KR20070074377A

KR20070074377A - 식물병 방제활성을 갖는 길항미생물과 이들을 이용한식물병방제제

Info

Publication number: KR20070074377A
Application number: KR1020060002418A
Authority: KR
Inventors: 박서기
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2006-01-09
Filing date: 2006-01-09
Publication date: 2007-07-12
Also published as: KR100757298B1

Abstract

본 발명은 식물병 방제활성을 갖는 길항미생물과 이들을 이용한 식물병방제제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 키틴이 함유된 기본 배지에서 증식된 길항미생물들과 그들에 의해서 생산된 키티나아제 및 키틴올리고머들을 식물에 직접 살포함으로써 오이 흰가루병, 노균병, 고추 역병, 인삼의 탄저병, 점무늬병, 모잘록병 및 잿빛곰팡이병의 방제에 우수한 방제효과를 얻을 수 있는 식물병방제제에 관한 것이다.

본 발명은 키틴분해 능력을 지니면서 식물병 방제활성을 갖는 리소박터 엔자이모게네스 C-3 (Lysobacter enzymogenes C-3) 와 크로모박테리움속 스트레인 C-61 (Chromobacterium sp. strain C-61), 쎄라시아 플리무티카 (Serratia plymuthica), 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2 (Streptomyces sp. strain S-2) 균주들을 선발하였고, 이들의 생육과 키티나아제 및 키틴올리고머의 생산을 극대화할 수 있는 배지의 조성 및 대량 배양 방법을 밝혔으며, 그 배양액을 식물체에 직접 살포함으로써 병을 방제할 수 있는 방법으로 오이 흰가루병과 노균병, 고추 역병, 인삼의 탄저병, 점무늬병, 모잘록병, 잿빛곰팡이병의 방제제로 사용할 수 있다.

키틴+기본배지, 길항미생물, 키티나아제, 키틴올리고머, 식물병 방제

Description

식물병 방제활성을 갖는 길항미생물과 이들을 이용한 식물병방제제 {Antagonistic microorganisms having activity against plant pathogens and plant diseases controlling agent comprising the same}

도 1은 본 발명에서 얻어진 길항미생물들의 키틴분해 능력을 나타낸 사진이다(Ly: 리소박터 엔자이모게네스 C-3, Ch: 크로모박테리움속 스트레인 C-61, Se: 쎄라시아 플리무티카, S2: 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2).

도 2는 감자전즙한천배지에서 고추의 토양병원균들에 대한 길항미생물들의 균사억제력을 나타낸 사진이다(길항미생물; Ly: 리소박터 엔자이모게네스 C-3, Ch: 크로모박테리움속 스트레인 C-61, Se: 쎄라시아 플리무티카, S2: 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2, 식물병원균; Ph: 파이토프쏘라 캡사이시, Rh: 라이족토니아 솔라니, Fo: 푸스리움 옥시포리움, Fs: 푸스리움 솔라니).

도 3은 감자전즙한천배지에서 인삼의 여러 병원균에 대한 길항미생물들의 균사억제력을 나타낸 사진이다(길항미생물; Ly: 리소박터 엔자이모게네스 C-3, Ch: 크로모박테리움속 스트레인 C-61, Se: 쎄라시아 플리무티카, S2: 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2, 식물병원균; Ap: 올터나리아 파낙스, Cg: 컬렉토트리쿰 글레오스포리오이데스, Pc: 파이토프쏘라 칵토륨, Bc: 보트리스 시네레아, Rs: 라이족토니 아 솔라니, Py: 피시움 얼티멈).

도 4는 길항미생물인 리소박터 엔자이모게네스 C-3의 16S rDNA 염기서열(614bp)을 나타낸다.

도 5는 길항미생물인 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2의 16S rDNA 염기서열(806bp)을 나타낸다.

도 6은 길항미생물인 쎄라시아 플리무티카의 16S rDNA 염기서열(603bp)을 나타낸다.

도 7은 길항미생물인 크로모박테리움속 스트레인 C-61이 생산하는 키티나아제 유전자의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 8은 포장 상태에서 리소박터 엔자이모게네스 C-3와 크로모박테리움속 스트레인 C-61의 혼합 배양액(원액)을 처리하였을 경우의 오이 흰가루병 방제효과를 나타낸 사진이다.

도 9는 폿트 상태에서 고추 역병균을 접종하고 쎄라시아 플리무티카 (Se), 리소박터 엔자이모게네스 C-3(Ly), 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch)을 처리하였을 경우의 고추 역병 방제효과를 나타낸 사진이다.

도 10은 포장상태에서 쎄라시아 플리무티카, 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61의 혼합배양액(원액)을 처리하였을 경우의 고추 역병 방제효과를 나타낸 사진이다.

도 11은 3년근과 4년근 인삼포장에 리소박터 엔자이모게네스 C-3와 크로모박테리움속 스트레인 C-61의 혼합 배양액(원액)을 처리하였을 경우의 인삼 점무늬병 방제효과를 나타낸 사진이다.

도 12는 폿트 상태에서 리소박터 엔자이모게네스 C-3(Ly), 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch)의 배양액을 처리하였을 경우의 인삼 모잘록병 방제효과와 쎄라시아 플리무티카 (Se)의 처리에 의한 인삼 피해를 나타낸 사진이다.

본 발명은 식물병 방제활성을 갖는 길항미생물과 이들을 이용한 식물병 방제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 키틴이 함유된 기본배지에서 증식된 길항미생물들과 그들에 의해서 생산된 키티나아제 및 키틴올리고머들을 식물에 직접 살포함으로써 우수한 방제효과를 얻을 수 있는 식물병방제제에 관한 것이다.

길항미생물의 식물병 억제는 일반적으로 항생, 기생, 경쟁 작용에 의해서 일어나는 것으로 알려져 있다. 이 중에서 기생 작용이란 식물병원진균 세포벽의 주요 구성성분인 키틴과 글루칸을 분해하여 억제하는 것을 의미한다. 따라서 키틴 분해효소(키티나아제)를 분비하는 미생물(키틴분해미생물)들은 식물병원진균의 세포벽을 분해하여 병을 억제하는 것으로 알려져 있다(한국식물병리학회지, 1995). 또한 키틴 및 키토산을 토양에 처리하였을 경우에는 유용미생물이 증식하여 작물의 뿌리가 촉진된다는 보고 (한국, 출원번호 10-1994-0000305) 가 있고, 키틴분해미생물들을 퇴비 조제 시에 첨가하여 토양에 처리하면 식물병이 방제된다는 보고 (한국, 출 원번호 10-1997-0026538, 출원번호 10-2004-0020482) 등도 있다. 본 발명자도 키틴분해성 길항미생물들인 트리코데르마속(Trichoderma sp.)과 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.)을 키틴이 함유된 상토에 처리하고 작물을 육묘 후 포장에 이식하였을 경우 작물의 생육은 물론 토양병을 억제한다는 것을 발견하였다(한국식물병리학회지, 2003). 이외에 길항미생물을 제제화(생물농약)하여 유기합성농약처럼 식물에 살포함으로써 병을 방제하려는 시도가 많이 진행되고 있다.

