JP5577502B2 - 機能性マイクロチップおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
しかし、シリコーンゴム製のマイクロチップは、素材価格が汎用の樹脂と比較し高価なことや、熱硬化を用いるため成形時間が長く大量生産に向かないことなどから、広範囲に使用されるには至っていない。
射出成形によれば短時間で大量にマイクロチップを生産することは可能だが、この方法ではマイクロチップの微細な凹凸構造を鋳型から正確に転写して形成させることが困難なため、素材や金型などの面から様々な工夫がなされている。本発明者らもポリプロピレン系樹脂を使用し、射出成形により低コストで大量にマイクロチップを製造する方法を考案している。
特許文献1には、微細流路チャンネル内の一部に、光硬化性高分子を用いて多孔質構造部を形成し、この多孔質構造部に酵素、抗体等を固定する技術を開示する。
しかし、この多孔質構造部は流体の流れを制限するものであり汎用性に劣る。
よって現状では、熱可塑性樹脂からなる低価格で大量供給が可能なマイクロチップでは、酵素、抗体を固定することにより得られる高度な機能を利用することはできず、改良が求められる。
ここで微細構造部は、生化学的な分析、検査、合成等を目的にした流路や液だめ部を有し、この表面の少なくとも一部に、タンパク質を固定することができる趣旨である。
ここで、グラフトするポリマーは、炭素数が4以上のアルキル基、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、アルデヒド基、メチロール基、イソシアネート基、オキサゾリン基、アルコキシシリル基から選ばれる1つまたは2つ以上の化学構造を有する単量体を1種類以上含むポリマーが好ましい。
単量体が炭素数、4以上のアルキル基を有するものである場合には、疎水的な表面吸着によりタンパク質を固定することになり、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、アルデヒド基、メチロール基、イソシアネート基、オキサゾリン基、アルコキシシリル基等の化学構造を有する単量体を用いた場合にはその官能基を利用してタンパク質を固定する。
ここで、微細構造部の表面に固定するタンパク質は用途に応じて選択され、例えば、各種酵素、抗体、抗原等が例として挙げられる。
タンパク質を固定する場合に、タンパク質に有するフリーのアミノ基、あるいは酵素、抗体等に特異なチオール基等の官能基を用いて縮合固定させることもできる。
前記微細構造の表面の少なくとも一部に炭素数が4以上のアルキル基、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、アミド基、アルデヒド基、メチロール基、イソシアネート基、オキサゾリン基、アルコキシシリル基から選ばれる1つまたは2つ以上の化学構造を有する単量体を1種類以上含むポリマーをグラフトし、当該ポリマーにタンパク質を固定させても良い。
当該ポリマーの官能基にタンパク質のアミノ基又はチオール基等の官能基を縮合結合させることもできる。
ここで、前記微細構造の表面の少なくとも一部に液状の光重合開始剤または光重合開始剤溶液を接触させたのち、該表面に単量体を接触させながら光照射することによりポリマーをグラフトするようにしてもよい。
単量体を接触させる方法は、単量体の気体または単量体および不活性ガスからなる気体を用いても良い。
また、機能性タンパク質にはフリーのアミノ基を初めとして、チオール基、カルボキシル基等の官能基を有し、これらの官能基をグラフトしたポリマーの官能基と結合架橋剤を用いて固定してもよい。
これにより本発明に係る機能性マイクロチップは、バイオチップとして分析、検査、合成などに有利に使用することができる。
なお、タンパク質に有する官能基としてはアミノ基の他にチオール基やカルボキシル基を用いてもよく、その場合には、これに対応した縮合反応性の官能基をグラフトポリマー側に形成するとよい。
図1に示した例では、プレート状のマイクロチップ10に、微細構造部としてクランク型流路部11の先にクロス型流路部12を形成し、さらにY字型流路部13を形成した例になっている。
なお、クロス型流路の接続しない部分(図1にて上方に向けた流路)の先にはメクラ栓をしてある。
これらの流路部は、図1にて流路部と区別して分かりやすくするために点線で示した第1チューブ〜第5チューブを用いて連結してある。
マイクロチップの材料はポリプロピレン(J−3021GR、出光石油化学株式会社)とエラストマー(ハイブラー7311S、株式会社クラレ)とを5:5の割合で配合した樹脂を用いて射出成形した。
なお、ハイブラー7311Sは、水添ポリスチレン・ビニールポリイソプレン・ポリスチレンブロック共重合体でスチレン含有率12質量%である。
微細構造部の大きさは流路深さ50μm、クランク型流路部11aの幅100μm、クロス型流路部の内、符号12aの部分の幅100μm、同様に12b:40μm、12c:30μm、Y字型流路部13は同様に13a:20μm、13b:50μm、13c:70μmの幅に設定した例となっている。
