KR20060129382A - 크로마토그래피 분리용의 극성 변성된 결합 상 물질 - Google Patents

크로마토그래피 분리용의 극성 변성된 결합 상 물질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1종 이상의 화학식 R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ의 실란에 의해 변성된 무기 기재를 포함하는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 신규한 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 무기 기재는 실리카 겔이며, 2종 이상의 실란에 의해 변성된다. 본 발명은 이의 제조방법 및 크로마토그래피 분야에서의 용도에 관한 것이다. 당해 신규한 조성물은 더욱 우수한 크로마토그래피 성능, 감소된 실란올 활성, 증대된 안정성, 및 제조 및 성능의 재현성을 제공한다.
크로마토그래피, 고정 상, 극성 변성, 결합 상

Description

크로마토그래피 분리용의 극성 변성된 결합 상 물질{Polar-modified bonded phase materials for chromatographic separations}
본 발명은 일반적으로 크로마토그래피 분리에 유용한 조성물 및 기재에 관한 것이다.
크로마토그래피 분야에서 고정 상으로 사용되는 결합 상(bonded phase)의 제조가 광범위하게 연구되고 있다. 실란은 액체 크로마토그래피에서의 결합 상의 제조에 가장 일반적으로 사용되는 표면 변성제(modifying reagent)이다. 다양한 표면을 갖는 실란의 화학은 널리 연구되고 있다. 실란과 실리카성 크로마토그래피 지지체 표면과의 반응에 관한 일반적인 논의가 문헌에 기재되어 있다[참조: HPLC Columns: Theory , Technology , and Practice, U.D. Neue, Wiley-VCH, Inc., New York (1997)]. 실란과 다공성 실리카와의 반응에 관한 추가의 설명이 문헌에 기재되어 있다[참조: Characterization and Chemical Modification of Silica Surface, E. F. Vansant, et al., Elsevier Science B. V. New York (1995)]. 실란과 각종 재료와의 반응에 관한 폭 넓은 설명이 문헌에 기재되어 있다[참조: Silica Gel and Bonded 상, Their Production . Properties and Use in LC, R. P. W. Scott, John Wiley & Sons, New York (1993)].
일관능성, 이관능성 및 삼관능성 실란을 사용하여 결합 상을 제조하는 것이 문헌[참조: L.C. Sander et al., (1984) Anal. Chem. 56: 504-510]에 기재되어 있다. 일관능성 실란은 실리카와 단일 공유 결합을 형성하여, 본래 안정성이 낮은 결합된 층을 제조할 수 있다. 이관능성 실란은 화학 결합 형성능이 더 크기 때문에, 안정성이 어느 정도 높은 결합층을 형성시킨다. 대체로, 삼관능성 실란은 실리카 표면에 가장 많은 수의 결합을 형성시켜, 가장 안정한 결합 상을 제조하는 것으로 예상될 수 있다. 삼관능성 실릴화제를 일관능성 표면 변성제 대신 사용하는 경우, 리간드 표면 부착물의 혼합물이 발생한다. 이들 부착물은 한 가지 이상의 종류의 실란올이 실리카 표면 위에 존재함으로써 영향을 받으며, 예를 들면, 유리 실란올(분리됨), 회합된 실란올(인접함) 또는 같은자리 실란올(geminal silanol)이 있다. 다른 한편으로, 삼관능성 실란은 모노-, 비스- 또는 트리스-실록산 결합에 의해 표면에 부착될 수 있다. 유리 실란올로 가수분해되는 경우, 미반응된 알콕시 그룹은 추가의 제제와 추가로 반응하여 제2 층을 형성할 수 있다.
그러나, 이관능성 실란 및 삼관능성 실란과 반응하는 경우에도, 결합 공정의 무작위성 및 입체 장애로 인하여, 표면 실란올을 전부 제거할 수 없는 것으로 알려져 있다. 가장 널리 시판중인 결합 상은 일관능성 실란을 기본으로 하는 것인데, 그 이유는 이관능성 실란 및 삼관능성 실란을 사용하는 결합 상의 제조를 재현하는 것이 어렵기 때문이다. 실리카 표면상에 존재하거나 제제 또는 용매 중에 존재하 는 소량의 물에 의해, 표면에 부착된 결합 상의 양이 현저하게 증가하여, 결합 상의 배치 대 배치 재현성에 문제가 발생할 수 있다[참조: U. D. Neue, supra, p. 115].
실리카 겔은 크로마토그래피 지지체로서 매우 유용하며, 특히 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로서 사용할 수 있는 독특한 성질이 있다. 특히, 실리카의 표면은 각종 리간드를 사용하여 변성되어 기계적, 열적 및 화학 안정성이 양호한 결합 상이 생성될 수 있기 때문에, 실리카는 HPLC 충전물로 매우 널리 사용된다. 실리카 겔은 규산 Si(OH)4의 중합체성 형태이며, 여기서 실록산 결합은 물 분자를 제거함으로써 주변 규소 원자들 사이에 형성된다. 중합체 구조물의 파괴가 발생하면, 실란올 그룹(Si-OH)이 존재한다. 실리카 겔의 실란올 그룹의 표면 밀도는 약 8μmole/㎡이다. 이들 실란올 그룹은 실릴화제와 반응한다. 가장 강력한 실란화 반응임에도 불구하고, 입체 장애가 표면의 더욱 조밀한 분포(coverage)를 방지하기 때문에, 실란올 그룹의 50% 이하만이 실릴화 유도체로 전환될 수 있다. 따라서, 본래 실란올 그룹의 상당 부분이 잔류하고, 이 그룹은 크로마토그래피 분리 과정에서 친실란성(silanophilic) 분석 대상물(analyte), 예를 들면, 염기성 분석 대상물(일반적으로 아민)과 상호작용한다. 또한, 미반응된 실란올 그룹이 존재함에 따라 칼럼상의 염기성 분석 대상물이 흡착되어, 테일링(tailing) 및 비대칭 피크가 발생하거나, 분석 대상물의 비가역적 흡착이 발생한다.
실리카계 결합 상의 또 다른 단점으로는 pH 안정성이 있다. 통상의 실리카 겔을 기본으로 하는 충전 물질은 pH 안정성의 범위가 한정되어 있다(2.5 내지 7.5). 낮은 pH에서는 규소-탄소 결합이 파괴되어 결합 상이 침식(erosion)된다. 높은 pH에서는 실리카 겔 자체가 용해되어 결합 상이 손실된다. 이와 같은 두 가지 예에는 크로마토그래피 프로파일의 열화가 존재하며, 재현이 불가능하다. 일반적으로, pH는 규정된 pH 값으로 유지되어야 하거나; 좁은 피크 생성능, 목적하는 체류 용적 또는 혼합물의 성분의 용해와 같은 유효성 및 특성이 손실되어 칼럼이 비가역적으로 손상된다. 이와 같은 손상은 칼럼에 지정되어 있는 좁은 pH 범위를 넘어서 잘못 사용하는 경우, 단시간 동안 사용해도 발생할 수 있다. 통상적으로, 결합 상의 수명은, 극한의 pH에서 사용하는 경우에는 수 시간이고, 온화한 조건하에서는 수 개월이다[참조: R.P.W. Scott, supra, p. 173]. 결합 상 제조의 재현성은 특정한 분리 및 분리 계획(protocol)에 대한 결합 상의 지속적인 적합성의 확보에 중요하며, 특히 법의학적 분석(forensic analysis) 또는 다른 분석 과정에 중요하다.
이들 문제점의 일부 해결방법은 제시되어 있는데, 예를 들면, 말단차단(endcapping)하여 남아있는 실란올 잔류물을 제거하는 방법, 이동상에 유기 변성제를 가하는 방법, pH가 낮은 이동상을 사용하여 실란올을 양자화시키는 방법, 실란제(silane reagent)의 규소 원자상에 메틸 그룹 대신 더욱 벌키한 치환체를 도입시키는 방법, 두자리 리간드를 사용하는 방법, 일반적인 실록산 결합 대신 규소-탄소 결합을 실리카와 실란의 규소 원자들 사이에 형성시키는 방법 및 혼합된 삼관능성 실란을 사용하는 방법이 있다. 그럼에도 불구하고, 표면 실란올의 부정적인 효과는 현재 크로마토그래피 사용자들을 만족시킬 만큼 해소되지 않았다.