그러나 현재 개발된 미생물제나 생물농약이 일반 농민들의 호응을 받기 위해서는 눈에 보이는 방제효과, 즉 유기합성농약 정도의 방제효과를 얻을 수 있어야 한다. 일반적으로 생물농약에 함유된 길항미생물들은 유기합성농약에 비하여 병원균 억제력이 더 약할 뿐만 아니라 식물체 내로 스며들지 못하고 표면에만 존재하기 때문에 병 방제효과가 더 낮다. 또한, 현재 개발되고 있는 생물농약들은 길항미생물을 배양하여 제제화해야 하기 때문에 노력은 물론 비용이 많이 소요된다. 따라서 미생물제나 생물농약이 성공하기 위해서는 기존보다 더 큰 방제효과를 낼 수 있어야 하고, 또한 조제하는데 소요되는 노력과 비용이 더 절감되어야 한다.

식물병에 대한 생물적 방제법은 국내, 외를 막론하고 오래전부터 연구돼 오고 있고 무수한 길항미생물들이 보고되고 있다. 본 발명에서 선발된 4종의 길항미생물 중에서도 쎄라시아 플리무티카는 대파 흑색썩음균핵병 (한국, 출원번호 10-2002-0010279), 스트렙토마이세스속 (Streptomyces sp.) 은 고추 역병, 벼 도열병, 사과 겹무늬 썩음병, 사과 탄저병 (한국, 출원번호10-1994-0005381), 식물 역병 및 입고병 (한국, 출원번호 10-2000-0079923)에 대한 길항미생물로서 국내특허가 있 다. 그러나 본 발명에서와 같은 방제법이나 그들의 키틴분해 능력에 대한 연구는 없다. 또한, 크로모박테리움속 스트레인도 고추 모잘록병균의 길항미생물로 보고되었지만 (한국식물병리학회지 1995년), 본 발명에서처럼 다양한 식물병에 적용한 예는 없다.

본 발명은 상기와 같이 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 키틴분해 능력을 지니면서 식물병 방제활성을 갖는 길항미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 비용 및 노력이 적게 소요되면서도 유기합성농약 정도의 큰 병 방제효과를 나타낼 수 있는 식물병 방제활성을 갖는 길항미생물을 이용한 식물병 방제제를 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 식물병 방제활성을 가지는 리소박터 엔자이모게네스 C-3(KACC 91200P)균주를 포함한다.

또한, 본 발명은 식물병 방제활성을 가지는 크로모박테리움속 스트레인 C-61(KACC91199P)을 포함한다.

또한, 본 발명은 리소박터 엔자이모게네스 C-3(KACC 91200P) 균주 또는 크로모박테리움속 스트레인 C-61(KACC 91199P)중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식 물병방제제를 포함한다.

상기에서 식물병방제제는 리소박터속, 크로모박테리움속, 쎄라시아 플리무티카, 스트렙토마이시스속 중에서 선택된 하나 이상의 균주를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 미생물을 증류수에 키틴, (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 및 MgSO₄.7H₂O를 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 방법을 포함한다.

상기의 미생물을 배양하는데 있어서, 배지는 증류수 1L당 키틴 1.0~10.0g, (NH₄)₂SO₄ 0.1~1.0g, KH₂PO₄ 0.12~1.2g, K₂HPO₄ 0.1~1.0g, MgSO₄.7H₂O 0.06~0.6g을 함유하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

길항미생물을 이용하여 보다 큰 방제효과를 얻기 위해서는 첫째 병 억제력이 우수한 길항미생물들이 이용되고, 단일 종보다는 여러 종이 상호 복합적으로 병 방제에 참여해야 한다. 둘째 이들 길항미생물들이 살포된 지역에서 오랫동안 왕성하게 활동할 수 있어야 한다. 셋째 길항미생물뿐만 아니라 다른 병 억제물질들이 상호 복합적으로 작용하여 병을 방제할 수 있어야 한다.

이들의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 키틴을 주요 영양원으로 하는 미생물(키틴분해미생물)로부터 여러 식물병원균에 대하여 억제 능력이 우수한 여러 종류의 길항미생물을 선발하였다. 이들 길항미생물을 키틴+기본배지에서 배양하여 식물체에 직접 살포함으로써, 배양액 속에 들어 있는 길항미생물과 키티나아제 및 키틴올리고머들이 병 방제에 참여함은 물론 처리된 지역의 길항미생물들이 키틴올리고머들을 영양원으로 하여 더 오랫동안 생존할 수 있도록 하였다. 또한, 길항미생물들이 배양액에서 생육하면서 키티나아제와 키틴올리고머들을 자동으로 생산되도록 함으로서 조제하는데 노력과 비용을 절감할 수 있도록 하였다.

본 발명을 위하여 전남지역의 여러 논, 밭, 산림 토양 등으로부터 키틴분해능력이 우수한 균주들을 1차 선발하였고, 이들 균주로부터 각종 식물병원균에 우수한 억제력을 지닌 4종의 길항미생물, 즉, 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61, 쎄라시아 플리무티카, 스트렙토마이시스속 스트레인 에스-2 균주를 선발하였다. 도 1에서 보여주는 바와 같이 키틴분해 능력은 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch) 균주가 가장 우수하고, 그 다음으로 쎄라시아 플리무티카(Se)와 리소박터 엔자이모게네스 C-3(Ly) 균주이고, 스트렙토마이시스속 스트레인 S-2(S2) 균주는 가장 낮은 분해력을 나타낸다.

본 발명에서 분리된 길항미생물의 염색체 DNA를 추출하여 PCR로 16S rDNA 유전자를 증폭시킨 다음 염기서열을 결정하여 알려진 균주(대조균주)의 염기서열과 비교하여 균주를 동정하였다. 그 결과 표 1에서 보는 바와 같이 Ch의 16S rDNA 유전자는 크로모박테리움 바이오레시움 (Chromobcterium violaceum)과 93.0%의 유사성을 나타내서 크로모박테리움속 스트레인 C-61로 명명하고, 동 균주는 한국농용미생물센터에 11월 14일자로 KACC 91199P로 기탁하였다. Ly(리소박터 엔자이모게네 스)의 16S rDNA 유전자(서열목록 1)는 리소박터 엔자이모게네스와 99.51%로 유사하여 리소박터 엔자이모게네스 C-3로 명명하고, 동 균주는 한국농용미생물센터에 11월 14일자로 KACC 91200P로 기탁하였다. Se의 16S rDNA 유전자(서열목록 3)는 쎄라시아 플리무티카와 99.67%의 유사성을 나타내서 쎄라시아 플리무티카 그대로 명명하였고, S2의 16S rDNA 유전자(서열목록 2)는 여러 스트렙토마이세스속과 유사성을 나타내서 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2로 명명하였다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 감자전즙한천배지에서 각각의 키틴분해미생물의 인접부위에 병원균의 균사 절편을 접종하고 배양하여, 키틴분해미생물과 여러 병원균 균사 사이에 형성된 억제대의 크기를 조사함으로써 분리된 키틴분해미생물의 병원균 억제 능력을 알아볼 수 있다.

