KR20070073921A - 구강질환 및 이상의 예방 및 치료에 사용하기 위한 이중아이코사노이드 시스템의 제형 및 사이토카인 시스템저해제 - Google Patents

구강질환 및 이상의 예방 및 치료에 사용하기 위한 이중아이코사노이드 시스템의 제형 및 사이토카인 시스템저해제 Download PDF

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acacia
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퀴 지아
유안 자오
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유니젠 파아마슈티컬스,인크.
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Abstract

본 발명은 구강, 잇몸 및 치아에 관련된 질병 및 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한 두가지 특정 종류의 화합물 -- 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 --의 혼합물을 포함하는 물질의 신규한 조성물을 제공한다. 이 물질의 조성물은 사이클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX)를 동시에 저해하며, 정상적이고, 노화되고 및 손상된 치주 세포 및 조직의 mRNA 레벨에서 사이토카인의 생성을 감소시킨다. 본 발명은 구강, 잇몸 및 치아의 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 더 제공한다. 구강, 치아 및 잇몸의 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법은 합성 및/또는 단일 식물 또는 복합 식물, 바람직하게는 스쿠텔라리아, 오록실룸, 아카시아 또는 운카리아 속의 식물로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물과 약제학적 및/또는 미용학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 그것을 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 결론적으로, 본 발명은, 이에 제한되지는 않지만, 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치수염(pulpitis)과 같은 치주질병(periodontal diseases), 의치(oral dentures)의 물리적 이식, 외상(trauma), 상해(injuries), 이갈기(bruxism), 신생물(neoplastic) 및 다른 퇴행 과정; 백질(material alba), 피막(pellicles), 치태(dental plagues), 치석(calculus) 및 착색(stains)에 의해 야기되는 치주 질환과 같은 구강, 치아 또는 잇몸의 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 제공한다. 본원에 기재된 조성물의 용도는 또한 최적의 침 생성, 침 의 pH 값을 유지하고, 세균 성장을 최소화하고, 치석산(plaque acid)의 형성을 감소시키고, 미네랄의 손실을 저해하고, 재석회질화를 촉진하고, 충치의 유병률(prevalence)을 감소시키고, 건강한 잇몸을 만들며, 치아를 미백하고, 건강한 구강 위생을 유지하고, 구취를 감소시키는데 유용할 것이다.
치주질환, 프리-비-링 플라보노이드, 플라반, COX-1, COX-2, LOX

Description

구강질환 및 이상의 예방 및 치료에 사용하기 위한 이중 아이코사노이드 시스템의 제형 및 사이토카인 시스템 저해제{FORMULATION OF DUAL EICOSANOID SYSTEM AND CYTOKINE SYSTEM INHIBITORS FOR USE IN THE PREVENTION AND TREATMENT OF ORAL DISEASES AND CONDITIONS}
본 발명은 일반적으로 구강, 치아 및 잇몸(gum)의 질환 및 이상의 예방 및 치료에 사용하기 위한 아이코사노이드 및 사이토카인 경로를 표적으로 하는 두가지 특정 부류의 화합물 - 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 - 의 블렌드의 혼합물을 포함하는 물질의 신규한 조성물에 관한 것이다. 특히, 상기 구강, 치아 및 잇몸 질환 및 이상은, 이에 제한되지는 않지만, 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치수염(pulpitis)과 같은 치주질환(periodontal diseases), 의치(dentures)의 물리적 이식, 외상(trauma), 상해(injuries), 이갈기(bruxism), 신생물(neoplastic) 및 다른 퇴행과정, 백질(material alba), 피막(pellicles), 치태(dental plagues), 치석(calculus) 및 착색(stains)에 의해 유발된 치주 이상을 포함한다. 본원에 기재된 조성물의 용도는 또한 최적의 타액 생성 및 pH를 유지하고, 세균의 증식을 최소화하고, 피막 및 치석(plaque)의 형성을 감소시키고, 치아의 칼슘 손실(decalcification) 및 충치(tooth caries; decay)를 저해하고, 재석회질화(remineralization)을 촉진하고, 건강한 잇몸을 만들고, 치아를 미백시키고, 건강한 구강위생(oral hygiene)을 유지하고 구취(oral malodour; halitosis)를 감소시킬 수 있다.
치주질환은 몇몇 또는 모든 치아 지지 구조(잇몸(gingiva), 백악질(cementum), 치주인대(periodontal ligament), 치조골(alveolar bone) 및 치아 주변의 다른 조직들)의 염증 및 감염의 조합이다. 치은염(잇몸) 및 치주염(잇몸 및 뼈)은 치주질환의 두가지 주요 형태이다. 미 국립 구강악안면연구소(National Institute of Dental and Craniofacial Research)에 의해 배포된 국제 구강 정보(National Oral Information)에 따르면, 미국 성인의 80 퍼센트가 현재 몇가지 형태의 치주질환을 가지고 있다고 추정된다. 치주질환은 피막이 깨끗한 치아(tooth or teeth) 상에 형성될 때 시작된다. 이 피막은 호기성 그람-양성 세균(aerobic gram-positive bacteria; 주로 악티노미세스속(actinomyces) 및 연쇄상구균(streptococci))을 유인하여 치석을 형성한 치아에 부착된다. 수일 내에 피막이 두꺼워지고 밑에 깔려있는 세균이 산소를 모두 소비하면, 혐기성 운동성 간균(anaerobic motile rods) 및 스피로헤타(spirochetes)가 잇몸밑 부분(subgingival area)에서 증식하기 시작한다. 혐기성 세균에 의해 배출된 내독소(endotoxins)는 염증, 잇몸 조직 파괴 및 심지어는 뼈의 손실을 야기한다. 치주질환의 네개의 주요 단계는 하기에 나타낸 것과 같이 특징질 수 있다. 치주질환으로부터 야기된 현미경적 병변(microscopic lesions)이 몇몇 감염자의 간, 신장 및 뇌에서 발견된다는 점에서 치주질환의 파괴적인 영향은 치과 위생 및 건강 그 이상 이다.
치주질환의 4단계
1급 염증
2급 염증, 부종, 프로빙에 대한 치은출혈
3급 염증, 부종, 프로빙에 대한 치은출혈, 화농성 분비물 -- 근소내지 정도(slight to moderate)의 뼈 손실
4급 염증, 부종, 프로빙에 대한 치은출혈, 화농성 분비물, 이동성 -- 심각한 뼈 손실
치주질환으로부터 야기된 염증은 주로 두가지 생물학적 시스템 : 아이코사노이드 시스템 및 사이토카인 시스템이 관여한다. 세포막으로부터의 아라키돈산(arachidonic acid; AA)의 방출 및 대사는 여러가지 다른 경로에 의하여 전염증성(pro-inflammatory) 대사산물을 생성한다. 염증에 대한 가장 중요한 경로 중의 두가지는 리폭시게나아제(lipoxygenase; LOX) 및 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase; COX) 효소에 의하여 매개된다. 이들은 류코트리엔(leukotrienes) 및 프로스타글란딘(prostaglandins) 각각을 생성시키는 평행 경로이고, 염증 반응의 개시 및 진행에 중요한 역할을 한다. 이 혈관수축성(vasoactive) 화합물은 잇몸 조직 안으로 염증성 세포의 침투를 촉진시키고 뼈 손실을 야기할 수 있는 염증 반응을 연장시키는 케모탁신(chemotaxins)이다. 따라서, 입, 치아 및 잇몸과 관련된 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제를 개발하기 위하여 염증의 이러한 매개물질을 생성시키는 효소를 표적으로 할 수 있다.
사이토카인 시스템은 네트워크의 활성화가 국부적일 때 항상성(homeostasis)에 매우 강력한 영향력을 미치고, 사이토카인은 표면 결합(surface-bound) 또는 확산성 형태(diffusible form)로 인접하게(vicinally) 작용한다. 그러나, 사이토카 인 생성이 지속적(sustained) 및/또는 전신성(systemic)일 때, 사이토카인은 징후(signs), 증상(symptoms) 및 염증의 병상(pathology), 감염, 자가면역(autoimmune) 및 악성 질병(malignant diseases)의 원인이 된다. TNF-α는 대식세포(macrophages), 호중성 백혈구(neutrophiles), 섬유아세포(fibroblasts), 케라티노사이트(keratinocytes), 자연살해세포(NK cells), T 및 B 세포 및 종양 세포에 의해 생성된 강력한 다면 발현성(pleiotropic) 사이토카인이다. TNF-α와 함께IL-1β는 염증 반응에서 주요한 역할을 한다. IL-1ra(IL-1 수용체 길항제), IL-1 수용체의 가용성 분획 또는 TNF-α 및 가용성 TNF 수용체에 대한 단일클론 항체와 같은 길항제의 투여는 모두 염증성 질환의 동물 모델에서 다양한 급성 및 만성 반응을 차단한다. NFκB(Nuclear factor kappa B)는 인터루이킨-1 베타(IL-1β), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha; TNFα), 인터루이킨-6(IL-6) 및 많은 다른 단백질들의 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자(transcription factor)이다. 이 길항제들 중 몇몇은 패혈증(sepsis), 치주질환 및 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 질병에서 항염증제로서 이용되기 시작하고 있다(Dinarello (2004) Curr Opin Pharmacol. 4:378-385). 항-TNF-α 항체가 류머티스성 관절염에서 고통의 두드러진 완화를 유도할 뿐 아니라, 크론병(Crohn's disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases)에서 조직 염증을 감소시킨다는 것이 발견되었다(Maini and Feldmann. (2002) Arthritis Res. 4 Suppl 2: S22-8).
치주 인대(periodontal ligament; PDL) 세포는 골아세포 유사(osteoblast- like) 특성을 나타내며, 백악질성(cementogenic) 또는 골원성(osteogenic) 계통 중 하나의 세포로 분화할 수 있다. 이 세포들은 치주조직(periodontium)의 보전 및 재생의 유지에 중요하다(Somerman et al. (1990) Arch Oral Biol. 35:241-47; Pitaru et al. (1994) J Periodontal Res. 29:81-94). 세균성 군체형성(colonization)에 의해 시작된 치주조직에서의 만성 감염은 PDL 세포 표현형(phenotype) 및 기능에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 전염증성 사이토카인의 합성을 유도한다. 이 사이토카인들은 감염 부위에 대하여 면역 세포를 공급하고 활성화시킬 뿐 아니라(Le and Vilcek (1987) J. Immunol. 139:3330; Kunkel et al. (1994) Ann.N.Y. Acad. Sci. 730:134), 지지골(supporting bone) 및 인대성 부착물(ligamentous attachment)의 손실을 유도한다(Pitaru et al. (1994) J Periodontal Res. 29:81-94). 예를 들어, TNF-α는 PDL 세포의 골아세포-유사 표현형 및 기능을 조절하는 것으로 알려져있다(Agarwal et al. (1998) Infect. Immun. 66:932-937). 게다가, TNF-α 및 IL-1β는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)의 하향조절(down-regulation)(Kuroki et al. (1994) Rheumatology 33:224) 및 콜라겐, 콜라게나아제, 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 프로스타글란딘 합성의 조절(Agarwal et al. (1998) Infect. Immun. 66:932-937)에 의하여 골아세포의 표현형의 특성(phenotypic characteristics)을 바꾼다.
분리된 PDL 세포에서, IL-1β는 표현형 변화를 유도한다(Agarwal et al. (1998) Infect. Immun. 66;932-937). 건강한 치주조직으로부터의 PDL 세포는 세균의 리포 다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 인지하지 않으며, LPS에 대응하여 전 염증성 사이토카인을 유도하지도 않는다. IL-1β 치료 후에, PDL 세포는 골아세포 유사 특성을 잃는 반면 새로운 LPS-반응성 표현형(LPS-responsive phenotype)으로 생각되어진다. 따라서, IL-1β는 PDL 세포 기능의 중요한 조절자이며, 이 세포가 감염시 면역반응에 능동적으로 관여하도록 유도한다. IL-1β는 뼈 재흡수(bone resorption)를 자극하고, 뼈 형성을 저해한다(Stashenko et al. (1987) J Bone Miner Res. 2:559-65; Nguyen et al. (1991) Lymphokine Cytokine Res. 10:15-21; Tatakis (1993) J Periodontol (1991) 64:416-31). 게다가, IL-1β는 TNF-α의 뼈 재흡수 작용을 상승시킨다(Bertolini et al. (1986) Nature 319:516-8; van der Pluijm et al. (1991) Endocrinology 129:1596). 치주염의 병리 과정에서 IL-1β의 또 다른 중요한 활성은 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinases; MMPs)의 생산을 유도한다는 것이다(Havemose-Poulsen and Holmstrup (1997) Crit. Rev. Oral, Biol. Med 8:217). IL-1β는 치은 섬유아세포 및 PDL 세포 모두에서 높은 농도의 프로콜라게나아제를 생산한다(Meikle et al. (1989) J Periodontal Res. 24:207-13; Lark et al. (1990) Connect Tissue Res. 25:49-65; Tewari et al. (1994) Arch Oral. Biol. 39:657-64). 게다가, IL-1β는 치은 섬유아세포에서 플라스미노겐 활성체(plasminogen activator)를 자극하여 몇몇의 매트릭스 메탈로프로테이나아제의 활성체인 플라스민(plasmin)을 생성한다(Mochan et al. (1998) J Periodontal Res. 23:28-32). 더욱이, 스타셴코 및 동료들은 잇몸 조직에서의 IL-1β 레벨과 최근의 부착소실(attachment loss) 사이에서의 양의 상관관계(positive correlation)를 보고하였다(Stashenko et al. (1991) J Clin Periodontaol 18:548-54).
TNFα는 면역 및 염증 반응의 또 다른 주요 매개 물질이며, 활성 치주 염증 부위에서 측정 가능한 양으로 발견되었다(Rossomando et al. (1990) Arch Oral Biol. 35:431-34; Stashenko et al. (1991) J Clin Periodontol 18:548-54). TNFα는 PDL 세포의 골아세포성 특징을 변화시킨다(Quintero et al. (1995) J. Dent. Res. 74:1802). 이것은 LPS에 대하여 IL-1β, IL-6 및 IL-8과 같은 다른 전염증성 사이토카인을 발현시키기 위한 능력에 의해 된다. TNFα는 섬유아세포에 의한 콜라게나아제의 분비, 연골 및 뼈의 재흡수를 유도하고, 치주염에서 치주 조직의 파괴에 영향을 준다(Elias et al. (1987) J. Immunol. 138:3812; Meikle et al. (1989) J Periodontal Res. 24:207-13; Chaudhary et al. (1992) Endocrinology 130:2528). 휴면 대식세포(macrophage)에서, TNFα는 IL-1β 및 프로스타글란딘 E2의 합성을 유도한다. TNFα는 또한 파골세포(osteoclasts)를 활성화시켜 뼈 재흡수를 유도한다. TNFα는 IL-1β의 뼈-재흡수 작용에서 상승 효과를 가진다(van der Pluijm et al. (1991) Endocrinology 129:1596; Bertolini et al. (1986) Nature 319:516-8; Johnson et al. (1989) Endocrinology 124:1424).
염증성 치주 병변에서, T-세포, 대식세포, 내피세포(endothelial cells) 및 섬유아세포와 같은 다양한 세포형은 mRNA 및 단백질 레벨 모두에서 증가된 IL-6 발현을 나타낸다(Kono et al. (1991) J. Immunol. 146:1812; Matsuki et al. (1992) Immunology 76:42-47; Fujihashi et al. (1993) Am. J. Pathol. 142:1239; Yamazaki et al. (1994) J Oral Pathol Med. 23:347-53). IL-6는 인간 B 세포 반 응에서 특히 중요하기 때문에, 치주염 병변에 나타난 B 세포/형질세포(plasma cell)의 증식이 병든 부위에서 IL-6의 생산 증가를 야기할 수 있을 것이라고 추측하였다(Fujihashi et al. (1993) J Periodontol 64:400-406). 게다가, IL-6는 뼈전환(bone turnover)의 국부 조절에 중요한 역할을 하며(Lowik et al. (1989) Biochem Biophys Res Commun. 162:1546-52; Ishimi et al . (1990) J. Immunol. 145:3297; Kurihara et al. (1990) J. Immunol. 144:4226), 에스트로겐 결핍에 의해 야기된 뼈 손실에 필수적이라고 여겨진다(Horowitz (1993) J Bone Miner Res. 8:1163-71). 시험관 내(In Vitro) 연구는 또한 IL-6 및 가용성 IL-6 수용체를 사용한 마우스 골형성 세포 및 골수세포의 동시 치료가 용골세포의 형성을 두드러지게 유도함을 증명하였다(Tamura et al. (1993) PNAS 90:11924). 게다가, IL-6는 또한 용골세포의 형성 및 용골세포 뼈 재흡수의 활성화를 자극함으로써 병적 상태의 뼈 재흡수에서 자가분비(autocrine) 및/또는 주변분비(paracrine) 인자로서 작용할 수 있다고 추측된다(Ohsaki et al. (1992) Endocrinology 131:2229). 이 발견은 치주염에서 치주 조직 파괴의 병인(pathogenesis)에 IL-6가 관여함을 의미한다.
COX 효소의 저해는 대부분의 비스테로이드성 항염증 약(non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDS)에 기인된 작용 메카니즘이다. 여기에는 대략 60%의 서열 상동성을 공유하지만, 프로파일 및 기능의 발현 면에서 다른, 두개의 전혀 다른 COX 효소 이성형(isoform; COX-1 및 COX-2)이 있다. COX-1은 혈소판 응집(platelet aggregation), 위(stomach)에서의 세포 기능 보호 및 정상 신장 기능 의 유지와 같은 정상적인 생리학적 기능 조절을 돕는 생리학적으로 중요한 프로스타글란딘의 생산과 관련된 효소의 구성적 형태이다(Dannhardt and Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem. 36:109-26). 두번째 이성형인 COX-2는 인터루이킨-1β(IL-1β) 및 다른 성장인자와 같은 전염증성 사이토카인에 의해 유도될 수 있는 효소의 형태이다(Herschmann (1994) Cancer Metastasis Rev. 134:241-56; Xie et al. (1992) Drugs Dev. Res. 25:249-65). 이 이성형은 아라키돈산(AA)로부터 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생산을 촉진시킨다. COX의 저해는 전통적인 NSAIDs의 항염증성 활성에 기인한다.