잔류하는 실란올의 문제를 부분적으로 해결하는 또 다른 방법은 실리카 지지체를 캡슐화하는 것이다. 비극성 선형 중합체를 실리카 표면 위에 흡착시키고, 감마선을 조사하여 가교결합이 개시될 수 있다. 그 결과 영구적이고 추출 불가능한 피막이 수득된다. 이와 같이 캡슐화된 실리카 또는 알루미나 지지체는 효율이 높고, 염기성 친실란성 화합물에 대한 분해능이 높다. 일본의 시세이도 캄파니(Shiseido Company)는 더욱 우수한 분해능을 갖는 캡슐화물을 함유하고 있으며, 이들은 이의 S/S-C18 역상 충전물상의 염기성 아미노 분석 대상물이 실험되고 있음을 보고하고 있다. 그러나, 이들 물질의 제조에는 문제가 있다.
분석 대상물들과 상호작용하는 잔류 실란올 그룹의 문제에 대한 유용한 해결방법은, 정전기적 및/또는 수소결합 상호작용을 통해 실리카 실란올과 반응할 수 있는 변성된 실리카 표면에 관능성을 부여하는 것이다. 결합된 γ-아미노프로필 그룹을 아실 클로라이드, 활성 에스테르 또는 이소시아네이트에 의해 변성시키는 것은 잘 알려져 있다. 예비 형성된 아미노프로필실릴화 실리카 표면을 아실화시켜, 아실아미노알킬 쇄를 갖는 실리카계 상 전달 촉매를 제조하는 방법이 문헌[참조: P. Tundo et al., (1979) J. Amer. Chem. Soc. 101: 6606-6613]에 기재되어 있다. 유사한 표면 변성 방법이, 키랄 액체 크로마토그래피에 적합한 아실아미노알킬실릴화 실리카 고정 상의 제조에 사용되고 있다[참조: N. Oi, et al., (1983) J. Chromatogr. 259: 487-493]. 아미노프로필실리카의 각종 산 클로라이드와의 아실화 반응이 활발하게 연구되고 있다[참조: A. Nomura, et al., (1987) Anal. Sci. 3: 209-212]. 이들 연구는 넓은 범위의 고체 상태 NMR에서 수행되고 있으며, 유사 한 아실아미노 유도된 실리카에서의 크로마토그래피 연구가 수행되고 있다[참조: B. Buszewski, et al., "peptieds bond carrying silicas", (1991) J. Chromatogr. 552: 415-427]. 최초의 상업용 극성-삽입된 상(polar-embedded phase)인 Supelcosil ABZ의 개발을 위한 유사한 화학물질을 사용하였다[참조: T. Ascah et al., (1990) J. Chromatogr. 506: 357-369]. 또한, 아미드 잔기 대신 우레탄 관능 그룹을 갖는 유사한 관능화된 실리카 표면이 보고되어 있다[참조: J. E. O'Gara, et al., (1999) Anal. Chem. 71: 2992-2997].
실리카 겔의 표면을 덮는 알킬 리간드에 극성 관능 그룹을 혼입시키면서, 상은 유기 변성제가 소량 존재하는 물 또는 100% 물에 의해 용매화된 형태로 남아있다. 이들 조건하에, 알킬 쇄는 이의 형태 자유도(conformational freedom)를 유지하며, 극성 분석 대상물과 상호작용할 수 있다. 표면에 인접한 극성 관능기의 존재는, 미반응된 실란올 그룹의 효과를 차단시키는 작용을 한다. 그러나, 이와 같은 접그방법은 개별적인 결합 단계를 갖기 때문에, 당해 상은, 알킬아미드 결합된 리간드 이외에도, 미반응된 아미노프로필 그룹, 아실 클로라이드와 실란올의 실리카 표면에서의 반응으로부터 제조된 알킬에스테르 결합된 리간드, 및 잔류 실란올의 일정 분획을 함유한다. 유도되거나 유도되지 않은 그룹의 혼합 가능성에 의해 분리의 잠재적 혼합 모드가 된다. 또한, 이것이 목적하는 고정 상 합성의 부반응이라는 사실 때문에, 잔류 아미노 그룹의 양은 조절하기 어렵다. 또한, 잔류 실란올 그룹의 문제, 산 또는 염기에 대한 상의 안정성, 및 상 제조의 재현성이 미해결된 상태로 남아있다.
선행 기술에서의 이들 단점은, 아래에 기술한 바와 같은 본 발명의 고정 상 및 제조방법에 의해 상당히 개선되었다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은, 하나의 배치로부터 또 다른 배치로의 재현성이 더욱 향상된 크로마토그래피용 결합 상을 제조함으로써, 위에서 언급한 바와 같은 당해 기술분야에서 요구되는 사항을 해소시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 염기성 및 산성 용출 조건에서 안정한 결합 상을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 실란올 함량이 낮으며 염기성 분석 대상물로 테일링되지 않는 결합 상을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 1종 이상의 화학식 1의 실란에 의해 변성된 무기 기재를 포함하는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이 고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
바람직하게는, 무기 기재는 금속 산화물 또는 메탈로이드 산화물, 예를 들면, 실리카, 알루미나, 제올라이트, 멀라이트, 지르코니아, 바나디아, 티타니아, 또는 이들의 혼합물 또는 복합체이며, 알콕시실란, 하이드록시실란, 아미노실란 또는 할로실란과 반응할 수 있는 반응성 금속 산화물을 갖는다. 무기 기재 표면을 실란을 사용하여 변성시킨 후에, 실란은 산소 결합을 통하여 무기 기재에 공유 결합된다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 모놀리스(monolith) 또는 다공성 입자 형태이다. 모놀리스에는 유리 섬유, 광섬유, 모세관 또는 비다공성 입자가 포함되며, 이들은 기재 표면과 연결될 수 있다. 바람직하게는, 당해 다공성 입자는 평균 세공 직경이 약 60 내지 약 1000Å이고 평균 입자 크기가 약 3 내지 약 60㎛이다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 실리카 겔을 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 무기 기재는, 1종 이상의 실란에 의해 변성되기 전에, 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 평형화(equilibration)된다. 평형 시간은 가변적이지만, 일반적으로 수 일 내지 수 주가 걸린다. 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 무기 기재가 평형 상태가 됨으로써 실리카 겔 기재 표면에 물이 일정한 양으로 제공되어, 크로마토그래피용 고정 상으로 사용되는 변성된 기재의 제조시 배치 대 배치 재현성이 향상된다. 바람직하게는, 불화세슘, 브롬화리튬, 브롬화아연, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 염화리튬, 브롬화칼슘, 아세트산칼륨, 불화칼륨, 염화마그네슘, 요오드화나트륨, 탄산칼륨, 질산마그네슘, 브롬화나트륨, 염화코발트, 질산나트륨, 요오드화칼륨, 염화스트론튬, 질산나트륨, 염화나트륨, 염화알루미늄, 브롬화칼륨, 황산알루미늄, 염화칼륨, 질산스트론튬, 염화바륨, 질산칼륨 또는 황산칼륨을 포함하는 수화 염 또는 포화 염 용액에 의해, 규정된 상대 습도를 갖는 분위기가 제공된다. 바람직하게는, 규정된 상대 습도는 50% 미만이다. 특별한 양태에서, 상대 습도는 약 0 내지 약 10%, 약 10 내지 약 20%, 약 20 내지 약 30%, 약 40 내지 약 50%, 약 50 내지 약 60%, 약 60 내지 약 70%, 약 70 내지 약 80%, 약 80 내지 약 90% 또는 약 90 내지 약 100%이다. 한 가지 바람직한 양태에서, 포화 염 용액은 상대 습도 약 11 내지 12%의 분위기를 제공하는 LiCl이다.