리소박터 엔자이모게네스 C-3(Ly)는 파이토프쏘라 캡사이시 (Phytophthora capsici), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 올터나리아 파낙스 (Alternaria panax), 컬렉토트리쿰 글레오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 파이토프쏘라 칵토륨 (Phytophthora cactorum), 보트리스 시네레아 (Botrytis cinerea) 등 다양한 병원균을 억제할 수 있다. 반면, 쎄라시아 플리무티카(Se)는 파이토프쏘라 캡사이시, 올터나리아 파낙스, 컬렉토트리쿰 글레오스포리오이데스, 파이토프쏘라 칵토륨, 보트리스 시네레아, 피시움 얼티멈 (Pythium ultimum) 등을 억제하고, 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch)은 라이족토니아 솔라니, 올터나리아 파낙스, 보트리스 시네레아 등을 억제하고, 스트렙토마 이시스속 스트레인 S-2는 라이족토니아 솔라니, 보트리스 시네레아 등을 억제할 수 있다(도 2, 3). 따라서 상기의 길항미생물들은 식물병원균에 대한 억제력이 각기 다르기 때문에, 이들의 조합에 따라 병 방제효과를 높일 수 있고, 또한 대상 병해의 범위를 넓힐 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에서 조제하기에 더 간편한 배지를 선정하기 위하여, 증류수에 키틴, (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄ 7H₂O를 함유한 배지를 단계별로 희석하여 길항미생물을 접종하여 배양하였다. 또한, 식물병원균은 생육하지 못하면서 길항미생물과 키티나아제의 생산 능력을 극대화할 수 있는 배지를 선정하기 위해 키틴을 제외한 화합물의 농도를 단계적으로 희석한 배지에서 길항미생물 및 식물병원균의 배양 상태를 조사하였다. 이들 배지에서 길항미생물들을 배양하였을 경우 희석배수가 높을수록 초기 생육은 약간 늦었지만, 배양 5일 이후에는 원액에서의 밀도와 큰 차이를 나타내지 않고, 키티나아제의 생산 능력은 희석배수가 높을수록 오히려 더 우수한 경향을 나타낸다. 식물병원균이 생육하지 못하고 길항미생물과 키티나아제의 생산 능력은 극대화할 수 있는 배지는 표 2에 나타낸 바와 같이 증류수 1L당 키틴 1.0g, (NH₄)₂SO₄ 0.1g, KH₂PO₄ 0.12g, K₂HPO₄ 0.1g, MgSO₄.7H₂O 0.06g을 함유하는 배지이고, 이를 "키틴+기본배지"로 하였다.

키틴+기본배지에서 길항미생물들을 대량 배양하기 위한 조건을 선정하기 위하여 배양기간에 따른 길항미생물의 밀도와 키티나아제의 활성을 조사하였다. 그 결과 모든 균주에서 배양 10일 후부터 22일까지 길항미생물의 밀도와 키티나아제의 활성에 큰 차이를 나타내지 않았다. 그러나 키틴+기본배지의 농도를 10배로 높였을 경우에는 길항미생물의 밀도와 키티나아제의 활성이 더 높았다. 따라서 길항미생물을 대량 배양할 수 있는 배지의 조성은 증류수 1L당 키틴 1.0~10.0g, (NH₄)₂SO₄ 0.1~1.0g, KH₂PO₄ 0.12~1.2g, K₂HPO₄ 0.1~1.0g, MgSO₄.7H₂O 0.06~0.6g을 포함한다. 이들 배양액 속에는 키틴이 분해되어 다양한 키틴올리고머들을 지니고 있다는 것을 알 수 있다. 따라서 이들 배양액을 길항미생물, 키티나아제, 키틴올리고머를 지닌 "미생물제"로 칭하고, 이들의 항균활성과 식물병 방제효과를 조사하게 되었다.

또한, 본 발명에서 배양액 속에 들어 있을 수 있는 키틴 및 키토올리고당과 키티나아제가 식물병원균을 어느 정도 억제할 수 있는가를 알아보기 위하여 프스리움 옥시포리움(Fusarium oxysporium), 보트리스 시네레아 (Botrytis cinerea), 클레도스포리움 스패로스퍼멈(Cladosporium sphaerospermum), 클레도스포리움 페누시멈(Cladosporium tenuissimum)에 대한 항균활성을 조사하였다. 그 결과 표4에서 보는 바와 같이 포자발아 억제효과는 올리고당의 크기와 병원균에 따라 각기 상이하며, 키틴올리고당보다는 키토올리고당의 억제효과가 훨씬 더 우수하였고, 올리고당의 크기가 커질수록 더 우수한 경향을 나타낸다.

본 발명에서 선정된 키틴+기본배지에서는 대부분의 식물병원균이 생육할 수 없기 때문에 미생물제 자체를 식물에 살포하더라도 병원균의 생육에는 큰 영향을 미치지 않을 것이다. 본 발명의 미생물제 속에 들어 있는 키티나아제는 식물병원진균의 세포벽을 분해하기 때문에 길항미생물만의 처리보다 더 높은 병 방제 효과를 기대할 수 있다. 본 미생물제 속에 들어 있는 키틴올리고머들은 병원균의 억제뿐만 아니라 식물의 병 방어능력을 유도시키고, 잎 표면을 둘러싸서 병원균의 침입을 억제하며, 미생물제가 식물 표면에 잘 부착하도록 하는 성질을 지니고 있기 때문에 병 방제 효과를 증가시킬 수 있다. 또한, 본 배지는 일반 키틴분해미생물의 배양에 이용된 배지의 주성분만 포함되어 있기 때문에 조제하기가 간단하고, 그 주성분의 농도도 1/30수준으로 매우 낮기 때문에 비용이 적게 소요되므로 매우 경제적이다. 결론적으로 길항미생물, 키티나아제 및 키틴올리고머들을 지니고 있는 미생물제의 살포는 기존의 어떠한 방법들보다 더 높은 병 방제효과를 얻을 수 있다.

상기의 여러 가능성을 검증하기 위하여 본 발명에서 개발된 미생물제를 일반 포장에서 관행 재배되고 있는 여러 작물에 살포하여 병 방제 효과를 조사하였다. 그 결과 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61, 쎄라시아 플리무티카를 함유한 미생물제는 오이 흰가루병과 노균병을 동시 방제할 수 있고, 쎄라시아 플리무티카, 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61을 함유한 미생물제는 고추 역병에 우수한 방제효과를 나타낸다. 또한, 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61을 함유한 미생물제는 인삼 탄저병과 점무늬병, 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61, 스트렙토마이시스속 스트레인 S-2를 함유한 미생물제는 인삼 모잘록병과 잿빛곰팡이병에 높은 방제효과를 나타낸다.

