양한 하이픈으로 결합된 형식 및 하이픈으로 결합되지 않은 형식이 있다. 또한, 용어 "비천연적으로 코딩된 아미노산"은 또한 천연적으로 코딩된 아미노산(20개의 일반 아미노산 또는 피로리신 및 셀레노시스테인을 포함하나 이에 한정되지 않음)의 변형물(예를 들어, 번역후 변형)에 의해 발생하지만, 그 자체로는 번역 복합체에 의해 성장 폴리펩티드 사슬에 천연적으로 혼입되지 않는 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않 는다. 이러한 비천연 발생 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"아미노 말단 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형 기는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 또는 다른 부분들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 부분"은 당업계 및 본원에서 분자의 독특한 정의 가능한 부분 또는 단위를 지칭하는 것으로 사용된다. 이 용어들은 화학 분야에서는 다소 동일한 의미이며, 본원에서는 일부 기능 또는 활성을 수행하고, 다른 분자와 반응성을 갖는 분자의 부분을 나타내는데 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "연결기" 또는 "링커"는 정상적으로 화학적 반응의 결과로 형성되고, 전형적으로 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭한다. 가수분해적으로 안정한 연결기는, 연결기가 수중에서 실질적으로 안정하고, 생리학적 조건 하에서 장기간 동안, 아마도 심지어 무기한 동안을 포함하나 이에 한정되지 않는 조건에서 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결기는, 연결기가 예를 들어, 혈액을 비롯한 물 또는 수용액에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 연결기는 연결기가 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 이 해되고 있듯이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기들 중 하나 이상 사이 링커기 또는 중합체 골격 중에서 분해가능한 연결기를 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산을 생물학적 활성제 상에서 알코올 기와 반응시킴으로써 형성된 에스테르 연결기는 일반적으로 이러한 약제를 방출시키는 생리학적 조건 하에서 가수분해된다. 다른 가수분해적으로 분해가능한 연결기는 카르보네이트 연결기, 아민 및 알데히드의 반응으로부터 유래하는 이민 연결기, 알코올을 포스페이트기에 반응시킴으로써 형성되는 에스테르 연결기, 히드라지드 및 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 연결기, 알데히드 및 알코올의 반응 생성물인 아세탈 연결기, 포르메이트 및 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 연결기, 중합체, 예를 들어 PEG의 말단을 포함하나 이에 한정되지 않는 아민기 및 펩티드의 카르복실기에 의해 형성된 펩티드 연결기, 및 중합체의 말단을 포함하나 이에 한정되지 않는 포스포라미다이트기, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 연결기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"는 바이러스, 세균, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균류, 식물, 동물 및 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 생물학적 유기체의 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 성질에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에 사용되는 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물의 질병의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하거나, 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 안녕을 증진시키기 위한 임의의 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 미세입자 및 미셀을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기 적당한 생물학적 활성제의 부류는 약물, 전구 약물, 방사성 핵종, 이미징제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관 제제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드성 제제, 미생물 유도 독소 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"이작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 연결기를 형성할 수 있는 2개의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정 생물학적 활성 성분 상의 기와 반응성을 갖는 한 작용기, 및 제2 생물학적 성분 상의 기와 반응성을 갖는 또 다른 기를 갖는 이작용성 링커를 사용하여, 제1 생물학적 활성 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적 활성 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 펩티드에 다양한 화합물을 부착시키기 위한 많은 절차 및 링커 분자들이 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 유럽 특허 출원 EP 188,256, 미국 특허 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호, 제4,680,338호, 및 제4,569,789호를 참고한다. "다작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 이작용성 중합체 또는 다작용 성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있고, GH, 예컨대 hGH 분자에 연결된 하나 이상의 분자들 간의 원하는 특정 간격 또는 형태를 제공하도록 선택될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. hGH 폴리펩티드에의 수용성 중합체의 연결은, 변형되지 않은 형태에 비해 증가된 또는 조절된 혈청 반감기 또는 증가된 또는 조절된 치료적 반감기, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 회합 특성, 예를 들어 응집 및 다량체 형성, 변화된 수용체 결합 및 변화된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하나 이에 한정되지 않는 변화를 일으킬 수 있다. 수용성 중합체는 그 자신의 생물학적 활성을 가지거나 가지지 않을 수 있다. 적당한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 그것의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체(본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-히드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 술페이트를 비롯한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 이당류, 글리칸, 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나 이에 한정되지 않는 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그것의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜 및 그것의 유도체의 공중합체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 그들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그러한 수용성 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"은 폴리에틸렌 글리콜(폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 그것의 유도체를 지칭한다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 및 분지형 중합체 양쪽 모두 및 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 포함한다. 다른 예시적인 실시양태는 예를 들어, 상업적 공급업체 카탈로그, 예를 들어 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corporation)의 카탈로그 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications"(2001)]에 열거되어 있다.
본원에 사용되는 용어 "조절된 혈청 반감기"는 그 자체의 변형되지 않은 형태를 기준으로 변형된 생물학적 활성 분자의 순환 반감기에서의 양성 또는 음성적 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 hGH를 투여한 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 취하고, 각각의 샘플 내 그 분자의 농도를 결정함으로써 측정된다. 혈청 농도와 시간의 상관 관계는 혈청 반감기를 계산할 수 있게 한다. 증가된 혈청 반감기는 바람직하게는 약 2배 이상이지만, 예를 들어, 만족스러운 투여 요법을 가능케 하거나 독성 효과를 피하는 경우 이보다 적은 증가도 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 증가는 약 3배 이상, 약 5배 이상 또는 약 10배 이상이다.
본원에 사용되는 용어 "조절된 치료적 반감기"는 그의 변형되지 않은 형태를 기준으로 치료적 유효량의 변형된 생물학적 활성 분자의 반감기의 양성적 변화 또는 음성적 변화를 의미한다. 치료적 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약 동학적 및/또는 약력학적 성질을 측정함으로써 측정된다. 바람직하게는, 증가된 치료적 반감기는 유익한 특정 투약 요법, 유익한 특정 총 투약량을 가능하게 하거나 원치 않는 효과를 피할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 치료적 반감기의 증가는 증가된 효능, 변형된 분자의 그의 표적에 대한 결합의 증가 또는 감소, 또는 변형되지 않은 분자의 작용 기전 또는 또 다른 매개변수의 증가로부터 비롯된다.
용어 "실질적으로 정제된"은 그의 자연 발생 환경, 즉 본연의 세포, 또는 재조합으로 생산된 hGH 폴리펩티드의 경우 숙주 세포에서 발견되는 단백질을 정상적으로 동반하거나 이와 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 필수적으로 함유하지 않을 수 있는 hGH 폴리펩티드를 지칭한다. 실질적으로 세포 물질을 함유하지 않을 수 있는 hGH 폴리펩티드는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만(건조 중량 기준)의 오염 단백질을 갖는 단백질의 제제를 포함한다. hGH 폴리펩티드 또는 그의 변종체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. hGH 폴리펩티드 또는 그의 변종체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 또는 약 1 mg/L 이하로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 "실질적으로 정제된" hGH 폴리펩티드는 적당한 방법, 예를 들어 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세 관 전기영동에 의해 결정 시에, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 구체적으로 약 75%, 80%, 85% 이상의 순도 수준, 더욱 구체적으로 약 90% 이상의 순도 수준, 약 95% 이상의 순도 수준, 약 99% 이상의 순도 수준 또는 그 이상을 가질 수 있다.
용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 회합되는 다른 세포 성분들을 실질적으로 함유하지 않음을 나타낸다. 이는 균질한 상태일 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 또는 수용액을 포함하나 이에 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 그것은 부가적인 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 성분일 수 있다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기법, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제제 내에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 그 유전자에 측접하고(flank) 관심 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 한 밴드를 생성하는 것을 나타낸다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질의 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 그 이상임을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "대상"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 일부 실시양태에서는 포유류, 다른 실시양태에서는 인간을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "유효량"은 치료되는 질병, 상태 또는 장애의 증상들 중 하나 이상을 일정한 정도로 경감시키는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 투여량을 지칭한다. 본원에 기재된(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방적 처리 및/또는 치료적 처리의 목적으로 투여될 수 있다.
용어 "증진시키다" 또는 "증진시키는"은 원하는 효과의 효능 또는 기간을 늘리거나 연장하는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 증진시키는 것과 관련하여, 용어 "증진"은 한 시스템에 대한 다른 치료제의 효능 또는 기간을 늘리거나 연장시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본원에 사용되는 "증진-유효량"은 원하는 시스템에서 또 다른 치료제의 효과를 증진시키는데 적당한 양을 지칭한다. 환자에게 사용되는 경우, 이러한 용도에 유효한 양은 질병, 장애 또는 상태의 심도 및 과정, 이전 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 의사의 판단에 따라 좌우되게 된다.
본원에 사용되는 용어 "변형된"은 소정의 폴리펩티드에 대한 임의의 변화, 예컨대 폴리펩티드의 아미노산 서열, 화학적 구조, 폴리펩티드의 공번역(co-translation) 변형 또는 번역후 변형을 지칭한다. "(변형된)"의 형태를 갖는 용어는 논의되는 폴리펩티드가 임의적으로 변형되는 것, 즉 논의되는 폴리펩티드가 변형되거나 변형되지 않을 수 있음을 의미한다.
용어 "번역후 변형된"은 폴리펩티드 사슬에 혼입된 후 당해 아미노산에 발생하는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 이 용어는 오직 예시를 위한 것인 공번역 생체 내 변형, 공번역 시험관 내 변형(예컨대, 세포-비포함 번역계 내), 번역 후 생체 내 변형 및 번역 후 시험관 내 변형을 포함한다.
예방적 용도에 있어, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 특정 질병, 장애 또는 상태에 걸리기 쉽거나 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여한다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의된다. 이러한 사용 시에 있어, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 통상의 실험(예를 들어, 용량 증가 임상 시험)에 의해서 이러한 예방적 유효량을 결정하는 것은 당업계의 지식 내에 속하는 것으로 간주된다.
치료적 용도에 있어, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 이미 질병, 상태 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 질병, 장애 또는 상태의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 투여한다. 이러한 양은 "치료적 유효량"으로 정의되고, 질병, 장애 또는 상태의 심도 및 과정, 이전 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 의사의 판단에 따라 좌우되게 된다. 이러한 치료적 유효량을 통상의 실험(예를 들어, 투여량 증가 임상 시험)에 의한 결정하는 것은 당업계의 지식 내에 속하는 것으로 고려된다.
용어 "치료(하는 것)"은 예방적 처리 및/또는 치료적 처리를 지칭하는데 사용된다.
비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 해당 처리가 필요한 유기체에 투여 시에 대사되어, 대사물을 생성시킬 수 있고, 이는 다시 원하는 치료 효과를 비롯한 원하는 효과를 생성시키기 위해 사용된다.
달리 언급되지 않는 한, 당업계의 기술에 속하는 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학 통상적인 방법이 사용된다.
발명의 상세한 설명
I. 도입부
본 발명에서는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 분자가 제공된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 hGH 폴리펩티드는 하나 이상의 번역후 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 번역후 변형은 제2 반응성 기를 포함하는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된(photocaged) 부분, 화학선 복사 여기성 부분, 광이성화가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴 유사체, 중 원자를 혼입시킨 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성(photocleavable) 기, 연장된 측쇄, 탄소-연결 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소로 표지화된 부분, 생체물리학적 프로브, 형광 기, 화학발광기, 전자 밀집 기, 자성 기, 층간삽입성 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점(quantum dot), 나노트랜스미터(nanotransmitter), 방사성 핵종, 방사성 트랜스미터, 뉴런 포착제, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합 물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 분자를 특정 반응성 기에 적당한 것으로 당업자에게 공지되어 있는 화학 방법론을 사용하여 제1 반응성 기를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산에 부착시키는 것을 포함한다.
관심 단백질 또는 폴리펩티드는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상 개수의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상 개수의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 천연 발생 양태의 단백질 중에 존재하는 하나 이상의, 그러나 전부에는 못 미치는 특별한 아미노산은 비천연 아미노산으로 치환된다.
본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GH 초유전자 부류, 특히 hGH의 구성원을 기초로 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 hGH와 같은 GH 초유전자 부류 구성원에 도입시키는 것은 통상 발생하는 20개의 아미노산과 반응하지 않으면서 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는 것과 특이적으로 화학 반응하는 것을 포함하는 접합 화학 작용을 적용하도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 GH 초유전자 족 구성원은 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 수용성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 결합된다. 본 발명은 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 포함하나 이에 한정되지 않는 20개의 천연적으로 혼입된 아미노산에서는 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는 비유전자로 코딩된 아미노산을 셀렉터 코돈에 상응하여 단백질에 선택적으로 혼입시키고, 이러한 아미노산을 적당히 반응성인 PEG 유도체를 사용하여 추후 변형시키는 것을 포함하는 것인 PEG 유도체를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시키는 데에 매우 효과적인 방법을 제공한다. 아미노산 측쇄는 일단 혼입되면 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특별한 작용기 또는 치환기에 적당한 것으로 당업자에게 공지된 화학 방법론을 사용하여 변형될 수 있다. 수용성 중합체를 단백질에 혼입시키기 위해 매우 다양한 공지된 화학 방법론들이 본 발명에 사용하기 적합하다.
PEG가 생물소재의 표면을 변형시키는데 사용될 수 있다는 점은 당업계에 잘 정립되어 있다(예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제6,610,281호, [Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci., 3(1); 125-136(2000)] 참고).
재조합 핵산 방법, 셀렉터 코돈, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소, 및 카르보닐 기, 히드라진, 히드라지드, 아미녹시, 아지드 및 알킨기를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 반응기를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 논의가 본원에 전체적으로 참고로 인용된 U.S. 특허 출원 제11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")에 제공된다. 비천연적으로 코딩된 아미노산의 세포 흡수 및 생합성이 또한 이 출원에 개시된다. 이 출원은 또한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 hGH로의 혼입, 및 hGH 폴리펩티드의 발현을 위한 부위를 상세히 기재한다. p-아세틸-(+/-)- 페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 본원에 참고로 인용되는 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746(2003)]에 기재되어 있다.
II. 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드
비천연 아미노산의 혼입은 단백질 구조 및/또는 기능의 변화를 조정하거나, 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근성, 부분(단백질 어레이에 대한 경우를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 대해 표적화하거나, 생물학적 활성 분자를 첨가하거나, 중합체를 부착하거나, 방사성 핵종을 부착하거나, 혈청 반감기를 조절하거나, 조직 투과(예컨대, 종양)를 조절하거나, 활성 수송을 조절하거나, 조직, 세포 또는 기관 특이성 또는 분포를 조절하거나, 면역원성을 조절하거나, 프로테아제 내성을 조절하는 것 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 증진되거나 심지어 완전히 신규한 가질 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킴으로써 하기 성질들은 임의적으로 변형된다: 독성, 생체 분포, 구조적 성질, 분광학적 성질, 화학적 및/또는 광화학적 성질, 촉매 작용 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나 이에 한정되지 않음), 공유적으로 또는 비공유적으로 반응할 수 있는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 작용 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체를 포함하나 이에 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구를 포함하나 이에 한정되지 않는 것들에 유용하다. 예를 들어, [Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참고한다.
본 발명의 한 측면에서, 본 조성물은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 이상 개수의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 그 이상 개수의 상이한 부위가 존재할 수 있는 경우를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 측면에서, 조성물은 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 하나 이상, 단 전부가 아닌 그보다 적은 수가 비천연 아미노산으로 치환된 단백질을 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(이 단백질이 2개 이상의 상이한 유형의 비천연 아미노산을 포함하거나, 2 가지 동일한 비천연 아미노산을 포함할 수 있는 경우를 포함하나 이에 한정되지 않음). 2 개를 초과하는 비천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이하거나, 또는 하나 이상의 상이한 비천연 아미노산과 동일한 종류로 된 다수의 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.
하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 관심 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명의 한 특성이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 또한, 부형제(약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하나 이에 한정되지 않음)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.
하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 진핵세포에서 생산함으로써, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 전형적으로 번역 후 진핵세포 변형을 포함하게 된다. 특정 실시양태에서, 단백질은 하나 이상의 비천연 아미노산, 및 진핵세포에 의해 생체 내 생성된 하나 이상의 번역후 변형을 포함하며, 여기에서 이러한 번역후 변형은 원핵세포에 의해서는 생성되지 않는다. 예를 들어, 변역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질-변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질-연결 변형, 글리코실화 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 한 측면에서, 번역후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 연결기에 의해 이당류((GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 아스파라긴에 부착시키는 것을 포함한다. 진핵 단백질의 N-연결 이당류의 일부 예를 열거한, 본원에 전체적으로 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")의 표 1을 참고한다(또한, 추가적인 잔기가 존재할 수 있으며, 이는 나타내지 않음). 또 다른 측면에서, 번역후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 연결, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 연결에 의해 이당류(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 포함한다.
또한, 또 다른 측면에서, 변역 후 변형은 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선 호르몬, 전전구인슐린(preproinsulin), 전구인슐린(proinsulin), 전전구-오피오멜라코르틴(preproopiomelanocortin), 전구-오피오멜라코르틴(pro-opiomelanocortin) 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)의 단백질분해 처리, 다중 서브유닛 단백질 또는 거대분자 어셈블리로의 어셈블리, 세포 중의 또 다른 부위로(소기관, 예를 들어 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로 또는 분비성 경로를 통하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음) 번역시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다. 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제4,963,495호 및 제6,436,674호는 hGH 폴리펩티드의 분비를 개선시키기 위해 고안된 구축물을 상술한다.
비천연 아미노산의 한 이점은, 그것이 추가적인 분자를 첨가시키는데 사용될 수 있는 추가적인 화학적 부분을 제공한다는 것이다. 이러한 변형은 진핵세포 또는 비진핵세포에서 생체 내에서, 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 번역후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들어, 번역후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄와의 반응을 포함하나 이에 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이러한 경우에서의 선택성은 단백질 중의 친핵성 잔기의 접근성 및 수에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서, 다른 더 많 은 선택적 반응들, 예를 들어 시험관 내 및 생체 내에서 비천연 케토-아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응을 사용할 수 있다. 예컨대, [Cornish, et al., (1996) J. Am . Chem . Soc ., 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) J. Am . Chem . Soc . 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc . Natl. Acad . Sci . 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; 및 Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7]를 참고하고, 이들 모두는 본원에 참고로 인용된다. 이는 형광 발색단, 가교결합제, 당류 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 시약으로 된 숙주를 사용하여 거의 모든 단백질을 선택적으로 표지화할 수 있게 한다. 또한, 본원에 참고로 인용되는 2003년 1월 16일 출원된 미국 특허 제6,927,042호(발명의 명칭: "Glycoprotein synthesis")를 참고한다. hGH에 부착될 수 있는 분자는 염료, 형광발색단, 가교결합제, 당류 유도체, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체가 포함되나, 이에 한정되지 않음), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 비오틴의 유사체, 수지, 비이드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들)(DNA, RNA 등을 포함하나 이에 한정되지 않음), 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 비천연 아미노산의 유전적 혼입을 포함하는, 단백질의 선택적 변형을 통해 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 조제물을 제공한다.
III . 비유전적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 생체 내 생성
본 발명의 hGH 폴리펩티드는 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 생체 내 생성되어, 천연 발생 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산에 첨가되거나 이를 치환할 수 있다.
천연 발생 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하여 tRNA 및 tRNA 합성효소를 생성하는 방법은 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호(일련 번호 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(일련 번호 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 이러한 방법은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNA와 독립적으로 기능하는(이는 따라서, 때때로 "오르토고날"이라고도 지칭됨) 번역 기구를 생성하는 것을 포함한다. 전형적으로, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 번역 시스템에서 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 사용하여 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하고, O-tRNA는 이 시스템 중에서 다른 tRNA에 의해 인식되지 못하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 상응하여 상기 시스템 중에서 생산된 단백질에 비천연적으로 코딩된 아미노산을 삽입함으로써 코딩된 폴리펩티드 중의 위치에 아미노산을 "치환"시킨다.
매우 다양한 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 특정 합성 아미노산을 폴리펩티드에 삽입하는 것으로 당업계에 기재되었으며, 이들은 일반적으로 본 발명에 사용하기 적합하다. 예를 들어, 케토-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소는 [Wang, L., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100; 56-61(2003)] 및 [Zhang, Z. et al., Biochem . 42(22): 6735-6746(2003)]에 기재되어 있다. 예시적인 O-RS 또는 그의 부분은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 각각 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호 및 제2003/0108885호에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RS와 함께 사용하기 위한 상응하는 O-tRNA 분자도 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호(일련 번호 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(일련 번호 제10/126,931호)에 기재되어 있다.
아지드-특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템의 한 예는 [Chin, J. W., et al., J. Am . Chem . Soc . 124: 9026-9027(2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 예시적인 O-RS 서열은 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0108885호(일련 번호 제10/126,931호)에 개시된 뉴클레오티드 서열 서열 번호: 14-16 및 29-32 및 아미노산 서열 서열 번호: 46-48 및 61-64를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 부가적 O-tRNA 서열은 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0108885호(일련 번호 제10/126,931호)에 개시된 뉴클레오티드 서열인 서열 번호: 1-3을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 비천연적으로 코딩된 특정 아미노산에 대해 쌍 특이적인 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 다른 예는 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호(일련 번호 제10/126,927호)에 기재되어 있다. S. 세레비지아에(S. cerevisiae ) 중에 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산 양쪽 모두를 혼입시키는 O-RS 및 O-tRNA는 [Chin, J. W., et al ., Science 301: 964-967(2003)]에 기재되어 있다.
수가지 기타 오르토고날 쌍이 보고되었다. 글루타밀(예컨대, [Liu, D. R., 및 Schultz, P. G.(1999) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 96:4780-4785] 참고), 아스파르틸(예컨대, [Pastrnak, M., et al., (2000) Helv . Chim . Acta 83:2277-2286] 참고), 및 티로실(예컨대, [Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem .(Tokyo. Jpn.) 124:1065-1068 참고]; 및 S. 세레비지아에 tRNA로부터 유래된 시스템 및 합성효소([Kowal, A. K., et al., (2001) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 98:2268-2273] 참고)가 대장균 내 비천연 아미노산에 잠정적으로 혼입됨이 기술되었다. 대장균 글루타미닐로부터 유래된 시스템(예컨대, [Kowal, A. K., et al., (2001) Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 98:2268-2273] 참고) 및 티로실(예컨대, [Edwards, H., 및 Schimmel, P.(1990) Mol . Cell . Biol . 10:1633-1641] 참고) 합성효소가 S. 세레 비지아에에 혼입되기 위해 사용되었다. 대장균 티로실 시스템이 포유동물 세포에서 생체 내 3-요오도-L-티로신의 혼입을 위해 사용되었다. [Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res . 30:4692-4699]를 참고한다.
O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 용도는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특이적 코돈을 선택하는 것을 포함한다. 임의의 코돈을 사용할 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 사용되지 않거나 완전히 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 예시적인 코돈은 거의 사용되지 않거나 사용되지 않는 넌센스 코돈, 예를 들어 정지 코돈(앰버, 오커 및 오팔), 4개 이상의 염기 코돈 및 다른 천연 3-염기 코돈 을 포함한다.
특이적인 셀렉터 코돈(들)을 당업계에 공지된 돌연변이 생성 방법(부위-특이적 돌연변이 생성, 카세트 돌연변이 생성, 제한 선택 돌연변이 생성 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 사용하여 hGH 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내 적당한 위치에 혼입시킬 수 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입시키는데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분, 예를 들어 O-RS, OtRNA, 및 오르토고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 [Wang, L., et al., Science 292: 498-500(2001); Chin, J. W., et al., J. Am . Chem . Soc . 124: 9026-9027(2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746(2003)]에 기재되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산의 생체 내 혼입 방법 및 조성물이 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호(일련 번호 제10/126,927호)에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체 내 번역 시스템에 사용하기 위해 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선택하는 방법은 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 출원 공보 제2003/0082575호(일련 번호 제10/126,927호) 및 제2003/0108885호(일련 번호 제10/126,931호)에 기재되어 있다. 본원에 전체적으로 참고로 인용되는 PCT 공보 WO 04/035743(발명의 명칭: "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins")는 케토 아미노산의 혼입을 위한 오르토고날 RS 및 tRNA 쌍을 기재하고 있다. 본원에 전체적으로 참고로 인용되는 PCT 공보 WO 04/094593(발명의 명칭: "Expanding the Eukaryotic Genetic Code")는 진핵 숙주 세포 내 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입을 위한 오르토 고날 RS 및 tRNA 쌍을 기재하고 있다. 그러한 방법은 또한 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")에 상세히 기재되어 있다.
오르토고날 tRNA 및 RS를 생성시키는 방법에 사용되는 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합물을 포함한다. 예를 들어, 그 방법의 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 유기체는 임의적으로 메타노코쿠스 잔나스치 , 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 , 할로박테리움 , 에쉐리키아 콜라이 , A. 풀지더스 , P. 푸리오수스 , P. 호리코시, A. 페르닉스 , T. 써모필루스 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 대안적으로, 이러한 유기체는 임의적으로 식물(복합체 식물, 예를 들어 외떡잎 식물, 또는 쌍떡잎 식물을 포함하나 이에 한정되지 않음), 해조류, 원생생물, 진균류(효모 등을 포함하며, 이에 한정되지 않음), 동물(포유류, 곤충류, 절지류 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함하나 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체 등을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 유기체는 메타노코쿠스 잔나스치 , 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 , 할로박테리움 , 에쉐리키아 콜라이 , A. 풀지더스 , 할로박테리움 , P. 푸리오수스, P. 호리코시 , A. 페르닉스 , T. 써모필루스 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 대안적으로, 제2 유기체는 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균류, 포유류 세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다.
V. hGH 폴리펩티드 내의 비천연 발생 아미노산의 위치
본 발명은 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 hGH 폴리펩티드에 혼입시키는 것을 고려한다. 하나 이상의 비천연 발생 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 파괴하지 않는 특정 위치에서 혼입될 수 있다. 이는 소수성 아미노산을 소수성 아미노산으로 (벌키 아미노산의 경우 벌키 아미노산으로, 친수성 아미노산의 경우 친수성 아미노산으로) 치환하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 "보존적" 치환을 수행하고(하거나) 비천연 발생 아미노산을 활성을 위해 필요하지 않은 위치에 삽입시킴으로써 달성될 수 있다.
hGH의 영역은 다음과 같이 나타낼 수 있으며, 여기에서 hGH 중 아미노산 위치는 중간 열에 나타낸다(본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호의 서열 번호 2).
나선 A 나선 B 나선 C 나선 D
[1-5]-[6-33]-[34-74]-[75-96]-[97-105]-[106-129]-[130-153]-[154-183]-[184-191]
N-말단 A-B 루프 B-C 루프 C-D 루프 C-말단
다양한 생화학적 및 구조적 접근을 사용하여, hGH 폴리펩티드 내에서 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하고자 하는 원하는 부위를 선택할 수 있다. 폴리펩티드 사슬 중 어떠한 위치가 비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입시키기 위해 선택하기에 적합하고, 선택은 임의의 목적 또는 원하는 특정 목적 없이 랜덤 선택에 의해 또는 합리적 설계에 기초할 수 있다는 점이 당업자에게 자명하다. 원하는 부위의 선택은 작동제, 슈퍼-작동제, 역 작동제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 이량체 또는 다량체 형성을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의 의 원하는 성질 또는 활성을 갖는 hGH 분자를 생성하거나, 본연의 분자에 비한 활성 또는 성질을 변화시키지 않거나, 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 성질, 예를 들어 용해도, 응집, 또는 안정성을 조작하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, hGH 폴리펩티드의 생물학적 활성에 요구되는 폴리펩티드 중의 위치는 당업계에 공지된 알라닌 스캐닝 또는 동족체 스캐닝 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, [Cunningham, B. 및 Wells, J., Science, 244: 1081-1085(1989)](hGH 생체활성에 중요한 14개의 잔기 동정) 및 [Cunningham, B., et al. Science 243: 1330-1336(1989)](동족체 스캐닝 돌연변이 생성을 사용하여 항체 및 수용체 에피토프 동정)을 참고한다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제5,580,723호; 제5,834,250호; 제6,013,478호; 제6,428,954호; 및 제6,451,561호는 표적 물질을 갖는 폴리펩티드의 활성에 영향을 주는 활성 도메인을 동정함으로써 hGH와 같은 폴리펩티드의 구조 및 기능을 계통적으로 분석하는 방법을 기재한다. 알라닌 또는 동족체 스캐닝 돌연변이 생성에 의한 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 것들 이외의 잔기는 폴리펩티드에 대해 얻으려 하는 원하는 활성에 따라 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 우수한 후보물질일 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 부위도 역시 폴리펩티드에 대해 얻으려 하는 원하는 활성에 따라 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 우수한 후보물질일 수 있다. 또 다른 대안은 폴리펩티드 사슬 상의 각각의 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 간단히 연속 치환하고, 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 비천연 아미노산을 사용하여 임의의 폴리펩티드에 치환하기 위한 위치를 선택하는 임의의 수단, 기술 또는 방법이 본 발명에 사용하기 적합하다는 점은 당업자에게 자명하다.
또한, 결실을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 천연 발생 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 내성을 가지기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. hGH에 대해 예를 들어, [Kostyo et al., Biochem. Biopphys . Acta, 925: 314(1987); Lewis, U., et al., J. Biol . Chem ., 253: 2679-2687(1978)]을 참고한다. 유사한 방식으로, 프로테아제 소화 및 단일클론 항체를 사용하여 hGH 폴리펩티드 수용체의 결합을 담당하는 hGH 폴리펩티드의 영역을 확인할 수 있다. 예를 들어, [Cunningham, B., et al . Science 243: 1330-1336(1989); Mills, J., et al ., Endocrinology, 107: 391-399(1980); Li, C., Mol. Cell . Biochem ., 46: 31-41(1982)](이는 활성의 손실 없이 잔기 134-149 사이의 아미노산이 결실될 수 있다는 것을 시사함)을 참고한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환에 내성을 갖지 않을 것으로 보이는 잔기를 제거한 후, 각각의 잔여 위치에서 제안되는 치환의 영향을 hGH 및 그것의 결합 단백질의 3차원 결정 구조로부터 조사할 수 있다. hGH에 대해 [de Vos, A., et al ., Science , 255: 306-312(1992)]을 참고하고; hGH의 모든 결정 구조는 단백질 및 핵산의 대형 분자의 3차원 구조적 데이터를 함유하는 중앙 집중식 데이터베이스(centralized database)인 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank)(3HHR, 1AXI 및 1HWG 포함)(PDB, 월드 와이드 웹 상의 rcsb.org에서 입수가능)에서 입수가능하다. 따라서, 당업자는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산 위치를 용이 하게 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 폴리펩티드의 나선 또는 베타 시트 2차 구조를 붕괴시키지 않는 단백질의 영역에 위치한 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함한다.
비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입의 예시적인 잔기는 가능한 수용체 결합 영역(부위 I 및 부위 II를 포함하나 이에 한정되지 않음)으로부터 제외된 것들일 수 있고, 완전히 또는 부분적으로 용매 노출될 수 있고, 이웃 잔기와 최소 수소결합 상호작용을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 이웃하는 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있고, 3차원 결정 구조, 자체의 수용체에 결합되거나 결합되지 않은 hGH 폴리펩티드의 2차, 3차 또는 4차 구조에 의해 예측되는 바와 같이 매우 가요성(C-D 루프를 포함하나 이에 한정되지 않음)이거나 구조적으로 강성(B 나선을 포함하나 이에 한정되지 않음)인 영역 중에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음과 같은 hGH 중의 2차 구조에 상응하는 하기 영역 중 하나 이상의 임의의 위치에서 혼입된다: 서열 번호 2의 1-5(N-말단), 6-33(A 나선), 34-74(A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96(B 나선), 97-105(B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129(C 나선), 130-153(C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183(D 나선), 184-191(C-말단). 다른 실시양태에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 N-말단(1-5), A-B 루프(32-46)의 N-말단 종결부, B-C 루프(97-105), C-D 루프(132-149), 및 C-말단(184-191)으로 구성된 군으로부터 선택된 hGH 중 하나 이상의 영역 에 위치한 하나 이상의 아미노산이 치환된 하나 이상의 비천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은, 하기에 상응하는 GH, 예컨대 hGH의 하기 위치들 중 하나 이상에서 혼입된다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 1번 위치 앞(즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192(즉, 단백질의 카르복실 말단에서).
하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 예시적인 혼입 부위는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 예시적인 부위로 된 부분집합은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. hGH의 결정 구조 및 그것의 hGH 수용체와의 상호작용을 조사한 결과는 이들 아미노산 잔기의 측쇄가 용매에 완전히 또는 부분적으로 접근가능하고, 이는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄가 단백질 표면으로부터 용매로 향할 수 있다는 점을 시사한다.
하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입을 위한 예시적인 위치는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. GH, 예컨대 hGH의 결정 구조 및 그것의 GH, 예컨대 hGH 수용체와의 상호작용을 조사한 결과는 이들 아미노산 잔기의 측쇄가 용매에 완전히 또는 부분적으로 노출되고, 본연의 잔기의 측쇄가 용매로 향한다는 점을 시사한다.
하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 예시적인 부위로 된 부분집합은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 30, 74, 103 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 예시적인 부위로 된 또 다른 부분집합은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 35, 92, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 예시적인 부위로 된 또 다른 부분집합은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 35, 92, 131, 134, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 예시적인 부위로 된 또 다른 부분집합은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 30, 35, 74, 92, 103, 145, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 예시적인 부위로 된 또 다른 부분집합은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 35, 92, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 부위에는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산의 35에 상응하는 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산들 중 하나 이상은 카르보닐 기, 예컨대 케톤 기를 함유한다. GH, 예컨대 hGH가 복수개의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산들 중 하나 초과는 파라-아세틸페닐알라닌이다. GH, 예컨대 hGH가 복수개의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산들 중 실질적으로 모두가 파라-아세틸페닐알라닌이다.
일부 실시양태에서, 비천연 발생 아미노산은 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 위치들 중 하나 이상에서 수용성 중합체에 연결된다: 1번 위치 앞(즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192(즉, 단백질의 카르복실 말단에서)(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 하기 위치들 중 하나 이상에서 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 하기 위치들 중 하나 이상에서 비천연 발생 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다: 35, 92, 143, 145(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 비천연 발생 아미노산은 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 위치들 중 하나 이상에서 수용성 중합체에 연결된다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35, 92, 131, 134, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 비천연 발생 아미노산은 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 위치들 중 하나 이상에서 수용성 중합체에 연결된다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 30, 35, 74, 92, 103, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 비천연 발생 아미노산은 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 위치들 중 하 나 이상에서 수용성 중합체에 연결된다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35, 92, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 비천연 발생 아미노산은 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 위치들 중 하나 이상에서 수용성 중합체에 연결된다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35.
일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH에 연결된 수용성 중합체(들)는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자(PEG)를 포함한다. 중합체, 예컨대 PEG는 선형 또는 분지형일 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 사용되는 선형 중합체, 예컨대 PEG는 MW이 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa일 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 사용되는 분지형 중합체, 예컨대 PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa, 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa일 수 있다. PEG와 같은 중합체가 여기에 더욱 기술된다. 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH와 수용성 중합체, 예컨대 PEG 간의 연결기는 옥심 결합이다.
