KR20070006754A

KR20070006754A - 랩온칩용 기판

Info

Publication number: KR20070006754A
Application number: KR1020067017353A
Authority: KR
Inventors: 요시아키 야마자키; 나오키 카와조에; 마사시 히가사; 기만 정; 히토시 노부마사; 유지 무라카미
Original assignee: 도레이 가부시끼가이샤
Priority date: 2004-04-21
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2007-01-11
Also published as: CA2560758A1; EP1739418A4; US20070178240A1; CN1942761A; US20090297733A1; JP4853285B2; WO2005103670A1; EP1739418A1; JPWO2005103670A1

Abstract

본 발명은, 수지를 기재로 하고 그 표면에 고에너지선으로 친수성 고분자를 결합시킨 랩온칩용 기판, 특히 단백질 처리 칩이다.

본 발명에 의해, 기재 표면에의 단백질의 흡착이 없고, 내세정 효과가 있어 장시간 사용가능한 랩온칩용 기판을 제공할 수 있다. 검출 노이즈가 저감되므로, 미량 또한 정밀도가 높은 단백질의 분석이 가능해지고, 마이크로 유로를 갖는 폴리머제의 단백질 전기영동용 칩을 제공할 수 있다.

Description

랩온칩용 기판{SUBSTRATE FOR LABO-ON-A-CHIP}

본 발명은 단백질의 구조·기능 해석 및 단백질을 사용한 반응에 이용되는 장치·기기 중, 단백질 용액의 유동 또는 반응 또는 분석을 행하는 랩온칩용 기판에 관한 것이다.

현재, 여러가지의 화학반응을 행하기 위한 마이크로 유로를 포함하는 칩은 반응효율, 속도, 각 시약의 관점으로부터 주목받고 있는 기술이며, 이미 “랩온칩”이라고 불리는 사방 수 ㎝의 유리제 칩상에 형성된 마이크로 유로 중에서 화학반응·분석을 행하는 새로운 분석방법에 관한 개념이 일반적으로 정착되어 있다. 금후, 바이오테크놀러지의 진전에 따라 생화학분야에 있어서도 마이크로 유로의 이용은 불가결한 기술이며, 특히 단백질의 구조·기능 해석 및 단백질을 사용한 반응에의 마이크로 유로의 응용이 기대된다.

단백질 용액을 마이크로 유로에 흘릴 때에 큰 문제가 되는 것은 마이크로 유로 표면에의 단백질의 흡착이며, 미소 단백질은 흡착에 의한 감소 및 구조변화의 영향을 크게 받을 뿐만 아니라, 회로를 반복해서 사용하는 경우에는 흡착된 단백질이 미소한 유로를 막을 우려가 있다. 일반적으로, 단백질의 흡착을 막기 위해서, 예를 들면 폴리알킬렌글리콜 등의 친수성 고분자를 기판 표면에 코팅하는 방법이 알려져 있다.

예를 들면 유로가 폴리에틸렌글리콜 및 / 또는 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린폴리머로 코팅된 칩, 또는 수지기판상에 마이크로 유로를 제작하여, 단백질의 합성·검출을 행하는 기술이 개시되어 있다(특허문헌1). 그러나, 이들은 표면에 친수성 고분자가 코팅된 것뿐이며, 예를 들면 세정시에 친수성 고분자가 박리되기 쉽다는 결점이 있다. 또한 수지기판에 친수성 모노머 분자를 수지기판에 침지시킨 후, 개시제를 도포, 중합함으로써 단백질의 흡착을 억제하는 기술은 공지이지만(특허문헌2), 이 경우도 기판과 고분자는 공유결합되어 있지 않고, 기판벽면의 친수성 고분자가 박리되어 버린다.

친수성 고분자를 표면에 공유결합시키고 있는 예로서는, 폴리디메틸실록산의 표면에 자외광을 조사함으로써 폴리알킬렌글리콜을 공유결합시키는 방법이 있다(비특허문헌1). 그러나, 규소의 함유량이 낮은 고분자 표면에 폴리알킬렌글리콜을 공유결합시키기 위해서는, 더욱 높은 에너지선을 조사할 필요가 있고, 이 경우, 기판이 변색되기 때문에 분석용으로서 적합하지 않다. 또한 폴리디메틸실록산은 사출성형이 어려워 마이크로 유로를 갖는 칩으로 가공해서 양산하는 것이 어렵다. 또한 지금까지 칩의 가공에 이용되어 온 폴리머의 대부분은 규소의 함유율이 낮은 것이며, 이들 폴리머의 경우, 종래의 자외광을 조사하는 방법으로 표면을 그래프트화하는 것은 기술적으로 어렵다.

또한 고분자 기판 표면에 폴리알킬렌글리콜을 정전적으로 코팅함으로써 단백질의 흡착을 억제시키는 방법은 공지이다(비특허문헌2). 그러나, 이 방법에서는 폴 리알킬렌글리콜과 기판의 결합력이 약해서, 용제로 세정했을 때 보다 많은 폴리알킬렌글리콜이 박리되어 떨어진다. 그 때문에 고분자 기판으로 이루어지는 마이크로 유로를 갖는 칩의 유로벽면에 폴리알킬렌글리콜을 정전적으로 코팅시킨 것만으로는 단백질의 분리·영동을 행할 수는 없다.

특허문헌1: 일본 특허공개 2003-334056호 공보

특허문헌2: 일본 특허공표 2001-500971호 공보

비특허문헌1: 휴(Hu Shuwen) 외 5 명 「자외선 폴리머 그래프트화에 의한 폴리디메틸실록산 마이크로 유로기판의 표면수식(Surface Modification of Poly(dimethylsiloxane) Microfluidic Devices by Ultraviolet Polymer Grafting)」 아날리티컬 케미스트리(Analytical Chemistry) 2002년, 74권, 16호, p4117-4123

비특허문헌2: 시(Si Lei) 「뮤신형 단백질을 이용하여 생체를 모방한 생체재료 표면(Biomimetic Surfaces of Biomaterials Using Mucin-Type Glyco proteins)」트렌드 인 글리코사이엔스 앤드 글리코테크놀러지(Trends in Glycoscience and Glycotechnology) 2000년, 12권, 66호, p229-239

본 발명은, 규소의 함유율이 중량비로 10%이하인 수지를 기재로 하고, 그 표면에 친수성 고분자가 공유결합된 랩온칩용 기판이다.

[도 1] 마이크로 유로를 갖는 단백질 영동용 칩의 모식도이다.

[도 2] 폴리에틸렌글리콜을 공유결합시키고 있지 않은 단백질 영동용 칩을 이용하여 형광표식을 영동시켰을 때의 전기영동도이다.

[도 3] 폴리에틸렌글리콜을 공유결합시킨 단백질 영동용 칩을 이용하여 형광표식 단백질을 영동시켰을 때의 전기영동도이다.

[도 4] 폴리에틸렌글리콜을 공유결합시킨 단백질 영동용 칩 유로를 10규정 염산으로 세정한 후, 형광표식 단백질을 영동시켰을 때의 전기영동도이다.

[도 5] 폴리에틸렌글리콜을 공유결합시킨 단백질 영동용 칩 유로를 10규정 수산화나트륨으로 세정한 후, 형광표식 단백질을 영동시켰을 때의 전기영동도이다.

