KR20070030160A - 인지기능 감퇴 및 노화 관련 기억 장애의 예방 및 치료에사용하기 위한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의혼합물의 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경퇴행성 질병뿐만 아니라, 산화성 스트레스, 염증 및 노화과정에 의해 야기되는 기억 및 인지기능 장애를 예방하고 치료하는 신규한 방법을 제공한다. 상기 방법은 프리-비-링 플라보노이드류, 및 상기 플라보노이드가 필요한 숙주에 대한 단일 식물 또는 다중 식물로부터 합성되고/되거나 분리되는 플라반의 혼합물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 전-염증성 시토카인의 발현을 동시에 억제하고, ROS 생성을 방지하고, 항산화 방어를 향상시키는 신규한 방법을 포함한다. 이러한 조성물의 활성은 인지기능을 상당히 유지하고 일정한 수준의 신경보호를 제공하도록 유도된다.

Description

인지기능 감퇴 및 노화 관련 기억 장애의 예방 및 치료에 사용하기 위한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물의 제형 {FORMULATION OF A MIXTURE OF FREE-B-RING FLAVONOIDS AND FLAVANS FOR USE IN THE PREVENTION AND TREATMENT OF COGNITIVE DECLINE AND AGE-RELATED MEMORY IMPAIRMENTS}

본 발명은 일반적으로 활성산소종 (ROS), 염증성 단백질 및 에이코사노이드(eicosanoids)에의 노출에 의해 일어나는 신경퇴행 (neurodegradation), 신경염증 (neuroinflammation) 및 누적성 인지기능 감퇴, 장애, 질병 및 질환(condition) 의 예방 및 치료에 사용하기 위해 제형화되는 물질의 조성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 산화성 손상 (oxidative insult), 염증 및 시클로옥시게나아제 (COX) 및 리폭시게나아제 (LOX) 경로에 의해 매개되는 노화, 인지기능, 신경염증 및 퇴행성 신경 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한 두 가지 특정 부류의 화합물, 즉 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 블렌드의 혼합물로 구성된 물질의 신규한 조성물에 관한 것이다. 상기 질병 및 질환으로는, 노화 진행의 결과로 발생되는 퇴행성 신경질환, 뇌졸중, 치매 (dementia), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 인지기능 감퇴가 있으나, 이들로 제한되지는 않는다.

세포막으로부터의 아라키돈산(AA)의 유리 및 대사작용은 수가지 상이한 경로 에 의해 전구염증성 대사물의 생성을 유발시킨다. 거의 틀림없이, 염증에 대한 가장 중요한 경로 중 2가지는 효소 5-리폭시게나아제(5-LO) 및 시클로옥시게나아제(COX)에 의해 매개된다. 이들은 염증 반응의 개시 및 진행에서 중요한 역할을 하는 류코트리엔 및 프로스타글란딘을 각각 생성시키는 유사한 경로이다. 이러한 혈관에 작용하는 화합물은 화학주성인자(chemotaxin)이며, 이들은 조직 내로의 염증 세포 침윤을 촉진하며, 염증 반응을 연장시키는 역할을 한다. 결과적으로, 이들 염증 매개체 생성의 원인이 되는 효소는 류머티스성 관절염, 골관절염, 알츠하이머 병 및 특정 형태의 암과 같은 질병의 발병에 기여하는 염증의 치료를 위한 많은 새로운 약물 개발을 위한 목적이 된다.

COX 효소의 억제는 대부분의 비-스테로이드성 항염증약(NSAID)의 작용 메카니즘에 기인한다. 60% 서열 상동성을 공유하지만 발현 프로파일 및 기능이 다른 2가지 상이한 이소형의 COX 효소(COX-1 및 COX-2)가 있다. COX-1은 혈소판 응집, 위 내에서의 세포 기능의 보호 및 정상 신장 기능의 유지와 같은 정상적인 생리학적 기능을 조절하는 데에 도움을 주는 생리학적으로 중요한 프로스타글란딘의 생성에 결부된 효소의 구성 형태이다 [Dannhardt and Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem. 36:109-126]. 제 2 이소형인 COX-2는 인터류이킨-1β(IL-1β) 및 다른 성장 인자와 같은 전구염증성 시토카인에 의해 유도되는 효소의 한 형태이다 [Herschmann (1994) Cancer Metastasis Rev. 134:241-256; Xie et al. (1992) Drugs Dev. Res. 25:249-265]. 상기 이소형은 아라키돈산(AA)으로부터의 프로스타글란딘 E2(PEG2)의 생성을 촉매한다. COX-2의 억제는 통상적인 NSAID의 항염증 활 성에 기인한다.

COX-1과 관련된 COX-2 선택성이 유지되는 동안 COX-2 및 5-LO에 대한 이중 특이성을 나타내는 억제제는 아라키돈산 대사작용의 다중 경로를 억제하는 데에 명백한 이점을 갖는다. 이러한 억제제는 프로스타글란딘(PG) 및 다중 류코트리엔(LT)의 생성을 제한함으로써 이들의 염증 작용을 차단한다. 이것은 아나팔락시스(anaphalaxis)의 느린 반응 성분으로서 또한 공지된 PGE2, LTB4, LTD4 및 LTE4의 혈관 확장, 혈관 침투 및 화학유인 작용을 포함한다. 이 중에서, LTB4가 가장 강력한 화학유인 및 화학운동 작용을 가진다 [Moore (1985) in Prostanoids ; pharmacological, physiological and clinical relevance, Cambridge University Press, N.Y., pp.229-230]

상기 언급한 COX-2/5-LO 이중 억제제의 이점과 더불어, 많은 이중 억제제는 전형적인 NSAIDs에 의해 야기되는 위장내의 손상과 불편함을 포함하여 NSAIDs 또는 COX-2의 부작용중 일부를 야기하지 않는다. 위의 염증을 유발하는 NSAID는 대부분 5-LO의 대사산물, 특히 LBT4 때문인 것으로 논의되어 왔다 [Kircher et al. (1997) Prostaglandins leukot.Essent. Fatty acids 56:417-23]. 루코트리엔은 위장 점막내에서 프로스타노이드(prostanoid) 억제가 뒤따르는 초기 아라키돈산 대사산물을 나타낸다. 이 화합물은 NSAIDs의 사용으로 인한 위장 상피 피해의 중요한 원인이 되는 것을 보인다. (Celotti and Laufer (2001) Pharmacological Research 43:429-36). 또한 COX 및 5-LO의 이중 억제제는 실험 쥐 모델의 노화된(arthritic) 심장의 관상동맥 수축을 억제하는 것으로 나타난다 [Gok et al. (2000) Pharmacology 60:41-46]. 이 특징들은 COX-2 억제제나 NSAIDs를 단독으로 사용하는 경우보다 COX-2 및 5-LO의 이중 억제제가 효능은 증가되고 부작용을 감소한다는 면에서 뚜렷한 이점이 있음을 나타낸다.

COX 억제제의 작용기작이 대부분의 통상적인 NSAID's의 반응기작과 일치하기 때문에, COX 억제제는 염증이 결정적인 역할을 하는 일시적인 이상상태나 만성적인 질병에서의 염증으로 인한 통증과 부종(swelling)을 포함하여 이와 동일한 많은 증상들을 치료하는데 사용된다. 일시적 이상증상의 치료는 경미한 찰과상(minor abrasion), 일광화상(sunburn), 접촉성 피부염(contact dermatitis)과 관련된 염증치료와 긴장(tension), 편두통(migraine headaches), 월경통(menstrual cramps) 등의 통증의 완화를 포함한다. 만성질병은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis)과 같은 관절질병(arthritic diseases)을 포함한다. 비록 류마티스 관절염은 대개 자가면역성 질병이고 골관절염은 관절연골의 퇴화에 기인하지만, 각 질병들과 관련된 염증들의 완화는 그러한 질병들로 고통받는 사람들의 삶의 질을 향상시킨다 [Wienberg (2001) Immunol. Res. 22:319-41; Wollihem (2000) Curr.Opin.Rheum. 13:193-201]. 염증은 류마티스 관절염과 더불어 대부분의 류마티스성 질병을 구성한다. 따라서, COX 억제제의 사용은 전신 낭창 적백혈병(SLE) [Goebel et al. (1999) Chem.Res.Tox. 12:488-500; Patrono et al. (1985) J. Clin. Invest. 76:1011-1018]과 피부경화증(scleroderma)과 같은 류마티스성 피부 질환과 같은 질병의 치료에까지 확장되고 있다. 또한 COX 억제제는 건선과 같은 류마티스성이 아닌 염증성 피부이상의 완화에도 사용되는데, 이는 프로스타글란 딘의 과잉생산으로 인한 염증을 감소시킴으로서 직접적인 효능을 발휘하는 것이다. [Fogh et al. (1993) Acta Derm. Venerologica 73:191-3].

최근의 과학적 진보로 COX-2의 발현, 일반적인 염증 및 알츠하이머 병(Alzheimer's disease(AD))의 발병학 사이의 상호관계가 확인되었다 [Ho et al. (2001) Arch. Neurol. 58:487-92]. 동물모델에서, COX-2 효소를 과잉발현하는 유전형질전환 쥐는 훨씬 손상되기 쉬운 뉴런을 갖는다. NIA(National Institute on Aging)는 NSAIDs가 알츠하이머 병의 진행을 늦출 수 있는 지를 측정하는 임상시험에 착수하였는데, 비선택적인 NSAID인 나프록센(Naproxen)과 특정적으로 선택적인 NSAID인 로페콕시브(rofecoxib, 상품명: 바이옥스(Vioxx))가 평가될 것이다. 알츠하이머 병에 대한 염증의 관여에 대해서도 입증되었고, 알츠하이머 협회와 NIA에 따르면 미국에서 알츠하이머 병으로 약 4백만 명이 고통 받고 있으며, 반세기가 지나면 14백만 명으로 증가될 것으로 예상된다고 한다.

COX-2 억제 및 뇌에서의 아밀로이드증(amyloidosis) 의 직접적인 예방은 AD 의 발병기전에서 NSAID 보호 효과가 있는 것으로 여겨진다[Xiang et al. (2002) Gene Expression 10:271-278]. 전구염증성 프로스타글란딘 PGE2 의 COX-2 생산을 억제함으로써, 또한 주변 뉴런들이 활성화된 소신경교세포 (microglia) 에 의해 생성되는 산화적 손상 및 염증성 손상으로부터 보호된다[Combs et al. (2001) Neurochem. Intl. 39:449-457]. 이 작용은 상기 순환을 부양하고 신경퇴행을 일으키는 시토카인 및 ROS 에 의한 이후의 소신경교세포 생성을 제거한다[Kalaria et al. (1996) Neurodegeneration 5:497-503; Combs et al. (1999) J. Neurosci. 19:928-939]. NSAID 는 또한 γ-시크리타제 (γ-secretase) 활성을 억제하여 아밀로이드 전구 단백질 (APP) 가공, 아밀로이드-베타 (Aβ) 펩티드 수준의 증가 및 신경섬유원 농축 (NFT) 및 신경반 (neuritic plaque) 의 발달을 방지한다 [Weggen et al. (2001) Nature 414:212-216; Takahashi et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:18664-18670].

ROS, 시토카인 및 전구염증성 에이코사노이드에의 노출에 의해 발생되는 진행성 신경쇠약은, 모두 공통의 근원을 공유하는 수많은 질환 상태들에서 나타난다. 이 질환들은 현재 NSAID 로 치료하는데, 이들은 ROS, 시토카인 및 전구염증성 에이코사노이드에 대한 다요인적 활성에 의해 발생되는 인지기능 유지 및 신경보호 특성을 갖고 있다. 이들은 아밀로이드 침착을 억제하고, 트롬복산 및 프로스타노이드 생산을 감소시키고, 시토카인 생산을 약화시키며, 소신경교세포 활성화를 방지하고, ROS 생성을 낮추는 작용을 하며, 일부 경우에는, 높은 항산화 능력을 가진다. 이러한 활성들 모두 인지기능 감퇴를 예방하고 산화적 스트레스와 노화로 인해 발생되는 신경퇴행에 대한 누적 효과를 더디게 할 수 있다.

NSAID의 신경보호 활성은 다양한 퇴행성 질환 상태, 노화, 염증 및 산화적 스트레스에 의해 관찰되는 신체적 및 신경퇴행성 쇠약에 관한 현재 이론들의 기초를 형성한다. 전리방사선에의 노출이 이에 조사된 장기 및 이들의 항산화 상태에 있어서 병리조직학적으로 유사한 변화를 유발함으로써 상기 중 일부 이상을 모방한다는 최초의 관찰은 유발인자로서 자유 라디칼의 생성을 내포하였다 [Gerschman et al. (1954) Science 119:623-626; Harman (1956) J. Gerontol. 11:289-300; Harman (1957) J. Gerontol. 2:298-300]. 노출 이전에 항산화제의 투여는 방사선의 유해한 영향에 대하여 상기 개체를 어느 정도 보호하였다. 이들 연구로부터 도출된 결론은 전리방사선 또는 산화적 대사작용에 의해 생성된 자유 라디칼 산화적 스트레스에 장기간 노출될 경우, 항산화 방어를 통해 저지되지 않는다면 세포내 환경의 산화환원 균형이 파괴되고 세포 자체가 손상된다는 것이었다. 이러한 관찰로부터, 식이열량 제한을 통해 기초대사를 조작함으로써 자유 라디칼 수준을 낮추는 것을 포함하여 수명 증대 및 신경보호에 대한 주요 연구들이 일어났다 [Berg and Simms (1960) J. Nutr. 71: 255-261; Weindruch and Walford (1988) The retardation of aging and disease by dietary restriction. C. C. Thomas, Springfield, IL].

Berg 및 Simms 는 신체 기능의 유지가 열량 섭취 제한 및 그에 따른 산화적 대사작용을 통한 자유 라디칼의 생산 감소, 즉 본질적으로 식이열량 제한(CR)과 상관관계에 있다고 제안하였다[Berg and Simms (1960) J. Nutr. 71: 255-261]. Harman 은 항산화제의 사용을 통한 이러한 보호작용이 지질 과산화를 방지함으로써 신경계에까지 미칠 것이라고 제안하였다[Harman (1969) J. Gerontol. 23:476-482]. 다른 조사자들은 세포 및 DNA 손상이 유기체의 기초대사율 (BMR) 과 대략적으로 상관관계가 있는 것을 관찰하였고, BMR 이 높을수록 수명이 짧고 세포 및 DNA 손상이 더 크다는 것을 증명하였다[Barja (2002) Free Rad. Biol. Med. 33:1167-1172]. 그 해석은, 미토콘드리아와 세포질의 산화적 대사작용으로부터 해로운 ROS 생성이 세포 및 분자 수준 모두에서 자유 라디칼에 의해 유도된 손상의 축적을 낳고 수많은 퇴행성 및 노화 관련 장애의 부분적인 원인이 된다는 것이다. 그러나, ROS 에 의해 유발된 손상은 CR 을 통해 BMR 을 억제하거나 또는 ROS 생산에 맞서는 항산화 방어를 증대시킴으로써 감소시킬 수 있다. CR은 다수의 종들의 수명을 증가시키는 효과적인 방법인 것으로 나타났다[Weindruch and Walford (1988) The retardation of aging and disease by dietary restriction, C. C. Thomas, Springfield, IL; Weindruch (1989) Prog. Clin. Biol. Res. 287:97-103). 이 연구로 인하여, 노화와 함께 나타나는 진행성 신체 및 신경 쇠약과 관련한 유기체의 항산화 상태에 대한 고찰이 고무되었고, 이후 노화에 대한 자유 라디칼설이 발전하였다[Harman (1994) Ann. NY Acad. Sci. 717:1-15].

추가적인 연구들은 신경보호 활성이 유기체의 항산화 방어들의 증대 또는 보충과 관련됨을 증명하는 것으로서, 이 이론을 지지한다. 설치류에서 미량영양소 [Liu et al. (2002) Ann. NY Acad. Sci. 959:133-166], 항산화제 [Floyd and Hensley (2000) Ann. NY Acad. Sci. 899:222-237; Joseph et al. (2000) Mech. Ageing Dev. 116:141-153; Galli et al. (2002) Ann. NY Acad. Sci. 959:128-132] 및 식물 추출물[Bickford et al. (2000) Brain. Res. 866:211-217; Cartford et al. (2002) J. Neurosci. 22:5813-5816] 을 이용한 식이 보충이 인지 과제들에서의 거동을 향상시키고[Bickford et al. (1999) Mech. Ageing Dev. 111:141-154], CNS 전기생리학적 반응들을 회복시키는 것[Gould et al. (1998) Neurosci. Lett. 250:165-168; Bickford et al. (1999) Free Rad. Biol. Med. 26:817-824] 외에도, 전리방사선[Lenton and Greenstock (1999) Mech. Ageing Dev. 107:15-20] 또는 산화적 손상[Butterfield et al. (1998) Ann. NY Acad. Sci. 854:448-462; Cao et al. (1999) J. Applied Physiol. 86:1817-1822] 에 대항하여 노화 신경계를 보호하는 것으로 나타났다. 이러한 중재적 치료(intervention therapy) 모두 세포내 환경의 항산화 상태를 변화시키고 중요 세포질 및 미토콘드리아 내용물들을 ROS 에 의한 분해로부터 보호하여 항상성을 회복 및/또는 유지시키는 것으로 추정된다. 항산화 상태의 지표는 이들 식이 조작에 따른 변화를 보여주었다. 예를 들어, 지질 과산화물 표지자들인, 말론디알데히드 (MDA)[Gemma et al. (2002) J. Neurosci. 22:6114-6120] 및 히드록시노넨알 (HNE) 이 저하되고[Yoshimura et al. (2002) Free Rad. Res. 36:107-112], 이소프로스탄이 감소하며[Montine et al. (2003) Biochem. Pharmacol. 65:611-617], 8-히드록시-2-데옥시구아노신 수준이 감소하며[Lee et al. (1998) Cancer Lett. 132:219-227], 단백질 카르보닐[Carney et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3633-3636; Stadtman and Berlett (1998) Drug Metab. Rev. 30:225-243] 및 니트로티로신 잔기들이 저하되고[Whiteman and Halliwell (1996) Free Rad. Res. 25:275-283], 및 스핀 포착 항산화제들이 저하된 반응성을 보인다[Carney et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3633-3636].