본 발명에 의하면 상기의 미생물제들은 모두 여러 작물의 병에 높은 방제효과를 나타내며, 조제하는데 소요되는 노력 및 비용이 낮기 때문에 앞으로 여러 식 물병의 방제에 많이 이용될 수 있으리라 기대된다. 또한, 이들의 여러 장점 때문에 본 배지의 조성 및 대량 배양 방법은 앞으로 비슷한 미생물제의 개발에 이용될 가능성이 크다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 키틴분해미생물로부터 식물병원균을 억제할 수 있는 길항미생물들의 선발

1) 우수한 키틴분해미생물의 분리

전남 지역의 논, 밭, 과수원, 산림 토양을 채취하여 멸균수에 희석하고, 키틴배지 위에 도말하여, 28℃에서 3일 배양 후, 키틴분해 능력이 우수한 4종의 미생물을 분리하였다(도 1). 도 1에서 보는 바와 같이 키틴분해 능력은 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch) 균주가 가장 우수하였고, 그 다음으로 쎄라시아 플리무티카(Se)와 리소박터 엔자이모게네스 C-3(Ly) 균주이었으며, 스트렙토마이시스속 스트레인 S-2(S2) 균주는 낮은 분해력을 나타냈다.

2) 분리된 키틴분해미생물의 병원균 억제 능력

분리된 키틴분해미생물의 병원균 억제 능력을 알아보기 위해, 감자전즙한천배지에서 3일 동안 배양한 병원균의 균사 절편 (직경 0.5cm)을 감자전즙한천배지의 중앙에 접종하고, 그 인접 4부 위에 키틴분해미생물을 접종하였다. 이들 배지를 28℃ 항온기에서 5일 동안 배양하여 키틴분해미생물과 병원균 균사 사이에 형성된 억제대의 크기를 조사하였다. 도 2, 3에서 보는 바와 같이 리소박터 엔자이모게네스 C-3(Ly)는 파이토프쏘라 캡사이시 (Phytophthora capsici), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 올터나리아 파낙스 (Alternaria panax), 컬렉토트리쿰 글레오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 파이토프쏘라 칵토륨 (Phytophthora cactorum), 보트리스 시네레아 (Botrytis cinerea) 등 다양한 병원균을 억제하였다. 반면, 쎄라시아 플리무티카(Se)는 파이토프쏘라 캡사이시, 올터나리아 파낙스, 컬렉토트리쿰 글레오스포리오이데스, 파이토프쏘라 칵토륨, 보트리스 시네레아, 피시움 얼티멈 (Pythium ultimum) 등을 억제하였고, 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch)은 라이족토니아 솔라니, 올터나리아 파낙스, 보트리스 시네레아, 스트렙토마이시스속 스트레인 S-2는 라이족토니아 솔라니, 보트리스 시네레아 등을 억제하였다.

3) 선발된 길항미생물의 동정

길항미생물의 염색체 DNA를 추출하여 PCR로 16S rDNA 유전자를 증폭시킨 다음 염기서열을 결정하여 알려진 균주(대조균주)의 염기서열과 비교하여 균주를 동정하였다. 그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch)는 크로모박테리움 바이오레시움 (Chromobcterium violaceum) 과 93.0%의 유사성을 나타내서 크로모박테리움속 스트레인 C-61로 명명하였다. Ly의 16S rDNA 유전자 는 리소박터 엔자이모게네스와 99.51%의 유사성을 나타내서 리소박터 엔자이모게네스 C-3로 명명하였고, Se의 16S rDNA 유전자는 쎄라시아 플리무티카와 99.67%의 유사성을 나타내서 그대로 명명하였고, S2의 16S rDNA 유전자는 여러 스트렙토마이세스속과 유사성을 나타내서 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2로 명명하였다.

리소박터 엔자이모게네스 C-3의 16S rDNA 염기서열(서열목록 1)은 도 4, 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2의 16S rDNA 염기서열(서열목록 2)은 도 5, 쎄라시아 플리무티카의 16S rDNA 염기서열(서열목록 3)은 도 6. 크로모박테리움속 스트레인 C-61의 키티나아제(chitinase) 유전자의 아미노산 서열(서열목록 4)은 도 7에 나타냈다.

[표 1]

분리 균주	대조 균주	염기 유사성 (%)	동정 균주
Ch	크로모박테리움 바이오레시움 (Chromobcterium violaceum)	93.00	크로모박테리움속 스트레인 C-61 (Chromobcterium sp.strain C-61)
Ly	리소박터 엔자이모게네스 (Lysobacter enzymogenes)	99.51	리소박터 엔자이모게네스 C-3 (Lysobacter enzymogenes C-3)
Se	쎄라시아 플리무티카 (Serratia plymuthica)	99.67	쎄라시아 플리무티카 (Serratia plymuthica)
S2	스트렙토마이시스 고거로티 (Streptomyces gougerotii) Streptomyces rutgersensis subsp. rutgersensis Streptomyces intermedius Streptomyces purpurascens	98.64 98.64 98.51 98.51	스트렙토마이시스속 스트레인 S-2 (Streptomyces sp. strain S-2)

[실시예 2] 식물병원균은 생육하지 못하면서 길항미생물과 키티나아제의 생산 능력을 극대화할 수 있는 배지

키틴분해미생물의 분리에 일반적으로 사용되고 있는 배지는 증류수 1L당 콜 로이드 키틴(colloidal chitin) 2g, 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 3g, 제일인산칼륨(KH₂PO₄) 4g, 제이인산칼륨(K₂HPO₄) 3g, 황산마그네슘(MgSO₄ 7H₂O) 0.2g, 붕산(H₃BO₃) 5.6㎎, 황산구리(CuSO₄ 5H₂O) 0.4g, 황산아연(ZnSO₄ 7H₂O) 0.5㎎, 몰리브덴산나트륨(NaMoO₄ 2H₂O) 1.5㎎, 구연산철(Fe citrate) 1.0㎎, 염화칼슘(CaCl₂₎ 10㎎, 이스트 익스트랙트(Yeast extract) 0.2g, pH 7.0으로 이루어져 있다. 본 배지는 조제하기가 복잡하고 길항미생물은 물론 식물병원균들도 생육하였다.