COX 및 LOX에 대한 이중 특이성(dual specificity)을 나타내는 저해제는 아라키돈산 대사의 다중 경로를 저해하는데 명백한 이점을 가진다. 이러한 저해제는 프로스타글란딘의 생산을 제한함으로써 프로스타글란딘(PG) 및 다중 류코트리엔 뿐 아니라 다중 류코트리엔(LT)의 염증 효과를 차단할 것이다. 이것은 혈관 확장(vasodilation), 혈관 투과성(vasopermeability) 및 아나팔락시스(anaphalaxis) 물질과 느리게 반응하는 것으로 알려진 PGE2, LTB4, LTD4 및 LTE4의 화학주성 효과를 포함한다. 이들 중, LTB4는 가장 강력한 화학주성 및 화학운동성(chemokinetic) 효과를 가진다(Moore (1985) in Prostanoids: pharmacological, physiological and clinical relevance, Cambridge University Press, N.Y., pp. 229-230).
COX 저해제의 작용 메카니즘이 대부분의 전통적인 NSAID의 작용 메카니즘과 일치하기 때문에, COX 저해제는 염증이 중요한 역할을 하는 일시적 상태 및 만성 질환에서 염증과 관련된 고통 및 팽창(swelling)을 포함하는 많은 동일한 증상을 치료하는데 사용된다. 그러나, 대부분의 알려진 NSAIDs는 불충분한 가용성 및 생물학적 유용성(bioavailability) 때문에 치주질환에는 적합하지 않다. 치주질환을 치료하기 위한 현재의 방법은 주된 목표인 감염의 조절에 제한되어 있다(Genco et al. (1990) in Contemporary Periodontics, The C.V. Mosby Company, St. Louis, pp. 361-370). 통상의 항균성 또는 안티 프라그제는 클로르헥시딘(chlorhexidine), 트리클로산(Triclosan), 스탠노스 플루오르화물(stannous fluoride), 리스테린(Listerine), 과산화수소(hydrogen peroxide), 세틸피리디미움 클로라이드 및 상귀나린 알카로이드(sanguinarine alkaloids)를 포함한다. 항균성 구강 세척제, 멸균 칩(antiseptic chip), 항생제 겔/마이크로스피어(micro-spheres) 및 효소 억제-독시클린 처방은 치주질환을 치료하고 조절하기 위한 바람직한 비-기계적/물리학적 선택이다. 출원인은 구강 질환 및 이상의 치료를 위한 아이코사노이드 및 사이토카인 경로를 표적화하는 주된 생물학적 활성 성분으로서 프리-비-링(Free-B-Ring)-플라보노이드(Flavonoids) 및 플라반(flavans)을 조합하는 제형에 대하여 어떠한 보고도 들어본 적이 없다.
플라보노이드 또는 바이오플라보노이드는 항세균성, 항염증성, 항알러지성, 항돌연변이성, 항바이러스성, 항종양성, 항 혈전(anti-thrombic) 및 혈관확장 활성을 가진다고 보고되어 있는 널리 분포된 자연 산물이다. 이 그룹 화합물에 대한 공통적인 구조 단위는 하기의 일반 구조 화학식에 나타낸 것과 같이 3-탄소 고리의 양측에 두개의 벤젠 고리를 포함한다.
Figure 112007036764298-PCT00001
이 일반적인 세개의 고리 구조에 결합되는 수산기(hydroxyl groups), 당(sugars), 산소 및 메틸기의 다양한 조합은 플라바놀(flavanols), 플라본(flavones), 플라반-3-올(카테킨), 안토시아닌(anthocyanins) 및 이소플라본을 포함하는 다양한 종류의 플라보노이드를 형성한다.
프리-비-링 플라본 및 플라보놀은 하기의 일반 구조에 나타낸 것과 같이 방향족 비 고리(이하 프리-비-링 플라보노이드라 함) 상에 치환기가 없는 특정한 종류의 플라보노이드이다.
Figure 112007036764298-PCT00002
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H2, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드(glycoside)를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬에 결합되고, 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체를 포함한다;
여기에서,
R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; 및
X는 이에 제한되지는 않지만, 히드록실, 염화물, 요오드화물, 플루오르화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 카보네이트 등을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온(counter anions)의 군으로부터 선택된다.
프리-비-링 플라보노이드는 비교적 드물다. 천연원으로부터 합성되거나 분리된 9,396개의 플라보노이드 중에서, 단지 231개의 프리-비-링 플라보노이드만이 알려져 있다(The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall/CRC, Version 5:1 June 2001). 프리-비-링 플라보노이드는 다양한 생물학적 활성을 가지는 것으로 보고되어 있다. 전형적으로, 플라보노이드는 그들의 유효성에 기초하여 임의대로 생물학적 활성을 측정하였다. 때때로, 비-고리(B-ring) 상에서 치환의 필요성은 p-당단백에 대한 높은 친화력의 결합(Boumendjel et al. (2001) Bioorg, Med. Chem. Lett. 11(1):75-77); 강심제의 효과(Itoigawa et al. (1999) J. Ethnopharmacol. 65(3):267-272), 리놀레산 하이드로과산화물 유도성(linoleic acid hydroperoxide-induced) 독성에 대한 내피세포의 보호 효과(Kaneko and Baba (1999) Biosci Biotechnol. Biochem 63(2):323-328), COX-1 저해 활성(Wang (2000) Phytomedicine 7:15-19) 및 프로스타글란딘 엔도페록시드(endoperoxide) 신타아제(kalkbrenner et al. (1992) Pharmacology 44(1):1-12)에 요구되는 비-고리 치환과 같은 특정 생물학적 활성을 위하여 강조되어 왔다. 프리-비-링 플라보노이드의 치환되지 않은 비-고리의 중요성을 언급한 논문은 거의 없다. 하나의 예는 강력한 항응고제(anticoagulants)로서 NADPH 퀴논 수용체 산화 환원효소(NADPH quinone acceptor oxidoreductase)를 저해하는 2-페닐 플라본의 용도이다(Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11);1417-1427).
다양한 프리-비-링 플라보노이드의 항염증성 활성 작용 메카니즘은 논의의 여지가 있다. 프리-비-링 플라보노이드, 크리신(chrysin; Liang et al. (2001) FEBS Lett. 496(1):12-18), 위고닌(wogonin; Chi et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61:1195-1203) 및 하란진(halangin; Raso et al. (2001) Life Sci. 68(8):921-931)의 항염증성 활성은 퍼옥시좀 증식 활성화 수용체 감마(peroxisome proliferator activated receptor gamma; PPARγ)의 활성화를 통한 유도성 사이클로옥시게나아제 및 산화 질소 신타아제의 억제 및 과립감소(degranulation)에 대한 영향 및 AA 방출과 관련이 있다(Tordera et al. (1994) Z. Naturforsch [C] 49;235-240). 오록실린(oroxylin), 바이칼레인(baicalein) 및 위고닌은 사이클로옥시게나아제에 영향을 미치지 않고 12-리폭시게나아제의 활성을 저해한다고 보고되어 있다(You et al. (1999) Arch. Pharm. Res. 22(1):18-24). 가장 최근에, 위 고닌, 바이칼레인 및 바이칼린(baicalin)의 항염증성 활성은 산화 질소 저해제 및 리포 다당류에 의해 유도된 유도성 산화질소 신타아제 및 cox-2 유전자 발현의 저해를 통하여 일어나는 것으로 보고되어 있다(Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11):1417-1427). 또한, 오록실린은 NFκB 활성화의 억제를 통하여 작용한다고 보고되어 있다(Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11):1417-1427). 마지막으로, 보고에 따르면 위고닌은 마크로파지에서 유도성 PGE2 생산을 저해한다고 한다(Wakabayashi and Yasui (2000) Eur. J. Pharmacol. 406(3):477-481).
중국의 약용식물(medicinal plant)인 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)는 바이칼레인, 바이칼린, 위고닌 및 바이칼레노시드를 포함하는 많은 양의 프리-비-링 플라보노이드를 포함한다. 전통적으로, 이 식물은 열을 없애고, 화끈거림(fire)을 제거하고, 습온(dampness-warm) 및 하계열(summer fever) 증후군; 고열에 의한 다갈증(polydipsia); 등창(carbuncle), 종기(Sores) 및 다른 화농성 피부 염증; 급성 편도선염(acute tonsillitis), 인후염(laryngopharyngitis) 및 성홍열(scarlet fever)과 같은 상부 호흡기감염(upper respiratory infection); 바이러스성 간염(viral hepatitis); 신염(nephritis); 신우염(pyelitis); 이질(dysentery); 토혈(hematemesis) 및 코피(epistaxis)를 포함하는 다수의 질환을 치료하기 위하여 사용되어 왔다. 이 식물은 또한 전통적으로 유산(miscarriage)을 방지하기 위하여 사용되어 왔다(Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998). 임상적으로 스쿠텔라리아는 현재 소아 폐렴(pediatric pneumonia), 소아 세균성 설사(pediatric bacterial diarrhea), 바이러스성 간염(viral hepatitis), 급성 담낭 염증(acute gallbladder inflammation), 고혈압(hypertension), 절개(cuts) 및 수술을 야기하는 국소성 급성 염증(topical acute inflammation), 기관지 천식(bronchial asthma) 및 상부 기관지염증과 같은 질환을 치료하기 위해 사용되고 있다(Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998). 기관지 천식을 치료하기 위한 스쿠텔라리아 뿌리의 약제학적 효능은 보고에 따르면 프리-비-링 플라보노이드의 존재 및 호산성 백혈구(eosinophils)의 보충과 관련된 에오탁신(eotaxin)의 억제와 관련있다(Nakajima et al. (2001) Planta Med. 67(2):132-135).
지금까지, 다수의 자연적으로 발생하는 프리-비-링 플라보노이드가 다양한 용도로 상용화되어 왔다. 예를 들면, 스쿠텔라리아 추출물의 리포좀 제형은 스킨 케어에 이용되고 있다(U.S. Pat. Nos. 5,643,598; 5,443,983). 바이칼린은 종양 유전자(oncogenes)에 대한 저해 효과 때문에, 종양을 예방하기 위하여 사용되고 있다(U.S. Pat. No. 6,290,995). 바이칼린 및 다른 화합물은 항바이러스성, 항세균성 및 면역 조절제(immunomodulating agents)(U.S. Pat. No. 6,083,921 및 WO98/42363) 및 천연 항산화제(WO98/49256 및 Poland Pub. No. 9,849,256)로서 사용되고 있다. 테르펜을 사용한 플라보노이드 제형은 충치를 치료하고 저해하기 위한 표면결합 글루코실트렌스퍼라아제(surface-bound glucosytransferase)의 저해제로서 사용되고 있다(US #20040057908). 일본 특허 No.63027435는 바이칼레인의 추 출 및 농축(enrichment)을 개시하며, 일본 특허 No.61050921은 바이칼린의 정제를 개시한다.
"강력한 COX-2 저해제로서의 프리-비-링 플라보노이드의 정제(Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors)"라는 제목의 2002년 3월 1일에 출원된 미국 특허 출원 No.10/091,362 및 "치료제로서의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합제형(Formulation of a Mixture of Free-B-Ring Flavonoids and Flavans as a Terapeutic Agent)"라는 제목의 2003년 7월 22일에 출원된 미국 특허 출원 No.10/427,746는 그들을 필요로 하는 수용자(host)에 프리-비-링 플라보노이드 또는 프리-비-링 플라보노이드의 혼합물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 사이클로옥시게나아제 효소 COX-2를 저해하기 위한 방법이 개시되어 있다. 이것은 프리-비-링 플라보노이드 및 COX-2 저해 활성 사이의 결합에 대한 첫번째 보고서이다. 이 출원들은 특히 그들 전체가 인용문헌으로서 본원에 포함되어 있다.
플라반은 하기의 일반식으로 나타낸 화합물을 포함하며:
Figure 112007036764298-PCT00003
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 이에 제한되지는 않지만, 갈레이트(gallate), 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 그들의 화학적 유도체를 포함하는 상기 치환기의 에스테르; 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합하고, 여기에서 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체 및 다른 중합된 플라반을 포함하고;
여기에서,
R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; 및
X는 이에 제한되지는 않지만, 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카보네이트 등을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택된다.
카테킨은 하기 구조를 가지는, 녹차에서 주로 발견되는 플라반이다:
Figure 112007036764298-PCT00004
카테킨은 단독 및 차에서 발견되는 다른 플라보노이드와 함께 결합하여 작용하며, 이들은 모두 바이러스성 및 항산화 활성을 가진다. 카테킨은 바이러스성 간염의 치료에 효과적임을 나타내었다. 카테킨은 또한 심장, 신장, 폐 및 비장에 대한 산화적 손상을 방지함을 나타내고, 위암 세포의 성장을 저해함을 나타내었다.
카테킨 및 그것의 이성체 에피카테킨(epicatechin)은 40μM의 IC50 값으로 프로스타글란딘 엔도페록사이드 신타아제를 저해한다(Kalkbrenner et al. (1992) Pharmacol. 44:1-12). 상용화된 순수(+)-카테킨은 COX-2에 대한 선택성 없이 실험 환경에 따라 약 183 내지 279μM 근처의 IC50 값으로 COX-1을 저해한다(Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61:1-7). 녹차 카테킨을 스프라그 다울리 수컷 흰쥐의 식이에 첨가하였을 때, 혈소판 PLA2의 활성 레벨이 낮아지고 혈소판 사이클로옥시게나아제의 레벨이 현저하게 감소되었다(Yang et al. (1999) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 45:337-346). 보고에 따르면 카테킨 및 에피카테킨은 인간의 결장암 DLD-1 세포에서 cox-2 유전자 전사를 약하게 억제한다(IC50=415.3μM)(Mutoh et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91:686-691). 레드 와인으로부터의 (+)-카테킨의 신경보호 능력은 사이클로옥시게나아제, 리폭시게나아제 또는 산화질소 신타아제와 같은 세포내 효소에 따른 저해 효과보다는 카테킨의 항산화 특성에 의한 것이다(Bastianetto et al. (2000) Br. J. Pharmacol. 131:711-720). 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate; EGCG), 에피갈로카테킨(epigallocatechin; EGC), 에피카테킨-3-갈레이트(epicatechin-3-gallate; ECG) 및 테아플라빈(theaflavins)과 같은 녹차 및 홍차로부터 정제된 카테킨 유도체들은 인간의 결장 점막(colon mucosa) 및 결장 종양 조직에서 AA의 대사에 의존하는 사이클로옥시게나아제 및 리폭시게나아제의 저해를 나타냈으며(Hong et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 62:1175-1183), cox-2 발현 및 PGE2 생산을 유도한다(Park et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286:721-725).
아카시아(Acacia)는 콩과 나무 및 관목(leguminous tree and shrubs) 속(genus)이다. 아카시아 속은 콩과 패밀리 및 미모사아과(Mimosoideae)의 서브패밀리에 속하는 1000종 이상을 포함한다. 아카시아는 오스트레일리아 뿐만 아니라 중앙 및 남아메리카, 아프리카, 아시아 일부의 열대 및 아열대 지역에 널리 분포하고 있으며, 가장 많은 수의 고유종을 가진다. 지금까지, 대략 330개의 화합물들이 다양한 아카시아 종으로부터 분리되고 있다. 플라보노이드는 아카시아로부터 분리된 화합물의 주된 종류이다. 약 180개의 다른 플라보노이드가 확인되었으며, 이들 중 111개가 플라반이다. 테르페노이드는 아카시아 속의 종으로부터 분리된 화합물 중 두번째로 많은 종류이며, 48개의 화합물이 확인되었다. 아카시아로부터 분리된 다른 종류의 화합물들은 알칼로이드(28), 아미노산/펩티드(20), 타닌산(16), 탄수화물(15), 산소 고리(oxygen heterocycles; 15) 및 지방성 화합물(10)을 포함한다(Buckingham, The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall CRC, version 5:2, Dec. 2001).
페놀성 화합물, 특히 플라반은 모든 아카시아 종에서 중ㅇ간 내지 높은 농도로 발견되었다(Abdulrazak et al. (2000) Journal of Animal Sciences. 13:935-940). 역사적으로, 대부분의 식물 및 아카시아 속의 추출물은 위장 질환, 설사, 소화불량을 치료하고 출혈을 멈추기 위한 수렴제(astringents)로서 사용되어왔다(Vautrin (1996) Universite Bourgogne (France) European abstract 58-01C:177; Saleem et al. (1998) Hamdard Midicus. 41:63-67). 아카시아 나무껍질로부터의 추출물은 일본에서 미백제로서(Abe, JP10025238), 치아 적용을 위한 글루코실 트렌스퍼라아제 저해제로서(Abe, JP07242555), 단백질 합성 저해제로서(Fukai, JP07165598), 외피(external skin) 제조를 위한 활성 산소 스케빈저(scavenger)로서(Honda, JP0717847, Bindra U.S.Pat. NO.6,126,950) 그리고 염증, 화분증(pollinosis) 및 기침을 예방하기 위한 히알루로니다아제(hyaluronidase)의 저해제로서(Ogura, JP07010768)의 외용(external use)으로 특허등록 되었다.
운카리아(Uncaria) 속은 34종을 포함하며, 이 중의 다수가 약용식물로서 잘 알려져 있다. 운카리아 식물은 상처 및 궤양(ulcers), 열(fevers), 두통, 위장병 및 미생물/균 감염의 치료를 위하여 여러가지의 재배에 의하여 사용되어 왔다. 운 카리아 식물은 많은 양의 카테킨과 다른 플라본들을 포함한다. 운카리아 속으로 보고되어 있는 다른 화합물들은 알칼로이드, 테르펜, 키노빈산 글루코시드(quinovic acid glycosides), 쿠머린(coumarins) 및 플라보노이드를 포함한다. 운카리아 감비르(Uncaria gambir)는 말레이시아, 싱가포르, 인디아 및 다른 동남아시아에 공통적인 종이다. 카테킨은 운카리아 감비르의 전체 식물에서 주요한 성분이다.
본 발명은 구강, 치아 및 잇몸에 관련된 질병 및 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위하여 아이코사노이드 시스템 및 사이토카인 시스템 모두를 동시에 저해하는데 효과적인 방법을 포함한다. 아이코사노이드 시스템 및 사이토카인 시스템 모두를 동시에 이중 조절하기 위한 방법은 그것을 필요로 하는 수용자에 단일 식물 또는 복합 식물로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물로 이루어진 조성물을 전신적으로 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 이 조성물은 본원에서 UP676이라 한다. 이 방법의 효능 및 안전성은 상이한 세포주, 복합 동물 모델 및 종국적으로는 인간의 임상 실험에서 정제된 효소를 사용하여 증명되었다. 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1의 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 0.1:99.9의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질의 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 80:20이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 프리-비-링 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물 또는 식물들로부터 분리되었고, 플라반은 아카시아 또는 운카리아 속 식물 또는 식물들로부터 분리된다.