스핀 포착 항산화제인 N-터트(tert)-부틸-α-페닐니트론 (PBN)의 처치는 노화 및 ROS에 의해 유도되는 신경퇴행을 약리학적으로 약화시키는 능력을 보여준다. PBN은 자유 라디칼 스캐빈저(scavenger)이며, 이는 ROS 를 감소시키고[Floyd (1999) Proc Soc Exp Biol Med. 222(3):236-245), 노화 촉진된 마우스 모델에서 단백질 카르보닐 생성을 낮추고[Butterfield et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:674-678], 허혈성 재관류 손상에 있어서 저빌(gerbil)의 뇌를 보호하고[Floyd and Hensley (2000) Ann. NY Acad. Sci. 899:222-237), 노령의 쥐에서의 소뇌 반응성을 유지시키고[Gould and Bickford (1994) Brain Res. 660:333-336), 인간 섬유아세포에서 텔로미어 단축 속도를 감소시키는 것으로 나타났다[von Zglinicki et al. (2000) Free Rad. Biol. Med. 28:64-74]. PBN은 또한 노령의 저빌에서 단백질 카르보닐 함량을 낮추고 방사형미로(radial arm maze) 행동과제에서의 수행능을 향상시키는데 효과적인 것으로 증명되었다[Carney et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3633-3636]. 따라서, 다양한 영양 중재에 의하여 유기체의 항산화 방어를 증대시키는 것은 설득력있는 주장으로 남아있다.

노화 및 산화적 스트레스는, 공간학습, 기억 형성 및 기억 고정에 필요한 장기적 강화(LTP)의 쇠퇴에서 보여지는 결손들에 의해 증명된 바, 해마의 정보처리 위축과 관련되어 있다[Barnes (1990) Prog. Brain Res. 86:89-104; McGahon et al. (1997) Neuroscience 81:9-16; Murray and Lynch (1998a) J. Neurosci. 273:12161-12168]. 본원에 개시된 물질의 조성물은 COX 및 LOX 억제제일 뿐 아니라, 강력한 항산화제로서, 산화적 스트레스, 염증 또는 노화에 의해 발생되는 해마의 정보처리 저하를 감소시킬 수 있다.

마지막으로, 염증성 프로스타노이드는 염증성 시토카인 IL-1β를 상향 조절함으로써 LTP를 손상시킨다. 이 시토카인은, 연령 및 산화적 스트레스와 함께 증가하는 것으로 나타났으며, 해마 및 DG의 CA1 영역의 LTP 를 억제한다[Murray and Lynch (1998a) J. Neurosci. 273:12161-12168]. IL-1β 발현에 있어서의 상향 조 절은 해마 내의 지질 과산화 증가와 관련되어 있다[Murray et al. (1999) Gerontology 45:136-142]. 이 과정에 대한 추가적인 평가에 의하여, 항산화제가 풍부한 식이로 처치된 동물이 IL-1β, 지질 과산화 및 관련된 LTP 의 결손에 있어서 노화 관련 변화들의 반전을 경험하는 것으로 밝혀졌다[Lynch (1998) Prog. Neurobiol. 56:571-589]. 덧붙여, 노화와 관련된 막 AA 농도의 감소 역시 항산화제의 식이 보충으로 개선되었다[Murray and Lynch (1998b) J. Biol. Chem. 273:12161-12168]. 이 요인들 모두 산화적 스트레스에의 노출, 염증 및 노화의 결과로서 일어나는 인지기능 감퇴가 식이 및 약리학적 중재로 늦추어지거나 또는 개선될 수 있음을 분명하게 나타낸다.

플라보노이드 또는 바이오플라보노이드는 널리 분포된 군의 천연 생성물이며, 이들은 항박테리아, 항염증, 항알레르기, 항돌연변이, 항바이러스, 항종양, 항혈전 및 혈관확장 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 상기 군의 화합물에 공통적인 구조 단위는 하기 일반식에 의해 도해되는 바와 같이 3-탄소 고리의 어느 한쪽 측면 상에 2개의 벤젠 고리를 포함한다 :

상기 일반적 3-고리 구조에 결합된 수산기, 당, 산소 및 메틸기의 다양한 조합이 플라바놀, 플라본, 플라반-3-올 (카테킨), 안토시아닌 및 이소플라본을 포함하는 다양한 부류의 플라보노이드를 생성시킨다.

플라보노이드의 섭취는 역으로 우발적 치매의 위험과 관련되어질 수 있다고 알려져 있다. 작용의 메카니즘은 잘 알려져 있지 않지만 플라보노이드의 항산화 효과에 기인한다고 추측된다 [Commenges et al.(2000) Eur. J. Epidermiol. 16:357-363]. 폴리페놀 플라본은 cox-2, NFκB 및 Bcl-X(L)을 포함하는 유전자의 mRNA 수준의 활성에 의해서 형질변환된 콜로노사이트(colonocyte)의 프로그램화된 세포 사멸, 분화 및 성장 저해를 유도한다.

최근의 보고들은 약초인 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis) 에서 분리된 플라보노이드가 cox-2 유전자 발현의 변경에 연관되었을 가능성을 제기하였다[Wakabayashi and Yasui (2000) Eur. J. Pharmacol. 406(3):477-481; Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61:1417-1427; Chi et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61:1195-1203; Raso et al. (2001) Life Sci. 68(8):921-931]. 유전자 발현이라는 용어는 mRNA 생산 및 단백질 합성 모두를 기술하기 위해 종종 사용된다. 사실상, 실제 유전자 발현의 변화는 단백질 수준에서의 관찰가능한 변화로 전혀 귀착되지 않을 수 있다. 단백질 수준의 변화가 항상 유전자 발현의 변화에 의해 일어나는 것은 아니라는 결론 또한 참일 수 있다. 게놈 DNA로부터 기능적 단백질로 유도하는 경로에서, 조절 가능한 지점이 6 개 있다: (1) 전구-mRNA 생산을 유도하는 핵 인자들 및 다른 신호들에 의한 전사 조절; (2) 엑손 스플라이싱, 5' 캡 구조 및 3' 폴리-아데닐화 서열 첨가 및 핵으로부터 세포질로의 성숙 mRNA 수송을 포함하는 전구-mRNA 가공 조절 ; (3) mRNA가 단백질로 번역되기 위해 세포질내 특정 부위에 분포하는 것을 제어하는 mRNA 수송 조절; (4) 임의의 단백질 번역 전에 또는 상기 특정 mRNA로부터의 번역을 종결시키는 수단으로서 mRNA 풀(pool)의 규모를 제어하는 mRNA 분해 조절; (5) 특정 속도의 단백질 번역 개시에 대한 번역 조절 및 (6) 당화 및 단백질 분해 등의 변형을 포함하는 번역후 가공 조절. 유전자학 연구의 맥락에서, 이 경로에서는 후기 단계들(예컨대 단백질 수준) 보다는 초기 단계들에 더 가까운 유전자 발현 수준(예컨대 mRNA 수준)을 측정하는 기술을 사용하는 것이 중요하다.

상기 언급된 cox-2 유전자 발현과 관련된 연구들 각각은 단백질 분석을 위한 웨스턴 블랏 기법을 사용하여, DNA 또는 mRNA 수준에 대한 검증없이 추정상의 유전자 발현의 변화를 사정한다. 웨스턴 블랏 기법이 단백질 수준만을 측정하고 특정한 전사 산물인 mRNA 는 측정하지 않기 때문에, 관찰되는 단백질 발현 증가를 유도하는 다른 기작들을 포함시키는 것이 가능하다. 예를 들어, LPS는 mRNAs 의 3' 비번역 부위 (3'UTR) 에서 발견되는 불안정 서열들을 통하여 mRNA 반감기를 조절하는 것으로 보고되었는데[Watkins et al. (1999) Life Sci. 65:449-481], 이는 유전자 전사 속도의 변경이 없는 단백질 발현 증가를 설명할 수 있었다. 결론적으로, 이는 이러한 처치 조건들이 유전자 발현에서의 의미있는 변화로 귀착되었는지의 여부에 대한 의문을 남긴다.

RT-qPCR 및 DNA 마이크로어레이 분석 등의 기술은 분석에 있어서 mRNA 수준 에 의존하며, 상이한 조건들 하, 즉 약학 제제의 존재 또는 부재하에서의 유전자 발현 수준을 평가하는데 사용할 수 있다. 본 출원인에 의하면 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 조합물로 이루어진 조성물을 치료제로 사용할 때 mRNA의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 특이적으로 측정하는 임의의 방법은 현재까지 보고되어있지 않다.

프리-비-링 플라본 및 플라보노이드는 하기 일반식에 의해 도해되는 바와 같이 방향족 B 고리 상에 치환기를 갖지 않는 특정 부류의 플라보노이드이다 (본원에서는 프리-비-링 플라보노이드로 언급함):

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH₂, -NHR, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,

여기에서,

R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 플루오르화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.

프리-비-링 플라보노드는 비교적 희박하다. 천연 공급원으로부터 합성되거나 유리된 총 9,396개의 플라보노이드 중에서, 단지 231개의 프리-비-링 플라보노이드만이 알려져 있다 [The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall/CRC, Version 5:1 June 2001]. 프리-비-링 플라보노이드는 다양한 생물학적 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 갈란긴(3,5,7-트리히드록시플라본)은 산화방지제 및 자유 라디칼 포착제로서 작용하며, 항-유전독성 및 암의 화학적 예방을 위한 보장된 후보 물질인 것으로 믿어진다 [Heo et al. (2001) Mutat. Res. 488(2):135-150]. 이것은 티로시나아제 모노페놀라아제의 억제제[Kubo et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. 8:1749-1755] 및 토끼 심장 카르보닐 환원효소의 억제제[Imamura et al. (2000) J. Biochem. 127:653-658]이고, 항미생물 활성[Afolayan and Meyer (1997) Ethnopharmacol. 57:177-181] 및 항바이러스 활성[Meyer et al. (1997) Ethnopharmacol. 56:165-169]을 갖는다. 바이칼레인 및 2개의 또다른 프리-비-링 플라보노이드는 사람 유방암 세포에 대해 항증식 활성을 갖는다 [So et al. (1997) Cancer Lett. 112:127-133].

전형적으로, 플라보노이드는 이들의 이용성에 근거하여 불규칙적으로 생물학적 활성에 대해 시험되었다. 경우에 따라, p-당단백질에 대한 고친화성 결합에 필요한 B-링 치환[Boumendjel et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11(1):75-77]; 강심 작용[Itoigawa et al. (1999) J. Ethnopharmacol. 65(3):267-272]; 리놀레산 히드로과산화물-유도 독성에 대한 내피 세포에 대한 보호 작용[Kaneko and Baba (1999) Biosci Biotechnol. Biochemm 63(2):323-328]; COX-1 억제 활성[Wang (2000) Phytomedicine 7:15-19] 및 프로스타글란딘 엔도페록시드 신타아제[Kalkbrenner et al. (1992) Pharmacologyy 44(1):1-12]과 같이, 특이적인 생물학적 활성에 대해 B-링 상의 치환의 요건이 강조되었다. 단지 몇개의 공보만이 프리-비-링 플라보노이드의 비치환된 B-링의 중요성을 언급하였다. 한가지 예는 효과적 항응고제로서 NADPH 퀴논 수용체 산화환원 효소를 억제하는 2-페닐 플라본의 사용이다 [Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11):1417-1427].

다양한 프리-비-링 플라보노이드의 항염증 활성에 대한 작용 메카니즘은 논쟁의 여지가 있다. 프리-비-링 플라보노이드인 크리신[Liang et al. (2001) FEBS Lett. 496(1):12-18], 우고닌[Chi et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61:1195-1203] 및 할란긴[Raso et al. (2001) Life Sci. 68(8):921-931]의 항염증 활성은 과산화소체 증식자-활성화 수용체 감마(PPARγ)의 활성화와 탈과립화 및 AA 방출에 대한 영향을 통한 유도성 시클로옥시게나아제 및 산화질소 신타아제의 억제와 관련되어 있다 [Tordera et al. (1994) Z. Naturforsch [C] 49:235-240]. 오로크실린, 바이칼레인 및 우고닌이 시클로옥시게나아제에 영향을 주지 않으면서 12-리폭시게 나아제를 억제하는 것으로 보고되었다 [You et al. (1999) Arch. Pharm. Res. 22(1):18-24]. 더욱 최근에는, 우고닌, 바이칼린 및 바이칼레인의 항염증 활성이 유도성 산화질소 신타아제의 억제 및 산화질소 억제제 및 리포다당류에 의해 유도되는 cox-2 유전자 발현을 통해 일어나는 것으로 보고되었다 [Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11):1417-1427]. 또한, 오로크실린은 NFκB의 활성을 억제하는 것으로 보고되었다 [Chen et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 61(11):1417-1427]. 최종적으로, 보고에 따르면, 우고닌은 대식 세포에서 유도성 PGE2 생성을 억제한다 [Wakabayashi and Yasui (2000) Eur J. Pharmacol. 406(3):477-481].

미트로겐-활성화 단백질 키나아제의 인산화 억제 및 바이칼레인에 의한 Ca2+ 이온 투과 담체 A23187 유도 PGE2 방출의 억제는 스쿠텔라리아 라딕스(Scutellariae radix)의 항염증 활성의 메카니즘인 것으로 보고되었다 [Nakahata et al. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi, 114, Supp. 11:215P-219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin Med. 26:311-323]. 보고에 따르면, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스는 IL-1β, IL-6, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 인터페론-γ(IFN-γ)의 초항원성 포도상구균 외독소 자극 T-세포 증식 및 생성을 억제한다 [Krakauer et al. (2001) FEBS Lett. 500:52-55]. 이와 같이, 바이칼린의 항염증 활성은 초항원에 의해 활성화된 전구염증성 시토카인 매개 징후 경로를 억제하는 것과 관련되었다. 그러나, 또한 바이칼린의 항염증 활성이 다양한 케모카인에 결합되어 이들의 생물학적 활성을 제한하는 것에 기인함이 제안되었다 [Li et al. (2000) Immunopharmacology 49:295-306]. 최근에는, 트롬빈 및 트롬빈 수용체 아고니스트 펩티드에 의해 유도되는 유착 분자 발현에 대한 바이칼린의 작용[Kimura et al. (2001) Planta Med. 67:331-334], 및 미토겐-활성화 단백질 키나아제 단계적 반응(MARK)의 억제[Nakahata et al.. (1999) Nippon Yakurigaku Zasshi, 114, Supp 11:215P=219P; Nakahata et al. (1998) Am. J. Chin Med. 26:311-323]가 보고되었다.

중국의 약용 식물인 스쿠텔라리아 바이칼렌시스는 바이칼레인, 바이칼린, 우고닌 및 바이칼레노시드를 포함하여 상당한 양의 프리-비-링 플라보노이드를 함유한다. 통상적으로, 상기 식물은 열 제거, 화염 제거, 습기-온난 및 여름 열 신드롬(summer fever syndromes); 고열로부터 유발되는 조갈증, 종창, 욕창 및 다른 발열성 피부 감염; 급성 편도선염, 후두인두염 및 성홍열과 같은 상부 호흡기 감염; 바이러스성 간염; 신염; 펠비티스(pelvitis); 이질; 토혈 및 코피를 포함하여 많은 질환을 치료하기 위해 사용되어 왔다. 상기 식물은 또한 유산을 방지하기 위해 통상적으로 사용되어 왔다 [Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998]. 임상적으로, 스쿠텔라리아는 현재 소아 폐렴, 소아 박테리아성 설사, 바이러스성 간염, 급성 담낭 염증, 고혈압, 절단 및 수술로부터 유발되는 국부적 급성 염증, 천식 및 상부 호흡기 감염과 같은 질환을 치료하기 위해 사용된다 [Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine, ShangHai Science and Technology Press, ShangHai, China, 1998]. 보고에 따르면, 천식을 치료하기 위한 스쿠텔라리아 뿌리의 약리 효과는 프리-비-링 플라보노이드의 존재 및 호산성 물질의 에오탁신 관련 점증의 억제에 관련된다 [Nakajima et al. (2001) Planta Med. 67(2):132-135].

지금까지, 많은 천연 프리-비-링 플라보노이드가 다양한 용도로 시판되어 왔다. 예를 들어, 스쿠텔라리아 추출물의 리포솜 형성은 피부 보호를 위해 사용되어 왔다 [미합중국 특허 제5,643,598호, 제5,443,983호]. 바이칼린은 암유전자에 대한 이것의 억제 효과로 인해 암을 예방하기 위해 사용되어 왔다 [미합중국 특허 제6,290,995호]. 바이칼린 및 다른 화합물은 항바이러스제, 항박테리아제 및 면역조절제[미합중국 특허 제6,083,921호 및 WO98/42363] 및 천연 산화방지제[WO98/49256 및 폴란드 공보 제9,849,256호]로서 사용되어 왔다. 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물은 구소용 제형에서 각각의 개별적 성분의 누적 SPF의 첨가제 작용을 하는 보충적 선스크린제로서 제형화되어 왔다. 크리신은 이것의 불안 감소 성질을 위해 사용되어 왔다 [미합중국 특허 제5,756,538호]. 항염증성 플라보노이드는 상부직장 및 결장 질환의 억제 및 치료[미합중국 특허 제5,858,371호] 및 리폭시게나아제의 억제[미합중국 특허 제6,217,875호]를 위해 사용되어 왔다. 이들 화합물은 또한 연결 조직의 치유 및 유지를 위해 글루코사민 콜라겐 및 다른 성분들과 제형화된다 [미합중국 특허 제6,333,304호], 플라노보이드 에스테르는 미용 조성물용 활성 성분을 구성한다 [미합중국 특허 제6,235,294호]. 2002년 3월 1일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/091,362호("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors") 및 2003년 4월 30일에 출원된 미합중국 특허 출원 10/427,746호("Formulation with dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase inhibitory activity")는 모두, 프리-비-링 플라보노이드를 포함하는 조성물 또는 프리-비-링 플라보노이드의 혼합물을 함유하는 조성물을 이들을 필요로 하는 수용자에게 투여함으로써 시클로옥시게나아제 효소 COX-2를 억제시키는 방법을 기술하고 있다. 이는 프리-비-링 플라보노이드들 사이의 결합 및 COX-2 억제 활성에 대한 첫 번째 보고이다. 이들 출원은 특히 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 인용된다.