본 발명의 특정 실시양태는 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 조성물로서, 공유 결합이 옥심 결합인 것인 조성물을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 PEG, 예컨대 선형 PEG이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 하나 이상의 선형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa일 수 있다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 선형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 30 kDa이 다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 하나 이상의 분지형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa일 수 있다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 분지형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 40 kDa이다. 일부 실시양태에서, GH는 GH, 예컨대 hGH이고, 이 실시양태 중 일부에서, GH, 예컨대 hGH는 서열 번호 2에 대해 약 80% 이상의 일치도를 갖는 서열을 가지고, 일부 실시양태에서는 GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 서열인 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하고; 이 실시양태 중 일부에서, 하나 이상의 옥심 결합은 비천연적으로 코딩된 아미노산과 하나 이상의 수용성 중합체 사이에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 예컨대 케톤 기를 함유하고; 일부 실시양태에서는, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 파라-아세틸페닐알라닌이다. 일부 실시양태에서, 파라-아세틸페닐알라닌은 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 치환된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체, 예컨대 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH로서, 공유 결합이 옥심 결합인 것인 GH, 예컨대 hGH를 제공한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 PEG이고, PEG는 선형 PEG이다. 이 실시양태에서, 선형 PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 선형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 30 kDa이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 분지형 PEG인 PEG 이다. 이 실시양태에서, 분지형 PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa, 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 분지형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 40 kDa이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 GH, 예컨대 hGH로서, GH, 예컨대 hGH가 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하고, GH가 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체, 예컨대 PEG에 연결되며, 공유 결합이 비천연적으로 코딩된 아미노산과 수용성 중합체, 예컨대 PEG 간의 옥심 결합인 GH, 예컨대 hGH를 제공한다. 일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 GH, 예컨대 hGH에 혼입된다. 수용성 중합체가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG는 선형 PEG이다. 이 실시양태에서, 선형 PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 선형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 30 kDa이다. 수용성 중합체가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG가 분지형 PEG이다. 이 실시양태에서, 분지형 PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa, 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 분지형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 40 kDa이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 GH, 예컨대 hGH로서, GH, 예컨대 hGH가 카르보닐 함유의, 비천연적으로 코딩된 아미노산인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하고, GH가 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체, 예컨대 PEG에 결합되며, 공유 결합이 비천연적으로 코딩된 아미노산과 수용성 중합체, 예컨대 PEG 간의 옥심 결합인 GH, 예컨대 hGH를 제공한다. 일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 카르보닐-함유 아미노산이 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 GH, 예컨대 hGH에 혼입된다. 수용성 중합체가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG는 선형 PEG이다. 이 실시양태에서, 선형 PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 선형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 30 kDa이다. 수용성 중합체가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG가 분지형 PEG이다. 이 실시양태에서, 분지형 PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa, 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 분지형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 40 kDa이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 케톤 기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 GH, 예컨대 hGH로서, GH가 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체, 예컨대 PEG에 결합되며, 공유 결합이 케톤 기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산과 수용성 중합체, 예컨대 PEG 간의 옥심 결합인 GH, 예컨대 hGH를 제공한다. 일부 실시양태에서, 케톤 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 GH, 예컨대 hGH에 혼입된다. 수용성 중합체가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG는 선형 PEG이다. 이 실시양태에서, 선형 PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 선형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 30 kDa이다. 수용성 중합체 가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG가 분지형 PEG이다. 이 실시양태에서, 분지형 PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa, 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 분지형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 40 kDa이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 GH, 예컨대 hGH로서, GH가 공유 결합에 의해 하나 이상의 수용성 중합체, 예컨대 PEG에 결합되며, 공유 결합이 파라-아세틸페닐알라닌과 수용성 중합체, 예컨대 PEG 간의 옥심 결합인 GH, 예컨대 hGH를 제공한다. 일부 실시양태에서, 파라-아세틸페닐알라닌은 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 GH, 예컨대 hGH에 혼입된다. 수용성 중합체가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG는 선형 PEG이다. 이 실시양태에서, 선형 PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 선형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 30 kDa이다. 수용성 중합체가 PEG인 일부 실시양태에서, PEG가 분지형 PEG이다. 이 실시양태에서, 분지형 PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa, 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 옥심 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 연결된 분지형 PEG를 포괄하는 일부 실시양태에서, PEG는 MW가 약 40 kDa이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 2를 포함하는 GH, 예컨대 hGH로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 옥심 연결기에 의해 MW가 약 30 kDa인 선형 PEG에 연결된 파라-아세틸페닐알라닌으로 치환된 GH, 예컨 대 hGH를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에서 치환된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 1번 위치 앞(즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192(즉, 단백질의 카르복실 말단에서)(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에 치환된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응 하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에 치환된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 35, 92, 143, 145(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에 치환된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35, 92, 131, 134, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에 치환된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 30, 35, 74, 92, 103, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르 몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에 치환된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35, 92, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에 치환된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35. PEG가 선형 PEG인 실시양태에서, PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 함유하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에 치환된 하나 이상의 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 1번 위치 앞(즉, N-말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192(즉, 단백질의 카르복실 말단에서)(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에서 치환된 하나 이상의 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에서 치환된 하나 이상의 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 35, 92, 143, 145(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에서 치환된 하나 이상의 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35, 92, 131, 134, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에서 치환된 하나 이상의 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 30, 35, 74, 92, 103, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에서 치환된 하나 이상의 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35, 92, 143, 145, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 실시양태에서, 본 발명은 옥심 결합에 의해 하나 이상의 PEG, 예컨대 선형 PEG에 연결된 GH, 예컨대 hGH를 포함하는 호르몬 조성물로서, GH, 예컨대 hGH가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, GH, 예컨대 hGH가 하기에 상응하는 위치들을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 위치에서 치환된 하나 이상의 파라-아세틸페닐알라닌인 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 호르몬 조성물을 제공한다: 서열 번호 2, 또는 서열 번호 1 또는 3의 대응하는 아미노산의 35. PEG가 선형 PEG인 실시양태에서, PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 GH, 예컨대 hGH로서, GH, 예컨대 hGH가 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하고, GH가 공유 결합에 의해 복수개의 수용성 중합체, 예컨대 복수개의 PEG에 결합되며, 공유 결합 중 하나 이상이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산과 수용성 중합체, 예컨대 PEG 간의 옥심 결합인 GH, 예컨대 hGH를 제공한다. GH, 예컨대 hGH는 약 2-100 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 2-50 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 2-25 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 2-10 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 2-5 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 5-100 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 5-50 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 5-25 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 5-10 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 10-100 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 10-50 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 10-20 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 20-100 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 20-50 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 또는 약 50-100 수용성 중합체, 예컨대 PEG에 결합될 수 있다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 본원에 기재된 임의의 위치에서 GH, 예컨대 hGH에 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 GH, 예컨대 hGH에 혼입된다. 일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 함유의, 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 파라-아세틸페닐알라닌과 같은 케톤 함유의, 비천연적으로 코딩된 아미노산인 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH는 파라-아세틸페닐알라닌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 파라-아세틸페닐알라닌은 서열 번호 2의 위치 35에 상응하는 위치에서 GH, 예컨대 hGH에 혼입되고, 여기에서 파라-아세틸페닐알라닌은 옥심 결합에 의해 중합체 중 하나, 예컨대 PEG 중 하나에 결합된다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체 중 하나 이상, 예컨대 PEG는 비천연적으로 코딩된 아미노산 중 하나 이상에 대한 공유 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 결합된다. 일부 실시양태에서, 공유 결합은 옥심 결합이다. 일부 실시양태에서, 복수개의 수용성 중합체, 예컨대 PEG는 복수개의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대한 공유 결합에 의해 GH, 예컨대 hGH에 결합된다. 일부 실시양태에서, 공유 결합들 중 하나 이상은 옥심 결합이고; 일부 실시양태에서는, 공유 결합들 중 복수개가 옥심 결합이며; 일부 실시양태에서는, 결합들 중 실질적으로 모두가 옥심 결합이다. 복수개의 수용성 중합체, 예컨대 PEG는 선형, 분지형, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 하나 이상의 선형 PEG가 혼입된 실시양태에 서, 선형 PEG는 MW가 약 0.1 내지 약 100 kDa, 또는 약 1 내지 약 60 kDa, 또는 약 20 내지 약 40 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 하나 이상의 분지형 PEG가 혼입된 실시양태에서, 분지형 PEG는 MW가 약 1 내지 약 100 kDa, 또는 약 30 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa이다. 복수개의 수용성 중합체, 예컨대 PEG를 이용하는 실시양태는 일반적으로 단일 PEG가 사용되는 실시양태보다 낮은 MW의 중합체를 이용하는 것으로 인지될 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 복수개의 PEG의 총 MW는 약 0.1-500 kDa, 또는 약 0.1-200 kDa, 또는 약 0.1-100 kDa, 또는 약 1-1000 kDa, 또는 약 1-500 kDa, 또는 약 1-200 kDa, 또는 약 1-100 kDa, 또는 약 10-1000 kDa, 또는 약 10-500 kDa, 또는 약 10-200 kDa, 또는 약 10-100 kDa, 또는 약 10-50 kDa, 또는 약 20-1000 kDa, 또는 약 20-500 kDa, 또는 약 20-200 kDa, 또는 약 20-100 kDa, 또는 약 20-80 kDa, 약 20-60 kDa, 약 5-10OkDa, 약 5-50 kDa, 또는 약 5-20 kDa이다.
인간 GH 길항제는 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 및 127에서 치환을 갖는 것들 또는 1번 위치에서(즉, N-말단에서)의 첨가 또는 이들의 임의의 조합(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 임의의 다른 GH 서열에서의 상응하는 아미노산)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
매우 다양한 비천연적으로 코딩된 아미노산은 hGH 폴리펩티드 중에서 소정의 위치를 치환하거나 이러한 위치로 통합될 수 있다. 일반적으로, 특정 비천연적으로 코딩된 아미노산은, hGH 폴리펩티드와 그의 수용체의 3차원 결정 구조, 보존적 치 환에 대한 선호성(즉, Phe, Tyr 또는 Trp를 아릴기재 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어 p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파르길티로신으로 치환), 및 hGH 폴리펩티드에 도입시키고자 하는 특이적 접합 화학(예를 들어, 알킨 부분을 갖는 수용성 중합체를 사용한 휘스겐 [3+2] 시클로첨가 또는 아릴 에스테르를 가짐으로써 포스핀 부분을 혼입하는 수용성 중합체를 사용한 아미드 연결기 형성을 수행하고자 하는 경우, 4-아지도페닐알라닌을 도입시킴)의 조사를 기초로 하여 혼입을 위해 선택된다.
한 실시양태에서, 방법은 제1 반응성 기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질에 혼입시키고; 이러한 단백질을 제2 반응성 기를 포함하는 분자(표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학선 복사 여기성 부분, 광이성화가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도체, 비오틴의 유사체, 비오틴 유사체, 중 원자를 혼입시킨 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기, 연장된 측쇄, 탄소-연결 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소로 표지화된 부분, 생체물리적 프로브, 형광 기, 화학발광 기, 전자 밀집 기, 자기 기, 삽입성 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노트랜스미터, 방사성 핵종, 방사성 트랜스미터, 뉴런 포착제, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이에 한정되지 않음)와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 경우들에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환(들)은 hGH 폴리펩티드에 있어 다른 첨가, 치환 또는 결실과 조합되어, hGH 폴리펩티드의 다른 생물학적 형질에 영향을 미치게 된다. 일부 경우들에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 hGH 폴리펩티드의 안정성(단백질분해성 분해에 대한 내성을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 증가시키거나 hGH 폴리펩티드의 그의 수용체에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 일부 경우들에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 hGH 폴리펩티드의 용해도(대장균 또는 다른 숙주 세포 중에서 발현되는 경우를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 첨가, 치환 또는 결실은 대장균 또는 기타 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드 가용성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 대장균 또는 기타 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드 가용성을 증가시키게 되는 비천연 아미노산의 혼입을 위한 또 다른 부위 외에도 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연 아미노산을 사용한 치환을 위한 부위도 선택된다. 일부 실시양태에서, hGH 폴리펩티드는 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 친화성을 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절(증가 또는 감소를 포함하나 이에 한정되지 않음)하거나, 수용체 이량체를 안정화시키거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나 특정 투여 경로를 개선하거 나 변화시키는 또 다른 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 수많은 그러한 변화가 본원에 전체적으로 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호(발명의 명칭: " Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")에 기재되어 있다. 유사하게, hGH 폴리펩티드는 프로테아제 분절 서열, 반응성 기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 다른 친화성 기재 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하나 이에 한정되지 않음), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 결합된 분자(비오틴을 포함하나 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환은 GH, 예컨대 hGH 길항제를 생성한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 대한 예시적인 부위로 된 부분집합은 하기의 것들을 포함한다: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127, 또는 1번 위치 앞 첨가(서열 번호 2, 또는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 임의의 다른 GH 서열에서의 상응하는 아미노산). 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH 길항제는 GH가 길항제로 작용할 수 있게 하는 영역들인 1-5(N-말단), 6-33(A 나선), 34-74(A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96(B 나선), 97-105(B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129(C 나선), 130-153(C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183(D 나선), 184-191(C-말단)에서 하나 이상의 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 예시적인 혼입 부위는 나선 A 및 나선 C의 부분의 아미노 말단 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, G120을 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어 p-아지도-L-페닐알라닌 또는 O-프로파르길-L-티로신으로 치환시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 열거된 치환은 GH, 예컨대 hGH 폴리펩티드를 GH, 예컨대 hGH 길항제가 되도록 하는 추가적인 치환과 조합된다. 예를 들어, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 본원에서 동정된 위치 중 하나에서 치환되고, G120(예를 들어, G120R, G120 K, G120W, G120Y, G120F 또는 G120E)에서 동시 치환이 도입된다. 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH 길항제는 GH, 예컨대 hGH 분자의 수용체 결합 영역 중에서 존재하는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.
일부 경우들에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상 개수의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산으로 치환된다. 일부 경우들에서, GH, 예컨대 hGH 폴리펩티드는 천연 발생 아미노산에 대해 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산으로 된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상 개수의 치환을 추가로 포함한다. 예를 들어, GH, 예컨대 hGH 중 하기 영역에서의 하나 이상의 잔기는 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산으로 치환된다: 1-5(N-말단): 32-46(A-B 루프의 N-말단 종결부); 97-105(B-C 루프); 및 132-149(C-D 루프); 및 184-191(C-말단). 일부 실시양태에서, GH, 예컨대 hGH 중 하기 영역에서의 하나 이상의 잔기는 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산으로 치환된다: 1-5(N-말단), 6-33(A 나선), 34-74(A 나선과 B 나선 사이의 영역, A-B 루프), 75-96(B 나선), 97-105(B 나선과 C 나선 사이의 영역, B-C 루프), 106-129(C 나선), 130-153(C 나선과 D 나선 사이의 영역, C-D 루프), 154-183(D 나선), 184-191(C-말 단). 일부 경우들에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 잔기는 하나 이상의 저 분자량 선형 또는 분지형 PEG(질량이 대략 ~ 5-20 kDa 이하)에 결합되어, 단일 고 분자량 PEG에 부착된 종에 비해 결합 친화성 및 이에 필적하는 혈청 반감기를 증진시킨다.
일부 실시양태에서, 하기 GH, 예컨대 hGH 부분 중 2개 이하는 위치 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122,.126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186 및 187에서 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산으로 치환된다. 일부 경우들에서, 하기 치환 쌍들 중 임의의 치환이 이루어진다: K38X* 및 K140X*, K41X* 및 K145X*, Y35X* 및 E88X*, Y35X* 및 F92X*, Y35X* 및 Y143X*, F92X* 및 Y143X*(여기에서, X*는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 나타냄). 2개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 바람직한 부위는 하기 잔기들의 조합을 포함한다: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186 및 187. 2개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산의 혼입에 특히 바람직한 부위는 하기 잔기들의 조합물을 포함한다: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145 및 155.
GH, 예컨대 hGH에서 2개 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입하기에 바람직한 부위는 하기 잔기들의 조합물을 포함한다: 서열 번호 2의 1번 위치 앞(즉, N-말단), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192(즉, 단백질의 카르복실 말단) 또는 이들의 임의의 조합.
V. 비진핵생물 및 진핵생물 에서의 발현
클로닝된 hGH 폴리뉴클레오티드의 높은 수준의 발현을 얻기 위해서는, 전형적으로 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강한 프로모터를 함유하는 발현 벡터, 전사/번역 종결제, 및 단백질을 코딩하는 핵산의 경우, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위에 서브클로닝(subcloning)한다. 적당한 세균 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, [Sambrook et al. Molecualr Cloning, A Laboratory Manual (2001), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999)]에 기재되어 있다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드 발현용 세균 발현 시스템은 대장균, 바실러스 균 속( Bacillus sp .), 슈도모나스 플루오레슨스 ( Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나 스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함하나 이에 한정되지 않는 것에서 입수가능하다([Palva et al., Gene 22: 229-235(1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545(1983)] 참고). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 또한 상업적으로도 입수가능하다. 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소(상기한 바와 같음)를 사용하여 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르토고날 성분을 사용할 수 있는 그들의 능력을 기초로 선택된다. 예시적인 숙주 세포는 그람-양성(Gram-positive) 세균(B. 브레비 스( brevis ), B. 서브틸리스 ( subtilis ), 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하나 이에 한정되지 않음) 및 그람-음성 세균(대장균, 슈도모나스 플루오레센 스, 슈도모나스 에어루기노사 , 슈도모나스 푸티다), 및 효모 및 다른 진핵세포를 포함한다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 많은 유용한 양으로 포함하는 단백질을 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 한 측면에서, 임의적으로 조성물은 10 마이크로그램 이상, 50 마이크로그램 이상, 75 마이크로그램 이상, 100 마이크로그램 이상, 200 마이크로그램 이상, 250 마이크로그램 이상, 500 마이크로그램 이상, 1 밀리그램 이상, 10 밀리그램 이상, 100 밀리그램, 1 그램 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 또는 세포 내 단백질 생산 방법(재조합 단백질 생산 및 정제에 대한 상세한 설명은 본원 에 제공됨)을 사용하여 얻어질 수 있는 양을 포함한다. 또 다른 측면에서, 임의적으로 단백질은 세포 용해물, 완충액, 약제학적으로 완충액 또는 다른 액체 현탁액을 포함하나 이에 한정되지 않는 것(약 1 nl 내지 약 100 L 이상 중 임의의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 부피를 포함하나 이에 한정되지 않음) 중의 1 리터 당 10 마이크로그램 이상, 50 마이크로그램 이상, 75 마이크로그램 이상, 100 마이크로그램 이상, 200 마이크로그램 이상, 250 마이크로그램 이상, 500 마이크로그램 이상, 1 밀리그램 이상 또는 10 밀리그램 이상의 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는 농도의 조성물 중에서 존재한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 진핵세포 내의 단백질을 대량(전형적으로, 시험관 내 번역을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 방법을 사용하여 가능한 것보다 큰 것을 포함하나 이에 한정되지 않음) 생산하는 것은 본 발명의 한 특징이다.
본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 많은 유용한 양의 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지, 완충액 등 중의 10 μg/리터 이상, 50 μg/리터 이상, 75 μg/리터 이상, 100 μg/리터 이상, 200 μg/리터 이상, 250 μg/리터 이상, 또는 500 μg/리터 이상, 1 mg/리터 이상, 2 mg/리터 이상, 3 mg/리터 이상, 4 mg/리터 이상, 5 mg/리터 이상, 6 mg/리터 이상, 7 mg/리터, 8 mg/리터 이상, 9 mg/리터 이상, 10 mg/리터 이상, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/리터, 1 g/리터, 5 g/리터, 10 g/리터, 또는 그 이상의 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않 는 농도에서 생산될 수 있다.
발현 시스템, 벡터, 숙주 세포, 배양 조건 및 배지, 및 hGH 폴리펩티드의 숙주 세포로부터의 단리가 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 제11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")에 더욱 기재되어 있다.
V. 일반 정제 방법
본 발명의 hGH 폴리펩티드는 정상적으로 재조합 시스템에서 발현된 후에 정제된다. hGH 폴리펩티드는 당업계에 공지된 각종 방법들에 의해 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 세균 숙주 세포 내에서 생성된 hGH 폴리펩티드는 난용성이거나 불용성(내포체의 형태의 경우)이다. 아미노산 치환은, 본원에 개시된 방법, 및 당업계에 공지되어 있는 것들을 사용하여 재조합으로 생산된 단백질의 가용성을 증가시키려는 목적으로 선택된 hGH 폴리펩티드 중에서 용이하게 이루어질 수 있다. 불용성 단백질의 경우, 단백질은 원심분리에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수집될 수 있고, 추가로 그 후 세포를 균질화할 수 있다. 난용성 단백질의 경우, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 포함하나 이에 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분적으로 가용성 단백질의 침전을 유도할 수 있다. 이어서, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 편리하게 수집할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 붕괴시키거나 균질화하여, 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법을 사용하여 세포 내에서부터 내포체를 방출시킬 수 있다. 숙주 세포 붕괴 또는 균질화는 효소적 세포 붕괴, 음파 처리, 다운스(dounce) 균질화 또는 고압 방출 붕괴를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 기 술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 고압 방출 기술을 사용하여 대장균 숙주 세포를 붕괴시켜 hGH 폴리펩티드의 내포체를 방출시킨다. hGH 폴리펩티드의 내포체를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질 분해와 같은 인자로 인한 손실 없이 내포체의 수율을 최대화시키기 위해 반복에 대한 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리하다.
이어서, 당업계에 공지된 다수의 적당한 가용화제들 중 임의의 것을 사용하여 불용성 또는 침전 hGH 폴리펩티드를 가용화시킬 수 있다. hGH 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드로 가용화된다. 편리하게 다루기 쉬운 배치 크기를 사용하여 큰 배치를 생산할 수 있도록, 가용화된 hGH 폴리펩티드의 부피는 최소화되어야 한다. 이 인자는 재조합 숙주가 부피가 수천 리터인 배치에서 성장할 수 있는 대규모 상업적 환경에서 중요할 수 있다. 또한, 대규모 상업적 환경에서 hGH 폴리펩티드를 제조하는 경우, 특히 인간의 약제학적으로 용도의 경우, 기구 및 용기 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 심한 화학 물질은 가능하면 반드시 피해야 한다. 더욱 심한 변성제 구아니딘 히드로클로라이드 대신에 더욱 순한 변성제 우레아를 사용하여 hGH 폴리펩티드 내포체를 가용화시킬 수 있다는 점이 본 발명의 방법에서 밝혀졌다. 우레아의 사용은 hGH 폴리펩티드 내포체를 유효하게 가용화시키면서 hGH 폴리펩티드를 제조하고 정제하는 방법에 사용되는 스테인레스강 장비에 대한 손상 위험을 상당히 감소시킨다.
가용성 hGH 단백질의 경우, hGH는 세포막 공간 또는 배지로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 hGH는 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하 기 전에 가용성 hGH를 농축하는 것이 요망될 수 있다. 당업자에게 공지된 표준 기법을 사용하여, 예를 들어 세포 용해물 또는 배지로부터 가용성 hGH를 농축할 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 표준 기법을 사용하여 숙주 세포를 파괴하고, 숙주 세포의 세포질 또는 세포막 공간으로부터 가용성 hGH를 용리할 수 있다.
hGH 폴리펩티드가 융합 단백질로서 생산되는 경우, 융합 서열을 제거하는 것이 바람직하다. 융합 서열의 제거는 효소적 또는 화학적 분절, 바람직하게는 효소적 분절에 의해 수행될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 융합 서열의 효소적 제거를 수행할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 동일성에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 당업자에게 자명한 바와 같이 효소의 선택에 의해 특정되게 된다. 화학적 분절은 시아노겐 브로마이드, TEV 프로테아제 및 기타 시약을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 시약을 이용하여 달성될 수 있다. 분절된 hGH 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 분절된 융합 서열로부터 정제된다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 이러한 방법은 융합 서열 및 hGH 폴리펩티드의 동일성 및 성질에 의해 결정되게 된다. 정제 방법은 크기-배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
hGH 폴리펩티드를 또한 정제하여, 단백질 용액으로부터 DNA를 제거할 수 있다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법, 예를 들어 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있으나, 프로타민(protamine) 술페이트를 포함하나 이에 한정되지 않는 핵산 침전제를 사용한 침전에 의해 제거될 수 있다. 원심분 리 또는 여과를 포함하나 이에 한정되지 않는 공지된 표준 방법을 사용하여 침전된 DNA로부터 hGH 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 hGH 폴리펩티드가 인간을 치료하는데 사용되는 환경에서 중요한 인자이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약제학적으로 허용되는 수준으로 감소시킨다.
또한, 발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기(bioreactor), 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반된 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 각각 배치식, 공급-배치식 또는 연속식 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 인간 hGH 폴리펩티드는 일반적으로 당업계의 표준 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하거나 여과하여, 세포 잔해물을 제거할 수 있다. 상청액을 원하는 부피로 농축 또는 희석시키거나, 또는 추가 정제용 제제를 컨디셔닝하는데 적당한 완충액으로 정용여과할 수 있다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 추가 정제는 본연 그대로의 형태로부터 hGH 폴리펩티드 변종체의 탈아미드화되고 짧게 잘린 형태를 분리하는 것을 포함한다.
하기 예시적인 절차 중 임의의 것을 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 정제하는데 사용할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스(SEPHAROSE)를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음); 실리카 상에서의 크로마토그래피; 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC); 역상 HPLC(RP-HPLC); 겔 여과 크로마토그래피(세파덱스(SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하 나 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 치환(displacement) 크로마토그래피; 전기영동 절차(분취 등점 집초법(isoelectric focusing)을 포함하나 이에 한정되지 않음), 시차 용해도법(differential solubility)(황산암모늄 침전을 포함하나 이에 한정되지 않음), SDS-PAGE 또는 추출.
비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 본 발명의 단백질은, 당업자에게 공지되고 당업자에 의해 사용되는 표준 절차에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 칼럼 크로마토그래피, 친화성 칼럼 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 다수의 방법에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 필요에 따라, 접힌 성숙 단백질을 올바르게 제조하고자 할 때, 필요한 경우 단백질 재접힘 단계를 사용할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적당한 방법을 고 순도가 바람직한 최종 정제 단계에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 비천연 아미노산(또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질)에 대항하여 생성된 항체를 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질의 친화성 이용 정제를 포함하나 이에 한정되지 않는 것을 위한 정제 시약으로서 사용한다. 폴리펩티드를 부분적으로 또는 균질하게 정제한 후, 필요에 따라, 임의적으로 검정 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 생산용 면역원을 포함하나 이에 한정되지 않는 것으로서 매우 다양한 용도에 사용한다.
본원에 언급된 다른 참고 문헌 외에도, [R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y.(1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y.(1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al.(1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris 및 Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles. High Separation Methods and Applications. Second Edition Wiley-VCH, NY; 및 Walker(1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ] 및 상기 문헌들에 인용된 참고 문헌에 나와있는 방법들을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 정제/단백질 접힘 방법들이 당업계에 공지되어 있다.
진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포에서 비천연 아미노산을 사용하여 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는 경우 한 이점은, 전형적으로 단백질 또는 폴리펩티드가 그들의 본연의 형태로 접힌다는 것이다. 그러나, 본 발명의 특정 실시양태에서, 당업자는 합성, 발현 및/또는 정제 후, 단백질이 관련 폴리펩티드의 원하는 형태와는 상이한 형태를 가질 수 있다는 점을 인식할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 발현된 단백질을 임의적으로 변성시킨 다음, 복원시킨다. 이는 샤페로닌을 관심 단백질 또는 폴리펩티드에 첨가하는 것, 단백질을 무질서 유발제(chaotropic agent), 예를 들어 구아니딘 HCl 중에서 가용화시키는 것, 단백질 디술피드 이소머라제를 사용하는 것 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행된다.
일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 바람직한 형태로 재접힘하는 것이 경우에 따라 바람직하다. 예를 들어, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌을 관심 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 복원 방법은 당업자에게 공지되어 있다(상기 참고 문헌들 및 [Debinski, et al.(1993) J. Biol . Chem ., 268: 14065-14070; Kreitman 및 Pastan(1993) Bioconjug . Chem ., 4: 581-585; 및 Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270] 참고). 예를 들어, 데빈스키(Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서의 내포체 단백질의 변성 및 환원을 기재하고 있다. 단백질은 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 포함하나 이에 한정되지 않는 것을 함유하는 산화환원 완충액에서 재접힘될 수 있다. 재접힘 시약은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉하도록 유동하거나 이동할 수 있으며, 또는 역의 경우도 성립한다.
hGH 폴리펩티드의 원핵세포 생산의 경우, 이로써 생산된 hGH 폴리펩티드는 잘못접힘(misfolding)될 수 있기 때문에, 생물학적 활성이 결핍되거나 감소될 수 있다. 단백질의 생체활성은 "재접힘"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 잘못접힘된 hGH 폴리펩티드는 예를 들어, 하나 이상의 무질서 유발제(예를 들어, 우레아 및/또는 구아니딘) 및 디술피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 사슬을 가용화시키고(여기에서, hGH 폴리펩티드도 불용성임), 풀고(unfolding), 환원시킴으로써 재접힘된다. 이어서, 중등 농도의 무질서유발 물질에서, 디술피드 결합을 재형성시키는 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가한다. 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제4,511,502호, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 것들을 사용하여 hGH 폴리펩티드를 재접힘할 수 있다. 또한, hGH 폴리펩티드를 다른 단백질과 함께 동시접힘시켜, 헤테로이량체 또는 헤테로다량체를 형성할 수 있다.
재접힘 또는 동시접힘 후, hGH 폴리펩티드를 추가 정제할 수 있다. hGH의 정제는, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한 당업자에게 공지된 각종 기법들을 이용하여 달성될 수 있다. 부가적 정제는 또한 정제된 단백질의 건조 또는 석출의 단계를 포함할 수 도 있다.
정제 후, hGH는 투석여과 및 투석을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 각종 방법들 중 임의의 방법을 이용하여 상이한 완충액으로 교환되고/되거나 농축될 수 있다. 단일 정제 단백질로서 제공되는 hGH는 응집 및 석출될 수 있다.
정제된 hGH의 순도는 역상 고성능 액체 크로마토그래피, RP-HPLC, 또는 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, SDS-PAGE에 의해 측정 시, 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 98% 이상, 또는 99% 이상, 또는 그 이상일 수 있다. hGH의 순도의 정확한 수치값과 무관하게, hGH는 약제학적 제품으로서 사용하기에, 또는 PEG와 같은 수용성 중합체와의 접합과 같은 추가적 가공을 행하기에 충분히 순수하다.
특정 hGH 분자는 기타 활성 성분 또는 단백질(부형제, 담체, 및 안정화제, 혈청 알부민 등 외)의 부재 하에 치료제로서 사용되거나, 또 다른 단백질 또는 중합체와 착화될 수 있다.
다양한 단리 단계 중 임의의 하나를, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상-HPLC("RP-HPLC"), 발포층(expanded bed) 흡착 또는 임의의 조합물 및/또는 임의의 적당한 순서의 그들의 반복을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 단리 단계로부터 유래하는 임의의 hGH 폴리펩티드 혼합물 상에서 또는 hGH 폴리펩티드를 포함하는 세포 용해물, 추출물, 배지, 내포체, 숙주 세포의 세포외질, 또는 기타 물질 상에서 수행할 수 있다.
본원에 기재된 기술을 수행하는데 사용되는 장비 및 다른 필요한 물질은 상업적으로 입수가능하다. 펌프, 분획 수집기(fraction collector), 모니터(monitor), 레코더(recorder) 및 전체 시스템은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-라드 래보러토리즈, 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(미국 캘리포니아주 헤라쿨레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언시즈, 인코포레이티드(Amersham Biosciences, Inc.)(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재)로부터 입수가능하다. 또한, 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는 크로마토그래피 물질들도 상기 회사들로부터 입수가능하다.
평형화, 및 본원에 기재된 칼럼 크로마토그래피 방법에서의 다른 단계, 예를 들어 세척 및 용리를 특수 장치, 예를 들어 펌프를 사용하여 더욱 신속하게 수행할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 펌프는 하이로드(HILOAD)
Figure 112007051714492-PCT00001
펌프 P-50, 페리스탈틱 펌프(Peristaltic pump) P-1, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
분획 수집기의 예는 레디프락 분획 수집기(RediFrac Fraction Collector), FRAC-100 분획 수집기, FRAC-200 분획 수집기 및 수퍼프락스(SUPERFRACS)
Figure 112007051714492-PCT00002
분획 수집기(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 또한, pH 및 선형 농도 구배를 형성하는 믹서도 입수가능하다. 상업적으로 입수가능한 믹서는 구배 믹서(Gradient Mixer) GM-1 및 인-라인 믹서(In-Line Mixer)(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다.
임의의 상업적으로 입수가능한 모니터를 사용하여 크로마토그래피 방법을 모니터링할 수 있다. 이러한 모니터는 UV, pH 및 전도성과 같은 정보를 모으는데 사용될 수 있다. 검출기의 예는 모니터(Monitor) UV-1, 유비코드(UVICORD)
Figure 112007051714492-PCT00003
S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨덕티비티 모니터(Conductivity Monitor)(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재)로부터의 다양한 아크타(AKTA)
Figure 112007051714492-PCT00004
시스템을 비롯한 전 시스템이 상업적으로 입수가능하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 예를 들어, hGH 폴리펩티드는 먼저 우레아 중에서 생성된 정제 hGH 폴리펩티드를 변성시킨 후, 적당한 pH에서 환원제(예를 들어, DTT)를 함유하는 트리스 완충액으로 희석시킴으로써 환원되고 변성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 우레아 중에서 약 2 M 내지 약 9 M의 농도 범위에서 hGH 폴리펩티드를 변성시킨 후, 약 5.0 내지 약 8.0의 범위의 pH에서 트리스 완충액 중에서 희석시킨다. 이어서, 이 실시양태의 재접힘 혼합물을 인큐베이션할 수 있다. 한 실시양태에서, 재접힘 혼합물을 실온에서 4 내지 24시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 환원되고 변성된 hGH 폴리펩티드 혼합물을 추가로 단리시키거나 정제할 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이, 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 그들의 후속 혼합물을 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 농축시킬 수 있다. 더욱이, 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 그들의 후속 혼합물을 포함하는 용리 완충액을 다음 단리 단계에 적당한 완충액으로 교환할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피 이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 일반적으로, [ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1114-21, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재))을 참고한다. 상업적으로 입수가능한 이온 교환 칼럼은 하이트랩(HITRAP)
Figure 112007051714492-PCT00005
하이프랩(HIPREP) 및 하이로드
Figure 112007051714492-PCT00006
칼럼(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함한다. 그러한 칼럼은 강 음이온 교환기, 예를 들어 Q 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00007
패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00008
하이 퍼포먼스(고성능) 및 Q 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00009
XL; 강 양이온 교환기, 예를 들어 SP 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00010
하이 퍼포먼스, SP 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00011
패스트 플로우 및 SP 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00012
XL; 약 음이온 교환기, 예를 들어 DEAE 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00013
패스트 플로우; 및 약 양이온 교환기, 예를 들어 CM 세파로스
Figure 112007051714492-PCT00014
패스트 플로우(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 사용한다. 정제 방법 중 임의의 단계에서 hGH 폴리펩티드에 대해 음이온 또는 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적당한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스는 섬유질, 다공성, 비다공성, 세립질(microgranular), 비이드형 또는 가교결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질은 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 상기 것들 중 임의의 것의 복합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
양이온 교환 매트릭스는 강 및 약 강이온 교환기를 포함한 임의의 적당한 양이온 교환기일 수 있다. 강 양이온 교환기는 넓은 pH 범위에 걸쳐 이온화되어 유지될 수 있고, 따라서 넓은 pH 범위에 걸쳐 hGH에 결합될 수 있다. 그러나, 약 양이온 교환기는 pH의 함수로서 이온화를 소실할 수 있다. 예를 들어, 약 양이온 교환기는 pH가 약 pH 4 또는 pH 5 미만으로 하락할 때 전하를 소실할 수 있다. 적당한 강 양이온 교환기는 하전된 작용기, 예컨대 술포프로필(SP), 메틸 술포네이트(S), 또는 술포에틸(SE)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 양이온 교환 매트릭스는 hGH 결합 pH 범위가 약 2.5 내지 약 6.0인 강 양이온 교환기일 수 있다. 대안적으로, 강 양이온 교환기는 hGH 결합 pH 범위가 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 hGH 결합 pH가 약 3.0인 강 양이온 교환기일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 매트릭스는 hGH 결합 pH 범위가 약 6.0 내지 약 8.0인 강 양이온 교환기일 수 있다. 양이온 교환 매트릭스는 매트릭스는 hGH 결합 pH 범위가 약 8.0 내지 약 12.5인 강 양이온 교환기일 수 있다. 대안적으로, 강 양이온 교환기는 hGH 결합 pH 범위가 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.0일 수 있다.
hGH 로딩 전에, 양이온 교환 매트릭스를 예를 들어, 수가지 칼럼 부피의 희석된 약산, 예컨대 4 칼럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 이용하여 평형화할 수 있다. 평형화 후, hGH를 첨가할 수 있고, 칼럼을 1회 내지 수회 세척한 다음, 역시 약산 용액 예를 들어, 약 아세트산 또는 인산 용액을 사용하여 실질적으로 정제된 hGH를 용리할 수 있다. 예를 들어, 대략 2 내지 4 칼럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 사용하여, 칼럼을 세척할 수 있다. 예를 들어, 2 내지 4 칼럼 부피의 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5) 또는 0.1 M 염화나트륨과 혼합된 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5)을 이용한 부가적 세척을 또한 이용할 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 양이온 교환 매트릭스는 수 칼럼 부피의 희석액과 약 염기를 사용하여 평형화될 수 있다.
대안적으로, 실질적으로 정제된 hGH는 양이온 교환기 매트릭스과 (충분히 낮은 pH 또는 이온 강도를 보유한) 완충액을 접촉시킴으로써 용리되어, 매트릭스로부터 hGH를 치환시킬 수 있다. 용리 완충액의 pH 범위는 pH 약 2.5 내지 6.0일 수 있다. 더욱 구체적으로, 용리 완충액의 pH 범위는 pH 약 2.5 내지 약 5.5, pH 약 2.5 내지 약 5.0일 수 있다. 용리 완충액의 pH는 약 3.0일 수 있다. 또한, 용리 완충액의 양은 매우 다양할 수 있으며, 일반적으로는 약 2 내지 약 10 칼럼 부피의 범위 내일 것이다. 더욱이, 당업자에게 공지된 적당한 완충액은 시트르산염, 인산염, 포름산염, HEPES 및 MES 완충액(농도 범위 = 약 5 mM 이상 내지 약 100 mM 이상)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
hGH를 양이온 교환기 매트릭스에 흡착시킨 후, 실질적으로 정제된 hGH를, 매 트릭스로부터 hGH를 치환시키기 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충액과 매트릭스를 접촉시킴으로써 용리시킬 수 있다. 용리 완충액의 pH는 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.5 범위 내일 수 있다. 보다 구체적으로, 용리 완충액은 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.0 범위 내일 수 있다. 실질적으로 정제된 hGH의 고 pH 용리액에 사용하기 적당한 완충액은 약 5 mM 이상 내지 약 100 mM 이상의 농도 범위의 시트르산염, 인산염, 포름산염, 아세트산염, HEPES 및 MES 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 0.1 M 붕산칼륨, 0.6 M 염화칼륨, 0.1 mM EDTA(pH 8.7)을 갖는 완충액이 사용될 수 있다. 실질적으로 정제된 hGH는 또한 표준 완충액, 예컨대 약 50 내지 100 mM 비사인(bicine), 약 75 mM 비사인; 25 내지 약 100 mM 염화나트륨, 약 50 mM 염화나트륨, 및 약 0.05 내지 약 0.5 EDTA, 약 0.1 mM EDTA(pH 7.5)를 포함하는 비사인 완충액을 이용하여 용리될 수 있다.