[도 6] 폴리에틸렌글리콜을 5.0kGy의 감마선을 조사해서 공유결합시킨 단백질 영동용 칩을 이용하여, 형광표식 단백질을 영동시켰을 때의 전기영동도이다.

[도 7] 폴리에틸렌글리콜을 10.0kGy의 감마선을 조사해서 공유결합시킨 단백질 영동용 칩을 이용하여, 형광표식 단백질을 영동시켰을 때의 전기영동도이다.

본 발명에 있어서의 수지란, 고분자의 단독재료, 혼합재료 혹은 이들의 개질 물, 또는 이들의 고분자 재료와 유리, 금속, 탄소재료 등의 혼합 또는 복합에 의해 얻어진 재료에 포함되는 고분자 재료를 의미한다. 합성 고분자로서는, 열가소성 고분자 및 열경화성 고분자 모두 사용할 수 있다. 합성법으로서는 각종 방법이 예시되지만, 본 발명의 고분자 재료에는, 이들 중 어느 하나의 방법에 의해 얻어지는 합성 고분자도 포함된다. 예를 들면, (1) 부가 중합체: 올레핀, 올레핀 이외의 비 닐화합물, 비닐리덴화합물 및 그 밖의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단량체의 단독 중합체 또는 공중합체, 또는 이들 단독 중합체 혹은 공중합체의 혼합물 혹은 개질물, (2) 중축합체: 폴리에스테르, 폴리아미드 등, 또는 이들의 중합체의 혼합물 혹은 개질물, (3) 부가 축합체: 페놀수지, 요소수지, 멜라민수지, 크실렌수지 등, 또는 이들의 중합체의 혼합물 혹은 개질물, (4) 중부가 생성물: 폴리우레탄, 폴리요소 등, 또는 이들의 중합체의 혼합물 혹은 개질물, (5) 개환 중합체: 시클로프로판, 에틸렌옥사이드, 프로필렌옥사이드, 락톤, 락탐 등의 단독 중합체 또는 공중합체, 또는 이들 단독 중합체 혹은 공중합체의 혼합물 혹은 개질물, (6) 환화 중합체: 디비닐화합물(예를 들면: 1,4-펜타디엔)이나 디인화합물(예를 들면: 1,6-헵타디인) 등의 단독 중합체 또는 공중합체, 또는 이들 단독 중합체 혹은 공중합체의 혼합물 혹은 개질물, (7) 이성화 중합체: 예를 들면 에틸렌과 이소부텐의 교호 공중합체 등, (8) 전해 중합체: 피롤, 아닐린, 아세틸렌 등의 단독 중합체 또는 공중합체, 또는 이들 단독 중합체 혹은 공중합체의 혼합물 혹은 개질물, (9) 알데히드나 케톤의 폴리머, (10) 폴리에테르술폰, (11) 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 천연고분자로서는, 셀룰로오스, 단백질, 다당류 등의 단독물 또는 혼합물이나 이들의 개질물 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 기재로서 사용하는 수지로서는, 특히 상기의 부가 중합체가 바람직하게 사용된다. 부가 중합체를 구성하는 단량체는 특별히 한정되지 않지만, 올레핀으로서는, 에틸렌, 프로필렌, 1-부텐, 1-펜텐, 1-헥센, 4-메틸-1-펜텐, 1-옥텐 등의 임의의 α-올레핀의 단독 중합체 혹은 이들 2종이상의 공중합체, 또는 이들 단독 중합체 및 / 또는 공중합체의 혼합물을 적당하게 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 올레핀 이외의 비닐화합물이란, 비닐기를 갖는 화합물이며, 예를 들면 염화비닐, 스티렌, 아크릴산, 메타크릴산, 아크릴산 또는 메타크릴산의 에스테르, 초산비닐, 비닐에테르류, 비닐카르바졸, 아크릴로니트릴 등을 들 수 있다. 올레핀 이외의 비닐리덴화합물이란 비닐리덴기를 함유하는 화합물이며, 염화비닐리덴, 불화비닐리덴, 이소부틸렌 등을 들 수 있다. 올레핀, 비닐화합물, 비닐리덴화합물 이외의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 화합물로서는, 무수말레인산, 무수피로멜리트산, 2-부텐산, 4불화에틸렌, 3불화염화에틸렌 등 및 이중결합을 2개이상 함유하는 화합물, 예를 들면 부타디엔, 이소프렌, 클로로프렌 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 기재로서 사용하는 수지로서 바람직한 부가 중합체는, 이들의 단량체의 단독 중합체 혹은 2종이상의 단량체의 공중합체 또는 이들 중합체의 혼합물을 적당하게 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는, 폴리에틸렌, 에틸렌과 다른 α-올레핀의 공중합체, 폴리프로필렌, 프로필렌과 다른 α-올레핀의 공중합체이다. 공중합체로서는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체를 포함한다. 폴리올레핀 이외의 고분자 재료로서는, 올레핀 이외의 비닐화합물, 비닐리덴화합물 및 그 밖의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 단량체의 단독 중합체 또는 공중합체, 예를 들면 폴리메타크릴산 에스테르수지, 폴리아크릴산 에스테르수지, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 아크릴로니트릴 공중합체(아크릴계 섬유 및 이들의 성형물, ABS수지 등), 부타디엔을 함유하는 공중합체(합성고무) 등, 및 폴리아미드(나일론을 비롯한 지방족 폴리아미드 및 방향 족 폴리아미드를 포함한다), 폴리에스테르(폴리에틸렌테레프탈레이트나 지방족 및 전방향족 폴리에스테르를 포함한다), 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리벤조에이트, 폴리에테르술폰, 폴리아세탈, 각종 합성고무 등이 바람직하게 이용된다.

이들 중에서도, 본 발명의 기재로서는 특히 폴리올레핀, 폴리이미드, 폴리카보네이트, 폴리아릴레이트, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴산메틸 등의 폴리메타크릴산계 수지, 폴리아미드, 폴리술폰계 수지, 셀룰로오스계 수지 등의 고분자 화합물을 주성분으로 하는 것이 바람직하고, 그것을 기재로 하는 칩에 있어서 효과가 발휘된다. 그 중에서도 특히, 폴리술폰계 수지, 폴리메타크릴산계 수지, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 셀룰로오스계 수지를 갖는 칩에 있어서 특히 현저하게 발휘된다.

본 발명에 있어서 기재로서 사용하는 수지는, 규소의 함유율이 높아지면, 수지가 부드러워져 칩의 강성이 낮아지기 때문에, 수지를 마이크로 유로 등에 가공한 경우, 압력 등의 외적인 힘에 의해 변형되는 일이 있으므로, 규소의 함유율이 10%이하인 것을 사용한다. 여기에서 말하는 규소의 함유율은, 분모에 수지중의 총분자량, 분자에 수지중의 규소의 총원자량으로 했을 때의 비율을 의미한다.

본 발명에 있어서의 공유결합이란 2개의 원자가 전자를 공유해서 만드는 결합을 말하고, 시그마결합, 파이결합, 다른 비국재 공유결합 및 / 또는 다른 공유결합 타입을 갖는 것을 말한다.

본 발명의, 친수성 고분자를 공유결합시킨 랩온칩용 기판은 다음과 같은 효과를 갖는다.