일본 특허 제63027435호는 바이칼레인의 추출 및 농축을 기술하고 있으며, 일본 특허 제61050921호는 바이칼린의 정제를 기술하고 있다.

플라반은 하기 일반식에 의해 도해되는 플라반을 포함한다:

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 -H, -OH, -SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 및 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에세테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 언급된 치환기의 에스테르; 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,

여기에서,

R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.

카테킨은 주로 녹차에서 발견되는 플라반이며, 하기 구조를 갖는다:

카테킨은 단독으로 그리고 차에서 발견된 다른 플라보노이드와 함께 작용하며, 항바이러스 활성 및 산화방지 활성 둘 모두를 갖는다. 카테킨은 바이러스성 간염의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 이것은 또한 심장, 신장, 폐 및 비장에 대한 산화적 손상을 예방하는 것으로 보이며, 위암 세포의 성장을 억제하는 것으로 입증되었다.

카테킨 및 이것의 이성질체인 에피카테킨은 40 μM의 IC₅₀ 값으로 프로스타글란딘 엔도페록시드 신타아제를 억제한다 [Kalkbrenner et al. (1992) Pharmacol. 44:1-12]. 4가지 식물종, 즉 아투나 라세모사(Atuna racemosa), 시지기움 카리노카르품(Syzygium carynocarpum), 시지기움 말라켄세(Syzygium malaccense) 및 반타네아 페루비아나(Vantanea peruviana)로부터 분리된 (+)-카테킨 및 갈로카테킨을 포함하는 5가지의 플라반-3-올 유도체는 3.3 내지 138 μM의 IC₅₀ 값으로, COX-1과 비교하여 COX-2에 대해 동일하거나 더 약한 억제 활성을 나타낸다 [Noreen et al. (1998) Planta Med. 64:520-524]. 케이바 펜탄드라(Ceiba pentandra)의 수피로부터 분리된 (+)-카테킨은 80 μM의 IC₅₀ 값으로 COX-1을 억제한다 [Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61:8-12]. 시판용의 순수한 (+)-카테킨은 실험 조건에 좌우하여 약 183 내지 279 μM의 IC₅₀ 값으로 COX-1을 억제하며, COX-2에 대한 선택성은 없다 [Noreen et al. (1998) J. Nat. Prod. 61:1-7].

녹차 카테킨은 스프라그 돌리 숫쥐의 식이물에 보충한 경우에, 혈소판 PLA₂의 활성 수준을 저하시켰으며, 혈소판 시클로옥시게나아제 수준을 현저히 감소시켰다 [Yang et al. (1999) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 45:337-346]. 보고에 따르면, 카테킨 및 에피카테킨은 사람 결장암 DLD-1 세포에서 cox-2 유전자 전사를 약하게 억제한다 (IC₅₀=415.3 μM) [Mutoh et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91:686-691]. 적포도주로부터의 (+)-카테킨의 신경보호 능력은 시클로옥시게나아제, 리폭 시게나아제 또는 산화질소 신타아제와같은 세포내 효소에 대한 억제 효과보다는 카테킨의 산화방지 성질로부터 결과된다 [Bastianetto et al. (2000) Br. J. Pharmacol. 131:711-720]. 에피갈로카테킨-3-갈레이트(EGCG), 에피갈로카테킨(EGC), 에피카테킨-3-갈레이트(ECG) 및 테아플라빈과 같은 녹차 및 홍차로부터 정제된 카테킨은 사람 결장 점막 및 결장 종양 조직에서 AA의 시클로옥시게나아제 및 리폭시게나아제 의존성 대사작용의 억제를 나타내었으며[Hong et al. (2001) Biochem. Pharmacol. 62:1175-1183], cox-2 발현 및 PGE2 생성을 유도한다 [Park et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286:721-725]. 켈라스트루스 오르비쿨라투스(Celastrus orbiculatus)의 기생부로부터 분리된 에피아프젤레킨은 15 μM의 IC₅₀ 값으로 COX-1 활성의 투여량-의존성 억제를 나타내었으며, 또한 100 mg/kg의 투여량에서 경구 투여 후에 카라기닌-유도 마우스 발 부종에 대한 항염증 활성을 나타내었다 [Min et al. (1999) Planta Med. 65:460-462].

아카시아는 콩과 나무 및 관목의 속(genus)이다. 아카시아 속은 콩과식물의 과 및 미모사아과 식물의 아과에 속하는 1000개보다 많은 종을 포함한다. 아카시아는 중남미, 아프리카, 아시아의 일부 및 가장 많은 풍토성 종을 갖는 오스트레일리아의 열대 및 아열대 지역에 전세계적으로 분포되어 있다. 아카시아는 경제적으로 매우 중요하며, 타닌, 고무, 목재, 연료 및 사료의 공급원을 제공한다. 주로 수피로부터 분리되는 타닌은 가죽 및 모피를 무두질하기 위해 광범위하게 사용된다. 일부 아카시아 수피는 또한 지역 특유의 주정에 향을 더해주기 위해 사용된다. 에이. 시누아타(A. sinuata)와 같은 일부 자생종은 또한, 물과 혼합하고 교반 시켰을 때 비누 거품을 형성시키는 다양한 식물 글루코사이드 중 어느 하나인 사포닌을 생성시킨다. 사포닌은 청정제, 발포제 및 유화제에 사용된다. 일부 아카시아 종의 꽃은 방향성이며, 향료를 만들기 위해 사용된다. 많은 아카시아의 심재는 농기구를 만들기 위해 사용되며, 또한 장작의 공급원을 제공한다. 아카시아 고무는 의약 및 제과에서 그리고 방직 산업에서 사이징재 및 마감재로서 광범위하게 사용되는 것으로 밝혀졌다.

지금까지, 약 330가지 화합물이 다양한 아카시아 종으로부터 분리되었다. 플라보노이드가 아카시아로부터 분리된 주된 부류의 화합물이다. 약 180가지의 상이한 플라보노이드가 확인되었으며, 이 중에서 111가지는 플라반이다. 테르페노이드가 아카시아 속의 종으로부터 분리된 2번째로 많은 부류의 화합물이며, 48가지 화합물이 확인되었다. 아카시아로부터 분리되는 다른 부류의 화합물로는 알칼로이드(28가지), 아미노산/펩티드(20가지), 타닌(16가지), 탄수화물(15가지), 산소 헤테로고리 화합물(15가지) 및 지방족 화합물(10가지)이 있다 [Buckingham, The Combined Chenical Dictionary, Chapman & Hall CRC, version 5:2 Dec. 2001].

페놀계 화합물, 특히 플라반은 모든 아카시아 종에서 고농도로 적당하게 발견되었다 [Abdulrazak et al. (2000) Journal of Animal Science. 13:935-940]. 역사적으로, 아카시아 속의 식물 및 추출물의 대부분은 위장병, 설사 및 소화불량을 치료하고 출혈을 중단시키기 위해 이용되어 왔다 [Vautrin (1996) Universitee Bourgogne (France) European abstract 58-01C:177; Saleem et al. (1998) Hamdard Midicus. 41:63-67]. 아카시아 아라비카 윌드(Acacia arabica Willd)의 수피 및 꼬투리는 다량의 타닌을 함유하며, 수렴제 및 거담제로서 이용되어 왔다 [Nadkarni (1996) India Materia Medica, Bombay Popular Prakasan, pp. 9-17]. 소말리아로부터의 아카시아 토르틸리스(Acacia tortilis)의 줄기 수피로부터 분리되는 디아릴프로판올 유도체는 평활근 이완 작용을 하는 것으로 보고되었다 [Hagos et al. (1987) Planta Medica. 53:27-31, 1987]. 아카시아 빅토리아에(Acacia victoriae)로부터 분리되는 테르페노이드 사포닌이 디메틸벤즈(아)안트라센-유도된 쥐의 피부 발암에 대한 억제 작용을 하며[Hanausek et al. (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting. 41:663], 아포토시스를 유도한다[Haridas et al. (2000) Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting. 41:600]. 아카시아 닐로티카(Acacia nilotica)로부터의 식물 추출물은 경련, 혈관수축 및 항고혈압 활성[Amos et al. (1999) Phytotherapy Research 13:683-685; Gilani et al. (1999) Phytotherapy Research 13:665-669] 및 항-혈소판 응집 활성[Shah et al. (1997) General Pharmacology, 29:251-255]을 갖는 것으로 보고되었다. 에이. 닐로티카에 대한 항염증 활성이 보고되었다. 플라보노이드, 다당류 및 유기산이 효과적 활성 성분임이 추측되었다 [Dafalah and Al-Mustafa (1996) American Journal of Chinese Medicine. 24:263-269]. 지금까지, 아카시아로부터 분리된 유일하게 보고된 5-리폭시게나아제 억제제는 모노테르페노이드 카르복사미드이다 [Seikine et al. (1997) Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 45:148-11].

아카시아의 수피로부터의 추출물은 표백제로서(Abe, JP10025238), 치과용 글 루코실 트랜스퍼라아제로서(Abe, JP07242555), 단백질 합성 억제제로서(Fukai, JP07165598), 외피 제조물용 활성 산소 포착제로서(Honda, JP07017847; Bindra, USP6,1266,950) 그리고 염증, 화분증 및 기침을 예방하기 위하 경구 소비용 히알루로니다아제 억제제로서(Ogura, JP07010768) 외부 용도에 대해 일본에서 특허되었다.

지금까지, 출원인에 의하면 신경퇴행, 신경염증 및 누적성 인지기능 감퇴, 장애 및 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반을 조합한 제형물은 보고된 적이 없다.

발명의 요약

본 발명은 시클로옥시게나아제 (COX) 및 리폭시게나아제 (LOX) 효소 둘 다를 동시에 억제하는데 효과적인 방법을 포함한다. COX 및 LOX 효소들에 대한 동시적 이중 억제를 위한 방법은, 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함한 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에 투여하는 것으로 이루어진다. 이 당해 조성물은 본원에서 라소페린^TM (Lasoperin^TM) 으로 지칭된다. 상기 당해 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 특정 질환 또는 이상의 예방 및 치료에 관한 지시사항 및 특이적 요건에 기초하여 조절될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 (프리-비-링 플라보노이드:플라반) 내지 0.1:99.9 (프리-비-링 플라보노이드:플라반) 의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 80:20 이다. 바람직한 구현예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물 중 스쿠텔라리아 속의 식물(들)에서 분리된 것이고, 플라반은 식물 중 아카시아 속의 식물(들)에서 분리된 것이다. 이 방법의 효능은 상이한 세포주, 다수의 동물 모델 및 종국에 인간 임상 연구에서 정제된 효소를 이용하여 증명되었다.

보다 명확히는, 본 발명은 신경세포 및 인지 기능에 관련된 COX 및 LOX 매개 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함하고, 이때 상기 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 (프리-비-링 플라보노이드:플라반) 내지 0.1:99.9 (프리-비-링 플라보노이드:플라반) 의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다. 바람직한 구현예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물 중 스쿠텔라리아 속의 식물(들)에서 분리된 것이고, 플라반은 식물 중 아카시아 속의 식물(들)에서 분리된 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 일반적인 인지기능 감퇴, 노화 관련 기억 상실, 신경염증성 및 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함하고, 이때 상기 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 내지 0.1:99.9 의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다. 바람직한 구현예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물 중 스쿠텔라리아 속의 식물(들)에서 분리된 것이고, 플라반은 식물 중 아카시아 속의 식물(들)에서 분리된 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, 인지기능 감퇴 및 기타 노화-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 질환에 연관된 mRNA의 생산을 조절하는 방법을 포함하고, 이때 상기 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 내지 0.1:99.9 프리-비-링 플라보노이드:플라반 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다. 한 가지 구현예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물 중 스쿠텔라리아 속의 식물(들)에서 분리된 것이고, 플라반은 식물 중 아카시아 속의 식물(들)에서 분리된 것이다.

본 발명은 또한 인지기능 감퇴 및 기타 노화-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 질환들에 연관된 시토카인 mRNA의 생산을 제어하는 전사인자들의 mRNA 생산을 조절하는 방법을 포함하고, 이때 상기 방법은, 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 내지 0.1:99.9 프리-비-링 플라보노이드:플라반 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다. 바람직한 구현예에서 프리-비-링 플라보노이드는 식물 중 스쿠텔라리아 속의 식물(들)에서 분리된 것이고, 플라반은 식물 중 아카시아 속의 식물(들)에서 분리된 것이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 인지기능 감퇴 및 기타 노화-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 질환들에 연관된, cox-1 은 제외한 cox-2 mRNA 의 생산을 제어 하는 전사인자들의 mRNA 생산을 조절하는 방법을 포함하고, 이때 상기 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 내지 0.1:99.9 프리-비-링 플라보노이드:플라반 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다. 바람직한 구현예에서 프리-비-링 플라보노이드는 식물 중 스쿠텔라리아 속의 식물(들)에서 분리된 것이고, 플라반은 식물 중 아카시아 속의 식물(들)에서 분리된 것이다.

이론에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물은 인터루킨-1 베타(IL-1β), 종양괴사인자-알파(TNFα) 및 인터루킨-6(IL-6)의 유전자 발현을 제어하는 핵 인자 카파 B (NFκB) 전사인자의 하향 조절을 통해 전구염증성 시토카인을 억제함으로써 작용하는 것으로 여겨진다. 또한, 상기 조성물은, 또 다른 전사인자로서 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 유전자 발현을 제어하는 것을 돕는 과산화소체 증식자-활성화 수용체 감마(PPARγ)의 유전자 발현을 억제하는 것으로 여겨진다. 덧붙여, 본 발명의 조성물은 COX-2 및 5-리폭시게나아제 (5-LO) 의 활성을 억제함으로써 AA 가 염증을 악화시키는 프로스타글란딘, 트롬복산 및 류코트리엔으로 전환되는 것을 억제한다. 상기 조성물은 또한 더 많은 NFκB 발현을 유도하여 그에 따라 더 많은 전구염증성 시토카인들의 유전자 발현을 유도할 수 있는 분자들인 활성산소종(ROS)을 중화시키는 강한 항산화능을 지닌다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 본원에서 또한 프리-비-링 플라본 및 프리-비-링 플라보놀로서 명명되는 프리-비-링 플라보노이드는 하기 일반식에 의해 도해되는 화합물을 포함한다:

[화학식 2]

상기 식에서,

R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -NR3+X-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,

여기에서,

R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 프리-비-링 플라보노이드는 합성 방법에 의해 수득되거나, 포포나무과(Annonaeae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceaee), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 과로부터 추출될 수 있다. 프리-비-링 플라보노이드는 데스모스(Desmos), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸(Oroxylum), 부케나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라(Cotula), 그나팔리움(Gnaphalum), 헤리치숨(Helichysum), 켄타루레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 박카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브루케아(Colebrookea), 스타치스(Stachys), 오리가눔(Origanum), 지지포라(Ziziphora), 린데라(Lindera), 악티노다프네(Actinodaphnee), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아(Millettia), 퐁가미아(Pongamia), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스(Artocarpus), 피쿠스(Ficus), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나(Notholaena), 피누스(Pinus), 울무스(Ulmis) 및 알피나(Alpina)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 고등식물의 속으로부터 추출되고, 농 축되고 정제될 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 플라반은 하기 일반식에 의해 도해되는 화합물, 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반을 포함한다:

[화학식 3]

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 H, -OH, -SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 및 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에스테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 언급된 치환기의 에스테르; 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,

여기에서,

R은 탄소수 1-10개의 알킬기로부터 선택되고;

X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 플라반은 아카시아 속으로부터 선택된 식물(들)로부터 수득될 수 있다. 바람직한 구현에서, 식물은 아카시아 카테츄(Acacia. catechu), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa), 아카시아 아라비아(Acacia arabia), 아카시아 카에시아(Acacia caesia), 아카시아 펜나타(Acacia pennata), 아카시아 시누아타(Acacia sinuata), 아카시아 메아른시이(Acacia mearrnsii), 아카시아 피크난타(Acacia picnantha), 아카시아 데알바타(Acacia dealbata), 아카시아 아우리쿨리포르미스(Acacia auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(Acacia holoserecia) 및 아카시아 만기움(Acacia mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은, 이에 제한되지는 않으나 일반적인 인지기능 감퇴, 노화 관련 기억 상실, 신경염증성 및 신경퇴행성 장애 및 신경세포 및 인지 기능에 관련된 기타 질환들을 포함한, 신경세포 및 인지 기능에 관련된 다수의 COX 및 LOX 매개 질병 및 질환을 예방 및 치료하는 방법을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인지기능 감퇴 및 기타 노화-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 이상들에 연관된 mRNA의 생산을 조절하는 방법을 포함한다.

본 발명에 따르는 예방 및 치료 방법은 단일 공급원 또는 여러 공급원으로부 터 분리된 치료적으로 유효량의 제형화된 프리-비-링 플라보노이드와 플라반을 이들을 필요로 하는 수용자에게 국부 투여하는 것을 포함한다. 여러 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물 및/또는 개별 성분의 순도는 화합물을 얻기 위해 사용되는 방법에 좌우하여 0.01% 내지 100%를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 구현에서, 동일량을 함유하는 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 혼합물의 투여량은 국부 제형의 총중량을 기준으로 0.001 내지 100%로부터 일반적으로 선택되는 효과적이고 비독성인 양이다. 일상적 임상 실험을 이용하는 당업자는 치료하려는 특정 질병에 대한 최적 투여량을 결정할 수 있다.

