JP5008064B2 - 唾液成分のオンチップ分析方法 - Google Patents
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の消費量の低減化につながること、分析の高速化につながることなどが挙げられる。
ーザー励起蛍光検出の一連の操作が迅速かつ簡便に行えることを見出した。しかも、水系試料(唾液)と相溶性の低いオイルでリザーバー内の試料溶液を覆うことで、反応リザーバー(リザーバー1)からの溶媒の蒸発を抑制できること、また、マイクロ流路(チャネル)にある泳動緩衝溶液に、メチルセルロースを添加して粘性を持たせることにより、リザーバーからマイクロ流路への試料の拡散が抑制できることをも見出した。かかる知見に基づきさらに研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
(1)唾液及び蛍光ラベル化試薬をリザーバー1に導入して、これをオイルで被覆し、唾液中のアミノ基を有する成分を蛍光ラベル化する工程、及び
(2)2個のリザーバー1及び2の間に電圧を印加して、上記(1)で得られた蛍光ラベル化されたアミノ基を有する成分を、リザーバー1からリザーバー2の方向に移動させて分析を行う工程、
を含むオンチップ分析方法。
で唾液中のアミノ基を有する成分を蛍光ラベル化することを考慮すると、通常、オイルの被膜が形成しやすい円形のものが好適である。リザーバー1は水系試料(唾液)を蛍光ラベル化試薬で蛍光ラベル化するための反応リザーバーとして用い、リザーバー2は後述する電気泳動によって試料が移動する先のリザーバーとして用いられる。
所製)等が例示される。
(1)唾液及び蛍光ラベル化試薬をリザーバー1に導入して、これをオイルで被覆し、唾液中のアミノ基を有する成分を蛍光ラベル化する工程、及び
(2)2個のリザーバー1及び2の間に電圧を印加して、上記(1)で得られた蛍光ラベル化されたアミノ基を有する成分を、リザーバー1からリザーバー2の方向に移動させて
分析を行う工程。
)等が例示される。
(o−フタルアルデヒド)、DPS−Cl(4-(5,6-ジメトキシ-1,3-ジハイドロ-1-オキソ-2H-イソインドール-2-イル)ベンゼンスルホニルクロライド)、NBD−Cl
(4−クロロ−7−ニトロ−2,1,3−ベンズオキサジアゾール)、NBD−F(4−フルオロ−7−ニトロ−2,1,3−ベンズオキサジアゾール)、Phisyl−Cl(4-(1,3-ジヒドロ-1-オキソ-2H-イソインドール-2-イル)ベンゼンスルホニルクロライド)、DNBC(3,5-ジニトロベンゾイクロリド)、FITC(フルオレセインイソチオシアネ
ート)、等が例示される。このうち、温和な条件下において短時間で反応が進行する点からNBD−FやOPA等が望ましい。
オイルがリザーバーの試料溶液を完全に被覆することができ、極性有機溶媒の蒸発を抑制できるからである。
させて分析を行う。分析は、マイクロチップ電気泳動装置を用いて行う。
クロチップ電気泳動装置としては、コスモアイSV1100(日立ハイテクノロジーズ社製)、MCE-2010(島津製作所製)等が例示される。
(1)蛍光ラベル化試薬の選定
アミノ基と短時間で反応する蛍光ラベル化試薬として、市販のマイクロチップ電気泳動(MCE)装置の検出波長(励起波長473 nm,蛍光検出波長580 nm以上)を考慮した上で,カテコールアミン類との反応が報告されている蛍光ラベル化試薬4-fluoro-7-nitro-2,1,3- benzoxadiazole (NBD-F)を選定した(X. Zhu, P.N. Shaw, D.A. Barrett, Anal. Chim. Acta, 478 (2003) 259-269.)。唾液にはアミノ酸なども多数含まれておりNBD-Fと反
応する(E. Soderling, K.Parto, O. Simell, Braz. J. Oral. Sci., 1 (2002) 40-43. P. Coufal, J. Zuska, T. van de Goor, V. Smith, B. Gas, Electrophoresis, 24 (2003) 671-677.)。
図2に,アミノ酸及びカテコールアミンとNBD-Fとの反応式を示す。
図2のグリシン(R=H)及びノルエピネフリン(R1=H,R2=OH)を標準試料として用い,各標準溶液に対して50mMホウ酸塩緩衝液(pH8.0)を等量加えてpH調整し、