역상 크로마토그래피 RP-HPLC를 수행하여 당업자에게 공지되어 있는 적당한 프로토콜에 따라 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, [Pearson et al., ANAL BIOCHEM.(1982) 124: 217-230(1982); Rivier et al., J. CHROM.(1983) 268: 112-119; Kunitani et al., J. CHROM.(1986) 359: 391-402]을 참고한다. RP-HPLC를 hGH 폴리펩티드에 대해 수행하여 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 이와 관련하여, 약 C3 이상 내지 약 C30 이상, 약 C3 이상 내지 약 C20 이상, 또는 약 C3 이상 내지 약 C18 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 매우 다양한 길이를 갖는 알킬 작용기를 갖는 실리카 유도체화 수지를 사용할 수 있다. 대안적으로, 중합체성 수지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 암버크롬(TosoHaas Amberchrome) CG1000sd 수지인 중합체 수지를 사용할 수 있다. 또한, 매우 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 시아노 또는 중합체 수지를 사용할 수 있다. 나아가, RP-HPLC 칼럼을 용매, 예를 들어 에탄올로 세척할 수 있다. 소스 RP 칼럼은 RP-HPLC 칼럼의 또 다른 예이다.
이온쌍 형성제(ion pairing agent) 및 유기 개질제, 예를 들어 메탄올, 이소프로판올, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적당한 용리 완충액을 사용하여 RP-HPLC 칼럼으로부터 hGH 폴리펩티드를 용리시킬 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 이온쌍 형성제는 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 및 트리에틸암모늄 아세테이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 하나 이상의 구배 또는 등용매 조건을 사용하여 용리를 수행할 수 있으며, 구배 조건은 분리 시간 및 피크 폭을 감소시키는 것이 바람직하다. 또 다른 방법은 상이한 용매 농도 범위를 갖는 2개의 구배를 사용하는 것을 포함한다. 본원에 사용하기 적당한 용리 완충액의 예는 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 용액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
hGH는 아세토니트릴 구배로, 예를 들어 소스 RP 칼럼(SOURCE RP COLUMN)을 이용하여 단리 또는 정제될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 hGH 폴리펩티드에 대해 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원에 참고로 인 용되는 [HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1020-90, 아머샴 바이오사이언시즈(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재)을 참고한다. 적당한 HIC 매트릭스는 아가로스, 가교결합된 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 비롯한 알킬-치환된 매트릭스 또는 아릴-치환된 매트릭스, 예를 들어 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환된 매트릭스, 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸-치환된 또는 페닐-치환된 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함하나 이에 한정되지 않는 혼합된 형식의 수지를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피에 대해 상업적으로 입수가능한 공급원은 하이트랩
Figure 112007051714492-PCT00015
하이프랩
Figure 112007051714492-PCT00016
및 하이로드
Figure 112007051714492-PCT00017
칼럼(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
간략히, 로딩(loading) 전, HIC 칼럼을 당업자에게 공지된 표준 완충액, 예를 들어 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 HEPES를 사용하여 평형화시킬 수 있다. 이어서, hGH 폴리펩티드를 로딩시킨 후, 칼럼을 HIC 칼럼 상에서 hGH 폴리펩티드는 보유하면서 원치 않는 물질을 제거하도록 하는 표준 완충액 및 조건을 이용하여 세척할 수 있다. 약 3 내지 약 10 칼럼 부피의 표준 완충액, 특히 예를 들어 EDTA 및 평형 완충액보다 낮은 황산암모늄 농도를 함유하는 HEPES 완충액, 또는 아세트산/염화나트륨 완충액 등을 사용하여 hGH 폴리펩티드를 용리시킬 수 있다. 또한, 예를 들어, 인산칼륨의 구배를 사용하여 감소하는 선형 염 구배를 사용하여, hGH 분자를 용리할 수 있다. 이어서, 예를 들어, 여과, 예를 들어 정 용여과 또는 한외여과에 의해 용리물을 농축시킬 수 있다. 정용여과를 사용하여, hGH 폴리펩티드를 용리하는데 사용되는 염을 제거할 수 있다.
예를 들어, 겔 여과(본원에 참고로 인용되는 [GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS](분류 번호 18-1022-18, 미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈), 히드록시아파타이트 크로마토그래피(적당한 매트릭스는 HA-우울트로겔(Ultrogel)), 하이 레졸루션(High Resolution)(칼바이오켐(Calbiochem)), CHT 세라믹 히드록시아파타이트(바이오래드), 바이오-겔(Bio-Gel) HTP 히드록시아파타이트(바이오래드)를 포함하나 이에 한정되지 않음), HPLC, 확장된 층 흡착, 한외여과, 정용여과, 동결건조 등을 사용하여 또 다른 단리 단계를 제1 hGH 폴리펩티드 혼합물 또는 임의의 그들의 후속 혼합물 상에서 수행하여 임의의 과량의 염을 제거하고, 완충액을 다음 단리 단계 또는 심지어 최종 약물 생성물의 제조에 적당한 완충액으로 대체시킬 수 있다. 본원에 기재된 각 단계에서 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드를 비롯한 hGH 폴리펩티드의 수율을 모니터링할 수 있다. 또한, 이러한 기술들을, 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 hGH 폴리펩티드의 수율을 평가하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 수가지 역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼, 예를 들어 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC, 및 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 것을 사용하여 hGH 폴리펩티드의 수율을 모니터링할 수 있다.
표준 기술, 예를 들어 SDS-PAGE를 사용하거나 웨스턴 블롯(Western blot) 및 ELISA 검정을 사용하여 hGH 폴리펩티드를 측정함으로써 순도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 음성 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대항하는 다클론 항체를 생성할 수 있다. 또한, 오염 숙주 세포 단백질의 존재에 대한 프로브에 항체를 사용할 수 있다.
RP-HPLC 물질 바이다크(Vydac) C4(바이다크)는 표면이 C4-알킬 사슬을 운반하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질 불순물로부터의 hGH 폴리펩티드의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이를 기초로 한다. 묽은 트리플루오로아세트산 중에서 아세토니트릴 구배를 사용하여 용리를 수행한다. 스테인레스강 칼럼(2.8 내지 3.2 리터의 바이다크 C4 실리카 겔로 충전시킴)을 사용하여 분취 HPLC를 수행한다. 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 히드록시아파타이트 울트로겔 용리물을 산성화시키고, 바이다크 C4 칼럼에 로딩한다. 세척 및 용리를 위해, 묽은 트리플루오로아세트산 중에서 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획물을 수집하고, 즉시 포스페이트 완충액으로 중성화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 hGH 폴리펩티드 분획물을 수집한다.
DEAE 세파로스(GE 헬스케어(GE Healthcare)) 물질은 세파로스 비이드의 표면에 공유 결합된 디에틸아미노에틸(DEAE)-기로 이루어져 있다. DEAE 기에 대한 hGH 폴리펩티드의 결합은 이온성 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산을 보유되지 않게 칼럼을 통과시킨다. 이러한 물질들을 세척한 후, 미량의 불순물을 낮은 pH에서 아세테이트 완충액을 사용하여 세척 칼럼에 의해 제거한다. 이어서, 칼럼을 중성 포스페이트 완충액으로 세척하고, hGH 폴리펩티드를 증 가된 이온 강도를 갖는 완충액으로 용리시킨다. 칼럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 충전한다. 칼럼 부피를 겔 1 ml 당 3 내지 10 mg의 hGH 폴리펩티드 범위의 hGH 폴리펩티드 로딩이 이루어지도록 조정한다. 칼럼을 물 및 평형화 완충액(인산나트륨/인산칼륨)로 세척한다. HPLC 용리액의 수집된 분획물을 로딩하고, 칼럼을 평형화 완충액으로 세척한다. 이어서, 칼럼을 세척 완충액(아세트산나트륨 완충액)로 세척한 후, 평형화 완충액으로 세척한다. 추후, hGH 폴리펩티드를 용리 완충액(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)를 사용하여 칼럼으로부터 용리시키고, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획물에서 수집한다. DEAE 세파로스 칼럼의 용리액을 특수 전도성을 갖도록 조정한다. 생성되는 약물 물질을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70℃에서 저장한다.
사용될 수 있는 부가의 방법으로서는 내독소를 제거하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 내독소는 그람-음성 숙주 세포 예를 들어, 에스케리챠 콜라이의 외부 막에 존재하는 리포 다당류(LPS)이다. 내부 독소 수치를 감소시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 실리카 지지체, 유리 분말 또는 히드록시아파타이트를 사용하는 정제 기술, 역상, 친화성, 크기-배제, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 또는 이들 방법의 병행법을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 변형 또는 부가적 방법은 관심 폴리펩티드로부터 오염 물질, 예를 들어 동시 이동(comigrating) 단백질을 제거하는데에 필요할 수 있다. 내독소 수준을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 리물로스 아메보사이트 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate; LAL) 검정을 포함하나 이 에 한정되지 않는다.
브래드포드(Bradford) 검정, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분석법(MALDI-TOF를 포함하나 이에 한정되지 않음) 및 당업자에게 공지되어 있는 단백질을 특성화하는 다른 방법들을 포함하나 이에 한정되지 않는 매우 다양한 방법 및 절차들이 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 hGH 단백질의 수율 및 순도를 평가하는데 사용될 수 있다. 부가적 방법은 단백질 오염 방법과 결부된 SDS-PAGE, 면역블로팅, 매트릭스 지원 레이저 탈착/이온화-질량 분광법(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광법, 등전 초점, 분석 음이온 교환, 크로마토포커싱, 및 원편광이색성을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
단리 및 정제를 위해 본원에 열거된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 절차들을 또한, 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 안정성, hGH 폴리펩티드의 PEG화 형태의 안정성, 및 PEG화 반응의 진전을 평가하기 위한 조제물 연구에 사용할 수 있다.
VIII . 교대 시스템에서의 발현
비재조합 숙주 세포, 돌연변이 생성된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키는데 수가지 전략들이 사용되었다. 또한, 이러한 시스템은 본 발명의 hGH 폴리펩티드를 제조하는데 사용하기 적합하다. 반응성 측쇄, 예를 들어 Lys, Cys 및 Tyr을 사용한 아미노산의 유도체화는 리신을 N2-아세틸-리신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비천연 아미노산을 혼입하는 직접적인 방법을 제공한다. 펩티드 단편의 효소적 결찰 및 본연의 화학적 결찰의 최근 개 발로, 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들어, [P. E. Dawson 및 S. B. H. Kent, Annu . Rev. Biochem ., 69: 923(2000)]을 참고한다. 화학적 펩티드 결찰 및 본연의 화학적 결찰이 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제6,184,344호, U.S. 특허 공보 제2004/0138412호, U.S. 특허 공보 제2003/0208046호, WO 02/098902, 및 WO 03/042235에 기재된다. 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 억제제 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관 내 추출물에 첨가하는 일반적 시험관 내 생합성 방법을 사용하여 100 개가 넘는 비천연 아미노산을 거의 모든 크기의 다양한 단백질에 부위 특이적으로 혼입시켰다. 예를 들어, [V. W. Cornish, D. Mendel 및 P. G. Schultz, Angew . Chem . Int . Ed. Engl ., 1995, 34; 621(1995); C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site - specific incorporation of unnatural amino acids into Proteins, Science 244:182-188(1989); 및 J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a 71071-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem . Soc. 111: 8013-8014(1989)]을 참조할 수 있다. 단백질 안정성, 단백질 접힘, 효소 기전 및 신호 형질도입의 연구를 위해 광범위한 범위의 작용기를 단백질에 혼입하였다.
선택적 압력 혼입으로 불리는 생체 내 방법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별 혼합(promiscuity)을 이용하였다. 예를 들어, [N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder 및 R. Huber, FASEB J., 13: 41(1999)]을 참고한다. 세포에 특정 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않는(switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하고, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 정체 성장기의 개시시, 천연 아미노산은 고갈되고, 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들어, 이 전략을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질로 혼입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2개의 특징적인 숄더(shoulder)를 나타내며(예를 들어, [C. Minks, R. Huber, L. Moroder 및 N. Budisa, Anal. Biochem., 284: 29(2000)] 참고), 트리플루오로메티오닌을 박테리오파지 T4 리소짐(lysozyme)에서 메티오닌을 대체하는데 사용하여 19F NMR에 의해 그의 키토-이당류 리간드와의 상호작용을 연구하였고(예를 들어, [H. Duewel, E. Daub, V. Robinson 및 J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404(1997)] 참고), 트리플루오로류신을 류신 대신 혼입한 결과, 류신-지퍼(zipper) 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가되었다. 예를 들어, [Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado 및 D. A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed. Engl ., 40: 1494(2001)]을 참고한다. 더욱이, 셀레노메티오닌(selenomethionine) 및 텔루로메티오닌(telluromethionine)을 다양한 재조합 단백질에 혼입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들어, [W. A. Hendrickson, J.R. Horton 및 D. M. Lemaster, EMBO J., 9: 1665(1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda 및 M. Hatada, Nat. Struct . Biol., 1: 283(1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann 및 R. Huber, Eur . J. Biochem ., 230: 788(1995); 및 N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder 및 R. Huber, J. Mol . Biol . 270; 616(1997)]을 참고한다. 또한, 알켄 또는 알킨 작용기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 혼입함으로써 화학적 수단에 의해 단백질을 추가적으로 변형시켰다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 [J. C. M. van Hest 및 D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 428: 68(1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick 및 D. A. Tirrell, J. Am. Chem . Soc ., 122: 1282(2000); 및 K. L. Kiick 및 D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56: 9487(2000)]; 미국 특허 제6,586,207호; 및 미국 특허 공보 제2002/0042097호를 참고한다.
이 방법의 성공은 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 따라 좌우되며, 이는 일반적으로, 단백질 번역의 적합도를 보증하는 높은 선택성을 필요로 한다. 이 방법의 범위를 확장하는 한 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 제한된 수의 경우에서 달성되었다. 예를 들어, 에쉐리키아 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의해 Ala294를 대체하는 경우 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의해 tRNAPhe를 아실화시킨다. [M. Ibba, P. Kast 및 H. Hennecke, Biochemistry. 33:7107(1994)]을 참고한다. 이 돌연변이체 PheRS를 정박시키는 에쉐리키아 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 혼입시킨다. 예를 들어, [M. Ibba 및 H. Hennecke, FEBS Lett ., 364: 272(1995); 및 N. Sharma, R. Furter, P. Kast 및 D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 467: 37(2000)]을 참고한다. 유사하게, 에쉐리키아 콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phel30Ser는 아자티로신을 티로신보다 유효하게 혼입시키는 것으로 밝혀졌다. [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll 및 S. Nishimura, J. Biol. Chem ., 275: 40324(2000)]을 참고한다.
비천연 아미노산을 생체 내에서 단백질에 혼입시키는 또 다른 전략은 교정(proofreading) 기전을 갖는 합성효소를 변형시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동계 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 분리 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 결합된 아미노산을 탈아실화하여 단백질 번역의 적합도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 불능인 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정(editing) 기능을 벗어나 혼입될 수 있다. 최근, 이 접근은 발릴-tRNA 합성효소(VaIRS)를 사용하여 입증되었다. [V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel 및 P. Marliere, Science, 292: 501(2001)]을 참고한다. VaIRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)를 사용하여 tRNAVal을 잘못 아미노아실화할 수 있고, 이러한 비동계 아미노산들은 추후 수정 도메인에 의해 가수분해된다. 에쉐리키아 콜라이 염색체의 랜덤 돌연변이 생성 후, ValRS의 수정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 에쉐리키아 콜라이 균주를 선택하였다. 이러한 수정- 결손 VaIRS는 부정확하게 tRNAVal을 Cys로 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하게 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH3로 대체됨), 또한, 돌연변이체 VaIRS는 이 돌연변이체 에쉐리키아 콜라이 균주가 Abu의 존재 하에서 성장하는 경우 Abu를 단백질에 혼입시킨다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질의 각각의 발린 위치에서 발린 중 약 24%가 Abu로 대체됨을 나타내고 있다.
또한, 고체상 합성 및 반합성 방법도 신규한 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들어, 하기와 같은 공보 및 여기에 인용된 참고 문헌을 참고한다: [Crick, F. J. C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for Proteins. Nature, 192: 1227-1232(1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on Polypeptides . XXXVI . The effect of pyrazole - imidazole replacements on the S- Protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24): 5914-5919(1966); Kaiser, E. T. Synthetic approaches to Biologically Active peptides and Proteins including enzymes, Acc Chem Res, 22: 47-54(1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810(1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing Proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054): 221-225(1992); Chaiken, I. M. Semisynthetic peptides and Proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3): 255-301(1981); Offord, R. E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng ., 1(3): 151-157(1987); 및 Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183): 243(1994)].
보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관 내에서 단백질에 도입시키는데 화학적 변형을 사용하였다. 예를 들어, [Corey, D. R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832): 1401-1403(1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem , 54: 565-595(1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science, 226(4674): 505-511(1984); Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol -subtilisin, J Biol . Chem, 243(24): 6392-6401(1968); Polgar, L. et., M. L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol -subtilisin. J. Am Chem Soc, 88: 3153-3154(1966); 및 Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881): 1038-1040(1988)]을 참고한다.
대안적으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA를 사용하는 생합성 방법을 사용하여 수가지 생체물리적 프로브를 시험관 내에서 합성된 단백질에 혼입시켰다. 다음과 같은 공보 및 여기에 인용된 참고 문헌을 참고한다: [Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu . Rev Biochem, 62: 483-514(1993); 및 Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton Polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci, 83(22): 8604-8608(1986)].
과거, 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자를 사용하여 프로그래밍된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 비천연 아미노산이 시험관 내에서 부위-특이적으로 혼입될 수 있다는 점이 밝혀졌다. 이러한 접근을 사용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성인 균주를 사용하여 다수의 공통된 20 개 아미노산을 근접한 구조적 동족체, 예를 들어 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, [Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acid into proteins, Science, 244: 182-188(1989); M. W. Nowak, et al., Science 268: 439-42(1995); Bain, J. D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111: 8013-8014(1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51(1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acid site-specifically into proteins, Methods in Enz ., 301-336(1992); 및 Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P. G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu RevBiophys . Biomol Struct. 24, 435-62(1995)]을 참고한다.
예를 들어, 정지 코돈 UAG를 인식하고, 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 제조하였다. 통상적인 부위-지향 돌연변이 생성을 사용하여 단백질 유전자의 해당 부위에서 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들어, [Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide -directed mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16(3): 791-802(1988)]을 참고한다. 아실화된 억제제 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관 내 전사/번역 시스템에서 합쳐진 경우, 특수 위치에서 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 상응하여 비천연 아미노산을 혼입시켰다. [3H]-Phe를 사용한 실험 및 α-히드록시산을 사용한 실험은 오직 원하는 아미노산이 UAG 코돈에 의해 특정된 위치에서만 혼입되고, 이 아미노산이 단백질 중의 임의의 다른 부위에서는 혼입되지 않는다는 점을 입증하였다. 예를 들어, [Noren, et al, 이하 동문: Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6): 425-432; 및 Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041): 197-200(1992)]을 참고한다.
tRNA는 화학적 또는 효소적 아미노아실화를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 방법 또는 기법에 의해 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.
아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성효소에 의해, 또는 리보자임을 포함하 나 이에 한정되지 않는 다른 효소적 분자에 의해 달성될 수 있다. 용어 "리보자임"은 "촉매적 RNA"와 상호 혼용된다. Cech 및 동료 연구원들(Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226)은 촉매(리보자임)로서 작용할 수 천연 발생 RNA의 존재를 입증하였다. 그러나, 이 천연 RNA 촉매는 단지 절단 및 스플라이싱을 위한 리보핵산 기질에 대해 작용하는 것으로 나타났으나, 최근 리보자임의 인위적 진화의 발달은 촉매의 영역을 각종 화학 반응들로 확장시켰다. 연구는 자체의 (2')3'-말단에서의 아미노아실-RNA 결합을 촉매할 수 있는 RNA 분자(Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647), 및 한 RNA 분자에서 다른 한 RNA 분자로 아미노산을 이동시킬 수 있는 RNA 분자(Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444)를 규명하였다.
본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 공보 제2003/0228593호는 리보자임의 구축 방법, 및 그것의 천연적으로 코딩된 아미노산 및 비천연적으로 코딩된 아미노산을 이용한 tRNA의 아미노아실화에 있어서의 용도를 기재한다. 리보자임을 포함하나 이에 한정되지 않는, tRNA를 아미노아실화할 수 있는 효소적 분자의 기질-고정화 형태는 아미노아실화 생성물의 효율적 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적당한 기질의 예는 아가로스, 세파로스 및 자기 비이드를 포함한다. 아미노아실화를 위한 리보자임의 기질-고정화 형태의 생산 및 용도가, 본원에 참고로 인용되는 [Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084] 및 U.S. 특허 출원 공보 제2003/0228593호에 기재된다.
화학적 아미노아실화 방법은, 아미노아실화에 있어 합성효소의 사용을 피하 기 위한, 본원에 참고로 인용되는 Hecht 및 동료 연구원들에 의해 도입되는 방법들을 포함하나 이에 한정되지 않는다[Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) 및 Schultz, Chamberlin, Dougherty 등(Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34)]. 그러한 방법 및 기타 화학적 아미노아실화 방법이 tRNA 분자의 아미노아실화를 위해 사용될 수 있다.
촉매 RNA의 생성 방법은 무작위화 리보자임 서열의 분리된 풀을 생성시키고, 풀에 지정 진화를 수행하며, 바람직한 아미노아실화 활성을 위한 풀을 선별하며, 요망되는 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
리보자임은 아실화 활성을 촉진하는 모티프 및/또는 영역, 예컨대 GGU 모티 프 및 U-풍부 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, U-풍부 영역은 아미노산 기질의 인식을 용이하게 할 수 있고, GGU-모티프는 tRNA의 3' 말단과 염기 쌍을 형성할 수 있음이 보고되었다. 이와 함께, GGU 및 모티프 및 U-풍부 영역은 아미노산 및 tRNA를 함께 동시 인식할 수 있도록 하고, 이로써 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화를 촉진한다.
리보자임은 tRNAAsn CCCG과 접합된 부분 무작위화 r24mini를 이용한 생체 외 선택에 의해, 또한 그 후 활성 클론에서 나타나는 일치 서열의 계통적 공학처리에 의해 발생될 수 있다. 이 방법에 의해 수득되는 한 예시적 리보자임은 "Fx3 리보자임"으로 칭해지고, 이는 내용이 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허출원 공보 제2003/0228593호에 기재되어 있으며, 동질 비천연 아미노산으로 채워진 각종 아미노아실-tRNA의 합성을 위한 다방면 촉매로서 작용한다.
기질 상에서의 고정화를 사용하여, 아미노아실화된 tRNA의 효율적 친화성 정제를 가능하게 할 수 있다. 적당한 기질의 예는 아가로스, 세파로스 및 자기 비이드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 리보자임은 RNA의 화학적 구조를 이용함으로써 수지 상에 고정될 수 있으며, 예컨대 RNA의 리보스 상의 3'-시스-디올은 과요오드산염으로 산화되어, 상응하는 디알데히드를 생성시켜 수지 상에서의 RNA의 고정을 용이하게 한다. 환원 아민화가 수지와 리보자임 간의 상호작용으로 비가역적 연결기를 만드는 저비용의 히드라지드 수지를 포함한, 각종 유형의 수지들을 사용할 수 있다. 아미노아실-tRNA의 합성은 이 온(on)-칼럼 아미노아실화 기법에 의해 상 당히 촉진될 수 있다. [Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4]는 칼럼 이용 아미노아실화 시스템을 기재한다.
아미노아실화된 tRNA의 단리는 다양한 방식들로 달성될 수 있다. 한 적당한 방법은 10 mM EDTA를 갖는 아세트산나트륨 용액과 같은 완충액, 50 mM N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판술폰산) 함유 완충액, 12.5 mM KCl(pH 7.0), 10 mM EDTA, 또는 단순히 EDTA 완충수(pH 7.0)를 갖는 칼럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용리하는 것이다.
아미노아실화된 tRNA를 번역 반응에 부가하여, tRNA가 번역 반응에 의해 생성된 폴리펩티드에서 선택 위치에 아미노아실화하는데 이용되는 아미노산을 혼입할 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 예는 세포 용해물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 세포 용해물은 투입 mRNA로부터 폴리펩티드를 생체내 번역하는데 필요한 반응 성분들을 제공한다. 그러한 반응 성분의 예는 리보좀형 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 신장 인자, 및 번역 관련 부가적 인자들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 부가적으로, 번역 시스템은 배치 번역 또는 구획화 번역일 수 있다. 배치 번역 시스템은 단일 구획에서 반응 성분들을 조합하나, 구획화 번역 시스템은 번역 효율을 억제할 수 있는 반응 생성물로부터 번역 반응 성분을 분리한다. 그러한 번역 시스템은 상업적으로 구입 가능하다.
또한, 결합된 전사/번역 시스템을 사용할 수 있다. 결합된 전사/번역 시스템은 유입 DNA의, 이후 반응 성분에 의해 번역되게 되는 상응 mRNA로의 양 전사를 허 용한다. 상업적으로 구입 가능한 결합된 전사/번역의 예는 급속 번역 시스템(RTS, Roche Inc.)이다. 그 시스템은 리보좀 및 번역 인자와 같은 번역 성분을 제공하기 위한 대장균 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 부가적으로, RNA 중합효소는 번역 시 사용하기 위한 mRNA 주형으로의 유입 DNA의 전사를 위해 포함된다. RTS는 공급/폐 구획과 전사/번역 구획을 포함한 반응 구획들 사이에 삽입된 막에 의한 반응 성분의 구획화를 이용할 수 있다.
tRNA의 아미노아실화는 트랜스퍼라제, 중합효소, 촉매 항체, 다작용 단백질 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 제제에 의해 수행될 수 있다.
[Lu et al., Mol Cell. 2001 Oct; 8(4):759-69]는 단백질을 비천연 아미노산 함유의 합성 펩티드에 화학적으로 결찰하는 방법을 기재한다(발현 단백질 결찰).
또한, 미세주사 기술을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 혼입시켰다. 예를 들어, [M. W. Nowak, P. C. Kearney, J.R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Science, 268: 439(1995); 및 D. A. Dougherty, Curr . Opin . Chem . Biol ., 4: 645(2000)]을 참고한다. 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 시험관 내 제조된 2개의 RNA 종(해당 아미노산 위치에서 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA 및 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 억제제 tRNA)을 주사하였다. 이어서, 난모세포의 번역 기구는 UAG에 의해 특정된 위치에서 비천연 아미노산을 삽입시킨다. 이 방법은 일반적으로 시험관 내 발현 시스템을 따르지 않는 혼입 막 단백질의 생체 내 구조-기능 연구를 가능케 하였다. 그 예는 형광 아미노산을 타치키닌(tachykinin) 뉴로키닌(neurokinin)-2 수용체에 혼입시켜 형광 공명 에너지 전달에 의한 거리를 측정하는 것(예를 들어, [G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel 및 A. Chollet, J. Biol . Chem ., 271: 19991(1996)] 참고; 비오티닐화 아미노산을 혼입시켜, 이온 채널 내 표면 노출 잔기를 동정하는 것(예를 들어, [J. P. Gallivan, H. A. Lester 및 D. A. Dougherty, Chem. Biol ., 4: 739(1997)] 참고); 케이징된 티로신 유사체를 사용하여, 실시간 이온 채널 내 형태적 변화를 모니터하는 것(예를 들어, [J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Neuron, 20: 619(1998)] 참고), 및 통문(gating) 기전 탐침(probing)을 위해 이온 채널 골격을 변화시키는데 알파 히드록시 아미노산을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, [P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty 및 H. A. Lester, Cell, 96: 89(1999); 및 T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz 및 J. Yang, Nat. Neurosci ., 4: 239(2001)] 참고)을 포함한다.
생체 내에서 비천연 아미노산을 단백질에 직접 혼입시키는 능력은 돌연변이체 단백질의 고 수율, 기술적 용이성, 세포 또는 가능하게는 생명체에서 돌연변이체 단백질 연구 잠재력 및 이러한 돌연변이체 단백질의 치료적 치료 용도의 이점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 다른 성질들을 갖는 비천연 아미노산을 단백질에 포함시킬 수 있는 능력은 단백질의 구조를 합리적으로 또한 계통적으로 조작하여, 단백질 기능을 탐침함과 동시에, 신규한 성질을 갖는 신규한 단 백질 또는 유기체를 생성할 수 있는 능력을 크게 확장시킬 수 있다.
파라-F-Phe를 부위-특이적으로 혼입시키려는 한 시도로, 효모 앰버 억제제 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성 Phe 영양요구성 에쉐리키 아 콜라이 균주에 사용하였다. 예를 들어, [R. Furter, Protein Sci . 7:419(1998)]을 참고한다.
또한, 무세포(시험관 내) 번역 시스템을 사용하여 본 발명의 hGH 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻는 것도 가능할 수 있다. 번역 시스템은 세포성 또는 세포-비함유일 수 있고, 원핵 또는 진핵세포계일 수 있다. 세포성 번역 시스템은 전세포 제제, 예컨대 투과가능화된 세포 또는 세포 배양물(여기에서, 원하는 핵산 서열은 mRNA 및 번역된 mRNA로 전사될 수 있음)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 세포-비함유 번역 시스템은 상업적으로 구입 가능하고, 많은 상이한 유형 및 시스템이 공지되어 있다. 세포-비함유 시스템의 예는 원핵세포 용해물, 예컨대 용해물, 및 진핵세포 용해물, 예컨대 밀 배아 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상적혈구 용해물, 토끼 난모세포 용해물 및 인간 세포 용해물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 진핵세포 추출물 또는 용해물은 수득되는 단백질이 당화, 인산화, 또는 기타 방식으로 변형될 때 바람직할 수 있는데, 그 이유는 많은 그러한 변형들이 단지 진핵 시스템에서 가능하기 때문이다. 이 추출물 및 용해물 중 일부는 상업적으로 구입 가능하다(Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). 막 추출물, 예컨대 분비 단백질을 번역하는데 유용한, 소포체막 함유의 견치 췌장 추출물도 또한 이용가 능하다. mRNA를 주형(생체외 번역)으로, 또는 DNA를 주형으로 포함할 수 있는 (생체외 전사 및 번역 조합의) 이 시스템에서, 생체외 합성은 리보솜에 의해 지시된다. 세포-비함유 단백질 발현 시스템의 발달을 위해 상당한 노력이 가해졌다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 [Kim, D.M. 및 J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74: 309-316(2001); Kim, D.M. 및 J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.M., 및 J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M., 및 J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); 및 Patnaik, R. 및 J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); U.S. 특허 제6,337,191호; U.S. 특허 공보 제2002/0081660호; WO 00/55353; 및 WO 90/05785]를 참고한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또 다른 접근법은 mRNA-펩티드 융합 기법을 포함한다. 예를 들어, [R. Roberts 및 J. Szostak, Proc . Natl Acad . Sci.(USA) 94:12297-12302(1997); A. Frankel, et al, Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003)]을 참고한다. 이 접근법에서, 퓨로마이신에 연결된 mRNA 주형은 리보솜 상에 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형되면, 비천연 아미노산은 펩티드에 혼입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 해독된 경우, 퓨로마이신은 펩티드의 C-말단을 차지한다. 수득되는 mRNA-펩티드 접합물이 생체외 검정에서 유리한 성질을 가지는 것으로 나타나는 경우, 그것의 실체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이 방식으로, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 라이브러리를 선별하여, 원하는 성질을 갖는 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 보다 최근, 정제된 성분을 갖는 생체외 리보솜 번역은, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 허용하는 것으로 보고되었다. 예컨대 [A. Forster et al, Proc . Natl Acad . Sci .(USA) 100:6353(2003)]을 참고한다.
재구성된 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다. 용해물, 또는 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 신장 인자 T(EF-Tu), 또는 종결 인자와 같은 정제된 번역 인자로 보충된 용해물의 조합물과 함께, mRNA를 단백질로 번역하기 위해, 정제된 번역 인자의 혼합물이 또한 성공적으로 사용되었다. 세포-비함유 시스템은 또한 본원에 구체적으로 참고로 인용되는 [Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993)]에 기재된 바와 같이, DNA가 시스템에 도입되어, mRNA로 전사되며, mRNA는 번역되는 결합된 전사/번역 시스템일 수 있다. 진핵 전사 시스템에서 전사된 RNA는 이종핵 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 꼬리 성숙의 mRNA의 형태일 수 있고, 이는 특정 번역 시스템에서 유리할 수 있다. 예를 들어, 캡핑된 mRNA는 망상적혈구 용해물 시스템에서 고효율로 번역된다.
VIII . hGH 폴리펩티드에 결합된 거대분자 중합체
본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략을 사용하여, 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 다양한 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형은 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당류, 수용성 덴드리머, 시클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생물소재, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이징된 부분, 화학선 복사 여기성 부분, 광이성화가능한 부분, 비오틴, 비오틴의 유도, 비오틴 유사체, 중 원자를 혼입시킨 부분, 화학적으로 분절가능한 기, 광분절성 기; 연장된 측쇄, 탄소-연결 당, 산화환원 활성제, 아미노 티오산; 독성 부분, 동위 원소로 표지화된 부분, 생체물리적 프로브, 형광 기, 화학발광 기, 전자 밀집 기, 자기 기, 삽입성 기, 발색단; 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노트랜스미터, 방사성 핵종, 방사성 트랜스미터, 뉴런 포착제, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가의 작용기를 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분에 혼입시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략의 예시적인 비제한적인 예로서, 하기 설명은 거대분자 중합체를 비천연 아미노산 폴리펩티드에 첨가하는 것에 초점을 맞출 것이며, 또한 여기에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 전략이 (필요에 따라, 당업자가 본 명세서의 개시 내용을 사용하여 실시할 수 있는 적당한 변형 사용) 앞서 열거한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 작용기를 첨가하는 것에 적용될 수 있다는 점이 이해된다.
매우 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합하여 hGH 폴리펩티드의 생물학적 성질을 조절하고(하거나) hGH 분자에 신규한 생물학적 성질을 제공할 수 있다. 이러한 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연 또는 비천연 아미노산으로 된 임의의 작용성 치환기 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 첨가되는 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 넓은 범위를 가질 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da를 포함하나 이에 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.
본 발명은 중합체:단백질 접합체로 된 실질적으로 균질한 제제를 제공한다. 본원에 사용되는 "실질적으로 균질한"은 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질 중의 절반을 초과하여 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 갖고, 본원에 제공된 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 hGH 폴리펩티드 조제물은 균질한 조제물의 이점, 예를 들어, 로트별(lot to lot) 약동학 예측성에 대한 임상적 적용의 용이성을 나타내기에 충분히 균질한 것들이다.
또한, 중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물 제조를 선택할 수 있으며, 본원에 제공되는 이점은 혼합물 중에 포함되는 모노-중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 필요에 따라, 다양한 수의 부착된 중합체 부분(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)를 갖는 다양한 단백질로 된 혼합물을 제조할 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 모노-중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 조합할 수 있고, 소정의 분율의 모노-중합체:단백질 접합체를 갖는 혼합물을 가질 수 있다.
선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예를 들어 생리학적 환경 중에서 침전하지 않도록 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 최종 생성물 조제물의 치료적 사용을 위해, 중합체는 약제학적으로 허용되는 것이다.
단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 분율은 반응 혼합물 중 그들의 농도와 같이 변하게 된다. 일반적으로, 최적비(최소 과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 존재하는 점에서 반응 효율의 측면에서)를 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응성 기의 수에 따라 결정할 수 있다. 분자량에 관해, 전형적으로 중합체의 분자량이 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 매개변수를 최적화하는 경우 중합체의 분지화를 고려해야 한 다. 일반적으로, 분자량이 클수록(또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 크다.
중합체의 예는 폴리알킬 에테르 및 그것의 알콕시-캡핑된 유사체(예컨대, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 그것의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리옥시에틸렌 글리콜(후자는 또한 폴리에틸렌글리콜 또는 PEG로도 알려짐)); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리히드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드 및 폴리히드록시알킬 아크릴아미드(예컨대, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드 및 그것의 유도체); 폴리히드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 그것의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 다당류 및 그것의 유도체, 가령 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예컨대 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 술페이트, 아미노덱스트란; 셀룰로스 및 그것의 유도체, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 그것의 유도체, 예컨대 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 히알루론산 및 그것의 유도체; 전분; 알긴산염; 콘드로이틴 술페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 그것의 유도체, 예컨대 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알코올; 그것의 공중합체; 그것의 삼원중합체; 그것의 혼합물; 및 상기 것들의 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 분율은 반응 혼합물 중 그것 의 농도와 같이 변화할 것이다. 일반적으로, 최적의 비(최소의 과잉 미반응 단백질 또는 중합체가 있는 반응 효율성의 측면에서)는, 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응기의 수에 의해 결정될 수 있다. 분자량과 관해, 전형적으로 중합체의 분자량이 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수가 적다. 유사하게, 중합체의 분지는 이 매개변수들을 최적화할 때 고려되어야 한다. 일반적으로, 분자량이 클수록(또는 분지가 많을수록), 중합체:단백질 비가 크다.
본원에 사용되고, PEG:hGH 폴리펩티드 접합체를 고려하는 경우 용어 "치료적 유효량"은 환자에게 원하는 이익을 제공하는 양을 지칭한다. 이 양은 개인에 따라 변화하고, 환자의 전체적인 신체적 상태 및 피처리 상태의 기저 원인을 비롯한 다수의 인자에 따라 좌우되게 된다. 요법에 사용되는 hGH 폴리펩티드의 양은 허용가능한 변화율을 제공하고, 유익한 수준에서 원하는 변화를 유지시킨다. 치료적 유효량의 본 발명의 조성물은 공개적으로 입수가능한 물질 및 절차를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 규명될 수 있다.
수용성 중합체는 선형, 포크형 또는 분지형을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용할 수 있다. 예로서, 본 발명의 특정 실시양태를 기재하는데 PEG를 사용한다.
PEG는 상업적으로 입수가능하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환(ring-opening) 중합에 의해 제조될 수 있는 공지된 수용성 중합체이다[Sandler 및 Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, 페이 지 138-161]. 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG 말단에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 것으로 널리 사용되며, 하기 화학식에 의해 hGH 폴리펩티드에 결합되는 것으로 나타낼 수 있다:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
(식 중, n은 2 내지 10,000이고, X는 H 또는 C1 -4 알킬, 보호기 또는 말단 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않는 말단 변형임).