본 발명은 제형을 최적화시키고 바람직한 생리학적 활성을 얻기 위해 효소적 및 생체내 모델을 사용하여 프리-비-링 플라보노이드와 플라반의 여러 조성물을 평가하는 방법을 포함한다. 상기 제형의 효과 및 안전성이 또한 사람 임상 연구에서 입증된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 방법 중 어느 하나에 의해 투여될 수 있다. 투여 방식은 특정 장내(경구) 투여, 비경구 (정맥내, 피하 및 근내) 투여 및 국부 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

상기의 일반적 설명과 하기의 상세한 설명은 단지 대표적이고 설명을 위한 것으로서, 청구되는 바와 같은 발명을 제한하는 것은 아님이 이해되어야 한다.

도 1A 내지 1C 는, 실시예 2 에 기술된 바와 같이, 13-주 방사형 수중미로(RAWM) 검사에서 각각 정상 식이 및 3, 7 또는 34 mg/kg 의 라소페린^TM 으로 보충된 식이가 제공된 노령의 수컷 피셔(Fisher) 344 쥐에 매일 투여된 라소페린^TM 의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 아카시아 카테츄의 수피 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리에서 분리한 2 개의 표준화된 추출물을 사용하여 실시예 1 에 기술된 바와 같이 라소페린^TM 제형물 (80:20) 을 제조하였다. 정상 식이로 유지된 어린 수컷 피셔 344 쥐는 정상 노화 관련 행동 변화에 대한 대조군으로 이용하였다. 데이터는 시험 회수 대 평균 총오차로 제시되었다(매 검사일에 4 회의 시험을 수행하였다). 도 1A는 1 주 및 2 주동안의 예비 검사 후의 결과를 도시한다(기준선). 도 1B는 5 주 후의 결과를 도시하고(회기(Session) II) 및 도 1C는 11 주 후의 결과를 도시한다(회기 III).

도 2는, 실시예 3 에 기술된 바와 같이 정상 식이 또는 3, 7 또는 34 mg/kg 라소페린^TM 으로 보충된 식이가 제공된 노령의 수컷 피셔 344 쥐에서 배경 공포 조건화 (CFC) 검사 전 12 주 동안 매일 투여된 라소페린^TM 의 효과를 도시한다. 아카시아 카테츄의 수피 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리에서 분리한 2 개의 표준화된 추출물을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 라소페린^TM 제형물 (80:20) 을 제조하였다. 정상 식이로 유지된 어린 수컷 피셔 344 쥐는 정상 노화 관련 행동 변화에 대한 대조군으로 이용하였다. 데이터는 투여량 그룹 대 평균 동결반응(freezing)률 (%) 로 제시되었다.

도 3은 실시예 4 에 기술된 바와 같은 복합적 선택 반응 시간에 대한 라소페 린^TM 의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 4 주간의 임상 시험 중의 40 개의 개체에 매일 라소페린^TM 을 투여하였다. 결과를 동일 기간에 걸쳐 위약(placebo)을 투여한 46 개 개체들의 군과 비교한다. 아카시아 카테츄의 수피 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리에서 분리한 2 개의 표준화된 추출물을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 라소페린^TM 제형물 (80:20) 을 제조하였다. 데이터는 기준선으로부터의 변화율(%)로 제시되었다. 이 도면은 라소페린^TM(300 mg/d)이 복합적 선택 및 정보로 제시된 과제들에 대한 처리 속도를 증가시킨 것을 증명한다.

도 4는 실시예 5에 기술된 바와 같은 반응시간 표준편차(RTSD)에 대한 라소페린^TM 의 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 라소페린^TM 을 4 주 임상 시험 중의 40 개 개체들에 매일 투여하였다. 결과를 동일 기간에 걸쳐 위약을 투여한 46 개 개체들의 군과 비교한다. 아카시아 카테츄의 수피 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리에서 분리한 2 개의 표준화된 추출물을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 라소페린^TM 제형물 (80:20) 을 제조하였다. 데이터는 기준선으로부터의 변화율(%)로 제시되었다. 이 도면은 라소페린^TM(300 mg/d)이 시험 중의 반응시간 표준편차, 즉 요구되는 인지 과제 동안에 주의깊게 집중하는 상태를 유지하는 능력을 증가시킨 것을 증명한다.

도 5는 라소페린^TM에 의한 COX-1 및 COX-2 억제를 그래프로 나타낸 것이다. 아카시아 카테츄의 수피 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리에서 분리한 2 개의 표준화된 추출물을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 라소페린^TM 제형물 (50:50) 을 제조하였다. 재조합된 양(羊) COX-1 (◆) 및 양 COX-2 (■) 의 퍼옥시다제 활성에 대한 라소페린^TM의 억제능을 조사하였다. 데이터는 억제제 농도(㎍/mL)에 대한 억제율(%)로 제시되었다. COX-1에 대한 IC₅₀은 0.38 ㎍/mL/효소단위였고, COX-2에 대한 IC₅₀은 0.84 ㎍/mL/단위이었다.

도 6은 A. 카테츄에서 분리한 정제된 플라반 카테킨에 의한 5-LO 억제에 대한 프로필을 그래프로 나타낸 것이다. 재조합 감자 5-리폭시게나아제 활성(◆)에 대한 상기 화합물의 억제능을 조사하였다. 데이터는 억제제 농도(㎍/mL)에 대한 억제제 부재하의 검정의 억제율(%)로 제시되었다. 5-LO에 대한 IC₅₀은 1.38 ㎍/mL/효소단위였다.

도 7은 실시예 8에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정된 바 비-유도 세포 중에서 3㎍/mL 라소페린^TM으로 처리한 후에 HT-29 세포 중에 잔류하는 LTB₄ 수준을 3㎍/mL 이부프로펜으로 처리한 후의 LTB₄ 수준과 비교한 도면이다. 아카시아 카테츄의 수피 및 스쿠텔라리아 바이칼렌시스의 뿌리에서 분리한 2 개의 표준화된 추출물을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 라소페린^TM 제형물 (80:20) 을 제조하였다.

도 8은 상이한 농도의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물과 결합된 지질다당류에 1시간 동안 노출된 후 말초혈액 단핵구 (PBMC) 내 지질다당류(LPS)에 의해 유도된 TNFα 수준에 대한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반(80:20) 혼합물의 영향을 그래프로 도시한 것이다. TNFα의 수준은 pg/mL 로 나타내었다.

도 9는 상이한 농도의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물과 결합된 지질다당류에 4시간 동안 노출된 후 말초혈액 단핵구 (PBMC) 내 지질다당류(LPS)에 의해 유도된 IL-1β 수준에 대한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반(80:20) 혼합물의 영향을 도시한 것이다. IL-1β의 수준은 pg/mL으로 나타내었다.

도 10은 상이한 농도의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물과 결합된 지질다당류에 4시간 동안 노출된 후 말초혈액 단핵구 (PBMC) 내 지질다당류(LPS)에 의해 유도된 IL-6 수준에 대한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반(80:20) 혼합물의 영향을 그래프로 도시한 것이다. IL-6의 수준은 pg/mL으로 나타내었다. 각 데이터 지점에 대하여 표준편차를 나타내었다.

도 11은 cox-1 및 cox-2 유전자 발현에 대한 다양한 농도의 라소페린^TM의 효과를 비교한 것이다. 발현 수준은 18S rRNA 발현 수준(내부 대조군)으로 표준화되고 그 후 무처리, 무(無) LPS 조건으로 정상화된다. 이 도면은, LPS-자극 및 라소페린^TM 에의 노출 후, cox-1이 아닌 cox-2의 유전자 발현만 감소된 것을 증명한다.

도 12는 등가 농도의 다른 NSAID들을 이용한 cox-1 및 cox-2 유전자 발현에 대한 3 ㎍/mL 라소페린^TM 의 효과를 비교한 것이다. 발현 수준은 18S rRNA 발현 수 준(내부 대조군)으로 표준화되고 그 후 무처리, 무 LPS 조건으로 정상화된다.

도 13A 및 13B 은 tnfα-1 (도 13A) 및 il -1β (도 13B) 유전자 발현에 대한 다양한 농도의 라소페린^TM에 대한 효과를 도시한 것이다. 발현 수준은 18S rRNA 발현 수준(내부 대조군)으로 표준화되고 그 후 무처리, 무 LPS 조건으로 정상화된다. 이들 도면은 LPS-자극 및 라소페린^TM 에의 노출 후 tnfα-1 및 il -1β 유전자 발현 감소를 증명한다.

도 14는 실시예 11에 기술된 바와 같이 4시간 동안 노출 후 세 개체로부터의 말초혈액 단핵구 (PBMC) 내 지질다당류(LPS)에 의해 유도된 cox-1, cox-2, il-1β, tnfα, il-6, nf κb 및 ppar γ의 수준에 대한 라소페린^TM의 효과를 도시한 것이다.

도 15는 nfκb 및 pparγ 유전자 발현 감소의 하향 조절에 의해 영향받은 tnfα, il -1β, il -6 및 cox -2에 대한 프로모터들을 도시한 것이다.

도 16은 실시예 14에 기술된 바와 같은 조건하에서 수행된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물에 대한 고압액체크로마토그래피 (HPLC) 크로마토그램을 도시한 것이다. 상기 기술된 조건들을 사용하여 유리 B-고리 플라보노이드는 11 내지 14 분 사이에 용출되었고, 플라반은 3 내지 5 분 사이에 용출되었다.

도 17은 실시예 14에 기술된 바와 같은 조건하에서 수행된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이다. 상기 기술된 조건들을 사용하여 두 가지 플라반(카테킨 및 에피카테킨)이 4.5 내지 5.5 분 사이에 용출되었고, 프리-비-링 플라보노이드(바칼레인(bacalein) 및 바칼린 (bacalin))가 12 내지 13.5분 사이에 용출되었다. 실시예 15에 기술된 조건하에서, 분리는 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 몰 흡광도(molar absorptivity) 차이에 기초한다.

본 발명은, 신경세포 및 인지 기능에 관련된 질병 및 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 시클로옥시게나아제 (COX) 및 리폭시게나아제 (LOX) 효소 둘 다를 동시에 억제하는데 효과적인 방법을 포함한다. COX 및 LOX 효소들에 대한 동시적 이중 억제를 위한 방법은, 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함한 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에 투여하는 것으로 이루어진다. 이 당해 조성물은 본원에서 라소페린^TM으로 지칭된다. 상기 당해 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 특정 질환 또는 이상의 예방 및 치료에 관한 지시사항 및 특이적 요건에 기초하여 조절될 수 있다.

본원에서는 본 발명의 일면을 지칭하기 위해 다양한 용어가 사용된다. 본 발명의 구성요소의 설명을 명료하게 하기 위해, 하기의 정의가 제공된다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 업계의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다.

용어 "하나" 실재물은 본원에서 사용될 때 하나 이상의 실재물을 의미하며, 예를 들어, 하나의 플라보노이드는 하나 이상의 플라보노이드를 의미함을 유의해야 한다. 이러한 것으로서, "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용되는 "프리-비-링 플라보노이드"는 하기 일반식에 의해 도해되는 바와 같이 방향족 B 고리 상에 치환기를 갖지 않는 특정 부류의 플라보노이드이다:

[화학식 2]

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH₂, -NHR, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,

여기에서,

R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본원에 사용되는 "플라반"은 일반적으로 하기 일반식에 의해 표현될 수 있는 특정 부류의 플라보노이드, 이량체, 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반을 의미한다:

[화학식 3]

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 H, -OH, -SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 및 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에세테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 치환기의 에스테르; 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 선택되며,

여기에서,

R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물, 카아보네이트 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본원에 사용되는 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 포함한다. 치료적으로 사용되는 경우, 사람 및 다른 동물에 적용된다.

"약학적 또는 치료적 유효 투여량 및 유효량"은 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 투여 수준을 의미한다. 그 결과는 질병의 징후, 증상 및 병인의 완화 또는 바람직한 생물계의 임의의 다른 변화일 수 있다. 정확한 투여량은 개체의 연령 및 크기, 질병 및 달성되는 치료를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

"위약"은 활성 물질은 없는, 질병의 징후, 증상 또는 병인을 완화시킬 수 있는 원하는 생물학적 결과를 유도하기에 충분한 약제학적 또는 치료적 유효 투여량 및 유효량의 대체물을 의미한다.

"수용자" 또는 "환자" 또는 "개체"는 치료가 요구되는 살아 있는 포유류, 사람 또는 동물이다. 상기 "수용자", "환자" 또는 "개체"는 일반적으로 본 발명의 방법에 따라 수행되는 치료의 수용자를 의미한다.

"약학적으로 허용가능한 담체"는 본원에서 사용될 때 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 해치지 않고 투여되는 수용자에 독성을 나타내지 않는 임의의 담체를 지칭한다. "약학적으로 허용가능한 담체"의 예로서는 식염수, 즉 링거액, 완충 식염수, 물, 포도당(dextrose) 용액, 혈청 알부민 등의 임의의 표준 약학적 담체 및 정제 및 캡슐 제형물을 위한 기타 부형제 및 보존제가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

"유전자 발현"은 유전자의 mRNA 로의 전사를 지칭한다.

"단백질 발현"은 mRNA의 단백질로의 번역을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바 "RT-qPCR"은 mRNA 분자를 cDNA 분자로 역전사(RT)한 후 형광 리포터와 연결된 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하여 유전자 발현 수준을 정량적으로 평가하는 방법을 지칭한다.

본원의 전체에 걸쳐서 다양한 인용문이 제공되는 것을 유의하여야 한다. 각각의 인용문헌은 참고문헌으로서 전체 내용이 상세하게 본원에 인용되었다.

본 발명은 신경세포 및 인지 기능에 관련된 질병 및 질환의 예방 및 치료에 사용하기 위한, COX 및 LOX 효소 둘 다를 동시에 억제하는데 효과적인 방법을 포함한다. COX 및 LOX 효소들에 대한 동시적 이중 억제를 위한 방법은, 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 포함한 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에 투여하는 것으로 이루어진다. 본원에서 라소페린^TM으로 지칭되는 이 당해 조성물은, 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된, 2003년 4월 30일 출원된 미합중국 특허출원 일련번호 제10/427,746호("Formulation with Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity")에 기술된 바와 같이 또한 유니베스틴^TM(Univestin^TM)이라는 상표명으로 유통되고 있다. 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 0.1:99.9 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다.

스쿠텔라리아 속의 식물들로부터 프리-비-링 플라보노이드를 분리 및 동정하는 것은 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 인용된, 2002년 3월 1일 출원된 미합중국 특허출원 일련번호 10/091,362("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors")에 기술되어 있다. 아카시아 속의 식물들로부터 플라반을 분리 및 동정하는 것은 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 인용된, 2002년 3월 22일 출원된 미합중국 특허출원 일련번호 10/104,477("Isolation of a Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia")에 기술되어 있다.

본 발명은 노화-, 인지기능-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 질병 및 질환의 예방 및 치료에 효과적인 방법을 포함한다. 이들 인지기능 및 신경세포성 질병 및 질환의 예방 및 치료 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 0.1:99.9 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다.

또한, 전구염증성 시토카인-매개 신경세포 및 인지기능의 질병 및 질환을 예방하고 치료하는 방법이 본 발명에 포함되는데, 상기 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것으로 구성된다. 상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 0.1:99.9 의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다.

또한, 노화-, 인지기능-, 신경퇴행성 및 신경염증성-관련 질병 및 질환에서의 두 가지 중요 성분인 TNFα 및 IL-1β를 감소시키는 방법이 본 발명에 포함된다. TNFα 및 IL-1β를 감소시키는 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 혼합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것으로 구성된다. 상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 0.1:99.9 의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90 으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다.

본 발명은 또한 ROS의 감소를 통하여 ROS에 의해 매개되는 질병 및 질환의 예방 및 치료를 위한 방법을 포함한다. ROS는 산화적 스트레스 및 지질 대사의 주 생성물로서, 노화-, 인지기능-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 질병 및 질환에서 현저히 증가될 수 있다. ROS-매개 질병 및 질환을 치료하는 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함한 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 상기 조성물에서 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99.9:0.1 프리-비-링 플라보노이드:플라반 내지 0.1:99.9 의 프리-비-링 플라보노이드:플라반 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다.

마지막으로, 본 발명은 또한, 시토카인 mRNA의 생산을 제어하는 전사인자들의 mRNA 생산을 조절하는 방법 및 cox-1 이 아닌 cox-2 mRNA의 생산을 제어하는 전사인자들의 mRNA 생산을 조절하는 방법을 포함하는, 인지기능 감퇴 및 기타 노화-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 질환들에 연관된 mRNA의 생산을 조절하는 방법을 포함한다. 인지기능 감퇴 및 기타 노화-, 신경퇴행성- 및 신경염증성-관련 질환들에 연관된 mRNA의 생산을 조절하는 방법은 단일 식물 또는 다수의 식물들로부터 합성 및/또는 분리된 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함한 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것으로 이루어진다. 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 99:1 내지 1:99 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비는 약 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 및 10:90으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 한가지 구현예에서, 상기 당해 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비는 약 80:20 이다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 프리-비-링 플라보노이드는 상기 기술된 일반식에 의해 도해된 화합물을 포함한다. 본 발명의 프리-비-링 플라보노이드는 합성 방법에 의해 수득되거나, 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceaee), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 과로부터 추출될 수 있다. 프리-비-링 플라보노이드는 데스모스(Desmos), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸(Oroxylum), 부케나비아(Buchenavia), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라(Cotula), 그나팔리움(Gnaphalum), 헤리치숨(Helichysum), 켄타루레아(Centaurea), 유파토리움(Eupatorium), 박카리스(Baccharis), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 몰사(Molsa), 콜레브루케아(Colebrookea), 스타치스(Stachys), 오리가눔(Origanum), 지지포라(Ziziphora), 린데라(Lindera), 악티노다프네(Actinodaphnee), 아카시아(Acacia), 데리스(Derris), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아(Millettia), 퐁가미아(Pongamia), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스(Artocarpus), 피쿠스(Ficus), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나(Notholaena), 피누스(Pinus), 울무스(Ulmus) 및 알피나(Alpina)를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 고등식물의 속으로부터 분리될 수 있다.