제 1로 내세정효과이다. 칩의 성형방법으로서 사출, 반응사출, 진공, 진공열프레스, 스탬핑, 압축, 압출, 발포, 블로우, 분말, 주형 등이 있다. 이들 성형법을 이용하면, 마이크로 유로에 박리제, 모노머, 개시제 등의 불순물이 부착될 가능성이 있고, 랩온칩을 사용할 때는 미리 세정함으로써, 이들의 불순물을 제거할 필요가 있다. 코팅에서는, 세정에 의해 표면에 코팅된 친수성 고분자 등이 박리된다. 그러나, 공유결합이면, 복수회 세정을 행해도 표면의 친수성 고분자 등이 박리되는 일은 없다.

제 2로 검출 노이즈의 저감이다. 본 발명의 랩온칩 중의 피험시료를 이동시키는 방법으로서, 압력, 농도, 전장, 자장의 차, 혹은 구배를 이용하는 방법, 표면력을 이용하는 방법, 관성력을 이용하는 방법 및 이들의 조합이 있다. 이들 방법으로 피험시료를 이동시킨 경우, 표면에 친수성 고분자를 코팅하고 있는 것만의 경우에는 이것이 박리된다. 이 때문에 단백질을 검출하는 경우에 피험시료 이외의 물질도 노이즈로서 검출되어 버려, 바른 분석을 행할 수 없다. 그러나, 친수성 고분자가 공유결합되어 있는 경우에는, 친수성 고분자가 박리되는 일이 없기 때문에, 노이즈를 저감시킬 수 있다.

제 3으로 장시간 사용효과이다. 본 발명에 있어서의 단백질 분석시간은 통상 바람직하게는 5분이내, 더욱 바람직하게는 3분이내이지만, 특별히 한정되지 않기 때문에, 경우에 따라 장시간, 예를 들면 30분이상 분석하는 일이 있다. 친수성 고분자가 코팅된 것인 경우, 장시간의 사용에 의해 표면의 친수성 고분자가 박리되어 버린다. 그러나, 본 발명과 같이 공유결합되어 있는 경우에는 장시간 사용해도 표 면의 친수성 고분자는 박리되지 않는다.

본 발명에 있어서의 친수성 고분자란, 수용성 고분자 또는 이(易)수용성은 아니지만 친수성을 갖는 고분자를 의미한다. 구체예로서는, 폴리비닐알코올, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸렌-비닐알코올 공중합체, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리α-히드록시비닐알코올, 폴리아크릴산, 폴리α-히드록시아크릴산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜이나 폴리프로필렌글리콜 등의 폴리알킬렌글리콜, 감자전분, 옥수수전분, 밀전분 등의 전분, 글루코만난, 견피브로인, 견세리신, 한천, 젤라틴, 난백 단백질 및 알긴산나트륨 등을 들 수 있다. 또한 이들의 술폰화물도 사용할 수 있다.

본 발명의 친수성 고분자로서는, 폴리알킬렌글리콜이 바람직하다. 폴리알킬렌글리콜로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜이나 폴리프로필렌글리콜로 대표되는 주쇄중에 산소원자를 함유하는 쇄상 고분자이지만, 폴리알킬렌글리콜이 그래프트 된 폴리머이어도 좋다. 폴리알킬렌글리콜의 분자량은, 특별히 한정되는 것은 아니고, 수 평균 분자량으로 600~4000000, 칩에의 단백질의 흡착 저해 능력을 고려하면 10000~1000000정도의 것이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 랩온칩용 기판은, 바람직하게는 기재의 표면에 친수성 고분자를 고에너지선으로 공유결합시킨 것이다.

본 발명에 있어서 기재의 표면에 친수성 고분자를 고에너지선으로 공유결합시키기 위해서는, 예를 들면 우선 칩을 친수성 고분자, 바람직하게는 폴리알킬렌글리콜의 용액에 침지 또는 접촉시킨 후, 감마선나 전자선 등의 고에너지선을 조사한 다. 친수성 고분자로서 폴리알킬렌글리콜 용액을 사용하는 경우, 폴리알킬렌글리콜 용액의 온도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0℃이상 30℃이하, 더욱 바람직하게는 10℃이상 25℃이하가 바람직하다. 또한 폴리알킬렌글리콜용액으로 하기 위한 용매도 특별히 한정되는 것은 아니고, 양용매로서 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 등이 사용되지만, 비용면, 안전면에서 물이 바람직하게 사용된다.

본 발명에 있어서의 고에너지선이란 어느 일정한 에너지량을 갖는 에너지선으로, 마이크로파, 적외선, 가시광선, 자외선, 엑스선, 감마선, 전자선, 양자선, 중성자선도 고에너지선에 포함된다. 이 중 감마선이란 그 파장이 10^-12~10^-15m인 것을 말한다. 본 발명에 있어서 기재로서 사용하는 수지의 규소의 함유율이 10%이하이기 때문에, 이들 고에너지선 중, 친수성 고분자를 수지기판에 직접 그래프트화할 수 있는 감마선이 바람직하다.

고에너지선의 조사량은 특별히 한정되는 것은 아니고, 단백질 흡착 억제 능력을 부여한 칩 혹은 마이크로 유로 표면에 폴리알킬렌글리콜쇄가 고정화될만큼의 조사량이 있으면 좋고, 감마선을 사용하는 경우는 흡수에너지로서 통상 100kGy이하, 바람직하게는 40kGy이하, 더욱 바람직하게는 수지기판의 황변에 의한 피험시료 검출에의 영향이 적은 10kGy이하가 사용된다.

본 발명에 있어서의 랩온칩이란, 용액시료에 대하여, 반응, 분리, 정제, 검출 등의 여러가지 과학조작을 기판상에서 행할 수 있도록 집적화하여, 칩화한 것을 말한다. 이들 기술에 의해 초고감도 분석, 초미량 분석, 초다종목 동시 분석 등을 실현시킬 수 있다. 일례로서는, 단백질 합성부, 단백질 정제부, 단백질 검출부를 마이크로 유로로 연결시킨 칩을 들 수 있다. 또한 본 발명에 있어서의 랩온칩용 기판이란, 랩온칩 자체, 이들 부분이 하나라도 포함되는 것, 마이크로 유로뿐인 것, 또는 마이크로 유로가 없고 기판뿐인 것을 포함한다.

본 발명의 랩온칩용 기판에 있어서, 기판상에서 친수성 고분자를 결합시키는 부위는 특별히 한정되지 않지만, 단백질 합성부, 단백질 정제부, 단백질 검출부, 마이크로 유로벽면 중 하나이상이 친수화되는 것이 바람직하다. 단백질 처리 칩의 유로에만 친수성 고분자를 결합시켜도 좋다.

본 발명의 랩온칩용 기판에 있어서, 단백질 합성부의 깊이는, 단백질 합성조 내의 반응액이 충분히 있어서 단백질 합성이 가능한 깊이 이상이며, 기판상에 합성조를 설치하는 것이 가능한 깊이 이하의 범위이며, 바람직한 범위는, 1㎛이상, 1000㎛이하이다. 또한 하한으로서는 20㎛이상이 더욱 바람직하다. 세로·가로의 디멘젼의 바람직한 범위는, 10㎛이상, 5000㎛이하이다. 하한으로서는 50㎛이상이 더욱 바람직하다. 특히 바람직한 범위는, 200㎛이상, 2000㎛이하이다.

단백질 합성조에 넣는 반응액으로서는, 공지의 대장균 추출물이나 밀배아 추출물, 토끼망 적혈구 추출물(추출액 중에는, 단백질 합성에 필요한 리보솜이나 아미노아실 tRNA 합성효소, 각종 가용성 번역 인자군이 함유된다)에, 완충액, 단백질 합성의 원료인 아미노산, 에너지원인 ATP, GTP 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다.