일부 경우들에서, 본 발명에 사용되는 PEG는 하나 말단에서 히드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH3임)로 종결된다("메톡시 PEG"). 대안적으로, PEG는 반응성 기를 사용하여 종결되어, 이작용성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응성 기는 통상 20개의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는데 사용되는 반응성 기(말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않음), 활성화된 에스테르(N-히드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않음) 및 알데히드를 포함하나 이에 한정되지 않음), 및 20개의 일반 아미노산에 대해 불활성이지만 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 상보적 작용기(아지드기, 알킨기를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 화학식 중에서 Y로 도시되는 PEG의 다른 말단이 천연 발생 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 hGH 폴리펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다는 점이 주목된다. 예를 들어, Y는 폴리펩티드의 아민기(리신의 엡실론 아민 또는 N-말단을 포함하나 이에 한 정되지 않음)에 대한 아미드, 카르바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 대안적으로, Y는 티올기(시스테인의 티올 기를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 대한 말레이미드 연결기일 수 있다. 대안적으로, Y는 통상 20개의 일반 아미노산을 통해 접근가능하지 않은 잔기에 대한 연결기일 수 있다. 예를 들어, PEG 상의 아지드기는 hGH 폴리펩티드 상의 알킨기와 반응하여 휘스겐 [3+2] 시클로첨가 생성물을 형성할 수 있다. 대안적으로, PEG 상의 알킨기는 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 아지드기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 강한 친핵성 물질(히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 세미카르바지드를 포함하나 이에 한정되지 않음)은 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여, 적용가능한 경우, 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 이들은 일부 경우에 적당한 환원제의 처리에 의해 추가로 환원될 수 있다. 대안적으로, 강 친핵성 물질은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 hGH 폴리펩티드로 혼입될 수 있으며, 수용성 중합체 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드기와 우선적으로 반응하는데 사용될 수 있다.
약 100 달톤(Da) 내지 100,000 Da, 또는 필요한 경우, 그 이상(때때로 0.1-50 kDa 또는 10-40 kDa를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함하나 이에 한정되지 않는, PEG의 임의의 분자 질량을 실질적으로 또는 원하는 대로 사용할 수 있다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 또는 그 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 넓은 범위를 가질 수 있다. PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다. 또한, 각각의 사슬이 1-100 kDa(1-50 kDa 또는 5-20 kDa을 포함하나 이에 한정되지 않음) 범위의 MW를 갖는 PEG 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는 분지형 사슬 PEG도 사용할 수 있다. 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da, 또는 그 이상을 포함하나 이에 한정되지 않을 수 있다. 분지쇄 PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자 량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 분지쇄 PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 20,000 Da이다. PEG 분자의 넓은 범위가 본원에 참고로 인용되는 [쉐어워터 폴리머즈(Shearwater Polymers), Inc. 카달로그, 넥타르 써레포틱스(Nektar Therapeutics) 카달로그](단, 이를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 기재되어 있다.
일반적으로, PEG 분자의 하나 이상의 말단은 비천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응을 위해 이용가능하다. 예를 들어, 아미노산 측쇄와의 반응을 위한 알킨 및 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체를 사용하여, PEG를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시킬 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 알킨 부분을 함유하여 [3+2] 시클로첨가 생성물을 형성시키거나 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종(즉, 에스테르, 카르보네이트)을 함유하여 아미드 연결기를 형성시킨다. 대안적으로, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 아지드 부분을 함유하여 [3+2] 휘스겐 시클로첨가 생성물을 형성시킨다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 경우, PEG는 각각 상응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 연결기를 형성시키기 위해 전형적으로 강력한 친핵성 물질(히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함한다. 다른 대안예에서, 상기한 반응성 기의 역 배향을 사용할 수 있으며, 즉 비천연적으로 코딩된 아미노산 중의 아지드 부분을 알킨을 함유하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, PEG 유도체를 갖는 hGH 폴리펩티드 변종체는 비천연적으 로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 작용기와 반응성을 갖는 화학적 작용기를 함유한다.
본 발명은 일부 실시양태에서 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 평균 분자량을 갖는 수용성 중합체 골격을 포함하는 아지드 함유 중합체 유도체 및 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체의 중합체 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 또한, 폴리(에틸렌) 글리콜, 및 폴리(덱스트란) 및 폴리(프로필렌 글리콜)을 포함하는 다른 관련 중합체를 포함하나 이에 한정되지 않는 매우 다양한 수용성 중합체들도 본 발명을 실시하기에 적합하고, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 모든 이러한 분자를 포괄하고 포함하기 위한 것이라는 점이 이해되어야 한다. 용어 PEG는 이작용성 PEG, 다중팔을 갖는(multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트 PEG(즉, 중합체 골격에 펜딩된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련된 중합체), 또는 그 안에 분해가능한 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
PEG는 전형적으로 투명하고, 무색 무취이고 수용성이고, 열에 안정하고, 많은 화학적 약제에 대해 불활성이고, 가수분해되거나 약화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체이용가능한 것으로 간주되며, 즉 PEG는 해를 가하지 않으면서 생명 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성이며, 즉 PEG는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향을 가진다. PEG는 체내에서 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예를 들면 생물 학적 활성제에 부착된 경우, 이 약제를 차폐시키는 경향을 갖고, 유기체가 이러한 약제의 존재에 내성을 가질 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 일으키거나, 응고 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 일으키는 경향을 갖지 않는다. 화학식 --CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(여기에서, n은 약 3 내지 약 4000, 전형적으로는 약 20 내지 약 2000임)을 갖는 PEG가 본 발명에 사용하기 적합하다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 약 800 Da 내지 약 100,000 Da의 분자량을 갖는 PEG가 중합체 골격으로서 특히 유용하다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da, 또는 그 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 넓은 범위를 가질 수 있다. PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, ^ 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.
중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 일반적으로, 분지형 중합체 골격은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분 및 중심 분지 코어에 결합된 다수의 선형 중합체 사슬을 가진다. 통상, PEG는 다양한 폴리올, 예를 들어 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 수가지 아미노산, 예를 들어 리신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)을 일반적 형태 R(-PEG-OH)m(여기에서, R은 코어 부분, 예를 들어 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리트리톨로부터 유도되고, m은 다수의 팔을 나타냄)으로 나타낼 수 있다. 또한, 다중팔을 갖는 PEG 분자, 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호, 제5,229,490호, 제4,289,872호; 미국 특허 출원 제2003/0143596호; WO 96/21469 및 WO 93/21259에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.
또한, 분지형 PEG는 PEG(--YCHZ2)n(여기에서, Y는 연결기이고, Z는 소정의 길이의 원자로 된 사슬에 의해 CH에 결합된 활성화된 말단 기임)로 표시되는 갈래형(forked) PEG의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 또 다른 분지형 형태인 펜던트 PEG는 PEG 사슬의 말단에서가 아니라 PEG 골격을 따라 반응성 기, 예를 들어 카르복실기를 가진다.
또한, 이러한 PEG 형태들 이외에, 중합체는 골격 내의 약한 또는 분해가능한 연결기를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해되게 되는 중합체 골격 중의 에스테르 연결기를 사용하여 제조될 수 있다. 이하 나타내는 바와 같이, 이러한 가수분해는 중합체를 저 분자량의 단편으로 분절시킨다:
-PEG-CO2-PEG- + H2O → PEG-CO2H + HO-PEG-
용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG가 본원에 개시된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 모든 형태를 나타내거나 포함한다는 점은 당업자에게 이해되어진다.
또한, 많은 다른 중합체들도 본 발명에 사용하기 적합하다. 일부 실시양태에서, 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성인 중합체 골격은 본 발명에 특히 유용하다. 적당한 중합체의 예는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들어 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 그들의 공중합체(에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하나 이에 한정되지 않음), 그들의 삼원중합체, 그들의 혼합물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 비록 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 변할 수 있지만, 전형적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da의 범위이다. 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 약 100 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 약 1,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 약 5,000 Da 내지 40,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체 골격의 각 사슬의 분자량은 약 10,000 Da 내지 40,000 Da이다.
실질적으로, 당업자는 실질적으로 수용성인 상기 골격에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 중합체 물질들이 본 발명에 사용하기 적당한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 중합체 유도체는 "다작용성"이며, 이는 중합체 골격이 작용기로 작용화되거나 활성화된, 2개 이상의 말단, 및 가능하게는 약 300개의 말단을 가진다는 점을 의미한다. 다작용성 중합체 유도체는 각기 동일하거나 상이할 수 있는 작용기에 결합된 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 중합체 유도체는 하기 구조를 가진다.
X-A-POLY-B-N=N=N
(식 중,
N=N=N은 아지드 부분이고,
B는 존재 또는 부재할 수 있는 연결 부분이고,
POLY는 수용성 비항원성 중합체이고,
A는 존재 또는 부재할 수 있고, B와 동일하거나 상이할 수 있는 연결 부분이고,
X는 제2 작용기임).
A 및 B에 대한 연결 부분의 예는 18개 이하, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개(단,이에 한정되지 않음)의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 알킬 기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 알킬 사슬에 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 또한, 알킬 사슬은 헤테로원자에서 분지될 수 있다. A 및 B에 대한 연결 부분의 다른 예는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 5 내지 6개(단,이에 한정되지 않음)의 탄소 원자를 함유하는 다작용화된 아릴기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 아릴기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적당한 연결기의 다른 예는 각각 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호 및 미국 특허 출원 공보 제2003/0143596호에 기재된 연결기를 포함한다. 당업자는 상기 연결 부분에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 연결 부분이 본 발명에 사용하기 적당한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.
X로 사용하기 적당한 작용기의 예는 히드록실, 보호된 히드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들어 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들어 N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아 민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤 및 아지드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 아지드기와의 반응이 일어나지 않도록, 선택된 X 부분은 아지드기와 상용가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 동형이작용성(여기에서, 이는 제2 작용기(즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미함), 또는 헤테로이작용성(여기에서, 이는 제2 작용기가 상이한 작용기인 것을 의미함)일 수 있다.
용어 "보호된"은 특정한 반응 조건 하에서 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 보호기 또는 보호 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응성 기의 유형에 따라 변화하게 된다. 예를 들어, 화학적 반응성 기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응성 기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디술피드일 수 있다. 화학적 반응성 기가 카르복실산, 예를 들어 부탄산 또는 프로피온산 또는 히드록실기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 tert-부틸일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기도 본 발명에 사용될 수 있다.
통상, 조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
수용성 중합체는 본 발명의 hGH 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 수용성 중합 체는 hGH 폴리펩티드에 혼입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 또는 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기 또는 비천연적으로 코딩된 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 첨가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통해 연결될 수 있다. 대안적으로, 수용성 중합체는 천연 발생 아미노산(시스테인, 리신 또는 N-말단 잔기의 아민 기를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 통해 비천연적으로 코딩된 아미노산을 혼입하는 hGH 폴리펩티드에 연결된다. 일부 경우들에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 비천연 아미노산을 포함하며, 여기에서 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산(들)이 수용성 중합체(들)(PEG 및/또는 이당류를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 연결된다. 일부 경우들에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 개수의 천연적으로 코딩된 아미노산(들)을 추가로 포함한다. 일부 경우들에서, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 하나 이상의 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 수용성 중합체는 비접합된 형태에 비해 hGH 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증진시킨다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여 변화(증가 또는 감소를 포함하나 이에 한정되지 않음)된 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특징, 예를 들어 생체 내 반감기를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, hGH의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 적어도 약 100배 증가된다.
강친핵성기(즉, 히드라지드, 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드)를 포함하는 PEG 유도체
본 발명의 한 실시양태에서, 카르보닐 함유의, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 결합된 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)임).
일부 실시양태에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 임의적으로, 존재 또는 부재할 수 있는 카르보닐기(C=O)임).
일부 실시양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이고, n은 100-1,000임).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 아미드 연결기에 의해 PEG 골격에 연결되는 말단 히드록실아민, 히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다.
일부 실시양태에서, 히드록실아민-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000(즉, 평균 분자량은 5 내지 40 kDa임)임).
일부 실시양태에서, 히드라진 함유 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 임의적으로, 존재 또는 부재할 수 있는 카르보닐기(C=O)임).
일부 실시양태에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000임).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 말단 히드라진, 히드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체를 사용하여 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각각의 사슬은 10 내지 40 kDa의 범위를 가질 수 있다. 이러한 분지형 PEG의 각각의 사슬은 더욱 바람직하게는 5 내지 20 kDa 범위의 MW를 가진다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체를 사용하여 변형된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 히드라진-말단 PEG 유도체 또는 히드라지드-말단 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000이고, X는 임의적으로, 존재 또는 부재할 수 있는 카르보닐기(C=O)임).
일부 실시양태에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의적으로 NH, O, S 또는 C(O)이거나 부재하고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000임).
일부 실시양태에서, 히드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 구조를 가진다:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
(식 중, R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의적으로 NH, O, S 또는 C(O)이거나 부재하고, m은 2 내지 10이고, n은 100 내지 1,000임).
수용성 중합체(들)가 hGH 폴리펩티드에 연결되는 정도 및 부위는 부위 1에서 hGH 폴리펩티드의 hGH 폴리펩티드 수용체에 대한 결합을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 연결은 hGH 폴리펩티드가 평형 결합 검정, 예를 들어 hGH에 대해 [Spencer et al., J. Biol . Chem ., 263: 7862-7867(1988)]에 기재된 것에 의해 측정시 약 400 nM 이하, 150 nM 이하의 Kd, 및 일부 경우 100 nM 이하의 Kd로 부위 1에서 hGH 폴리펩티드 수용체를 결합시키도록 배치된다.
중합체의 활성화, 및 펩티드의 접합을 위한 방법 및 화학 작용은 문헌에 기재되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 중합체의 활성화에 통상 사용되는 방법은 시아노겐 브로마이드, 페리오데이트, 글루타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 술포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 사용하여 작용기를 활성화시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. ([R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Defcker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al, Eds. POLYERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991)] 참고).
PEG의 작용화 및 접합에 대한 수가지 검토 및 논문이 이용가능하다. 예를 들어, [Harris, Macromol . Chem . Phys. C25: 325-373(1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65(1987); Wong et al, Enzyme Microb . Technol . 14: 866-874(1992); Delgado et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304(1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165(1995)]를 참고한다.
또한, 중합체의 활성화 방법은 WO 94/17039, 미국 특허 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제5,281,698호, 및 WO 93/15189에서 찾을 수 있고, 활성화된 중합체와 효소 사이의 접합의 경우 접합 펙터(응고 인자) VIII(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제([Veronese et al., App . Biochem . Biotech. 11: 141-45(1985)] 참고)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.
비천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어 p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하 는 hGH 폴리펩티드의 PEG화(즉, 임의의 수용성 중합체의 첨가)는 임의의 편리한 방법에 의해 수행된다. 예를 들어, hGH 폴리펩티드는 알킨-종결 mPEG 유도체로 PEG화된다. 간략히, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH를 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 hGH 폴리펩티드의 수용액에 첨가한다. 전형적으로, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH 부근(일반적으로, 약 pH 4-10)에서 pKa를 갖는 완충액으로 완충된다. 예를 들어, pH 7.5에서 PEG화하기 적당한 완충액의 예는 HEPES, 포스페이트, 보레이트, 트리스-HCl, EPPS 및 TES를 포함하나 이에 한정되지 않는다. pH를 연속적으로 모니터링하고, 필요에 따라 조정한다. 전형적으로, 반응을 약 1 내지 48시간 동안 계속한다.
추후, 반응 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피하여, 차단되지 않은 PEG가 분자의 양쪽 말단에서 활성화되어 hGH 폴리펩티드 변종체 분자를 가교결합시키는 경우 형성될 수 있는 PEG화된 hGH 폴리펩티드의 임의의 고 분자량 복합체 및 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH로부터 PEG화된 hGH 폴리펩티드 변종체를 분리시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 중의 조건은 임의의 가교결합된 PEG화된 hGH 폴리펩티드 변종체 복합체가 하나 이상의 PEG 기에 접합된 한 hGH 폴리펩티드 변종체 분자를 함유하는 원하는 형태를 따라 용리되면서, 유리 mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH가 칼럼을 통해 유동하도록 하는 것이다. 적당한 조건은 가교결합된 복합체 대 원하는 접합체의 상대적 크기에 따라 변화하고, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 접합체를 함유하는 용리액을 한외여과에 의해 농축시키고, 정용여과에 의해 탈염시 킨다.
필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 PEG화된 hGH 폴리펩티드를 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음); 실리카 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스 G-75를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기-배제 크로마토그래피, 금속-킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/정용여과: 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동 절차(분취 등점 집초법을 포함하나 이에 한정되지 않음), 시차 용해도법(황산암모늄 침전을 포함하나 이에 한정되지 않음), 또는 추출을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 하나 이상의 절차에 의해 추가 정제할 수 있다. 겉보기 분자량을 구형 단백질 표준과 비교함으로써 GPC에 의해 추정할 수 있다([Preneta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH(Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참고). hGH-PEG 접합체의 순도를 단백질분해성 분해(트립신 분절을 포함하나 이에 한정되지 않음) 후, 질량 분석법 분석에 의해 평가할 수 있다. [Pepinsky B., et al., J. Pharmacol . & Exp . Ther . 297(3): 1059-66(2001)]을 참고한다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드의 아미노산에 연결된 수용성 중합체는 제한없이 추가로 유도체화되거나 치환될 수 있다.
기타 PEG 유도체 및 일반 PEG화 기법
아지드-함유, 알킨-함유 및 포스핀-함유 PEG 유도체가 U.S. 특허 출원 제 11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")에 기재되어 있다.
hGH 폴리펩티드에 연결될 수 있는 다른 예시적인 PEG 분자, 및 PEG화 방법은 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 공보 제2004/0001838호; 제2002/0052009호; 제2003/0162949호; 제2004/0013637호; 제2003/0228274호; 제2003/0220447호; 제2003/0158333호; 제2003/0143596호; 제2003/0114647호; 제2003/0105275호; 제2003/0105224호; 제2003/0023023호; 제2002/0156047호; 제2002/0099133호; 제2002/0086939호; 제2002/0082345호; 제2002/0072573호; 제2002/0052430호; 제2002/0040076호; 제2002/0037949호; 제2002/0002250호; 제2001/0056171호; 제2001/0044526호; 제2001/0027217호; 제2001/0021763호; 미국 특허 제6,646,110호, 제5,824,778호, 제5,476,653호, 제5,219,564호, 제5,629,384호, 제5,736,625호, 제4,902,502호, 제5,281,698호, 제5,122,614호, 제5,473,034호, 제5,516,673호, 제5,382,657호, 제6,552,167호, 제6,610,281호, 제6,515,100호, 제6,461,603호, 제6,436,386호, 제6,214,966호, 제5,990,237호, 제5,900,461호, 제5,739,208호, 제5,672,662호, 제5,446,090호, 제5,808,096호, 제5,612,460호, 제5,324,844호, 제5,252,714호, 제6,420,339호, 제6,201,072호, 제6,451,346호, 제6,306,821호, 제5,559,213호, 제5,612,460호, 제5,747,646호, 제5,834,594호, 제5,849,860호, 제5,980,948호, 제6,004,573호, 제6,129,912호; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W0 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316에 기재된 것들을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 PEG 분자를, 단일 사슬, 분지형 사슬, 다중팔 사슬, 일작용성, 이작용성, 다작용성 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 형태로 사용할 수 있다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 출원 일련 제11/046,432호(발명의 명칭: "Modified Human Growth Hormone Polypeptides and Their Uses")는 PEG 및 그것의 형태에 대한 추가적 논의를 제공한다.
IX. 효능, 기능적인 생체 내 반감기 및 약동학적 매개변수의 측정
본 발명의 한 중요한 측면은 폴리펩티드를 수용성 중합체 부분에 접합하거나 접합하지 않고 hGH 폴리펩티드를 구성함으로써 얻어진 연장된 생물학적 반감기이다. hGH 폴리펩티드 혈청 농도의 신속한 감소는 접합된 hGH 폴리펩티드 및 비접합된 hGH 폴리펩티드 및 그것의 변종체 처리에 대한 생물학적 반응을 평가하는데 중요하다. 바람직하게는, 또한, 본 발명의 접합된 hGH 폴리펩티드 및 비접합된 hGH 폴리펩티드 및 그것의 변종체는 정맥내 투여 후 연장된 혈청 반감기를 가짐으로써, 예를 들어, ELISA 방법 또는 1차 스크리닝 분석방법에 의한 측정을 가능케 한다. 바이오소스 인터내셔널(BioSource International)(미국 캘리포니아주 카마릴로 소재) 또는 다이애그노스틱 시스템스 래보러토리즈(Diagnostic Systems Laboratories)(미국 텍사스주 웹스터 소재)로부터의 ELISA 또는 RIA 키트를 사용할 수 있다. 생체 내 생물학적 반감기의 측정은 본원에 기재된 것과 같이 수행된다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 효능 및 기능적 생체 내 반감기는 [Clark, R., et al., J. Biol . Chem . 271(36), 21969-21977(1996)]에 기재된 프로토콜에 따라 결정될 수 있다.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대한 약동학적 매개변수는 정상 스프라그-도우리(Sprague-Dawley) 수컷 쥐(처리군 당 N = 5 마리 동물)에서 평가될 수 있다. 동물은 쥐 1 마리 당 25 ㎍의 단일 투여량을 정맥내 투여받거나 50 ㎍의 단일 투여량을 피하 투여받게 되고, 일반적으로 수용성 중합체에 접합되지 않은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 경우 약 6시간, 및 수용성 중합체에 접합된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 경우 약 4일 동안의 미리 정해진 시간에 따라 대략 5-7개의 혈액 샘플을 취하게 된다. hGH 폴리펩티드에 대한 약동학적 데이터는 수가지 종에서 잘 연구되어 있고, 이를 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드에 대해 얻어진 데이터와 직접 비교할 수 있다. hGH와 관련된 연구에 대해, [Mordenti J., et al., Pharm . Res. 8(11): 1351-59(1991)]을 참고한다.
약역학적 매개변수들을 또한 영장류, 예컨대 사이노몰거스 원숭이에서 평가할 수 있다. 단일 주사를 피하 또는 정맥내 투여할 수 있고, 혈청 hGH 수준은 시간 경과에 따라 모니터한다.
당업계에 공지되어 있는 다양한 검정에 의해 본 발명에 따른 hGH 폴리펩티드의 특이적 활성을 결정할 수 있다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 hGH 폴리펩티 드 뮤테인 또는 그의 단편의 생물학적 활성을 본원에 기재되거나 인용된 방법 또는 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 시험할 수 있다.
X. 투여 및 약제학적 조성물
본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질(hGH, 합성효소, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)은, 임의적으로 적당한 약제학적으로 담체(단, 이에 한정되지 않음)와 함께 치료적 용도로 사용된다. 예를 들어, 이러한 조성물은 치료적 유효량의 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 그들의 조합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 조제물은 투여 방식에 적합하도록 만들어진다. 일반적으로, 단백질을 투여하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.
하나 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 치료용 조성물을 임의적으로 하나 이상의 적당한 시험관 내에서 및/또는 질병을 갖는 생체 내 동물 모델에서 시험하여 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 효능, 조직 기전을 확인하고, 투여량을 평가한다. 특히, 투여량은 즉, 천연 아미노산 동족체(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 hGH 폴리펩티드를 천연 아미노산 hGH 폴리펩티드에 비교하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음)에 대한 비천연 물질의 활성, 안정성 또는 다른 적당한 기준에 의해 관련 검정에서 초기에 결정될 수 있다.
투여는 정상적으로 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 최종 접촉점에 도입시키 는데 사용되는 경로 중 임의의 것에 의해 이루어진다. 본 발명의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 임의의 적당한 방식으로, 임의적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다. 본 발명의 내용 중에서 이러한 폴리펩티드를 환자에게 투여하는 적당한 방법이 이용하능하고, 비록 특정 조성물을 투여하는데 하나 이상의 경로를 사용할 수 있지만, 종종, 특정 경로가 또 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 유효한 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물, 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물로 된 매우 다양한 적당한 조제물이 존재한다.
PEG화된 hGH를 포함하나 이에 한정되지 않는 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 피하 또는 정맥내, 또는 임의 기타 주사 또는 주입 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는, 단백질 또는 펩티드에 적당한 임의의 통상적 경로에 의해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 조성물은 경구, 정맥내, 복막내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하, 또는 직장 수단을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한, 변형되거나 비변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 리포좀을 통해 투여할 수 있다. 일반적으로, 이러한 투여 경로 및 적당한 조제물은 당업자에게 공지되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 PEG화된 hGH를 포함하나 이에 한정되지 않는 hGH 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 단독으로 또는 다른 적당한 성분과 함께 사용될 수 있다.
또한, 비천연 아미노산을 단독으로 또는 다른 적당한 성분과 함께 포함하는 hGH 폴리펩티드를 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 조제물(즉, 이들은 "분무될(nebulized)" 수 있음)로 만들 수 있다. 에어로졸 조제물을 가압된 허용되는 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 안에 위치시킬 수 있다.
예를 들어, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복막내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적당한 조제물은 항산화제, 완충액, 정균제, 및 의도하는 수용물의 혈액과 등장성인 조제물을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. hGH의 조제물은 단회 투약 또는 다회 투약 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이얼로 제공될 수 있다.
비경구 투여 및 정맥내 투여는 바람직한 투여 방법이다. 특히, 현재 사용되는 조제물과 함께, 천연 아미노산 동족체 치료제(EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체 및/또는 임의의 다른 약제학적으로 전달되는 단백질에 전형적으로 사용되는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않음)에 이미 사용되는 투여 경로는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 조제물을 제공한다.
폴리펩티드 조성물의 점도 및 조제물 프로파일은 통상적 조제물에 비해 보다 작은 플런저 압력을 이용함으로써 작은 게이지 바늘을 이용하여 투여하도록 할 수 있다. 27, 28, 29, 30 또는 31 게이지 바늘을 포함하나 이에 한정되지 않는 보다 작은 게이지 바늘을 본 발명의 폴리펩티드 조성물을 대상에게 투여하는데 사용할 수 있다. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제6,875,432호는 단백질 조제물의 점 도, 및 피하 투여용 단백질 조제물의 점도와 관련된 문제를 논의한다. 작은 게이지 바늘은 투야 처방에 대한 환자의 컴플라이언스를 향상시키는 주사의 통증 감소로 인해 이롭다. 주사하는데 필요한 보다 작은 플런저 압력은 PEG화된 hGH를 포함하나 이에 한정되지 않는 hGH 폴리펩티드가 짧은 주사 시간 내에 투여하는 것을 보다 용이하게 한다. 바늘의 유형은 펜 바늘, 얇은 벽, 정상 벽, 루어(luer) 바늘을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
점도는 당업자에게 공지된 표준 기법에 의해 측정될 수 있다. "점도"는 "동점도" 또는 "절대 점도"일 수 있다. "동점도"는 중력의 영향 하에서의 유체의 저항적 흐름의 척도이다. 동일 부피의 2개 유체를 동일한 모세관 점도계에 두어 중력에 의해 흐르도록 할 때, 점성 유체는 보다 점성이 덜한 유체보다 모세관을 통과하여 흐르는데 시간이 더 걸린다. 한 유체가 그 흐름을 완성하는데 200초 걸리고, 다른 한 유체가 400초 걸린다면, 두 번째 유체는 동점도 스케일에서 첫 번째 유체의 점도의 2배이다. 동적 또는 단순 점도로도 불리는 "절대 점도"는 동점도와 유체 밀도의 곱이다: 절대 점도= 동점도×밀도
동점도의 차원은 L2/T(여기에서, L는 길이이고, T는 시간임)이다. 통상, 동점도는 센티스토크(cSt)로 표시된다. 동점도의 SI 단위는 mm2/s(이는 1 cSt임)이다. 절대 점도는 센티포이즈(cP)의 단위로 표시된다. 절대 점도의 SI 단위는 밀리파스칼-초(mPa-s)(여기에서, 1 cP = 1 mPa-s)이다.
본 발명의 내용 중에서, 환자에게 투여되는 투약량은 환자에 있어 시간에 따 른 유익한 치료적 반응 또는 적용 분야에 따른 다른 적당한 활성을 갖기에 충분하다. 투약량은 특정 벡터 또는 조제물의 효능, 및 사용되는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 치료되는 환자의 상태, 및 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 또한, 투약량의 크기는 특정 환자에서 특정 벡터, 조제물 등의 투여에 동반되는 임의의 유해한 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정된다.
질병(암, 유전적 질병, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 벡터 또는 조제물의 유효량을 결정할 때, 의사는 순환 혈장 수치, 조제물 독성, 질병의 진행, 및/또는 관련되는 경우, 항-비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생산을 평가한다.
예를 들어, 70 킬로그램 환자에게 투여되는 투약량은 전형적으로 관련 조성물의 변화된 활성 또는 혈청 반감기에 대해 조정된 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 등가의 범위에서 존재한다. 본 발명의 벡터 또는 약제학적 조제물은 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체, 생물학적 반응 개질제 등의 투여를 비롯한 임의의 공지된 통상적인 요법에 의해 치료 조건을 보충할 수 있다.
투여를 위해, 본 발명의 조제물은 관련 조제물의 LD-50 또는 ED-50, 및/또는 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태를 포함하나 이에 한정되지 않는 것에 적용되는 바와 같이 다양한 농도에서의 비천연 아미노산의 임의의 부작용의 관찰에 의해 결정되는 속도로 투여된다. 투여는 단일 투약 또는 분할 투약을 통해 달성될 수 있다.
조제물을 주입받은 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 일으키는 경우, 적당한 투여량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/고열 억제 약물을 투여한다. 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜히드라민(단, 이에 한정되지 않음)을 추가 주입하기 30분 전에 주입에 대한 반응, 예를 들어 고열, 근육통 및 오한을 경험하는 환자에게 마취 전 투약한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 더욱 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘(meperidine)을 사용한다. 반응의 심도에 따라 세포 주입을 늦추거나 중단한다.
본 발명의 인간 hGH 폴리펩티드는 포유류 대상에 직접 투여될 수 있다. 투여는 정상적으로 hGH 폴리펩티드를 대상에 도입시키는데 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 비록 임의의 소정의 경우에서의 가장 적당한 경로는 치료되는 상태의 특성 및 심도에 따라 좌우되지만, 본 발명의 실시양태에 따른 hGH 폴리펩티드 조성물은 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 통하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음), 협측(설하를 포함하나 이에 한정되지 않음), 질, 비경구(피하, 근육내, 진피내, 관절내, 흉막내, 복막내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내를 포함하나 이에 한정되지 않음), 국소(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 양쪽 모두) 및 경피 투여에 적당한 것들을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 화합물의 조제물은 단회 투여 또는 다회 투여 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이얼로 제공될 수 있다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 단위 투여량 주사가능한 형태(용액, 현탁액 또는 유화액을 포함하나 이에 한정되지 않 음)의 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 연속 주입(미니펌프, 예를 들어 삼투압 펌프를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음), 단일 볼루스(bolus) 또는 서방성 데포 조제물에 의해 투여될 수 있다.
투여에 적당한 조제물은 항산화제, 완충액, 정균제, 및 조제물에 등장성을 제공하는 용질, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 함유할 수 있는 수용액 및 비수용액, 등장성 멸균 용액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 전술된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
동결건조는 관심 단백질 제제로부터 물을 제거하는 작용을 하는, 단백질을 제공하기 위해 통상 이용되는 기법이다. 동결건조, 즉 동결건조는 건조할 물질을 먼저 동결시킨 후, 물 또는 냉동 용매를 진공 환경 중 승화에 의해 제거하는 공정이다. 부형제는 미리 동결건조된 조제물 내에 포함되어, 동결건조 공정 중 안정성을 증진시키고/시키거나 저장 시 동결건조된 생성물의 안정성을 향상시킬 수 있다. [Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30(1990) 및 Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291(1991)].
약제학적 물질의 분무 건조도 또한 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, [Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals", in Drug Dev. Ind. Pharm, 18(11 & 12), 1169-1206(1992)]를 참고한다. 소분자 약제학적 물질에 부가하여, 다양한 생물학적 물질을 분무 건조하였고, 이는 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모를 포함한다. 분무 건조는 1-단계 공정으로 액체 약제학적 제제를 미세 한, 분진이 없거나 응집된 분말로 전환시킬 수 있으므로 유용한 기법이다. 기본 기법은 하기 4 단계들을 포함한다: a) 공급 용액을 분무로 만드는 아토마이제이션(atomization); b) 분무-공기 접촉; c) 분무의 건조; 및 d) 건조된 건조 공기로부터의 생성물의 분리. 본원에 참고로 인용되는 U.S. 특허 제6,235,710호 및 제6,001,800호는 분무 건조에 의한 재조합 에리트로포이에틴의 제조를 기재한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는, 투여되는 특정 조성물, 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물(임의적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함)의 매우 다양한 적당한 제형들이 존재한다(예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed.(1985)] 참고).
적당한 담체는 인산염, 붕산염, HEPES, 시트르산염 및 다른 유기산을 함유하는 완충액, 아스코르브산을 비롯한 항산화제, 저 분자량(약 10개 미만의 잔기(단, 이에 한정되지 않음)) 폴리펩티드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린(단, 이에 한정되지 않음); 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈(단, 이에 한정되지 않음); 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신(단, 이에 한정되지 않음); 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린(단, 이에 한정되지 않음); 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 2가 금속 이온, 예를 들어 아연, 코발트, 또는 구리(단, 이에 한정되지 않음); 당 알코올, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨(단, 이에 한정되 지 않음); 염 형성 짝이온, 예를 들어 나트륨 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어((트윈(Tween) 80(폴리소르베이트(Polysorbate) 80) 및 트윈 20(폴리소르베이트 20; PS20)을 포함하나 이에 한정되지 않는) 트윈TM, 플루로닉스(Pluronics)TM 및 플루로닉산, 예를 들어 플루로닉산 F68(폴록사머(poloxamer) 188) 또는 PEG(단, 이에 한정되지 않음), 또는 PEG를 포함한다. 적당한 계면활성제는 예를 들어, 폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드), 즉 (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드), 즉 (PPO-PEO-PPO), 또는 이의 조합물을 기재로 한 폴리에테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO가 상표명 플루로닉스TM, R-플루로닉스TM, 테트로닉스(Tetronics)TM 및 R-테트로닉스TM(바스프 완도트 코포레이션(BASF Wyandotte Corp.), Wyandotte, Mich.)로 상업적으로 구입 가능하고, 또한 본원에 전체적으로 참고로 인용되는 U.S. 특허 제4,820,352호에 기재된다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체는 적당한 계면활성제일 수 있다. 한 계면활성제, 또는 계면활성제들의 조합물을 사용하여, 교반으로부터 비롯되는 응력을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 응력으로부터 PEG화된 hGH를 안정화시킬 수 있다. 상기 것들 중 일부는 "벌크화제"로 칭해질 수 있다. 그 중 일부는 또한 "긴장성 개질제"로 일컬어질 수 있다. 부가적 담체는 황화암모늄((NH4)2SO4)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 황화암모늄((NH4)2SO4)을 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM, 1 mM, 0.9 mM, 0.8 mM, 0.7 mM, 0.6 mM, 0.5 mM, 0.4 mM, 0.3 mM, 0.2 mM 및 0.1 mM을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 mM 내지 약 200 mM의 범위로 본 발명의 조제물에 사용할 수 있다. 히스티딘은 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM, 1 mM, 0.9 mM, 0.8 mM, 0.7 mM, 0.6 mM, 0.5 mM, 0.4 mM, 0.3 mM, 0.2 mM 및 0.1 mM을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 mM 내지 약 200 mM의 범위로 본 발명의 조제물에 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 히스티딘은 조제물 내에 약 5 mM 내지 약 30 mM이다.
본 발명의 조제물의 완충액은 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM, 11 mM, 10 mM, 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, 0.9 mM, 0.8 mM, 0.7 mM, 0.6 mM, 0.5 mM, 0.4 mM, 0.3 mM, 0.2 mM 및 0.1 mM을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 mM 내지 약 200 mM의 범위로 본 발명의 조제물에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 완충액은 약 0.1 mM 내지 약 200 mM의 농도이다. 일부 실시양태에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 75 mM의 농도이다. 일부 실시양태에서, 완충액은 약 1 mM 내지 약 20 mM의 농도이다. 일부 실시양태에서, 완충액은 약 5 mM 내지 약 30 mM의 농도이다. 본 발명의 조제물의 완충액은 pH 8.5, pH 8.0, pH 7.5, pH 7.0, pH 6.5, pH 6.0, pH 5.5, pH 5.0, pH 4.5 및 pH 4.0을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 pH 4.0 내지 약 pH 8.5의 pH 범위를 제공할 수 있다. pH는 상기 열거된 값들 내에 속하는 pH 값의 임의의 1/10 값이며, 예를 들어, pH 8.5, pH 8.4, pH 8.3, pH 8.2, pH 8.1, pH 8.0, pH 7.9, pH 7.8, pH 7.7, pH 7.6, pH 7.5, pH 7.4, pH 7.3, pH 7.2, pH 7.1, pH 7.0, pH 6.9, pH 6.8, pH 6.7, pH 6.6, pH 6.5, pH 6.4, pH 6.3, pH 6.2, pH 6.1, pH 6.0, pH 5.9, pH 5.8, pH 5.7, pH 5.6, pH 5.5, pH 5.4, pH 5.3, pH 5.2, pH 5.1, pH 5.0, pH 4.9, pH 4.8, pH 4.7, pH 4.6, pH 4.5, pH 4.4, pH 4.3, pH 4.2, pH 4.1 및 pH 4.0이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.3이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 pH 5.5 내지 약 8.0이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 4.0 내지 약 8.5이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 4.0 내지 약 7.5이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6.0 내지 약 7.5이다.