한 가지 측면에서, 변성된 무기 기재는, 크로마토그래피용 고정 상으로 사용되는 경우, 산성 또는 염기성 용출 조건에 1000시간 동안 노출되는 경우에도, 분리된 분석 대상물에 대한 체류 시간, 피크 대칭성(peak symmetry) 및 체류 인자가 약 3% 이하의 가변성을 나타낸다. 바람직하게는, 상기한 고정 상에서, 분리된 분석 대상물에 대한 체류 시간, 피크 대칭성 및 체류 인자는 산성 또는 염기성 용출 조건에 3000시간 동안 노출되는 경우에도 약 5% 이하의 가변성을 나타낸다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 실리카 겔이며, 2종 이상의 실란을 사용하여 변성된다. 한 가지 양태에서, 실리카 겔 기재는 제1 실란에 의해 변성되고, 후속적으로 당해 실리카 겔 기재는 제2 실란에 의해 변성된다. 또 다른 양태에서, 제1 실란, 제2 실란 또는 이들 둘 다는 실란의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 변성은 불활성 용매, 예를 들면, 톨루엔 또는 크실렌, 및 스캐빈져(scavenger), 예를 들면, 피리미딘, 트리에틸아민, 이미다졸, N,N-디메틸부틸아민 또는 이들의 배합물의 존재하에 수행된다. 바람직하게는, 실리카 겔 기재의 변성을 수행하기 위한 반응 온도는 불활성 용매의 환류 온도이다.
특정한 바람직한 양태에서, 실리카 겔 기재는 δ가 0 내지 3인 1종 이상의 실란과 δ가 0 또는 1인 1종의 실란에 의해 변성된다. 특정한 다른 양태에서, 실 리카 겔 기재는 δ가 0 내지 3인 2종 이상의 실란을 사용하여 변성된다.
특별한 양태에서, 실리카 겔 기재는 제1 실란에 의해 변성되고, 후속적으로 제2 실란에 의해 변성된다. 제1 실란은 δ가 0 내지 3일 수 있으며, 제2 실란은 δ가 0 내지 3일 수 있다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바밀, 시아노 또는 글리시독시이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 카바마토 또는 우레탄이고; 제2 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바밀, 시아노 또는 글리시독시이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바메이트, 우레탄 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 1이고, α 가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 이소시아네이토, 디올, 에톡시, 프로폭시, 카보닐, 카복시 또는 아세토닐이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바메이트, 우레탄 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 티오, 디티오, 에테르, 설피닐, 설포닐, 설폰산, 황산염, 설폰아미도, 아미노, 니트릴, 이소니트릴, 에폭시, 구아니디노, 니트로, 니트로소 또는 인산염이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 0, 1, 2 또는 3이고, α가 0이며, β가 0 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이며, Q가 아미도이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 아미도, 시아노 또는 글리시독시이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 아미도, 시아노 또는 글리시독시이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 이소시아네이토, 디올, 에톡시, 프로폭시, 카보닐, 카복시 또는 아세토닐이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 티오, 디티오, 에테르, 설피닐, 설포닐, 설폰산, 황산염, 설폰아미도, 아미노, 니트릴, 이소니트릴, 에폭시, 구아니디노, 니트로, 니트로소 또는 인산염이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, R1이 H이며, γ가 0, 1 또는 2이고; 제2 실란은 δ가 0 또는 1이고, β가 1 내 지 30이며, α가 0 또는 1이고, R1이, 존재하는 경우, H 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 아미도, 시아노 또는 글리시독시이다.
다른 양태에서, 실리카 겔 기재는 하나 이상의 추가의 실란, 예를 들면, 말단차단 실란에 의해 추가로 변성된다. 바람직하게는, 말단차단 실란은 모노실란, 디실란, 트리실란, 테트라실란 또는 이들의 배합물이다. 말단차단에 적합한 모노실란에는, 예를 들면, 트리메틸클로로실란, N,N-디메틸트리메틸실릴아민, 트리메틸실릴이미다졸, 디메틸디클로로실란, 디메톡시디메틸실란, 트리메틸실란올, 트리메틸실릴포스핀 또는 N-트리메틸실릴아세트아미드가 포함된다. 말단차단에 적합한 디실란에는, 예를 들면, 헥사메틸디실라잔 또는 1,3-디메톡시테트라메틸디실록산이 포함된다. 말단차단에 적합한 트리실란에는, 예를 들면, 헥사메틸사이클로트리실록산이 포함된다. 말단차단에 적합한 테트라실란에는, 예를 들면, 옥타메틸사이클로테트라실록산이 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 변성된 무기 기재는 크로마토그래피용 고정 상으로 사용된다. 바람직한 양태에서, 크로마토그래피에는 박층 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 정상(normal phase) 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 이온 쌍 크로마토그래피, 역상 이온 쌍 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 키랄 인지(recognition) 크로마토그래피, 관류 크로마토그래피, 일렉트로크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 마이크로칼럼 액 체 크로마토그래피, 모세관 크로마토그래피, 액체-고체 크로마토그래피, 제조용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피, 침강 액체 크로마토그래피, 결합 상 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 섬광 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피 질량 분석기, 기체 크로마토그래피, 미세유체(microfluid)를 기본으로 하는 분리, 고체 상 추출 분리 또는 모놀리스를 기본으로 하는 분리가 있다.
특별한 양태에서, X는 할로겐, 알콕시, 아미노 또는 아실옥시이다. 특정한 양태에서, Q, R1 또는 R2는 키랄 인지 리간드이다. 바람직하게는, 키랄 인지 리간드는 임의로 활성이고, 지질, 아미노산, 펩티드, 당류, 하이드록시 치환된 아민 또는 하이드록시 치환된 산을 포함하는 추가의 키랄 화합물을 포함할 수 있다. 특정한 양태에서, 키랄 인지 리간드는 헤테로사이클로알킬 잔기 또는 연결된 헤테로사이클로알킬 잔기, 예를 들면, 사이클로덱스트린이다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 실리카 겔 기재이며, 당해 기재는 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 실리카 겔 기재를 평형화시키는 단계(a), 1종 이상의 실란에 의해 실리카 겔 기재를 변성시키는 단계(b) 및 말단차단 실란에 의해 실리카 겔 기재를 추가로 변성시키는 단계(c)에 의해 변성된다.
다른 양태에서, 제2 실란을 사용하는 추가의 변성 단계가 단계(b) 이후에 또는 단계(b)와 동시에 수행된다. 특정한 다른 양태에서, 제2 실란의 δ는 1이고, R1은 C1-C6 하이드로카빌이다. 특별한 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계와 동시에 수행하며, 다른 특별한 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계 이후에 수행한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 무기 기재를 평형화시키는 단계(a), 1종 이상의 실란에 의해 무기 기재를 변성시키는 단계(b) 및 말단차단 실란에 의해 무기 기재를 추가로 변성시키는 단계(c)를 포함하는, 무기 기재의 변성방법을 제공한다.
바람직하게는, 실란은 화학식 1의 화합물이다.
화학식 1
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
특별한 양태에서, 당해 방법은 무기 기재를 제2 실란(여기서, δ는 0 내지 3이다)으로 변성시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 실란의 δ는 0 또는 1이다. 특정한 다른 양태에서, 제2 실란의 δ는 1이고, R1은 C1-C6 하이드로카빌이다. 특별한 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계와 동시에 수행하며, 다른 특별한 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계 이후에 수행한다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 수화 염 또는 포화 염 용액에 의해 제공된 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 평형화된다. 바람직하게는, 수화 염 또는 포 화 염 용액에는 불화세슘, 브롬화리튬, 브롬화아연, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 염화리튬, 브롬화칼슘, 아세트산칼륨, 불화칼륨, 염화마그네슘, 요오드화나트륨, 탄산칼륨, 질산마그네슘, 브롬화나트륨, 염화코발트, 질산나트륨, 요오드화칼륨, 염화스트론튬, 질산나트륨, 염화나트륨, 염화알루미늄, 브롬화칼륨, 황산알루미늄, 염화칼륨, 질산스트론튬, 염화바륨, 질산칼륨 또는 황산칼륨이 포함된다. 특별한 양태에서, 상대 습도는 약 0 내지 약 10%, 약 10 내지 약 20%, 약 20 내지 약 30%, 약 40 내지 약 50%, 약 50 내지 약 60%, 약 60 내지 약 70%, 약 70 내지 약 80%, 약 80 내지 약 90% 또는 약 90 내지 약 100%이다. 특별한 양태에서, 규정된 상대 습도는 50% 미만이다.