단백질 정제부의 폭, 깊이의 바람직한 범위는 특별히 한정되지 않지만, 단백질을 정제하기 위한 담체가 들어가는 크기이면 좋다.

단백질을 정제하기 위한 담체의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 유리(수식이나 기능화한 것을 포함한다), 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 재료의 공중합물, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 불소수지 등을 포함한다), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 수지, 실리카 또는 수식 실리콘을 함유하는 실리카 모체재료, 탄소, 금속 등이 포함된다.

단백질 검출부에서는, 단백질의 전기영동 등을 사용할 수 있다. 구체적인 방법으로서는, 아가로스 겔 전기영동, 검출부분의 마이크로 유로를 캐필러리로서 사용한 캐필러리 전기영동법, 등전점 전기영동, SDS-PAGE, Native-PAGE, μ-CE, 마이크로칩 전기영동 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 특히 바람직하게 사용되는 것은, SDS-PAGE이다. 구체적인 방법은, 단백질 합성부, 단백질 정제부로부터 마이크로 유로를 통해 반송되어 온 단백질 용액에 요소, SDS(도데실황산나트륨), 2-메틸캅토에탄올 등을 첨가하여, 단백질의 입체구조를 파괴시켜 변성시키고, 또한 마이크로 유로에서 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 행함으로써 달성된다.

이 검출용 전기영동은, 단백질 합성부, 단백질 정제부를 갖는 칩과 동일 칩상에서의 온칩 전기영동법에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써, 하나의 칩으로 합성, 정제, 검출 모두를 행할 수 있다. 또한 온칩 전기영동을 이용함으로써, 전기영동의 시간을 짧게 할 수 있어, 합성·검출의 일련의 작업을 하이 스루풋화할 수 있다.

마이크로 유로는 오목부를 형성한 판상의 기재를 다른 기재와 접합해서 제작된다. 혹은 관통된 슬릿형상을 갖는 박막과 이것을 끼워 넣는 적어도 2개의 기재에 의해서도 제작가능하다. 기재는 시트상, 판상, 필름상, 봉상, 관상, 도막상, 원통상, 기타 복잡한 형상의 성형물을 취할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 가공성 및 취급의 용이함으로부터, 바람직하게는 시트상, 판상, 필름상이다.

본 발명에 있어서의 단백질 처리 칩이란 단백질의 영동에 의해 분자량, 어피니티, 전기적 특성 등 단백질의 성질을 해석하는 기능을 갖는 칩을 말한다. 또한 이 칩은 단백질의 합성, 정제, 염색에도 사용할 수 있고, 흡착 억제 효과를 발견할 수 있다. 또한 칩 내에 마이크로 유로를 포함하는 것도 단백질 처리 칩에 포함된다.

종래의 유리제 또는 플라스틱제 단백질 처리 칩에의 단백질 흡착은 단시간의 접촉으로 발생하고, 저농도영역(약 1ng~100㎍/ml)에 있어서 그 흡착율(접촉시킨 단백질 용액중의 단백질이 내흡착되는 단백질의 비율)은, 최대 약 50%에나 도달하고, 한번 흡착된 단백질은 불가역한 구조변화(변성)를 일으키고, 변성된 단백질은 2차적인 단백질의 흡착을 유인하여, 결과적으로 단백질의 다층 흡착층이 형성된다. 이것을 막기 위해서, 단백질 용액이 접촉되는 표면을 친수성 고분자, 특히 폴리알킬렌글리콜로 코팅하여, 단백질의 흡착을 야기하는 가장 큰 요인인 소수성 상호작용을 저감시킴으로써, 단백질의 흡착을 억제할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 단백질이란, 복수의 아미노산이 펩티드 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 화합물을 말하고, 천연 유래물, 합성물, 및 단쇄의 펩티드도 함유하는 것을 의미한다. 구성성분으로서 아미노산 이외에 당, 핵산, 지질을 함유하고 있어도 좋다.

본 발명에 있어서 해석될 수 있는 단백질로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 천연 유래물, 합성물 및 아미노산 이외의 구성성분을 함유하는 핵단백질, 당단백질, 리포단백질 등을 해석할 수 있지만 수용성 단백질에 특히 바람직하게 사용된다. 측정가능한 분자 사이즈는, 마커를 적당하게 설정함으로써 모든 사이즈의 단백질이 해석가능해진다. 본 발명의 칩을 이용하여 분리할 수 있는 단백질의 분자량 범위는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 10kDa~200kDa, 더욱 바람직하게는, 14kDa~140kDa의 범위이다. 또한, 막결합된 단백질 등은 가용화 후에 본 발명의 전기영동법에 적용되는 것이 바람직하다. 그렇게 하기 위한 가용화 처리는 염용액이나 EDTA 등의 킬레이트제로 초음파 등의 기계적 처리, 또는 계면활성제로의 처리 등에 의해 달성된다.

본 발명의 전기영동법에 사용하는 분리용 담체로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 통상의 캐필러리 겔 전기영동 또는 마이크로칩형 겔 전기영동 등에 있어서 단백질의 분자 사이즈 분리 분석용으로서 사용되는 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드겔, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸프로필셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, β-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린 등의 분리용 담체를 들 수 있고, 또한 PCT/JP01/04510에 기재된 β-1,3글루칸 구조를 함유하는 커드란, 라미나란이나 해초 추출물 등에도 적용가능하다. 분리용 담체의 첨가제로서는, 도데실황산나트륨(SDS), Triton X-100, ε-아미노카프론산, 3-[(3-콜라미드프로필)-디메틸아미노-1-프로판, CHAPS, 6~8M 요소, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 헥실트리메틸암모늄브로마이드(HTAB), 도데실트리메틸암모 늄브로마이드(DTAB) 등을 들 수 있다.

영동용 완충액으로서는, 예를 들면 트리스-글리신버퍼, 트리스―붕산버퍼, 트리스―염산버퍼, 트리스-트리신버퍼, 트리스―인산2수소나트륨버퍼 등을 들 수 있지만, 일반적으로 단백질의 전기영동용 완충액으로서 사용되는 완충액이나, 시판의 단백질 전기영동용 키트중에 제공되고 있는 완충액 등도 사용할 수 있다. 상기영동용 완충액은, 일반적으로 단백질의 전기영동용 완충액으로서 사용되는 농도로 사용할 수 있다.

영동용 완충액은, 상기 분리용 담체를 함유하고 있어도 좋다. 분리용 담체를 영동용 완충액에 첨가해서 사용함으로써, 조작을 간편하게 할 수 있어, 해석을 보다 고속으로 행할 수 있다.

영동용 완충액의 pH는, 적절한 전기 침투류 및 단백질의 바람직한 전기영동의 관점에서, 2.0~9.0이 바람직하고, 6.8~8.6이 보다 바람직하다.

시료 조제용 용액으로서는, 물, SDS용액, 또는 SDS-트리스붕산용액 등에 2-메르캅토에탄올 또는 디티오스레이톨을 첨가한 것 등을 사용할 수 있다. 피크 강도의 향상, 피크 분리도의 향상, 검출한계의 향상, 측정 정밀도의 향상의 관점에서, 물이 특히 바람직하다. 물로서는, 초순수, 탈이온수, MilliQ수 등, 단백질의 전기영동에 통상 사용되는 물이 사용될 수 있지만, MilliQ수가 특히 바람직하다.