본 발명의 조제물의 아미노산은 100 g/L, 95 g/L, 90 g/L, 85 g/L, 80 g/L, 75 g/L, 70 g/L, 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L, 50 g/L, 45 g/L, 40 g/L, 35 g/L, 30 g/L, 25 g/L, 20 g/L, 19 g/L, 18 g/L, 17 g/L, 16 g/L, 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12 g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L, 7 g/L, 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L, 1 g/L, 0.9 g/L, 0.8 g/L, 0.7 g/L, 0.6 g/L, 0.5 g/L, 0.4 g/L, 0.3 g/L, 0.2 g/L 및 0.1 g/L을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 g/L 내지 100 g/L의 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 약 0.1 g/L 내지 60 g/L이다. 일 부 실시양태에서, 아미노산은 약 0.1 g/L 내지 100 g/L이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 약 1 g/L 내지 50 g/L이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 약 5 g/L 내지 25 g/L이다.
본 발명의 조제물의 당 알코올은 100 g/L, 95 g/L, 90 g/L, 85 g/L, 80 g/L, 75 g/L, 70 g/L, 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L, 50 g/L, 45 g/L, 40 g/L, 35 g/L, 30 g/L, 25 g/L, 20 g/L, 19 g/L, 18 g/L, 17 g/L, 16 g/L, 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12 g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L, 7 g/L, 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L, 1 g/L, 0.9 g/L, 0.8 g/L, 0.7 g/L, 0.6 g/L, 0.5 g/L, 0.4 g/L, 0.3 g/L, 0.2 g/L, 및 0.1 g/L를 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 g/L 내지 100 g/L의 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 당 알코올은 약 0.1 g/L 내지 약 60 g/L이다. 일부 실시양태에서, 당 알코올은 약 0.1 g/L 내지 약 100 g/L이다. 일부 실시양태에서, 당 알코올은 약 1 g/L 내지 약 50 g/L이다. 일부 실시양태에서, 당 알코올은 약 2 g/L 내지 약 25 g/L이다.
본 발명의 조제물의 탄수화물은 100 g/L, 95 g/L, 90 g/L, 85 g/L, 80 g/L, 75 g/L, 70 g/L, 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L, 50 g/L, 45 g/L, 40 g/L, 35 g/L, 30 g/L, 25 g/L, 20 g/L, 19 g/L, 18 g/L, 17 g/L, 16 g/L, 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12 g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L, 7 g/L, 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L, 1 g/L, 0.9 g/L, 0.8 g/L, 0.7 g/L, 0.6 g/L, 0.5 g/L, 0.4 g/L, 0.3 g/L, 0.2 g/L, 및 0.1 g/L를 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 g/L 내지 100 g/L의 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 탄수화물은 약 0.1 g/L 내지 약 100 g/L이 다. 일부 실시양태에서, 탄수화물은 약 1 g/L 내지 약 50 g/L이다. 일부 실시양태에서, 탄수화물은 약 2 g/L 내지 약 25 g/L이다. 일부 실시양태에서, 탄수화물은 약 0.1 g/L 내지 약 50 g/L이다.
본 발명의 조제물의 이당류는 100 g/L, 95 g/L, 90 g/L, 85 g/L, 80 g/L, 75 g/L, 70 g/L, 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L, 50 g/L, 45 g/L, 40 g/L, 35 g/L, 30 g/L, 25 g/L, 20 g/L, 19 g/L, 18 g/L, 17 g/L, 16 g/L, 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12 g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L, 7 g/L, 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L, 1 g/L, 0.9 g/L, 0.8 g/L, 0.7 g/L, 0.6 g/L, 0.5 g/L, 0.4 g/L, 0.3 g/L, 0.2 g/L, 및 0.1 g/L를 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 g/L 내지 100 g/L의 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이당류는 약 0.1 g/L 내지 약 50 g/L이다.
본 발명의 조제물의 단당류는 100 g/L, 95 g/L, 90 g/L, 85 g/L, 80 g/L, 75 g/L, 70 g/L, 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L, 50 g/L, 45 g/L, 40 g/L, 35 g/L, 30 g/L, 25 g/L, 20 g/L, 19 g/L, 18 g/L, 17 g/L, 16 g/L, 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12 g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L, 7 g/L, 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L, 1 g/L, 0.9 g/L, 0.8 g/L, 0.7 g/L, 0.6 g/L, 0.5 g/L, 0.4 g/L, 0.3 g/L, 0.2 g/L, 및 0.1 g/L를 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 g/L 내지 100 g/L의 범위 내일 수 있다.
본 발명의 조제물의 비이온성 계면활성제는, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.0085%, 0.008%, 0.0075%, 0.007%, 0.0065%, 0.006%, 0.0055%, 0.005%, 0.0045%, 0.004%, 0.0035%, 0.003%, 0.0025%, 0.002%, 0.0015%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, 및 0.0001%를 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.01% 내지 약 10%의 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.0001% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 10%이다. 일부 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.1% 내지 약 5%이다. 일부 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.1% 내지 약 1%이다. 일부 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.0001% 내지 약 1%이다.
본 발명의 조제물 내의 hGH의 약제학적 양은 50 mg, 49 mg, 48 mg, 47 mg, 46 mg, 45 mg, 44 mg, 43 mg, 42 mg, 41 mg, 40 mg, 39 mg, 38 mg, 37 mg, 36 mg, 35 mg, 34 mg, 33 mg, 32 mg, 31 mg, 30 mg, 29.5 mg, 29 mg, 28.5 mg, 28 mg, 27.5 mg, 27 mg, 26.5 mg, 26 mg, 25.5 mg, 25 mg, 24.5 mg, 24 mg, 23.5 mg, 23 mg, 22.5 mg, 22 mg, 21.5 mg, 21 mg, 20.5 mg, 20 mg, 19.5 mg, 19 mg, 18.5 mg, 18 mg, 17.5 mg, 17 mg, 16.5 mg, 16 mg, 15.5 mg, 15 mg, 14.5 mg, 14 mg, 13.5 mg, 13 mg, 12.5 mg, 12 mg, 11.5 mg, 11 mg, 10.5 mg, 10 mg, 9.5 mg, 9 mg, 8.5 mg, 8 mg, 7.5 mg, 7.0 mg, 6.5 mg, 6.0 mg, 5.5 mg, 5.0 mg, 4.5 mg, 4.0 mg, 3.5 mg, 3.0 mg, 2.5 mg, 2.0 mg, 1.5 mg, 1.0 mg, 0.9 mg, 0.8 mg, 0.7 mg, 0.6 mg, 0.5 mg, 0.4 mg, 0.3 mg, 0.2 mg, 및 0.1 mg을 포함하나 이에 한정되지 않는 약 0.1 mg 내지 약 50 mg의 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조제물 내의 hGH 의 약제학적 양은 약 2 mg 내지 약 30 mg이다. 일부 실시양태에서, 조제물 내의 hGH의 약제학적 양은 약 2 mg 내지 약 25 mg이다. 일부 실시양태에서, 조제물 내의 hGH의 약제학적 양은 약 0.1 mg 내지 약 30 mg이다. 일부 실시양태에서, 조제물 내의 hGH의 약제학적 양은 약 0.1 mg 내지 약 8 mg이다. 일부 실시양태에서, 조제물 내의 hGH의 약제학적 양은 약 0.5 mg 내지 약 8 mg이다. 일부 실시양태에서, 조제물 내의 hGH의 약제학적 양은 약 0.5 mg 내지 약 6 mg이다. 일부 실시양태에서, 조제물 내의 hGH의 약제학적 양은 약 1 mg 내지 약 5 mg이다.
또한, 수용성 중합체에 연결된 것들, 예를 들어 PEG를 포함하는 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 지연 방출형 시스템에 의해 또는 이의 일부로서 투여될 수 있다. 지연 방출형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐을 포함하나 이에 한정되지 않는 성형품의 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함하나 이에 한정되지 않는 것을 포함한다. 지연 방출형 매트릭스는 생체이용가능한 물질, 예를 들어 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)([Langer et al., J. Bionaed . Mater. Res., 15: 167-277(1981): Langer, Chem . Tech., 12: 98-105(1982)] 참고), 에틸렌 비닐 아세테이트([Langer et al., 이하 동문] 참고) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988), 폴리락티드(폴리아세트산)(미국 특허 제3,773,919호; EP 58,481), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산 및 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체([U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556(1983)] 참고), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘트로이친 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지 질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 지연 방출형 조성물은 리포좀으로 포획되는 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포좀은 다음과 같이 그 자체로 공지된 방법에 의해 제조된다: DE 3,218,121; [Epstein et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 82: 3688-3692(1985); Hwanget al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 77: 4030-4034(1980)]; EP 52,322: EP 36,676: EP 88,046: EP 143,949: EP 142,641: 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.
리포좀 내 포획되는 hGH 폴리펩티드는 예를 들어, DE 3,218,121; [Epstein et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 82; 3688-3692(1985); Hwang et al., Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A., 77: 4030-4034(1980)]; EP 52,322: EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008: 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 공지되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 실험적으로 결정될 수 있다. 리포좀의 일부 예는 예를 들어, [Park JW, et al., Proc. Natl. Acad . Sci . U.S.A. 92: 1327-1331(1995); Lasic D 및 Papahadjopoulos D(eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B(ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT(2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8: 1172-1181(2002); Nielsen UB, et al., Biochim . Biophys . Acta 1591(1-3): 109-118(2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161(2003)]에 기재되어 있다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.
본 발명의 내용 중에서, 환자에게 투여되는 투약량은 시간이 경과함에 따라 대상에서 유익한 반응을 일으키기 충분해야 한다. 일반적으로, 투약량 당 비경구로 투여되는 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 총 약제학적 유효량은 비록 치료적 자유 재량에 따르지만, 환자 체중 1 kg 당 일일 약 0.01 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 또는 약 0.05 mg 내지 약 1 mg 범위이다. 또한, 투여 빈도도 치료적 자유 재량에 따르며, 인간에 사용할 수 있는 것으로 승인된 상업적으로 입수가능한 hGH 폴리펩티드 산물보다 더 빈번하거나 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 PEG화된 hGH 폴리펩티드는 상기한 투여 경로들 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다.
XI. 본 발명의 hGH 폴리펩티드의 치료 용도
본 발명의 hGH 폴리펩티드는 광범위한 장애들을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 hGH 작동제 폴리펩티드는 예를 들어 성장 결핍 치료, 면역 장애 치료, 및 심장 기능 자극에 유용할 수 있다. 성장 결핍을 갖는 개인은 예를 들어, 터너 증후군을 갖는 개인, GH-결핍 개인(아동 포함), 그들의 성장판이 닫히기 약 2-3 년 전 그들의 정상 성장 곡선이 늦거나 지연되는 것을 경험하는 아동(때때로, "단신 정상 아동"이라고도 함), 및 GH에 대한 인슐린 유사 성장 인자-I(IGF-1) 반응이 화학적으로(즉, 글루코코르티코이드 처리에 의해) 또는 천연 조건에 의해 차단된 개인, 예를 들어 GH에 대한 IGF-I 반응이 천연적으로 감소된 성인 환자를 포 함한다. 본 발명의 hGH 폴리펩티드는 하기 상태들을 앓는 개인을 치료하는데 유용할 수 있다: 소아 성장 호르몬 결핍, 특발성 저신장증, 소아기 발병 성인 성장 호르몬 결핍, 성인기 발병 성인 성장 호르몬 결핍, 또는 2차 성장 호르몬 결핍. 성인기에 성장 호르몬 결핍으로 진단을 받는 성인은 뇌하수체 종양 또는 방사능을 가졌을 수 있다. 대사성 증후군, 두부 손상, 비만, 골다공증 또는 우울증을 포함하나 이에 한정되지 않는 상태는 성인에게 성장 호르몬 결핍-유사 증후군을 초래할 수 있다.
작동제 hGH 변종체는, 증가가 항체 매개 또는 세포 매개에 의한 것이든, 면역계가 hGH 폴리펩티드로 처리된 숙주에 대해 내인성이거나 공여체로부터 hGH 폴리펩티드에 제공된 숙주 수용물(골수 이식물 중)로 이식되든, 그의 면역 기능을 증가시킴으로써 포유류의 면역계를 자극시키는데 작용할 수 있다. "면역성 장애"는 약물(예를 들어, 화학요법) 치료로 인해 면역성이 감소된 소 비장을 갖는 개인의 경우를 비롯하여, 개인의 면역계가 정상적인 경우보다 감소된 항체 또는 항원에 대한 세포 반응을 갖는 임의의 상태를 포함한다. 면역성 장애를 갖는 개인의 예는 예를 들어, 노인 환자, 화학요법 또는 방사선 요법을 받는 개인, 주요 질병으로부터 회복되거나 수술을 받게 된 개인, AIDS를 앓는 개인, 선천성 및 후천성 B-세포 결핍, 예를 들어 고감마글로불린혈증, 공통 변화된 무감마글로불린혈증, 및 선택적 면역글로불린 결핍(예를 들어, IgA 결핍)을 갖는 환자, 바이러스, 예를 들어 면역 반응보다 짧은 인큐베이션 시간을 갖는 광견병에 감염된 환자, 및 유전적 장애, 예를 들어 디조지(diGeorge) 증후군을 앓는 개인을 포함한다.
본 발명의 hGH 길항제 폴리펩티드는 거인증 및 선단 비대증, 당뇨병 및 당뇨병으로부터 유발되는 합병증(당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증), 혈관 안구 질병(예를 들어, 증식성 혈관신생 포함), 신증, 및 GH-반응성 암(GH-responsive malignancy)의 치료에 유용할 수 있다.
혈관 안구 질병은 예를 들어, 망막병증(예를 들어, 미숙 또는 낫모양 세포 빈혈증에 의해 유발됨) 및 근육 퇴행을 포함한다.
GH-반응성 암은 예를 들어, 윌름 종양(Wilm's tumor), 육종(예를 들어, 골원성 육종), 유방암, 결장암, 전립선암, 및 갑상선암, 및 GH 수용체 mRNA를 발현하는 조직의 암(즉, 태반, 흉선, 뇌, 타액선, 전립선, 골수, 골격근, 기관, 척수, 망막, 림프절, 및 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma), 직장결장 암종, 폐 암종, 림프모구 백혈병 및 흑색종으로부터의 암)을 포함한다.
본 발명의 GH, 예컨대 hGH 작동제 폴리펩티드는 예를 들어, 만성 신부전, 만성 신장 기능부전(CRI) 관련 성장 부전, 터너 증후군 관련 단신, 소아 프라더 윌리 증후군(PWS), 쇠약 또는 악액질의 HIV 환자, 부당 경량아(SGA), 비만 및 골다공증을 치료하는데 유용할 수 있다.
hGH의 평균 양은 변할 수 있고, 특히 자격을 갖춘 의사의 권장 및 처방에 기초해야 한다. hGH의 정확한 양은 치료되는 상태의 정확한 유형, 치료되는 환자의 상태, 및 조성물 내 다른 성분과 같은 인자들에 대한 선호 대상의 문제이다. 제공되는 양은 hGH을 사용한 요법을 기초로 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상적 방식으로 제조될 수 있다.
XII. 제조 물품
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조제물을 함유하고, 그것의 사용에 관한 설명서를 제공하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기를 포함한다. 제조 물품은 동결건조 형태, 액체 형태, 분무 건조 형태, 냉동 형태 또는 기타 형태를 포함하나 이에 한정되지 않는 본 발명의 조제물, 및 필요한 경우, 그것의 제조 또는 재구성을 위한 설명서도 포함할 수 있다. 적당한 용기는 예를 들어, 병, 바이얼, 주사기, 자동 주입 장치 및 시험관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질들로부터 형성될 수 있다. 용기는 조제물을 보유하고, 용기 상에 있거나 용기와 연합된 표지는 필요한 경우, 동결건조된 조제물의 재구성, 및/또는 사용을 위한 지시를 가리킬 수 있다. 예를 들어, 표지는 조제물이 특정 단백질 농도가 되도록 재구성됨을 가리킨다. 표지는 조제물이 피하 투여에 유용하거나 그것을 위해 의도된 것임을 추가로 가리킬 수 있다. 조제물 보유 용기는 일회용 또는 다회용 바이얼일 수 있다. 한 실시양태에서, 조제물 보유 용기는 일회용 바이얼이다. 제조 물품은 적당한 희석제를 포함하는 2차 용기를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 적당한 희석제는 무균수 또는 정균 주사용수, USP이다. 필요한 경우, 희석제와 동결건조된 조제물을 혼합할 때, 조제물 내 최종 단백질 농도는 일반적으로 약 2 mg/ml 내지 약 50 mg/ml일 수 있다. 필요한 경우, 희석제와 동결건조된 조제물을 혼합할 때, 조제물 내 최종 단백질 농도는 일반적으로 약 2 mg/ml 내지 약 25 mg/ml일 수 있다. 조제물 내 최종 단백질 농도는 일반적으로 약 2 mg/ml 내지 약 25 mg/ml일 수 있다. 한 실시양태에서, 최종 단백질 농도는 약 8 mg/ml이다. 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 포장 삽입물을 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하기 실시예는 청구하는 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이므로, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1 Met- Y35pAF hGH 의 조제물을 위한 물질 및 방법
이 실시예는 PEG와 접합하기 전 저장하는 동안 Met-Y35pAF hGH의 단백질 구조 및 활성을 보존하는 적당한 조건 및 부형제를 확인하고 평가한 조제물 연구를 기재한다. hGH의 액체 조제물은 1) 2.5 g/L 중탄산나트륨, 20 g/L 글리신, 2 g/L 만니톨, 2 g/L 락토스(pH 7.3); 또는 2) 시트르산나트륨, 20 g/L 글리신, 5 g/L 만니톨(pH 6.0)을 함유하는 냉동 조제물이다. 0.5-4 mg/ml의 평가 투여량의 PEG-hGH가 활성 성분으로서 첨가된다. 이 조제물은 현재 -20℃에서 저장된다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH의 단일-투약 동결건조된 조제물, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH의 액체 조제물의 개발이 요망된다.
방법
Met-Y35pAF hGH의 물리적 및 화학적 안정성을 특징화하기 위해 수가지 방법들이 수행되었다. 이 방법들은 PEG화된 hGH를 이용한 조제물 연구에 사용될 수 있다.
환원성 겔(SDS-PAGE-R)을 갖는 SDS-PAGE는, 이 기법이 모든 디술피드 결합이 완전히 절단되고, 폴리펩티드가 완전히 펼쳐지도록 하기 때문에, 분자량에만 기초하여 hGH를 분리하여, 잠정적 분해 생성물이 가시화되도록 하였다. 비환원성 겔(SDS-PAGE-NR)을 갖는 SDS-PAGE는, 단백질이 환원제 없이 풀리고, 이에 디술피드 결합이 비변형상태로 남기 때문에, 분자량에 기초하여 분자를 분리하여 hGH의 잠정적 이량체가 확인되도록 하였다.
열 변성으로 인한 풀림 ΔH(엔탈피)를 측정하기 위해 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하였다. 이 기법은 단백질의 총 융점(Tm)의 증가 또는 감소로 반영되는 단백질 안정성에 대한 상이한 용액 조건 및 부형제의 영향을 평가하였다. 사용된 또 다른 기법은 상대적 소수성에 기초하여 분자를 분리하는 역상 HPLC(RP-HPLC)였다. 구체적으로, 이 방법은 탈아미드화 및 산화와 같은 구조적 변형과 관련된 체류 거동 및 소수성의 미묘한 차이에 기초하여 hGH를 분리하는데 사용되었다.
매트릭스 및 용액
U.S.P.(U.S. 약전) 등급 또는 고 분석 등급 부형제를 이용하여, 48가지 조합의 조제물 매트릭스를 고안하였다. 사용된, 매트릭스, 샘플 제조 및 절차는 하기와 같다(표 1):
A B C D E F G
부형제* 20 mM 아세트산나트륨 pH 4.5 20 mM 시트르산나트륨 pH 6.0 50 mM 히스티딘 pH 6.5 50 mM 인산나트륨 pH 7.0 50 mM 중탄산나트륨 pH 7.3 50 mM HEPES pH 7.5
1 비첨가
2 15 mM 트레할로스
3 15 mM 수크로스
4 15 mM 만니톨
5 75 mM (NH4)2SO4
6 250 mM 글리신
7 250 mM 아르기닌
8 100 mM 글루타메이트
모든 부형제들의 스톡을 멸균 여과하고, 데이팅하며, 4℃에서 저장하였다. 당을 100 mM 스톡으로 제조하였고, (NH4)2SO4를 1 M 스톡으로 제조하였으며, 아미노산을 1 M 글리신, 666 mM 아르기닌, 또는 1 M 글루타메이트의 스톡 농도로 제조하였다.
특정 완충액을 250 mM 내지 1 M 스톡(멸균 여과 및 데이팅됨)으로 실험 당일에 제조하였고, 부형제를 최종 농도가 되도록 첨가하였으며, 멸균 여과하여, 4℃에서 저장하였다.
샘플 제조
WHO 완충액 중 위치 35에서 치환된 비천연 아미노산 p-아세틸-페닐알라닌을 갖는 메티오닐-hGH의 샘플(MetY35pAF cB1)을 4.425 mg/ml로 6개의 상이한 바이얼에 할당하여, 연구 당일까지 -80℃에서 냉동시켰다. 실험 당일에, MetY35pAF를 0.1 내지 0.5 mL 슬라이드-a-라이저에서 투석에 의해 4℃에서 특정 완충액으로 완충액 교환하였다. 대략 800 μl의 425 mg/ml Met-Y35pAF hGH를 4시간 이상 동안 250 mL 완충액에서 투석하였고, 투석 완충액을 교환하여(250 mL), 하룻밤 동안 투석하였다. 500 mL의 사용으로 WHO 완충액 부형제의 10,000,000배 희석물을 얻었다.
투석에서 샘플을 제거하고, 농도를 측정하였다. 각 샘플을 적절한 농도가 되도록 희석하였다. DSC에 있어, 원하는 최종 농도는 0.75 mg/ml(450 ul 부피)였다. RP-HPLC에 있어, 최종 농도는 2 mg/ ml(30 ul 부피)였다. 10개 샘플을 매트릭스의 개별군에 대해 RP-HPLC로 분석하였다. 4가지 시점(3일, 1주, 2주 및 1개월)을 위한 충분한 샘플을 4℃에서 관에 저장하였다. 5회 냉동/해동 사이클을 위한 충분한 샘플을 -80℃에서 바이얼에서 저장하였다. 이 연구의 일부로서 완료된 일정 수의 냉동/해동 사이클(1, 2, 3, 4 및 5회 사이클) 전에 부가적 냉동/해동 사이클을 행했을 수 있다. 4℃에서 0 시점에 대한 샘플을 즉시 HPLC 바이얼에 두었다.
SDS-PAGE-R에 대해, 30 ug(2 mg/mL로 0.015 mL)의 물질을 분석에 사용하였다. 샘플을 RP-HPLC을 위해 지정된 3개 바이얼에 분취하였다.
SDS-PAGE-NR에 대해, 30 ug(2 mg/mL로 0.015 mL)의 물질을 분석에 사용하였다. 샘플을 RP-HPLC을 위해 지정된 3개 바이얼에 분취하였다. 모든 경우들에서, 임의의 나머지 샘플을 -80℃에서 즉시 냉동시켰다.
실시예 2 Met - Y35pAF hGH 에 대한 조제물 연구의 결과
완충액 pH
모든 조제물 완충액의 pH를 4℃에서 6주 후에 분석하였다. 표 1에 나와 있는 바와 같이, 중탄산나트륨 완충액(군 E)을 제외하고는, 모든 완충액의 pH가 6주 기간에 걸쳐 안정하였음이 밝혀졌다. 군 E의 pH는 시간 경과에 따라 증가하였다.
SDS-PAGE-R 및 SDS - PAGE - NR
SDS-PAGE 환원성 및 비환원성 겔을 갖는 샘플의 분석은, 5회 냉동/해동 사이클 동안 4℃에서 4주(1개월) 후에 변화가 없음을 나타냈다. 이 방법에 의해 이량체 형성 또는 분해 생성물이 밝혀지지 않았다. 군 A에 대한 환원성 겔(4℃에서 t=0, t= 4주)은 도 2C 및 2D에 나와 있는 바와 같고, 군 B에 대한 비환원성 겔(4℃에서 t=0, t= 4주)은 도 2 A 및 2B에 나와 있는 바와 같다.
시차 주사 열량계( DSC )
MetY35pAF hGH의 열 안정성에 대한 완충액 및 부형제의 영향이 도 3 내지 8에 나와 있다. 도 3A-F는 조제물 군 A-F의 중첩 써모프로파일을 나타낸다. 도 5는 전체 매트릭스에 대한 DSC 융점 및 Tm 변화를 요약된 표를 제공한다. 매트릭스의 B7 및 F2로부터의 써모프로파일이 도 4A-B에 나와 있다.
완충액 A는 도 5 및 6에 나와 있는 바와 같은 최저의 Tm를 입증하였다. 아르기닌은 도 5 및 6에서 매트릭스의 B7 및 C7에 나와 있는 바와 같이, 군 B 및 C에서 Tm를 증가시켰다. 보다 높은 pH(즉, pH > 7.0)에서, MetY35pAF hGH는 보다 큰 열안정성을 나타냈으나; 도 3 및 4에 나와 있는 바와 같이 보다 높은 융점 및 보다 넓은 곡선을 갖는 부가적 부분모집단이 나타났다. 이 부분모집단은 보다 큰 안정성 또는 응집 경향을 나타낼 수 있다. 아미노산, 특히 Arg 및 Glu, 및 (NH4)2SO4는 보다 높은 pH에서 Tm를 감소시켰다. 당은 전반적 Tm에 영향을 미치지 않았다.
도 7에 나와 있는 바와 같이, ΔHv/ΔH의 비를 모든 군에 대해 분석하였다. 재조합 hGH는 ΔHv/ΔH > 4를 나타내는 것으로 알려져 있다. 이 비의 편차가 관찰되었다. 이 값은 MetY35pAF의 풀림이 비가역적임을 입증한다. pH가 증가함에 따라, 부가적 부분모집단이 동정되었다(군 F의 제2 부분모집단에 대한 비도 또한 도 7에서 pH 7.5에서 플로팅함). 각 샘플의 엔탈피(AUC) 변화는, 보다 높은 pH에서의 변화를 제외하고는, 도 8에 나와 있는 바와 같이 유사하였다. 보다 높은 pH에서의 ΔH의 차는 결여된 넓은 전이로 인한 것일 수 있고, 이는 보다 낮은 AUC를 설명한다. ΔH(피트(fit의 AUC)를 각 군에 대해 플로팅하여, 각 군 내에서 유사한 값들이 수득됨을 확인하였다.
역상 HPLC( RP - HPLC )
RP-HPLC를 사용하여, 4주 동안 4℃에서 저장하는 동안의 MetY35pAF hGH의 순도 및 화학적 분해를 분석하였다. WHO hGH 표준물질을 갖는 MetY35pAF hGH를 각기 포함하는 군 B, C, E 및 F에 대한 데이터세트가 도 9A-D에 나와 있다. 도 10A는 군 E5에 존재하는 상이한 피크들(주요 피크, 1차 탈아미드화/산화 피크, 및 2차 탈아미드화 피크)을 분석함에 있어 아질런트 켐스테이션 소프트웨어의 사용을 도시한다. 1차 탈아미드화/산화 피크는 도 10B 및 11에 나와 있는 바와 같이 군 E에 있어 시간 경과에 따라 증가하였고; 또한 보다 높은 pH는 보다 낮은 pH보다 더 많은 양의 탈아미드화/산화를 나타냈다. 도 12는 2차 탈아미드화/산화 피크가 모든 조제물 군에 있어 시간 경과에 따라 덜한 가변성을 나타냄을 보여준다. 도 13에 나와 있는 바와 같이 주요 GH 피크는 모든 조제물 군에 대해 감소하였으나, 군 B 및 C는 다른 군에 비해 덜한 감소를 나타냈다. 군 A는 매우 적은 탈아미드화를 나타냈으나, 주요 GH 피크는 시간 경과에 따라 감소하였고, 알려진 탈아미드화/산화 피크 이외의 부가적 피크는 시간 경과에 따라 발달하지 않았다. 그러나, 군 A의 데이터는 MetY35pAF가 이 pH에서 0 내지 3일에 매우 안정함(이는 PEG화 반응이 1 내지 2일에 걸쳐 pH 4.0에서 일어나기 때문에 중요함)을 나타낸다.
RP-HPLC를 또한 사용하여, 냉동-해동 사이클을 겪은 샘플을 분석하였다. B 및 C 내의 개별군은 도 14(1차, 탈아미드화/산화 피크) 및 도 15(2차 탈아미드화 피크)에 나와 있는 바와 같이 유사한 것으로 보였다. 2회 냉동/해동 사이클 후, 주요 GH 피크는 도 16에 나와 있는 바와 같이 감소하였고, 이는 냉동/해동 효과를 가리킨다. 그러나, 이 조제물 연구의 개시 전에 1 또는 2회 냉동/해동 사이클이 이 샘플에서 일어났다.
결과의 요약
hGH는 보다 낮은 pH에서 매우 가요성인 구조를 나타내고, hGH가 보다 높은 pH에서 매우 경질인 구조를 형성함이 잘 확립되어 있다[Kasimova et al. J. Mol. Biol. 2002 318: 679-695].
시험한 완충액들 중, pH 6.0의 완충액 B(20 mM 시트르산나트륨)가 MetY35pAF hGH의 화학적 및 열역학적 안정성에 대해 최적으로 수행함이 밝혀졌다. pH 6.0의 아르기닌 첨가는 MetY35pAF hGH의 열안정성을 증가시켰다. 이 시점에서, 당은 MetY35pAF hGH에 대해 어떠한 양 또는 음의 영향을 미치지 않았으나; 당은 PEG화 현상 전 및 후의 pH 이동에 있어 중요할 수 있다. 시간 경과에 따른 옥심 연결기는 또한 pH 7.5와 같은 보다 높은 pH에서보다 pH 6.0에서 더 안정하기 쉽다.
실시예 3
PEG-hGH의 안정성 프로파일을 가속화 안정성 조건 하에 핵심 제형 매개변수로 조사하고, 주요 분해 생성물을 동정하며, 안정성 표시 검정을 확인한다. 단일-투약 조제물 개발의 주요 목적은 냉장 온도에서 충분한 저장 안정성을 최소로 가지고, 주변 온도에서 저장될 때 충분한 저장 안정성을 가지는 조제물을 최적화하는 것이다. 동결건조된 조제물 개발에 부가하여, 부가적 연구로서 광 노출 및 교반에 대한 민감도, PEG화된 hGH 및 비-PEG화 형태의 구분을 위한 RP-HPLC 방법의 개발, 구조적 분석, 및 기타 연구를 조사한다. 성공적인 동결건조된 조제물은 정상적으로 하기 특성을 나타낸다: 제형 및 충전-마무리 동안의 취급에 대한 용액 중 안정성, 동결건조 중의 양호한 저장 안정성, 건조된 상태(관련된 경우에 한해)의 본연의 구조, 명료한 샘플 붕괴 또는 용융 파괴(melt back)의 부재, 최적의 수분 함량 수준, 높은 유리 전이 온도, 울퉁불퉁한 케이크 구조, 효율적인 건조 사이클, 최소의 주사 연관 통증, 및 재구성 시 1분 이내 물-충전 주사제 내의 용해. 일부 실시양태들에서, 최적의 수분 함량 수준은 동결건조된 조제물에 있어 <3% 물이다. 바람직한 실시양태들에서, 최적의 수분 함량 수준은 동결건조된 조제물에 있어 <1% 물이다.
제형 변수를 결정한다. 동결건조된 조제물 후보물질의 안정성을 4주, 6주 및 2개월 이하 동안 각 주 일정 시점에서 40℃, 주변 온도 및 냉장 온도에서 조사한다. 또한, 동결건조된 조제물 후보물질의 안정성을 3, 4 및 6개월 증가분 시점 이하 동안 주변 온도 및 냉장 온도에서 조사한다. 1주 동안 2 내지 8℃에서 저장하는 동안 각 조제물의 재구성된 형태의 안정성도 또한 시험한다. 분석 방법은 상기 SDS-PAGE 방법, SEC-HPLC, 이온-교환 HPLC, RP-HPLC 및 기타 구조적 분석들을 포함한다.
가장 안정한 조제물에 대한 동결건조 사이클의 최적화에 유용한 기본 매개변수를 결정한다. 예를 들어, 붕괴 온도(또는 유리 전이 온도), 어닐링 온도, 및 냉동 조제물의 기타 중요 물리적 성질을 결정한다. 시험 동결건조 공정을 수행하여, 최적화된 사이클을 갖는 이상적인 케이크가 수득될 수 있음을 확인한다.
실시예 4
역상 고성능 액체 크로마토그래피( RP - HPLC )
역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)는 상대적 소수성에 기초하여 분자를 분리하는 기법이다. 샘플을 탄화수소 사슬에 공유 결합된 실리카의 정지상 상에 통과시킨다. 관심 분자를 정지상에 의해 지연시키고, 단일용매(isocratic)의 용매로 용리한다. 크로마토그래피 용리 시간은 특별한 분자에 대해 특징적이다. 이 방법은 탈아미드화와 같은 구조적 변형과 관련된 체류 거동 및 소수성의 미묘한 차이에 근거하여 hGH를 분리한다.
C4 RP-HPLC를 사용하여, 재조합 인간 성장 호르몬(hGH)의 상대적 순도 및 잠정적 화학적 분해(탈아미드화 및 산화)를 평가하였다. 이 방법을 사용하여, hGH의 동정 및 순도 평가를 지지하였다. 이 기법을 이용하여, hGH의 몇가지 부분적 분해 생성물을 관찰하였다. 이 기법에 대한 참고 문헌은 [유럽 약전 2002, p. 193; 영국 약전 2001, p.1938-1939; 및 "A Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatographic Method for Characterization of Biosynthetic Human Growth Hormone" by R.M. Riggin et al. Analytical Biochemistry 167, 199-209(1987)]을 포함한다.
이 절차를 위한 장비는 하기 또는 이와 균등한 것을 포함하였다: UV/Vis 분광광도계(아질런트 8453 또는 이와 균등한 것); 50 ul 석영 큐벳; PD-10, Nap-10, 또는 Nap 5 탈염 칼럼(샘플 부피에 의존; 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) Nap5 칼럼 17-0853-02 또는 이와 균등한 것); 0.5 mL 비바스핀(Vivaspin) 농축기(필요한 경우; 비바사이언스(Vivascience) 10,000 MWCO, PES, VSO102 또는 이와 균등한 것); HPLC 바이얼 및 캡(알테크(Alltech) 100 ul 스크류 캡 폴리프로필렌 바이얼 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개방 홀 스크류 캡 #73044, 또는 이와 균등한 것); 클린(clean) 1 및 2 L 유리 병; 칼럼, 예컨대 바이닥(Vydac) C4 214TP54, C4-실리카 역상 HPLC 칼럼(치수: 4.6×250 mm, 입자 크기: 5 μ, 및 세공 크기: 3OθA; 및 선형 구배를 실행할 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기기(예컨대, 진공 탈기장치, 4차 펌프, 온도조절 오토샘플러, 온도조절 칼럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD), 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 아질런트 1100 HPLC).
이 절차를 위한 시약은 달리 지시되지 않는 한, 분석적 등급 이상인 고체 화학물질, 및 HPLC 등급 이상인 용매를 포함하였다. 그러한 화학물질의 예는 트리스 - 트로메타민, U.S.P. 등급, 스펙트럼 TR149, 또는 이와 균등한 것; N-프로판올, HPLC 등급, 99.9%, 시그마 알드리히(Sigma Aldrich) 34871, 또는 이와 균등한 것; 및 중탄산암모늄, 울트라 >99.5%, 플루카(Fluka) # 09830, 또는 이와 균등한 것을 포함한다. 부가적 용액은 탈아미드화 조절용 완충액(30 mM 중탄산암모늄, pH 9.0) 및 이동상 용액을 포함한다. 탈아미드화 조절을 위한 완충액을 위해, 2.37 g의 중탄산암모늄을 0.95 L 밀리-Q(Milli-Q) H2O에 용해시키고, NaOH를 이용하여 pH를 9.0로 조정하며, 부피가 밀리-Q H2O로써 1 L가 되도록 하였다. 수득되는 완충액을 0.22 μm PES 필터(코닝(Corning) #431098, 또는 이와 균등한 것)를 이용하여 멸균 여과하였다. 이동상 용액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.5 및 29% n-프로판올))을 이용하여, 6.05 g 트로메타민(USP 등급, 스펙트럼 #TR149, 또는 이와 균등한 것)을 0.95 L 밀리-Q H2O에 용해시켰다. 용액을 HCl을 이용하여 pH 7.5로 조정하였고, 밀리-Q H2O를 이용하여 부피가 1 L가 되도록 하였다. 두 용매(트리스 및 프로판올)를 혼합하고, 혼합물을 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098, 또는 이와 균등한 것)를 이용하여 멸균 여과시켰다.
RP-HPLC에서 표준물질로 사용하기 위한 샘플은 1.0 ml의 물을 이용하여 1.9-2.1 mg/ml로 재구성된 세계보건기구(WHO) hGH(분류 번호 98/574)을 포함하였다. 다른 hGH 참고 기준물질을 1.9-2.1 mg/ml 농도로 사용할 수 있다. 분리 용액을 위해, hGH 표준물질을, PD-10, Nap-10, 또는 Nap-5 탈염 칼럼을 이용하여 30 mM 중탄산암모늄(pH 9.0) 완충액으로 완충액 교환한다. 0.5 mL 비바스핀 농축기를 이용하여 표준물질을 1.9-2.1 mg/ml로 농축시키고, 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 분석을 위해 시험 물질을 2.0 mg/ml 단백질 농도로 희석하였다. 표준 기법을 이용하여, 샘플 농도를 측정하였다.