프리-비-링 플라보노이드는 줄기, 줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 여러 부분에서 발견될 수 있다. 프리-비-링 프라보노이드의 분리 및/또는 정제 방법은 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된, 2002년 3월 1일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/091,362호("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors") 및 2003년 4월 30일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/427,746호("Formulation with Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity")에 기술되어 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 플라반은 상기 기술된 일반식에 의해 도해되는 화합물을 포함한다. 본 발명의 플라반은 아카시아 속으로부터 선택된 식물(들)로부터 분리된다. 바람직한 구현에서, 식물은 아카시아 카테츄(A. catechu), 아카시아 콘킨나(A. concinna), 아카시아 파르네시아나(A. farnesiana), 아카시아 세네갈(A. Senegal), 아카시아 스페시오사(A. speciosa), 아카시아 아라비아(A. arabia), 아카시아 카에시아(A. caesia), 아카시아 펜나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata), 아카시아 메아른시이(A. mearrnsii), 아카시아 피크난타(A. picnantha), 아카시아 데알바타(A. dealbata), 아카시아 아우리쿨리포르미스(A. auriculiformis), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia), 아카시아 만기움(A. mangium), 운카리아 감비르(Uncaria gambir), 운카리아 토멘토사(Uncaria tomentosa), 운카리아 아프리카나(Uncaria africana) 및 운카리아 콰비르(Uncaria qabir)로 구성된 군으로부터 선택된다.

플라반은 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 식물의 여러 부분에서 발견될 수 있다. 플라반의 분리 및/또는 정제 방법은 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된 2002년 3월 22일에 출원된 미합중국 특허 출원 제10/104,477호("Isolation of Dual CoX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia)에 기술되어 있다.

본 발명의 한가지 특정 구현예에서, 프리-비-링 플라보노이드는 식물 중 스쿠텔라리아 속의 식물(들)에서 분리된 것이고, 플라반은 식물 중 아카시아 속의 식물(들)에서 분리된 것이다.

본 발명은 COX 및 LOX 효소 활성을 특이적으로 억제하고, 전구염증성 시토카인들의 mRNA 생산 및 ROS 생산을 촉진하는 중요 전사인자들의 하향 조절을 통해 상기 시토카인들을 감소시키며 활성산소종(ROS), 염증성 단백질 및 에이코사노이드에의 노출로 인해 발생되는 신경퇴행, 신경염증 및 누적성 인지기능 감퇴, 장애, 질병 및 질환의 예방 및 치료에 관계된 항산화 특성들을 유지시키는 활성 식물 추출물을 확인하기 위해 여러가지 생체내 인지 과제 및 시험관내 생화학적, 세포적 및 유전자 발현 스크린을 조합하는 전략을 수행한다. 상기 추출물은 또한, mRNA 유전자 발현에 대한 영향력이 있는지에 대해 평가된다. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반은 식품에 대한 첨가 성분으로서 경구적으로 투여될 때 노화 관련 인지기능 감퇴를 예방하는 능력이 있는지 검사되었다.

실시예 1은 각각 아카시아 및 스쿠텔라리아에서 분리된 두 가지 표준화된 추출물을 하나 이상의 부형제(들)와 함께 이용하는 일반적인 라소페린^TM 제조 방법을 개시한다. 표 1과 관련하여, 이 특정 라소페린^TM 뱃치(batch)는 75.7% 의 프리-비-링 플라보노이드 및 10.3% 의 플라반을 포함하여 총 86% 의 활성 성분을 함유하였다. 하나 이상의 부형제(들)를 당해 조성물에 선택적으로 첨가할 수 있다. 상기 첨가되는 부형제의 양은 요구되는 각 성분의 실제 활성 함유량에 기초하여 조절될 수 있다.

라소페린^TM이 인지기능에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 동물 모델을 사용하여 해마-의존적 작업 기억을 평가하는 두가지 특이적 행동 검사인 방사형 수중미로(RAWM) 및 배경 공포 조건화 (CFC) 검사를 수행하였다. 실시예 2는, 방사형 수중미 (RAWM) 검사로 측정된 해마-의존성 인지기능에 대한 라소페린^TM의 영향을 도시한다. 그 결과는 도 1A 내지 1C 에 개시되어 있는데, 이들은 각각 3, 7 또는 34 mg/kg 라소페린^TM이 보충된 식이를 제공받은 노령의 수컷 피셔 344 쥐에 대한 13-주 방사형 수중미로 (RAWM) 검사에서 매일 투여된 라소페린^TM의 효과를 그래프로 도시한다. 정상 식이로 유지된 어린 수컷 피셔 344 쥐는 정상적인 노화 관련 행동 변화에 대한 대조군으로서 이용되었다. 데이터는 시험 회수 대 평균 총오차로 제시되었다(매 검사일에 4 회의 시험을 수행하였다). 도 1A는 1 주 및 2 주동안의 예비 검사 후의 결과를 도시한다(기준선). 도 1B는 5 주 후의 결과를 도시하고(회기 II) 및 도 1C는 11 주 후의 결과를 도시한다(회기 III). 도 1A 내지 1C에 나타난 데이터는 라소페린^TM(7 및 34 mg/kg 투여군)이 노화 관련 기억 장애를 예방한다는 것을 증명한다.

RAWM이 운동 기능 성분을 포함하기 때문에, 투여된 제형물이 관절통 및 불쾌감을 완화시킨다면 이 과제에서 향상을 경험하는 것이 가능하다. 이를 제어하기 위해, 동물이 움직이는 것을 요구하지 않고 따라서 상기 두 과제 모두의 인지 측면을 확인시켜주는 CFC 검사를 또한 수행하였다(상기 CFC 결과를 평가함에 있어서 상기 제형물의 진통 특성을 검사하기 위해 통각수용기 충격 역치가 사용되었다). 실시예 3은 배경 공포 조건화 (CFC) 검사로 측정된 바 해마-의존적 인지기능에 대한 라소페린^TM의 효과를 도시한다. 이 연구에서는 실시예 2에 기술된 바와 같이 60 마리의 수컷 피셔 344 쥐들을 사용하였다. 결과는 도 2에 개시되어 있는데, 이는 3, 7 또는 34 mg/kg 라소페린^TM 으로 보충된 식이가 제공된 노령의 수컷 피셔 344 쥐에서 배경 공포 조건화 검사 전 12 주 동안 매일 투여된 라소페린^TM 의 효과를 도시한다. 정상 식이로 유지된 어린 수컷 피셔 344 쥐는 정상 노화 관련 행동 변화에 대한 대조군으로 이용하였다. 데이터는 투여량 그룹 대 평균 동결반응률 (%) 로 제시되었다. 도 2는 라소페린^TM(7 및 34 mg/kg 투여군)이 노화 관련 손상을 개선한 것을 증명한다.

실시예 4 및 5는 무작위의, 위약-대조된, 이중-블라인드 임상 시험에서 4 주간의 기간에 걸쳐 40 개 개체에 매일 300 mg/1일이 투여된 라소페린^TM 의 인지기능에 대한 효과를 도시한다. 그 결과를 위약으로 처리된 개체들과 비교하였다. 인지적 성취의 측정은 정신운동 속도, 작업 기억 속도(실행 결정, 민첩성 & 유연성) 및 순간 기억력(언어 & 공간 기억 처리)를 평가하는 일련의 웹 기반 인지기능 관리(Cognitive Care) 검사를 사용하여 수행하였다. 연구를 시작하기 전에, 참가자들은 기준선 성과를 확립하기 위해 이틀 연속으로 검사를 수행할 것이 요구되었다. 데이터 분석은 기준선 성과와 처치 후의 성과를 비교한다.

정신운동 속도 또는 육체적 반사는 사람에게 도면이 컴퓨터 화면 상에 나타난 후 가능한 한 빨리 키를 눌러 반응할 것을 요구하는 단순한 반응시간 검사이다.

작업 기억 속도는 단어 및 그림을 동시에 제시하고 사람에게 이들이 동일한지 상이한지를 결정할 것을 요구한다. 반대되는 단서 역시 무작위적으로 제시되고 사람에게 옳은 반응에 반대되는 반응을 하여 옳은 쌍에 대한 반응이 없거나 그 반대로 되도록 할 것을 요구한다. 이 과제는 억제 또는 "학습된 반응의 억제" 및 그 후 상기 반응 속발성(response contingency)의 반대("과제 전환")을 요한다. 한 가지 과제 또는 한 가지 반응 모드에서 또 다른 것으로의 전환 속도는 종종 정신적 유연성 및 고차원적인 인지적 처리능, 및 우수한 결정력과 동등시된다.

순간 기억력은 암기되어야 할 일련의 자극 "표적" 항목들 다음에 "탐침(probe)" 항목이 온다는 점에서 고전적인 스턴버그(Sternberg) 과제와 유사하다. 피검자는 상기 탐침 항목이 이전의 표적 목록의 일원이었는지 결정해야 한다. 개개인의 단기기억능을 평가하기 위하여 목록의 길이를 변화시킬 수 있다. 이 과제에서는 문자들 및 공간적 상태 모두 검사된다.

상기 결과는 도 3 및 도 4에 도시되어 있는데, 각각은 복합적 선택 반응 시간에 대한 라소페린^TM 의 효과를, 반응시간 표준편차(RTSD)에 대한 라소페린^TM 의 효과를 그래프로 나타내고 있다. 반응시간 표준편차는 시험 중의 변동을 나타낸다. 도 3 및 4는 라소페린^TM이 복합적 선택 및 정보로 제시된 과제들에 대한 처리 속도를 증가시킨 것을 증명한다.

실시예 6 은 라소페린^TM을 사용하여 수행된 COX 억제 검정을 기술한다. 상기 생화학적 검정은 COX 의 억제를 측정하는 데 사용되는 것으로서, 헴(heme) 및 아라키돈산의 존재하에서의 단백질의 퍼옥시다제 활성에 의존한다. 라소페린^TM 에 대한 투여량 반응 및 IC₅₀ 결과가 도 5에 나와있다. COX-1에 대한 IC₅₀ 은 0.38 ㎍/mL/효소단위이었고, COX-2에 대한 IC₅₀ 은 0.84 ㎍/mL/단위였다.

실시예 7 은 A. 카테츄에서 분리한 플라반 카테킨을 사용한 LOX 억제 검정을 기술한다. LOX 활성의 억제는 시험관내 리폭시게나아제 스크리닝 검정을 이용하여 평가되었다. 이 검정의 결과는 도 6에 개시되어 있다. 카테킨에 의한 5-LO 억제에 대한 IC₅₀ 은 1.38 ㎍/mL/효소단위인 것으로 측정되었다.

실시예 8은 LOX 경로의 아라키돈산, 즉 LTB4의 분해에 있어서 화합물들의 표적화된 억제를 수행한 세포 검정을 기술한다. 그 결과는 도 7에 나와 있다. 도 7을 참조할 때, 라소페린^TM이 HT-29 세포에서 새로 합성된 LTB₄ 의 80%의 생성을 억제한 것을 알 수 있다. 이부프로펜은 동일 기간 동안에 LTB₄ 양에 있어서 20% 의 감소만을 나타내었다.

실시예 9 는 말초혈액 단핵구 내 LPS에 의해 유도된 TNFα, IL-1β, 및 IL-6 수준에 대한 라소페린^TM의 효과에 대한 측정을 기술한다. 그 결과는 도 8 내지 도 10에 개시되어 있다. 도 8을 참조할 때, 상기 추출물이 세포 배양물의 상층액으로 분비되는 TNFα를 2 내지 100 ㎍/mL 의 다양한 범위의 농도로 실질적으로 감소시킨 것을 알 수 있다. 이들 도면들을 참조할 때, 10 ㎍/mL 농도의 LPS 가 각각 1 시간 및 4 시간 동안의 라소페린^TM과의 공동 배양 후 가장 큰 수준의 TNFα 및 IL-1β 유도를 보였다는 것을 알 수 있다. 상기 추출물은 세포 배양물 상층액으로 분비되는 TNFα 및 IL-1β 를 다양한 범위의 농도로 실질적으로 감소시킨 것을 알 수 있다(도 8 및 도 9 참조). TNFα, IL-1β 및 IL-6은 염증 및 노화-관련 장애 동안 증가하기 때문에, 라소페린^TM은 감작된 염증성 세포들에서 이들 전구염증성 시토카인 및 전사인자들을 감소시킴으로써 이들 장애에 대하여 유의미한 영향을 가질 수 있다.

실시예 10은 라소페린^TM 대 다른 NSAIDS에 의한 cox-2 유전자 억제의 차이를 측정하기 위해 수행된 실험을 기술한다. 반정량적 RT-qPCR 검정에서 cox-1 및 cox-2 mRNA 생산의 억제에 대한 유전자 발현 데이터를 수득하였다. 그 결과는 도 11 내지 도 13에 나와 있다. 도 11을 참조할 때, 라소페린^TM이 cox-1 유전자 발현에는 아무 영향 없이 cox-2 mRNA 생산을 억제한 것을 알 수 있다. 게다가, 다른 cox-2 억제제 약물들과 비교할 때, 라소페린^TM은 LPS에 의해 자극된 cox-1 및 cox-2 유전자 발현 증가를 감소시킬 수 있었다. 중요하게는, 셀레콕시브(celecoxib) 및 이부프로펜 모두 cox-2 유전자 발현을 증가시켰다(도 12). 마지막으로, 도 13A 및 도 13B 를 참조할 때, 라소페린^TM 으로 처리한 경우 tnf α-1 및 il -1 αβ 생산 모두 감소한 것을 알 수 있다.

실시예 11은 실시예 11에 기술된 바와 같이 4시간 동안 노출 후 세 개체로부터의 말초혈액 단핵구 (PBMC) 내 LPS에 의해 유도된 cox-1, cox-2, il -1β, tnf α, il-6, nf κb 및 ppar γ의 수준에 대한 라소페린^TM의 효과를 결정하기 위해 수행된 실험을 기술한다. 결과는 도 14 에 나와 있다. 도 14를 참조할 때, 라소페린^TM 추출물이 모든 mRNA 종에 대한 유전자 발현을 현저히 감소시킨 것을 알 수 있다.

실시예 12는 염증성 유전자들의 프로모터 요소들이 라소페린^TM에 의해 하향 조절될 것을 기술한다. 이 프로모터 요소들은 도 15에 나와 있다.

실시예 13은 산소 라디칼 흡수 능력(ORAC) 검사로 측정된 바 항산화제로서의 라소페린^TM의 유효성을 측정하기 위해 사용된 방법을 기술한다. 상기 ORAC 분석은 형광 표식자로서 플루오레신(fluorescein)을 이용하는 것으로서, 신체에서 발견되는 가장 흔한 활성산소종 중 하나인 과산화 라디칼을 찾아 소거하는 항산화제의 능력을 측정할 수 있다. 그 결과는 표 2에 나와 있는데, 표 2 는 여러 가지의 잘 공지된 식품 기반 항산화제들의 농축액에 대하여 기술한다. 라소페린^TM은 높은 ORAC 점수를 가진다. 사실상, 라소페린^TM의 ORAC는 항산화제인 비타민 C에 필적하며, 따라서 체내 ROS 수준을 효과적으로 감소시킬 것이다.

실시예 14 및 15는 표준화된 추출물 내 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 양을 측정하기 위해 사용되는 두 가지 방법을 기술한다. 그 결과는 도 16 및 도 17에 나와 있다.

하기 실시예들은 예시를 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.

실시예

실시예 1. 아카시아 및 스쿠텔라리아에서 분리한 추출물들로부터 라소페린 ^TM 의 제조

각각 아카시아 및 스쿠텔라리아에서 분리한 2 가지 표준화된 추출물을 하나 이상의 부형제(들)과 함께 사용하여 라소페린^TM을 제형화하였다. 사용된 아카시아 추출물은 카테킨 및 에피카테킨으로서의 플라반을 총 60% 이상 함유하였으며, 스쿠텔라리아 추출물은 프리-비-링 플라보노이드를 70% 이상 함유하였는데, 주로 바이칼린(baicalin)이었다. 상기 스쿠텔라리아 추출물은 표 1에 개시된 바와 같이 다른 소량의 프리-비-링 플라보노이드를 함유하였다. 하나 이상의 부형제(들)을 당해 조성물에 첨가하였다. 플라반 및 프리-비-링 플라보노이드의 비는 COX-2 대 5-LO 억제 및 생성물의 효능 요건에 관한 지시사항 및 특정 요건에 기초하여 조절될 수 있다. 부형제(들)의 양은 각 성분의 실제 활성적인 함량에 기초하여 조절될 수 있다. 생성물의 각 개별 뱃치에 대한 배합표는 생성물의 명세 및 품질 제어(QC) 결과에 기초하여 산출하여야 한다. 생성물 명세를 충족시키기 위하여 2-5% 범위의 추가량의 활성 성분이 추천된다.

표 1은 라소페린^TM(로트 # G1702-COX-2)의 1회 뱃치 동안 생성된 배합표를 나타낸다. 간단히, 프리-비-링 플라보노이드(바이칼린) 함량이 82.2% 인 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리 추출물 (38.5 kg) (로트 # RM052302-01); 총 플라반 함량이 80.4% 인 아카시아 카테츄 수피 추출물 (6.9 kg) (로트 # RM052902-01) 및 부형제 칸덱스(Candex)(5.0 kg)를 조합하여 배합비가 85:15인 라소페린^TM 제형물(50.4 kg)을 제조하였다. 표 1은 이 특정 뱃치의 라소페린^TM(로트 # G11702-COX-2)의 활성 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반에 대한 정량을 제시하는데, 이는, 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된, 2003년 4월 30일 출원된 미합중국 출원 일련번호 제10/427,746호("Formulation With Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity")에 기술된 방법을 사용하여 결정된 것이다.