본 발명에서는 조제하기가 더 간편한 배지를 선정하기 위하여 증류수 1L당 키틴 1g, (NH₄)₂SO₄ 3g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 3g, MgSO₄ 7H₂O 0.2g을 함유한 배지에 길항미생물을 접종하고 28℃, 180rpm의 교반항온기에서 배양하였다. 그 결과 본 배지에서는 길항미생물의 생육과 키티나아제의 생산능력 모두 우수하였지만 식물병원균이 생육하였다. 따라서 식물병원균은 생육하지 못하면서 길항미생물과 키티나아제의 생산 능력을 극대화할 수 있는 배지를 선정하기 위하여 상기의 배지를 원액으로 하고 키틴을 제외한 화합물의 농도를 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32로 희석하였다. 이들 배지에서 길항미생물들을 배양하였을 경우 희석배수가 높을수록 초기 생육은 약간 늦었지만, 배양 5일 이후에는 원액에서의 밀도와 큰 차이를 나타내지 않았고, 키티나아제의 생산 능력은 희석배수가 높을수록 오히려 더 우수한 경향이었다. 한편, 식물병원균의 생육은 난균류인 파이토프쏘라속 (Phthophthora spp.)이 원액과 1/2희석액, 피시움속 (Pythium sp)은 1/8희석액에서 까지 생육하였지만, 1/16, 1/32 희석액에서는 실시 예 1에서 공시된 모든 병원균(도 2, 3)이 생육하지 못하였다. 그리고 증류수 1L당 키틴 1g만 첨가된 배지에서는 실시 예 1에서 공시된 모든 길항미생물의 생육이 현저히 저하되었다. 따라서 본 발명에서는 식물병원균이 생육하지 못하고 길항미생물과 키티나아제의 생산 능력은 극대화할 수 있는 키틴+기본배지로서 표 2에 나타낸 배지를 선정하게 되었다.

[표 2]

증류수 (1L)
(NH₄)₂SO₄	0.1g (100ppm)
KH₂PO₄	0.12g (120ppm)
K₂HPO₄	0.1g (100ppm)
MgSO₄.7H₂O	0.06g (60ppm)
키틴	1.0g

[실시예 3] 대량 배양기에서 길항미생물 밀도와 키티나아제 활성의 극대화

뉴트리언트 액체배지 (Nutrient broth; peptone 5g, beef extract 3g, 증류수 1L)에서 28℃, 180rpm으로 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61, 쎄라시아 플리무티카는 1일간, 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2는 2일간 배양하였다. 그 배양액 500㎖를 대량배양기의 500L 키틴+기본배지(표 2)에 접종하고 28℃에서 배양하면서 3일 간격으로 길항미생물의 밀도와 키티나아제의 활성을 조사하였다. 그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 리소박터 엔자이모게네스 C-3(Ly)와 크로모박테리움속 스트레인 C-61(Ch)은 배양 7일 후, 쎄라시아 플리무티카(Se)과 스트렙토마이세스속 스트레인 S-2(S2)는 배양 10일 후 가장 높은 밀도를 나타냈고, 키티나아제는 크로모박테리움속 스트레인 C-61의 경우 배양 10일 후 최고 활성을 나타냈지만 그 나머지 균주들은 배양 16일 후에 최고의 활성을 나타냈다. 그러나 모든 균주에서 배양 10일 후부터 22일까지 미생물의 밀도와 키티나아제의 활성에 큰 차이를 나타내지 않았다. 한편, 키틴+기본배지의 농도를 10배로 높였을 경우에는 길항미생물의 밀도와 키티나아제의 활성이 더 높았다. 또한, 배양액속에는 키틴이 분해되어 다양한 키틴올리고머들을 지니고 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서 이들 배양액을 길항미생물, 키티나아제, 키틴올리고머를 지닌 미생물제로 칭하고, 이들의 항균활성과 식물병 방제효과를 조사하게 되었다.

[표 3]

배양 기간 (일)	Ly		Se		Ch		S2
배양 기간 (일)	밀도	상대활성	밀도	상대활성	밀도	상대활성	밀도	상대활성
1	6.1	1.0	6.5	1.0	5.4	1.0	3.7	1.0
4	10.2	4.0	9.8	7.6	9.5	16.8	7.3	8.2
7	12.4	11.3	10.9	10.6	11.6	29.5	8.6	15.5
10	12.1	15.2	11.7	13.3	11.3	33.2	9.5	21.7
13	12.3	16.5	11.4	14.5	11.5	31.8	9.3	22.3
16	11.9	17.8	11.1	15.7	11.0	29.4	8.9	24.5
19	12.1	15.9	11.3	15.1	11.2	30.2	9.4	22.7
22	11.7	16.2	11.0	14.7	11.3	28.4	9.3	23.3

[실시예 4] 키틴올리고당, 키토올리고당 및 키티나아제의 항균활성

배양액 속에 들어 있을 수 있는 키틴 및 키토올리고당과 키티나아제가 식물병원균을 어느 정도 억제할 수 있는가를 알아보기 위하여 여러 작물에 병을 일으키는 푸스리움 옥시포리움(Fusarium oxysporium), 보트리스 시네레아 (Botrytis cinerea)와 저장중인 배에 병을 일으키는 클레도스포리움 스패로스퍼멈(Cladosporium sphaerospermum), 클레도스포리움 페누시멈(Cladosporium tenuissimum)에 대한 항균활성을 조사하였다. 즉, 마이크로플레이트(microplate)에 정제된 2~6당의 키틴 혹은 키토산과 키티나아제를 농도별로 넣고, 각 병원균의 포자현탁액(10⁴ 포자/㎖)과 20%의 감자전즙(PDB)을 넣은 다음 28℃에서 24시간 보존 후 현미경하에서 포자발아율을 조사하였다. 그 결과 표4에서 보는 바와 같이 포자발아 억제효과는 올리고당의 크기와 병원균에 따라 각기 상이하였는데, 전체적인 경향으로 볼 때 키틴올리고당보다는 키토올리고당의 억제효과가 훨씬 더 우수하였고, 올리고당의 크기가 커질수록 더 우수한 경향이었다. 또한, 키토올리고당의 경우 보트리스 시네레아, 클레도스포리움 스패로스퍼멈, 클레도스포리움 페누시멈에 대한 항균활성은 우수하였지만 푸스리움 옥시포리움에 대한 활성은 낮았다. 키티나아제의 경우는 클레도스포리움 스패로스퍼멈과 클레도스포리움 페누시멈에 대하여 20ppm에서도 항균활성을 보여 주었지만 보트리스 시네레아에 대해서는 200ppm에서 활성이 관찰되었고, 푸스리움 옥시포리움에 대해서는 2000ppm에서도 항균활성이 관찰되지 않았다.

[표 4]

처리 시료		50% 이상의 포자 발아 억제 농도(ppm)
처리 시료		보트리스 시네레아	푸스리움 옥시포리움	클레도스포리움 스패로스퍼멈	클레도스포리움 페누시멈
키토올리고당	2당	500	>5000	500	500
	3당	500	>5000	500	500
	4당	50	5000	50	50
	5당	5	500	5	5
	6당	5	50	5	5
키틴올리고당	2당	>5000	>5000	5000	5000
	3당	>5000	>5000	5000	5000
	4당	>5000	>5000	500	500
	5당	5000	5000	50	500
	6당	5000	5000	50	50
키티나아제		200	>2000	20	20

[실시예 5] 미생물제를 이용한 오이 흰가루병과 노균병의 방제효과

폿트 실험

순천대학 구내 유리 온실에 오이를 정식하고 흰가루병과 노균병의 이병엽을 처리하여 자연 발병토록 한 다음 실시 예 2의 방법에 의해서 10일간 배양된 미생물제를 처리 당 5주씩 3 반복으로 10일 간격 2회 처리하고 마지막 처리 10일 후의 발병도를 조사하였다.