본 발명은 또한 구강, 치아 및 잇몸의 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다. 구강, 치아 및 잇몸의 상기 질병 및 질환을 예방하고 치료하기 위한 방법은 단일 식물 또는 복합 식물로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물의 유효량을, 그것을 필요로 하는 수용자에 전신적 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9;0.1의 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 0.1:99.9의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20;80 및 10:90으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질의 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 80:20이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속 식물 또는 식물들로부터 분리되고, 플라반은 아카시아 또는 운카리아 속 식물 또는 식물들로부터 분리된다.
프리-비-링 플라보노이드는 또한 본원에서 하기의 일반 구조에 나타낸 화합물을 포함하는 하기의 발명에 따라 사용될 수 있는 프리-비-링 플라본 및 플라보놀을 말한다.
Figure 112007036764298-PCT00005
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합하고, 여기에서 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체를 포함한다;
여기에서,
R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기로부터 선택되고; 및
X는 이에 제한되지는 않지만, 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카보네이트 등을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 프리-비-링 플라보노이드는 합성 방법에 의해 얻거나, 이에 제한되지는 않지만, 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤프레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 나도고사리과(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)를 포함하는 식물군으로부터 추출할 수 있다. 프리-비-링 플라보노이드는, 이에 제한되지는 않지만, 데스모스(Desmos), 아키로클리네(Achyrocline), 오록실룸(Oroxylum), 부케나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라(Cotula), 그나팔리움(Gnaphalium), 헬리크리섬(Helichrysum), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 박카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브루케아(Colebrookea), 스타치스(Stachys), 오리가눔(Origanum), 지지포라(Ziziphora), 린데라(Lindera), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아(Millettia), 퐁가미아(Pongamia), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스(Artocarpus), 피쿠스(Ficus), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나(Notholaena), 피누스(Pinus), 울무스(Ulmus) 및 알피니아(Alpinia)를 포함하는 고등 식물 속으로부터 추출되고, 농축되고 정제될 수 있다.
하기의 발명에 따라 사용될 수 있는 플라반은 하기의 일반 구조로 나타낸 화합물을 포함한다:
Figure 112007036764298-PCT00006
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 이에 제한되지는 않지만, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 그들의 화학적 유도체를 포함하는 상기 치환기의 에스테르; 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합되며, 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체 및 다른 중합된 플라반을 포함하며,
여기에서,
R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기로부터 선택되고; 및
X는 이에 제한되지는 않지만, 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카보네이트 등을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 플라반은 아카시아 또는 운카리아 속으로부터 선택된 식물 또는 식물들로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 식물은 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비카(Acacia arabica), 아카시아 카에시아(A. caesia), 아카시아 펜나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata), 아카시아 메아른시이(A. mearnsii), 아카시아 피크난타(A. picnantha), 아카시아 데알바타(A. dealbata), 아카시아 아우리쿨리포미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia) 및 아카시아 만기움(A. mangium); 및 운카리아 감비르(Uncaria gambir), 운카리아 라노사(Uncaria lanosa), 운카리아 히르수테(Uncaria hirsute), 운카리아 아프리카나(Uncaria africana), 운카리아 엘리프티카(Uncaria elliptica), 운카리아 오리엔탈리스(Uncaria orientalis), 운카리아 아테뉴아테(Uncaria attenuate), 운카리아 아시다(Uncaria acida), 운카리아 호모말라(Uncaria homomalla), 운카리아 세시리프룩투스(Uncaria sessilifructus), 운카리아 스테로필라(Uncaria sterrophylla), 운카리아 베르나이시이(Uncaria bernaysii), 운카리아 시넨시스(Uncaria sinensis), 운카리아 칼로필라(Uncaria callophylla), 운카리아 리코필라(Uncaria rhychophylla), 운카리아 토멘토사(Uncaria tomentosa), 운카리아 롱기플로라(Uncaria longiflora), 운카리아 히르수테(Uncaria hirsute), 운카리아 코르다타(Uncaria cordata) 및 운카리아 보르넨시스(Uncaria borneensis)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시예에서 본 발명은, 이에 제한되지는 않지만, 치은염, 테스트형 치주염(aggressive periodontitis), 만성 치주염, 치근단 치주염(periapical periodontitis), 전신성 질환의 징후와 같은 치주염 및 괴사성 치주 질환(necrotizing periodontal disease)과 같은 치주(잇몸) 질환을 포함하는 구강, 잇몸 및 치아와 관련된 다수의 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함하며, 여기에서 상기 치주질환의 원인은, 이에 제한되지는 않지만, 만성 세균성 감염, 치석의 축적, 흡연 및/또는 저작에 의한 담배 사용, 유전적 감수성(genetically susceptibility), 임신 및 사춘기, 스트레스, 약물치료 및 당뇨병, 영양실조 및 다른 전신성 질환을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 민감성 잇몸 및 치아, 후유증(sequelae), 치수염, 과민증(irritation), 의치(oral denture)의 물리적 이식에 의해 야기되는 통증 및 염증, 외상, 손상, 이갈기 및 구강 내, 잇몸 또는 혀 상의 다른 작은 상처, 치태 및 치석, 치아의 칼슘 손실, 단백질 가수분해 및 충치의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 치료제를 포함하는 치료적 조성물을 더 포함한다. 상기 기재된 구강, 치아 및 잇몸의 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 그들의 용도에 더하여, 본원에 기재된 치료적 조성물은 또한 최적의 침 생성, 침의 pH 값을 유지하고, 세균 성장을 최소화하고, 치석산(plaque acid)의 형성을 감소시키고, 미네랄의 손실을 저해하고, 재석회질화를 촉진하고, 충치의 유병률(prevalence)을 감소시키고, 건강한 잇몸을 만들며, 치아를 미백하고, 건강한 구강 위생을 유지하고, 구취를 감소시키는데 유용할 것이다.
본 발명에 따른 예방 및 치료 방법은 단일원 또는 복합원으로부터 분리된 제형화된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 치료적 유효량을, 그것을 필요로 하는 수용자에 전신적 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 복합 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 개개 및/또는 혼합물의 순도는 화합물을 얻기 위하여 사용된 방법론에 의존하여, 0.01 내지 100%를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시예에서, 상기와 같이 포함한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물의 투약량은 국소 제형의 총 중량에 기초하여 0.001% 내지 100%의 범위로부터 일반적으로 선택된 효능 있는 무독성의 양이다. 일반적인 임상 실험을 사용하는 당업자들은 치료할 특정 병을 위한 최적의 투약량을 결정할 수 있다.
본 발명은 제형을 최적화하고 바람직한 생리학적 활성을 얻기 위하여, 효소에 의한 생체 내(in vivo) 모델을 사용하는 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 서로 다른 조성물의 측정을 포함한다. 이 제형의 효능 및 안전성은 인간 임상 실험에서 증명된다. 본 발명의 조성물은 당업자에게 알려져 있는 어떠한 방법으로도 투여될 수 있다. 투여의 형태는, 이에 제한되지는 않지만, 장(구강) 투여, 비경구(정맥내, 복강내 및 근육내) 투여 및 국소 적용을 포함한다. 하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 치료의 방법은 단일 식물 또는 복합 식물로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물의 치료적 유효량을, 그것을 필요로 하는 수용자에 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 국소 투여의 방법은, 이에 제한되지는 않지만, 치약, 겔, 연고, 양치질 물약, 츄잉껌, 팅크제(tinctures), 드링크 뿐만 아니라 다른 공지의 약제학적 제형도 포함한다.
지금까지, 본 발명의 출원인은 구강, 치아 및 잇몸과 관련된 질병 및 질환의 치료를 위한 주요 생물학적 활성 화합물로서 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반을 조합하는 제형에 대한 어떠한 보고도 알지 못한다. 프리-비-링 플라보노이드의 방향족 고리 중의 하나에서의 치환기 결실은 구강 치료에 이 화합물을 효과적으로 사용하기 위하여 매우 중요한 역할을 한다. 다른 많은 항염증성 약물 및 자연적으로 생성된 화합물과는 달리, 바이칼린과 같은 프리-비-링 플라보노이드는 분자의 한 쪽에 저극성(low polarity) 방향족 고리를 가지고, 다른 한쪽에 고극성 글루쿠로니드(glucuronide) 및 두개의 하이드록실기를 가진다. 이 구조 배치는 이 화합물이 잇몸 조직에 쉽게 침투하고 잔류할 수 있게 한다. 본원에서 UP676으로 칭하는 물질의 조성물을 생산하기 위한 플라반과 프리-비-링 플라보노이드의 조합은 치주 질환의 모든 4단계에서 염증을 포함하는 치주 조직의 염증을 조절할 수 있게 도와주는 아이코사노이드 시스템 및 사이토카인 시스템 모두에 대하여 상승적이고 강력한 조절자를 제공한다. 게다가, 다른 생물학적 능력 즉, 상피 세포막에 침투하는 생물학적 활성 화합물의 비율 및 백분율(percentage)과 치주조직에서의 생물학적 활성 화합물의 국소 농도 때문에, 두가지 다른 형태의 화합물의 조합(고극성 플라반 대 저극성 프리-비-링 플라보노이드)은 모두 생물학적 활성 플라반에 의한 급속한 현장 통증(on-site pain) 및 급성 염증의 경감 뿐만 아니라 생물학적 활성 프리-비-링 플라보노이드에 의한 치주 조직에서의 만성 염증의 더 길고 지속적인 조절을 제공한다. 결과적으로, 상대적으로 낮은 농도의 플라반(20 중량%)과 많은 량의 프리-비-링 플라보노이드(80 중량%)의 제형의 바람직한 제형에서, 더욱 강력한 항산화 플라반은 프리-비-링 플라보노이드의 산화 분해(oxidative degradation)에 대한 천연 방부제로서 기능하고, 주요 활성 화합물인 최적의 pH 및 이온화 환경에서의 프리-비-링 플라보노이드를 운반하게 하는 조성물을 중화하고 완충하는 기능을 할 것이다.
앞서 말한 일반 설명 및 하기의 상세한 설명 모두는 단지 예시적이고 설명적인 것이며, 청구되는 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 분리된 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물(HPLC에 기초한 83% 바이칼린)에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로필을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 추출물의 재조합 오바인(ovine) COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 0.24μg/mL/효소 단위로 측정된 반면, COX-2의 IC50은 0.48μg/mL/단위로 측정되었다.
도 2는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 분리된 정제된 화합물 바이칼린에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 화합물의 재조합 오바인 COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 0.44μg/mL/효소 단위로 측정되었고, COX-2의 IC50은 0.28μg/mL/단위로 측정되었다.
도 3은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 분리된 정제된 화합물 바이칼레인에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 화합물의 재조합 오바인 COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 0.18μg/mL/효소 단위로 측정되었고, COX-2의 IC50은 0.28μg/mL/단위로 측정되었다.
도 4는 아카시아 카테츄로부터 분리된 총 플라반의 50%를 포함하는 표준화된 플라반 추출물에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 추출물의 재조합 오바인 COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 0.17μg/mL/효소 단위로 측정되었고, COX-2의 IC50은 0.41μg/mL/단위로 측정되었다.
도 5는 아카시아 카테츄로부터 분리된 90% 이상의 플라반으로 구성된 조성물의 성분에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 조성물의 재조합 오바인 COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 0.11μg/mL/효소 단위로 측정되었고, COX-2의 IC50은 0.42μg/mL/단 위로 측정되었다.
도 6은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드의 추출물과 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 플라반의 추출물을 80:20의 비율로 조합함으로써 생산된 제형에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 이하 UP676이라 칭하는 이 조성물의 성분의 재조합 오바인 COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 2μg/mL/효소 단위로 측정되었고, COX-2의 IC50은 4μg/mL/단위로 측정되었다.
도 7은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드의 추출물과 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 플라반의 추출물을 50:50의 비율로 조합함으로써 생산된 제형에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 조성물의 재조합 오바인 COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 0.38μg/mL/효소 단위로 측정되었고, COX-2의 IC50은 0.84μg/mL/단위로 측정되었다.
도 8은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드의 추출물과 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 플라반의 추출물을 20:80의 비율로 조합함으로써 생산된 제형에 의한 COX-1 및 COX-2의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 상기 조성물의 재조합 오바인 COX-1(◆) 및 오바인 COX-2(■)의 페록시다아제 활성에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해율 대 저해제 농도(μg/mL)로 나타내었다. COX-1의 IC50은 0.18μg/mL/효소 단위로 측정되었고, COX-2의 IC50은 0.41μg/mL/단위로 측정되었다.
도 9는 아카시아 카테츄로부터의 플라반 추출물에 의한 5-LO의 저해 프로파일을 그래프로 나타낸 것이다. 실시예 4에 기재한 것과 같이 상기 조성물의 재조합 포테이토 5-리폭시게나아제 활성(◆)에 대한 저해를 테스트하였다. 데이터는 저해제를 제외한 검정의 저해율로 나타내었다. 5-LO의 IC50은 1.38μg/mL/효소 단위었다.
도 10은 80:20의 비율의 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드와 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 플라반의 혼합물로 이루어진 전형적인 제형의 고압 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography; HPLC)의 크로마토그램을 실시예 9에 기재한 것과 같은 조건 하에서 수행한 것을 도시한 것이다.
도 11은 실시예 10에 기재된 것과 같이 THP-1 또는 HT-29 세포(ATCC)에서 ELISA에 의해 측정된 LPS-유도된 새로 합성된 LTB4(◆)의 양에서 UP676의 농도를 증가시키는 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 상기 UP676은 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드의 표준화된 추출물과 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 플라반을 80:20의 비율로 조합함으로써 생성된다. UP676 제형의 활성은 유도된 LTB4 합성의 % 저해로 나타내었다.
도 12는 실시예 10에 나타낸 것과 같이 3μg/mL의 이부프로펜을 처리한 것과유도되지 않은 세포에 3μg/mL의 UP676을 처리한 후 HT-29 세포에서 잔류물을 ELISA로 측정함으로써 LTB4 농도를 비교하였다. UP676 제형은 처리 2일 후 HT-29 세포에서 LTB4 생산에 대하여 80%의 저해를 나타내었다.
도 13은 실시예 12에 기재된 것과 같이 염증의 저해를 측정하기 위하여 귀 부종(ear-swelling) 데이터를 그래프로 나타낸 것이다. 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드의 표준화된 추출물 및 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 플라반을 80:20의 비율로 조합함으로써 생성된 UP676을 경구 영양법(oral gavage)을 통하여 이도메타신(1.5mg/kg)이 주어진 마우스 및 비처리된 마우스와 비교하였다. 데이터를 각각의 마우스에 대하여 귓불에 처리된 마우스 대 비처리된 마우스의 미크론 치수로 차이를 나타내었다.
도 14는 실시예 13에 기재된 것과 같이 자외선을 사용한 마우스의 방사선 처리 시간에 따른 작용으로서 서로 다른 치료 그룹에서의 무모 생쥐(hairless mice) 피부 홍반(erythema) 변화를 그래프로 나타낸 것이다. 그룹 B-1, A-1 및 A-2의 마우스들은 방사선 처리 전(그룹 B-1 및 B-2) 또는 후(A-1 및 A-2)에 UP676으로 처리하였다. 상기 UP676은 80:20의 비율로 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 프리-비-링 플라보노이드의 표준화된 추출물 및 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 분리된 플라반을 조합하여 만들었다. 도 14를 참고하면, 자외선 조사 전 후 모두에서 UP676의 국소 적용은 대조군과 표준 치료제 - 수트-어-케인(sooth-a-caine)을 투여한 그룹에 비해 홍반 수치가 현저하게 감소되었음을 나타냄을 알 수 있다.
도 15는 실시예 15에 기재된 조건 하에서 1, 3, 6, 8 및 13일 째에 다양한 수용액에서의 순수 카테킨 농도의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 분해(decomposition) 및 색 변화로부터 pH 7.5의 수용액에서 순수 카테킨을 보호하기 위하여 사용될 수 있는 다양한 화학적 방부제를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 UP676 300mg 단독 경구 투여 후 10마리의 건강한 피실험체(n=10, 암컷 6마리 및 수컷 4마리)로부터 시간에 대한 평균 혈청 프리-비-링 플라보노이드 농도를 그래프로 나타낸 것이다. 평균 Cmax는 0.93μg/mL(% RSD = 84.9)이고, 평균 Tmax는 대략 5.8시간(% RSD = 43.4)이었다.
여러가지 용어들이 본 발명의 특징을 나타내기 위하여 본원에 사용되고 있다. 본 발명의 화합물에 대한 설명의 명료화를 돕기 위하여 다음의 정의가 제공된다.
용어 "하나(a or an)"의 개체(entity)는 하나 또는 그 이상의 개체를 말함을 주의하여야 한다; 예를 들어, 플라보노이드(a flavonoid)는 하나 또는 그 이상의 플라보노이드를 말한다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 또는 그 이상(one or more)" 및 "적어도 하나(at least one)"는 본원에서 서로 교환하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "프리-비-링 플라보노이드(Free-B-Ring Flavonoids)는 하기의 일반식에 나타낸 것과 같이 방향족 B-고리 상에 치환기를 가지고 있지 않은 특정한 종류의 플라보노이드이다.
Figure 112007036764298-PCT00007
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합하고 여기에서 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체를 포함한다;
여기에서,
R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; 및
X는, 이에 제한되지는 않지만, 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카보네이트 등을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용된 "플라반(Flavans)"은 하기의 일반식으로 일반적으로 나타낼 수 있는 플라보노이드의 특정한 종류를 말한다:
Figure 112007036764298-PCT00008
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 이에 제한되지는 않지만, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르를 포함하는 치환기의 에스테르 및 그들의 화학적 유도체; 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합하고, 여기에서 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체 및 다른 중합된 플라반을 포함한다;
여기에서,
R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; 및
X는 이에 제한되지는 않지만 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카보네이트 등을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용된 "치료적(Therapeutic)"은 치료 및/또는 예방(prophylaxis)를 포함한다. 치료적이 사용될 때는 인간 뿐만 아니라 다른 동물도 말한다.
"약제학적 또는 치료적으로 유효한 투약량 또는 양"은 바람직한 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 수준의 투약량을 말한다. 상기 결과는 징후, 증상 또는 질병의 원인 또는 바람직한 생물학적 시스템의 또 다른 변화를 완화시킬 수 있다. 정확한 투약은, 이에 제한되지는 않지만, 피실험자의 나이 및 사이즈, 효능을 나타내는 질병 및 치료를 포함하는 다양한 인자에 따라 변경할 수 있다.
"플라시보(Placebo)"는 비활성 물질(non-active substance)로 질병의 징후, 증상 또는 원인을 완화시킬 수 있는 바람직한 생물학적 효과를 유도하기 위한 약제학적 또는 치료적 유효량 또는 투약량의 대용품을 말한다.