라소페린 ^TM 제형물의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 함량

활성 성분	함량(%)
플라보노이드
바이칼린	62.5%
소수 플라보노이드
우고닌-7-글루쿠로니드	6.7%
오록실린 A 7-글루쿠로니드	2.0%
바이칼레인	1.5%
우고닌	1.1%
크리신-7-글루쿠로니드	0.8%
5-메틸-우고닌-7-글루쿠로니드	0.5%
스쿠텔라린	0.3%
노르우고닌	0.3%
크리신	<0.2%
오록실린 A	<0.2%
총 프리-비-링 플라보노이드	75.7%
플라반
카테킨	9.9%
에피카테킨	0.4%
총 플라반	10.3%
총 활성 성분	86%

표 1을 참조할 때, 라소페린^TM의 이 특정 뱃치는 75.7% 프리-비-링 플라보노이드 및 10.3% 플라반을 포함하여 총 86%의 활성성분으로 구성되어 있다. 이 배치의 라소페린^TM(50.0 kg)으로부터 캡슐 형태로 된 두 가지 상이한 투여량 수준의 최종 생성물을 제조하였다: 1회분 당 125 mg(60 개 캡슐) 및 1회분 당 250 mg(60 개 캡슐). 동일한 접근법을 사용하여, 각각 배합비가 50:50 및 20:80인 2개의 추가적인 뱃치의 라소페린^TM을 제조하였다.

실시예 2. 해마-의존적 인지기능( RAWM )에 대한 라소페린 ^TM 의 효과

스쿠텔라리아 바이칼렌시스 뿌리에서 분리한 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 아카시아 카테츄 수피에서 분리한 표준화된 플라반 추출물을 배합비 80:20 으로 조합하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 라소페린^TM 제형물(80:20)을 제조하였다[또한 본원에 전체 내용이 참고문헌으로 인용된, 2003년 4월 30일 출원된 미합중국 특허출원 일련번호 제10/427,746호("Formulation with Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity")의 실시예 14 참조]. 해마-의존적 인지기능(RAWM)에 대한 라소페린^TM의 효과를 조사하기 위하여, 방사형 수중미로(RAWM)를 사용하여 60 마리의 수컷 피셔 344 쥐(연령은 하기 나열됨)의 수행능을 평가하였다. 이 검사는 처치 과정 동안의 학습 및 기억의 변화를 측정한다. 실험적 식이를 시작하기 전에 기준선 크기를 결정하고, 실험적 식이의 초반 이후 5 및 11 주차에 검사를 다시 수행하였다. 실시간 조건은 동물의 과제 수행 능력을 증명하고 과제 수행 능력의 차이에 대한 대조군으로 작용한다(예컨대, 운동력, 시력, 동기유발, 등). 지연 조건은 3 및 4 회째의 시험 사이에 4 시간의 지연을 도입하여, 과제를 보다 어렵게 만든다. 노화 관련 기억 장애가 증명되는 것은 지연 조건하에서이다.

동물들. 수컷 피셔 344 쥐들(National Institute on Aging contact colony; Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Ind.) (6 개월차, n=12 및 17 개월차, n=48)을 한 쌍씩 수용하고, 21±1℃에서 12 시간 광주기/암주기로 환경적으로 제어된 챔버내를 유지하고, 음식 및 물을 자유급이 하였다. 어린 및 노령의 대조군 동물들에는 NIH-31(TD 00365; Harlan Teklab, Madison, WI.) 쥐 사료를 제공하였다. 검사군들에는 라소페린^TM(3, 7 또는 34 mg/kg)이 보충된 NIH-31 쥐 사료가 제공되었다. 상기 대조군 식이 및 실험 제형물은 Harlan Teklab에 의해 제조되었고, 압출성형된 펠렛 형태로 동물들에 제공되었다. 상기 연구의 모든 일면 동안 적절한 확인을 보장하기 위하여 상기 쥐들에 마이크로칩을 부착하였다. 동물의 수가 많기 때에, 실험을 30 마리씩의 두 그룹으로 분할하였고, 각 군은 6 마리씩을 포함하였다. 기준선을 수득하기 위해, 실험적 식이를 하기 전에 동물들을 RAWM에서 평가하였다. 최초 RAWM 검사 완료시, 노령의 쥐들을 카운터-밸런스(counter-balanced) 방식으로 4개 군(노령의 대조군, 3, 7, 및 34 mg/kg 라소페린^TM) 중 하나로 할당하여 RAWM 수행에서 각 군이 불분명하도록 하였다. 동물 체중 및 음식 섭취를 주마다 모니터링하여 전반적인 건강 및 음식물 소화를 측정하였다. 각 군들 사이에 이 지표들의 차이는 관찰되지 않았다.

방사형 수중미로 (RAWM). RAWM 는 1.5 m 수조 내 원형 선택 영역(직경 60 cm)에서 방사된 12 개의 아암(arm)(15 cm 너비*43 cm 길이)으로 구성되어 있다. 탈출 플랫폼(10 cm*13 cm)은 물의 표면에서 2 cm 아래에 상기 아암들 중 하나의 끝에 위치하였다. 쥐들을 5 일동안 미로에서 예비훈련시켰다. 예비훈련은 초기에 목표지점이 아닌 아암의 입구를 차단하고 점차 접근가능한 아암의 수를 늘려 12 개를 모두 개방함으로써 상기 동물이 목표 아암을 발견하도록 하는 것으로 구성된다. 그 후, 쥐들을 각 5 일씩인 두 단위 동안 훈련시켰다. 전체 훈련 과정은 3 주를 요하였다. 각 시험에 대한 출발 아암은 11 개의 접근가능한 아암으로부터 유사-임의 방식으로 결정되었다. 주어진 아암은 하루에 한번만 사용되어 매일 4 개의 상이한 출발 아암이 있도록 하였다. 장소 및 위치의 선호를 피하기 위하여, 출발 및 목표 아암은 주어진 날에 한 군 내의 각 동물들에 대해 상이하였고, 군 별로는 동등하였다. 시험 간 30 초 간격을 두면서 1일 당 4회의 시험을 수행하였다(최대 180 초). 쥐가 180초 내에 탈출 플랫폼을 발견하지 못한다면, 천천히 올바른 아암으로 유인하였다. 탈출 플랫폼을 가진 아암으로 들어가기 전에 들어간 아암의 수(오차)를 기록하였다. 6 내지 10일 동안 3 및 4 회째 시험 사이에 3 시간 지연을 도입하였다. 상기 지연 동안, 쥐들을 자신들의 수용소에 위치시켰다. 그 결과는 도 1A 내지 1C 에 나와 있다. 데이터는 시험 회수 대 각 시험에 대한 평균으로 제시되었다.

도 1A 내지 1C를 참조할 때, 모든 회기에서 시험이 진행됨에 따라 총 오차가 현저히 감소하였는데, 이는 쥐들이 상기 과제를 학습할 수 있었음을 나타낸다. 실시간 과제에서는, 수행에 있어서 연령- 또는 약물-관련 차이가 없었다. 지연 과제에서는, 모든 3개 지연 회기(기준선, 회기 II 및 회기 III; 각각 도 1A, 1B 및 1C 참조) 동안 유의미한 노화 영향이 있었다. 노령의 동물들은 어린 대조군들보다 4 회째 시도에서 현저히 나쁘게 수행하였다. 기준선 (도 1A) 및 회기 II (도 1B) 지연 검사 동안 약물에 기인한 영향은 없었다. 그러나, 회기 III 지연 검사(도 1C)에서는 약물에 의한 유의미한 영향이 있었다. 7 및 34 mg/kg 군들은 노령의 대조군들보다 현저히 적은 오차를 기록했다. 이들은 어린 대조군들과 많이 다르지 않았는데, 이는 라소페린^TM이 노화 관련 기억 장애를 예방한 것을 시사한다. 상기 분석은 반복 측정의 이원 분산분석(2-way ANOVA)이다.

실시예 3. 해마-의존적 인지기능( CFC )에 대한 라소페린 ^TM 의 영향

이 연구에서는 실시예 2에 기술된 바와 같이 60 마리의 수컷 피셔 344 쥐들을 사용하였다.

배경 공포 조건화 (CFC). 검사 수행 후 1 주일 후에, 쥐들을 전류 충격기 (Med Associates)에 연결된 격자 바닥 (1.6 cm 간격의 직경 4.8 mm 의 막대)을 가진 상자(30.5 cm*24.1 cm*21 cm, Med Associates, St. Albans, Vt.)에 위치시켰다. 각 쥐들을 상기 상자 내에 위치시키기 전에, 상자를 3% 아세트산으로 세척하였는데, 이는 최초 환경에 대한 특정 냄새분자로 작용하였다. 두 연속 훈련 블럭들을 수행하였다. 각 훈련 블럭은 30 초의 85-dB 백색 잡음 조건화 자극(CS) 및 2초의 0.5 mA 사지충격(US)을 가진 것으로 180초 길이였다. 상기 CS 및 US 는 훈련 블럭의 마지막에 함께 종결되었다. 모든 쥐들이 사지충격에 점프로 반응하였다. 상기 쥐들은 두번째 훈련 블럭 후 30 초간 훈련 상자 내에 남아있었다. 냄새 분자로서 3% 아세트산을 사용하여 동일 기구 내에 동물들을 먼저 위치시킴으로써 훈련 이틀 후 잔류를 검사하였는데, 이때 훈련은 CS 또는 US 없이 5분간 수행되었다. 2 내지 3시간 후, 격자 바닥이 한 조각의 검은 포마이커로 덮인 것을 제외하고는 동일한 챔버 내에 쥐들을 위치시키고, 상기 수용소를 3% 수산화암모늄 (Novel Context) 으로 6분간 세척하고, 그 동안에 CS 를 마지막 3분간 가하였다. 매 10초에 처치 군의 쥐들에 대하여 실험자 블라인드 상황에서 수동적으로 동결반응을 측정하였다. 10초 간격으로 실험자는 쥐가 동결반응을 하는지 평가하였다. 동결반응율은 하기와 같이 계산되었다: 쥐들이 동결반응으로 평가된 간격의 수/총 간격 회수 x 100. 그 결과는 도 2 에 나와 있다.

훈련 맥락에서의 동결반응: 이 분석에서 어린 대조군들과 비교하여 노령의 대조군들에서 통계학상으로 유의미한 동결반응이 있었다(도 2 참조). 7 및 34 mg/kg 투여량의 라소페린^TM은 노화 관련 손상을 개선시켰다. 3 mg/kg 투여량에 있어서는 노화 관련 손상을 개선하는 비-통계학상으로 유의미한 경향이 있었다. 라소페린^TM-처치된 쥐들 중 어느 것도 어린 대조군들과 현저히 차이나지 않았다.

잡음 조건화 자극 (CS)에 대한 동결반응은 비-해마의존성 기억을 측정한다. 이 측정에 관해서는, 상기 군들 간에 동결반응에서의 통계학상으로 유의미한 차이가 없었다(데이터는 제공되지 않음).

신규한 상황에 대한 동결반응은 기준선 동결반응을 측정하는 대조 측정이다. 이 측정치를 얻기 위해, 훈련 정황 동안 일어나는 동결반응의 양과 CS 를 기준선 동결반응과 비교하여 학습이 일어났는지 결정한다. 상기 군들 간에 동결반응에서의 통계학상으로 유의미한 차이가 없었다(데이터는 제공되지 않음).

통각수용기 역치. 상기 기구는 검사 챔버 30.5*25.4*30.5 cm (Coulbourn Instruments, Allenstown, Pa.)로 구성되었다. 상기 챔버의 윗면 및 두 측면은 알루미늄으로 제조되었다. 나머지 두 측면은 투명한 플라스틱으로 제조되었다. 상기 상자를 희미하게 조명하였다(xx 럭스). 바닥은 스테인레스 스틸 막대 (직경 5 mm, 막대간 간격 1.68 cm)로 구성되었다. 정밀 조절 충격기 (Model H12-16, Coulbourn Instruments)로 충격을 전달하였다. 쥐들을 금속 격자 바닥 (격자 차원)을 가진 수용소에 두었다. 실험자로부터의 반대편의 챔버 면에 거울을 위치시켜 관찰을 용이하게 하였다. 실험 시작 전에 모든 쥐들에 2 분의 습관화 기간을 주었다. 일련의 충격을 시작하기 전에 격자 바닥을 스틸 울(steel wool) 및 물로 세척한 후 각 쥐들을 챔버에 2분간 위치시켰다. 각 충격 펄스는 0.5초간 지속되었고, 약 10초 간격으로 충격을 전달하였다. 대수적으로 나열된 20 개 단계들에서 충격 강도는 0.05 내지 4.0 mA 이었다. 역치를 결정하는데 풀 레인지(full range)를 사용하지는 않았다. 예비 관찰로부터 역치가 발견되는 강도의 범위를 추정하였다. 이 범위들의 중간지점을 실험들에서 초기 강도로 이용하였다. 위축은 한쪽 발을 들어올리는 것으로 정의되었고 점프는 3개 이상의 발의 빠른 움직임으로 정의되었으며, 둘 다 바닥으로부터 물러나는 것을 요구하였다. 작은 표본들에 대한 "상하" 방법의 적응을 각 일련의 충격 동안 충격 강도 제시의 순서를 결정하는데 사용하였다.

상기 과정의 단계들은 하기와 같았다: 1) 첫번째 시리즈는 치료의 관찰을 위해 위축 또는 점프 역치에 가능한 한 가까운 충격 강도로 시작하였다; 2) 충격 강도 감소(0.1 log₁₀ 단위)에 따라 반응(위축 또는 점프)이 일어나고, 충격 강도 증가 (0.1 log₁₀ 단위)에 따라서는 반응이 일어나지 않도록 하는 일련의 시험들을 수행하였다. 행동 변화가 일어날 때까지 각 시리즈 내에서 시험들을 지속하고, 그 후 4 회 시험 후 종료하였다. 추정된 중간 유효 강도(EI₅₀)를 식 EI₅₀ = Xf + kd 로 계산하였는데, 이때 Xf 는 가해진 마지막 강도이고, k 는 Dixon 참조문헌[Dixon (1965) J. Am. Stat. Assoc. 60:47-55]의 표 1 의 값이고, 및 d 는 충격 강도 사이의 로그 간격이다. 위축 역치를 평가하기 위하여 2 회의 일련의 충격을 수행하였고, 그 후 2 회의 일련의 충격으로 점프 역치를 평가하였다. 이 검사는 배경 공포 조건화 행동 패러다임에서 주어진 강도에 대해 제어하고, 이와 관련된 별도의 결과를 갖지 않는다.

실시예 4. 처리 속도에 대한 라소페린 ^TM 의 영향

인지기능에 대한 라소페린^TM의 영향을 평가하기 위하여, 인지기능이 손상되지 않은 35 내지 65 세의 개인들에서 4 주간에 걸쳐 일련의 검사를 수행하였다. 각 개인들을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 라소페린^TM 제형물(80:20) 300 mg/1일로 처치하였다. 정신운동 속도, 작업 기억 속도(실행 결정, 민첩성 & 유연성) 및 순간 기억력(언어 & 공간 기억 처리)을 평가하는 일련의 웹 기반 인지기능 관리 검사를 이용하여 인지적 성취의 크기를 수득하였다. 연구를 시작하기 전에, 기준선 성취를 확립하기 위하여 참가자들은 이틀 연속으로 검사를 수행하도록 요구되었다. 데이터 분석은 기준선 성취를 처치 후의 성취와 비교한다. 처치된 개인들에 대하여 주마다 식이 보충으로의 처치가 인지기능 변화를 일으키는지를 측정하는 검사를 수행하였다. 데이터 분석은 처치된 개인들의 성취를 동일 기간 동안 위약이 제공된 개인들과 비교한다. 기준선 및 모든 투여 주간 동안 검사를 완료한 대상자들만 분석에 포함하였다. 검사 회기를 무효화할 수 있는 주의 산만 또는 웹/컴퓨터 "고장"에 기인할 수 있는 비정상적인 결과를 배제하기 위하여 검사 평균에서 2 이상의 표준편차를 기록한 사람들 및 다른 검사 수치와 내부적으로 일치하지 않는 사람들을 제외하였다. 검사 기간들 동안의 변화의 반복수치 분석(ANOVA), 기준선과 최종 검사 주간 비교, 적절한 사후검정으로 데이터를 분석하였다.

정신운동 속도 또는 육체적 반사는 대상자에게 도면이 컴퓨터 화면 상에 나타난 후 가능한 한 빨리 키를 눌러 반응할 것을 요구하는 단순한 반응시간 검사이다. 정신운동 과제에 대한 모든 연령의 전체적인 수행능은 매우 안정적이었고, 평균, 중앙 또는 표준편차 수치(p>0.05) 에 있어서 각 군간 유의미한 차이는 나타나지 않았다. 따라서, 상기 정신운동 속도 검사는 처치군 및 대조군 사이에 아무런 차이를 나타내지 않았다. 그러나 검사 기간동안 모든 군에서 일반화된 성취능 향상이 있었다.

복합적 선택 반응시간 과제인 작업 기억 속도는 단어 및 그림을 동시에 제시하고 사람에게 이들이 동일한지 상이한지를 결정할 것을 요구한다. 반대되는 단서 역시 무작위적으로 제시되고 사람에게 옳은 반응에 반대되는 반응을 하여 옳은 쌍에 대한 반응이 없거나 그 반대로 되도록 할 것을 요구한다. 이 과제는 억제 또는 "학습된 반응의 억제" 및 그 후 상기 반응 속발성의 반대("과제 전환")를 요한다. 한 가지 과제 또는 한 가지 반응 모드에서 또 다른 것으로의 전환 속도는 종종 정신적 유연성 및 고차원적인 인지적 처리능 및 우수한 결정력과 동등시된다. 이 검사의 인지적 측면은 처리 속도, 지속적인 주의력, 인지적 유동성 및 복합적이고 노력을 요하는 인지 과제에서 올바르게 빠른 결정을 내리는 능력을 포함한 실행적 인지기능을 평가할 수 있다.