절차
기기를 하기 조건으로 설정하였다: 1) 칼럼: 바이닥 C4 214TP54 칼럼; 2) 펌프 설정 - 구배: 단일용매; 유속: 0.5 ml/분; 지속기간: 90 분; 최대 압력: 200 bar; 3) 오토샘플러 온도: 4℃; 4) 인젝터 설정 - 주입: 표준물질' 주입; 주입 부피: 20 μl; 인출 속도: 100 μl/분; 바늘 세정: 물로 100 ul; 주입 속도: 100 μl/분; 중단 시간: 펌프에 따라; 5) DAD 신호-표 2; 피크 폭 >0.1 분; 슬릿: 4 nm; 중단 시간: 75 분;
샘플 Bw 참고물질 Bw 단위
220 4 600 100 nm
276 4 600 100 nm
214 8 600 100 nm
220 4 600 100 nm
6) 칼럼 온도조절기 - 온도: 45℃; 저장: 온도; 7) 예비 적분 현상 - 기울기 민감도: 0.1; 피크 폭: 0.5; 면적 리젝트(Area Reject): 1.0; 높이 리젝트(Height Reject): 1.0; 적분 온(ON): 10분.
칼럼을 10 칼럼 부피(41.5 ml = 0.5 ml/분으로 83분)의 이동상으로 평형화하였다. 20 μl의 표준물질을 오토샘플러를 이용하여 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. WHO 표준물질의 체류 시간이 33 내지 35분이 아닌 경우, 또는 기타 다른 표준물질이 37 내지 40분이 아닌 경우, 이동상 조성물을 조정하였고, 칼럼을 재평형화하였고, 표준물질을 재실행하였다. 제시된 조정은, 체류 시간이 33분 미만인 경우, 이동상의 리터 당, 5 ml 미만의 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5)을 첨가하는 것을 포함하였고, 체류 시간이 35분 초과인 경우, 2 ml 미만의 n-프로판올을 첨가하는 것을 포함하였다. 프로판올의 증발이 일어날 수 있으므로, 샘플을 시험하는 각 날에 표준물질을 실행하였고, 이에 따라 완충액을 조정하였다.
20 μl의 분리 용액을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 데스아미도-hGH가 주요 피크 대비 약 0.85의 체류 시간에서 작은 피크로 나타났다. hGH 및 데스아미도-hGH에 상응하는 피크들 간의 간격이 1.0 이상이고, hGH 피크의 대칭 인자가 0.8 내지 1.8인 경우가 아니라면, 시험은 유효하지 않았다. 20 μl의 시험 물품을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 샘플을 세 벌로 실행하였다. 평균 체류 시간을 보고하였다.
PEG화된 hGH 및 다른 형태를 분석하기 위해, 각종 조건 및/또는 매개변수에 대한 변형이 필요할 수 있다. RP-HPLC에 대한 변형은 당업자에게 공지되어 있다.
데이터 분석
시험 물품의 평균 체류 시간을 표준물질과 비교하였다. 시험 물품의 평균 순도를 [(주요 피크의 적분 면적/모든 피크들의 적분 면적)×100%]에 의해 계산하였다. 용매로 인한 임의의 피크(들)를 무시하였다.
WHO hGH 표준물질을 갖는 MetY35pAF hGH에 대한 RP-HPLC의 결과가 표 3 및 도 17에 제공된다. 시험 물품 및 참고 기준물질 간의 체류 시간 차이, 및 순도와 같은 명세 사항은 상이한 분자 또는 분자 형태에 따라 변화할 수 있다(즉, metY35pAF hGH 대비 Y35pAF hGH).
체류 시간(분) 면적 면적율(%) 대칭 해상도
WHO
주요 피크 34.4 36576 99.3 0.86
탈아미드화 WHO
탈아미드화 피크 28.069 4920 11.05
주요 피크 33.746 38180 85.76 1.54
MetY35pAF
주요 피크 42.307 31432 96.08 0.69
탈아미드화 MetY35pAF
탈아미드화 피크 34.461 5225 16.67 1.72
주요 피크 42.034 24534 78.28
MetY35pAF (2)
주요 피크 41.938 30304 96.16 0.69
탈아미드화 MetY35pAF (2)
탈아미드화 피크 34.209 5039 16.74
주요 피크 41.495 23716 78.82 1.69
실시예 5
크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)은 이동상 분자에 의해 투과되는 다공성 매트릭스로서 정지상을 이용하는 기법이다. 세공 구조에 들어가기에 충분히 작은 샘플 분자는 지연되는 반면, 보다 큰 분자는 배제되므로, 칼럼을 통해 급속히 운반된다. 따라서, 크기 배제 크로마토그래피는 크기에 의한 분자를 분리시키고, 크로마토그래피 용리 시간은 특별한 분자에 대해 특징적이다. SEC-HPLC를 사용하여, 재조합 인간 성장 호르몬(hGH) 효능을 평가하였다.
SEC-HPLC는 단량체(PEG화 및 비-PEG화) hGH의 백분율을 결정하는 방법이다. 이 기법을 이용하여 이량체 및 기타 고분자량 단백질이 관찰가능하다. 따라서, 이 기법은 PEG화 형태와 비-PEG화 형태뿐만 아니라, 샘플 내 단량체를 이량체 및 기타 고분자량 물질과 구분한다. 이 기법에 관한 참고문헌은 [유럽 약전 2002, p. 193; 영국 약전 2001, p.1941; 및 "High-Performance Size-Exclusion Chromatographic Determination of the Potency of Biosynthetic Human Growth Hormone Products" by R.M. Riggin et al. Journal of Chromatography 435(1988), p. 307-318]을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이 절차를 위한 장비는 하기 또는 이와 균등한 것을 포함하였다: UV/Vis 분광광도계(아질런트 8453 또는 이와 균등한 것); 50 ul 석영 큐벳; 0.5 mL 비바스핀 농축기(필요한 경우: 비바사이언스 10,000 MWCO3 PES, VSO102 또는 이와 균등한 것); HPLC 바이얼 및 캡(알테크 100 ul 스크류 캡 폴리프로필렌 바이얼 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개방 홀 스크류 캡 #73044, 또는 이와 균등한 것); 깨끗한 1 및 2 L 유리 병; 치수: 4.6×35 mm, 및 4 μ 입자 크기를 갖는 가드 칼럼과 함께, 토소하스(Tosohaas) TSK 슈퍼(Super) SW3000 18675 및 슈퍼 SW 가드 칼럼 18762, 치수: 4.6×300 mm, 입자 크기: 4 μm, 및 세공 크기: 250 Å를 갖는 실리카-기재 크기 배제 HPLC 칼럼과 같은 칼럼; 선형 구배를 수행할 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기기(예컨대, 진공 탈기장치, 4차 펌프, 온도조절 오토샘플러, 온도조절 칼럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD), 굴절율 검출기(RID) 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 아질런트 1100 HPLC).
이 절차를 위한 시약은 달리 지시되지 않는 한, 분석적 등급 이상인 고체 화학물질, 및 HPLC 등급 이상인 용매를 포함하였다. 그러한 화학물질의 예는 일염기성 인산나트륨, 스펙트럼 U.S.P. 등급 S0130, 또는 이와 균등한 것; 이염기성 인산나트륨, 스펙트럼 U.S.P. 등급 S0140, 또는 이와 균등한 것; 2-프로판올, 피셔(Fisher) HPLC 등급 A451-4, 또는 이와 균등한 것을 포함하였다. 부가적 용액은 이동상 용액(97%의 63 mM 인산나트륨 pH 7.0; 3%의 2-프로판올) 및 용액 A를 포함한다. 이동상 용액을 제조하기 위해, 26.8 g의 이염기성 인산나트륨을 1 L 밀리-Q H2O에 용해시키고, 13.79 g의 일염기성 인산나트륨을 1 L 밀리-Q H2O에 용해시켰다. 두 용액을 혼합하여, pH 7.0의 인산나트륨 완충액을 제조하였다. 100 mM 인산나트륨, pH 7.0 완충액을, 밀리-Q H2O를 이용하여 63 mM로 희석시켰다. 970 ml의 63 mM 인산나트륨(pH 7.0)을 30 ml의 2-프로판올(또는 97%의 63 mM 인산나트륨(pH 7.0), 3%의 2-프로판올을 수득하기에 적당한 기타 적절한 부피)과 혼합하였다. 수득되는 완충액을 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098, 또는 이와 균등한 것)를 이용하여 멸균 여과하였다. 용액 A는 25 mM 인산나트륨(pH 7.0)이다. 250 ml의 10OmM 인산나트륨(pH 7.0) 완충액을 750 mL 밀리-Q H2O로 희석하였다. 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098, 또는 이와 균등한 것)를 이용하여, 수득되는 완충액을 멸균 여과하였다.
SEC-HPLC에서 표준물질로 사용하기 위한 샘플은 1.0 ml의 물을 이용하여 1.9-1.1 mg/ml로 재구성된 세계보건기구(WHO) hGH(분류 번호 98/574)을 포함하였다. 1.9-1.1 mg/ml 농도로 다른 hGH 참고 기준물질을 사용하였다. 분리 용액을 위해, hGH 표준물질을, 12 내지 24시간 동안 50℃에서 인큐베이션하고, 용액 A에 용해시킨 후, 용액 A로 1 mg/ml로 희석하고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 시험 물질을 1.0 mg/ml로 희석하였다. 표준 기법을 이용하여, 샘플 농도를 측정하였다.
절차
기기를 하기 조건으로 설정하였다: 1) 칼럼: TSK 슈퍼 SW3000 18675 및 가드 칼럼 18762 오토샘플러; 2) 온도: 실온; 3) 펌프 설정 - 구배: 단일용매; 유속: 0.3 ml/분; 지속기간: 25 분; 최대 압력: 120 bar; 4) 인젝터 설정 - 주입: 표준물질 주입; 주입 부피: 20 μl; 인출 속도: 100 μl/분; 주입 속도: 100 μl/분; 바늘 세정: 100 ul H2O; 중단 시간: 펌프에 따라; 4) DAD 신호 - 표 4; 피크 폭 >0.05 분; 슬릿: 2 nm; 중단 시간: 펌프에 따라;
샘플 Bw 참고물질 Bw 단위
214 4 600 100 nm
276 4 600 100 nm
220 8 600 100 nm
280 4 600 100 nm
250 8 600 100 nm
5) RID 신호 - 온도: 35℃; 반응 시간: >0.2분 4s, 표준물질; 6) 칼럼 온도조절기: 온도: 23 ℃; 저장: 온도.
칼럼을 10 칼럼 부피(50 ml = 0.3 ml/분으로 166분)의 이동상으로 평형화하였고, 샘플을 주입하기 전, RID를 20분 동안 퍼징하였다. 20 μl의 분리 용액을 주입하였다. 수득된 크로마토그램에서, 1) 주요 비-PEG화 피크가 대략 13 내지 13.5분의 체류 시간에서 용리하였고, 2) hGH 이량체에 상응하는 피크는 대략 12.2 내지 12.6분의 체류 시간에서 용리하였으며, 3) 보다 높은 분자량의 단백질(비-PEG화)은 7.4 내지 8.0분의 상대적 체류 시간에서 용리하였다. 주요 PEG화 피크는 대략 8.3 내지 8.8분의 체류 시간에서 용리하였다. 20 μl의 표준물질을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 20 μl의 시험 물품을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 샘플을 세 벌로 실행하였다. 평균 체류 시간을 기록하였다.
PEG화된 hGH 또는 다른 형태를 특징화하기 위해, 각종 조건 및/또는 매개변수에 대한 변형이 필요할 수 있다. SEC-HPLC에 대한 변형은 당업자에게 공지되어 있다.
데이터 분석
hGH 시험 물품의 체류 시간을 표준물질과 비교한다. 비-PEG화된 hGH의 순도 결정을 위해, hGH 시험 물품 및 표준물질의 적분된 주요 피크 면적을 비교하고, hGH 시험 물품 내의 단량체의 백분율을 계산한다: (hGH 샘플의 피크 면적/표준물질의 피크 면적)×100%. hGH 시험 물품 내의 이량체 및/또는 고 응집물의 백분율을 또한 계산한다. PEG화된 hGH의 순도 결정을 위해, PEG화된 hGH 샘플 및 표준물질의 적분된 주요 피크 면적을 비교하고, PEG화-hGH 샘플 내의 PEG화 단량체를 [(PEG화된 hGH 샘플의 피크 면적/표준물질의 피크 면적)×100%]로 계산한다. hGH 시험 물품 내의 PEG화 이량체, 고 응집물, 및 비-PEG화 단량체의 백분율을 또한 계산한다. 대안적으로, 순도를 [(hGH 샘플의 주요 피크의 적분 면적/hGH 샘플의 모든 피크들의 적분 면적)×100%]에 의해, 비-PEG화된 hGH 또는 PEG화된 hGH애 대해 결정한다. 용매로 인한 임의의 피크(들)를 무시하였다. 기준 표준물질의 백분율에 의해서가 아닌, 절대 질량 또는 직접적 피크 면적을 이용하여 순도 결정을 계산한다.
명세사항: hGH 시험 물품 및 표준물질 간의 체류 시간은 대략 < ±30초이다. 이량체 및 고분자량 단백질에 대해, 시험 물품으로 수득된 크로마토그램에서, 주요 피크의 체류 시간보다 적은 체류 시간을 갖는 임의의 피크의 면적의 합은 각기 피크들의 총면적의 4.0% 또는 6.0% 이하이다. 용매로 인한 임의의 피크(들)를 무시하였다.
도 18은 30K PEG-metY35pAF 및 metY35pAF로부터의 SEC-HPLC 데이터를 나타낸다.
실시예 6
양이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피( cIEX - HPLC )
양이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(cIEX-HPLC)는 단백질과 수지에 고정화된 전하 간의 전하-전하 상호작용에 의존하는 기법이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 음 하전 수지에 결합하는 단백질의 양 하전 이온을 이용한다. hGH의 통상의 구조적 변형은 아스파라긴(Asn) 잔기의 탈아미드화이고, 이 cIEX-HPLC 방법은 PEG화 및 비-PEG화된 hGH의 탈아미드화 생성물 및 탈아미드화 중간체를 분리시킨다.
하기 방법을 이용하여, 재조합 인간 성장 호르몬(hGH)의 상대적 순도 및 잠정적 화학적 분해(즉, 탈아미드화)를 평가하였다. 이 방법을 사용하여, PEG화 및 비-PEG화 hGH의 동정 및 순도 평가를 지지하였다. 이 기법을 이용하여, hGH의 몇가지 부분적 분해 생성물이 관찰가능하였다.
이 절차를 위한 장비는 하기 또는 이와 균등한 것을 포함하였다: UV/Vis 분광광도계(아질런트 8453 또는 이와 균등한 것); 50 ul 석영 큐벳; 0.5 mL 비바스핀 농축기(필요한 경우; 비바사이언스 10,000 MWCO, PES, VSO102 또는 이와 균등한 것); HPLC 바이얼 및 캡(알테크 100 ul 스크류 캡 폴리프로필렌 바이얼 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개방 홀 스크류 캡 #73044, 또는 이와 균등한 것); 깨끗한 1 및 2 L 유리 병; 칼럼, 예컨대 폴리CAT A 4.6×200 mm, 5μ, 1000 Å(204CT0510) 및 폴리CAT A 가드 칼럼, 4.6×10 mm, 5μ, 1000 Å(JGCCT0510); 및 선형 구배를 수행할 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기기(예컨대, 진공 탈기장치, 4차 펌프, 온도조절 오토샘플러, 온도조절 칼럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD), 굴절율 검출기(RID) 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 아질런트 1100 HPLC).
이 절차를 위한 시약은 달리 지시되지 않는 한, 분석적 등급 이상인 고체 화학물질, 및 HPLC 등급 이상인 용매를 포함하였다. 그러한 화학물질의 예는 아세트산암모늄, 스펙트럼 HPLC 등급 A2149, 또는 이와 균등한 것; 아세토니트릴, 피셔 HPLC 등급 A998, 또는 이와 균등한 것, 중탄산암모늄을 포함한다. 부가적 용액은 이동상 A(40% 아세토니트릴, H2O); 이동상 B(40% 아세토니트릴, 500 mM 아세트산암모늄, pH 4.5), 및 탈아미드화 조절을 위한 완충액(30 mM 중탄산암모늄, pH 9.0)을 포함한다. 이동상 A 완충액을 위해, 400 mL HPLC 등급 아세토니트릴을 600 ml 멸균 여과된 밀리-Q H2O와 혼합하였고, 수득되는 혼합물을 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098), 또는 이와 균등한 것)를 이용하여 멸균 여과하였다. 이동상 B 완충액을 위해, 38.54 g 아세트산암모늄을 970 mL 밀리-Q H2O에 용해시켰다. 빙초산을 이용하여 용액을 pH 4.5로 조정한 후, 밀리-Q H2O를 이용하여 부피를 1000 mL 부피로 조정하였다. 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098)를 이용하여 완충액을 멸균 여과하였다. 100 mL 밀리-Q H2O, 400 mL HPLC 등급 아세토니트릴, 및 500 mL 500 mM 아세트산암모늄(pH 4.5)을 혼합하였다. 탈아미드화 조절을 위한 완충액을 위해, 2.37 g의 중탄산암모늄을 0.95 L 밀리-Q H2O에 용해시킨 후, NaOH를 이용하여 pH를 9.0로 조정하였다. 이어서, 밀리-Q H2O를 이용하여 부피를 1 L로 조정하였다. 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098, 또는 이와 균등한 것)를 이용하여, 수득되는 완충액을 멸균 여과하였다.
cIEX-HPLC에서 표준물질로 사용하기 위한 샘플은 1.0 ml의 물로 재구성되고 1.9-1.1 mg/ml로 희석된 세계보건기구(WHO) hGH(분류 번호 98/574)을 포함하였다. 1.9-1.1 mg/ml 농도로 다른 hGH 참고 기준물질을 사용할 수 있다. 분리 용액을 위해, hGH 기준물질(들)을, (샘플 부피에 따라) PD-IO, Nap-10 또는 Nap-5 탈염 칼럼을 이용하여 30 mM 중탄산암모늄(pH 9.0) 완충액으로 완충액 교환하였다. 0.5 mL 비바스핀 농축기를 이용하여 표준물질을 1.9-1.1 mg/ml로 농축시키고, 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 시험 물품을 1.0 mg/ml로 희석하였다. 탈아미드화 분리 표준물질이 포함되었다. 대안적으로, 시험 물품 및 표준물질을 일정 범위의 농도 범위에 걸쳐 희석한다. 표준 기법을 이용하여 샘플 농도를 측정하였다.
절차
기기를 하기 조건으로 설정하였다: 1) 칼럼: 폴리CAT A 204CT0510 및 JGCCT0510; 2) 오토샘플러 온도: 4℃; 3) 펌프 설정-구배: 50 50-250 mM 아세트산암모늄 pH 4.5;
시간 이동상 A 이동상 B 유속(ml/분) 압력(bar)
0 90 10 0.5 140
14 90 10 0.5 140
79 50 50 0.5 140
19.5 50 50 0.75 140
80 0 100 1 140
115 0 100 1 140
115.5 90 10 1 140
150 90 10 1 140
150.5 90 10 0.5 140
153 90 10 0.5 140
4) 인젝터 설정 - 주입: 표준물질 주입; 주입 부피: 15 μl; 인출 속도: 50 μl/분; 주입 속도: 50 μl/분; 바늘 세정: 15 ul H2O; 중단 시간: 펌프에 따라; 5) DAD 신호 - 표 5; 피크 폭: >0.1 분; 슬릿: 4 nm; 중단 시간: 펌프에 따라;
샘플 Bw 참고물질 Bw 단위
280 4 600 100 nm
276 4 600 100 nm
214 8 600 100 nm
220 4 600 100 nm
250 8 600 100 nm
6) 칼럼 온도조절기: 온도: 20℃; 저장: 온도.
칼럼을 10 칼럼 부피의 90% 이동상 A 및 10% 이동상 B로 평형화하였다. 15 μl의 분리 용액을 주입하였다. 수득된 크로마토그램에서, 주요 비-PEG화 피크가 대략 64 내지 67분의 체류 시간에서 용리하였고, 비 PEG화 탈아미드화 피크는 대략 62 내지 65분의 체류 시간에서 용리하였으며, 주요 PEG화 피크는 대략 43 내지 46분의 체류 시간에서 용리하였고, PEG화 탈아미드화 피크는 대략 41 내지 44분의 체류 시간에서 용리하였다. 15 μl의 표준물질을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 15 μl의 시험 물품을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 샘플을 세 벌로 실행하였다. 평균 체류 시간을 보고하였다.
PEG화된 hGH 및 다른 형태를 분석하기 위해, 각종 조건 및/또는 매개변수에 대한 변형이 필요할 수 있다. cIEX-HPLC에 대한 변형은 당업자에게 공지되어 있다. 부가적 참고 기준물질은 벌크 pY35pAF의 인-프로세스(in-process) 방출을 위한 인-프로세스 pY35pAF, PEG화-pY35pAF에서 잔류 유리 pY35pAF를 정량화하기 위한 정제된 pY35pAF, 및 정제된 PEG-pY35pAF를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
데이터 분석
표준물질을 갖는 hGH 시험 물품의 체류 시간을 비교하고, 계산된 비-PEG화된 hGH 및 PEG화된 hGH의 순도를 구하였다. [(hGH 샘플의 주요 피크의 적분 면적/모든 피크들의 적분 면적)×100%]와 같은 계산법에 의해 순도를 결정할 수 있다. 용매로 인한 임의의 피크(들)를 무시하였다.
표 6 및 도 19는 30K PEGmY35pAF hGH 및 mY35pAF hGH의 cIEX-HPLC 분석을 나타낸다.
탈아미드화 30K PEG mY35pAF 상대 % 30K PEG mY35pAF 상대 % 탈아미드화 mY35pAF 상대 % mY35pAF 상대 %
mY35pAF 66.26 100
탈아미드화 mY35pAF 63.48 18.5 81.4
30K PEG mY35pAF 43.37 5.3 45.07 72.1
탈아미드화 30K PEG mY35pAF 43.32 21.1 45.42 64.9
실시예 7
이 실시예는 p-아세틸-D,L-페닐알라닌(pAF) 및 m-PEG-히드록실아민 유도체의 합성을 기재한다.
[Zhang, Z., Smith, B. A. C, Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003)42, 6735-6746]에 전술된 절차를 이용하여 라세믹 pAF를 합성하였다.
m-PEG-히드록실아민 유도체를 합성하기 위해, 하기 절차를 완료하였다. 실온(RT)에서 1시간 동안 교반된, 디클로로메탄(DCM, 70 mL) 중 (N-t-Boc-아미녹시)아세트산(0.382 g, 2.0 mmol) 및 1,3-디이소프로필카르보디이미드(0.16 mL, 1.0 mmol)의 용액에, 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 아민(m-PEG-NH2, 7.5 g, 0.25 mmol, 바이오벡트라(BioVectra) 제조의 Mt. 30 K) 및 디이소프로필에틸아민(0.1 mL, 0.5 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 48시간 동안 RT에서 교반한 후, 약 100 mL로 농축하였다. 혼합물을 냉 에테르(800 mL)에 적가하였다. t-Boc-보호 생성물을 석출시켰고, 여과 수집하였으며, 에테르 3x100 mL로 세정하였다. 그것을 DCM(100 mL) 중에 재용해시키고, 에테르(800 mL)에 2회 석출함으로써 추가 정제하였다. 생성물을 진공 건조시켜, 7.2 g(96%)을 수득하였고, 이를 NMR 및 닌히드린 시험으로 확인하였다.
수득된 탈보호 생성물(7.0 g)의 deBoc를 1시간 동안 0℃에서 50% TFA/DCM(40 mL) 중에 수행한 후, 1.5시간 동안 RT에서 수행하였다. 대부분의 TFA를 진공 제거한 후, 디옥산(1 mL) 중 4N HCl룰 잔류물을 첨가함으로써, 히드록실아민 유도체의 TFA 염을 HCl 염으로 전환시켰다. 석출물을 DCM(50 mL) 중에 용해시키고, 에테르(800 mL) 중에 재석출시켰다. 최종 생성물(6.8 g, 97%)을 여과 수집하였고, 에테르 3x100 mL로 세정하였으며, 진공 건조하고, 질소 하에 저장하였다. 동일 절차를 이용하여, 다른 PEG(5K, 20K) 히드록실아민 유도체를 합성하였다.
실시예 8
이 실시예는 비천연 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드를 위해 사용되는 발현 및 정제 방법을 기재한다. 숙주 세포를 오르토고날 tRNA, 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소, 및 hGH 구축물을 이용하여 형질전환하였다.
형질전환된 DH10B(fis3) 세포의 냉동 글리세롤 스톡으로부터의 작은 천자를 먼저 37℃에서 100 μg/ml 암피실린을 갖는 2 ml의 한정 배지(류신, 이소류신, 미량 금속 및 비타민으로 보충된 글루코스 최소 배지)에서 성장시켰다. OD600이 2-5에 도달할 때, 60 μl를 100 μg/ml 암피실린을 갖는 60 ml 프레쉬 한정 배지로 옮겨, 37 ℃에서 다시 성장시켜, OD600가 2-5에 달하도록 하였다. 50 ml의 배양액을 5 리터 발효기(사르토리우스(Sartorius) BBI)에서 2 리터의 100 μg/ml 암피실린을 갖는 한정 배지에 옮겼다. 발효기 pH를 탄산칼륨을 이용하여 pH 6.9로 조절하였고, 온도를 37℃로 조절하였으며, 공기 유속을 5 lpm로 조절하였고, 폴리알킬렌 소포제 KFO F119(루브리졸(Lubrizol))로 발포하였다. 교반기 속도를 용해 산소 수준을 ≥30%로 유지하기 위해 자동 조정하였고, 교반기 속도가 그 최대 속도에 도달하면, 순수 산소를 사용하여 공기 스파징을 보충하였다. 37℃에서 8시간 후에, 배양물을 0.15 시간-1의 특정 성장 속도를 유지하기 위해 지수적 증가 속도로 한정 배지의 50X 농축물에 공급하였다. OD600가 대략 100에 도달하면, 파라-아세틸-페닐알라닌의 라세믹 혼합물을 첨가하여 3.3 mM의 최종 농도가 되도록 하였고, 온도를 28℃로 저하시켰다. 0.75 시간 후, 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드를 첨가하여, 0.25 mM의 최종 농도가 되도록 하였다. 세포를 28℃에서 추가 8시간 성장시키고, 펠렛화하였으며, 추가 가공 시까지 -80 ℃에서 냉동시켰다.
인비트로겐(Invitrogen) 설명서 매뉴얼이 제공하는 표준 His-태그가 부착된 단백질 정제 절차를 통해, 또한 그 후 이온 교환 칼럼에 의해 프로본드 니켈-킬레이트화 수지(ProBond Nickel-Chelating Resin)(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 이용하여, His-태그가 부착된 돌연변이체 hGH 단백질을 정제하였다.
정제된 hGH를 8 mg/ml로 농축하였고, 반응 완충액(20 mM 아세트산나트륨, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 4.0)으로 완충액 교환하였다. MPEG-옥시아민 분말을 PEG:hGH의 20:1 몰비로 hGH 용액에 첨가하였다. 반응을 온화한 진탕 하에 2일 동안 28℃에서 수행하였다. 이온 교환 칼럼을 통해 미반응 PEG 및 hGH로부터 PEG-hGH를 정제하였다.
실시예 9
SDS - PAGE 에 의한 순도 분석
하기 방법을 이용하여, SDS-PAGE, 및 그에 이어 총 단백질 염색에 의해 PEG-재조합 hGH 접합체의 순도를 평가하였다. 단백질과 같은 임의의 하전된 분자는, 전기장 내에 놓일 때 이동하게 된다. 전기장 내 단백질의 이동 속도는 전기장의 강도, 단백질 상의 순 전기 전하, 및 마찰 저항에 의존한다. 마찰 저항은 단백질의 크기 및 모양의 함수이다. 대부분의 단백질은 과잉 SDS의 존재 하에 변성될 때, 일정한 중량 비로 SDS에 결합하고, 이에 따라 그것은 본질적으로 동일한 전하 밀도를 가지고, 단백질 크기에 따라 폴리아크릴아미드 겔에서 이동한다. 겔 전기영동에 의해 분리된 단백질을 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색(Coomassie Brilliant Blue staining)에 의해 검출할 수 있다.
이 절차를 위한 장비는 하기 또는 이와 균등한 것을 포함하였다: X셀(XCell) 슈어록(Surelock) 미니-셀(인비트로겐), +70-80℃로 설정된 열 블록, 전원 공급(200 V 이하), 마이크로원심분리기(예컨대, 베크만 코울터 마이크로퓨지(Beckman Coulter Microfuge) 18 또는 22R), 및 왕복 진탕기. 시약은 NuPAGE MOPS SDS 러닝(Running) 완충액(2OX, 인비트로겐 PN NPOOO1); NuPAGE MES SDS 러닝 완충액(2OX, 인비트로겐 PN NP0002); NuPAGE LDS 샘플 완충액(4X, 인비트로겐 PN NP0007); NuPAGE 샘플 환원제(10X, 인비트로겐 PN NP0009); 12% 비스-트리스 NuPAGE 프리캐스트 겔, 1.0 mm×10-웰(인비트로겐 PN NP034 IBOX); 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 프리캐스트 겔, 1.0 mm×10-웰(인비트로겐 PN NP0321BOX); 예비-염색 분자량 마커(씨블루(seeBlue) 플러스2(Plus2), 인비트로겐 PN LC5925] 참고); 밀리Q-품질 H2O 또는 이와 균등한 것; 심플리블루(SimplyBlue) 세이프스테인(SafeStain)(인비트로겐 PN LC6065) 또는 이와 균등한 것; 기준 표준물질(WHO rhGH 표준물질; rhGH에 대한 적정 용액(Y35pAF-pB2/pB3, 2 mg/ml); pEG-rhGH 접합물에 대한 적정 용액(PEG30-pY35pAF-01, 2 mg/mL)을 포함하였다. 표준물질 및 시험 물품의 단백질 농도를 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여 측정하였다.
PEG 화 rhGH 생성물의 분석
10 μg의 참고 기준물질(RS, 예컨대 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01)을 비환원 및 환원 조건 하에 제조하였다. 10 ug의 PEG30-pY35pAF-01(2 mg/mL)를 4X LDS 및 밀리Q H2O에 첨가하여, 1X LDS 중 최종 28 μl 샘플을 제조하였다. 환원 조건 하에서, 10 μg의 기준 표준물질을 4X LDS, 1OX 환원제, 및 밀리Q H2O를 첨가하여, 1X LDS 및 1X 환원제 중 28 μl 샘플을 수득하였다. 유사하게, lO μg의 PEG화 rhGH 시험 물품을 또한 비환원 및 환원 조건 하에 제조하였다. PEG-rhGH 시험 물품 및 PEG-rhGH 참고 기준물질을 가열하지 않았으나, 제조업자의 설명서에 따라 1X MES SDS 러닝 완충액으로 제조된 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 프리캐스트 겔 상에 로딩하기 전에 스냅 원심분리하였다. 겔을 예비-염색 분자량 마커, 10 μg 기준 표준물질, 블랭크 레인(잠정적 캐리오버(carryover) 효과를 최소화하기 위해 권장됨)의 순으로 로딩한 후, 35분 동안 200 V의 최대 설정으로 시험 물품을 로딩하였다. 겔을 디-H2O 중에 인큐베이션하였고, 심플리블루 또는 이의 균등물을 이용하여 진탕 하에 염색하였고, 물로 탈색하였다.
PEG-rhGH 시험 물품의 전기영동도는 PEG-rhGH 기준 표준물질로 수득된 전기영동도에 순응해야 한다. 참고 기준물질에 부합하지 않는 임의의 밴드는 분해 생성물 또는 응집물일 수 있다. 고분자량 밴드는 응집물을 나타낼 수 있고, 보다 낮은 분자량 밴드는 PEG에 더 이상 접합되지 않는 폴리펩티드를 나타낼 수 있다.
실시예 10
CEX - HPLC / IEX - HPLC 에 의한 rhGH 의 순도 및 화학적 분해 분석
하기 방법을 이용하여, 양이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC)에 의해 PEG화 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH)의 상대적 순도 및 잠정적 화학적 분해(즉, 탈아미드화)를 평가하였다. CEX-HPLC는 단백질과 수지에 고정화된 전하 간의 전하-전하 상호작용에 의존하는 기법이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 음하전 수지에 결합하는 단백질의 양 하전 이온을 이용한다. rhGH의 통상의 구조적 변형은 아스파라긴(Asn) 잔기의 탈아미드화이고, 이 CEX-HPLC 방법은 PEG화 및 비-PEG화된 hGH의 탈아미드화 생성물 및 탈아미드화 중간체를 분리시킨다. 이 방법을 사용하여, PEG화 rhGH의 동정 및 순도 평가를 지지하였다. 이 기법을 이용하여, rhGH의 몇가지 부분적 분해 생성물이 관찰가능하다.
이 절차를 위한 장비는 하기 또는 이와 균등한 것을 포함하였다: UV/Vis 분광광도계(아질런트 8453 또는 이와 균등한 것); 50 μl 석영 큐벳; 0.5 mL 비바스핀 농축기(필요한 경우; 비바사이언스 10,000 MWCO, PES, VS0102 또는 이와 균등한 것); PD-10, NAP-10, 또는 NAP-5 칼럼(GE 헬스케어(Healthcare), 분류 번호 17-0851-01, 17-0853-01, 17-0854-01); HPLC 바이얼 및 캡(알테크 100 μl 스크류 캡 폴리프로필렌 바이얼 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개방 홀 스크류 캡 #73044, 또는 이와 균등한 것); 깨끗한 1 및 2 L 유리 병; 칼럼 - 폴리CAT A 4.6×200 mm, 5μ, 1000 Å(폴리LC, 204CT0510) 및 폴리CAT A 가드 칼럼, 4.6×10 mm, 5μ, 1000 Å(폴리LC, JGCCT0510); 선형 구배를 수행할 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기기(예컨대, 진공 탈기장치, 4차 펌프, 온도조절 오토샘플러, 온도조절 칼럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD), 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 아질런트 1100 HPLC).
이 절차를 위한 시약은 달리 지시되지 않는 한, 밀리-Q 품질 또는 이와 균등한 물, 분석적 등급 이상인 고체 화학물질, 및 HPLC 등급 이상인 용매를 포함하였다. 시약의 저장 및 절차적 단계는 달리 지시되지 않는 한, 실온에서 행해졌다. 그러한 화학물질의 예는 아세트산암모늄, 스펙트럼 A2149, HPLC 등급, 또는 이와 균등한 것; 아세토니트릴, 피셔 A998, HPLC 등급, 또는 이와 균등한 것; 중탄산암모늄, 플루카 # 09830, 울트라 > 99.5%, 또는 이와 균등한 것; 빙초산, 피셔 # 64-19-7, HPLC 등급, 또는 이와 균등한 것; 시트르산나트륨 이수화물, 스펙트럼 SO165, USP 등급, 또는 이와 균등한 것; 글리신, 스펙트럼 AM125 또는 이와 균등한 것; 만니톨, 스펙트럼 MA165, 또는 이와 균등한 것; 6 N HCl, 말린크로드트(Mallinckrodt) 2662-46, 또는 이와 균등한 것을 포함하였다.
이동상 A 완충액은 50 mM 아세트산암모늄(pH 4.25), 40% 아세토니트릴(AcCN)였고, 이동상 B 완충액은 500 mM 아세트산암모늄(pH 4.25), 40% AcCN였다. 제조된 부가적 시약은 10% 아세트산; 탈아미드화를 위한 완충액: 30 mM 중탄산암모늄(pH 9.0); 및 샘플 희석 완충액: 20 mM 시트르산나트륨, 20 g/L 글리신, 5 g/L 만니톨( pH 6.0)이었다(이들 각각은 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098, 또는 이와 균등한 것)를 이용하여 멸균 여과됨).
비-PEG화된 hGH 표준물질로서 세계 보건 기구(WHO) rhGH(분류 번호 98/574)를 사용하였다. 그것을 1.0 ml의 물 중에 재구성하였고, 희석 완충액을 이용하여 1.1 mg/ml로 희석하였다. 10%(v/v)의 10% 아세트산을 첨가하여, pH를 pH 3.8 내지 4.3로 조정하였고, 이에 최종 농도가 1.0 mg/ml(허용가능한 범위 0.9 내지 1.1 mg/ml)가 되었다. 또 다른 비-PEG화된 hGH 표준물질인, 적정 용액 Y35pAF-pB2/pB3을 유사한 방식으로 제조하였다. PEG화된 hGH 표준물질인 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01을 또한 유사한 방식으로 제조하였다.
PEG화 분리 용액을 위해, PEG30-pY35pAF-01 적정 용액을, PD-10, Nap-10, 또는 Nap-5 탈염 칼럼을 이용하여, 30 mM 중탄산암모늄(pH 9.0) 완충액으로 완충액 교환하였다. 표준물질을 0.5 mL 비바스핀 농축기를 이용하여, 대략 2 mg/ml(허용가능한 범위 1.9-2.1 mg/ml)로 농축하였고, 샘플을 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 필요한 샘플 또는 샘플의 일부분을 희석 완충액을 이용하여 1.1 mg/ml로 희석하였고, 10%(v/v)의 10% 아세트산을 첨가하여, pH를 pH 3.8 내지 4.3로 조정하였고, 이에 최종 농도가 1.0 mg/ml(허용가능한 범위 0.9 내지 1.1 mg/ml)가 되도록 하였다.