또한 물을 시료 조제용 용액으로서 사용하는 경우, 피크 강도의 증강, 검출한계의 향상의 관점에서, 단백질을 수용해시키는 것이 바람직하다.

시료용액 중의 단백질의 농도로서는 특별히 한정되지 않지만, 측정 정밀도의 관점에서, 0.05~2000ng/㎕이 바람직하고, 0.1~2000ng/㎕이 보다 바람직하고, 0.5~200ng/㎕이 특히 바람직하다.

본 발명의 칩을 이용한 전기영동법이 사용될 수 있는 바람직한 형태로서는, 캐필러리 전기영동, 마이크로칩형 전기영동, 및 나노채널형 전기영동을 들 수 있다.

캐필러리 전기영동은, 통상, 내경이 1000㎛이하인 캐필러리 내에 영동용 완충액을 충전하고, 일단에 시료를 도입한 후, 양단간에 고전압을 인가해서 피검 단백질을 캐필러리 내에서 전개시키는 것이다.

캐필러리 전기영동에 사용되는 캐필러리에 있어서, 내경, 외경, 전체길이, 유효길이는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 통상 사용되는 사이즈의 것이 사용될 수 있다. 유효길이에 관해서, 고속에서의 해석을 가능하게 하는 관점에서, 짧은 유효길이의 캐필러리를 사용할 수 있다. 여기에서, 캐필러리의 유효길이란, 시료 주입구로부터 검출부까지의 거리를 말한다.

마이크로칩형 전기영동에 있어서는, 도입용 유로와, 상기 도입용 유로에 교차되는 분리용 유로를 구비하고, 또한 상기 도입용 유로의 일단에 시료 리저버가 배치되고, 상기 도입용 유로의 타단에 아웃렛이 배치된 마이크로칩이 이용된다.

마이크로칩형 전기영동의 형태에서는, 본 발명의 전기영동법은, 구체적으로는, 단백질을 함유하는 시료를 열변성시키지 않고, 시료 리저버에 시료를 제공하는 공정, 상기 시료 리저버중의 시료를 분리용 유로에 도입하는 공정, 및 분리용 유로에 있어서 시료를 영동시키는 공정을 포함하는 프로세스에 의해 행해진다.

시료 리저버에 시료를 제공하는 공정은, 보다 구체적으로는, 도입용 유로의 일단의 시료 리저버와 타단의 아웃렛에 전압을 가함으로써 달성된다. 전압의 강도는 장치에 따라 다르지만, SV1100(히타치덴시사제)의 경우, 50~800V, 통상 300V의 전압이 가해진다. 이것에 의해 시료가 도입용 유로와 분리용 유로의 교차부에 제공된다.

시료 리저버중의 시료를 분리용 유로에 도입하는 공정은, 보다 구체적으로는, 도입용 유로의 일단의 시료 리저버와 그 타단의 아웃렛에 스퀴징 전압을 가하고, 여분의 시료를 시료 리저버와 그 타단의 아웃렛측으로 배출하는 공정 및 분리용 유로의 아웃렛측과, 그 반대측에 분리전압을 가하는 공정이 동시에 달성된다. 전압의 강도는 장치에 따라 적당하게 선택되지만, 예를 들면 SV1100(히타치덴시사제)의 경우, 전자는 130V 전후, 후자는 700~900V로 달성된다. 한편, PCT/JP01/04510에 기재된 방법도 적용가능하다.

마이크로칩형 전기영동에 있어서는, 마이크로칩의 크기는, 예를 들면 세로 10~120mm, 가로 10~120mm, 두께 500~5000㎛이다.

마이크로칩에 있어서의 도입용 유로 및 분리용 유로의 각각의 형상은 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 유로가 한장의 칩상에 3~96개 설치된 동시에 다유로를 해석할 수 있는 칩을 사용할 수도 있다. 다유로의 배열방법은, 병행, 방사 선상, 원형상 등이 있지만, 그 형상은 특별히 한정되는 것은 아니다.

상기 마이크로칩의 분리유로의 폭, 깊이는, 마이크로칩의 크기, 사용목적 등에 따라 적당하게 설정될 수 있다. 구체적으로는, 마이크로 유로의 폭은 충분한 해 석 감도를 얻는 관점에서, 0.1㎛이상, 바람직하게는 10㎛이상이며, 충분한 해석 정밀도를 얻는 관점에서, 1000㎛이하, 바람직하게는 500㎛이하인 것이 바람직하다. 또한 상기 마이크로 유로의 깊이는, 마이크로칩의 크기, 사용목적 등에 따라 적당하게 설정될 수 있다. 구체적으로는, 충분한 해석 감도를 얻는 관점에서, 0.1㎛이상, 바람직하게는 10㎛이상이며, 충분한 해석 정밀도를 얻는 관점에서, 1000㎛이하, 바람직하게는 500㎛이하인 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리용 유로의 길이는, 마이크로칩의 크기, 해석 대상의 화합물에 따라 적당하게 선택할 수 있지만, 유효길이를 보다 길게 하는 것이 바람직하다. 유효길이는, 유로 교차부로부터, 고분자 화합물의 검출점(분리용 유로상에 배치)까지의 거리를 말한다. 충분한 분리 능을 얻는 관점에서, 0.1mm이상, 바람직하게는 10mm이상이며, 고속분리의 관점에서, 100mm이하, 바람직하게는 50mm이하인 것이 바람직하다.

또한 상기 리저버의 크기는, 시료의 용량에 따라 적당하게 설정할 수 있다. 구체적으로는, 시료도입의 핸들링 및 전극의 굵기의 관점에서, 직경 0.05mm이상, 바람직하게는 4mm이하인 것이 바람직하다.

마이크로칩형 전기영동에 있어서의 영동 전장은, 양호한 분리능을 얻고, 이동시간을 단축시키는 관점에서, 20V/cm~50kV/cm이며, 바람직하게는, 50V/cm~20kV/cm이며, 보다 바람직하게는 100V/cm~10kV/cm인 것이 바람직하다.

나노채널형 전기영동이란, 나노미터 사이즈, 1nm~1㎛, 바람직하게는 10~500nm, 보다 바람직하게는 50~100nm의 유로폭으로 이루어지는 유로가 형성된 칩 을 이용해서 행해지는 전기영동을 말한다. 이것에는 상기 기재된 나노 사이즈의 구 조체가 마이크로미터 사이즈의 유로에 형성되어 있는 것을 포함한다. 나노 사이즈의 구조체의 형상은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 사각, 환, 삼각 등의 것이 사용될 수 있고, 구조체의 설치간격도 특별히 한정되지 않는다. 이들이 형성된 나노채널칩이 이용된다. 캐필러리 전기영동의 경우와 마찬가지로 동시에 다유로 해석가능한 칩도 포함된다.

나노채널형 전기영동에 있어서의 유로는, 사이즈가 나노미터라는 특징을 갖는 유로의 형상이 곡률을 굽힌 것, 사행상, 지그재그상 또는 이들의 조합 등, 여러가지 설계가 가능하다. 이것에 의해, 미소 스케일 내에 많은 유로를 형성할 수 있다. 또한 이것에 의해 한번에 다수의 샘플을 처리할 수 있어, 하이 스루풋화가 가능하다. 또한 나노 사이즈의 구조체가 마이크로미터 사이즈의 유로에 형성되는 경우, 그 형상을 자유롭게 바꿀 수 있고, 그 설치간격도 자유롭게 바꿀 수 있다는 이점을 갖는다. 동시에 다유로의 측정이 가능하다.