순간 기억력은 암기되어야 할 일련의 자극 "표적" 항목들 다음에 "탐침" 항목이 온다는 점에서 고전적인 스턴버그 과제와 유사하다. 대상자는 상기 탐침 항목이 이전의 표적 목록의 일원이었는지 결정해야 한다. 개개인의 단기기억능을 평가하기 위하여 목록의 길이를 변화시킬 수 있다. 이 과제에서는 문자들 및 공간적 상태 모두 검사된다.

상기 결과는 도 3 에 나와 있는데, 도 3 은 라소페린^TM이 선택의 정확도의 손상없이 인지적 처리(결단) 속도를 증가시키고, 따라서 인지적 노력이 요구되거나 복합적인 선택 상황들에 대한 반응 속도를 향상시킬 수 있음을 증명한다.

실시예 5. 반응시간 표준편차로 측정되는 바 집중력 및 주의력에 대한 라소페린 ^TM 의 영향

인지기능에 대한 라소페린^TM의 영향을 평가하기 위하여, 인지기능이 손상되지 않은 35 내지 65 세의 개인들을 대상으로 실시예 4 에 기술된 바와 같이 4 주간에 걸쳐 일련의 검사를 수행하였다. 반응시간 표준편차 (RTSD)는 종종 주의력 측정 단위로서 사용되며, 인지과학에서는, 일반적으로 처리 효율 및 신경 잡음을 반영하는 것으로 간주된다(Jensen). 도 4를 참조할 때, 4주간의 검사 기간 동안 RTSD 에 있어서 유의미한 향상이 있었음을 알 수 있다. 즉, 라소페린^TM이 투여된 대상자들에 있어서 기준선에서 4주차까지 상기 표준편차가 감소되었다. 위약이 투여된 대상자들 또한 향상을 나타내었으나, 동일 수준까지는 아니었다. 이는 상기 효과가 단순 학습에 의해 상기 검사를 더 잘 수행한 것이라기 보다는 라소페린^TM 처치로 강화된 과제 수행능의 일관성 향상에 기인한 것임을 시사한다. 이 결과는라소페린^TM이 지속적인 주의력을 증가시켜 인지적 노력을 요하는 또는 복잡한 선택 상황에 대한 반응의 일관성을 향상시킬 수 있음을 시사한다.

실시예 6. 라소페린 ^TM 에 의한 COX -1 및 COX -2 억제

하기 방법을 이용하여 라소페린^TM의 IC₅₀ 에 대한 측정을 수행하였다. 보조인자로서의 아라키돈산의 존재하에서 각 효소의 퍼옥시다제 활성을 가시화하기 위하여 절개가능한 과산화물 발색단을 상기 검정에 포함시켰다. 전형적으로, 상기 검정을 96-웰 판에서 수행하였다. 100% DMSO 중의 10 mg/mL 스탁(stock)으로 취해진 각 억제제를 하기 농도 범위로써 실온에서 3 회 검사하였다: 0, 0.1, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 및 500 ㎍/mL. 각 웰에, 150 ㎕ 의 100 mM Tris-HCl(pH 7.5) 을, 트리스 완충액 중에 희석된 10 ㎕ 의 22 μM 헤마틴(Hematin), DMSO 중에 희석된 10 ㎕ 의 억제제 및 25 효소단위의 COX-1 또는 COX-2 효소 중 하나과 함께 첨가하였다. 성분들을 회전 플랫폼 상에서 10 초간 혼합한 후, 20 ㎕ 의 2 mM N,N,N'N'-테트라메틸-p-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(TMPD) 및 20 ㎕ 의 1.1 mM AA 를 첨가하여 반응을 개시하였다. 상기 플레이트를 10 초간 교반한 후, 5 분간 배양하고, 570 nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 억제제 농도 대 억제율을 도해하고, 등온선을 따라 최대값의 반이 되는 지점을 취하고 x-축에 대하여 농도를 나타냄으로써 IC₅₀ 을 측정하였다. 그 후 IC₅₀ 을 검정 내의 효소 단위들의 수에 대하여 정상화하였다. 라소페린^TM 에 대한 투여량 반응 및 IC₅₀ 결과는 도 5에 제시된다.

실시예 7. A. 카테츄에서 분리한 카테킨에 의한 5- 리폭시게나아제 (5- LO )의 억제

상기 염증성 반응에 포함된 가장 중요한 경로 중 하나는, 비-헴의 철-함유 리폭시게나아제(5-LO, 12-LO, 및 15-LO)에 의해 생성되는데, 이들은 산소 분자가 아라키돈산 (AA) 등의 지방산에 첨가되어 수산화과산화물인 5-, 12- 및 15-HPETE 를 생성하는 것을 촉매하며, 이들은 그 후 류코트리엔으로 전환된다. A. 카테츄로부터의 플라반 추출물이 어느 정도의 5-LO 억제를 제공하여 5-HPETE의 형성을 예방할 수 있다는 초기의 지표가 있었다. 리폭시게나아제 억제제 스크리닝 검정 키트 (Cayman Chemical, Inc., Cat # 760700)를 사용하여 A. 카테츄로부터의 상기 정제된 플라반 카테킨이 시험관내에서 5-LO을 직접적으로 억제하는지 평가하였다. 미세여과법을 이용하여 완충액을 인산에서 트리스-기반 완충액으로 교환한 후, 상기 키트에 정상적으로 사용되는 대두의 15-LO 를 감자 5-LO로 대체하였다. 이 검정은 산소 감지 크로마겐을 통하여 수산화과산화물의 형성을 검출한다. 간단히 말해, 90 ㎕ 의 0.17 효소단위/㎕ 감자 5-LO, 20 ㎕ 의 1.1 mM AA, 100 ㎕ 의 산소-감지 크로마겐 및 1 ㎕ 의 정제된 플라반 억제제를 최종 농도가 0 내지 500 ㎍/mL 범위가 되도록 첨가하여 상기 검정을 3회 수행하였다. 결과는 도 6 에 나와 있다. 카테킨으로부터 5-LO 억제에 대한 IC₅₀ 은 1.38 ㎍/mL/효소단위인 것으로 측정되었다.

실시예 8. 라소페린 ^TM 처치 후의 LTB ₄ 수준 측정

S. 바이칼렌시스 뿌리로부터의 표준화된 프리-비-링 플라보노이드 추출물 및 A. 카테츄 수피로부터의 표준화된 플라반 추출물을 80:20 라소페린^TM의 배합비로 사용하여 실시예 1 에 개요된 바와 같이 라소페린^TM 제형물을 제조하였다. 라소페린^TM 및 또 다른 공지된 5-LO 억제제인 이부프로펜을, COX-1, COX-2 및 5-LO 를 발현하는 단핵구 세포주인 HT-29 세포에 3 ㎍/mL 로 첨가하고 37℃의 습한 환경에서 5% CO₂ 와 함께 48 시간동안 배양하였다. 각 처치된 세포주를 그 후 원심분리로 수확하고, 생리적 용해 완충액 중에서 적당한 균질화로 파괴시켰다. LTB₄ (LTB₄; Neogen, Inc., Cat # 406110) 에 대하여 경쟁적 ELISA 를 이용하여, 5-LO 경로에 대한 라소페린^TM 억제 효과의 측정으로서, 각 세포주 내 새로 합성된 LTB₄ 수준에 대한 라소페린^TM의 효과를 평가하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 160,000 내지 180,000 개 세포를 첨가하여 상기 검정을 2회 수행하였다. 결과는 도 7 에 나와 있다. 도 7 에 나타난 바와 같이, 라소페린^TM 은 HT-29 세포 내에서 새로 합성된 LTB₄ 의 생성을 80% 억제하였다. 이부프로펜은 같은 기간동안 단지 20% 의 LTB₄ 양의 감소를 보였다.

실시예 9. 말초혈액 단핵구에서 LPS 에 의해 유도되는 TNF α 및 IL -1β의 수준에 대한 라소페린 ^TM 의 효과

Histopaque 구배 (Sigma) 를 이용하여 인간 수혈자로부터 말초혈액 단핵구 (PBMC)를 분리하였다. 상기 세포들을 그 후 1% 소 혈청 알부민이 보충된 RPMI 1640 에서 약 12 시간 동안 배양한 후, 증가된 농도의 지질다당류(LPS)로 처리하여 다양한 농도의 라소페린^TM (80:20)의 존재하에서 염증을 유도하였다. 그 결과는 도 8 내지 도 10 에 나와 있다.

실시예 10. 라소페린 ^TM 대 다른 NSAID 들에 의한 cox -1이 아닌 cox -2 유전자 발현에 대한 억제의 차이

라소페린^TM 이 게놈 수준에서 작용하는지 평가하기 위하여, 분리된 인간 말초혈액 단핵구(PBMC)를 지질다당류(LPS)로 자극하고, 라소페린^TM, 셀레콕시브, 이부프로펜 또는 아세트아미노펜으로 처리하고, 그 후 생산된 전체 RNA 를 수집하여 반정량적 RT-qPCR로 평가하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트 내에 각 웰당 130,000 개 세포를 첨가하여 검정을 수행하였다. 그 후 세포들을 10 ng/mL LPS 로 자극하고, 1, 3, 10, 30 및 100 ㎍/mL의 라소페린^TM 및 3 ㎍/mL 의 셀레콕시브, 이부프로펜 및 아세트아미노펜과 함께 37℃의 습한 환경에서 5% CO₂ 와 함께 18 시간동안 공동-배양하였다. 그 후 상기 조건 처리된 각 세포를 원심분리로 수확하고, TRIzol

시약 (Invitrogen^TM Life Technologies, Cat # 15596-026) 및 추천되는 TRIzol

시약 제조자 프로토콜을 이용하여 생성된 전체 RNA 를 분리하였다. 전체 RNA를 무작위 헥사머 (Promega Corp., Cat#C1181) 및 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (M-MLV RT; Promega Corp., Cat # M1701)를 사용하여 역전사하였다. 18S rRNA 내부표준 및 유전자 특이적 검정에 대해 미리 개발된 입증된 Assays-on-Demand 산물 (AOD, Applied Biosystems, Inc., Cat # 4331182)을 이용하여 ABI Prism

7700 유전자 분석 시스템(Sequence Detection System)으로 qPCR 실험을 수행하였다. 유전자 특이적 발현 수치를 이들 각각의 18S rRNA 유전자 발현 수치(내부 대조군)로 표준화한 후, 무 LPS 무약물 처치 조건을 100으로 보정하였다. 처치 조건들은 이 널(null) 조건에 비례한다. 라소페린^TM 은 cox-2 의 정상화된 유전자 발현을 100배 이상 감소시킨 반면, cox-1 정상화된 유전자 발현은 거의 변화를 나타내지 않았다. 동일 처치 조건 하에서, 정상화된 TNFα 유전자 발현은 6배 감소하였고, 정상화된 IL-1β 유전자 발현은 100배 이상 감소하였다. PBMC를 3 ㎍/mL 라소페린^TM, 셀레콕시브, 이부프로펜 또는 아세트아미노펜으로 처치한 경우, 라소페린^TM 만이 cox-2 의 유전자 발현을 증가시키지 않았다. 이 작업은 단백질 수준의 변화를 평가하기 위하여 ELISA-기반 검정과 연결되었고, 단백질 기능 변화를 평가하기 위하여 효소 기능 검정과 연결되었다. 이 연구들의 결과, 라소페린^TM 처치 후의 게놈 및 단백질 관련 효과가 입증되었다. 상기 문헌에 인용된 다른 연구들은 단백질 특이적 방법들을 사용하여, 유전자 발현을 직접적으로 보여주기 보다는 이를 추론하였다. 그 결과는 도 11 내지 도 13 에 나와 있다.

실시예 11. 라소페린 ^TM 에 의한 중요 염증성 단백질의 mRNA 의 하향 조절

인간 수혈자로부터의 PBMC(지역 혈액 은행에서 수득)를 히스토파크(Histopaque) 구배 (Sigma)를 사용하여 분리하였다. 그 후, 세포를 1% 소 혈청 알부민이 보충된 RPMI 1640에서 24 시간 동안 배양한 후, LPS (10 ㎍/mL) 및 증가된 농도의 라소페린^TM (80:20)으로 처리하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트 내에 각 웰당 130,000 개 세포를 첨가하여 검정을 수행하였다. 그 후 세포들을 10 ㎍/mL LPS 로 자극하고, 100 ㎍/mL의 라소페린^TM 과 함께 37℃의 습한 환경에서 5% CO₂ 와 함께 18 시간동안 공동-배양하였다. 그 후 상기 조건 처리된 각 세포를 원심분리로 수확하고, TRIzol

시약 (Invitrogen^TM Life Technologies, Cat # 15596-026) 및 추천되는 TRIzol

시약 제조자 프로토콜을 이용하여 생성된 전체 RNA 를 분리하였다. 전체 RNA를 무작위 헥사머 (Promega Corp., Cat#C1181) 및 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (M-MLV RT; Promega Corp., Cat # M1701)를 사용하여 역전사하였다. 18S rRNA 내부표준 및 유전자 특이적 검정에 대해 미리 개발된 입증된 Assays-on-Demand 산물 (AOD, Applied Biosystems, Inc., Cat # 4331182)을 이용하여 ABI Prism

7700 유전자 분석 시스템(Sequence Detection System)으로 qPCR 실험을 수행하였다. 유전자 특이적 발현 수치들을 이들 각각의 시클로필린(cyclophylin) A mRNA 유전자 발현 수치 (내부 대조군)로 표준화하고 그 후 무 LPS 무약물 처치 조건을 100으로 보정하였다. 처치 조건들은 이 널(null) 조건에 비례한다. 결과는 도 14에 나와 있다.

도 14를 참조할 때, 라소페린^TM 은 cox- 2 의 정상화된 유전자 발현을 평균 3배 감소시킨 반면, cox-1의 정상화된 유전자 발현은 거의 변화를 나타내지 않았다. 동일 처치 조건 하에서, 정상화된 tnf α 유전자 발현은 평균 3배 감소하였고, 정상화된 il -1β 유전자 발현은 평균 45배 감소하였고, 정상화된 il -6 유전자 발현은 평균 37배 감소하였다. 상기 문헌에 인용된 다른 연구들은 단백질 특이적 방법들을 사용하여, 도 14 에 제시된 바와 같이, 유전자 발현을 직접적으로 보여주기 보다는 이를 추론하였다.

실시예 12. 라소페린 ^TM 에 의한 염증성 유전자들의 프로모터 요소들의 하향 조절

염증성 유전자들인 tnf α, il -1β, il -6 및 cox -2 에 대한 프로모터 영역들은 모두, 세포들이 라소페린^TM으로 처치될 때의 유전자 발현의 하향 조절을 설명할 수 있는 NFκB 결합부위를 포함한다. cox-2 프로모터 영역은 또한 레티노이드(retinoid) X 수용체 전사 단백질과 상호작용하는 PPARγ 반응 요소 (PPRE)를 포함한다. 라소페린^TM은 pparγ 유전자 발현을 하향 조절하는데, 이는 아마도 PPARγ 단백질을 감소시켜, 상호작용으로 cox -2 유전자 발현을 자극할 수 없도록 하는 것으로 여겨진다. 게다가, 라소페린^TM은 또한 nf κb 유전자 발현도 하향 조절한다. 따라서, 상기 화합물은 cox-2 유전자 발현에 뿐 아니라 아마도 COX-2 단백질 생산에도 영향을 주는 두 가지 전사인자들을 공격한다. 이 프로모터 요소들은 도 15에 나와 있다.

실시예 13. 라소페린^TM의 산소 라디칼 흡수 능력 (ORAC) 측정

문헌 [Cao et al. (1994) Free Radic. Biol. Med. 16:135-137 및 Prior and Cao (1999) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 220:255-261]에 기술된 실험 절차를 이용하여, 여러 가지 잘 공지된 식품 기반 항산화제들과 비교하여 라소페린^TM의 산소 라디칼 흡수 능력 (ORAC) 에 대하여 검사하였다. 상기 ORAC 분석은 형광 표식자로서 플루오레신을 이용하는데, 이는 신체에서 발견되는 가장 흔한 활성산소종 중 하나인 과산화 라디칼을 찾아 소거하는 항산화제의 능력을 측정할 수 있다. ORAC_hydro 는 수용성 항산화 능력을 반영하고, ORAC_lipo 는 지용성 항산화 능력을 나타낸다. 수용성 비타민 E 유사체인 트롤록스(Trolox)는 검정 표준으로 사용되고 결과는 그램(g)당 마이크로몰(μmole) 트롤록스 당량(TE)으로 표현된다. 라소페린^TM은 5,604 μmole TE/g의 ORAC_total에 있어서 ORAC_hydro 가 5,517 μmole TE/g 이고, ORAC_lipo 가 87 μmole TE/g 이다. 그 결과는 표 2에 나와 있으며, 표 2는 라소페린^TM 이 비타민 C 에 필적하는 ORAC 를 가지며, 따라서 체내 ROS 수준을 감소시킬 것임을 나타낸다.

보통의 항산화제들과 라소페린^TM 간 ORAC 비교

시료명	ORAC (μ mole TE /g)
비타민 C(수용성)	5,000
비타민 E (지용성)	1,100
라소페린 분말	5,517
포도 농축액	133
체리 농축액	79
크랜베리(Cranberry) 농축액	90
블루베리 농축액	125

실시예 14. 역상 고압액체크로마토그래피(HPLC)에 의한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물의 정량화 (방법 1)

80%:20% 메탄올:테트라히드로퓨란 중의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물(20 ㎕ 의 1.13 mg/mL 표준화된 추출물)을 Phenomenex Luna C-18 컬럼 (250*4.6 mm, 비드 크기 5 μm)상에 로딩하고, 1.0 mL/min, 선형의 80% A 내지 20% A 구배로 35℃ 에서 19 분간 용출하였다(A=0.1% (v/v) 인산; B=아세토니트릴). 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 조건에서 프리-비-링 플라보노이드(바칼레인 및 바칼린)는 11 내지 14 분 사이에 두드러진 피크로 용출되었고, 플라반(카테킨 및 에피카테킨)은 약 3 내지 5 분에 작은 피크로 용출되었다. 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반의 양은 각 곡선 아래의 영역을 측정하고 공지된 표준들과 비교하여 결정되었다.