"수용자" 또는 "환자"는 본원에 기재된 조성물을 투여받는 인간 또는 동물의 살아있는 피실험자이다. 따라서, 본원에 기재된 발명은 인간 뿐만 아니라 가축에도 적용할 수 있고, 용어 "환자" 또는 "수용자"는 방법을 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 가축의 적용의 경우에, 투약 범위는 동물의 체중을 고려하여 하기에 기재된 것과 같이 결정할 수 있다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않으며, 투여된 수용자에 독성을 나타내지 않는 어떠한 담체를 말한다. "약제학적으로 허용가능한 담체"의 예는, 이에 제한되지는 않지만, 생리 식염수 즉, 링거액, 완충된 생리 식염수, 물, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민 및 정제화 및 캡슐화 제제를 위한 첨가제 및 방부제와 같은 표준 약제학적 담체 중 하나를 포함한다.
"유전자 발현(Gene expression)"은 mRNA에 대한 유전자의 전사를 말한다.
"단백질 발현(Protein expression)"은 단백질에 대한 mRNA의 번역을 말한다.
본원에서 사용된 "RT-qPCR"은 mRNA 분자를 cDNA 분자로 역전사하고, 형광 리포터와 결합한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 사용하여 유전자의 발현 수준을 정량적으로 측정하는 방법을 말한다.
여러가지의 인용이 이 출원을 통하여 제공된다는 것을 주목하여야 한다. 각각의 인용은 참조에 의해 그 전체가 본원에 명확하게 통합되어 있다.
본 발명은 유성 및 수용매를 사용하여 스쿠텔라리아 속으로부터의 세가지 종과 오록실럼 인디쿰을 포함하는 프리-비-링 플라보노이드를 함유한 식물 및 아카시아 카테츄와 운카리아 속으로부터의 세가지 종을 포함하는 플라반을 함유한 식물의 추출(실시예 1, 표 1)을 위한 방법을 제공한다. 조 추출물의 사이클로옥시게나아제 저해 활성을 검정하였다(실시예 2, 표 2 및 3). 정제된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반은 실시예 3 및 4와 표4에 나타낸 것과 같이 각각 사이클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX)에 대하여 저해 활성을 나타내었다. 추출물을 정 량화하고 분석하는 방법은 실시예 5 및 6에 기재되어 있으며, 허브식물 재배지(botanical origins)로부터 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반을 생성하기 위한 방법은 실시예 7 및 8에 제공되어 있다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물은 실시예 1, 2, 5 및 8에 정의된 것과 같이 총 프리-비-링 플라보노이드의 1-99 중량% 사이의 순도를 가지는 활성 화합물로 이루어져 있다. 바이칼린은 스쿠텔라리아 속으로부터 유래된 추출물에서 대략 총 프리-비-링 플라보노이드의 50-90 중량%를 차지하는 주요한 활성 성분이다. 바람직한 실시예에서(실시에 9), 프리-비-링 플라보노이드 중량의 주요 성분이 바이칼린인 스쿠텔라리아 속으로부터 유래된 표준화된 추출물은 총 프리-비-링 플라보노이드의 82% 이상을 함유한다(표 11을 참고).
하나의 실시예에서, 표준화된 플라반 추출물은 실시예1, 4, 6 및 7에 정의된 것과 같이 총 플라반의 1-99 중량% 사이의 순도를 가지는 활성 화합물로 이루어져 있다. 카테킨은 아카시아 카테츄 및 운카리아 감비르 모두로부터 유래된 추출물에서 총 플라반의 30-95 중량%를 차지하는 주요 활성 성분이다. 바람직한 실시예에서(실시예 9), 아카시아 카테츄로부터 유래된 표준화된 플라반 추출물은 80% 이상의 카테킨을 함유한다.
하나의 실시예에서, 99:1 내지 1:99의 비율로 상기 두개의 추출물 또는 합성 화합물을 혼합하여 UP676을 만들었다. 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 바람직한 w/w(weight by weight) 비율은 실시예 9 및 표11에 정의된 것과 같이 80:20이 다.
UP676에서 프리-비-링 플라보노이드의 농도는 약 1% 내지 99%가 될 수 있고, UP676에서 플라반의 농도는 99% 내지 1%가 될 수 있다. 실시예 9 및 표 11에 기재된 것과 같이 본 발명의 바람직한 실시예에서, UP676에서 총 프리-비-링 플라보노이드의 농도는 UP676 총 중량의 약 60%의 바이칼린을 포함하여 대략 75%이고, UP676에서 총 플라반의 농도는 대략 9.9%의 카테킨을 포함하여 대략 10%이다. 이 실시예에서, UP676에서의 총 활성 성분(프리-비-링 플라보노이드 플러스 플라반)은 85 중량% 이상이다.
본 발명은 치주질환 및 잇몸 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한 아이코사노이드 및 사이토카인 경로를 동시에 저해하는데 효과적인 방법을 포함한다. 아이코사노이드 및 사이토카인 경로의 이중 조절을 위한 방법은 단일 식물 또는 복합 식물로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물로 이루어진 조성물을 그들을 필요로 하는 수용자에 전신적 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 이 성분의 조성물은 본원에서 UP676라 말한다. 이 방법의 효능은 서로 다른 세포주, 복합 동물 모델 및 마침내 인간 임상 연구에서 정제된 효소를 사용하여 증명하였다. 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 프리-비-링 플라보노이드:플라반 99.9;0.1 내지 프리-비-링 플라보노이드:플라반 0.1:99.9의 범위이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30;70, 20;80 및 10:90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물 질의 합성에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 80:20이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속의 식물 또는 식물들로부터 분리되고, 플라반은 아카시아 속 식물 또는 식물들로부터 분리된다.
본 발명은 또한 사이클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX) 효소 활성을 동시에 저해하는 방법을 포함한다. 사이클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX) 효소 활성을 동시에 저해하기 위한 방법은 단일 식물 또는 복합 식물로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체로 이루어진 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 수용자에 전신적 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 프리-비-링 플라보노이드:플라반 99.0:0.1 내지 프리-비-링 플라보노이드:플라반 0.1:99.9의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 대략 90:10, 80:20, 70;30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 물질의 합성에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 80:20이다. 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속의 식물 또는 식물들로부터 분리되고, 플라반은 아카시아 속의 식물 또는 식물들로부터 분리된다.
본 발명은 또한 IL-1β, TNFα 및 IL-6 뿐만 아니라 구강, 잇몸 및 치아에 관련된 질병 및 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한 염증에 관련된 다른 단백질의 동시 감소를 위한 방법을 포함한다. 이론에 제한되지는 않지만, 이 단백질을 감소시키기 위한 메카니즘은 본 발명의 물질의 조성물에 의한 유전자 발현의 하향 조절의 결과라고 믿는다. 전염증성 사이토카인, 특히 IL-1β는 치주조직의 만성 감염에서 중요한 역할을 한다. 전염증성 사이토카인의 합성 유도는 PDL 세포형 및 기능에 영향을 미친다. 이 사이토카인은 감염 부위에서 면역 세포를 활성화시키고 보충할 뿐 아니라, 지지골의 손실 및 인대 부착을 유도한다. 전염증성 사이토카인 유전자의 발현, 특히 IL-1β, TNFα 및 IL-6의 동시 억제를 위한 방법은 단일 식물 또는 복합 식물로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물로 이루어진 조성물을 그것을 필요로 하는 수용자에 전신적 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 이 물질의 조성물을 UP676이라 한다. 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 프리-비-링 플라보노이드:플라반 99.9:0.1 내지 프리-비-링 플라보노이드:플라반 0.1:99.9의 범위이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 대략 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서, 물질 합성에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 20:80이다. 다른 바람직한 실시예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 스쿠텔라리아 속의 식물 또는 식물들로부터 분리되고, 플라반은 아카시아 속의 식물 또는 식물들로부터 분리된다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 이에 제한되지는 않지만, 치은염, 테스트형 치주염(aggressive periodontitis), 만성 치주염, 치근단 치주염(periapical periodontitis), 전신성 질환의 징후와 같은 치주염 및 괴사성 치주 질 환(necrotizing periodontal disease)과 같은 치주(잇몸) 질환을 포함하는 구강, 잇몸 및 치아와 관련된 다수의 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함하며, 여기에서 상기 치주질환의 원인은, 이에 제한되지는 않지만, 만성 세균성 감염, 치석의 축적, 흡연 및/또는 저작에 의한 담배 사용, 유전적 감수성(genetically susceptibility), 임신 및 사춘기에 의해 야기되는 스트레스, 약물치료 및 당뇨병, 영양실조 및 다른 전신성 질환을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 민감성 잇몸 및 치아, 후유증(sequelae), 치수염, 과민증(irritation), 의치(oral denture)의 물리적 이식에 의해 야기되는 통증 및 염증, 외상, 손상, 이갈기 및 구강 내, 잇몸 또는 혀 상의 다른 작은 상처, 치태 및 치석, 치아의 칼슘 손실, 단백질 가수분해 및 충치의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 치태 및 치석, 치아의 칼슘 손실, 단백질 가수분해 및 충치의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 치료제를 포함하는 치료학적 조성물을 더 포함한다. 게다가 구강, 치아 및 잇몸의 상기 기재된 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 그것의 용도는 또한 최적의 침 생성, 침의 pH 값을 유지하고, 세균 성장을 최소화하고, 치석산(plaque acid)의 형성을 감소시키고, 미네랄의 손실을 저해하고, 재석회질화를 촉진하고, 충치의 유병률(prevalence)을 감소시키고, 건강한 잇몸을 만들며, 치아를 미백하고, 건강한 구강 위생을 유지하고, 구취를 감소시키는데 유용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 프리-비-링 플라보노이드는 상기 기재된 일 반 구조로 나타낸 화합물을 포함한다. 본 발명의 프리-비-링 플라보노이드는, 이에 제한되지는 않지만, 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤프레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 나도고사리과(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)를 포함하는 식물군으로부터 합성 방법에 의하여 얻어질 수 있거나 분리될 수 있다. 프리-비-링 플라보노이드는, 이에 제한되지는 않지만, 데스모스(Desmos), 아키로클리네(Achyrocline), 오록실룸(Oroxylum), 부케나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라(Cotula), 그나팔리움(Gnaphalium), 헬리크리섬(Helichrysum), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 박카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브루케아(Colebrookea), 스타치스(Stachys), 오리가눔(Origanum), 지지포라(Ziziphora), 린데라(Lindera), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아(Millettia), 퐁가미아(Pongamia), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스(Artocarpus), 피쿠스(Ficus), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나(Notholaena), 피누스(Pinus), 울무스(Ulmus) 및 알피니아(Alpinia)를 포함하는 고등 식물 속으로부터 추출되고, 농축되고 정제될 수 있다. 상기 플라보노이드는, 이에 제한되지는 않지만, 줄기(stems), 줄기 껍 질(stem barks), 잔가지(tiwgs), 덩이줄기(tubers), 뿌리(roots), 뿌리 껍질, 어린 가지(young shoots), 열매(seeds), 뿌리줄기(rhizomes), 꽃 및 다른 생식기관, 잎 및 다른 지상부(aerial parts)를 포함하는 식물의 서로 다른 부분에서 발견할 수 있다.
프리-비-링 플라보노이드의 분리 및 정제를 위한 방법은 2002년 3월 1일에 출원된 "강력한 Cox-2 저해제로서 프리-비-링 플라보노이드의 확인(Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors"라는 제목의 미국출원 No. 10/091,362 및 2003년 8월 27일에 출원된 "강력한 Cox-2 저해제로서 프리-비-링 플라보노이드의 확인"이라는 제목의 미국출원 No. 10/469,275에 기재되어 있으며, 그각각이 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 플라반은 상기에 기재된 일반 구조에 나타낸 화합물을 포함한다. 본 발명의 플라반은 아카시아 또는 운카리아 속으로부터 선택된 식물 또는 식물들로부터 얻어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 식물은 아카시아 카테츄(Acacia catechu), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비카(Acacia arabica), 아카시아 카에시아(A. caesia), 아카시아 펜나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata), 아카시아 메아른시이(A. mearnsii), 아카시아 피크난타(A. picnantha), 아카시아 데알바타(A. dealbata), 아카시아 아우리쿨리포미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia) 및 아카시아 만기움(A. mangium); 및 운카 리아 감비르(Uncaria gambir), 운카리아 라노사(Uncaria lanosa), 운카리아 히르수테(Uncaria hirsute), 운카리아 아프리카나(Uncaria africana), 운카리아 엘리프티카(Uncaria elliptica), 운카리아 오리엔탈리스(Uncaria orientalis), 운카리아 아테뉴아테(Uncaria attenuate), 운카리아 아시다(Uncaria acida), 운카리아 호모말라(Uncaria homomalla), 운카리아 세시리프룩투스(Uncaria sessilifructus), 운카리아 스테로필라(Uncaria sterrophylla), 운카리아 베르나이시이(Uncaria bernaysii), 운카리아 시넨시스(Uncaria sinensis), 운카리아 칼로필라(Uncaria callophylla), 운카리아 리코필라(Uncaria rhychophylla), 운카리아 토멘토사(Uncaria tomentosa), 운카리아 롱기플로라(Uncaria longiflora), 운카리아 히르수테(Uncaria hirsute), 운카리아 코르다타(Uncaria cordata) 및 운카리아 보르넨시스(Uncaria borneensis)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 플라반은 이에 제한되지는 않지만, 줄기(stems), 줄기 껍질(stem barks), 잔가지(tiwgs), 덩이줄기(tubers), 뿌리(roots), 뿌리 껍질, 어린 가지(young shoots), 열매(seeds), 뿌리줄기(rhizomes), 꽃 및 다른 생식기관, 잎 및 다른 지상부(aerial parts)를 포함하는 식물의 서로 다른 부분에서 발견할 수 있다.
플라반의 분리 및 정제를 위한 방법은 2002년 3월 22일에 출원된 "아카시아로부터의 이중 Cox-2 및 5-리폭시게나아제 저해제의 분리(Isolation of a Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia)"라는 제목의 미국출원 No. 10/104,477에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다.
본 발명은 특히 COX 및 LOX 효소 활성을 저해하고, mRNA 유전자 발현에 강한 영향을 주며, 염증을 감소시키는 활성 식물 추출물에 대한 시험관 내 생화학적, 세포 및 유전자 발현 선별 뿐 아니라 생체 내 염증 및 독성 연구와 조합하는 단계를 실행한다. 특히 COX 및 LOX를 저해하는 활성 식물 추출물을 확인하기 위하여 본원에서 사용된 방법은 실시예 1 및 2 뿐만 아니라, 2002년 3월 1일에 출원된 "강력한 Cox-2 저해제로서 프리-비-링 플라보노이드의 확인(Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors"라는 제목의 미국출원 No. 10/091,362, 2002년 3월 22일에 출원된 "아카시아로부터의 이중 Cox-2 및 5-리폭시게나아제 저해제 분리"라는 제목의 미국출원 No. 10/104,477 및 2003년 4월 30일에 출원된 "이중 Cox-2 및 5-리폭시게나아제 저해 활성을 사용한 제형"이라는 제목의 미국출원 No. 10/427,746에 기재되어 있으며, 그 각각이 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다.
본 발명의 조성물의 다양한 용도는 2004년 2월 24일에 출원된 "정의된 식물 추출물을 사용한 탄수화물 유도성 비만의 저해(Inhibition of Carbohydrate Induced Obesity with a Defined Plant Extract)"라는 제목의 미국출원 No. 10/785,704, 2004년 4월 2일에 출원된 "포유동물의 피부 관리를 위한 이중 COX-2 및 5-리폭시게나아제 저해제 제형(Formulation of Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitors for Mammal Skin Care)"라는 제목의 미국출원 No. 10/817,330, 2004년 9월 1일에 출원된 "인지기능 저하 및 노화에 따른 기억력 감퇴의 예방 및 치료에 사용하기 위한 이중 COX-2 및 5-리폭시게나아제 저해 활성을 가지는 제형(Formulation With Dual COX-2 and 5-lipoxygenase Inhibitory Activity for Use in the Prevention and Treatment of Cognitive Decline and Age-Related Memory Impariments)"라는 제목의 미국출원 No. 10/932,571 및 2004년 8월 27일에 출원된 "복합 사이토카인 유전자의 하강 조절을 위한 치료제(Therapeutic Agent for the Down-Regulation of Multiple Cytokine Genes)"라는 제목의 미국출원 No. 60/605,110에 기재되어 있다. 이들 출원 각각은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다.
생화학적 검정은 헴(heme) 및 아라키돈산의 존재하에서 단백질의 페록시다아제 활성으로 믿어지는 COX의 저해를 측정하기 위하여 사용된다. 실시예 3에 기재된 이 연구는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 분리된 정제된 프리-비-링 플라보노이드, 바이칼린 및 바이칼레인과 아카시아 카테츄로부터 분리된 플라반 추출물을 보여주며, 각각의 고농도의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반을 포함하는 표준화된 추출물은 COX 활성을 저해함을 나타내었다(도 1-5). 게다가, 실시예 9에 나타낸 것과 같이 제조된 서로 다른 비의 각각의 표준화된 추출물(즉, 80:20, 50:50 및 20:80 프리-비-링 플라보노이드:플라반)을 가지는 조성물은 모두 시험관 내에서 COX 활성을 저해하는데 높은 효과를 나타냈다(도 6-8).
프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 조합이 COX-1 및 COX-2 효소에 대하여 더욱 안정된 조절을 제공한다는 것이 명백하게 증명되었다. 예를 들어, COX-2보다 COX-1에 대하여 150배 이상 더 강력한 COX-1 선택적 저해제인 아스피린(aspirin)은 위장관 부작용을 야기한다. 반대로, COX-1 효소보다 COX-2 효소에 대하여 50 내지 200배 더 효능을 가지는 선택적 COX-2 저해제인 바이옥스(Vioxx), 셀레브렉 스(celebrex) 및 벡스트라(Bextra)는 위장관 손상까지 야기시키지는 않지만, 이 COX-2 선택적 약물은 심장혈관 위험을 증가시킨다. 반면에, 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 제형은 바이칼린의 보다 큰 COX-2 활성 및 카테킨의 보다 큰 COX-1 활성 사이의 균형을 제공한다. COX-1 효소에 대한 UP676 제형에서 카테킨의 적절한 선택도(moderate selectivity; 2.3 fold)는 선택적 COX-2 저해제에 의해 야기된 심장혈관 위험을 감소시키기 위하여 작용한다.