포장 실험

전남 순천시 대대동 김태현씨의 오이재배 비닐하우스에서 실시 예 3의 방법에 의해서 10일간 배양된 미생물제를 처리 당 100평에 2.5말을 처리하고 10일 후의 발병도를 조사하였다. 발병도(%)는 다음의 공식에 의하여 산출되었다.

발병도(%) = {∑(발병수 × 계수) ÷ 4N} × 100

여기에서 0=발병 무, 1=병반 면적 1~5%, 2=병반 면적률 5.1~20%, 3=병반 면적률 20.1~40%, 4=병반 면적률 40.1% 이상으로 하였고, N=조사 엽수이다.

방제가(%)는 다음의 공식에 의하여 산출되었다.

방제가(%) = {(무처리군 발병도-처리군 발병도)÷무처리군 발병도}×100

실험 결과

표 5에서 보는 바와 같이 폿트 실험에서 무처리의 흰가루병 발병도는 48.7%, 노균병은 21.3%이었고, 포장 실험에서 무처리의 흰가루병 발병도는 65.3%, 노균병은 32.3%이었다. 미생물제를 처리하였을 경우에는 폿트 실험의 경우 흰가루병은 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 쎄라시아 플리무티카, 크로모박테리움속 스트레인 C- 61의 모든 처리구에서 85% 이상의 높은 방제가를 나타냈고, 노균병은 쎄라시아 플리무티카 처리구에서만 73%의 방제가를 나타냈다. 포장 실험의 경우 흰가루병은 리소박터 엔자이모게네스 C-3+크로모박테리움속 스트레인 C-61 처리구나 리소박터 엔자이모게네스+크로모박테리움속 스트레인 C-61+쎄라시아 플리무티카 처리구 모두에서 높은 방제가를 나타냈고 이들을 10배 희석하여 살포하였을 경우에도 93.7%의 높은 방제가를 나타냈다. 한편, 노균병의 경우에는 리소박터 엔자이모게네스 C-3+크로모박테리움속 스트레인 C-61+쎄라시아 플리무티카 처리구에서만 70% 이상의 방제가를 나타냈다. 따라서 리소박터 엔자이모게네스 C-3+크로모박테리움속 스트레인 C-61+쎄라시아 플리무티카의 3 균주를 함유한 미생물제는 흰가루병과 노균병을 동시에 방제할 수 있고, 그 방제효과도 매우 우수하였다.

[표 5]

실험 장소	처리 시료	희석배수 및 사용량	흰가루병		노균병
실험 장소	처리 시료	희석배수 및 사용량	발병도 (%)	방제가 (%)	발병도 (%)	방제가 (%)
폿트 실험	리소박터 엔자이모게네스 C-3	원액	2.6	94.7	18.6	12.7
	쎄라시아 플리무티카	원액	7.2	85.2	5.8	72.8
	크로모박테리움속 스트레인 C-61	원액	4.2	91.4	19.3	9.3
	무처리	-	48.7	-	21.3	-
포장 실험	리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61	원액	2.8	95.7	28.9	10.5
	리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61	10배 희석	4.1	93.7	30.1	6.8
	리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61+쎄라시아 플리무티카	원액	3.8	94.2	7.8	75.9
	리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61+쎄라시아 플리무티카	10배 희석	4.7	92.8	9.7	70.0
	무처리	-	65.3	-	32.3	-

[실시 예 6] 미생물제를 이용한 고추 역병의 방제효과

폿트 실험. 고추 역병균인 파이토프쏘라 캡사이시를 감자전즙한천배지에서 7일 동안 배양 후, 믹서기로 잘게 미쇄하여 오트밀-토양배지(오트밀 10g+토양 90g) 에 접종하였다. 이들을 28℃에서 10일 동안 배양 후, 배양토 및 균사를 잘게 부수어 0.5mm 체로 거른 다음 접종원으로 사용하였다. 접종원은 멸균 토양 (상토)에 10% 혼합하여 폿트에 넣고 30일 된 고추 묘를 줄당 5주씩 2줄에 이식 후, 각 길항미생물의 배양액 50㎖를 관주하여 비닐하우스에 보존하면서 이병주를 조사하였다.

포장 실험. 전남 해남군 산이면 이정훈씨의 노지재배 고추에 실시 예 3의 방법에 의해서 10일간 배양된 미생물제(20말)를 처리 당 300평씩 6월 12일, 7월 4일, 7월 25일 3회에 걸쳐 토양 관주하고 20일 후의 이병주율을 조사하였다.

실험 결과. 표 6에서 보는 바와 같이 폿트 실험의 경우 역병균을 접종하고 길항미생물을 처리하지 않았을 경우(무처리) 48.7%의 이병주율을 나타냈고, 자연 발병된 포장에서는 56.4%의 이병주율을 나타냈다. 이에 비하여 리소박터 엔자이모게네스 C-3 처리구의 방제가는 43.5%, 쎄라시아 플리무티카 처리구는 77.6%, 크로모박테리움속 스트레인 C-61 처리구는 47.0%로서 쎄라시아 플리무티카 처리구가 가장 좋은 방제효과를 보여주었다. 따라서 포장 실험에서는 쎄라시아 플리무티카 단독 처리구와 상기 3 균주의 혼합배양액에 대한 방제효과를 비교해 보았는데, 단독 처리보다는 혼합배양액에서 91.8%의 높은 방제가를 나타냈다.

[표 6]

실험 장소	처리 시료	희석배수 및 사용량	이병주율 (%)	방제가(%)
폿트 실험	리소박터 엔자이모게네스 C-3	원액, 폿트당 50㎖	27.5	43.5
	쎄라시아 플리무티카	원액, 폿트당 50㎖	10.9	77.6
	크로모박테리움속 스트레인 C-61	원액, 폿트당 50㎖	25.8	47.0
	무처리	-	48.7	-
포장 실험	쎄라시아 플리무티카	원액, 300평당 20말	11.6	79.4
	쎄라시아 플리무티카+ 리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61	원액, 300평당 20말	4.6	91.8
	무처리	-	56.4	-

[실시 예 7] 미생물제를 이용한 인삼 탄저병과 점무늬병의 방제 효과

전남 해남군 산이면 박병주씨의 3년근과 4년근 인삼포장에 실시 예 3의 방법에 의해서 10일 동안 배양된 미생물제(리소박터 엔자이모게네스 C-3 + 크로모박테리움속 스트레인 C-61의 혼합 배양액)를 처리 당 100평씩 6말을 살포하고 20일 후 탄저병과 점무늬병의 이병엽율을 조사하였다. 그 결과 표 7에서 보는 바와 같이 탄저병의 경우에는 3년근 포장에서 79.4%, 4년근 포장에서 80.8%의 방제가를 나타냈고, 점무늬병의 경우에도 3년근 포장에서는 82.6%, 4년근 포장에서는 80.4%의 방제가로서 두 포장 모두에서 탄저병과 점무늬병에 대하여 우수한 방제효과를 보여주었다.