시험 물품을 희석 완충액을 이용하여 1.1 mg/ml로 희석하였고, 10%(v/v)의 10% 아세트산을 첨가하여, pH를 pH 3.8 내지 4.3로 조정하였고, 이에 최종 농도가 1.0 mg/ml(허용가능한 범위 0.9 내지 1.0 mg/ml)가 되도록 하였다. 표준물질 및 시험 물품의 단백질 농도를 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여 측정하였다.
절차
기기를 하기 조건으로 설정하였다: 1) 칼럼: 폴리CAT A204CT0510 및 JGCCT0510; 2) 오토샘플러 온도: 실온; 3) 펌프 설정: 단계 구배: 81.5 내지 108.5 mM 아세트산암모늄 pH 4.25(7 내지 13% B), 그에 이어 108.5 내지 500 mM 아세트산암모늄 pH 4.25(13 내지 100% B); 4) 표 7;
시간 이동상 A 이동상 B 유속(ml/분) 압력(bar)
0 100 0 1.0 140
10 100 0 1.0 140
11 93 7 1.0 140
91 87 13 1.0 140
102 0 100 1.0 140
118 0 100 1.0 140
119 100 0 1.0 140
151 100 10 1 140
5) 인젝터 설정 - 주입: 표준물질 주입; 주입 부피: 25 μl; 인출 속도: 50 μl/분; 주입 속도: 50 μl/분; 바늘 세정: 15 μl H2O; 중단 시간: 펌프에 따라; 6) DAD 신호: 표 8;
샘플 Bw 참고물질 Bw 단위
280 4 600 100 nm
276 4 600 100 nm
214 8 600 100 nm
220 4 600 100 nm
250 8 600 100 nm
피크 폭: >0.1 분; 슬릿: 4 nm; 중단 시간: 펌프에 따라; 7) 칼럼 온도조절기: 온도: 30℃; 온도를 기록한다.
칼럼을 10-15 칼럼 부피의 100% 이동상 A를 이용하여 평형화하였다. 25-50 μl의 PEG화 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01을 주입하였다. 주요 PEG화 피크가 56.97 분(±0.5 분)의 체류 시간에서 용리하였다. 그 다음, 25-50 μl의 WHO 또는 적정 용액 Y35pAF-pB2/pB3을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 주요 비-PEG화 피크가 주요 PEG화 피크에 대한 1.73 ± 0.01분의 상대적 체류 시간인 98.54분(±0.5분)의 체류 시간에서 용리하였다.
이어서, 25 내지 50 μl의 PEG화 분리 용액을 주입하였다. 수득된 크로마토그램에서, 주요 PEG화 피크가 56.97분(±0.5분)의 체류 시간에서 용리하였고, PEG화 탈아미드화 피크가 주요 피크 대비 (45.23 ± 0.3 분; 현 조건은 2.3 ± 0.02의 분리를 초래함) 0.79 ± 0.02분의 체류 시간에서 용리하였다.
이어서, 25 내지 50 μl의 PEG화 시험 물품을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 샘플을 세 벌로 수행하였고, 평균 체류 시간을 기록하였다. 흡광도(280 nm)를 이용하여 크로마토그램을 생성시켰다.
데이터 분석
PEG화 rhGH 시험 물품의 체류 시간을 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01과 비교하였다. 시험 물품의 평균 순도를 [(주요 피크의 적분 면적/모든 피크들의 적분 면적)×100%]을 이용하여 계산하였다. 용매로 인한 임의의 피크(들)를 무시하였다.
실시예 11
SEC- HPLC 에 의한 rhGH 의 순도 결정
이 절차를 사용하여, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 재조합 인간 성장 호르몬(rhGH) 및 PEG화 rhGH의 순도를 평가하였다. 이 시험은 PEG화 형태와 비-PEG화 형태뿐만 아니라, 샘플 내 이량체 및 다른 관련 물질로부터 단량체를 분리시킨다. SEC-HPLC는 이동상 분자에 의해 투과되는 다공성 매트릭스로서 정지상을 이용하는 기법이다. 세공 구조에 들어가기에 충분히 작은 샘플 분자는 지연되는 반면, 보다 큰 분자는 배제되므로, 칼럼을 통해 급속히 운반된다. 따라서, 크기 배제 크로마토그래피는 크기에 의한 분자를 분리시키고, 크로마토그래피 용리 시간은 특별한 분자에 대해 특징적이다. 이 절차를 이용하여, 단량체(PEG화 및 비-PEG화) rhGH의 백분율을 결정한다. 이 기법을 이용하여 이량체 및 기타 고분자량 단백질이 관찰가능하다. SEC-HPLC 적분의 한 예가 도 20에 나와 있고, 여기에서 y-축은 흡광도(214 nm)이고, x-축은 시간(분)이다.
이 기법에 대한 참고문헌은 [유럽 약전 2002, p. 193; 영국 약전 2001, p. 1941; "High-Performance Size-Exclusion Chromatographic Determination of the Potency of Biosynthetic Human Growth Hormone Products" by R.M. Riggin et al. Journal of Chromatography 435(1988), p. 307-318]을 포함한다.
이 절차를 위한 장비는 하기 또는 이와 균등한 것을 포함하였다: UV/Vis 분광광도계(아질런트 8453 또는 이와 균등한 것); 50 ul 석영 큐벳; 0.5 mL 비바스핀 농축기(필요한 경우; 비바사이언스 10,000 MWCO, PES, VSO102 또는 이와 균등한 것); HPLC 바이얼 및 캡(알테크 100 ul 스크류 캡 폴리프로필렌 바이얼 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개방 홀 스크류 캡 #73044, 또는 이와 균등한 것); 깨끗한 1 및 2 L 유리 병; 칼럼 - 치수: 4.6×35 mm 및 4 μ 입자 크기를 갖는 가드 칼럼과 함께, 토소하스 TSK 슈퍼 SW3000 18675 및 슈퍼 SW 가드 칼럼 18762, 치수: 4.6×300 mm, 입자 크기: 4 μm 및 세공 크기: 250Å를 갖는 실리카-기재 크기 배제 HPLC 칼럼; 선형 구배를 수행할 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기기(예컨대, 진공 탈기장치, 4차 펌프, 온도조절 오토샘플러, 온도조절 칼럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD), 굴절율 검출기(RID) 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 아질런트 1100 HPLC).
이 절차를 위한 시약은 달리 지시되지 않는 한, 밀리-Q 품질 또는 이와 균등한 물, 분석적 등급 이상인 고체 화학물질, 및 HPLC 등급 이상인 용매를 포함하였다. 시약의 저장 및 절차적 단계는 달리 지시되지 않는 한, 실온에서 행해졌다. 그러한 화학물질의 예는 일염기성 일수화물 인산나트륨, 스펙트럼 U.S.P. 등급 SO130, 또는 이와 균등한 것; 이염기성 칠수화물 인산나트륨, 스펙트럼 U.S.P. 등급 SO140, 또는 이와 균등한 것; 2-프로판올, 피셔 HPLC 등급 A451-4, 또는 이와 균등한 것을 포함하였다.
이동상 완충액은 97%의 63 mM 인산나트륨(pH 7.0), 3%의 2-프로판올이었다. 용액 A는 25 mM 인산나트륨(pH 7.0)이었다. 양자 모두를 0.22 μm PES 필터(코닝 #431098, 또는 이와 균등한 것)를 이용하여, 멸균 여과하였다.
세계 보건 기구(WHO) rhGH(분류 번호 98/574)를 비-PEG화된 hGH 표준물질로 사용하였다. 그것을 1.0 ml의 물로 재구성하였고, WHO 완충액 중 1 mg/ml 농도(허용가능한 범위 0.9 내지 1.1 mg/ml)로 희석하였다. 또 다른 비-PEG화된 hGH 표준물질인 적정 용액 Y35pAF-pB2/pB3을 유사한 방식으로 제조하여, 20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6)로 희석하였다. PEG화된 hGH 표준물질인 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01을 또한 유사한 방식으로 제조하여, 20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6)로 희석하였다. 분리 용액을 위해, PEG30-pY35pAF-02 고분자량 표준물질을 1 mg/ml 농도(허용가능한 범위 0.9 내지 1.1 mg/ml)가 되도록 하였다. 이 용액은 대략 33% PEG-PEG-GH, 66.5% PEG-GH를 함유한다. 시험 물질을 용액 A로 대략 1.0 mg/ml로 희석하였다(허용가능한 범위 0.9 내지 1.1 mg/ml). 모든 샘플 농도를 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여 측정하였다. 샘플을 임의의 적당한 완충액을 이용하여 희석할 수 있다.
절차
기기를 하기 조건으로 설정하였다: 1) 칼럼: TSK 슈퍼SW3000 18675 및 가드 칼럼 18762; 2) 펌프 설정 - 구배: 단일용매; 유속: 0.3 ml/분; 지속기간: 25분; 최대 압력: 120 bar; 3) 인젝터 설정 - 주입: 표준물질 주입; 주입 부피: 10 μl; 인출 속도: 100 μl/분; 주입 속도: 100 μl/분; 바늘 세정: 100 ul H2O; 중단 시간: 펌프에 따라; 4) DAD 신호: 표 9;
샘플 Bw 참고물질 Bw 단위
214 4 600 100 nm
276 4 600 100 nm
220 8 600 100 nm
280 4 600 100 nm
250 8 600 100 nm
피크 폭: >0.05 분; 슬릿: 2 nm; 중단 시간: 펌프에 따라; 5) RID 신호 -- 온도: 35℃; 반응 시간: >0.2분 4s, 표준물질; 6) 칼럼 온도조절기: 온도: 23 ℃; 온도를 기록한다.
칼럼을 10 칼럼 부피(50 ml = 0.3 ml/분으로 166)의 이동상으로 평형화하였고, RID를 샘플 주입 전 20분 이상 동안 퍼징하였다. DAD 및 RI 검출기를 샘플 수행 전 오토밸런싱하였다.
20 μl의 적정 용액 Y35pAF-pB2/pB3(또는 WHO 표준물질)을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 수득된 크로마토그램에서, 주요 비-PEG화 피크가 대략 12.96(±0.05)분의 체류 시간에서 용리하였다. 고분자량 비-PEG화 rhGH 이량체는 주요 피크 대비 0.94 ± 0.02의 체류 시간에서 용리하였다. 고분자량 응집물은 7.3 내지 8.0분의 체류 시간에서 용리하였다.
20 μl의 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01을 주입하였다. 주요 PEG화 피크는 대략 8.33(±0.08)분의 쳬류 시간(비-PEG화 rhGH 대비 0.64의 상대적 체류 시간)에서 용리하였다. 고분자량 PEG화 rhGH 응집물은 8.0분 초과의 시간에서 용리하였다.
20 μl의 분리 용액을 주입하였고 HPLC 프로그램을 실행하였다. 주요 PEG화 피크는 8.28분의 체류 시간에서 용리하였고, 고분자량 종은 주요 PEG화 피크 대비 0.9(±0.05)의 상대적 체류 시간인 7.54분에서 용리하였다.
20 μl의 시험 물품을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 샘플을 세 벌로 실행하였고, 평균 체류 시간을 기록하였다. rhGH 시험 물품의 체류 시간을 rhGH 기준물질(들)과 비교하였다.
시험 물품으로부터의 SEC-HPLC 데이터를 참고 기준물질로부터 수득된 데이터와 비교하였다. PEG화 rhGH의 순도를 결정하기 위해, PEG화 rhGH 샘플의 적분된 주요 피크 면적을 총 피크 면적과 비교하였고, PEG-rhGH 샘플 중 PEG화 단량체의 백분율을 [(PEG-rhGH 샘플의 주요 피크 면적/총 피크 면적)×100%]에 의해 계산하였다. PEG화된 hGH 시험 물품 내 PEG화 이량체, 고 응집물, 및 비-PEG화 단량체의 백분율을 계산하였다. 용매로 인한 임의의 피크(들)를 무시하였다. 주요 PEG화된 hGH 피크 전에 크로마토그램에서 용리하는 피크는 고분자량 종을 나타낸다. 그러한 고분자량 종은 이량체(예컨대, PEG-PEG-hGH 및 기타 가능한 이량체) 또는 가용성 응집물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 주요 PEG화된 hGH 피크 후에 용리하는 피크는 저분자량 종을 나타낸다. 그러한 저분자량 종은 비-PEG화 단량체 및 짧게 자른(clipped) 형태의 PEG화된 hGH를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
실시예 12
RP - HPLC 에 의한 PEG - hGH 의 순도 및 화학적 분해 분석
하기 방법을 사용하여, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 PEG화 재조합 인간 성장 호르몬(PEG-hGH)이 상대적 순도 및 잠정적 화학적 분해(즉, 산화)를 평가하였다. RP-HPLC는 상대적 소수성에 기초하여 분자를 분리시키는 기법이다. 샘플을 탄화수소 사슬에 공유결합된 실리카의 정지상에 통과시킨다. 관심 분자는 정지상에 의해 지연되고, 단일용매성 용매로 용리된다. 크로마토그래피 용리 시간은 특별한 분자에 대해 특징적이다. 이 방법은 산화와 같은 구조적 변형과 관련된 체류 거동 및 소수성의 미묘한 차이에 기초한 아형태 뿐만 아니라, 비-PEG화된 hGH로부터 PEG-hGH를 분리시킨다. 이 방법을 사용하여, PEG-hGH의 동정 및 순도 평가를 지지하였다. 이 기법을 이용하여, rhGH의 몇가지 부분 분해 생성물이 관찰가능하다. RP-HPLC 적분의 한 예가 도 21에 나와 있고, 여기에서 y-축은 흡광도(214 nm)이고, x-축은 시간(분)이다.
이 절차를 위한 장비는 하기 또는 이와 균등한 것을 포함하였다: UV/Vis 분광광도계(아질런트 8453 또는 이와 균등한 것); 50 μl 석영 큐벳; 0.5 mL 비바스핀 농축기(필요한 경우; 비바사이언스 10,000 MWCO, PES, VSO102 또는 이와 균등한 것); HPLC 바이얼 및 캡(알테크 100 μl 스크류 캡 폴리프로필렌 바이얼 #12962, TFE 라이너 캡 #73048, 개방 홀 스크류 캡 #73044, 또는 이와 균등한 것); 깨끗한 1 및 2 L 유리 병; 칼럼 - J. T. 베이커 와이드 포어 부틸(J. T. Baker Wide Pore Butyl), 250×4.6 mm(분류 번호 7116-00); 선형 구배를 수행할 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 기기(예컨대, 진공 탈기장치, 4차 펌프, 온도조절 오토샘플러, 온도조절 칼럼 구획, 다이오드 어레이 검출기(DAD) 및 켐스테이션 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 아질런트 1100 HPLC).
이 절차를 위한 시약은 달리 지시되지 않는 한, 밀리-Q 품질 또는 이와 균등한 물, 분석적 등급 이상인 고체 화학물질, 및 HPLC 등급 이상인 용매를 포함하였다. 시약의 저장 및 절차적 단계는 달리 지시되지 않는 한, 실온에서 행해졌다. 그러한 화학물질의 예는 아세토니트릴, 피셔 A998, HPLC 등급, 또는 이와 균등한 것; 트리플루오로아세트산, 할로카르본(Halocarbon) UN2699, 바이오그레이드(Biograde), 또는 이와 균등한 것; 인산나트륨, 스펙트럼 MA1654, USP 등급, 또는 이와 균등한 것; 글리신, 스펙트럼 AM125 또는 이와 균등한 것; 만니톨, 스펙트럼 MA165, 또는 이와 균등한 것; 트레할로스, 플루카 90208, 또는 이와 균등한 것; 10 N 수산화나트륨, 또는 이와 균등한 것을 포함한다. 이동상 A는 H2O 중 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% TFA였다.
비-PEG화 표준물질 중 하나는 세계 보건 기구(WHO) rhGH(분류 번호 98/574)였다. 그것을 1.0 ml의 물로 재구성하였고, WHO 완충액을 이용하여 1.0 mg/ml(허용가능한 범위 0.9 내지 1.1 mg/ml)로 희석하였다. 또 다른 비-PEG화 표준물질인 적정 용액 Y35pAF-pB2/pB3을 유사한 방식으로 제조하였고, 20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6)로 희석하였다. PEG화 표준물질인 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01을 또한 유사한 방식으로 제조하였으며, 20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6)로 희석하였다. PEG화 분리 용액을 위해, PEG30-pY35pAF-01을 24시간 동안 4℃에서 0.1% H2O2와 함께 인큐베이션하여, PEG30-pY35pAF-01을 산화시켰다. 5% 내지 20%의 산화된 PEG30-pY35pAF-01를 수득하기 위해, H2O2와의 이 인큐베이션 시간은 4 내지 24시간에서 변화할 수 있다. 필요한 경우, 카탈라제(20 mg/ml 스톡)를 첨가하여, 산화 반응을 중단시킬 수 있다.
시험 물품을 희석 완충액을 이용하여 1.0 mg/ml로 희석하였다(허용가능한 범위 0.9 내지 1.0 mg/ml). 샘플 희석 완충액은 적당한 완충액일 수 있다. 표준물질 및 시험 물품 단백질 농도를 당업계에 공지된 표준 기법을 이용하여 측정하였다.
절차
기기를 하기 조건으로 설정하였다: 1) 칼럼: J. T. 베이커 와이드 포어 부틸, 250×4.6 mm(분류 번호 7116-00); 2) 오토샘플러-온도: 4℃; 3) 펌프 설정: 표 10;
시간(분) 유속(mL/분) % B
0.0 1.0 31.0
17.5 1.0 64.5
17.75 1.0 100
18.75 1.0 100
19.0 1.0 31.0
25.0 1.0 31.0
4) 인젝터 설정 - 주입: 표준물질 주입; 주입 부피: 10 μl; 인출 속도: 100 μl/분; 주입 속도: 100 μl/분; 바늘 세정: 20 μl H2O; 중단 시간: 펌프에 따라; 5) DAD 신호: 표 11;
샘플 Bw 참고물질 Bw 단위
214 4 600 100 nm
276 4 600 100 nm
280 16 600 100 nm
220 4 600 100 nm
250 8 600 100 nm
피크 폭: >0.1 분; 슬릿: 4 nm; 중단 시간: 펌프에 따라; 6) 칼럼 온도조절기: 온도: RT; 온도를 기록한다.
새 칼럼을 lOCV의 HPLC-등급 증류수로 플러슁하여, 처음 채워진(shipping) 용매를 제거하였다. 칼럼을 10 내지 15 칼럼 부피(CV)의, 밀리Q H2O 및 10 내지 15 CV H2O 중 60% 이소프로판올 내 0.1% TFA로 세정하였다. 이에 이어, 필요한 경우 5 CV의 50:50 DMSO:H2O로 세정하였고; 그렇지 않은 경우 칼럼을 이동상 A로 평형화하였다.
칼럼을 10 내지 15 칼럼 부피의 100% 이동상 A로 평형화하였다. 10 μl의 PEG화 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01을 주입하였다. 주요 PEG화 피크는 17.05분(±0.5분)의 체류 시간에서 용리하였다.
10 μl의 WHO 또는 적정 용액 Y35pAF-pB2/pB3을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 주요 비-PEG화 피크는 주요 PEG화 피크 대비 1.1 ± 0.05의 상대적 체류 시간인 19.04분(±0.5분)의 체류 시간에서 용리하였다
10 μl의 PEG화 분리 용액을 주입하였다. 수득된 크로마토그램에서, 주요 PEG화 피크는 17.12분(±0.5분)의 체류 시간에서 용리하였고, PEG화 산화 피크는 주요 피크 대비 0.93 ± 0.02의 체류 시간에서 용리하였다(15.94 ±0.3분 및 2.97 ± 0.05의 해상도).
10 μl의 PEG화 시험 물품을 주입하였고, HPLC 프로그램을 실행하였다. 샘플을 세 벌로 실행하였고, 평균 체류 시간을 기록하였다.
(A214을 이용하는) PEG화 rhGH 시험 물품의 체류 시간을 적정 용액 PEG30-pY35pAF-01과 비교하였다. (A214을 이용하는) 시험 물품의 평균 순도를 [(주요 피크의 적분 면적/모든 피크들의 적분 면적)×100%]를 이용하여 계산하였다. 용매로 인한 임의의 피크(들)를 무시하였다.
실시예 13
조제물에 사용된 방법들의 요약이 표 12에 나와 있다. 장기 저장, 염기성 또는 산성 조건은 하기 생성물-관련 불순물을 초래할 수 있다: 탈아미드화 hGH - Asn149, Asn152; 산화 hGH - Met14, Met125; 이성체화 hGH - Asp130; 탈수 hGH - Asp130; desPhe/des-Phe-Pro-Phe1, Pro2(비효소적 절단); 이량체(공유 및 비공유 종); 짧게 자른 hGH(Thr142와 Tyr143 사이의 절단). 수분 분석, pH, 및 증식 검정을 포함하나 이에 한정되지 않는 생물학적 검정과 같은 부가적 방법을 사용하여, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 hGH의 조제물을 평가한다.
현 방법 구조/안정성 탈아미드화 산화 짧게 잘림 (Clipped) 이성체화 desPhe/desPhe-Pro 고MW 종 탈PEG화 hGH
SDS PAGE 겔 × × ×
IEF 겔 × × ×
SEC-HPLC × ×
RP-HPLC × ×
CEX-HPLC × × × (×) ×
가속화 연구를 위한 분석적 초원심분리 ×
가속화 연구를 위한 동적 광 산란 ×
FTIR ×
SDS-PAGE, SEC-HPLC, 및 cIEX-HPLC는 핵심 분해 생성물을 나타낸다. cIEX-HPLC는 고리 이미드, 이소-asp(이성체화 hGH-Asp130) 및 탈아미드화 중간체를 나타낼 수 있다.
실시예 14
동결건조된 조제물 연구
20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6) 내 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 정제된 PEG화 hGH 샘플을, 안정성 분석 전에 조제물 매트릭스에서의 완충액으로 투석하였다(표 13). hGH의 위치 35의 티로신에 대해 치환된 비천연적으로 코딩된 아미노산(파라-아세틸페닐알라닌)과 mPEG-옥시아민 간의 반응은 hGH와 PEG 간에 옥심 결합을 형성시켰다. 이어서, 샘플을 동결건조하였고, 4, 25 및 40℃에서 저장하였다. 각종 시간(0, 1주, 2주, 4주, 6주, 2개월 및 3개월) 동안 동결건조된 샘플을 저장한 후, 샘플을 물 내에서 2 mg/ml로 재구성하였고, 수분 함량(카알 피셔(Karl Fisher)), pH 및 농도와 같은 특성을 당업자에게 공지된 표준 기법을 이용하여 재구성후 관찰하였다. 실시예 9 내지 13에 기재된 방법을 이용하여, 분해 생성물을 위한 PEG화된 hGH를 분석하였다. 인산나트륨 및 숙신산나트륨이 조제물 매트릭스 내에 포함되었다. 부가적 분석에는 4개월 및 6개월의 시점이 포함된다.
조제물 매트릭스
조제물 ID 완충액 pH 벌크화제 안정화제 항산화제 계면활성제
P6MT 10 mM 인산염 6 4% 만니톨 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
S4MT 10 mM 숙신산염 4 4% 만니톨 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
S5MT 10 mM 숙신산염 5 4% 만니톨 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
S5GT 10 mM 숙신산염 5 2.5% 글리신 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
H6MT 10 mM 히스티딘 6 4% 만니톨 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
P6GT 10 mM 인산염 6 2.5% 글리신 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
P6MA 10 mM 인산염 6 4% 만니톨 4.4% 아르기닌 없음 0.01% PS20
P6MS 10 mM 인산염 6 4% 만니톨 2% 수크로스 없음 0.01% PS20
P6MTMet 10 mM 인산염 6 4% 만니톨 2% 트레할로스 1 mM 메티오닌 0.01% PS20
P7MT 10 mM 인산염 7 4% 만니톨 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
P7GT 10 mM 인산염 7 2.5% 글리신 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
P6MGT 10 mM 인산염 6 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 없음 0.01% PS20
P6MGT-P 10 mM 인산염 6 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 없음
P6MT-P 10 mM 인산염 6 4% 만니톨 2% 트레할로스 없음
P6GT-P 10 mM 인산염 6 2.5% 글리신 2% 트레할로스 없음
결과
수분 함량, pH 및 농도 결과가 표 14-32에 나와 있다.
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이 연구를 위한 SDS 겔이 도 22-58에 나와 있다. 희미한 21.5 kDa 밴드가 도 22의 레인 3 및 4에 가시적이었다.
SEC-HPLC: 도 20는 한 예로서의 SEC-HPLC 적분이다. 표 33-50은 이 연구로부터의 결과를 나타낸다. 주요 PEG화된 hGH 피크와 비-PEG 피크 사이에 짧게 잘린 피크가 용리하였다.
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4주(pH 4) 및 6주(pH 5)동안 저 pH 조제물을 연구하였다. 연구 시간의 틀에 대해, 하기 경향이 나타났다. SEC-HPLC 및 RP-HPLC 분석은, 저 pH 조제물(pH 4 및 5)이 고 pH 조제물(pH 6 및 7)보다 4℃에서 동결건조된 물질을 저장한 후 비-PEG화 물질의 증가된 수준을 가져왔음을 나타냈다. 또한, 보다 높은 응집물 수준은 pH 6 및 7의 조제물에서보다 25 및 40℃에서의 pH 조제물에서 관찰되었다. 또한, pH 6 및 7의 조제물은 cIEX-HPLC에 의해 분석 시, 저 pH 조제물보다 주요 피크 면적의 보다 큰 %를 나타냈다
25 및 40℃에서 동결건조된 hGH를 저장한 3개월간의 연구 시간의 틀 전반에 걸쳐, 히스티딘을 갖는 조제물은 SDS-PAGE에 의해 최소량의 고분자량 응집물을 나타냈다. 글리신과 함께 만니톨을 함유하는 조제물은 교반 유도 응집에 대해 안정화된 것으로 나타났고, 이는 그 조합이 양호한 벌크화제임을 나타낸다. 그러나, 만니톨과 조합된 히스티딘도 또한 교반 유도 응집에 대해 hGH의 안정화를 나타냈다. 트레할로스는 효과적인 안정화제였다.
실시예 15
주입 타당성 연구
4가지 상이한 농도들에서 PEG화된 hGH의 조제물을 이용하여 주입 타당성 연구를 수행하였다 20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6) 내 PEG-hGH를 원심 농축을 통해 10 mM NaH2PO4, 4% 만니톨, 2% 트레할로스, 0.01% 폴리소르베이트 20(PS20)(pH 6.0)(조제물 ID = P6MT)로 완충액 교환하였다. P6MT 완충액 내의 PEG-hGH을 8, 10, 12 및 14 mg/mL로 농축시켰다. 1 mL 충전물을 바이얼에 넣고, 샘플을 동결건조시켰다. 동결건조된 바이얼을 1 ml의 물로 재구성시켰다. 4 lbs의 힘을 이용하여 27 게이지 바늘을 통해 1 ml의 각 농도를 밀어 넣음으로써, 주입 타당성을 시험하였다. 즉시적 재구성은 시험된 모든 농도의 PEG화된 hGH에서 나타났다. 8 mg/mL PEG화된 hGH는 3.5 s(초)로 주입되었고; 10 mg/mL PEG화된 hGH는 3.6 s로 주입되었으며; 12 mg/mL PEG화된 hGH는 3.9 s로 주입되었고; 14 mg/mL PEG화된 hGH는 4.5 s로 주입되었다.
30 게이지 바늘을 통해 부가적 주입 타당성 연구를 수행하였다. 8, 10, 12, 및 14 mg/mL에서의, 10 mM NaH2PO4, 4% 만니톨, 2% 트레할로스, 0.01% 폴리소르베이트 20(pH 6.0)(조제물 ID = P6MT 완충액) 내의 PEG-hGH를 30 게이지 바늘을 이용하여 주입 타당성에 대해 시험하였다. 샘플을 8 lbs의 힘 하에 지속적시간 동안 30 게이지 바늘을 통해 밀어 넣었다. 1 ml의 각 농도를 8 lbs 하에 30 게이지 바늘을 통해 밀어 넣을 때, 8 mg/mL, 10 mg/mL, 12 mg/mL 및 14 mg/mL 농도가 각기 7.4 s(초), 9.9 s, 9.9 s, 및 10.7 s로 주입되었다.
표준 사람이 일반적으로 8 lbs 이하의 힘을 주사기에 인가할 수 있기 때문에, 8 lbs의 힘 하에서 10초 내 1 cc의 주입은 주입용 표준물질로서 수용된다.
실시예 16
1주 재구성 연구
이 연구를 위해, 재구성된 샘플을 4℃에서 1주 동안 저장하였다. 이 연구를 위해 사용된 조제물 매트릭스는 표 13에서와 동일하였다. 1주 동안 저장한 후, 농도 및 pH를 측정하였다. 샘플을 또한 표 72-74 및 도 59-60에 나와 있는 바와 같이, SEC-HPLC, RP-HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
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Figure 112007051714492-PCT00077
Figure 112007051714492-PCT00078
4℃에서 1주간 재구성된 샘플을 저장함으로써, 그 결과 P6MT, P6MTMet, P7GT 및 P6GT-P의 전방피크 1이 약간 증가되었다(~1%). 저 pH 샘플은 pH 6 및 7의 샘플보다 더한 탈PEG화를 나타냈다.
실시예 17
교반 / UV 연구
샘플에 장기 저장 조건을 모방할 수 있는 스트레스를 가하였고, 분해 또는 응집 생성물의 유도를 관찰하였다. UV 광에 노출될 때의 분해는 분자 내에서, 또는 구체적으로 옥심 또는 PEG에서 일어날 수 있다. 2개의 교반 연구를 수행하였다. 4시간 교반 연구에서, 표 13으로부터의 재구성된 샘플을 4시간 동안 주변 실온에서 격렬하게 보어텍싱한 후, 농도 및 pH를 측정하였고, SEC-HPLC, RP-HPLC, 및 SDS-PAGE에 의해 분석을 수행하였다. 이 샘플의 부분집합을 SEC-HPLC에 의해 4℃에서 저장한 후 1주 후에 분석하여, 응집물이 단량체로 해체될 수 있는지의 여부를 조사하였다. 대조군 샘플은 4시간 동안 주변 실온에서 저장된, 재구성된 샘플이었다.
2시간 교반 연구에서, 폴리소르베이트-비함유 샘플, 그것의 폴리소르베이트-함유 상응부, 및 P6MA를 주변 온도에서 2시간 동안 온화하게 보어텍싱하여, 교반 후 PEG화된 hGH의 안정성에 대한 폴리소르베이트의 영향을 확인하였다. 표 85를 참고한다.
UV 노출 연구에 대해, 대조군은 4시간 동안 주변 실온에서 저장된, 재구성된 샘플이었다. 동결건조된 샘플을 주변 온도에서 4시간 동안 UV 광에 노출하였고, 물 중 재구성한 후, SDS-PAGE, RP-HPLC 및 SEC-HPLC에 의해 분석하였다.
표 75 내지 85를 참고한다. 이 샘플의 SDS-PAGE 분석이 도 61-66에 나와 있다. SEC-HPLC 데이터는 0.01%로 폴리소르베이트 20을 함유하는 모든 조제물들이 교반 중에 응집을 유도하였음을 나타냈다(30-80%). [Bam, NB et al.]는 재조합 hGH(rhGH)의 교반 동안 불용성 응집물의 억제에 있어 트윈(Tween) 20(폴리소르베이트 20)의 용도를 기재한다[J Pharm Sci. 1998 Dec; 87(12): 1554-9]. 또한, [Maa, YF et al.]은 분무-건조된 rhGH 분말의 생산에 있어 불용성 단백질 응집물의 감소를 초래하였음을 나타냈다[J Pharm Sci 1998 Feb; 87(2): 152-9]. 교반-유도 응집물은 비가역성 비공유 응집물임이 밝혀졌다. 주요 광-유도 분해 경로는 탈PEG화 및 공유 전방피크 2의 형성이었다.
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Figure 112007051714492-PCT00085
Figure 112007051714492-PCT00086
Figure 112007051714492-PCT00087
Figure 112007051714492-PCT00088
Figure 112007051714492-PCT00089
실시예 18
교반 연구
표 86에 나와 있는 조제물 매트릭스를 이용하여 또 다른 교반 연구를 수행하였다. 유리 바이얼 내 250 μL로 충전된 2 mg/mL 샘플에 대해 교반을 수행하였다. 샘플을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 방해받지 않고 실온에서 인큐베이션한 샘플의 이벌 세트를 양성 대조군("대조군(Control)")으로 사용하였다. 샘플의 pH 및 농도를 측정하였고, SEC-HPLC 분석을 표 87-90에 나와 있는 바와 같이 t=0, 대조군 및 교반 샘플에 대해 수행하였다.
조제물 매트릭스
조제물 ID 완충액 pH 벌크화제 안정화제 계면활성제
P7MGT-P 10 mM 인산염 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스
P7MGT01P 10 mM 인산염 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 0.01% PS20
P7MGT005P 10 mM 인산염 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 0.005% PS20
P7MGT0025P 10 mM 인산염 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 0.0025% PS20
P7MGT001P 10 mM 인산염 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 0.001% PS20
H7MT-P 10 mM 히스티딘 7 4% 만니톨 2% 트레할로스
H7MGT-P 10 mM 히스티딘 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스
7MHT-P 7 2% 만니톨, 1.25% 히스티딘 2% 트레할로스
Figure 112007051714492-PCT00090
Figure 112007051714492-PCT00091
Figure 112007051714492-PCT00092
Figure 112007051714492-PCT00093
미량의 폴리소르베이트는 교반 하에 응집을 유도하였다. 교반 시에 히스티딘 조제물은 글리신-함유 조제물에 필적하게 수행하였다.
실시예 19
가속화 응집 연구
장기 저장 조건을 모방하고 잠정적 분해 또는 응집 생성물을 확인하기 위해, 가속화 응집 연구를 수행하였다. 대략 8 및 14 mg/ml의 두 조제물(조제물 ID H7MT-P 및 H7MGT-P)을 이용하여, 가속화된 응집 연구를 수행하였다. 조제물의 성분들이 표 91에 기재되어 있다. "-P" 표시는 폴리소르베이트 20의 부재를 가리킨다. 연구된 스트레스는 냉동-해동 조건, 교반, UV 노출 및 온도였다. 상기 방법을 사용하여 PEG화된 hGH를 평가하였다. 샘플을 실시예 9 및 11에 기재된 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 방법으로 각기 평가하였다. 부가적 분석 시점은 1개월, 2개월 등을 포함한다. 부가적 샘플 분석 기법은 동적 광 산란(DLS) 및 분석적 초원심분리를 포함한다.
조제물 매트릭스 (가속화 응집 연구)
조제물 ID 완충액 pH 벌크화제 안정화제 농도
H7MT-P 10 mM 히스티딘 7 4% 만니톨 2% 트레할로스 8 mg/mL
H7MT-P 10 mM 히스티딘 7 4% 만니톨 2% 트레할로스 14 mg/mL
H7MGT-P 10 mM 히스티딘 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 8 mg/mL
H7MGT-P 10 mM 히스티딘 7 2% 만니톨, 1.25% 글리신 2% 트레할로스 14 mg/mL
63 mL의 5.7 mg/mL PEG화된 hGH(20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6) 내)을 14.2 mg/mL로 농축하였다. 농축물의 절반을 H7MT-P에 대해 투석하였고, 나머지 절반을 H7MGT-P에 대해 투석하였다. 투석으로 단백질이 희석되게 되었으므로, H7MT-P 내의 샘플은 13.6 mg/mL로 농축되었고, H7MGT-P는 13.5 mg/mL로 농축되었다. 13.6 mg/mL의, H7MT-P 내의 PEG화된 hGH의 일부(대략 4.5 mL)를 H7MT-P 완충액을 이용하여 7.8 mg/mL로 희석하였다. 유사하게, 13.5 mg/mL의, H7MGT-P 내의 대략 4.5 ml의 PEG화된 hGH를 H7MGT-P 완충액을 이용하여 8.0 mg/mL로 희석하였다.
냉동/해동 연구
조제물을 15분 동안 -70℃에서 냉동시켰다. 이어서, 그것을 25℃에서 해동하였다. 이어서, 바이얼을 열어, 샘플의 일부를 제거하여 SEC-HPLC 및 SDS-PAGE 분석을 행하였고, 바이얼을 다시 닫았다. 이 절차를 5회 반복하였다. SEC-HPLC 분석의 결과가 표 92 내지 95에 나와 있다. SDS-PAGE 분석의 결과가 도 67 내지 70에 나와 있다.
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 조제물 ID; H7MT-P; 농도: 8 mg/ml
빈도 F/T % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
0 1.00 0.71 98.15 0.14 7.16E+04
1 0.70 0.65 98.57 0.08 7.50E+04
2 0.75 0.65 98.53 0.07 7.57E+04
3 0.78 0.66 98.43 0.12 7.69E+04
4 0.88 0.68 98.36 0.08 7.62E+04
5 1.04 0.77 98.10 0.08 7.89E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 조제물 ID; H7MT-P; 농도: 14 mg/ml
빈도 F/T % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
0 0.66 0.62 98.63 0.09 6.81E+04
1 0.64 0.63 98.65 0.08 7.36E+04
2 0.65 0.63 98.64 0.08 7.35E+04
3 0.67 0.66 98.59 0.08 7.96E+04
4 0.76 0.66 98.47 0.10 8.08E+04
5 0.84 0.65 98.39 0.11 7.60E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 조제물 ID; H7MGT-P; 농도: 8 mg/ml
빈도 F/T % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
0 0.73 0.64 98.51 0.12 7.41E+04
1 0.61 0.65 98.62 0.12 7.45E+04
2 0.77 0.62 98.47 0.14 7.42E+04
3 0.82 0.67 98.41 0.10 7.58E+04
4 0.69 0.67 98.55 0.08 7.58E+04
5 0.92 0.69 98.26 0.13 7.43E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 조제물 ID; H7MGT-P; 농도: 14 mg/ml
빈도 F/T % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
0 0.81 0.66 98.43 0.09 7.26E+04
1 0.78 0.68 98.44 0.10 7.64E+04
2 0.75 0.65 98.47 0.13 7.44E+04
3 0.74 0.68 98.49 0.08 8.06E+04
4 0.89 0.65 98.37 0.09 7.42E+04
5 0.99 0.70 98.21 0.11 7.16E+04
샘플의 냉동/해동으로 고 MW 응집물이 0.2 내지 0.3% 증가하게 되었고, 8 mg/mL 샘플에서는 첫 번째 냉동-해동 사이클 후 고 MW 응집물이 해체될 수 있었다.