또한 작용 메카니즘은 상기 참조된 현재 사용가능한 약물과 천연 포뮬라(formula) UP676가 완전히 다름을 나타낸다. 아스피린, 바이옥스, 셀레브렉스 및 벡스트라는 강하게 결합된 효소-저해제 복합체를 형성하기 위해 공유결합을 통하여 COX 효소와 불가역적으로(irreversibly) 결합한다. 이러한 극적 상호작용은 효소의 활성 부위 및 사이드 포켓(side pocket)을 변화시키고, 효소를 파괴한다(Walker MC. Kurumbal RG., et al. (2001) Biochem. 357:709-718). 반면에, UP676에서 플라보노이드는 그들의 항산화 특성 때문에 더욱 약하고 가역적인 결합을 통하여 COX 효소를 저해한다. 이 상호작용의 과정에서, COX 효소의 구조 및 기능은 불가역적으로 변하는 것이 아니기 때문에 그 결과 UP676에 대하여 더욱 나은 내성(tolerance) 및 안정한 프로파일을 가진다.
아카시아 카테츄로부터 분리된 플라반 추출물에 의한 LOX 활성의 저해는 실시예 4에 기재된 것과 같이 시험관 내 리폭시게나아제 선별 검정을 사용하여 측정된다. 그 결과를 도9에 나타내었다. 프리-비-링 플라보노이드에 플라반을 첨가하여, UP676은 또한 5-LOX의 활성을 저해한다. 5-LOX의 저해는 만성 염증의 증상과 직접적으로 관련된 탐식성 류코트리엔(phagocytic leukotrienes)의 축적을 감소시키고, 또한 잠재적인 위장관 부작용을 감소시킨다. 이러한 효능은 실시예 10 및 도 11 및 12에 나타나 있다. 간단히 말하면, LOX 경로에서 아라키돈산의 분해로 화합물의 저해를 표적하는 세포 검정, 즉 류코트리엔 B4를 실시예 10에 기재된 것과 같이 UP676 샘플을 사용하여 수행하였다. UP676에 의한 LTB4의 저해를 도 12에 나타내었다. 이 도면에 나타낸 결과를 참고하면, 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 조합은 류코트리엔 생산을 현저하게 감소시키는 추가적인 이익을 제공함이 분명하다. 류코트리엔 생산에서 이 감소는 이부프로펜과 같은 전통적인 비스테로이드성 항염증성 약물보다 더 뛰어나다.
실시예 11은 UP676이 인간의 세포에서 IL-1β, TNFα 및 IL-6를 포함하는 항염증성 사이토카인 그룹의 유전자 발현을 효과적으로 억제함을 나타낸다. 상기 실험은 확립된 염증성 세포 모델인 리포다당류(LPS)로 자극된 인간 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMC)을 사용하여 수행되었다. 세포를 다양한 농도(0, 10, 30 및 100μg/mL)에서 UP676과 함께 배양할 때, 전염증성 사이토카인의 유전자 발현은 투약 의존성(dose dependent manner)으로 억제된다(표 12).
전염증성 사이토카인, 특히 IL-1β, TNFα 및 IL-6는 치주조직에서 만성 염증에 중요한 역할을 한다. 사이토카인은 감염부위에서 면역세포를 활성화시키고 보충할 뿐만 아니라 지지골의 손실 및 인대성 부착물의 손실을 유도한다. 이 사이 토카인 유전자의 mRNA 레벨은 병든 치주조직에서 높아지며, 전염증성 사이토카인의 합성은 PDL 세포형 및 기능에 영향을 미친다. UP676이 mRNA 레벨에서 IL-1β, TNFα 및 IL-6를 포함하는 전염증성 사이토카인을 동시에 극적으로 억제하기 때문에, 이는 치주질환을 치료하는 효과적인 방법을 제공한다.
생체 내 효능은 마우스의 귀 및 발목 관절에 AA와 같은 피부 자극 물질(skin irritating substances)의 적용(미생물 감염 및 치석에 대한 치주 조직의 생물학적 반응을 모방하였음)과 실시예 12에 기재된 것과 같이 UP676를 처리한 마우스에서 부종(swelling)의 감소를 측정함으로써 증명되었다. 이 결과는 도 13에 기재되어 있다. 이 도면을 참고하면, 50mg/kg 내지 200mg/kg의 투약량의 UP676 경구투여가 국소 자극으로 야기된 마우스의 귀 부종을 현저하게 감소시킴을 알 수 있다.
UP676 국소 적용의 효능은 실시예 13 및 도 14에 나타낸 것과 같이 또 다른 동물 모델을 사용하여 UV 유도성 피부 홍반을 예방하고 치료함으로써 추가로 증명되었다. 실시예 13에 기재된 연구에서, UP676을 80:20 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 혼합비로 물에 용해시키고, 각각 UV 노출 전 및 후 무모 생쥐의 피부에 두가지 농도로 국소적으로 적용하였다. 두개의 농도 및 UV 노출 전 또는 후와 같은 적용 시간을 고려하지 않고, 4개의 UP676 그룹으로부터 무모 생쥐의 홍반 수치는 모두 대조군 및 수트-어 케인을 처리한 그룹 모두에서의 심각하고 광범위한 홍반에 비하여 더욱 작은 피부 면적에서 매우 적은 발적(redness)을 보였다. 이 연구는 UP676이 염증 반응을 감소시키기 위하여 무모 생쥐의 피부에 침투할 수 있음을 나타낸다. 이론에 제함됨 없이, 이 결과는 아이코사노이드 및 사이토카인 경로 모두의 동시 저해에 의하여 달성된다고 믿어진다.
실시예 14(표 13)는 약제학적, 피부학적 및 미용학적으로 허용가능한 첨가제를 사용하여 UP676 크림을 제조하기 위한 일반적 방법을 기재한다. 비교를 위하여, 이 실시예는 0.5 중량%의 UP676 국소 크림을 제조하기 위한 상세한 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 또한 약제학적 및/또는 미용학적으로 허용가능한 첨가제, 흡착제, 향미 및/또는 담체와 같은 다른 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 치료할 수용자가 허용할 수 있는 첨가제로 제조될 수 있다. 첨가제는 약물의 희석제 또는 비히클로서 사용되는 불활성 물질(inert substance)이다. 이러한 첨가제의 예는, 이에 제한되지는 않지만, 물, 알콜(에탄올 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜), 완충액, 염수, 수화 실리카, 덱스트로스 용액, 셀룰로오스 검, 소르비톨, 만니톨, 방부제 및 다른 수성의 생리학적으로 균형을 맞춘 염용액을 포함한다. 치료학적 조성물은 또한 등장(isotonicity) 및 화학적 안정성을 강화시키는 물질과 같은 미량의 첨가물을 포함할 수 있다. 실시예 17에 나타낸 것과 같이, 이러한 방부제는, 이에 제한되지는 않지만, BHA, BHT, 시트르산 이암모늄(diammonium citrate; DAC), 부틸히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 에틸렌디아민사초산(ethylenediamine tetraacetic acid; EDTA), H2O2, 프로필 갈레이트(propyl gallate; PG), 소디움 글루코네이트(sodium gluconate; SG) 및 소디움 바이설페이트/메타비설파이트(sodium bisulfate/metabisulfite; SBS), 소디움 라우릴 설페이트, 스태너스 클로라이 드(stannous chloride), 스태너스 플루오라이드(stannous fluoride), 소디움 벤조에이트, 벤조산을 포함한다. 고정유(fixed oils), 참기름(sesame oil), 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 비수용성 비히클이 또한 사용될 수 있다. 다른 유용한 제형은 소디움 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨, 크산탄 검, 메틸 셀룰로오스 또는 덱스트란과 같은 점성 강화제를 함유하는 현탁액을 포함한다. 완충액의 예는 인산 완충용액, 중탄산염 완충용액, 트리스 완충용액, 히스티딘, 구연산염 및 글라이신 또는 그들의 혼합물을 포함하며, 방부제의 예는, 이에 제한되지는 않지만, m- 또는 o-크레졸, 포르말린 및 벤질 알콜을 포함한다. 표준 제형은 투여를 위하여 현탁액 또는 용액과 같은 적합한 형태로 취할 수 있는 액체 또는 겔 또는 페이스트 또는 고체가 될 수 있다.
하나의 실시예에서, 조성물을 수용자 안에서 본 발명의 제형을 천천히 방출하는 서방형 제형(controlled release formulation)으로 제조하였다. 본원에서 사용되는 서방형 제형은 서방형 비히클에 본 발명의 조성물을 포함한다. 적합한 서방형 비히클은 당업자에게 알려져 있는 것일 수 있다. 바람직한 서방형 제형은 생분해성(biodegradable; 즉, bioerodible)이다.
실시예 15는 pH 및 방부제가 모두 다른 용액에서의 카테킨의 안정성을 나타낸다. 카테킨은 이 화합물이 산화적 스트레스에 대해 더욱 산성 및 민감성이 되도록 만드는 페놀성 히드록시기를 포함한다. 카테킨의 매우 높은 산소 유리기 흡수력(Oxygen Radical Absorption Capacity; 2000에서 ORAC)은 카테킨의 항산화 특성 을 나타낸다. 도 15에 나타낸 것과 같이 측정된 pH, H2O2 및 금속 이온의 존재와 같은 다양한 조건 하에서 순수한 카테킨의 스트레스 테스트에 기초하여, 카테킨은 4℃ 및 40℃의 중성 조건하에서는 안정하였으나 염기성 조건 또는 Fe3 +와 같은 금속 이온에 노출되었을 때는 안정하지 않았다. 심지어 약한 염기성 조건(pH=7.5)하에서는 카테킨이 분해되었다. 그러나, 그것은, 이에 제한되지는 않지만, 스태너스 클로라이드(SnCl2), 소디움 바이설페이트/메타바이설파이트(SBS) 및 다른 도 16에 나타낸 것과 같은 방부제를 포함하는 다수의 방부제에 의하여 예방될 수 있다.
바람직한 실시예에서 이 두 종류 화합물의 결합에 대한 또 다른 이점은, 상대적으로 더 적은 농도의 플라반(20 중량%)와 많은 양의 프리-비-링 플라보노이드의 제형, 산화적 분해에 대하여 천연 방부제로서 더욱 강력한 항산화 플라반 기능 및 최적의 pH 및 이온화 조건에서 주요 활성 성분인 프리-비-링 플라보노이드를 운반하기 위한 방법에서 중화 및 완충제로서 작동한다.
실시예 16은 인간에서 경구 투여 후 UP676에서의 활성 성분의 생물학적 유용성을 나타낸다. 이 결과는 도 17에 기재하였다. 도 17을 참고하면, 이 분석에서 나타난 폭 넓은 에러 바는 피실험자간의 각각의 편차 때문이다. 중량에서 종류 및 차이는 Cmax 및 Tmax에 대해 나타난 차이점 또는 흡수 및 제거와 관계가 없다. UP676에서 프리-비-링 플라보노이드가 상피 세포를 통하여 침투할 수 있다는 것이 명백하게 나타났다. 그러나, 혈청과 같은 인간의 체액에서 프리-비-링 플라보노이드의 존재는 바이칼레인과 같은 아글리콘 형태(aglycon form)가 아니라 바이칼린 또는 황화 바이칼레인과 같은 더욱 결합된 구조이다. 혈청에서 프리-비-링 플라보노이드의 총 농도를 정량하기 위하여, 모든 결합된 화합물을 아글리콘--바이칼레인을 방출하기 위한 두가지의 효소를 사용하여 가수분해한 후, HPLC로 정량하였다.
표 14는 각각의 피실험자로부터 관찰된 바이칼레인의 농도(Cmax, μg/mL) 및 시간(Tmax, 시간)의 최대값을 나타낸다. 데이터는 대부분의 피실험자의 최대 농도가 초기 투약 후 4 및 8시간 사이에 달성되었음을 보여준다. 평균 Cmax는 0.93μg/mL이고, 평균 Tmax는 대략 5.8시간(% RSD = 43.4)이었다. 이 데이터에 기초하여, 흡수 및 제거에 대한 평균 시간을 전체 연구 그룹에 대하여 계산하고 도면을 작성하였다(도 17). UP676으로부터의 COX 저해의 IC50값은 도 6에 나타낸 것과 같이 0.2-0.4μg/mL 사이이며, 그것은 효능이 있는 농도에 도달하기 위하여 UP676의 경구 투여 약 2시간 후에 얻는다. 그러나, 프리-비-링 플라보노이드의 혈청 농도는 경구 투여 후 약 10시간 동안 상기 치료학적 농도로 잔존할 수 있다. 프리-비-링 플라보노이드으로부터의 빠른 생물학적 유용성의 결핍을 보충하기 위하여, 카테킨형 플라반의 제형은 우선적인 이점을 제공한다. 카테킨, 케르세틴 및 에피갈로카테킨-3-갈레이트의 생물학적 유용성 연구는 카테킨의 Cmax 및 Tmax가 빨리 나타나며(약 45분), 반감기가 2시간이라고 보고되어 있음을 보여준다(Kao et al. (2000) Endocrinology 141(3):980-987; Koga and Meydani (2001) Am. J. Clin. Nutr. 73:941-948; Lee et al. (2002) Cancer Epidemiol. Biomarker Prevention 11:1025-1032). 따라서, 플라반과 프리-비-링 플라보노이드의 결합에 의해 빠르게 침투하는 카테킨이 경구 투여 후 약 0.5 시간안에 효과적인 혈청 농도에 도달한다. 2차 활성 성분인 카테킨의 농도가 떨어질 때, 프리-비-링 플라보노이드는 경구 투여 후 12시간 지속될 수 있는 생물활성 농도에 도달한다. 결론적으로, UP676 제형은 빠른 현장 치주 고통의 감소 및 카테킨과 같은 플라반으로부터 생기는 항염증성 효과 및 바이칼린과 같은 프리-비-링 플라보노이드로부터 생기는 지속 효과를 가지도록 설계되어 있다. 이러한 상승적이고 우선적인 효과는 또한 성분의 국소 운반을 통하여 달성될 수 있다.
실시예 17은 인간의 피부에 대한 UP676을 안전하게 국소적으로 적용하는 것을 나타낸다. 실시예 9 및 14에 나타낸 것과 같이 제조된 UP676을 강력한 자극 및 접촉 감작(contact sensitization)의 유도에 대하여 인간의 피부상에서 측정하였다. 총 97 및 101명의 피실험자의 유도를 완료하고, 각각 0.5% 및 1.5%의 UP676 크림을 테스트하였다. 테스트 결과는 0.5% 및 1.5% 농도에서의 UP676 크림이 최소한의 자극을 주며, 유도성 접촉 감작의 흔적을 찾을 수 없었음을 보여준다.
결론적으로, 본 발명의 조성물은 당업자에게 알려진 어떤 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여 방법은, 이에 제한되지는 않지만, 구강 투여, 비경구적(정맥내, 복강내 및 근육내) 투여 및 국소 투여를 포함한다. 본 발명에 따른 치료 방법은 단일 식물 또는 복합 식물로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물의 치료학적 유효량을 그것을 필요로 하는 환자에게 내부 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시예에서, 조성물은 국소적으로 투여된다. 본 발명의 치료제는, 이에 제한되지는 않지만, 페이스트, 연고, 겔, 로션 또는 구강 청결제 또는 크림 베이스와 같은 또는 에멀전과 같은, 패치, 드레싱과 같은 또는 마스크, 붙지 않는 거즈, 붕대, 면봉 또는 클로스 와이프와 같은 것을 포함하는 치료학적 조성물을 국소적으로 투여하기 위하여 당업자에게 알려진 적합한 어떤 방법에 의해 국소적으로 투여된다. 이러한 국소 적용은 칫솔을 이용한 브러싱, 코팅된 치실(dental floss) 또는 면봉을 이용한 적용 또는 액체 또는 겔을 이용한 린스제와 같은 국소 투여를 위한 공지의 어떠한 표준 방법을 사용하여 어떤 효과적인 부위에 국소적으로 적용될 수 있다. 치료학적 조성물은 투여 방법에 따른 다양한 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 운반의 특정 방법을 위하여, 본 발명의 치료학적 조성물은 본 발명의 첨가제로 제조될 수 있다. 본 발명의 치료제는 어떠한 수용자, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 투여의 특정한 방법은 치료될 질환에 의존할 수 있다.
하나의 실시예에서, 적절한 연고는 0.05 내지 5%(바람직하게는 0.1 내지 0.5%)의 치약, 0.01 내지 5%의 구강 청결제(바람직하게는 0.2 내지 1%) 및 0.1 내지 25%(바람직하게는 0.5 내지 5%)의 에멀젼 겔 또는 크림으로부터 국소 제형의 총 중량에 기초하여 0.001% 내지 100%의 범위로부터 일반적으로 선택된 효과적이고 무독성을 나타내는 양의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물의 바람직한 농도로 구성되어 있다.
투여의 방법에 관계 없이, 특정 투약량은 대략 수용자의 체중에 따라 계산된 다. 상기 언급된 제형 각각을 포함하는 치료를 위한 정확한 투약량을 결정하는데 필요한 계산의 추가적인 개선(refinement)은 당업자에 의해 통상적으로 만들어질 수 있으며, 이것은 과도한 실험없이 특히 본원에 기재된 투약 정보 및 검정에 비추어서 그들에 의해 통상적으로 수행되는 일의 범위내에 있다. 이 투약량은 적절한 용량 반응 데이타와 함께 사용되는 투약량을 결정하기 위한 확립된 검정법의 사용을 통하여 확인할 수 있다.
본원에 기재된 발명은 인간에의 적용 뿐만 아니라 가축용으로도 사용될 수 있으며, 용어 "수용자(host)"는 제한하는 용도로 해석해서는 안된다. 가축 적용의 경우에, 투약 범위는 상기에 기재된 것과 같이 결정할 수 있으며, 동물의 체중을 감안하여야 한다.
하기의 실시예는 단지 실례를 목적으로 제공되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1 : 아카시아 및 스쿠텔라리아 식물로부터의 유성 및 수성 추출물의 제조
콩과 아카시아 카테츄(L)의 나무껍질, 스쿠텔라리아 오르토칼릭스의 뿌리, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리 또는 스쿠텔라리아 라테리플로라의 전체 식물 및 여러가지 오록실룸 및 운카리아 종으로부터의 식물 물질을 2mm 보다 크지 않은 입자 사이즈의 가루로 만들었다. 그 후 건조된 가루 식물 물질(60g)을 삼각 플라스크로 옮기고, 메탄올:디클로로메탄(1:1)(600mL)을 첨가하였다. 혼합물을 한시간 동안 교반하고, 여과하고, 바이오매스를 메탄올:디클로로메탄(1:1)(600mL)로 다시 추출하였다. 유성 추출물을 얻기 위하여 유성 추출물을 진공 하에서 화합하고 증발시켰다(하기의 표 1을 참조). 유성 추출 후, 바이오매스를 자연 건조시키고, 초순수 물(600mL)로 한번 추출하였다. 수성 추출물을 얻기 위하여 수용액을 여과하고 동결건조하였다(하기의 표 1을 참조).