나노채널형 전기영동에 있어서도 마이크로칩형 전기영동과 마찬가지로 도입용 유로, 상기 도입용 유로에 교차되는 분리용 유로, 상기 도입용 유로의 일단에 시료 리저버, 상기 도입용 유로의 타단에 아웃렛이 배치된 것을 포함하지만, 형상은 특별하게 한정되는 것은 아니다.

나노채널형 전기영동에 있어서의 나노채널칩의 크기는 마이크로칩과 같은 것이 적용된다. 예를 들면 세로 10~120mm, 가로 10~120mm, 두께 500~5000㎛이다. 나노채널칩의 유로의 깊이, 유로의 길이, 리저버의 크기 등은 마이크로칩에 준한다.

전기영동에 제공한 단백질의 검출법으로서는, 예를 들면 UV파장광에 의한 흡 수, 형광, 레이저, 램프, LED 등에 의한 검출, 전기 화학적 검출, 화학발광 검출 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 단백질 또는 펩티드의 경우, 200nm에 있어서의 흡수를 측정하는 것, SYPRO Orange와 단백질 또는 펩티드를 반응시켜, 460~550nm에서 여기시키고, 550~650nm에서 형광을 측정하는 것, 단백질과 형광 마커(AgilentTechnologies No.5065-4430)와 반응시켜, 630~650nm에서 여기시키고, 670~700nm에서 형광을 측정하는 것, 또는 단백질과 형광 마커(Molecular Probes Alexa633)와 반응시켜, 550~650nm에서 여기시키고, 640~700nm에서 형광을 측정함으로써나, 혹은 전기 화학적 측정, 화학발광 측정 등에 의해, 단백질 또는 펩티드를 검출할 수 있다.

캐필러리 전기영동에 있어서는, 예를 들면 캐필러리의 아웃렛에, UV파장광을 발생시킬 수 있는 장치와 상기 UV파장광의 검출기를 설치해도 좋고, 혹은 형광파장을 발생시킬 수 있는 장치와 상기 형광파장이 검출가능한 검출기를 설치해도 좋다.

마이크로칩형 전기영동에 있어서는, 예를 들면 분리용 유로상에 배치된 검출 점에 UV파장광의 검출기를 설치해도 좋고, 혹은, 형광파장을 발생시킬 수 있는 장치와 상기 형광파장이 검출가능한 검출기를 설치해도 좋다. 또한 동시에 다유로가 검출가능하다.

나노채널형 전기영동에 있어서는, 마이크로칩형 전기영동의 경우와 같은 검출기, 검출방법이 적용된다. 또한 나노채널형 전기영동에 있어서는, 동시 다유로검출시, 마이크로칩형 전기영동의 경우보다 다수의 샘플이 동시에 검출가능하다.

검출시, 단백질, 펩티드, 아미노산 등의 분류를 행하는 경우에는, UV흡수, 분자량 마커, 표품과의 이동시간의 비교, 매스 스펙트럼의 해석 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 단백질 처리 칩은 영동부분 뿐만 아니라 무세포계에서의 단백질 산생, 정제, 염색되는 부분이 있어도 좋다.

본 발명의 단백질 처리 칩은, 기재가 되는 수지에 흑색물질이 함유되거나 또는 코팅되어 있어도 좋다. 여기에서 말하는 흑색이란, 가시광(파장이 400nm~800nm) 범위에 있어서, 흑색부분의 분광 반사율이 특정의 스펙트럼 패턴(특정의 피크 등)을 갖지 않고, 똑같이 낮은 값이며, 또한, 흑색부분의 분광 투과율도 특정의 스펙트럼 패턴을 갖지 않고, 똑같이 낮은 값인 것을 말한다.

이 분광 반사율, 분광 투과율의 값으로서는, 가시광(파장이 400nm~800nm)의 범위의 분광 반사율이 7%이하이며, 동파장 범위에서의 분광 투과율이 2%이하인 것이 바람직하다. 또한, 여기에서 말하는 분광 반사율은, JIS Z 8722 조건C에 적합 한 조명·수광광학계로, 기재로부터의 정반사광을 받아들인 경우의 분광 반사율을 말한다.

흑색으로 하는 수단으로서는, 기재, 절연재료에 흑색물질을 함유시킴으로써 달성할 수 있다. 이 흑색물질은, 광을 반사하거나 투과하기 어려운 것이면 특별히 제한은 없지만, 바람직한 것을 들면, 카본블랙, 그래파이트, 티탄블랙, 아닐린블랙, 또는 Ru, Mn, Ni, Cr, Fe, Co 및 / 혹은 Cu의 산화물, 또는 Si, Ti, Ta, Zr 및 / 혹은 Cr의 탄화물 등의 흑색물질을 사용할 수 있다.

이들 흑색물질은 단독으로 함유시키는 것 외, 2종류 이상을 혼합해서 함유시 킬 수도 있다. 예를 들면 기재, 절연재료가 폴리에틸렌테레프탈레이트, 초산셀룰로오스, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 실리콘 수지 등의 폴리머인 경우에는, 이 중의 흑색물질 중에서도, 카본블랙, 그래파이트, 티탄블랙, 아닐린블랙을 바람직하게 함유시킬 수 있고, 특히 카본블랙을 바람직하게 사용할 수 있다. 유리, 세라믹의 무기재료인 경우에는, Ru, Mn, Ni, Cr, Fe, Co 및 / 또는 Cu의 산화물, Si, Ti, Ta, Zr 및 / 또는 Cr의 탄화물을 바람직하게 함유시킬 수 있다.

본 발명에 있어서의 영동이란 피험물질이 마이크로 유로중을 압력, 농도, 전장, 자장의 차, 혹은 구배를 이용하는 방법, 표면력을 이용하는 방법, 관성력을 이용하는 방법 및 이들의 조합에 의해 이동시키는 방법을 말한다. 이 방법에 의해, 피험물질을 분자량, 어피니티, 전기적 특성 등 단백질의 성질을 해석할 수 있다.

본 발명에 있어서의 전기 침투류란, 마이크로 유로벽이 전하가 있는 물질, 예를 들면 도데실황산나트륨 등에 의해 대전되었을 때, 벽면 근처에서 전기적 중성을 유지하고자 하기 때문에, 용액중의 반대 부호의 이온, 예를 들면 나트륨 이온 등이 벽면 근처에 모여 전기이중층을 형성하지만, 이 때, 마이크로 유로에 전하를 가하면, 유로중의 이온이 전기이중층의 이온과 반발해서 발생하는 흐름을 말한다. 본 발명의 친수성 고분자를 마이크로 유로벽면에 공유결합시킴으로써, 마이크로 유로 내의 전기 침투류를 억제하여, 마이크로 유로 내에서 전기영동을 행할 수 있다.

본 발명의 단백질 처리 칩에는, 사람의 질환의 진단에 사용하는 임상검체인 객담, 타액, 뇨, 변, 정액, 혈액, 조직, 장기 혹은, 그 밖의 체액, 또는 이들 체액 의 분화, 미생물 오염의 검사에 사용하는 식품, 음료수, 토양, 배수, 하천수, 해수, 와이프액, 와이프면을 피험재료로서 사용할 수 있다. 또한 균체의 배양액이나, 고형 배지상에 배양된 균체(콜로니)를 사용할 수 있다.