[표 7]

실험 포장	처리 시료	탄저병		점무늬병
실험 포장	처리 시료	이병엽율 (%)	방제가 (%)	이병엽율 (%)	방제가 (%)
3년근 포장	리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61 (6말/100평)	5.3	79.4	9.5	82.6
3년근 포장	무처리	25.7	-	54.7	-
4년근 포장	리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61 (6말/100평)	3.2	80.8	6.4	80.5
4년근 포장	무처리	16.7	-	32.8	-

전남 해남군 산이면 박병주씨의 5년근 인삼포장에 실시 예 3의 방법에 의해서 10일 동안 배양된 미생물제(리소박터 엔자이모게네스 C-3 + 크로모박테리움속 스트레인 C-61의 혼합 배양액)를 6월 3일, 6월 12일, 7월 4일, 7월 25일 4회 살포 하고, 동일한 방법에 의해서 인삼 점무늬병과 탄저병 약제인 아족시스트로빈 액상수화제를 살포한 후 인삼 탄저병과 점무늬병에 대한 방제효과를 비교하였다. 표 8에서 보는 바와 같이 무처리구의 이병엽율이 탄저병은 31.6%, 점무늬병은 72.3%로 심하게 발생하였다. 미생물제를 처리하였을 경우 탄저병은 81.3%, 점무늬병은 84.7%의 방제가를 나타냈는데, 이는 유기합성농약인 아족시스트로빈 액상수화제를 처리하였을 경우와 거의 비슷한 방제효과를 보여주었다.

[표 8]

처리 시료	희석배수 및 사용량	탄저병		점무늬병
처리 시료	희석배수 및 사용량	이병엽율 (%)	방제가 (%)	이병엽율 (%)	방제가 (%)
리소박터 엔자이모게네스 C-3+ 크로모박테리움속 스트레인 C-61	원액 (15말/200평)	5.9	81.3	11.1	84.7
아족시스트로빈 액상수화제	2000배 (15말/200평)	7.3	76.7	10.3	85.8
무처리		31.6	-	72.3	-

[실시 예 8] 미생물제를 이용한 인삼 모잘록병과 잿빛곰팡이병의 방제 효과

폿트 실험 : 전남 해남군 산이면 인삼포장의 토양을 폿트에 담고 개갑된 인삼 종자를 파종한 다음, 실시 예 3의 방법에 의해서 10일 동안 배양된 각 미생물제를 토양 관주하고 순천대학 구내 온실에서 재배하면서 15일 후의 출아율과 30일 후의 이병묘율을 조사하였다.

포장 실험 : 전남 해남군 산이면 박병주씨의 포장에서 실시되었다. 모잘록병 방제실험은 종자 파종일인 2004년 12월 14일에 실시 예 3의 방법에 의해서 10일 동안 배양된 미생물제(리소박터 엔자이모게네스 C-3+크로모박테리움속 스트레인 C-61+스트렙토마이시스속 스트레인 에스-2의 혼합배양액)를 200평에 20말 정도 1차 토양 관주하고, 2005년 4월 30일에 2차 관주 후, 5월 20일에 이병묘율을 조사하였다. 또한 대조구로서 토로스분제를 종자에 분의 소독 후 파종하여 방제효과를 비교하였다. 잿빛곰팡이 방제실험은 5년근 포장에 4월 30일, 5월 14일, 6월 3일에 3회 토양관주하고 7월 15일에 이병묘율을 조사하였다.

실험 결과 : 폿트 실험의 경우 표 9와 도면 12에서 보는 바와 같이 쎄라시아 플리무티카 (Se) 처리구는 거의 출아하지 못하였다. 그러나 스트렙토마이시스속 스트레인 S-2, 리소박터 엔자이모게네스 C-3, 크로모박테리움속 스트레인 C-61 처리구는 무처리구보다 더 좋은 출아율을 나타냈고 모잘록병 발생도 현저히 억제되었다. 특히 스트렙토마이시스속 스트레인 S-2와 리소박터 엔자이모게네스의 모잘록병 억제율이 크로모박테리움속 스트레인 C-61보다 더 우수하였다.

[표 9]

실험 장소	처리 시료	출아율(%)	모잘록병 (이병주율, %)
폿트 실험	리소박터 엔자이모게네스 C-3	87.0	5.5
	크로모박테리움속 스트레인 C-61	88.5	13.0
	쎄라시아 플리무티카	2.0	-
	스트렙토마이시스속 스트레인 에스-2	92.0	3.5
	무처리	64.5	33.0

포장실험의 경우 표 10에서 보는 바와 같이 모잘록병에 대한 방제효과는 미생물제 처리구가 82.3%, 토로스분제처리구가 70.8%의 방제가를 보여줌으로써 미생물제에 의한 방제효과가 우수함을 알 수 있었고, 잿빛곰팡이에 대한 미생물제의 방제 효과도 72.8%로서 우수하였다.

[표 10]

실험 장소	처리 시료	희석배수 및 사용량	모잘록병		잿빛곰팡이병
실험 장소	처리 시료	희석배수 및 사용량	이병주율(%)	방제가(%)	이병주율(%)	방제가(%)
포장 실험	Ly+Ch+S2	원액 (20말/200평)	4.9	82.3	5.2	72.8
	토로스분제	분의 처리	8.1	70.8	-	-
	무처리	-	27.7	-	19.1	-

* Ly+Ch+S2 = 리소박터 엔자이모게네스 C-3+크로모박테리움속 스트레인 C-61+스트렙토마이시스속 스트레인 S-2의 혼합배양액

이상에서 살펴본 바와 같이 길항미생물의 배양으로 얻어진 식물병방제제는 제제하기가 간편하고 비용이 적게 소요되며, 다양한 식물병에 대하여 유기합성농약 수준 혹은 그보다 훨씬 더 우수한 방제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서 식물병방제제를 제제하기 위한 길항미생물과 배지의 조성 및 대량배양 방법은 다양한 식물병 방제에 매우 유익하게 사용될 것이다.