식물 종으로부터의 유성 및 수성 추출물의 생산량
식물원 식물 부위 유성 추출물 수성 추출물
아카시아 카테츄 나무 껍질 27.2g 10.8g
스쿠텔라리아 오르토칼릭스 뿌리 4.04g 8.95g
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 9.18g 7.18g
스쿠텔라리아 라테리플로라 전체 식물 6.54g 4.08g
오록실룸 인디쿰 열매 6.58g 4.04g
운카리아 히르수타 지상부 2.41g 0.90g
운카리아 시넨시스 지상부 3.94g 1.81g
운카리아 토멘토사 나무 껍질 6.47g 2.31g
실시예 2 : 아카시아 카테츄 , 여러가지 스쿠텔라리아 종 및 다른 식물로부터의 식물 추출물에 의한 COX-2 및 COX-1 페록시다아제 활성 저해
특정 COX-2 저해제의 확인을 위한 생물검정 유도성 선별 방법은 하기에 기재된 것과 같이 효소의 페록시다아제 활성을 검정하기 위하여 설계하였다.
페록시다아제 검정. COX-2의 저해를 측정하기 위한 검정을 고속 대량 플랫폼(high throughput platform; Raz) 용으로 개량하였다. 간단히 말하면, 페록시다아제 완충액(100mM TBS, 5mM EDTA, 1μM 헴, 1mg 에피네프린, 0.094% 페놀)에서 재조합 오바인 COX-2(Cayman)을 15분간 추출물(1:500으로 희석)과 함께 배양하였다. 퀀타블루(Quantablu; Pierce) 물질을 첨가하고, 25℃에서 45분간 발색시켰다. 그 후 전계발광(luminescence)을 Wallac Victor 2 plate reader를 사용하여 판독하였다. 이 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2는 프리-비-링 플라보노이드와 구조적으로 유사한 아카시아 카테츄의 나무껍질, 두가지 스쿠텔라리아 종의 뿌리를 포함하는 세가지 식물 종으로부터 얻어진 유성(20μg/mL) 및 수성(20μg/mL) 추출물에 의한 COX-2 효소의 저해를 나타낸다. 데이터는 재조합 오바인 COX-2 효소 및 기질 단독과 관련된 페록시다아제 활성 퍼센트로 나타내었다. 유성 추출물에 의한 퍼센트 저해(percent inhibition)는 30% 내지 90%에 이른다.
여러가지 종에 의한 COX-2 페록시다아제 활성의 저해
식물원 유성 추출물에 의한 COX-2의 저해 수성 추출물에 의한 COX-2의 저해
아카시아 카테츄(나무껍질) 75% 30%
스쿠텔라리아 오르토칼릭스(뿌리) 75% 77%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스(뿌리) 75% 0%
COX-1 및 COX-2 아형(isoform)의 상대적 저해에 대한 비교는 이 효소 각각에 대한 IC50 값의 생성을 필요로 한다. IC50은 대조군에 따른 효소 활성의 50% 저해가 각각의 저해제에 의하여 달성되는 농도로서 정의된다. 이 실험에서, IC50 값은 표 3에 기재한 것과 같이 COX-2 및 COX-1 각각에 대하여 6 내지 50μg/mL 및 7 내지 80μg/mL의 범위임을 발견하였다. COX-2 및 COX-1의 IC50 값의 비교는 각각의 이 효소에 대한 여러가지 식물로부터의 유성 추출물의 특이성을 나타낸다. 예를 들어, 스쿠텔라리아 라테리플로라의 유성 추출물은 각각 30 및 80μg/mL의 IC50 값으로 COX-1과 COX-2에 대하여 바람직한 저해를 나타낸다. 몇몇의 추출물이 COX-2에 대하여 바람직한 저해를 나타낸 반면, 다른 것들은 그렇지 않았다. 아 분획으로부터의 HTP 분획 및 정제된 화합물의 실험은 이 추출물 및 화합물의 정확한 저해 특이성을 측정하기 위하여 필요하다.
인간을 위한 유성 추출물 및 오바인 COX-2 및 COX-1의 IC50 값
식물원 IC50 인간 COX-2 (μg/mL) IC50 오바인 COX-2 (μg/mL) IC50 오바인 COX-1 (μg/mL)
아카시아 카테츄(나무껍질) 3 6.25 2.5
스쿠텔라리아 오르토칼릭스 (뿌리) 테스트 하지 않음 10 10
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (뿌리) 30 20 20
스쿠텔라리아 라테리플로라 (전체 식물) 20 30 80
운카리아 시넨시스(전체 식물) 테스트 하지 않음 2.2 72.0
오록실룸 인디쿰(열매) 테스트 하지 않음 2.48 8.4
실시예 3 : COX -1 및 COX -2 페록시다아제 활성의 저해
COX-1 및 COX-2 활성이 저해된 화합물의 선별을 위하여 고효율의 시험관 내 검정이 개발되었고, 두 효소의 페록시다아제 활성의 저해에 이용되었다(Needleman et al. (1986) Annu Rev Biochem. 55:69). 간단히 말하면, 테스트 될 조성물 또는 화합물을 정해진 량의 COX-1 및 COX-2 효소에 대하여 적정하였다. 보조 인자(cofactor)로서 아라키돈산의 존재하에 각각 효소의 페록시다아제 활성을 시각화하기 위하여 쪼갤 수 있는(cleavable) 과산화물 발색단(peroxide chromophore)을 검정법에 포함하였다. 전형적으로, 검정은 96-웰 형식으로 수행하였다. 100% DMSO에 용해시킨 10mg/mL의 저장용액(stock solution)으로부터 취한 각각의 저해제를 0, 0.1, 1, 5, 10, 20, 50, 100 및 500μg/mL 범위의 농도를 사용하여 상온에서 3번 테스트하였다. 각각의 웰에, pH 7.5의 100mM Tris-HCl 150μL을 트리스 버퍼에 용해시킨 22μM 헤마틴 10μg/mL, DMSO에 용해시킨 저해제 10μL 및 COX-1 또는 COX-2 효소의 25 단위와 함께 첨가하였다. 상기 화합물을 회전 플랫폼 상에서 10초간 혼합하고, 반응을 개시하기 위하여 2mM N,N, N'N'-테트라메틸-p-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(N,N,N'N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride; TMPD) 20μL 및 1.1mM 아라키돈산 20μL를 첨가하였다. 플레이트를 10초간 교반한 후, 570nm에서 흡광도를 읽기 전에 5분간 배양하였다. 저해 농도 대 % 저해를 도면에 기입하고, X축 상의 농도를 가로지르고 등온선(isotherm)을 따르는 반직선 극대점(half-maximal point)을 취함으로써 IC50 을 결정하였다. 그 후, 검정에서 IC50 을 다수의 효소 단위로 표준화시켰다. 20μg/mL의 순수한 프리-비-링 플라보노이드로부터의 COX-1/COX-2 저해 활성을 표 4에 요약하였다.
정제된 프리-비-링 플라보노이드에 의한 COX 효소 활성의 저해
프리-비-링 플라보노이드 COX-1의 저해 COX-2의 저해
바이칼린 95% 97%
바이칼레인 107% 109%
5,6-디하이드록시-7-메톡시플라본 75% 59%
7,8-디하이드록시플라본 74% 63%
위고닌 16% 12%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 분리된 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물, 바이칼린 및 바이칼레인의 용량 반응 및 IC50 값을 각각 도 1, 2 및 3에 제공하였다. 아카시아 카테츄의 적목질(heartwood)로부터 분리된 두개의 표준화된 플라반 추출물(각각 50% 및 90% 이상)의 용량 반응 및 IC50 값을 각각 도 4 및 5에 제공하였다. 다양한 조성물의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 세가지 제형의 용량 반응 및 IC50 값을 각각 도 6(80:20 혼합), 도 7(50:50 혼합) 및 도 8(20:80 혼합)에 제공하였다.
실시예 4 : 아카시아 카테츄로부터 분리된 카테킨에 의한 5- 리폭시게나아제의 저해
염증 반응에 포함되는 가장 중요한 경로 중의 하나는 하이드로페록사이드 5-, 12- 및 15-HPETE를 생산하기 위한 AA와 같은 지방산에 산소 분자의 첨가를 촉진시키는 비햄(non-heme), 철-함유 리폭시게나아제(5-LO, 12-LO 및 15-LO)에 의해 만들어지며, 그 후 류코트리엔으로 전환된다. 아카시아 카테츄로부터의 플라반 추출물이 어느 정도의 LOX 저해를 제공할 수 있음을 초반에 나타내고 있기 때문에, 5-HPETE의 형성을 예방한다. 90% 이상의 플라반을 포함하는 아카시아 카테츄로부터 분리된 추출물이 직접적으로 시험관 내에서 LOX를 저해하는지를 측정하기 위하여 리폭시게나아제 저해제 선별 검정 키트(Cayman Chemical, Inc., Cat# 760700)을 사용하였다. 키트에서 포스페이트를 정밀 여과를 수행하여 트리스-기초 완충액으로 완충액 교체를 한 후, 통상적으로 사용하는 콩 유래의 15-LO를 감자 LOX로 교체하였다. 이 검정은 산소 감지 크로마겐을 통하여 하이드로페록사이드의 형성을 검출한다. 간단히 말하면, 0 내지 50μg/mL 범위의 최종 농도에 0.17단위/μL 감자 5-LO 90μL, 1.1mM AA 20μL, 산소 감지 크로마겐 100μL, 정제된 플라반 저해제 10μL를 첨가하여 검정을 3번 수행하였다. 이 조성물로부터의 5-LO 저해에 대한 IC50 은 1.38μg/mL/효소 단위로 측정되었다. 이 결과를 도 9에 기재하였다.
실시예 5 : 스쿠텔라리아 오르토칼릭스 (뿌리) 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시 스( 뿌리)로부터 분리된 활성 추출물에서 프리 -비-링 플라보노이드의 HOLC 정량
실시예 1 및 2에 기재된 것과 같이 3가지 다른 식물 종으로부터 분리된 다섯개의 활성 추출물에서 프리-비-링 플라보노이드의 존재 및 정량을 HPLC에 의하여 측정하고, 그 결과를 하기의 표 5에 기재하였다. 프리-비-링 플라보노이드를 22분간 80% 내지 20%의 1% 인산 및 아세토니트릴 경사를 사용하여 루나 C-18 컬럼(Luna C-18 column; 250 x 4.5nm, 5μm) 상의 HPLC에 의해 정량적으로 분석하였다. 프리-비-링 플라보노이드를 254nm에서 UV 검출기를 사용하여 검출하고, 바이칼린, 바이칼레인 및 다른 프리-비-링 플라보노이드 표준물질과 비교한 정체시간(retention time)에 기초하여 확인하였다.
활성 추출물 추출물의 중량 바이오매스로부터 추출가능한 % 프리-비-링 플라보노이드의 총량 추출물 안의 프리-비-링 플라보노이드 %
스쿠텔라리아 오르토칼릭스 (수성 추출물) 8.95g 14.9% 0.2mg 0.6%
스쿠텔라리아 오르토칼릭스 (유성 추출물) 3.43g 5.7% 1.95mg 6.4%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (수성 추출물) 7.18g 12.0% 0.03mg 0.07%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (유성 추출물) 9.18g 15.3% 20.3mg 35.5%
실시예 6 : 아카시아 카테츄로부터 분리된 활성 추출물의 HPLC 정량
실시예 1 및 2에 나타낸 것과 같이 아카시아 카테츄로부터 분리된 유성 및 수성 추출물 안의 플라반을 포토다이오드 어레이 검출기(PhotoDiode Array detector; HPLC/PDA) 및 루나 C18 칼럼(250mm x 4.6mm)를 사용하여 HPLC에 의해 정량하였다. 플라반을 20분 이상 10% 내지 30% ACN, 5분간 60%의 ACN으로부터 아세토니트릴 경사를 이용한 칼럼으로부터 용출하였다. 플라반을 표준물질로 카테킨 및 에피카테킨을 사용한 정체시간 및 PDA 데이터를 기초로 정량하였다. 두개의 주요 플라반의 정체 시간은 각각 12.73분 및 15.76분이었다.
아카시아 카테츄의 나무껍질롭루터의 활성 추출물 추출물의 중량 바이오매스로부터 추출가능한 % 추출물 안의 플라반 %
수성 추출물 10.8g 18.0% 0.998%
유성 추출물 27.2g 45.3% 30.37%
실시예 7 : 아카시아 카테츄로부터의 표준화된 추출물의 제조
아카시아 카테츄(지상부 뿌리 500mg)를 하기의 용매 시스템 25mL(2 x 25mL)로 두 번 추출하였다. (1) 100% 물, (2) 80:20 물:메탄올, (3) 60:40 물:메탄올, (4) 40:60 물:메탄올, (5) 20:80 물:메탄올, (6) 100% 메탄올, (7) 80:20 메탄올:THF, (8) 60:40 메탄올:THF. 각각의 추출물로부터의 두가지 추출물을 저진공 하에서 농축하고 건조시켰다. 각 추출물 안의 화학 화합물의 확인은 포토다이오드 어레이 검출기(HPLC/PDA) 및 250mm x 4.6mm C18 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 달성되었다. 화학 화합물을 표준물질로서 카테킨 및 에피카테킨을 사용하여 정체 시간 및 PDA 데이터를 기초로 정량하였다. 결과를 표 7에 기재하였다. 표 7에 나타낸 것과 같이, 80% 메탄올/물을 사용한 용매 추출로부터 얻어진 플라반 추출물이 가장 높은 농도의 플라반 화합물을 제공한다.
아카시아 카테츄로부터의 표준화된 플라반 추출물을 얻기 위한 용매
추출 용매 추출물의 중량 바이오매스로부터 추출가능한 % 카테킨의 총량 추출물 안의 카테킨 %
100% 물 292.8mg 58.56% 13mg 12.02%
물:메탄올(80:20) 282.9mg 56.58% 13mg 11.19%
물:메탄올(60:40) 264.8mg 57.52% 15mg 13.54%
물:메탄올(40:60) 264.8mg 52.96% 19mg 13.70%
물:메탄올(20:80) 222.8mg 44.56% 15mg 14.83%
100% 메탄올 215.0mg 43.00% 15mg 12.73%
메탄올:THF(80:20) 264.4mg 52.88% 11mg 8.81%
메탄올:THF(60:40) 259.9mg 51.98% 15mg 9.05%
표준화된 추출물을 알콜/물 용매를 사용하여 바이오매스를 추출함으로써 운카리아 감비르의 전체 식물로부터 얻었다. 운카리아 감비르로부터 얻은 표준화된 추출물에서 플라반 용량을 동일한 방법을 사용하여 정량하였다. 그 결과를 표 8에 기재하였다. 플라반을 표준물질로서 카테킨을 사용하여 정체시간 및 PDA에 기초하여 정량하였다.
더 높은 순도의 물질을 재결정화 용매로서 알콜/물 및/또는 수성 용매를 사용하여 8% 내지 15% 사이의 카테킨 용량을 가지는 추출물의 재결정화에 의하여 얻을 수 있다. 가열된 추출물의 포화 용액을 활성탄 또는 다른 탈색제를 첨가함으로써 재결정화 전에 탈색할 필요가 있다. 그 후 가열된 포화 용액을 냉각하여 높은 순도의 카테킨을 재결정화하였다. 그 후 용매를 제거하기 위하여 결정을 여과하고, 건조시키고 미세한 파우더로 연마하였다. 재결정화는 바람직한 레벨의 순도를 달성하기 위하여 필요에 따라 반복할 수 있다(60% 내지 100%의 카테킨 플리반).
실시예 8 : 여러가지 스쿠텔라리아 종으로부터 얻어진 표준화된 프리 -비-링 플라보노이드의 제조
스쿠텔라리아 오르토칼릭스(500mg의 지상부)를 25mL의 하기 용매 시스템으로 두 번 추출하였다. (1) 100% 물, (2) 80:20 물:메탄올, (3) 60:40 물:메탄올, (4) 40:60 물:메탄올, (5) 20:80 물:메탄올, (6) 100% 메탄올, (7) 80:20 메탄올:THF, (8) 60:40 메탄올:THF. 추출물을 저진공하에서 화합하고, 농축하고 건조시켰다. 각각의 추출물에서 화학적 성분의 확인은 포토다이오드 어레이 검출기(HPLC/PDA) 및 250mm x 4.6mm C18 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 수행되었다. 화학적 성분을 정체 시간 및 PDA 데이터를 기초로 하여 정량하였다. 그 결과를 표 9에 기재하였다.
추출용매 추출물의 중량 바이오매스로부터 추출가능한 % 플라보노이드의 총량 추출물에서 플라보노이드의 %
100% 물 96mg 19.2% 0.02mg 0.20%
물:메탄올(80:20) 138.3mg 27.7% 0.38mg 0.38%
물:메탄올(60:40) 169.5mg 33.9% 0.78mg 8.39%
물:메탄올(40:60) 142.2mg 28.4% 1.14mg 11.26%
물:메탄올(20:80) 104.5mg 20.9% 0.94mg 7.99%
100% 메탄올 57.5mg 11.5% 0.99mg 10.42%
메탄올:THF(80:20) 59.6mg 11.9% 0.89mg 8.76%
메탄올:THF(60:40) 58.8mg 11.8% 1.10mg 10.71%
스쿠텔라리아 바이칼렌시스(1000mg의 지상부)를 하기와 같이 50mL의 메탄올 및 물의 혼합물을 사용하여 2번 추출하였다 : (1) 100% 물, (2) 70:30 물:메탄올, (3) 50:50 물:메탄올, (4) 30:70 물:메탄올, (5) 100% 메탄올. 추출물을 저진공하에서 화합하고, 농축하고 건조시켰다. 화학적 성분의 확인은 포토다이오드 어레이 검출기(HPLC/PDA) 및 250mm x 4.6mm C18 칼럼을 사용하는 HPLC에 의해 수행되었다. 화학적 성분을 정체 시간 및 PDA 데이터를 기초로 하여 정량하였다. 그 결과를 표 10에 기재하였다.