この液に等量の25mM NBD-Fアセトニトリル溶液を加えて反応させた。室温放置(グリシン溶液:約5分,ノルエピネフリン溶液:15〜30分)した液につき,NBD-Fラベル化反応生成物を質量スペクトルで確認した。
)は正イオンモードの質量スペクトルであり、ラベル化反応時間30分,250 μMノルエピ
ネフリン反応液に対し,0.05%ギ酸を含む水及びメタノール混液(1:1)で50倍希釈した
。試料導入量は3 μL/minであった。(b)は負イオンモードの質量スペクトルであり、
ラベル化反応時間15分,250 μMノルエピネフリン反応液に対し,水及び2-プロパノール
混液(1:1)で10倍希釈した。試料導入量は2 μL/minであった。
ヒト唾液を用いて,前述のラベル化条件でオンチップラベル化を実施し,蛍光顕微鏡を用いて状態観察を行った。その結果,反応中にアセトニトリルの揮発が認められた(図4)。
比率を9:1に低減させても蛍光ラベル化反応に支障がないことは,アミノ酸のプレラベル化標準試料を用いてマイクロチップ電気泳動で確認した(図5)。
(a)は、唾液 5 μL, NBD-F溶液 5 μL, オイル 5 μLであり、(b)は、唾液 9 μL, NBD-F溶液 1 μL, オイル 5 μLであり、(c)は、唾液 8 μL, NBD-F溶液 1 μL, オイル 6
μLである。
ポリ-α-オレフィンオイル 6 μLが好適であることが分かった。
(1)プレラベル化試料による検討
アミノ酸標準溶液(a)及びヒト唾液試料(b)に対し,50mMホウ酸塩緩衝液(pH8.0)を等
量加えてpH調整し,この液に等量の25mM NBD-Fアセトニトリル溶液を加えてラベル化した(室温,15分間放置)。これらの試料につき,MCE法で測定した。このとき,マイクロチ
ップ流路のプレコンディショニング(流路表面の平衡化)を測定直前に実施することで,分析再現性の大幅な向上が図れることが分かった。
<装置>
マイクロチップ電気泳動装置:コスモアイSV1100(日立ハイテクノロジーズ)
プラスチック製マイクロチップ:DNA用i-チップ IC-9001(日立ハイテクノロジーズ)
(流路幅100 μm,深さ30 μm,有効分離流路長30 mm)
<電気泳動液>
1.0%(w/v)メチルセルロースを含む50 mMホウ酸塩緩衝液(pH 9.3)
<泳動条件>
図1に記載のプラスチック製マイクロチップを用いて、下記の泳動条件で測定を行った。
実施例1(3)で定めたオンチップラベル化反応条件(試料溶液 8 μL, NBD-F溶液 1 μL, オイル 6 μL)で,反応中のマイクロチップ流路への試料拡散について検証した。
その結果,15分で約1.8 mm,30分で約2.9 mmの流路への流入が認められた(図7)。
プレラベル化したヒト唾液及びオンチップラベル化したヒト唾液について,ラベル化反応時間を室温15分間とし,MCE法で測定を行った。ラベル化反応率及び試料導入量に若干
の相違は認められているが,両者で類似した泳動結果が得られた(図8)。
であることが明らかとなった(図8)。
オイル皮膜なしの場合、図4に示すように反応中に試料中の溶媒が蒸発してしまい、測定値から濃度を定量できなくなる。
緩衝液にメチルセルロースを含まない場合、ラベル化反応中に拡散により試料がチップチャネル内へ流れ込んでしまう。メチルセルロース添加により試料拡散を電気泳動分離に影響がないように最小限に抑えている。
Claims (4)
- 2個のリザーバー1及び2の間が粘性物質を含有する電気泳動用緩衝液を含むマイクロ流路で結ばれたユニットを複数有する電気泳動用マイクロチップを用いて、唾液中のアミノ基を有する成分をオンチップ分析する方法であって、
(1)唾液及び蛍光ラベル化試薬をリザーバー1に導入して、これをオイルで被覆し、唾液中のアミノ基を有する成分を蛍光ラベル化する工程、及び
(2)リザーバー1及び2の間に電圧を印加して、上記(1)で得られた蛍光ラベル化されたアミノ基を有する成分を、リザーバー1からリザーバー2の方向に移動させて分析を行う工程、
を含むオンチップ分析方法。 - 電気泳動用緩衝液が、メチルセルロースを含むホウ酸塩緩衝液である請求項1に記載のオンチップ分析方法。
- 工程(1)で用いられる蛍光ラベル化試薬が、4−フルオロ−7−ニトロ−2,1,3−ベンズオキサジアゾールである請求項1に記載のオンチップ分析方法。
- 工程(1)で用いられるオイルが、ポリ−α−オレフィンオイルである請求項1に記載のオンチップ分析方法。
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