(실시예)

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위는 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1

크기 20×60mm, 두께 0.2mm의 폴리메틸메타크릴레이트의 기판을 분자량 500000, 2000ppm의 폴리에틸렌글리콜 수용액에 침지했다. 침지한 폴리메틸메타크릴레이트판을 밀봉하고, 2.5kGy의 감마선을 조사하여, 그래프트화했다. 감마선을 조사한 기판을 건조시키고, 투광부에 구멍을 뚫은 형광 플레이트에 부착했다. 부착한 형광 플레이트에 10㎍/ml로 희석한 FITC표식 BSA단백질 및 IgG단백질의 수용액을 실온에서 10분간 고층화하고, 용액을 제거한 후 인산 완충액(PBS)으로 세정하여 형광강도를 쟀다.

비교예1

크기 20×60mm, 두께 0.2mm의 폴리메틸메타크릴레이트의 기판에 감마선을 조사하지 않고 투광부에 구멍을 뚫은 형광 플레이트에 부착하고, 10㎍/ml로 희석한 FITC표식 BSA단백질 및 IgG단백질의 수용액을 실온에서 10분간 고층화하고, 용액을 제거한 후 인산 완충액으로 세정한 것을 비교예1로 했다.

참고예

크기 20×60mm, 두께 0.2mm의 폴리메틸메타크릴레이트의 기판에 감마선을 조사하지 않고 투광부에 구멍을 뚫은 형광 플레이트에 부착하고, 1mg/ml의 소혈청 알부민(BSA) 인산 완충용액을 실온에서 1시간 고층화하고 인산 완충용액으로 세정한 후 10㎍/ml로 희석한 FITC표식 BSA단백질 및 IgG단백질의 수용액을 실온에서 10분간 고층화하고, 용액을 제거한 후 인산 완충액으로 세정한 것을 참고예로 했다. 이 참고예는, 친수성 고분자를 코팅하는 방법이며, 친수성 고분자가 박리되기 때문에 랩온칩으로서는 실용적이지 않지만, 단백질의 흡착을 억제할 수 있는 기존의 방법으로서 본 발명과 비교했다.

실시예1, 비교예1, 참고예에 있어서 칩 중에 잔류한 단백질을 측정한 결과를 표1에 나타낸다. 표의 수치는 형광강도이며, 수치가 작을수록 단백질의 흡착이 적은 것을 나타낸다.

수지기판에 폴리에틸렌글리콜을 감마선으로 공유결합시킨 실시예1에서는, 감마선으로 공유결합처리를 하고 있지 않은 비교예1에 비해서 단백질의 흡착이 1/4~1/6로 억제되었다. 이 결과로부터, 본 발명은, 참고예로 한 기존의 방법과 같은 정도의 단백질의 흡착 억제 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

이들 재료를 유로 직경 0.04×0.1mm, 길이 10cm의 마이크로 유로로 가공하고, 단백질을 통과시켰을 때의 단백질의 회수율을 표 2에 나타낸다. 표의 수치가 클수록 단백질의 흡착이 억제되어, 회수량이 향상된 것을 나타낸다.

수지기판에 폴리에틸렌글리콜을 감마선으로 공유결합시킨 실시예1에서는, 감마선으로 공유결합처리를 하고 있지 않은 비교예1에 비해서 단백질의 마이크로 유로 내에서의 형광표식 BSA단백질의 회수율이 약 20%, 형광표식 IgG단백질의 회수율이 약 30% 향상되었다.

실시예2

폭 100㎛×깊이 60㎛×길이 50cm의 마이크로 유로를 갖는 폴리메타크릴레이트 기판의 마이크로 유로중에 분자량 500000, 2000ppm의 폴리에틸렌글리콜 수용액을 충전하고, 2.5kGy의 감마선을 조사하여, 그래프트화했다. 조사 후, 마이크로 유로중의 폴리에틸렌글리콜 수용액을 꺼내고, 정제수로 세정했다. 대장균 유래의 무세포 단백질 합성 반응역을 마이크로 유로에 주입한 후, 30℃에서 1시간 방치하고, 클로람페니콜의 3'-수산기에 아세틸 CoA로부터 아세틸기를 전이하는 분자량 26000의 효소인 Chloramphenicol Acetyltransferase(CAT)를 합성했다. 마이크로 유로중에서 합성된 CAT단백질을 회수하고, ELISA법으로 정량한 것을 실시예2로 했다.

비교예2

폭 100㎛×깊이 60㎛×길이 50cm의 마이크로 유로를 갖는 폴리메타크릴레이트 기판의 마이크로 유로를 정제수로 세정했다. 대장균 유래의 무세포 단백질 합성 반응액을 마이크로 유로에 주입한 후, 30℃에서 1시간 방치하고, CAT단백질을 합성했다. 마이크로 유로중에서 합성된 CAT단백질을 회수하고, ELISA법으로 정량한 것을 비교예2로 했다.

실시예2, 비교예2에서 합성된 단백질의 양을 비교한 결과를 표 3에 나타낸다.

수지기판에 폴리에틸렌글리콜을 감마선으로 공유결합시킨 실시예2에서는, 감마선으로 공유결합처리를 하고 있지 않은 비교예2에 비해서, 단백질의 합성량은 약2배가 되었다.

이하의 실시예3, 참고예3, 실시예4~7에서 이용한, 폴리메틸메타크릴레이트를 원료로 하고 직경 100㎛의 마이크로 유로를 갖는 단백질 전기영동용 칩의 모식도를 도 1에 나타낸다.

실시예3

폴리메틸메타크릴레이트를 원료로 하고 직경 100㎛의 유로를 갖는 전기영동용 칩을 분자량 500000, 2000ppm의 폴리에틸렌글리콜 수용액에 침지했다. 침지한 전기영동용 칩을 밀봉하고, 2.5kGy의 감마선을 조사하여, 그래프트화했다. 유로 내의 폴리에틸렌글리콜을 제거하고, 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 충전해서 도 3의 A, B, C의 부분에 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 넣고, D의 부분에 형광표식 트립신 인히비터 및 형광표식 BSA의 1% SDS를 함유하는 0.05MTris-HCl(pH8)용액을 넣었다. 폴리아크릴아미드, 단백질 용액을 충전한 전기영동용 칩의 A, B, C, D의 부분에 전극을 끼우고, B에 350V의 전압을 1분간 가했다. 그 후 C에 500V, B, D에 150V의 전압을 가하여 영동을 행한 것을 실시예3으로 했다.

비교예3

폴리메틸메타크릴레이트를 원료로 하고 직경 100㎛의 유로를 갖는 전기영동용 칩에 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 충전해서 도 3의 A, B, C의 부분에 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 넣고, D의 부분에 형광표식 트립신 인히비터 및 형광표식 BSA의 1% SDS를 함유하는 0.05MTris-HCl(pH8)용액을 넣었다. 폴리아크릴아미드, 단백질 용액을 충전한 전기영동용 칩의 A, B, C, D의 부분에 전극을 끼우고, B에 350V의 전압을 1분간 가했다. 그 후 C에 500V, B, D에 150V의 전압을 가하여 영동을 행한 것을 비교예3으로 했다.