스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 추출된 프리-비-링 플라보노이드의 정량
추출용매 추출물의 중량 바이오매스로부터 추출가능한 % 플라보노이드의 총량 추출물에서 플라보노이드의 %
100% 물 277.5mg 27.8% 1mg 0.09%
물:메탄올(70:30) 338.6mg 33.9% 1.19mg 11.48%
물:메탄올(50:50) 304.3mg 30.4% 1.99mg 18.93%
물:메탄올(30:70) 293.9mg 29.4% 2.29mg 19.61%
100% 메탄올 204.2mg 20.4% 2.73mg 24.51%
더 높은 순도의 프리-비-링 플라보노이드를 재결정화 용매로서 알콜/물을 사용하여 8% 내지 15% 사이의 프리-비-링 플라보노이드 용량을 가지는 추출물의 재결정화에 의하여 얻을 수 있다. 가열된 추출물의 포화 용액을 활성탄 또는 다른 탈색제를 첨가함으로써 재결정화 전에 탈색할 필요가 있다. 그 후 프리-비-링 플라보노이드를 냉각하여 재결정화하였다. 결정을 여과하고, 건조시키고 미세한 파우더로 연마하였다. 재결정화는 바람직한 레벨의 순도를 달성하기 위하여 필요에 따라 반복할 수 있다(60% 내지 100%의 프리-비-링 플라보노이드).
실시예 9 : 스쿠렐라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 얻은 표준화된 프리 -비-링 플라보노이드와 아카시아 카테츄로부터 얻은 표준화된 플라반 추출물을 사용한 제형의 제조
본원에서 UP676이라 칭하는 물질의 신규한 조성물을 아카시아 및 스쿠텔라리아 각각으로부터 분리된 두개의 표준화된 추출물 및 하나 또는 그 이상의 첨가제를
함께 사용하여 제조하였다. 이러한 조성물을 제조하기 위한 일반적인 예시를 하기에 기재하였다. 이 실시예에서 사용된 아카시아 추출물은 카테킨 및 에피카테킨과 같은 총 플라반의 80% 이상을 포함하고 있으며, 스쿠텔라리아 추출물은 주로 바이칼린인 프리-비-링 플라보노이드의 80% 이상을 포함하고 있다. 스쿠텔라리아 추출물은 또한 표 11에 기재한 것과 같은 미량의 프리-비-링 플라보노이드를 포함하고 있다. 하나 또는 그 이상의 첨가제/방부제 또한 물질의 조성물에 첨가된다. 플라반 및 프리-비-링 플라보노이드의 비는 COX 대 LO의 저해, 피부 침투의 필요성 및 필수적인 효능의 지속 시간과 같은 물질의 효능 필요 요건 등에 대한 지표 및 특정 요건에 기초하여 조정될 수 있다. 첨가제의 양은 각각의 성분의 실질 활성 함량에 기초하여 조정될 수 있다. 제품 각각의 배치(batch)에 대한 블렌딩 테이블은 성분 각각의 배치에 대한 물질 특이성 및 QC 결과에 기초하여 생성될 수 있다. 2 내지 5% 범위의 활성 물질의 추가량이 물질 특이성에 알맞게 추천된다.
85:15 중량%의 활성 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 블렌딩 비를 가지는 UP676 제형(50.4kg)을 얻기 위하여 82.2%(바이칼린)의 프리-비-링 플라보노이드 함량을 가지는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물(38.5kg)(lot#RM052302-01); 80.4%의 총 플라반 함량을 가지는 아카시아 카테츄 나무껍질 추출물(6.9kg)(lot#RM052902-01); 및 첨가제(5.0kg의 칸덱스)를 화합하였다. 표 11은 실시예 6 및 8에서 제공하는 방법을 사용하여 측정된 UP676(Lot#G1702-COX-2)의 이 특정 배치의 활성 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 정량을 제공한다. 표 11을 참고하면, UP676의 특정 배치는 75.7%의 프리-비-링 플라보노이드 및 10.3%의 플라반을 포함하는 총 활성 성분의 86%를 포함한다. 도 10은 80:20 중량 블렌딩 비의 활성 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반을 가지는 대표적인 UP676 샘플의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
UP676 제형의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 함량
활성 성분 % 함량
1. 플라보노이드
a. 바이칼린 62.5%
b. 소량의 플라보노이드
ⅰ. 위고닌-7-글루쿠로나이드 6.7%
ⅱ. 옥실린 A 7-글루쿠로나이드 2.0%
ⅲ. 바이칼레인 1.5%
ⅳ. 위고닌 1.1%
ⅴ. 크리신-7-글루쿠로나이드 0.8%
ⅵ. 5-메틸-위고닌-7-글루쿠로나이드 0.5%
ⅶ. 스쿠텔라린 0.3%
ⅷ. 노르위고닌 0.3%
ⅸ. 크리신 <0.2%
ⅹ. 옥실린 A <0.2%
c. 총 프리-비-링 플라보노이드 75.7%
2. 플라반
a. 카테킨 9.95
b. 에피카테킨 0.4%
c. 플라반 소계 10.3%
3. 총 활성 성분 86%
동일한 방법을 사용하여, UP676의 하기 배치를 각각 12:88 및 15:85의 블렌딩 비를 가지는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리로부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 얻은 표준화된 플라반 추출물의 조합을 사용하여 제조하였다.
12:88 중량의 블렌딩 비를 가지는 UP676 조성물(500g, lot#QJ205-19)을 얻기 위하여 87.9%의 프리-비-링 플라보노이드 함량(바이칼린으로서)을 가지는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물(58.0g)(lot#RM21203-01) 및 84.9%의 총 플라반 함량을 가지는 아카시아 카테츄 나무껍질 추출물(442.0g)(lot#RM05603-01)을 혼합하였다. 실시예 6 및 8에서 제공하는 방법을 이용하는 UP676(lot#QJ205-19)의 이 특정 배치에서 프리-비-링 플라보노이드의 함량(바이칼린)은 9.65%이고, 플라반 함량(총 카테킨 및 에피카테킨)은 73.2%였다.
15:85 중량의 블렌딩 비를 가지는 UP676 조성물(2000g, lot#A1904)를얻기 ㅇ위하여 82.9%의 프리-비-링 플라보노이드 함량(바이칼린으로서)을 가지는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물(300g)(lot#RM060403-01) 및 90.8%의 총 플라반 함량을 가지는 아카시아 카테츄의 나무껍질 추출물(1700g)(lot#RM050603-01)을 혼합하였다. 실시예 6 및 8에서 제공하는 방법을 이용하는 UP676(lot#A1904)의 이 특정 배치에서 프리-비-링 플라보노이드 함량(바이칼린)은 15.6%이고, 플라반 함량(총 카테킨 및 에피카테킨)은 75.0%였다.
실시예 10 : UP676 의 제형으로부터 용량 반응 및 5- LO 효소 저해의 IC 50 값의 측정
UP676 제형(80:20)을 80;20의 블린딩 비를 가지는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 얻은 표준화된 플라반 추출물의 조합을 사용하여 실시예 9에 기재된 것과 같이 제조하였다. 샘플을 THP-1 또는 HT-29 세포; COX-1, COX-2 및 5-LOX를 나타내는 단핵세포주를 포함하는 조직 배양액에 적정하였다. 5-LOX 경로상에서 UP676의 저해 효과를 측정함으로써 각각의 세포주에 존재하는 LTB4의 새로 합성된 농도에 대한 이 UP676 제형의 효과를 측정하기 위하여 류코트리엔 B4(LTB4; Neogen, Inc., Cat#406110) 용 경쟁적 ELISA를 사용하였다. 상기 검정을 6-웰 플레이트의 웰 당 160,000 내지 180,000의 세포를 첨가하여 두번 수행하였다. UP676 제형을 3, 10 및 100μg/mL의 THP-1 배양에 첨가하고, 습한 환경에서 5% CO2 하의 37℃에서 밤새(~12 내지 15 시간) 배양하였다. 결과를 도 11에 기재하였으며, 이는 새로운 LPS-유도성 LTB4의 생성이 3 및 10μg/mL 사이의 THP-1 배양에 대한 UP676의 첨가에 의하여 거의 완벽하게 저해되었음을 나타낸다.
UP676과 다른 공지의 5-LOX 저해제인 이부프로펜을 3μg/mL의 HT-29 세포에 첨가하고, 습한 환경에서 5% CO2 하의 37℃에서 48시간 배양하였다. 각각 처리된 세포주를 그 후 원심 분리에 의하여 얻고, 생리학적 완충액에서 적당한 다운스 균질화 용해(dounce homogenization lysis)에 의하여 파괴시켰다. 도 12에 나타난 것과 같이, UP676은 HT-29 세포에서 새로이 합성된 LTB4 생성의 80%를 저해하였다. 이부프로펜은 단지 동일한 시간 동안 LTB4 양에 대한 20%의 감소만을 나타내었다.
실시예 11 : mRNA 레벨에서의 염증과 관련된 전염증성 사이토카인 및 다른 단백질의 UP676 하향 조절된 유전자 발현
말초혈액 단핵세포(PBMC)는 질병과 관련된 염증을 위한 확립된 세포 모델이다. 3명의 건강한 인간 피험자로부터의 PMBC를 다양한 농도의 UP676(0, 10, 30 및 100μg/mL)의 존재하 및 부재하에서 10ng/mL의 리포 다당류(LPS)로 자극하였다. 상기 세포를 RNA 정제를 위하여 수득(harvesting)하기 전에 18시간 동안 5% CO2 하의 37℃에서 배양하였다. RNA를 Qiagen RNeasy Kit로 제조하고, cDNA를 ABI cDNA Archive kit를 사용하여 합성하였다. 실시간 정량적-PCR(real time quantitative-PCR) 검정을 ABI 프리즘 서열 검출기(ABI Prism Sequence Detector)를 사용하여 수행하였다. 18S rRNA 유전자 또는 사이클로필린 A 유전자를 표준화를 위한 내부 대조군으로서 사용하였다. 3개의 실험으로부터 얻은 데이터의 개요를 표 12에 기재하였다. 평균적으로, IL-1β, TNFα 및 IL-6의 유전자 발현 억제는 각각 45배, 3배 및 27배였다. 게다가, PBMCs에서 LPS를 사용한 18시간의 전자극에서 UP676에 의한 ppar γ의 10배 이상의 억제 및 nfκb mRNA의 2배 억제가 측정되었다.
PBMCs에서의 UP676 유전자 저해(숫자는 100μg/mL 및 0μg/mL의 UP676으로 처리된 샘플간 mRNA 레벨의 폴드 체인지(fold change)를 나타낸다)
유전자 실험재료 #1 실험재료 #2 실험재료 #3 평균
cox1 3 -3 -5 -0.8
cox2 -71 -84 -35 -63
il-1β -108 -11 -16 -45
tnfα -6 -1.5 -2.5 -3.3
il-6 nd -40 -34 -27
pparγ nd -7 -13 -10
nfκb -2.7 -2.2 -1.6 -2.2
실시예 12 : 생체 내 마우스 귀 부종 모델을 사용한 UP676 의 효능 평가
UP676 제형을 실시예 9에 기재된 것과 같이 80:20의 블렌딩 비를 가지는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리로부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 얻은 표준화된 플라반 추출물의 조합을 사용하여 제조하였다. 이 조성물이 생체 내에서 염증을 치료하기 위하여 사용할 수 있는지 없는지를 테스트하기 위하여, 상기 조성물을 아라키돈산(AA)으로 귀를 처리하기 하루 전에 4 내지 5주의 노령 ICR 마우스(Harlan Labs)에 경구 영양법으로 투여하였다. 테스트 마우스는 동일한 투약량의 올리브 오일과 현탁시킨 50, 100 및 200mg/kg의 UP676을 공급한 반면, 대조군에는 단지 올리브 오일만을 공급하였다. 다음날, 95% 알콜에 용해시킨 20μL의 330mM 아라키돈산을 각각의 마우스 한쪽 귀에 적용하고, 대조군으로서 다른 쪽 귀에는 알콜을 적용하였다. UP676으로 처리된 마우스들은 도 13에 나타낸 것과 같이 UP676의 증가된 투약량으로 추적된 측정가능한 용량 반응을 나타내었다. 도 13을 참고하면, 200mg/kg의 투약은 "비처리된" 대조군에 비해 50% 이상으로 부종을 감소시킨다. 50mg/kg의 UP676 투약은 50mg/kg의 다른 강력한 항염증성 인도메타신 투약과 같은 효능을 가진다.
실시예 13 : 자외선 조사에 대한 피부 노출로부터 야기된 손상의 예방 및 치료에서 UP676 의 효능 평가
자외선 조사에 대한 피부 노출로부터 야기된 손상의 예방 및 치료에서 UP676 제형의 효능을 테스트하기 위하여 무모 암컷 생쥐 여섯개 그룹(그룹당 다섯마리)(Strain SKH-1, Harlan Labs)을 0.626mW/cm2으로 3일 연속 3분간, 마취시킨 상태에서 조사(irradiated)하였다. UP676 제형을 실시예 9에 기재된 것과 같이 80:20의 블렌딩 비를 가지는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리로부터 얻은 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물과 아카시아 카테츄의 나무껍질로부터 얻은 플라반 추출물의 조합을 사용하여 제조하였다. 상기 여섯개의 처리 그룹은 하기와 같다:
그룹 #
1. 대조군 : 자외선 조사 전 또는 후 처리하지 않음
2. 양성 대조군 : 자외선 조사 후 수트-어-케인(바나나 보트; Banana Boat)의 국소적 적용으로 처리됨.
3. UP676 처리 B-1 : 자외선 조사 전 물에 용해시킨 1mg/mL UP676의 국소적 적용으로 처리됨.
4. UP676 처리 A-1 : 자외선 조사 후 물에 용해시킨 1mg/mL UP676의 국소적 적용으로 처리됨.
5. UP676 처리 B-2 : 자외선 조사 전 물에 용해시킨 5mg/mL UP676의 국소적 적용으로 처리됨.
6. UP676 처리 A-2 : 자외선 조사 후 물에 용해시킨 5mg/mL UP676의 국소적 적용으로 처리됨.
자외선 노출과 치료 3일 후, 하기의 스케일을 사용하여 홍반(발적)의 수준을 측정한다: 0 - 홍반이 보이지 않음; 1 - 매우 가벼운 홍반; 2 - 뚜렷한 홍반; 3 - 심각한 홍반; 및 4 - 종양 형성. 각각의 그룹에 대하여 눈을 통해 홍반을 수치 측정하였다. 결과를 도 14에 기재하였다. 도 14를 참고하면, 대조군(그룹 1)이 3일째(자외선에 3일간 노출된 후 72시간)에 심각한 발적을 보임을 알 수 있다. 수트-어-케인 그룹(그룹 2) 또한 3일째에 최대 발적을 보였다. UP676 처리 그룹(그룹 3-6)에 대한 발적은 2 수치를 절대 넘지 않았다. 피실험자를 통한 이러한 수치는 UP676이 피부 홍반을 야기하는 자외선을 예방하고 치료하는데 효과적임을 나타낸다.
4일째 대표 마우스의 사진은 대조군, 수트-어-케인TM 처리 그룹 및 UP676 처리 그룹(데이터 미도시)간의 차이점을 명확하게 나타낸다. 대조군 및 수트-어-케인TM 처리 동물은 자외선 노출 전 및 후에 UP676 제형으로 처리된 동물에 비해 홍반의 매우 광범위한 패턴 및 발적을 나타내었다. 자외선 조사 전에 5mg/mL UP676으로 처리된 동물들은 다른 모든 동물등레 비해 최소한의 홍반을 나타냈다.
실시예 14 : UP676 조성물을 크림으로 제조
UP676(UP676의 0.5 중량%)(실시예 9에 기재된 것과 같은 lot#A1904)을 하기의 방법 및 표 13에 나타낸 것과 같이 크림으로 제조하였다.
UP676(Lot#A1904)을 상온에서 물에 용해시키고, 용액에 충분히 현탁될 때까지(대략 5분) 블렌더로 균질화시켰다. 상온에서 용액을 교반 또는 휘젓지 않고, 울트레즈-21(Ultrez-21)을 용액의 표면에 한방울씩 첨가하여 충분히 적셔지도록(하얀 면적이 보이지 않도록) 용액 안으로 떨어뜨린다. 약하게 교반한 후, 용액을 40℃로 가열하고 글리세린을 첨가하였다(Part A). 그 후 상기 혼합물을 추가로 5분 더 교반하였다. 잔류 성분(Part B)을 측량하고, 혼합하는 동안 40℃로 가열하였다. 40℃에서, 잔류 성분(Part B)를 Part A에 첨가하고, 결과 조성물을 균질해질때까지(대략 5분) 잘 섞어주었다. 에멀젼을 30℃에서 냉각시키고, 교반 막대 및/또는 주걱(spatula)를 사용하여 교반하는 동안 중화제를 사용하여 적정함으로써 pH를 대략 5.5(5.3 내지 5.7)로 조절하였다. 에멀젼은 카보머(carbomer)의 중화-유도성 형태 변화 때문에 높은 점도을 가진다. 상기 에멀젼은 마침내 에멀젼 크림용으로 바람직함 점도를 갖는다. 그 후 상기 에멀젼 크림을 깨끗한 저장 용기 안으로 넣은 후 균일할때까지 혼합하고 한달간 2℃ 내지 8℃에서 보관한다.
0.5% UP676 크림용 성분 리스트
상 성분 %(w/w) 중량(g)
수상 순수한 물 85.00 1275.0
UP676(Lot#A1904) 0.50 7.5
울트레즈 21 카보머 0.50 7.5
글리세린 8.00 120.0
오일 PEG-7 글리세릴 코코 에이트 3.00 45.0
카프릴릭/카프릭 트 리글리세라이드 2.67 40.0
pH 중화제 소디움 하이드록사이 드(18% w/v), 분자생 물학적 등급 0.00 0.0
합계 7 성분 99.7 1495.0
실시예 15 : 용액 안에서의 카테킨 안정성 평가
순수한 카테킨을 하기에 상세히 설명하는 용액으로 혼합한 후 0.05%(W/V)의 최종 농도를 위해 물에 용해시킨 70% MeOH에 용해시켰다. 45℃에서 안정성 실험을 위하여 대조 용액을 포함하지 않은 총 6가지의 서로 다른 조건을 선별하였다. 각각 pH 5 또는 8의 완충 용액을 만들기 위하여 수성 K2HPO4(0.5M) 또는 KH2PO4(0.5M)를 사용하였다. 각각 0.6% H2O2 또는 0.05% SnCl2 또는 0.05% FeCl3 또는 0.05% EDTA 농도로 카테킨 용액에 H2O2, SnCl2, FeCl3 또는 EDTA를 첨가하였다. 7가지 용액 모두를 45℃에서 밀봉된 병에 넣어 보관하였다. 각각의 샘플들을 0, 1, 3, 6, 8, 10, 13, 20 및 28일째에 실시예 6에 기재된 것과 같이 HPLC로 카테킨 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 15에 기재하였다.