<110> Sunchon National University <120> Antagonistic microorganisms having activity against plant pathogens and plant diseases controlling agent comprising the same <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 614 <212> DNA <213> Lysobacter enzymogenes C-3 <400> 1 tgcaagtcga acggcagcac agaggagctt gctccttggg tggcgagtgg cggacgggtg 60 aggaaaacgt cggaatctgc ctatttgtgg gggataacgt agggaaactt acgctaatac 120 cgcatacgac ctacgggtga aagtggggga ccgcaaggcc tcacgcagat agatgagccg 180 acgtcggatt agctagttgg cggggtaaag gcccaccaag gcgacgatcc gtagctggtc 240 tgagaggatg atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300 agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa 360 ggccttcggg ttgtaaagca cttttgtccg gaaagaaaag cttagggtta ataaccctga 420 gtcatgacgg taccggaaga ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata 480 cgaagggtgc aagcgttact cggaattact gggcgtaaag cgtgcgtagg tggtttgtta 540 agtctgatgt gaaagccctg ggctcaacct gggaatggca ttggaaacct ggcttactag 600 agtgcggtag aggg 614 <210> 2 <211> 806 <212> DNA <213> Streptomyces sp. strain S-2 <400> 2 cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gaacgatgaa gcccttcggg gtggattagt 60 ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc tgccctgcac tctgggacaa gccctggaaa 120 cggggtctaa taccggatat gaccgtcttg ggcatccttg acggtgtaaa gctccggcgg 180 tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg 240 acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300 ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc 360 gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga agcgagagtg 420 acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480 gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt gtcacgtcgg 540 ttgtgaaagc ccggggctta accccgggtc tgcagtcgat acgggcaggc tagagttcgg 600 taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg 660 gtggcgaagg cggatctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720 acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcaaca 780 ttccacgttg tccgtgccgc agctaa 806 <210> 3 <211> 603 <212> DNA <213> Serratia plymuthica <400> 3 tgcaagtcga gcggtagcac aagagagctt gctctctggg tgacgagcgg cggacgggtg 60 agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac 120 cgcataacgt ctacggacca aagtggggga ccttcgggcc tcacgccatc agatgtgccc 180 agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc 240 tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300 agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa 360 ggccttaggg ttgtaaagca ctttcagcga ggaggaaggg tagtgtgtta atagcacatt 420 gcattgacgt tactcgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata 480 cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtttgtta 540 agtcagatgt gaaatccccg cgcttaacgt gggaactgca tttgaaactg gcaagctaga 600 gtc 603 <210> 4 <211> 536 <212> PRT <213> Chromobcterium sp.strain C-61 <400> 4 Met Ser Lys Leu Ser Leu Thr Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ala Ala Phe Ala Ala Pro Ala Cys Ser Ala 20 25 30 Trp Ser Asn Ala Gln Thr Tyr Asn Gly Gly Asp Tyr Ala Leu Tyr Ala 35 40 45 Asn Lys Thr Trp Arg Ala Lys Trp Trp Thr Gln Asn Asn Gln Pro Gly 50 55 60 Ala Asp Gln Trp Gly Pro Trp Glu Glu Arg Pro Ala Ser Glu Cys Thr 65 70 75 80 Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gly Pro Gly Pro Gly Thr Gly Val Pro Pro 85 90 95 Glu Pro Thr Pro Thr Val Gly Arg His Val Gly Ser Tyr Phe Ala Gln 100 105 110 Trp Ser Ile Tyr Gly Arg Asn Tyr Lys Leu Arg Asn Leu Val Asp Ala 115 120 125 Gly Gly Asp Lys Lys Leu Thr Phe Leu Asn Tyr Ala Phe Gly Asn Val 130 135 140 Tyr Ala Asp Gly Lys Cys Gly Met Val Thr Arg Ala Glu Asn Gly Asn 145 150 155 160 Gly Asp Gly Gly Asp Ala Trp Ala Asp Tyr Gln Lys Ser Phe Gly Ala 165 170 175 Asn Glu Ser Val Asp Gly Lys Ala Asp Ser Trp Ser Asp Pro Leu Arg 180 185 190 Gly Asn Phe Asn Gln Leu Arg Lys Leu Lys Leu Ala Asn Pro Ser Leu 195 200 205 Lys Val Leu Ile Ser Leu Gly Gly Trp Thr Trp Ser Lys Asn Phe Gly 210 215 220 Lys Phe Ala Ala Thr Asp Ala Gly Arg Lys Thr Met Val Ala Ser Cys 225 230 235 240 Ile Asp Leu Tyr Leu Lys Gly Asn Leu Pro Val Gly Glu Asn Ala Gly 245 250 255 Gly Ala Gly Ala Ala Lys Gly Val Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp 260 265 270 Glu Tyr Pro Gly Gly Gly Gly Leu Pro Ser Asn Ser Val Asp Pro Asn 275 280 285 Asp Lys Gln Asn Phe Thr Leu Leu Met Ala Glu Phe Arg Ser Gln Leu 290 295 300 Asp Ala Leu Thr Ala Gln Asn Lys Arg Arg Tyr Tyr Leu Thr Ala Ala 305 310 315 320 Ile Gly Ser Gly Val Asp Lys Ile Arg Gln Thr Glu Pro Ala Lys Tyr 325 330 335 Ala Ala Tyr Met Asp Trp Ile Asn Val Met Thr Tyr Asp Phe Asn Gly 340 345 350 Gly Trp Asp Ala Lys Gly Pro Thr Asn Phe Gln Ser Asn Leu Phe Arg 355 360 365 Asp Pro Ala Ala Pro Val Thr Gly Asp Arg Val Tyr Tyr Asn Val Asp 370 375 380 Asp Ser Ile Gln Thr Leu Val Lys Ala Gly Val Pro Lys Thr Lys Leu 385 390 395 400 Asn Val Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Arg Gly Trp Ala Gly Val Ala Ala 405 410 415 Gly Pro Lys Gly Asp Gly Leu Tyr Gln Val Ala Thr Gly Ala Gly Lys 420 425 430 Gly Thr Tyr Glu Ala Gly Ile Glu Asp Tyr Lys Val Leu Lys Thr Arg 435 440 445 Ser Ala Lys Gln Phe Val His Pro Val Ser Lys Gln Leu Trp Thr Tyr 450 455 460 Asp Gly Asn Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Asp Pro Ala Thr Ile Arg Thr 465 470 475 480 Lys Leu Asp Tyr Val Arg Gln Gln Gln Leu Gly Gly Val Phe Ser Trp 485 490 495 Ser Leu Asp Gly Asp Asp Ala Gln Gly Ser Leu Leu Lys Thr Thr Ser 500 505 510 Glu Val Arg Gln Asp Ala Ala Ala Ala Lys Lys Lys Ala Ala Ala Lys 515 520 525 Thr Ser Ala Ala Ser Pro Leu Lys 530 535

Claims

식물병 방제활성을 가지는 리소박터 엔자이모게네스 C-3 균주(KACC 91200P).
식물병 방제활성을 가지는 크로모박테리움속 스트레인 C-61 균주(KACC 91199P).
리소박터 엔자이모게네스 C-3 (KACC 91200P), 크로모박테리움속 스트레인 C-61(KACC 91199P) 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식물병 방제제.
제1항 또는 제2항의 미생물을 증류수에 키틴, (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄, 및 MgSO₄.7H₂O를 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 방법.
제 4항에 있어서, 배지는 증류수 1ℓ당 키틴 1.0~10.0g, (NH₄)₂SO₄ 0.1~1.0g, KH₂PO₄ 0.12~1.2g, K₂HPO₄ 0.1~1.0g, MgSO₄.7H₂O 0.06~0.6g을 함유하는 것을 특징으로 하는 배지에 제1항 또는 제2항의 미생물을 대량으로 배양하는 방법.