한 가지 양태에서, 무기 기재는 금속 또는 메탈로이드 산화물 기재이다. 특별한 양태에서 금속 또는 메탈로이드 산화물은 실리카, 알루미나, 제올라이트, 멀라이트, 지르코니아, 바나디아, 티타니아 또는 이들의 혼합물 또는 복합체를 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 위에서 기술한 바와 같이 1종 이상의 실란에 의해 변성된 무기 기재를 포함하는 고정 상을 사용하는 크로마토그래피 분리를 수행함을 포함하는, 다수의 분석 대상물을 분리하는 방법을 제공한다. 크로마토그래피 분리는 기체 또는 액체 이동상을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 양태에서, 이동상은 물을 0 내지 100% 포함한다. 바람직하게는, 크로마토그래피 분리는 박층 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 이온 쌍 크로마토그래피, 역상 이온 쌍 크로마토 그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 키랄 인지 크로마토그래피, 관류 크로마토그래피, 일렉트로크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 마이크로칼럼 액체 크로마토그래피, 모세관 크로마토그래피, 액체-고체 크로마토그래피, 제조용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피, 침강 액체 크로마토그래피, 결합 상 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 섬광 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피 질량 분석기, 기체 크로마토그래피, 미세유체를 기본으로 하는 분리, 고체 상 추출 분리 또는 모놀리스를 기본으로 하는 분리이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 1종 이상의 화학식 1의 실란을 사용하여 변성된 실리카 겔 기재를 제공하는, 실리카 겔 기재상에서 크로마토그래피를 사용하여 분석 대상물을 분리시키는 개선된 방법을 제공하며, 당해 방법에서, 실리카 겔 기재는, 1종 이상의 실란을 사용하여 변성되기 전에, 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 평형화되며, 실리카 겔은 δ가 0 내지 3인 1종 이상의 실란, δ가 0 또는 1인 1종 이상의 실란 및 말단차단제를 사용하여 변성된다.
화학식 1
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
다른 측면에서, 본 발명은 위에서 기술한 바와 같이 고정 상이 변성된 무기 기재를 포함하는 크로마토그래피 칼럼을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 무기 기재를 변성시키기 위한 화학식 1의 실란을 제공한다.
화학식 1
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
본 발명의 추가의 목표, 이점 및 특징은 다음의 상세한 설명에서 일부 기술되며, 당해 기술분야의 숙련가들이 실시할 실험에 의해 명확하게 될 것이며, 본 발명의 실제 사용에 의해 명확해질 수 있다.
본 발명은 다음의 도면을 참조로 하면 더욱 완전하게 이해될 수 있다.
도 1은 극성 변성되고 결합된 실리카 겔을 제조하기 위한, 실란의 실리카 겔과의 합성 반응을 개략적으로 예시한 것이다.
도 2는 극성 변성된 고정 상의 구조를 개략적으로 예시한 것이다.
도 3A 내지 3D는 극성 변성된 결합 상의 안정성에 대한 pH 1.5의 효과를 보여준다.
도 4A 내지 4D는 극성 변성된 결합 상의 안정성에 대한 pH 10.0의 효과를 보 여준다.
도 5는 20% 메탄올 중에서의 궤양 치료제에 대한, 알킬의 선택도와 극성 변성된 결합 상의 선택도의 차이를 예시한 것이다.
도 6은 20% 메탄올 중에서의 세팔로스포린 항생제에 대한, 알킬의 선택도와 극성 변성된 결합 상의 선택도의 차이를 예시한 것이다.
도 7은 파라벤(paraben) 약제에 대한, 알킬의 선택도와 극성 변성된 결합 상의 선택도의 차이를 예시한 것이다.
도 8은 경련방지제에 대한, 알킬의 선택도와 극성 변성된 결합 상의 선택도의 차이를 예시한 것이다.
도 9A 및 9B는 감기 치료제 성분에 대한, 알킬의 선택도와 극성 변성된 결합 상의 선택도의 차이를 예시한 것이다.
도 10은 알킬 및 극성 변성된 결합 상에서의 항진균제의 크로마토그래피 분리를 예시한 것이다.
도 11A 내지 11C는 극성 변성된 결합 상에서의 아닐린 동족체, 베타-차단제 및 트리사이클릭 항우울제의 크로마토그래피 분리를 예시한 것이다.
도 12A 및 12B는 100% 수성 이동상 조건하의 극성 변성된 결합 상에서의 뉴클레오티드 및 카테콜라민의 크로마토그래피 분리를 예시한 것이다.
도 13A 및 13B는 높은 유기 이동상 조건하의 알킬 및 극성 변성된 결합 상에서의 지방산과 비타민의 크로마토그래피 분리를 예시한 것이다.
도 14는 알킬 및 극성 변성된 결합 상을 사용한, 펩티드로 이루어진 혼합물 의 크로마토그래피 분리를 예시한 것이다.
I. 정의 및 개요
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 별도의 언급이 없는 한 본 발명은 가변적일 수 있는 특정한 알킬, 아릴 또는 극성 그룹에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정한 양태를 기술하기 위한 것일 뿐이며 본 발명의 범주를 한정시키기 위한 것이 아님이 이해되어야 한다.
본원 및 청구의 범위에 사용되는 바와 같이, 본원에 별도로 명확하게 기재되어 있지 않는 한, 용어에는 복수 개의 대상이 포함된다. 따라서, 예를 들면, "용매"에는 2종 이상의 용매가 포함되며, "실란"에는 2종 이상의 실란이 포함된다.
수치의 범위가 제공되는 경우, 본원에 별도로 명확하게 기재되어 있지 않는 한, 언급된 범위내의 상한치와 하한치 사이의 하한치 단위의 1/10에 대한 각각의 개재값(intervening value) 및 언급된 임의의 다른 값 또는 언급된 범위내의 개재값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더욱 좁은 범위의 상한치와 하한치는 독립적으로 더욱 좁은 범위에 포함될 수 있으며, 본 발명에도 포함되어, 언급된 범위의 한계에서 명확하게 배재된다. 언급된 범위가 상한치와 하한치 중의 하나 또는 이들 둘 다를 포함하는 경우, 이들 값 중의 하나 또는 둘 다는 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 카보닐 잔기는 "C(O)"로 표기한다.
본원에 사용된 바와 같이, Q는 -NHC(O)- (아미도), -C(O)NH- (카바밀), -OC(O)NH- (카바마토), -NHC(O)O- (우레탄), -NHC(O)NH- (카바미도 또는 우레아), -NCO (이소시아네이토), -CHOHCHOH- (디올), CH2OCHCH2O- (글리시독시), -(CH2CH2O)n- (에톡시), -(CH2CH2CH2O)n- (프로폭시), -C(O)- (카보닐), -C(O)O- (카복시), CH3C(O)CH2- (아세토닐), -S- (티오), -SS- (디티오), -CHOH- (하이드록시), -O- (에테르), -SO- (설피닐), -SO2- (설포닐), -SO3-(설폰산), -OSO3-(황산염), -SO2NH-, -SO2NMe- (설폰아미도), -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +- (아민), -CN (니트릴), -NC (이소니트릴), -CHOCH- (에폭시), -NHC(NH)NH- (구아니디노), -NO2 (니트로), -NO (니트로소) 및 -OPO3- (인산염)으로 정의된다(여기서, Me는 메틸렌 또는 메틸이고, n은 30 이하, 일반적으로 10이하의 정수이다). Q는 단일 극성 잔기 이상의 극성 잔기에 가능성(possibility)을 제공해야 한다. 예를 들면, Q는 에폭시 및 에테르 관능성 둘 다를 포함하는 글리시독시, 및 폴리에테르 폴리에톡시 및 폴리프로폭시를 포함한다.
"글리시독시"는 "글리시딜옥시"와 혼용되며, 에폭시 관능 그룹 CH2OCHCH2O-을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "알킬 결합 상"은 본 발명에 따르는 실란(여기서, α는 0이고, δ는 0이며, β는 60 이상이다)에 의해 변성된, 알킬 잔기를 갖는 변성된 무기 기재를 의미한다. 그렇지 않으면, "알킬 결합 상"은 실란(여기서, α는 0이고, δ는 1 내지 3이다)에 의해 변성된, 알킬 잔기를 갖는 변성된 무기 기재를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "극성 변성된 결합 상"은 본 발명에 따르는 하나 이상의 극성 실란(여기서, δ는 0 내지 3이며, β는 1 내지 30이고, α는 1이다)에 의해 변성된, 위에서 기술한 바와 같이 무기 기재의 표면 가까이에 위치한 극성 Q 잔기(예를 들면, 아미도, 카바마토, 시아네이토, 에테르 등)를 제공하는 변성된 무기 기재를 의미한다.