0.05%의 농도를 얻기 위하여 하기의 방부제 : BHA, BHT, 디암모니움 시트레이트(DAC), H2O2, 프로필 갈레이트(PG), 소디움 글루코네이트(SG) 및 소디움 바이설페이트/메타바이설파이트(SBS)를 완충된(pH 7.5) 0.05%의 카테킨 MeOH/H2O 용액에 첨가하였다. 여덟개의 용액 모두를 45℃에서 밀봉된 병에 넣어 보관하였다. 각각의 샘플들을 0, 1, 3, 6, 8, 10, 13, 20 및 28일째에 실시예 6에 기재된 것과 같이 HPLC로 측정하였다. 그 결과를 도 16에 기재하였다.
실시예 16 : 경구 투여 후 UP676 에서 바이칼린의 생물학적 효능 평가
이 임상 연구는 열명의 건강한 피험자가 참여하는 단일 기관, 공개 임상(open-label) 연구이다. 피험자들은 밤새 금식하고, 다음날 아침 8:00시에 임상 실험 센터에 오라고 보고하였다. 각각의 피험자들은 실시예 9에 기재된 것과 같이 제조된 300mg의 UP676을 복용하는 즉시 다음의 기초 정맥천자(baseline venipuncture)를 하였다. 추후 혈장 샘플을 1/2, 1, 2, 4 및 8시간에 채취하였다. 추가적인 샘플을 2일 째 및 7일 째의 24시간에 채취하였다. 각각의 혈장 표본을 헤파린이 담겨있는 튜브에 넣어 혈액 채취를 수행하였다. 그 후 혈액을 10분간 2,500rpm에서 원심분리하였다. 프리-비-링 플라보노이드의 농도를 측정하기 전에 다음의 최종 수집을 분석하기 위하여 각각의 튜브로부터 상층액을 분리하여 트랜스퍼 튜브에 넣어 -70℃에 보관하였다. (ⅰ) 프리-비-링 플라보노이드의 흡수 및 청소율(clearance)에 대한 곡선 아래의 면적(area under the curve; AUC); (ⅱ) 프리-비-링 플라보노이드의 최대 혈장 농도(Cmax); (ⅲ) 프리-비-링 플라보노이드의 최대 혈장 농도 시간; (ⅳ) 프리-비-링 플라보노이드의 혈장 배출 반감기(T1 /2); 및 (ⅴ) 24시간 뇨 청소율(urinary clearance) AU24Hr을 측정하기 위하여 이 분석에 착수하였다.
HPLC에 의한 몇몇의 혈장 테스트 엘리컷의 전 실험은 프리-비-링 플라보노이드가 글루쿠로니데이션(glucuronidation) 및 설페이션(sulfation)을 통한 결합 때문에 검출한계가 4μg/mL 이하임을 나타내었다. 따라서, 모든 결합된 프리-비-링 플라보노이드를 아글리콘 분자 바이칼레인으로 전화시키기 위하여 혈장을 2,000u/mL에서 β-글루쿠로니다아제 및 170u/mL에서 설파타아제로 분해시켰다. 그 후 총 바이칼레인 대사 산물을 표준 물질로서 순수한 바이칼레인을 사용하여 HPLC를 수행하였다. 37℃에서 7시간 분해시키고, 계속해서 HPLC 분석을 하는 동안 플라보노이드의 산화를 방지하기 위하여 아스코르브산을 첨가하였다.
혈장의 β-글루쿠로니다아제 및 설파타아제 분해 후 에틸 아세테이트를 사용하여 플라보노이드를 추출하고, 그 후 즉시 건조를 위하여 질소류(nitrogen stream)를 사용하여 증발시키고, HPLC 분석 전에 약하게 가열(35℃) 하였다. 샘플을 재구성하기 위하여 1mg/mL 아스코르브산 완충액을 포함하는 80:20 메탄올:테트라하이드로퓨란 용액을 사용하였다. 바이칼레인의 정량은 질량 검정(mass calibration) 및 정체 시간 확인을 위하여 순수한 바이칼레인 표준 물질을 사용하여 1mL/분의 유량에서 0.1% 인산(v/v)(완충액 A) 및 아세토니트릴(완충액 B)를 사용하여 역상 크로마토그래피에 의하여 달성되었다. 추출된 물질의 검출을 275nm에서 직렬 UV 검출기(inline UV detector measuring)를 사용하여 관찰하였다.
결과를 도 17에 기재하였다. 도 17을 참고하면, 데이터는 바이칼레인의 혈장 청소율을 계산하기 위하여 사용된 포인트를 굵게 나타내었다. 모든 피험자에 대하여 대수적으로 변형되고 도시되었을 때, 이 데이터들은 시간에 대하여 일차함수를 나타내었다(데이터 미도시). 여기에는 피험자와 피험자간에 나타나는 개인차가 있다. 표 14는 각각의 피험자에게서 관찰된 바이칼레인 농도(Cmax, μg/mL) 및 시간(Tmax, 시간)의 최대값을 나타낸다. 데이터는 대부분의 피험자에 대하여, 최대 농도가 초기 투약 후 4시간 및 8시간 사이에 달성됨을 나타낸다. 평균 Cmax는 0.93μg/mL(%RSD=84.9)이고, 평균 Tmax는 대략 5.8시간(%RSD=43.4)이었다. 이 데이터에 기초하여, 흡수 및 청소율의 평균을 전체 연구 그룹에 대하여 계산하고 도면에 기입하였다(도 17).
각각의 피험자로부터 관찰된 바이칼레인 농도(Cmax, μg/mL) 및 시간(Tmax, 시간)의 최대값
A B C D E F G H I J
Cmax (μg/mL) 1.1 0.80 0.38 0.58 0.44 2.8 0.88 0.47 0.14 0.26
Tmax (시간) 2.0 8.0 4.0 8.0 8.0 4.0 8.0 4.0 8.0 8.0
실시예 17 : 인간 피부에의 반복 적용에 의한 자극 및 접촉 감작의 유도에 대한 UP676 크림의 평가
UP676을 드레이지 패치 테스트(Draize Patch Test)에 대한 적응을 이용하여 인간 피부에 테스트하였다(Marzulli and Maibach (1997) Contact Allergy : Predictive Testing in Humans. In Advances in Mordern Toxiocology, Dermatotoxicology and Pharmacology. Eds. Marzulli, F.N and Maibach, H.I. 4, 353-372). 테스트 부위는 상완(upper arm) 또는 등의 부척주 부위(paraspinal region)에 위치하였다. 각각의 테스트 물품은 도입 부위(induction site) 및 테스트 부위(challenge site)를 가진다. 도입부는 두개의 하위 부위(sub-site)인 최초 부위(original-site) 및 이동 부위(move-site)를 포함한다. 실시예 14에 기재된 것과 같이 제조된 0.2mg/mL의 UP676 크림/패치를 포함하는 패치는 이동 부위에 적용할 것을 요구하는 충분히 강력한 자극 반응이 개발되지 않는 한 도입 부위에 반복적으로 적용하였다. 패치는 임상 의학 연구소에 의해서 적용하였고, 대략 24 시간 또는 48/72 시간 후에 피험자가 제거하여 폐기하였다. 도입 단계(induction phase)에서, 피부 상의 동일한 부위에 대하여 테스트 물품을 반복적으로 적용하고 총 9개의 도입 패치를 4주의 기간 안에 적용하였다. 휴지 기간은 마지막 도입 패치의 적용 및 테스트 패치의 적용 사이의 10 내지 20일로 하였다. 이 기간 동안에는 테스트 부위에 테스트 물품 또는 다른 어떤 물질도 적용하지 않았다. 테스트 단계(challenge phase)에서, 테스트 물품을 신체 반대측의 테스트 하지 않은 부위(naive site)에 적용하고 대략 24시간 또는 48시간 후에 피험자가 폐기하였다.
각각의 패치 적용에 대한 피부 반응을 100-와트 백열 블루 전구에 의한 빛 아래에서 지정된 측정용 점수(scoring scale)에 따라 측정하고 평가하였다. 이동 부위에 대하여 테스트 물품의 적용이 보증된 강력한 자극 반응의 경우, 잔여 점수는 이전에 노출된 모든 부위에 대한 도입의 마지막(또는 만일 도입이 완료된 후에도 반응이 지속된다면 반응이 완료될 때까지)에 기록된다. 모든 피부 반응을 기록하였다. 테스트 단계 동안, 피부 반응은 패치 적용 후 약 48 시간 및 72 또는 96시간에 평가하였다. 유도성 감작에 대한 결론은 테스트 평가로부터 우선적으로 얻어졌다.
0.5% 및 1.5% UP676 농도로 실시예 14에서 제조된 두개의 UP676 크림을 상기 방법에 따라 평가하였다. 총 120 명의 피험자를 각 그룹에 모집하였다. 97명의 피험자가 0.5% UP676 그룹에 대한 연구를 완료하였고, 101명의 피험자가 1.5% UP676 그룹에 대한 연구를 완료하였다. 0.5% UP676에 대한 도입 동안, 15명의 피험자가 때때로 가벼운 홍반(+ 및/또는 1의 수치)의 발생을 나타내었다. 테스트에서, 4명의 피험자는 48시간에 가벼운 홍반을 나타내고 96시간에는 사라졌다. 1.5% UP676에 대한 도입 동안, 26명의 피험자가 때때로 가벼운 홍반(+ 및/또는 1의 수치)의 발생을 나타내었다. 테스트에서, 한명의 피험자가 48시간에 가벼운 홍반을 나타내고 96시간에는 사라졌다.
이 연구는 UP676이 자극 및 감작을 야기하지 않는 효과적인 농도로 인간의 피부에 국소적으로 적용될 수 있는 안전한 성분임을 나타낸다.

Claims (40)

  1. 적어도 하나의 프리-비-링 플라보노이드 및 적어도 하나의 플라반의 혼합물 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함하는 구강, 잇몸 및 치아의 질병 및 질환을 예방하고 치료하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 비가 99:1의 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 1:99의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비가 약 80:20인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 하기 구조를 가지는 화합물의 군으로부터 선택되며;
    Figure 112007036764298-PCT00009
    여기에서,
    R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합하고, 여기에서 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체를 포함하고;
    여기에서,
    R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬이;
    X는 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카보네이트를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 플라반이 하기의 구조를 가지는 화합물의 군으로부터 선택되며;
    Figure 112007036764298-PCT00010
    여기에서,
    R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 이에 제한되지는 않지만, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 그들의 화학적 유도체를 포함하는 앞서 언급한 치환기의 에스테르 ; 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합되며, 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체 및 다른 중합된 플라반을 포함하고,
    여기에서,
    R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬이;
    X는 이에 제한되지는 않지만, 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카보네이를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 유기 합성에 의하여 얻어지거나 식물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 줄기(stems), 줄기 껍질(stem barks), 나무몸통(trunks), 나무몸통 껍질(trunk barks), 잔가지(twigs), 덩이줄기(tubers), 뿌리(roots), 뿌리 껍질, 어린 순(young shoots), 씨(seeds), 뿌리줄기(rhizomes), 꽃 및 다른 생식기관, 잎 및 다른 지상부(aerial parts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 부분으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤프레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아 에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 나도고사리과(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물과로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 데스모스(Desmos), 아키로클리네(Achyrocline), 오록실룸(Oroxylum), 부케나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라(Cotula), 그나팔리움(Gnaphalium), 헬리크리섬(Helichrysum), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 박카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브루케아(Colebrookea), 스타치스(Stachys), 오리가눔(Origanum), 지지포라(Ziziphora), 린데라(Lindera), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아(Millettia), 퐁가미아(Pongamia), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스(Artocarpus), 피쿠스(Ficus), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나(Notholaena), 피누스(Pinus), 울무스(Ulmus) 및 알피니아(Alpinia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 속으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 플라반이 아카시아 및 운카리아(Uncaria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 속으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 및 오록실룸 인디쿰의 식물 또는 식물들로부터 분리되고, 상기 플라반이 아카시아 카테츄 및 운카리아 감비르의 식물 또는 식물들로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 체중에 대하여 0.001 내지 200mg/kg로부터 선택되는 투약량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체 안에 대략 0.001 중량% 내지 40.0 중량%의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물로 이루어진 제형으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    투여의 경로가 국소적, 에어로졸, 좌약, 내피(intradermic), 근육내 및 정맥내 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 투여의 경로가 국소적인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 조성물이 치약, 겔, 연고, 양치질 물약, 츄잉검, 팅크제 및 드링크로 이루어진 군으로부터 선택되는 매체를 사용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 전통적인 첨가제 및 선택적으로 보조제 및/또는 담체, 및/또는 일정한 또는 서방형 비히클을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 구강, 잇몸 및 치아의 질병 및 질환이 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치수염(pulpitis)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치주질병(periodontal diseases), 의치(dentures)의 물리적 이식, 외상(trauma), 상해(injuries), 이갈기(bruxism), 신생물(neoplastic) 및 다른 변색 과정; 백질(material alba), 피막(pellicles), 치태(dental plagues), 치석(calculus) 및 착색(stains)에 의해 야기되는 치주 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 적어도 하나의 프리-비-링 플라보노이드 및 적어도 하나의 플라반의 혼합물로 이루어지는 구강, 치아 및 잇몸과 관련된 건강상의 이로움을 제공하는 물질인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비가 99:1의 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 1:99의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    물질의 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비가 약 80:20인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 하기의 구조를 가지는 화합물의 군으로부터 선택되며;
    Figure 112007036764298-PCT00011
    여기에서,
    R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3 +X-, 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합하고 여기에서 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체를 포함하며;
    여기에서,
    R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; 및
    X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카보네이트를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 플라반이 하기의 구조를 가지는 화합물의 군으로부터 선택되며;
    Figure 112007036764298-PCT00012
    여기에서,
    R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 H, -OH, -SH, -OCH3, -SCH3, -OR, -SR, -NH2, -NRH, -NR2, -NR3 +X-, 이에 제한되지는 않지만, 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 하이드록실-신나모일 에스테르, 트리하이드록시벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 그들의 화학적 유도체를 포함하는 앞서 언급한 치환기의 에스테르 ; 단일 또는 복합 당의 조합물의 글리코사이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 상기 글리코사이드는 탄소, 산소, 질소 또는 황에 의해 7-하이드록시 크로몬과 결합하고, 여기에서 상기 단일 또는 복합 당의 조합물은, 이에 제한되지는 않지만, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 그들의 화학적 유도체 및 다른 중합된 플라반을 포함하며;
    여기에서,
    R은 1 내지 10 사이의 탄소 원자를 가지는 알킬기이고; 및
    X는 이에 제한되지는 않지만 하이드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포 스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카보네이트를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 카운터 음이온의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  24. 제19항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 유기 합성에 의하여 얻어지거나 식물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 줄기(stems), 줄기 껍질(stem barks), 나무몸통(trunks), 나무몸통 껍질(trunk barks), 잔가지(twigs), 덩이줄기(tubers), 뿌리(roots), 뿌리 껍질, 어린 순(young shoots), 씨(seeds), 뿌리줄기(rhizomes), 꽃 및 다른 생식기관, 잎 및 다른 지상부(aerial parts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 부분으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤프레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고 사리과(Pteridaceae), 나도고사리과(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물과로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 데스모스(Desmos), 아키로클리네(Achyrocline), 오록실룸(Oroxylum), 부케나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라(Cotula), 그나팔리움(Gnaphalium), 헬리크리섬(Helichrysum), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 박카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브루케아(Colebrookea), 스타치스(Stachys), 오리가눔(Origanum), 지지포라(Ziziphora), 린데라(Lindera), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아(Millettia), 퐁가미아(Pongamia), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스(Artocarpus), 피쿠스(Ficus), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나(Notholaena), 피누스(Pinus), 울무스(Ulmus) 및 알피니아(Alpinia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 속으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 플라반이 아카시아 및 운카리아로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 속으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 프리-비-링 플라보노이드가 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 및 오록실룸 인디쿰의 식물 또는 식물들로부터 분리되고, 상기 플라반이 아카시아 카테츄 및 운카리아 감비르의 식물 또는 식물들로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  30. 제19항에 있어서,
    약제학적으로 허용가능한 첨가제 및 선택적으로 보조제 또는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  31. 제19항에 있어서,
    상기 조성물이 국소적 적용을 위한 제형인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  32. 제19항에 있어서,
    상기 조성물이 일정한 또는 서방형 비히클로 제형화되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  33. 제19항에 있어서,
    상기 조성물이 치약, 겔, 연고, 양치질 물약, 츄잉검, 팅크제 및 드링크로 이루어진 군으로부터 선택되는 매체을 사용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  34. 제19항에 있어서,
    구강, 치아 및 잇몸과 관련된 건강상의 이점이 최적의 타액 생성 및 pH를 유지하고, 세균의 증식을 최소화하고, 피막 및 치석(plaque)의 형성을 감소시키고, 치아의 칼슘 손실(decalcification) 및 충치(tooth caries; decay)를 저해하고, 재석회질화(remineralization)을 촉진하고, 치아를 미백시키고, 건강한 구강위생(oral hygiene)을 유지하고 구취(oral malodour; halitosis)를 감소시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 방법이 적어도 하나의 프리-비-링 플라보노이드 및 적어도 하나의 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  35. 최적의 타액 생성 및 pH를 유지하고, 세균의 증식을 최소화하고, 피막 및 치석(plaque)의 형성을 감소시키고, 치아의 칼슘 손실(decalcification) 및 충치(tooth caries; decay)를 저해하고, 재석회질화(remineralization)을 촉진하고, 치아를 미백시키고, 건강한 구강위생(oral hygiene)을 유지하고 구취(oral malodour; halitosis)를 감소시키며, 상기 방법이 적어도 하나의 프리-비-링 플라보노이드 및 적어도 하나의 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물의 유효량을 그것을 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함하는 구강, 치아 및 잇몸에 대한 건강상의 이점을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 조성물이 허용가능한 담체 안에 대략 0.001 중량% 내지 40.0 중량%의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물로 이루어진 제형으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    투여의 경로가 국소적, 에어로졸, 좌약, 내피(intradermic), 근육내 및 정맥내 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 투여의 경로가 국소적인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제35항에 있어서,
    상기 조성물이 치약, 겔, 연고, 양치질 물약, 츄잉검, 팅크제 및 드링크로 이루어진 군으로부터 선택되는 매체를 사용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방 법.
  40. 제35항에 있어서,
    상기 조성물이 전통적인 첨가제 및 선택적으로 보조제 및/또는 담체, 및/또는 일정한 또는 서방형 비히클을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020077011409A 2004-10-19 2005-10-19 구강질환 및 이상의 예방 및 치료에 사용하기 위한 이중아이코사노이드 시스템의 제형 및 사이토카인 시스템저해제 KR20070073921A (ko)

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