グラフトしたい微細構造部の表面に光重合開始剤を所定時間接触させ、次にアクリル酸、メタクリ酸等の気体状の官能基含有モノマーを表面部に接触するように反応容器内に充填し、光(紫外線)を照射する。
本実施例では、重合開始剤としてチバ・スペシャルティ・ケミカルズ製の光重合開始剤 Ciba DAROCUR 1173(2-ヒドロキシ-2-メチル-1-フェニル-プロパン-1-オン)を用いた。 また、単量体はアクリル酸(和光純薬工業製)を使用し、紫外線照射は紫外線ランプ(アズワン株式会社製 LUV−16)を用いた。
このようにポリマーをグラフトしたマイクロチップは、その後に各種酵素、抗体、抗原を固定できる。
図1に示したY字型流路部13に液状の光重合開始剤を約10時間接触させ、次に30℃のアクリル酸を窒素でバブリングして発生させたアクリル酸と窒素の混合気体を流しながら紫外線を1時間照射し、ポリアクリル酸をグラフトした。
次に、Cy3で蛍光標識した抗体、Cy3 Goat F(ab’)2 Anti−Mouse IgG(H+L)2μg/ml水溶液と、結合架橋剤、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド メト−p−トルエンスルホナート(和光純薬工業製)20mg/ml水溶液とを1:1で混合した溶液に室温(26℃)、5時間接触させた。 その後は、蒸留水で洗浄し、乾燥した。
その蛍光観察像を図3に示す。
蛍光顕微鏡観察は、高級システム顕微鏡BX50にユニバーサル落射蛍光装置BX−FLA(何れもOLYMPUS製)を取付けて実施した。
図3(a)は明視野観察像であり(b),(c)は蛍光観察像である。
これにより、ポリアクリル酸をグラフトすることで抗体の固体化ができることが分かる。
図1に示したクランク型流路部12に、光重合開始剤を4時間接触させ、次にアクリル酸と窒素の混合流体を流しながら紫外線を1.5時間照射し、ポリアクリル酸をグラフトした。
次に、酵素、グルコースオキダーゼ10mgと、結合架橋剤、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド メト−p−トルエンスルホナート24mgを1mlの蒸留水に溶解した溶液を4℃にて20時間接触させた。
酵素が固定化されたことの確認を次のように実施した。
図1に示した外径1mm、内径0.5mmのシリコン製の第1チューブ21から10%グルコース水溶液(D(+)−グルコース、和光純薬工業製)、流量0.5μl/min(流速100mm/min)で流した。
第2チューブ21から1%フェリシアン化カリウム水溶液(和光純薬工業製)、流量0.8μl/minで流し、第4チューブ24から0.1%ルミノール(和光純薬工業製)in1%水酸化ナトリウム水溶液、0.8μl/minで流した。
ここで、送液はマイクロシリンジおよびマイクロシリンジポンプを用いた。
図4にルミノール反応による発光強度の測定結果を示す。
ルミノール発光は、グルコースオキシダーゼにより分解され生成する過酸化水素とルミノールの反応により起こり、発光強度は、Y字型流路部13の合流点にて、上記BX50と顕微鏡デジタルカメラDP70(OLYMPUS製)により測定した。
図4(a)は、ポリアクリル酸をグラフトしたもので(b)は、ポリアクリル酸をグラフトしないもの、(c)は、参考のために蒸留水を流路に流したものである。
この結果、図4の縦軸のスケールを考慮すると、ポリアクリル酸をグラフトしたものの発光度が高く、酵素を表面に固定できたことが確認できた。
11 クランク型流路部
12 クロス型流路部
13 Y字型流路部
21 第1チューブ
22 第2チューブ
23 第3チューブ
24 第4チューブ
25 第5チューブ
Claims (1)
- 重合体AとエラストマーBとを主たる組成成分とする樹脂製のマイクロチップであって、
重合体Aはポリプロピレン又はプロピレンが主成分である共重合体で結晶融解ピーク温度が140℃以上であり、
エラストマーBは、共役ジエンの重合体を水素添加した重合体Xと重合体Xおよび重合体Aに相溶しない重合体Yとからなるブロック共重合又は/及びグラフト共重合体であり、
当該マイクロチップは表面又は/及び内部に、流路又は液だめとして機能する構造を少なくとも1コ以上含む微細構造部を有し、
前記微細構造部の表面の少なくとも一部にポリマーをグラフトしてあり、当該グラフトしたポリマーがタンパク質を固定できる性質を有し、
前記ポリマーは、カルボキシル基又は/及びアミノ基を有し、
前記タンパク質は、酵素、抗体及び抗原のうちのいずれかであり、前記ポリマーにカルボキシル基を有する場合には、カルボジイミド類の結合架橋剤の共存下で水中にて前記タンパク質に有するアミノ基と反応させ、前記ポリマーにアミノ基を有する場合には、前記タンパク質に有するカルボルキル基とカルボジイミド類の結合架橋剤の共存下で水中にて反応させることで前記タンパク質が変質しない室温以下で当該タンパク質を固定したことを特徴とするマイクロチップ。
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