"극성-삽입된 상(polar-embedded phase)"은 알킬 잔기를 갖는 하나 이상의 극성 실란에 의해 변성되고, 알킬 잔기를 가지며, 극성 Q 잔기가 알킬 잔기에 의해 형성된 소수성 상에 삽입된, 극성 변성된 결합 상을 의미한다. 극성 실란은, 2개의 극성 알킬 관능 그룹이 존재하는 한, 장쇄 극성 실란, 단쇄 극성 실란 또는 이들의 배합물일 수 있다.
"장쇄 실란"은 δ다 0 내지 3이고, β가 1 내지 30이며, α가 0 또는 1인 본 발명에 따르는 실란을 의미하며, 당해 실란은 탄소수 7 이상의 하이드로카빌 그룹을 포함한다.
"단쇄 실란"은 δ다 0 내지 3이고, β가 1 내지 30이며, α가 0 또는 1인 본 발명에 따르는 실란을 의미하며, 당해 실란은 탄소수 6 이하의 하이드로카빌 그룹을 포함한다.
"하이드로카빌"은 알케닐 또는 알키닐 잔기를 포함하지만, 일반적으로 알킬 잔기를 의미한다.
"규정된 상대 습도를 갖는 분위기"는 포화 염 용액 또는 수화 염 용액에 제공되는 제어된 일정한 상대 습도를 의미한다. 통상적으로, 샘플은 밀봉된 용기, 예를 들면, 데시케이터 속에 존재하는 포화 염 용액 또는 수화 염에 걸쳐 평형화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "평형화"는 추가의 변화가 일어나지 않는 정상 상태 조건을 의미한다. 무기 기재를 규정된 상대 습도 분위기에서 평형화시키는 것은, 정상 상태 또는 평형화시키는 데 통상적으로 수 일 또는 수 주가 필요하며, 무기 기재의 표면의 함수량은 일정하다. 비교적 높은 상대 습도의 분위기하에 평형화시킴으로써, 무기 기재의 표면 결합된 물의 양이 더 많아진다. 반대로, 비교적 낮은 상대 습도의 분위기하에 평형화시킴으로써, 무기 기재의 표면 결합된 물의 양은 더 적어진다.
"키랄 인지 리간드"는 분석 대상물의 다른 에난티오머보다, 분석 대상물의 특정한 에난티오머와 우선적으로 상호작용할 수 있는, 키랄 또는 광학 활성을 갖는 잔기를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비대칭" 또는 "피크 비대칭"은 크로마토그래피 피크의 형태를 기술하는 인자를 의미하며, 이는 10% 피크 높이에서의 피크 정점, 크로마토그래피 곡선의 배면, 크로마토그래피 곡성의 전면 사이의 거리의 비로 정의된다.
본 발명은 차세대 결합 상; 및 1종 이상의 실란이 무기 기재와 반응하여 최소한의 잔류 음이온 교환 활성, 예를 들면, 실란올 활성을 갖는 더욱 우수한 크로마토그래피 흡착제를 제공하는 표면 변성방법을 사용한 제조방법을 기술하고 있다. 본 발명은 공유 결합된 실란으로 최대한 분포된 결합 상을 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 음이온 교환 활성의 부재는 이들 차세대 물질의 중요한 진전이다. 또한, 결합 상은 염기성 및산성 처리에 대한 매우 향상된 안정성, 길어진 수명 및 재현 가능한 크로마토그래피 성능을 나타낸다.
또한, 본 발명은 변성된 알킬 및 극성 결합 상의 제조에 실란을 제공한다. 실란은, 2단계 변성 공정에 걸쳐 이점을 갖는 단일 반응 단계에서 무기 기재 표면에 결합될 수 있는 목적하는 치환체를 갖고 있는 것으로 기재되어 있다. 또한, 2종 이상의 상이한 실란은 무기 기재에 유리하게 결합될 수 있으며, 단일 반응 또는 순차적 반응에서 결합될 수 있다.
다음과 같이, 이들 차세대 고정 상의 제조방법은 알려져 있는 고정 상에 대한 다수의 이점을 나타낸다. 고정 상은 역상 특성을 유지하고(1), 종래의 알킬 상에 비해, 고정 상은 상이한 선택도를 제공하며(2), 통상의 알킬 칼럼에 불충분하게 체류된 극성 분석 대상물이 이들 신규한 상의 극성 그룹과 상호작용하여 향상된 체류 특성을 나타내고(3), 100% 수성 이동상 중에서도 고정 상을 완전히 습윤되도록 유지시킴으로써, 극성 그룹은 극성 화합물의 체류를 보조하며(4), 실란올 활성이 억제되어, 특히 중간 pH 값에서, 염기성 화합물의 피크 형태가 양호해지고 테일링이 감소하고(5), 이들 상은 상당한 유기 이동상과도 혼화성이다(6). 이동상 조성물이 100% 수성 상에서부터 100% 유기 상까지 전 범위를 포괄하는 능력은, 매우 극성 및 비극성인 분석 대상물을 둘 다 갖는 샘플을 분석하기 위한 구배방법(gradient method)에 유용하다.
고정 상의 개선을 위해 본 발명에 사용되는 변성된 무기 기재 및 이의 제조방법은 아래에 기술되어 있다.
II . 실란
본 발명의 조성물의 제조에 사용되는 실란은 통상의 합성 방법, 예를 들면, 에폭사이드의 가수분해, 아민과 아실 클로라이드의 반응, 및 알콜 또는 아민의 탄소-질소 이중 결합에의 첨가에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, O-알킬-N-(트리알콕시실릴알킬)우레탄은 미국 특허공보 제6,071,410호[Nau et al.]에 기재되어 있는 바와 같이 제조할 수 있다. 추가의 극성 실란은 미국 특허공보 제6,645,378호[Liu et al.] 및 제5,374,755호[Neue et al.]에 기재되어 있다. Q와 같은 극성 잔기를 갖는 실란은 유기 합성 분야의 숙련가들에 의해 합성될 수 있다. 극성 실란은 적절한 알릴 에테르, 아미드, 카바미드 등을 디메틸에톡시실란과 반응시켜 목적하는 R1 δ-Qα-(CH2)β 성분을 갖는 디메틸에톡시실란을 수득함으로써 용이하게 제조할 수 있다.
한 가지 양태에서, 무기 기재를 변성시키기 위해 화학식 1의 실란이 제공된다.
화학식 1
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
바람직하게는, 결합 상의 제조에 사용되는 1종 이상의 실란의 α는 1이다. 바람직하게는 Q는 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH- 또는 -NHC(NH)NH-이다. 다른 양태에서, Q는 -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -S-, -SS-, -NO2, -NO 또는 -OPO3-이다.
III . 알킬 및 극성 결합 상
본 발명의 수행은, 더욱 장쇄인 알킬 쇄(예를 들면, C8-C18)의 결합을 따라 단쇄 극성 실란이 결합하는 것은 고정 상(당해 고정 상은 극성 분석 대상물을 상당한 수성 조건하에 재현성 있게 보유할 수 있다)에 대한 성공적인 전개 방식이라는 것을 밝혀내는 것이다. 이들 단쇄 극성 또는 친수성 실란의 결합에 의해, 실리카 표면이 물로 습윤되며 더욱 장쇄인 알킬 쇄와 완전하게 상호작용한다. 이러한 유형의 역상 충전물을 제조하기 위한 결합 밀 말단차단 공정은 최소한 2단계 공정이다. 한 가지 양태에서, 제1 단계에서, 알킬 실란, 극성 변성된 실란 또는 이들의 혼합물일 수 있는 하나 이상의 장쇄 실란(예를 들면, C8 또는 C18)은 무기 기재, 예를 들면, 실리카에 결합된다. 제2 결합 단계는 단쇄 실란 또는 말단차단제를 사용한다. 말단차단 반응은 2개의 최초 결합 단계 이후에 수행될 수 있다. 표 1은 본원에 기술된 결합 상의 제조에 사용되는 예시적인 실란을 나타낸 것이다.
Figure 112006057624396-PCT00001
극성 또는 친수성 단쇄 실란은 결합 후에 가수분해되어 실란올 그룹이 제조될 수 있다. 표면에 인접한 이들 실란올 그룹은 최종 알킬 결합 상에 높은 수준의 극성 특성을 제공하지만, 결합된 실리카 기재의 표면에서 발견된 잔류 실란올보다 산도(acidity)가 낮아서, 체류성이 낮고 친실란성 분석 대상물의 테일링이 발생한다.