보어텍스 / UV 노출
이 연구를 위해, 표 91에 나와 있는 조제물 매트릭스를 사용하였다. 교반(보어텍스) 및 UV 노출 연구에서의 대조군 샘플에 대해, 조제물을 6시간 동안 실온에서 유지시켰다. 교반 연구에서, 액체 샘플을 고속으로 6시간 동안 실온에서 보어텍싱하였다. UV 노출 연구에서, 동결건조된 샘플을 4시간 동안 실온에서 UV 광에 노출하고, 재구성한 후, 분석하였다. 샘플을 꺼내어, SEC-HPLC 및 SDS-PAGE 분석을 행하였다. 표 96 내지 98은 대조군 샘플, 보어텍싱된 샘플 및 UV 노출 샘플에 대한 SEC-HPLC 데이터를 나타낸다. 이 샘플의 SDS-PAGE 분석이 도 71 및 72에 나와 있다.
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 보어텍스/UV 조절
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 0.78 0.68 98.43 0.11 7.58E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 0.66 0.66 98.57 0.11 7.63E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 0.69 0.69 98.49 0.13 7.52E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 0.77 0.68 98.43 0.12 7.58E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 보어텍싱된 샘플 (실온에서 6시간 동안 보어텍싱함)
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 9.99 n/a 89.89 0.11 7.68E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 14.75 n/a 85.13 0.12 7.11E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 16.85 n/a 83.04 0.10 7.78E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 4.22 n/a 95.69 0.09 7.40E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); UV-노출 샘플 (실온에서 4시간 동안 UV 광에 노출함)
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 0.64 0.91 97.96 0.49 7.49E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 0.67 0.84 98.17 0.32 7.14E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 0.53 0.82 98.14 0.50 7.55E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 0.71 0.83 98.13 0.33 7.38E+04
폴리소르베이트 20을 포함하지 않는 히스티딘 조제물은 격렬한 교반으로 형성된 응집물의 양을 감소시키는 것으로 확인되었다.
탈PEG화는 주요 분해 현상이었고, 샘플의 hGH 농도가 낮을수록 더 현저하였다. UV 노출은 대조군에 비해% 전방피크 2(이량체화)를 초래하였다.
또 다른 교반 연구에서, 동결건조된 샘플을 1주 또는 2주 동안 4℃ 또는 40℃에서 저장하였다. 이어서, 샘플을 재구성한 후, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 표 99 내지 102는 SEC-HPLC 결과를 나타낸다. 도 73 및 74는 1주 샘플에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 도 75 및 76은 2주 샘플에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); T=1주, 4℃
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 0.63 0.65 98.59 0.13 7.45E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 0.51 0.60 98.76 0.12 7.41E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 0.62 0.63 98.60 0.14 7.46E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 0.81 0.63 98.44 0.12 7.42E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); T=2주, 4℃
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 0.72 0.64 98.55 0.09 7.35E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 0.58 0.66 98.69 0.07 7.12E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 0.42 0.51 98.98 0.09 7.18E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 0.50 0.66 98.75 0.08 7.15E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); T=1주, 40℃
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 0.51 0.87 96.83 1.79 7.65E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 0.45 0.92 96.83 1.80 7.19E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 0.41 0.77 96.34 2.48 7.82E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 0.46 0.88 96.11 2.55 7.40E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); T=2주, 40℃
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 0.39 0.90 95.80 2.91 7.41E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 0.39 1.02 95.37 3.22 6.97E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 0.32 0.77 94.50 4.41 7.36E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 0.39 0.97 94.15 4.49 6.89E+04
1주 후, H7MT-P은 4℃에서 H7MGT-P보다 더 적은 고분자량 응집물을 생성시켰다. H7MT-P는 약간 더 많은 이량체 형성을 초래하였으나, 40℃에서 H7MGT-P보다 더 적은 탈PEG화된 hGH를 초래하였다. 2주 후, 증가된 양의 이량체화가 40℃에서 관찰되었다. 상당한 탈PEG화가 40℃에서 관찰되었다. H7MT-P는 40℃에서 H7MGT-P보다 더 적은 탈PEG화된 hGH를 형성시켰다. 부가적 시점은 4주에서의 측정을 포함한다.
또한, PEG화-hGH의 샘플을 열 풀림 조건에 노출하였다. 열 풀림 샘플을 82℃의 융점(Tm)보다 높은 85℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 표 103은 열 풀림에 노출된 샘플의 SEC-HPLC 분석을 나타낸다. SDS-PAGE 분석이 도 73 및 74에 나와 있다.
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 열-풀림
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P; 8 mg/ml 89.23 n/a 10.77 0 8.14E+04
H7MT-P; 14 mg/ml 91.89 n/a 8.11 0 7.81E+04
H7MGT-P; 8 mg/ml 90.09 n/a 9.91 0 8.42E+04
H7MGT-P; 14 mg/ml 92.18 n/a 7.82 0 7.97E+04
실시예 20
FT /IR(푸리에 변환 적외선 분광법( Fourier Transform Infrared Spectroscopy) 스캔
PEG화된 hGH의 분석을 FT/IR을 이용하여 수행하였다. 재스코(Jasco) 모델 FT/IR 660 플러스(Plus)에서 FT/IR 스캔을 수행하였다. 각 샘플을 4 cm-1의 해상도로 320회 스캔하였고, 재스코 스펙트라 메니저(Jasco Spectra Manager) vl.53.00를 이용하여 분석하였다. 공기 배경 및 물 블랭크를 각 일의 샘플 실행 전에 취하였다. 물에서 유래된 신호의 제거는 1700 cm-1에서의 흡광도의 부재로 확인되었다. 적절한 배경 및 블랭크 대조군을 각 샘플 스펙트럼에서 뺀 후, 나머지 단백질 및 부형제 피크의 두 번째 유도 분석을 아미드 I 영역(1600-1700 cm-1)에서 수행하였다. 액체 대조군으로서, 6 mg/mL의 PEG-hGH 벌크를 사용하였다.
PEG-hGH의 아미드 I 신호는, 심지어 동결건조 후에도 다른 단백질보다 상대적으로 더 약했다. 그러나, 대부분의 샘플은 1651 cm-1에서 α-나선 신호를 나타냈고, 이에 따라 조제물 후보물질들 간의 정성적 비교를 달성할 수 있었다. 글리신은 아미드 I 영역에서 강한 신호를 나타내고, 이에 따라 신호는 원래의 데이터에서 글리신 신호를 빼는 과정 중에 왜곡될 수 있었다.
액체 대조군 대비, P6MT, S4MT, S5MT, H6MT, P6GT, P6MS, P6MTmet, P7MT 및 P6MT-P 조제물의 두 번째-유도 FTIR 스펙트럼[신호 강도(y 축) 대 파수(cm-1(x-축)]은 이하를 나타냈다: 1) 대부분의 만니톨 조제물은 완충액 또는 pH에 무관하게 양호한 α-나선 신호를 보전하였다. 2) 한 조제물로서 글리신을 함유하는P6GT는 밴드 신호에 있어 상당한 이동을 나타냈다. 3) 다른 피크들이 1620, 1630, 1725 및 1750에서 관찰되었다. S5GT, P6MA, P7GT, P6MGT, P6MGT-P, 및 P6GT-P 조제물의 두 번째 유도 FTIR 스펙트럼은 불량한 α-나선 신호를 가졌다. 또한, 모든 글리신 조제물은 액체 샘플의 본연의 신호에서 상당한 이탈을 나타냈다. 아르기닌-함유 조제물은 동결건조 중에 주요 구조적 변화를 나타냈다.
4℃에서 동결건조된 물질을 2개월간 저장한 후, FT/IR을 수행하였다. PEG-hGH의 아미드 I 신호는 심지어 동결건조 후에도 다른 단백질보다 상대적으로 약했다. 그러나, 대부분의 샘플들은 1651 cm-1에서 α-나선 신호를 나타냈고, 이에 따라 조제물 후보물질들 간의 정성적 비교가 달성될 수 있었다. 글리신은 아미드 I 영역에서 강한 신호를 나타냈다. 2개월째, 모든 글리신 조제물은 액체 샘플의 본연의 신호에서 상당한 이탈을 나타냈다. 대부분의 만니톨 조제물은 완충액 또는 pH에 무관하게 양호한 α-나선 신호를 보전하였다.
실시예 21
교반 (계면활성제 시험)
20 mM 시트르산나트륨, 2% 글리신, 0.5% 만니톨(pH 6) 내의 PEG-hGH를 H7MT-P를 이용하여 2 mg/mL로 희석하였다. 0.01% 폴리소르베이트 20(PS)을 한 샘플에 첨가하였고, 0.01% 플루로닉 F68(F68)을 다른 한 샘플에 첨가하였으며, 세 번째 샘플에는 계면활성제를 첨가하지 않았다. 유리 바이얼 내 500 μL 충전으로 교반을 수행하였다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 샘플의 SEC-HPLC 분석이 표 104에 나와 있고; 교반된 샘플을 "Vtx"로 표시한다.
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 계면활성제와의 교반
조제물 ID % 전방피크 1+2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P, t=0 2.84 98.16 0 5.81E+045.59E+04
H7MT, 0.01% PS, t=0 1.49 98.51 0 5.59E+04
H7MT, 0.01% F68, t=0 1.58 98.42 0 5.75E+04
H7MT-P, 1시간 보어텍싱 12.54 87.46 0 5.79E+04
H7MT, 0.01% PS, 1시간 보어텍싱 57.21 42.79 0 6.13E+04
H7MT, 0.01% F68, 1시간 보어텍싱 4.43 95.57 0 5.58E+04
시험한 다른 샘플에 비해, 플루로닉 F68은 표 104에 나와 있는 바와 같이 교반 유도 응집의 방지에 있어 가장 효과적이었다.
부가적 실험은 잔류 부형제를 제거하기 위해 샘플을 희석하는 것 대신에 샘플을 투석하는 것, 및/또는 폴리소르베이트 80을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 계면활성제를 시험하는 것을 포함할 수 있다. 계면활성제를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 계면활성제와 함께 사용될 수 있다. 부가적 연구는 교반-유도 응집에 대한 H7MT 조제물 내 PEG-hGH의 안정성에 대한 하기 계면활성제들의 영향을 시험하는 것을 포함한다: 1) 계면활성제 비포함(음성 대조군); 2) 0.01%를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 양의 폴리소르베이트 20; 3) 0.005%, 0.01%, 0.05% 및 0.1%를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 양의 플루로닉 F68(또는 폴록사머 188); 4) 0.01%를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 양의 폴리소르베이트 80; 및 5) 플루로닉 F68 및 폴리소르베이트 20 또는 플루로닉 F68 및 다른 계면활성제의 조합물. 최량의 계면활성제, 또는 계면활성제들의 조합물을 함유하는 부가적 동결건조된 조제물(H7MT)을 제조하고, 그것의 40℃에서의 안정성을 H7MT 조제물과 비교하게 된다. PEG-hGH의 농도는 2 mg/ml일 것이고, 분석 시점은 0, 1, 2, 3 및 4주, 또는 그 이상일 것이다. 본원에 기재된 기법을 사용하여 분석할 것이다.
실시예 22
장기 연구
부가적 장기 안정성 연구는 4℃ 및 29℃를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 온도들에서 0, 3, 6, 9, 12, 18 및 24개월 동안 저장한 후, 조제물을 평가하는 것을 포함한다. 동결건조 후에 재구성된 샘플의 안정성을 각종 시간, 예컨대 0, 1일, 3일, 및 1주간 2 내지 8℃에서 저장하는 동안 조사할 수 있다.
실시예 23
동결건조된 조제물 연구
실시예 14에 논의된 동결건조된 조제물 연구로부터 부가적 데이터를 생성시켰다. 4개월 시점에 대해 생성된 데이터는 하기를 포함한다: SDS-겔(4개월 동안 4℃ 및 25℃에서 저장한 샘플; 도 77 내지 80); 재구성 후의 농도 및 pH(표 105 내지 106); 4개월 동안 4℃ 및 25℃에서 저장한 샘플의 SEC-HPLC 분석(표 107 및 108); 및 4개월 동안 4℃ 및 25℃에서 저장한 샘플의 RP-HPLC 분석(표 109 및 110). 4개월 후, 히스티딘을 함유하는 조제물은 계속해서 시험 조제물의 SDS-PAGE를 통해 최소량의 공유 응집물을 나타냈다. 마지막 2개월에 걸쳐, H6MT 및 P7MT는 25℃에서 최소의 변화를 나타냈다.
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Figure 112007051714492-PCT00099
실시예 24
PEG-HGH을 이용한 히스티딘 상호작용 연구
이 연구의 목적은, PEG-hGH를 8 mg/mL 이상의 농도로 첨가할 때, 10 mM 히스티딘 완충액, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.0)에서 관찰된 pH 하락을 조사하는 것이다. 이 연구로써 히스티딘 조제물의 농도 의존성 pH 변화가 PEG-hGH과의 히스티딘 결합으로 인한 것인지의 여부를 조사하였다.
유리/결합된 히스티딘을 결정하기 위한 RP-HPLC 및/또는 IEX-HPLC 방법을 상기 연구에 사용할 수 있다.
5 mg/mL 및 25 mg / mL PEG - hGH 의 투석
1 또는 2가지 농도의 PEG-hGH를 하기 완충액 중 하나에 대해 투석하였다: 10 mM Na2HPO4(pH 7.1); 10 mM 히스티딘(pH 7.0); 10 mM 히스티딘(유리 염기)(pH 7.7); 30 mM 히스티딘(유리 염기)(pH 7.7). 투석 후, 단백질의 pH를 측정하였다. SEC-HPLC를 실행하고 단백질 피크 후 용출되는 히스티딘 피크를 측정함으로써 히스티딘의 양을 결정하였다. 214 nm:280 nm를 비교하여, 히스티딘의 PEG-hGH에의 결합 여부를 결정하였다.
10 mM 히스티딘(유리 염기)(pH 7.7)에 대해, 4.5 mg/ml 단백질 샘플은 pH가 7.18였고, 14.0 mg/ml 단백질 샘플은 pH가 6.89였다. 214 nm:280 nm 비는 양 단백질 농도에 대해 동일하였다(19.2). 30 mM 히스티딘(유리 염기)(pH 7.7)에 대해, 13.3 mg/ml 단백질 샘플은 pH가 7.19였다. 214 nm:280 nm 비는 19.2였다. 10 mM His(pH 7.0)에 대해, 4.6 mg/ml 단백질 샘플은 pH가 6.94였고, 13.2 mg/ml 단백질 샘플은 pH가 6.76였다. 214 nm:280 nm 비는 양 단백질 농도에 대해 동일하였다(19.1). 10 mM Na2HPO4(pH 7.1)에 대해, 4.6 mg/ml 단백질 샘플은 pH가 7.10였고, 13.2 mg/ml 단백질 샘플은 pH가 7.09였다. 214 nm:280 nm 비는 저 단백질 농도에서는 19.2였고, 고 단백질 농도에서는 19.1이었다.
농축 중의 pH 변화
농축 중 단백질의 pH 변화를 측정하였다. 10 mM 히스티딘(유리 염기) 및 30 mM His(유리 염기)를 시험하였고; 단백질 농도는 1 mg/ml에서 출발하였다. 10 mM His(유리 염기)(pH 7.7)에서, 하기 결과가 나타났다: 1.0 mg/ml 단백질은 pH 7.41를 가졌고; 11.7 mg/ml 단백질은 pH 6.82를 가졌으며; 15.0 mg/ml 단백질은 pH 6.71을 가졌다. 30 mM His(유리 염기)(pH 7.7)에서, 하기 결과가 나타났다: 1.0 mg/ml 단백질은 pH 7.58를 가졌고; 11.4 mg/ml 단백질은 pH 7.22를 가졌으며; 17.1 mg/ml 단백질은 pH 7.05를 가졌다.
히스티딘의 첨가
PEG-hGH를 14 mg/ml로 농축하고, 물에 대해 투석하였다. 적은 부피의 농축된 히스티딘을 단백질에 첨가함으로써 히스티딘 농도를 증가시켰다. pH를 각 히스티딘 증가분에서 측정하였다. 하기 pH 측정을 하기 각 히스티딘 농도(mM)에서 결정하였다: 0 mM 히스티딘에서 pH 5.57, 0.25 mM 히스티딘에서 pH 5.68, 0.5 mM 히스티딘에서 pH 5.74, 1 mM 히스티딘에서 pH 5.86, 2.5 mM 히스티딘에서 pH 6.13, 5 mM 히스티딘에서 pH 6.36, 10 mM 히스티딘에서 pH 6.63, 및 30 mM 히스티딘에서 pH 7.05.
이 연구에서, 히스티딘이 PEG-hGH에 결합하지 않는 것으로 나타났다. 히스티딘의 완충능은 단백질의 완충능을 극복할 수 없었다. 일염기성 인산염을 시험하여, 그것이 pH를 유지하기 위한 충분한 완충능을 제공하는지의 여부를 결정한다. 일염기성 인산염을 포함하나 이에 한정되지 않는, 약 pH 5.5 내지 약 pH 8.0의 완충능을 갖는 임의의 완충액이 적당할 수 있다. 히스티딘을 갖는 조제물은 교반으로 인한 보다 적은 양의 응집물 및 응집물들을 가졌다.
일염기성 인산염을 하기 검정으로 시험한다. PEG-hGH를 14 mg/ml로 농축시키고, 물에 대해 투석한다. 적은 부피의 농축된 인산염을 단백질에 첨가함으로써, 인산염 농도를 증가시킨다. 각 인산염 증가분에 대해 pH를 측정하고, pH 대 인산염 농도(mM)에서 플롯을 생성시킨다.
실시예 25
실시예 19에서 논의된 가속화 응집 연구로부터 부가적 데이터를 생성시켰다. 4주 시점들에 대해 생성된 데이터는 하기 것들을 포함한다: SDS-겔(4주 동안 4℃ 및 40℃에서 저장한 샘플; 도 81 및 82); pH(표 111); 및 4주 동안 4℃ 및 40℃에서 저장한 샘플의 SEC-HPLC 분석(표 112 및 113).
측정된 pH
조제물 ID 농도 4℃ pH 40℃ pH
H7MT-P 8 mg/mL 6.32 6.29
H7MT-P 14 mg/mL 6.17 6.17
H7MGT-P 8 mg/mL 6.42 6.39
H7MGT-P 14 mg/mL 6.28 6.25
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); T=4주, 4℃
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P 8 mg/ml 0.57 0.72 98.56 0.15 8.15E+04
H7MT-P 14 mg/ml 0.47 0.69 98.68 0.16 7.92E+04
H7MGT-P 8 mg/ml 0.50 0.69 98.60 0.21 7.83E+04
H7MGT-P 14 mg/ml 0.64 0.71 98.44 0.21 7.78E+04
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); T=4주, 40℃
조제물 ID % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
H7MT-P 8 mg/ml 0.35 1.08 92.00 6.58 8.56E+04
H7MT-P 14 mg/ml 0.29 1.24 91.53 6.94 8.07E+04
H7MGT-P 8 mg/ml 0.35 0.92 89.66 9.06 8.05E+04
H7MGT-P 14 mg/ml 0.37 1.15 89.31 9.17 7.61E+04
4주의 기간 후, H7MT-P는 4℃ 및 40℃ 모두에서 H7MGT-P보다 더 적은 탈-PEG화된 hGH를 형성시켰고, 40℃에서 적은 양의 공유 응집물을 생성시켰다. 총체적으로, 40℃에서, 주요 분해 생성물은 탈-PEG화된 hGH였고, 4℃에서 보다 증가된 양의 이량체화 및 더 많은 공유 응집물이 있었다.
실시예 26
교반 연구(계면활성제)
실시예 21에 기재된 것들에 대해 후속(follow-up) 연구를 수행하였다. PEG-hGH를 H7MT로 투석하였고, 투석된 단백질을 H7MT를 이용하여 2 mg/ml로 희석하였다. 하기 양과 같은 각종 양의 계면활성제 플루로닉 F68을 샘플에 첨가하였다: 플루로닉 F68 비첨가, 0.01% 플루로닉 F68, 0.05% 플루로닉 F68, 0.1% 플루로닉 F68, 0.25% 플루로닉 F68, 또는 0.5% 플루로닉 F68. 2개의 대조군 샘플은 단백질없이 0.01% 플루로닉 산을 갖는 H7MT 완충액을 함유하였다. 한 샘플을 보어텍싱하였고, 반면 다른 하나는 보어텍싱하지 않았다(t=0). 유리 바이얼 내 500 uL로 충전하여 교반을 수행하였고, 샘플을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 각종 샘플에 대해 SEC-HPLC 분석을 수행하였고, 결과가 표 114에 나와 있다.
SEC-HPLC(피크 면적의 요약); 교반
조제물 ID % 전방피크 1+2 % 주요 피크 총면적
H7MT, 계면활성제 비포함, t=0 4.40 95.60 8.85E+04
H7MT, 계면활성제 비포함, 2시간 보어텍싱 12.45 87.55 7.47E+04
H7MT, 0.01% F68, 2시간 보어텍싱 15.66 84.34 7.38E+04
H7MT, 0.05% F68, 2시간 보어텍싱 2.45 97.55 7.11E+04
H7MT, 0.1% F68, 2시간 보어텍싱 1.69 98.31 7.12E+04
H7MT, 0.25% F68, 2시간 보어텍싱 1.37 98.63 7.35E+04
H7MT, 0.5% F68, 2시간 보어텍싱 1.36 98.64 7.33E+04
응집 가역성을 조사하는 연구에서, 0.1% 플루로닉 F68을 보어텍싱된 대조군(계면활성제 비포함) 샘플에 첨가하여, 교반-유도 응집물이 플루로닉 F68에 의해 해체될 수 있는지의 여부를 조사하였다. 샘플을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 이 연구의 결과는 플루로닉 F68이 교반-유도 응집을 감소시킬 수는 있으나, 그것을 해체하지 않음을 보여주었다. 0.1% 플루로닉 F68을 갖는 H7MT는 보다 적은 양의 플루로닉 F68을 갖는 조제물보다 더 적은 양의 응집물을 가졌다.
실시예 27
침강 속도 분석
이 분석을 수행하여, 하기 3가지 샘플의 응집을 측정하였다: 39.9 mg/ml, 24.3 mg/ml, 및 1.0 mg/ml의 PEG-hGH 폴리펩티드. 이 스톡들을 0.6 mg/ml로 희석한 직후, 둘베코 인산염 완충 식염수(기브코(Gibco) 파트 no. 144190-144)로 측정하였다. 이 샘플들에 대한 고해상 침강 계수 분포를, 농도를 제공하는 수직 축, 및 침강 계수에 기초한 분리를 나타내는 수평 축으로 생성시켰다. 각 분포를 정규화하여, 샘플들 간의 농도 차이를 설명하였다. 39.9 mg/ml의 PEG-hGH은 1.27 S에서 주요 피크를 가졌고, 그 피크는 총 흡광도의 98.7%를 나타냈다. 24.3 mg/ml의 PEG-hGH는 1.29S에서 주요 피크를 가졌고, 그 피크는 총 흡광도의 97.5%를 나타냈다. 주요 피크(단량체)보다 빨리 침강하는 부(minor) 피크가 나타났다.
실시예 28
AUC / SEC 연구
상이한 농도(39.9 mg/ml, 24.3 mg/ml, 및 1.1 mg/ml)의 PEG화된 hGH 폴리펩티드를 갖는 샘플들, 및 표 115에 나와 있는 조제물은 SEC-HPLC, SDS-PAGE 및 AUC에 의해 분석 시에 유사한 응집 양을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 표 116은 칼럼에 로딩된 20 ug의 물질로부터의 SEC-HPLC 결과를 나타낸다. SDS-PAGE 분석(각 레인에 로딩된 10 ug)이 도 83에 나와 있다.
완충액 pH 벌크화제 안정화제 농도
30 mM 히스티딘 7 4% 만니톨 2% 트레할로스 39.9 mg/ml39.9 mg/mL
30 mM 히스티딘 7 4% 만니톨 2% 트레할로스 24.3 mg/mL
10 mM 히스티딘 7 4% 만니톨 2% 트레할로스 1.1 mg/mL
농도 % 전방피크 1 % 전방피크 2 % 주요 피크 % 비-PEG 총면적
39.9 mg/mL 0.56 1.46 97.98 0.00 5.98E+04
24.3 mg/mL 0.48 1.46 98.06 0.00 7.55E+04
1.1 mg/mL 0.67 1.55 97.79 0.00 7.58E+04
실시예 29
중간체 안정성 연구
표 117은 중간체 안정성 연구를 상세히 설명한다. 조제물 ID H7.3MT은 30 mM 히스티딘, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.3)이다. 조제물 ID H7.3MT+F은 0.1% 플루로닉 F68과 함께, 30 mM 히스티딘, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.3)로 이루어진다. 조제물 ID HP7MT은 10 mM 히스티딘, 10 mM 인산염, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.0)이다. 조제물 ID HP7MT+F는 0.1% 플루로닉 F68과 함께, 10 mM 히스티딘, 10 mM 인산염, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.0)로 이루어진다. 위치 35에서 파라-아세틸페닐알라닌이 치환된, 3가지 상이한 농도, 즉 8 mg/ml, 12 mg/ml 및 16 mg/ml의 PEG화된 hGH를 사용한다. 연구는 t=0, 1주, 8주 및 24주의 시점, 및 4℃, 25℃ 및 40℃의 온도에서의 분석을 포함한다. 이 연구에 이용되는 방법은 전술된 바와 같다: SDS-PAGE(환원 및 비환원); SEC-HPLC, RP-HPLC, IEX, FTIR, 수분 함량 등. BrdU 표지화를 포함하는 증식 검정을 이용하여 생물학적 활성을 측정한다. 간략히, 이 검정은 혈청 기아 래트 GHR(L43R)를 발현하는 BAF3 세포주, 2E2-2B12-F4를 이용하여 수행한다. 세포를 96-웰 플레이트 내 특정 밀도의 세포/웰로 플레이팅한다. 세포를 다중점 투약 범위의 PEG화된 hGH 폴리펩티드로 활성화하고, 50 uM BrdU(시그마(Sigma)(미국 미주리주 세인트루이스 소재))과 동시에 표지한다. 48시간 배양 후, 세포를 1OO ul의 BD 사이토픽스/사이토펌(BD Cytofix/Cytoperm) 용액(BD 바이오사이언시스)를 이용하여 실온에서 30분 동안 고정/투과화시킨다. BrdU 에피토프를 노출하기 위해, 고정/투과화된 세포를 37℃에서 1시간 동안 30 ug/웰의 DNase(시그마)로 처리한다. APC-접합 항-BrdU 항체(BD 바이오사이언시스)를 이용한 면역형광 염색은 FACS 어레이로 샘플을 분석할 수 있도록 한다. 이 방법에 대한 변형들이 당업자에게 공지되어 있다.
Figure 112007051714492-PCT00100
Figure 112007051714492-PCT00101
Figure 112007051714492-PCT00102
Figure 112007051714492-PCT00103
재구성 연구
조제물 ID H7.3MT는 30 mM 히스티딘, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.3)이다. 조제물 ID H7.3MT+F는 0.1% 플루로닉 F68과 함께, 30 mM 히스티딘, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.3)로 이루어진다. 조제물 ID HP7MT는 10 mM 히스티딘, 10 mM 인산염, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.0)이다. 조제물 ID HP7MT+F는 0.1% 플루로닉 F68과 함께, 10 mM 히스티딘, 10 mM 인산염, 4% 만니톨, 2% 트레할로스(pH 7.0)로 이루어진다. 동결건조된 샘플을 8주 동안 4℃에서 보유한 후, 샘플을 재구성하고, t=0, 4, 8, 및 24시간에서 실온에서 보유하고, 전술된 방법을 이용하여 분석한다. 표 118을 참고한다.
Figure 112007051714492-PCT00104
주입 타당성 연구
8, 12, 16 및 25 mg/ml의 PEG화된 hGH 폴리펩티드(조제물 ID H7.3MT)를 이용하여 주입 타당성을 시험한다. 폴리펩티드 또는 PEG가 없는 완충액 대조군뿐만 아니라, 비접합 PEG(조제물 ID H7.3MT)를 또한 대략 16 mg/ml 및 25 mg/ml에서 분석한다. 인스트론 기기를 사용하고, 27 및 29 게이지 바늘과 함께 4 lbs의 힘을 사용한다.
본원에 기재된 기법에서의 각종 조건 및/또는 매개변수에 대한 변형은 당업자에게 공지되어 있다. 상술된 방법 또는 당업자에게 공지된 기타 방법과 방법들을 조제물 연구를 위해 사용할 수 있다. 샘플에 대한 효능 연구를 당업자에게 공지된 검정을 이용하여 수행할 수 있다.
적당한 조제물은 플루로닉 산을 갖는 H7MT-P; 플루로닉 산을 갖는 H7MGT-P; H7MT-P; H7MGT-P; 플루로닉 산을 갖는 H6MT-P; 플루로닉 산을 갖는 H6MGT-P; H6MT-P; H6MGT-P; HP7MT; 플루로닉 산을 갖는 HP7MT; H7.3MT; 플루로닉 산을 갖는 H7.3MT를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적당한 조제물은 약 6 내지 약 7.3의 pH 범위를 가질 수 있다. 적당한 조제물은 약 5.5 내지 약 8의 pH 범위를 가질 수 있다. 적당한 조제물은 약 5 내지 약 30 mM로 히스티딘을 포함할 수 있다. 적당한 조제물은 약 60 g/L 이하의 만니톨을 임의적으로 포함할 수 있다. 적당한 조제물은 약 50 g/L 이하의 트레할로스를 임의적으로 포함할 수 있다. 적당한 조제물 60 g/L 이하의 글리신을 임의적으로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 오직 예시를 위한 것이고, 이들의 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며 본 출원의 기술사상 및 범위 및 첨부되는 청구범위의 범주 내에 포함된다는 점이 이해된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적으로 전체적으로 본원에 참고로 인용된다.
인용 서열
서열 번호 # 서열명
1 hGH의 전장 아미노산 서열
2 hGH의 성숙 아미노산 서열(아형태 1)
3 hGH의 32-46이 결실된 20-kDa hGH 변종체
SEQUENCE LISTING <110> Hays, Anna-Maria Buechler, Ying Litzinger, David C. <120> Formulations of Human Growth Hormone Comprising a Non-Naturally Encoded Amino Acid <130> AMBX-0077.00PCT <150> 60/638,616 <151> 2004-12-22 <150> 60/680,617 <151> 2005-05-13 <150> 60/728,035 <151> 2005-10-17 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Asn 20 25 30 Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn 35 40 45 Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser 50 55 60 Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr 85 90 95 Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg 100 105 110 Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr 115 120 125 Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn 130 135 140 Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr 145 150 155 160 Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 165 170 175

Claims (55)

  1. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 hGH 폴리펩티드의 약제학적 조제물로서,
    a) 완충액;
    b) 하나 이상의 담체, 부형제 또는 안정화제; 및
    c) 약제학적 유효량의 인간 성장 호르몬(hGH)
    을 포함하는 약제학적 조제물.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 링커, 중합체 또는 생물 활성 분자에 연결된 것인 hGH 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 폴리펩티드가 수용성 중합체에 연결된 것인 hGH 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 hGH 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 완충액이 인산염, 붕산염, HEPES, 시트르산염, 히스티딘, 히스티딘 유도체, 이미다졸, 아세트산염 및 중탄산염으로 구성된 군으로부터 선택 되는 성분을 포함하는 것인 조제물.
  6. 제1항에 있어서, 완충액의 pH가 약 pH 4.0 내지 약 pH 8.5인 것인 조제물.
  7. 제6항에 있어서, 완충액의 pH가 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.5인 것인 조제물.
  8. 제7항에 있어서, 완충액의 pH가 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.5인 것인 조제물.
  9. 제8항에 있어서, 완충액의 pH가 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.3인 것인 조제물.
  10. 제6항에 있어서, 완충액의 pH가 약 pH 5.5 내지 약 8.0인 것인 조제물.
  11. 제1항에 있어서, hGH의 약제학적 유효량이 약 0.1 mg 내지 약 30 mg인 것인 조제물.
  12. 제11항에 있어서, hGH의 약제학적 유효량이 약 2 mg 내지 약 30 mg인 것인 조제물.
  13. 제11항에 있어서, hGH의 약제학적 유효량이 약 0.1 mg 내지 약 8 mg인 것인 조제물.
  14. 제13항에 있어서, hGH의 약제학적 유효량이 약 0.5 mg 내지 약 8 mg인 것인 조제물.
  15. 제14항에 있어서, hGH의 약제학적 유효량이 약 0.5 mg 내지 약 6 mg인 것인 조제물.
  16. 제15항에 있어서, hGH의 약제학적 유효량이 약 1 mg 내지 약 5 mg인 것인 조제물.
  17. 제12항에 있어서, hGH의 약제학적 유효량이 약 2 mg 내지 약 25 mg인 것인 조제물.
  18. 제1항에 있어서, 완충액이 약 0.1 mM 내지 약 200 mM의 농도인 것인 조제물.
  19. 제18항에 있어서, 완충액이 약 1 mM 내지 약 75 mM의 농도인 것인 조제물.
  20. 제19항에 있어서, 완충액이 약 1 mM 내지 약 20 mM의 농도인 것인 조제물.
  21. 제19항에 있어서, 완충액이 약 5 mM 내지 약 30 mM의 농도인 것인 조제물.
  22. 제1항에 있어서, 하나 이상의 담체, 부형제 또는 안정화제가 항산화제, 아미노산, 탄수화물, 킬레이트제, 당 알코올, 염 형성 짝이온 및 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조제물.
  23. 제22항에 있어서, 담체, 부형제 또는 안정화제가 항산화제인 것인 조제물.
  24. 제23항에 있어서, 항산화제가 아스코르브산인 것인 조제물.
  25. 제22항에 있어서, 담체, 부형제 또는 안정화제가 아미노산인 것인 조제물.
  26. 제25항에 있어서, 아미노산이 글리신, 글루타민, 히스티딘, 히스티딘 유도체, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타메이트, 리신 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조제물.
  27. 제25항에 있어서, 아미노산이 약 0.1 g/L 내지 약 100 g/L인 것인 조제물.
  28. 제27항에 있어서, 아미노산이 약 1 g/L 내지 약 50 g/L인 것인 조제물.
  29. 제28항에 있어서, 아미노산이 약 5 g/L 내지 약 25 g/L인 것인 조제물.
  30. 제27항에 있어서, 아미노산이 약 0.1 g/L 내지 약 60 g/L인 것인 조제물.
  31. 제22항에 있어서, 담체, 부형제 또는 안정화제가 탄수화물인 것인 조제물.
  32. 제31항에 있어서, 탄수화물이 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조제물.
  33. 제32항에 있어서, 탄수화물이 트레할로스, 수크로스, 만노스, 글루코스 및 덱스트린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조제물.
  34. 제31항에 있어서, 탄수화물이 약 0.1 g/L 내지 약 100 g/L인 것인 조제물.
  35. 제34항에 있어서, 탄수화물이 약 1 g/L 내지 50 g/L인 것인 조제물.
  36. 제35항에 있어서, 탄수화물이 약 2 g/L 내지 약 25 g/L인 것인 조제물.
  37. 제34항에 있어서, 탄수화물이 약 0.1 g/L 내지 약 50 g/L인 것인 조제물.
  38. 제22항에 있어서, 담체, 부형제 또는 안정화제가 당 알코올인 것인 조제물.
  39. 제38항에 있어서, 당 알코올이 만니톨인 것인 조제물.
  40. 제38항에 있어서, 당 알코올이 약 0.1 g/L 내지 약 100 g/L인 것인 조제물.
  41. 제40항에 있어서, 당 알코올이 약 1 g/L 내지 약 50 g/L인 것인 조제물.
  42. 제41항에 있어서, 당 알코올이 약 2 g/L 내지 약 25 g/L인 것인 조제물.
  43. 제40항에 있어서, 당 알코올이 약 0.1 g/L 내지 약 60 g/L인 것인 조제물.
  44. 제22항에 있어서, 담체, 부형제 또는 안정화제가 비이온성 계면활성제인 것인 조제물.
  45. 제44항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트(polysorbate) 80 및 폴록사머(poloxamer) 188(플루로닉(Pluronic) F68)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조제물.
  46. 제44항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 약 0.0001% 내지 약 10%인 것인 조제물.
  47. 제46항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 약 0.01% 내지 약 10%인 것인 조제물.
  48. 제47항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 약 0.1% 내지 약 5%인 것인 조제물.
  49. 제48항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 약 0.1% 내지 약 1%인 것인 조제물.
  50. 제46항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 약 0.0001% 내지 약 1%인 것인 조제물.
  51. 제44항에 있어서, 2개의 비이온성 계면활성제를 포함하는 것인 조제물.
  52. 제22항에 있어서, 담체, 부형제 또는 안정화제가 킬레이트제인 것인 조제물.
  53. 제52항에 있어서, 킬레이트제가 EDTA인 것인 조제물.
  54. 제1항의 조제물의 유효량으로 hGH에 의해 조절되는 장애를 갖는 환자를 치료 하는 방법.
  55. 제1항에 있어서, 완충액이 약 pH 5.5 내지 약 8.0의 완충능을 가지는 성분을 포함하는 것인 조제물.
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