실시예3, 비교예3에서 영동된 단백질을 관찰한 결과를 도 2, 3에 나타낸다. 수지기판에 폴리에틸렌글리콜을 감마선으로 처리하고 있지 않은 비교예3에서는 단백질이 영동되지 않은 것에 대해(도 2), 감마선으로 공유결합시킨 실시예2에서는 단백질이 밴드로 되어 검출되고, 분리·영동되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예4

폴리메틸메타크릴레이트를 원료로 하고 직경 100㎛의 유로를 갖는 전기영동용 칩을 분자량 500000, 2000ppm의 폴리에틸렌글리콜 수용액에 침지했다. 침지한 전기영동용 칩을 밀봉하고, 2.5kGy 감마선을 조사하여, 그래프트화했다. 유로 내의 폴리에틸렌글리콜을 제거하고, 10규정의 염산으로 유로를 세정했다. 세정 후, 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 충전하여 도 3의 A, B, C의 부분에 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 넣고, D의 부분에 형광표식 트립신 인히비터 및 형광표식 BSA의 1% SDS를 함유하는 0.05MTris-HCl(pH8)용액을 넣었다. 폴리아크릴아미드, 단백질 용액을 충전한 전기영동용 칩의 A, B, C, D의 부분에 전극을 끼우고, B에 350V의 전압을 1분간 가했다. 그 후 C에 500V, B, D에 150V의 전압을 가하여 영동을 행한 것을 실시예4로 했다.

실시예5

폴리메틸메타크릴레이트를 원료로 하고 직경 100㎛의 유로를 갖는 전기영동용 칩을 분자량 500000, 2000ppm의 폴리에틸렌글리콜 수용액에 침지했다. 침지한 전기영동용 칩을 밀봉하고, 2.5kGy의 감마선을 조사하여, 그래프트화했다. 유로 내의 폴리에틸렌글리콜을 제거하고, 10규정의 수산화나트륨 수용액으로 유로를 세정했다. 세정 후, 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 충전하여 도 3의 A, B, C의 부분에 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 넣고, D의 부분에 형광표식 트립신 인히비터 및 형광표식 BSA의 1% SDS를 함유하는 0.05MTris-HCl(pH8)용액을 넣었다. 폴리아크릴아미드, 단백질 용액을 충전한 전기영동용 칩의 A, B, C, D의 부분에 전극을 끼우고, B에 350V의 전압을 1분간 가했다. 그 후 C에 500V, B, D에 150V의 전압을 가하여 영동을 행한 것을 실시예5로 했다.

실시예4, 실시예5에서 영동된 단백질을 관찰했다. 결과를 도 4, 5에 나타낸다. 유로를 강산, 강염기로 세정해도, 수지기판에 폴리에틸렌글리콜을 감마선으로 공유결합시킨 칩에 있어서는 단백질이 분리·영동되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예6

폴리메틸메타크릴레이트를 원료로 하고 직경 100㎛의 유로를 갖는 전기영동용 칩을 분자량 500000, 2000ppm의 폴리에틸렌글리콜 수용액에 침지했다. 침지한 전기영동용 칩을 밀봉하고, 5.0kGy의 감마선을 조사하여, 그래프트화했다. 유로 내의 폴리에틸렌글리콜을 제거하고, 10규정의 수산화나트륨 수용액으로 유로를 세정했다. 세정 후, 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 충전하여 도 3의 A, B, C의 부분에 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 넣고, D의 부분에 형광표식 트립신 인히비터 및 형광표식 BSA의 1% SDS를 함유하는 0.05MTris-HCl(pH8)용액을 넣었다. 폴리아크릴아미드, 단백질 용액을 충전한 전기영동용 칩의 A, B, C, D의 부분에 전극을 끼우고, B에 350V의 전압을 1분간 가했다. 그 후 C에 500V, B, D에 150V의 전압을 가하여 영동을 행한 것을 실시예6으로 했다.

실시예7

폴리메틸메타크릴레이트를 원료로 하고 직경 100㎛의 유로를 갖는 전기영동용 칩을 분자량 500000, 2000ppm의 폴리에틸렌글리콜 수용액에 침지했다. 침지한 전기영동용 칩을 밀봉하고, 10.0kGy의 감마선을 조사하여, 그래프트화했다. 유로 내의 폴리에틸렌글리콜을 제거하고, 10규정의 수산화나트륨 수용액으로 유로를 세정했다. 세정 후, 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 충전하여 도 3의 A, B, C의 부분에 5% 폴리아크릴아미드(분자량 60만~100만) 0.1MTris-Aspartic Acid(pH8)용액을 넣고, D의 부분에 형광표식 트립신 인히비터 및 형광표식 BSA의 1% SDS를 함유하는 0.05MTris-HCl(pH8)용액을 넣었다. 폴리아크릴아미드, 단백질 용액을 충전한 전기영동용 칩의 A, B, C, D의 부분에 전극을 끼우고, B에 350V의 전압을 1분간 가했다. 그 후 C에 500V, B, D에 150V의 전압을 가하여 영동을 행한 것을 실시예7로 했다.

실시예6, 실시예7에서 영동된 단백질을 관찰했다. 결과를 도 6, 7에 나타낸다. 감마선의 조사량이 5kGy, 10kGy에 있어서 수지기판의 황변에 의한 피험시료 검출에의 영향이 없어 단백질을 검출할 수 있었다.

본 발명에 의해, 기재표면에의 단백질의 흡착이 없고, 내세정 효과가 있어 장시간 사용가능한 랩온칩용 기판을 제공할 수 있다. 검출 노이즈가 저감되므로, 미량 또한 정밀도가 높은 단백질의 분석이 가능해지고, 마이크로 유로를 갖는 폴리머제의 단백질 전기영동용 칩을 제공할 수 있다.

Claims

규소의 함유율이 중량비로 10%이하인 수지를 기재로 하고, 그 표면에 친수성 고분자가 공유결합된 것을 특징으로 하는 랩온칩용 기판.
제 1항에 있어서, 기재의 표면에 친수성 고분자를 고에너지선으로 공유결합시킨 것을 특징으로 하는 랩온칩용 기판.
제 1항에 있어서, 고에너지선이 감마선인 것을 특징으로 하는 랩온칩용 기판.
제 3항에 있어서, 감마선의 흡수에너지가 10kGy이하인 것을 특징으로 하는 랩온칩용 기판.
제 1항에 있어서, 친수성 고분자가 폴리알킬렌글리콜인 것을 특징으로 하는 랩온칩용 기판.
제 1항에 있어서, 폴리술폰계 수지, 폴리메타크릴산계 수지, 폴리아미드계 수지, 폴리아크릴로니트릴로부터 선택되는 1종이상의 수지를 기재로 하는 것을 특징으로 하는 랩온칩용 기판.
제 1항에 있어서, 단백질 처리 칩인 것을 특징으로 하는 랩온칩용 기판.
단백질 처리 칩의 유로에만 폴리알킬렌글리콜을 고에너지선으로 공유결합시킨 것을 특징으로 하는 제 7항에 기재된 단백질 처리 칩.
단백질 영동용인 것을 특징으로 하는 제 7항에 기재된 단백질 처리 칩.
단백질 전기영동용인 것을 특징으로 하는 제 7항에 기재된 단백질 처리 칩.
상기 전기영동에 있어서 전기 침투류를 억제하는 것을 특징으로 하는 제 7항에 기재된 단백질 처리 칩.