또 다른 양태에서, 제1 단계에서, 하나 이상의 장쇄 알킬실란 또는 극성 변성된 실란은 무기 기재에 결합된다. 제2 결합 단계는 단쇄 극성 변성된 실란을 사용하여 수행되며, 임의의 제3 결합 단계는 말단차단제를 사용하여 수행된다.
따라서, 본 발명은 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한, 1종 이상의 화학식 1의 실란에 의해 변성된 무기 기재를 포함하는 조성물을 제공한다.
화학식 1
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
고정 상의 목적하는 소수성 및 극성은 R1, R2, β및 Q의 선택에 의해 조절된다. 바람직한 양태에서, 무기 기재는 실리카 겔이며, 2종 이상의 실란에 의해 변성된다. 한 가지 양태에서, 실리카 겔 기재는 제1 실란에 의해 변성되고, 후속적으로 당해 실리카 겔 기재는 제2 실란에 의해 변성된다. 또 다른 양태에서, 제1 실란, 제2 실란 또는 이들 둘 다는 실란의 혼합물을 포함한다
특정한 바람직한 양태에서, 실리카 겔 기재는 δ가 0 내지 3인 1종 이상의 실란과 δ가 0 또는 1인 1종의 실란에 의해 변성된다. 특정한 다른 양태에서, 실리카 겔 기재는 δ가 0 내지 3인 2종 이상의 실란을 사용하여 변성된다.
특별한 양태에서, 실리카 겔 기재는 제1 실란에 의해 변성되고, 후속적으로 제2 실란에 의해 변성된다. 제1 실란은 δ가 0 내지 3일 수 있으며, 제2 실란은 δ가 0 내지 3일 수 있다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바밀, 시아노 또는 글리시독시이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 카바마토 또는 우레탄이고; 제2 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바밀, 시아노 또는 글리시독시이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바메이트, 우레탄 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 이소시아네이토, 디올, 에톡시, 프로폭시, 카보닐, 카복시 또는 아세토닐이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도, 카바메이트, 우레탄 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이고, Q가 티오, 디티오, 에테르, 설피닐, 설포닐, 설폰산, 황산염, 설폰아미도, 아미노, 니트릴, 이소니트릴, 에폭시, 구아니디노, 니트로, 니트로소 또는 인산염이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 1이며, β가 1 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이고, Q가 아미도 또는 카바밀이며; 제2 실란은 δ가 0, 1, 2 또는 3이고, α가 0이며, β가 0 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C30 하이드로카빌이며, Q가 아미도이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 아미도, 시아노 또는 글리시독시이다.
다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 아미도, 시아노 또는 글리시독시이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 이소시아네이토, 디올, 에톡시, 프로폭시, 카보닐, 카복시 또는 아세토닐이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, γ가 0, 1 또는 2이며, R1이 H이고; 제2 실란은 δ가 1이고, R1이 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 티오, 디티오, 에테르, 설피닐, 설포닐, 설폰산, 황산염, 설폰아미도, 아미노, 니트릴, 이소니트릴, 에폭시, 구아니디노, 니트로, 니트로소 또는 인산염이다.
또 다른 양태에서, 제1 실란은 δ가 1이고, α가 0이며, β가 8 내지 30이고, R1이 H이며, γ가 0, 1 또는 2이고; 제2 실란은 δ가 0 또는 1이고, β가 1 내지 30이며, α가 0 또는 1이고, R1이, 존재하는 경우, H 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C6 하이드로카빌이며, Q가 아미도, 시아노 또는 글리시독시이다.
당해 기술분야의 숙련가들은 상기한 양태들은 예시적인 것일 뿐이며, 실란과 말단차단제의 추가의 배합물이 본 발명의 조성물 및 제조방법에 포함됨을 인지할 것이다.
다른 양태에서, 실리카 겔 기재는 하나 이상의 추가의 실란, 예를 들면, 말단차단 실란에 의해 추가로 변성된다. 바람직하게는, 말단차단 실란은 모노실란, 디실란, 트리실란, 테트라실란 또는 이들의 배합물이다. 말단차단에 적합한 모노실란에는, 예를 들면, 트리메틸클로로실란, N,N-디메틸트리메틸실릴아민, 트리메틸실릴이미다졸, 디메틸디클로로실란, 디메톡시디메틸실란, 트리메틸실란올, 트리메틸실릴포스핀 또는 N-트리메틸실릴아세트아미드가 포함된다. 말단차단에 적합한 디실란에는, 예를 들면, 헥사메틸디실라잔 또는 1,3-디메톡시테트라메틸디실록산이 포함된다. 말단차단에 적합한 트리실란에는, 예를 들면, 헥사메틸사이클로트리실록산이 포함된다. 말단차단에 적합한 테트라실란에는, 예를 들면, 옥타메틸사이클로테트라실록산이 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 고정 상이 위에서 기술한 바와 같은 변성된 무기 기재를 포함하는 액체 또는 기체 크로마토그래피용 크로마토그래피 칼럼을 제공한다. 다른 측면에서, 아래에 기술한 바와 같이, 변성된 결합 상은 미세유체 크로마토그래피에 사용할 수 있다.
IV . 알킬 및 극성 변성된 결합 상 의 제조
또 다른 양태에서, 본 발명은 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 무기 기재를 평형화시키는 단계(a), 1종 이상의 실란에 의해 무기 기재를 변성시키는 단계(b) 및 말단차단된 실란을 사용하여 무기 기재를 추가로 변성시키는 단계(c)를 포함하는, 무기 기재의 변성방법이 기술되어 있다.
바람직하게는, 1종 이상의 실란은 화학식 1의 화합물이다.
화학식 1
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
특별한 양태에서, 당해 방법은 무기 기재를 제2 실란(여기서, δ는 0 내지 3이다)으로 변성시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 실란의 δ는 0 또는 1이다. 특정한 다른 양태에서, 제2 실란의 δ는 1이고, R1은 C1-C6 하이드로카빌이다. 특별한 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계와 동시에 수행하며, 다른 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계 이후에 수행한다.
도 1은 극성 변성된 결합 상이 합성을 위한 반응을 개략적으로 예시한 것이다. 결합 상 제조의 제1 단계는 다공성 실리카 겔과 장쇄 실란과의 반응 및 다공성 실리카 겔과 단쇄 극성 실란과의 반응이다. 두 가지 실릴화 반응이 수행됨에도 불구하고, 소량의 반응 가능한 실란올이 실리카 겔의 표면에 잔류할 수 있다. 따라서, 말단차단 반응을 수행하여 임의의 원치않는 잔류 실란올을 덜 흡착성인 트리메틸실릴 그룹으로 전환시킬 수 있다. 바람직하게는, 당해 반응은 결합된 실리카를 과량의 말단차단제와 접촉시켜 수행한다. 당해 반응은 잔류 실란올이 완전히 처리되도록 충분한 시간 동안 수행되어야 한다.
도 2는 장쇄 및 단쇄 실란 리간드가 실리카 겔의 표면 실란올의 약 50%를 변성시키는, 극성 변성된 결합 상의 구조를 개략적으로 예시한 것이다. 잔류 표면 실란올은 적절한 말단차단제, 예를 들면, 트리메틸클로로실란에 의해 말단차단된다.
바람직하게는, 변성은 불활성 용매, 예를 들면, 톨루엔 또는 크실렌, 및 스캐빈져, 예를 들면, 피리미딘, 트리에틸아민, 이미다졸, N,N-디메틸부틸아민 또는 이들의 배합물의 존재하에 수행된다. 바람직하게는, 실리카 겔 기재의 변성을 수행하기 위한 반응 온도는 불활성 용매의 환류 온도이다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 실리카 겔 기재이며, 당해 기재는 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 실리카 겔 기재를 평형화시키는 단계(a), 1종 이상의 실란에 의해 실리카 겔 기재를 변성시키는 단계(b) 및 말단차단된 실란을 사용하여 실리카 겔 기재를 추가로 변성시키는 단계(c)에 의해 변성된다.
다른 양태에서, 제2 실란을 사용하는 추가의 변성 단계가 단계(b)에 이어서 또는 단계(b)와 동시에 수행된다. 특정한 다른 양태에서, 제2 실란의 δ는 1이고, R1은 C1-C6 하이드로카빌이다. 특별한 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계와 동시에 수행하며, 다른 특별한 양태에서, 제2 실란을 사용하는 변성 단계는 제1 실란을 사용하는 변성 단계 이후에 수행한다.