실시예 15. 역상 등용매 ( Isocratic ) HPLC 에 의한 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물의 정량화 (방법 2)

80%:20% 메탄올:물 중의 프리-비-링 플라보노이드 및 플라반 혼합물(20 mL 의 3.55 mg/mL 표준화된 추출물)을 Phenomenex Luna C-18 컬럼 (250*4.6 mm, 비드 크기 5 mm)상에 로딩하고, 80% A 로 35℃ 에서 등용매적으로 용출하였다(A=0.1% (v/v) 인산; B=아세토니트릴). 도 17에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 조건하에서 두 가지 플라반(카테킨 및 에피카테킨)이 약 4.5 내지 5.5 분에 용출되었고, 프리-비-링 플라보노이드(바칼레인 및 바칼린)는 12 내지 13.5 분 사이에 세척시에 용출되었다. 플라반 피크들의 정량화는 실시예 14에 기술된 바와 같이 수행되었다.

Claims (57)

1. 하나 이상의 프리-비-링 플라보노이드와 하나 이상의 플라반의 혼합물을 포함하는 유효량의 약제 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함하여, 시클로옥시게나아제(COX) 및 리폭시게나아제(LOX) 매개 피부 질환 및 질병을 예방하고 치료하기 위한 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비가 99:1 내지 1:99로부터 선택되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비가 약 80:20인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 하기 일반식을 갖는 화합물로 구성된 군으로 선택되는 방법:

   [화학식 2]

   

   상기 식에서,

   R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH₂, -NHR, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

   여기에서,

   R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

   X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카아보네이트를 포함하는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
5. 제1항에 있어서, 상기 플라반이 하기 일반식을 갖는 물질로 구성된 군으로부 터 선택되는 방법:

   [화학식 3]

   

   상기식에서,

   R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 H, -OH, -SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 및 각각 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에스테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르로 구성된 군으로 부터 독립적으로 선택되는 치환기의 에스테르; 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 황 글리코사이드; 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

   여기에서,

   R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

   X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플 루오르화물 및 카아보네이트를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
6. 제1항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 유기 합성에 의해 수득되거나 식물로부터 단리되는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부로 구성된 군으로 선택되는 식물 부분으로부터 단리되는 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물과로부터 단리되는 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 데스모스( Desmos ), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸( Oroxylum ), 부케나비아( Buchenavia ), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라( Cotula ), 그나팔리움( Gnaphalium ), 헤리치숨( Helichrysum ), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움 ( Eupatorium ), 박카리스( Baccharis ), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아( Scutellaria ), 몰사( Molsa ), 콜레브루케아( Colebrookea ), 스타치스(Stachys), 오리가눔( Origanum ), 지지포라( Ziziphora ), 린데라( Lindera ), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스( Derris ), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아( Millettia ), 퐁가미아( Pongamia ), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스( Artocarpus ), 피쿠스( Ficus ), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나( Notholaena ), 피누스( Pinus ), 울무스( Ulmis ) 및 알피니아(Alpinia)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물속으로부터 단리되는 방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 플라반이 아카시아 카테츄(Acacia catechu ), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna ), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana ), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa ), 아카시아 아라비카(Acacia arabica ), 아카시아 카에시아(A. caesia ), 아카시아 펜나타(A. pennata), 에이. 시누아타(A. sinuata ), 에이. 메아른시이(A. mearnsii ), 아카시아 피크난타(A. picnantha ), 아카시아 데알바타(A. dealbata ), 아카시아 아우리쿨리포르미스(A. auriculiformis ), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia ) 및 아카시아 만기움(A. mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된 식물종으로부터 단리되는 방법.
11. 제6항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 스쿠텔리아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반이 아카시아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되는 방법.
12. 제1항에 있어서, 조성물이 체중 기준으로 0.001 내지 200㎎/kg에서 선택된 1회분 투여량으로 투여되는 방법.
13. 제1항에 있어서, 투여 경로가 경구, 국부, 좌약, 정맥내 및 피하, 장내, 근내, 복강내 및 정맥내 투여로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
14. 제1항에 있어서, 약제 조성물이 국부 도포용으로 약제학적, 피부학적 및 미용적으로 적합한 통상적인 부형제 및 임의적으로 보조제, 및/또는 담체 및/또는 규 칙적 또는 조절 방출 비히클을 추가로 포함하는 방법.
15. 하나 이상의 프리-비-링 플라보노이드와 하나 이상의 플라반의 혼합물을 포함하는 유효량의 약제 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함하여, 기억 및 인지기능 손상 및 신경퇴행성 질환을 예방하기 위한 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비가 99:1 내지 1:99로부터 선택되는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비가 약 80:20인 약제 조성물.
18. 제15항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 하기 일반식을 갖는 화합물로 구성된 군으로 선택되는 약제 조성물:

    [화학식 2]

    

    상기 식에서,

    R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH₂, -NHR, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

    여기에서,

    R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

    X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카아보네이트를 포함하는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
19. 제15항에 있어서, 상기 플라반이 하기 일반식을 갖는 화합물, 이량체, 삼량 체 및 다른 중합된 플라반으로 구성된 군으로부터 선택되는 약제 조성물:

    [화학식 3]

    

    상기식에서,

    R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 H, -OH, -SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 및 각각 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에세테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르로 구성된 군으로 부터 독립적으로 선택되는 치환기의 에스테르; 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

    여기에서,

    R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

    X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플 루오르화물 및 카아보네이트를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
20. 제15항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 유기 합성에 의해 수득되거나 식물로부터 단리되는 약제 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부로 구성된 군으로 선택되는 식물 부분으로부터 단리되는 약제 조성물.
22. 제20항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물과로부터 단리되는 약제 조성물.
23. 제20항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 데스모스( Desmos ), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸( Oroxylum ), 부케나비아( Buchenavia ), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라( Cotula ), 그나팔리움( Gnaphalium ), 헤리치리숨( Helichrysum ), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움 ( Eupatorium ), 박카리스( Baccharis ), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아( Scutellaria ), 몰사( Molsa ), 콜레브루케아( Colebrookea ), 스타치스(Stachys), 오리가눔( Origanum ), 지지포라( Ziziphora ), 린데라( Lindera ), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스( Derris ), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아( Millettia ), 퐁가미아( Pongamia ), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스( Artocarpus ), 피쿠스( Ficus ), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나( Notholaena ), 피누스( Pinus ), 울무스( Ulmis ) 및 알피니아(Alpinia)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물속으로부터 단리되는 약제 조성물.
24. 제20항에 있어서, 상기 플라반이 아카시아 카테츄(Acacia catechu ), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna ), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana ), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa ), 아카시아 아 라비카(Acacia arabica ), 아카시아 카에시아(A. caesia ), 아카시아 펜나타(A. pennata), 아카시아 시누아타(A. sinuata ), 아카시아 메아른시이(A. mearnsii ), 아카시아 피크난타(A. picnantha ), 아카시아 데알바타(A. dealbata ), 아카시아 아우리쿨리포르미스(A. auriculiformis ), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia ) 및 아카시아 만기움(A. mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된 식물종으로부터 단리되는 약제 조성물.
25. 제20에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 스쿠텔리아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반이 아카시아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되는 약제 조성물.
26. 제15항에 있어서, 조성물이 체중 기준으로 0.001 내지 200㎎/kg에서 선택된 1회분 투여량으로 투여되는 약제 조성물.
27. 제15항에 있어서, 투여 경로가 경구,국부, 좌약, 정맥내 및 피내, 장내, 근내, 복막내 및 정맥내 투여로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
28. 제15항에 있어서, 약제 조성물이 국부 도포용으로 약제학적, 피부학적 및 미용적으로 적합한 통상적인 부형제 및 임의적으로 보조제, 및/또는 담체 및/또는 규칙적 또는 조절 방출 비히클을 추가로 포함하는 방법.
29. 하나 이상의 프리-비-링 플라보노이드와 하나 이상의 플라반의 혼합물을 포함하는 유효량의 약제 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함하여, 전구염증성 시토카인의 발현을 동시에 억제시키는 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비가 99:1 내지 1:99로부터 선택되는 약제 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-고리 플라보노이드 대 플라반의 비가 약 80:20인 약제 조성물.
32. 제29항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 하기 일반식을 갖는 화합 물로 구성된 군으로 선택되는 방법:

    [화학식 2]

    

    상기 식에서,

    R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH₂, -NHR, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

    여기에서,

    R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

    X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카아보네이트를 포함하는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
33. 제29항에 있어서, 상기 플라반이 하기 일반식을 갖는 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 방법:

    [화학식3]

    

    상기식에서,

    R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 H, -OH, -SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 및 각각 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에스테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르로 구성된 군으로 부터 독립적으로 선택되는 치환기의 에스테르; 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 황 글리코사이드; 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

    여기에서,

    R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

    X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카아보네이트를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
34. 제29항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 유기 합성에 의해 수득되거나 식물로부터 단리되는 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부로 구성된 군으로 선택되는 식물 부분으로부터 단리되는 방법.
36. 제34항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물과로부터 단리되는 방법.
37. 제34항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 데스모스( Desmos ), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸( Oroxylum ), 부케나비아( Buchenavia ), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라( Cotula ), 그나팔리움( Gnaphalium ), 헤리치숨( Helichrysum ), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움 ( Eupatorium ), 박카리스( Baccharis ), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아( Scutellaria ), 몰사( Molsa ), 콜레브루케아( Colebrookea ), 스타치스(Stachys), 오리가눔( Origanum ), 지지포라( Ziziphora ), 린데라( Lindera ), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스( Derris ), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아( Millettia ), 퐁가미아( Pongamia ), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스( Artocarpus ), 피쿠스( Ficus ), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나( Notholaena ), 피누스( Pinus ), 울무스( Ulmis ) 및 알피니아(Alpinia)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물속으로부터 단리되는 방법.
38. 제34항에 있어서, 상기 플라반이 아카시아 카테츄(Acacia catechu ), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna ), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana ), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa ), 아카시아 아라비카(Acacia arabica ), 아카시아 카에시아(A. caesia ), 아카시아 펜나타(A. pennata), 에이. 시누아타(A. sinuata ), 에이. 메아른시이(A. mearnsii ), 아카시아 피크난타(A. picnantha ), 아카시아 데알바타(A. dealbata ), 아카시아 아우리쿨리포르미스(A. auriculiformis ), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia ) 및 아카시아 만기움(A. mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된 식물종으로부터 단리되는 방법.
39. 제34항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 스쿠텔리아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반이 아카시아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되는 방법.
40. 제29항에 있어서, 조성물이 체중 기준으로 0.001 내지 200㎎/kg에서 선택된 1회분 투여량으로 투여되는 약제 조성물.
41. 제29항에 있어서, 투여 경로가 경구,국부, 좌약, 정맥내 및 피내, 장내, 근내, 복막내 및 정맥내 투여로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
42. 제29항에 있어서, 약제 조성물이 국부 도포용으로 약제학적, 피부학적 및 미 용적으로 적합한 통상적인 부형제 및 임의적으로 보조제, 및/또는 담체 및/또는 규칙적 또는 조절 방출 비히클을 추가로 포함하는 방법.
43. 제 29 항에 있어서, 상기 전구염증성 시토카인이 cox-2, il-1β, tnfα, il-6, 및/또는, 퍼옥시좀 증식자 활성 수용체 감마 (PPARγ) 또는 핵 인자 카파 B (NFκB)로 이루어진 군에서 선택되는 전사인자들에 대한 이들의 영향을 통해 조절되는 상기 시토카인들로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
44. 하나 이상의 프리-비-링 플라보노이드 및 하나 이상의 플라반의 혼합물로 이루어진 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게 투여하는 것을 포함하는, 활성산소종 (ROS) 생성을 방지하고 뇌의 항산화 방어들을 증대시키고, 활성산소종 (ROS)-매개 정신 질병 및 질환을 예방 및 치료하는 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드 대 플라반의 비가 99:1 내지 1:99로부터 선택되는 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 조성물 중의 프리-비-링 플라보노이드:플라반의 비가 약 80:20인 약제 조성물.
47. 제44항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 하기 일반식을 갖는 화합물로 구성된 군으로 선택되는 방법:

    [화학식 2]

    

    상기 식에서,

    R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 -H, -OH, -SH, -OR, -SR, -NH₂, -NHR, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜토오스, 메틸-알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 글리코사이드로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

    여기에서,

    R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

    X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카아보네이트를 포함하는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
48. 제44항에 있어서, 상기 플라반이 하기 일반식을 갖는 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 방법:

    [화학식 3]

    

    상기식에서,

    R₁, R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 H, -OH, -SH, -OCH₃, -SCH₃, -OR, -SR, -NH₂, -NRH, -NR₂, -NR₃ ⁺X^-, 및 각각 갈레이트, 아세테이트, 신나모일 및 히드록실-신나모일 에스테르, 트리히드록실벤조일 에스테르 및 카페오일 에스테르로 구성된 군으로 부터 독립적으로 선택되는 치환기의 에스테르; 탄소, 산소, 질소 또는 황, 알도펜 토오스, 메틸 알도펜토오스, 알도헥소오스, 케토헥소오스 및 이들의 화학적 유도체를 포함하는 단일 당 또는 여러 당의 조합물의 황 글리코사이드; 이량체, 삼량체 및 다른 중합된 플라반으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되며,

    여기에서,

    R은 탄소수 1-10개의 알킬기이고;

    X는 히드록실, 염화물, 요오드화물, 설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 플루오르화물 및 카아보네이트를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 약제학적으로 허용될 수 있는 카운터 음이온으로 구성된 군으로부터 선택된다.
49. 제44항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 유기 합성에 의해 수득되거나 식물로부터 단리되는 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드 및 상기 플라반이 줄기, 줄기 수피, 나무줄기, 나무줄기 수피, 가지, 덩이줄기, 뿌리, 뿌리 수피, 어린싹, 종자, 뿌리줄기, 꽃 및 다른 재생성 기관, 잎 및 다른 기부로 구성된 군으로 선택되는 식물 부분으로부터 단리되는 방법.
51. 제49항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 포포나무과(Annonaceae), 국화과(Asteraceae), 능소화과(Bignoniaceae), 콤브레타과(Combretaceae), 국화과(Compositae), 대극과(Euphorbiaceae), 꿀풀과(Labiatae), 라우랜세아에(Lauranceae), 콩과(Leguminosae), 뽕나무과(Moraceae), 소나무과(Pinaceae), 고사리과(Pteridaceae), 시놉테리다세아에(Sinopteridaceae), 느릅나무과(Ulmaceae) 및 생강과(Zingiberacea)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물과로부터 단리되는 방법.
52. 제49항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 데스모스( Desmos ), 아치로클리네(Achyrocline), 오록실룸( Oroxylum ), 부케나비아( Buchenavia ), 아나팔리스(Anaphalis), 코툴라( Cotula ), 그나팔리움( Gnaphalium ), 헤리치숨( Helichrysum ), 켄타우레아(Centaurea), 유파토리움 ( Eupatorium ), 박카리스( Baccharis ), 사피움(Sapium), 스쿠텔라리아( Scutellaria ), 몰사( Molsa ), 콜레브루케아( Colebrookea ), 스타치스(Stachys), 오리가눔( Origanum ), 지지포라( Ziziphora ), 린데라( Lindera ), 악티노다프네(Actinodaphne), 아카시아(Acacia), 데리스( Derris ), 글리키르히자(Glycyrrhiza), 밀레티아( Millettia ), 퐁가미아( Pongamia ), 테프로시아(Tephrosia), 아르토카르푸스( Artocarpus ), 피쿠스( Ficus ), 피티로그람마(Pityrogramma), 노톨라에나( Notholaena ), 피누스( Pinus ), 울무스( Ulmis ) 및 알피니아(Alpinia)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물속으로부터 단리되는 방법.
53. 제49항에 있어서, 상기 플라반이 아카시아 카테츄(Acacia catechu ), 아카시아 콘킨나(Acacia concinna ), 아카시아 파르네시아나(Acacia farnesiana ), 아카시아 세네갈(Acacia Senegal), 아카시아 스페시오사(Acacia speciosa ), 아카시아 아라비카(Acacia arabica ), 아카시아 카에시아(A. caesia ), 아카시아 펜나타(A. pennata), 에이. 시누아타(A. sinuata ), 에이. 메아른시이(A. mearnsii ), 아카시아 피크난타(A. picnantha ), 아카시아 데알바타(A. dealbata ), 아카시아 아우리쿨리포르미스(A. auriculiformis ), 아카시아 홀로세레시아(A. holoserecia ) 및 아카시아 만기움(A. mangium)으로 구성된 군으로부터 선택된 식물종으로부터 단리되는 방법.
54. 제49항에 있어서, 상기 프리-비-링 플라보노이드가 스쿠텔리아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되고, 플라반이 아카시아속 식물에 속하는 식물(들)로부터 단리되는 방법.
55. 제44항에 있어서, 조성물이 체중 기준으로 0.001 내지 200㎎/kg에서 선택된 1회분 투여량으로 투여되는 방법.
56. 제44항에 있어서, 투여 경로가 경구, 국부, 좌약, 정맥내 및 피하, 장내, 근내, 복강내 및 정맥내 투여로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
57. 제44항에 있어서, 약제 조성물이 국부 도포용으로 약제학적, 피부학적 및 미용적으로 적합한 통상적인 부형제 및 임의적으로 보조제, 및/또는 담체 및/또는 규칙적 또는 조절 방출 비히클을 추가로 포함하는 방법.

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