결합 공정에서 사용되는 실란의 양은 실리카 표면상의 실란올의 개수와 관계되며, 바람직하게는 동일한 양 내지 약 5배 과량의 범위이다. 실리카는 이론적으로 실란올 그룹을 표면 1㎡당 약 8μmol 포함하기 때문에, 실리카 표면 1㎡당 실란이 약 8/3 내지 약 40/3μmol인 것이 바람직함을 의미한다(실란 1개당 반응성 클로로 또는 알콕시 그룹 3개임을 나타낸다). 궁극적으로 실리카에 결합하는 실란의 양은 가하는 실란의 양에 상당히 의존적이지는 않으며, 바람직하게는 결합 공정에서의 실란의 양은, 실리카 표면상의 실란올의 몰수를 기준으로 하여, 약 50% 과량이다. 이어서, 삼관능성 실릴화제는 실리카 표면 1㎡당 약 2 내지 약 10μmol, 바람직하게는 약 3 내지 약 6μmole/㎡를 사용하여, 실리카 표면과 반응한다. 이들 몰수는 실리카 표면이 친실란제(silanophile)로부터 충분하게 차폐되도록 한다.
V. 기재
본 발명에서 사용되는 기재에는, 예를 들면, 티타니아, 지르코니아, 바나디아, 알루미나 및 실리카를 각각 포함하는 금속 및 메탈로이드 산화물과 같은 무기 기재가 포함된다. 실리카 및 실리카 복합체를 포함하는 유리도 사용할 수 있다. 또한, 기재에는 복합체 재료, 예를 들면, 멀라이트, 제올라이트, CaTiO3(페로브스카이트), FeTiO3[일메나이트(ilmenite)] 및 Mg2TiO4(스피넬)가 포함될 수 있다. 무기 기재에는 다공성 광물 재료, 예를 들면, 실리카, 알루미나, 이산화티탄, 산화지르코늄 및 다른 금속 산화물 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 무기 기재는 입자 또는 모놀리스 등의 형태로 존재할 수 있지만, 추가의 무기 지지체 또는 유기 지지체의 성분 또는 피막으로서 존재할 수도 있다.
유기 지지체 물질은 다당류, 예를 들면, 셀룰로스, 전분, 덱스트린, 아가(agar) 또는 아가로스(agarose), 또는 친수성 합성 중합체, 예를 들면, 치환되거나 치환되지 않은 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐 친수성 중합체, 폴리스티렌, 폴리설폰 등으로 이루어질 수 있다.
그렇지 않으면, 무기 복합체 물질 및 유기 복합체 물질은 고형 지지체로서 사용될 수 있으며, 무기 기재는 당해 지지체 위에 배치된다. 이와 같은 복합체 물질은, 무기 지지체와 접촉하면서, 유기 지지체의 공중합 또는 생성에 의해 형성될 수 있다. 적합한 복합체 물질의 예에는, 미국 특허공보 제5,268,097호, 제5,234,991호 및 제5,075,371호에 기재되어 있는 바와 같이, 다당류-합성 중합체 및/또는 다당류-광물 구조물 및/또는 합성 중합체-광물 구조물이 있다.
무기 기재는 직경이 약 0.01 내지 10mm 범위인 비드 또는 규칙적인 입자 또는 불규칙적인 입자; 두께가, 예를 들면, 약 0.1 내지 약 10mm 범위인 임의 크기의 섬유(중공 섬유 또는 기타 섬유), 멤브레인, 평평한 표면; 및 스폰지형 물질, 예를 들면, 직경이 수 ㎛ 내지 수 mm인 홀을 갖는 프릿(frit) 형태일 수 있다.
바람직하게는, 무기 기재는 금속 산화물 또는 메탈로이드 산화물, 예를 들면, 실리카, 알루미나, 제올라이트, 멀라이트, 지르코니아, 바나디아, 티타니아, 또는 이들의 혼합물 또는 복합체이며, 알콕시실란, 하이드록시실란, 아미노실란 또는 할로실란과 반응할 수 있는 반응성 금속 산화물을 갖는다. 무기 기재 표면을 실란을 사용하여 변성시킨 후에, 실란은 산소 결합을 통하여 무기 기재에 공유 결합된다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 모놀리스 또는 다공성 입자 형태이다. 모놀리스에는 유리 섬유, 광섬유, 모세관 또는 비다공성 입자가 포함되며, 이들은 기재 표면과 연결될 수 있다. 바람직하게는, 당해 다공성 입자는 평균 세공 직경이 약 60 내지 약 1000Å이고 평균 입자 크기가 약 3 내지 약 60㎛이다.
바람직한 양태에서, 무기 기재는 평균 세공 직경이 약 60 내지 약 1000Å이고 평균 입자 크기가 약 3 내지 약 60㎛인 실리카 겔 입자를 포함한다.
VI . 일정한 규정된 상대 습도 분위기에서의 평형화
본 발명의 결합방법에는 실란이 무기 기재, 예를 들면, 실리카에 공유 결합하여, 액체 또는 기체상 크로마토그래피 분리용의 안정한 결합 고정 상을 형성시키는 것이 포함된다. 일반적으로, 실란올을 제조하기 위해 알콕시 실란의 알콕실 그룹이 일부 가수분해되는 데에는 어느 정도의 물이 존재하는 것이 필요하며, 실란올은 무기 기재의 표면에서 OH 그룹과 반응할 수 있게 되어, 중합, 가교결합, 무기 기재 표면에의 결합, 및 결합 상의 전개가 수행된다,
결합방법에 사용되는 무기 기재는, 실란의 반응 정도 및 재현성을 더욱 양호하게 조절하기 위해, 변성 단계(들) 이전에 일정한 상대 습도 분위기에서 평형화된다. 배치 대 배치 재현성 및 고정 상의 최적의 성능을 위해, 무기 기재의 상대 습도를 일정하게 유지시키고 평형화시키는 것이 필요하다.
무기 기재, 예를 들면, 실리카상의 조절된 양의 물은, 일정한 상대 습도 분위기에서 각종 포화 염 용액 또는 수화 염에 걸쳐, 실리카를 수증기로 평형화시켜 수득할 수 있다. 실리카를 약 11 내지 12%의 상대 습도에서 수산화리튬 포화 용액에 걸쳐 평형화시키는 것이 편리하지만, 그 외의 상대 습도 범위에서도 다른 염 용액에 걸쳐 또는 다른 방식으로 가능하다.
평형화가 완결되는 한, 평형화 시간은 중요하지 않다. 일반적으로, 1 내지 3주 범위의 평형화 시간이면 충분하다. 평형화 온도는 중요하지 않지만, 약 5℃ 이하까지는 가변적이여야 하며, 일반적으로 실온이 사용된다. 실리카 표면의 물의 양은 배치에서부터 배치까지 일정해야 하며, 바람직하게는 실리카 표면 1㎡당 약 10 내지 약 40μmol이여야 한다.
바람직하게는, 불화세슘, 브롬화리튬, 브롬화아연, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 염화리튬, 브롬화칼슘, 아세트산칼륨, 불화칼륨, 염화마그네슘, 요오드화나트륨, 탄산칼륨, 질산마그네슘, 브롬화나트륨, 염화코발트, 질산나트륨, 요오드화칼륨, 염화스트론튬, 질산나트륨, 염화나트륨, 염화알루미늄, 브롬화칼륨, 황산알루미늄, 염화칼륨, 질산스트론튬, 염화바륨, 질산칼륨 또는 황산칼륨을 포함하는 수화 염 또는 포화 염 용액에 의해, 규정된 상대 습도를 갖는 분위기가 제공된다. 바람직하게는, 규정된 상대 습도는 50% 미만이다. 특별한 양태에서, 상대 습도는 약 0 내지 약 10%, 약 10 내지 약 20%, 약 20 내지 약 30%, 약 40 내지 약 50%, 약 50 내지 약 60%, 약 60 내지 약 70%, 약 70 내지 약 80%, 약 80 내지 약 90% 또는 약 90 내지 약 100%이다. 한 가지 바람직한 양태에서, 포화 염 용액은 상대 습도 약 11 내지 12%의 분위기를 제공하는 LiCl이다.
예를 들면, 무기 기재를 상대 습도 약 10 내지 약 20%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 11.3%의 상대 습도를 제공하는 LiCl 염 용액을 사용할 수 있다. 무기 기재를 상대 습도 약 20 내지 약 30%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 22.5%의 상대 습도를 제공하는 아세트산칼륨 용액을 사용할 수 있다. 무기 기재를 상대 습도 약 30 내지 약 40%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 32.8%의 상대 습도를 제공하는 MgCl2 용액을 사용할 수 있다. 무기 기재를 상대 습도 약 40 내지 약 50%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 43.2%의 상대 습도를 제공하는 K2CO3 용액을 사용할 수 있다. 무기 기재를 상대 습도 약 50 내지 약 60%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 57.6%의 상대 습도를 제공하는 NaBr 용액을 사용할 수 있다. 무기 기재를 상대 습도 약 60 내지 약 70%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 68.9%의 상대 습도를 제공하는 KI 용액을 사용할 수 있다. 유사하게, 무기 기재를 상대 습도 약 70 내지 약 80%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 75.3%의 상대 습도를 제공하는 NaCl 용액을 사용할 수 있다. 무기 기재를 상대 습도 약 80 내지 약 90%의 분위기에서 평형화시키기 위해서는, 81.0%의 상대 습도를 제공하는 질산알루미늄 용액을 사용할 수 있다. 평형화를 위한 추가의 상대 습도값을 제공하기 위해 추가의 염 용액을 사용할 수 있으며, 이는 핸드북으로부터 선택할 수 있다[참조: Handbook of Chemistry and Phvsics, "Table of constant RH Solutions" (Chemical Rubber Co. Press, Cleveland, OH)]
VII . 크로마토그래피 수행 및 사용방법
한 가지 측면에서, 변성된 무기 기재는, 크로마토그래피용 고정 상으로 사용되는 경우, 산성 또는 염기성 용출 조건에 1000시간 동안 노출되는 경우에도, 분리된 분석 대상물에 대한 체류 시간, 피크 대칭성 및 체류 인자가 약 3% 이하의 가변성을 나타낸다. 바람직하게는, 상기한 고정 상에서, 분리된 분석 대상물에 대한 체류 시간, 피크 대칭성 및 체류 인자는 산성 또는 염기성 용출 조건에 3000시간 동안 노출되는 경우에도 약 5% 이하의 가변성을 나타낸다.
크로마토그래피용 알킬 및 극성 결합된 고정 상을 제조하기 위한 본 발명의 방법에 의해, 다른 결합 상에 문제가 될 수 있는 테일링 및 피크 비대칭성이 전혀 나타나지 않아서, 염기성 분석 대상물 분석의 분석이 매우 현저하게 개선된다. 예를 들면, 테일링의 부재 및 염기성 분석 대상물의 더욱 우수한 분리가, 아닐린 동족체 아닐린, 2-에틸아닐린, N-에틸아닐린, N,N-디메틸아닐린, N-프로필아닐린의 분리를 기술하고 있는 실시예 19에 예시되어 있다(도 11A 참조). β-차단제의 분리[프락톨롤(피크 1)), 핀돌롤(피크 2), 비스프롤롤(피크 3) 및 알프레놀롤(피크 4)]가 도 11B에 도시되어 있다. 트리사이클릭 항우울제의 분리[데스메틸 독세핀(desmethyl doxepin)(피크 1), 프로트립틸린(피크 2), 데시프라민(피크 3), 노르트립틸린(피크 4), 독세핀(피크 5), 임프라민(피크 6), 아미트리프틸린(피크 7) 및 트리미프라민(피크 8)]가 도 11C에 도시되어 있다. 고정 상 1로 충전된 칼럼이 우수한 선택성을 갖는 뛰어난 피크 형태를 보여준다(도 11A 내지 11C 참조).
특히 잔류 실란올 활성 및 염기 불활성에 의해 평가되는 경우, 이들 결합 상은 더욱 우수한 크로마토그래피 거동을 제공한다. 피리미딘/페놀에 대한 피크 비대칭성의 비(Asl/As2)는, 시험된 모든 다른 결합 상과 비교하여 더 우수한 결합 상에 대한 염기의 친화성이 알콜에 비해 거의 검출되지 않음을 보여준다[참조: Li, et al., New Reversed Phase HPLC Columns for Drug Discovery and Pharmaceutical Method Development, Pittcon 2003].
옥타데실실란("C18")으로부터 제조된 순수 알킬 상과 비교하여, 실시예에 기재된 극성 변성된 상은 상당한 수성 용매에서 습윤성이 더욱 우수하고, 산성 또는 염기성 이동상에 대한 안정성이 더욱 우수하며, 분석 대상물의 보유력이 양호하고, 소수성 선택도가 양호하며, 분석 대상물들 사이의 소수성 및 극성을 바탕으로 하는 식별성이 양호하다.
본 발명의 변성된 무기 기재는 크로마토그래피용 고정 상용으로 사용할 수 있으며, 위에서 기술한 바와 같이 1종 이상의 실란에 의해 변성된 무기 기재를 포함하는 고정 상을 사용하는 크로마토그래피 분리를 수행함을 포함하는, 다수의 분석 대상물을 분리하는 방법을 제공한다. 크로마토그래피 분리는 기체 또는 액체 이동상을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 양태에서, 이동상은 물을 0 내지 100% 포함한다. 예를 들면, 크로마토그래피법 또는 분리 방법은 박층 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 이온 쌍 크로마토그래피, 역상 이온 쌍 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 키랄 인지 크로마토그래피, 관류 크로마토그래피, 일렉트로크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 마이크로칼럼 액체 크로마토그래피, 모세관 크로마토그래피, 액체-고체 크로마토그래피, 제조용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피, 침강 액체 크로마토그래피, 결합 상 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 섬광 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피-질량 분석기, 기체 크로마토그래피, 미세유체를 기본으로 하는 분리, 고체 상 추출 분리 또는 모놀리스를 기본으로 하는 분리일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 1종 이상의 화학식 1의 실란을 사용하여 변성된 실리카 겔 기재를 제공하는, 실리카 겔 기재상에서 크로마토그래피를 사용하여 분석 대상물을 분리시키는 개선된 방법을 제공하며, 당해 방법에서, 실리카 겔 기재는, 1종 이상의 실란을 사용하여 변성되기 전에, 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 평형화되며, 실리카 겔은 δ가 0 내지 3인 1종 이상의 실란, δ가 0 또는 1인 1종 이상의 실란 및 말단차단제를 사용하여 변성된다.
화학식 1
R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
위의 화학식 1에서,
R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
α는 0 또는 1이며,
β는 0 내지 30이고,
γ는 0, 1 또는 2이며,
δ는 0 내지 3이고,
R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, CH3C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN, -NC, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
X는 이탈 그룹이다.
특별한 양태에서, 실리카 겔 기재는 상대 습도 11%의 분위기에서 평형화된다. 바람직하게는, X는 할로겐, 알콕시, 아미노 또는 아실옥시이다. 특정한 양태에서, Q, R1 또는 R2는 키랄 인지 리간드이다. 바람직하게는, 키랄 인지 리간드는 임의로 활성이고, 지질, 아미노산, 펩티드, 당류, 하이드록시 치환된 아민 또는 하이드록시 치환된 산을 포함하는 키랄 화합물을 포함할 수 있다. 특정한 양태에서, 키랄 인지 리간드는 헤테로사이클로알킬 잔기 또는 연결된 헤테로사이클로알킬 잔기, 예를 들면, 사이클로덱스트린이다.
VIII . 모세관 크로마토그래피 및 미세유체 공학적 용도
액체 분리 기술을 나노 스케일로 소형화시키는 것에는, 좁은 칼럼 내부 직경(100㎛ 미만) 및 느린 이동상 유속(300nℓ/min 미만)이 포함된다. 모세관 크로마토그래피와 같은 기술에서, 모세관 영역 전기영동(CZE: capillary zone electrophoresis), 나노액체크로마토그래피(나노-LC), 개방 관형 액체 크로마토그래피(OTLC: open tubular liquid chromatography) 및 모세관 일렉트로크로마토그래피(CEC: capillary electrochromatography)는 통상적인 규모의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 다수의 이점을 제공한다. 이들 이점에는, 분리 효율이 더 커지고, 분리 속도가 빠르며, 소용적 샘플을 분석하고, 2차원적 기술을 조합하는 것이 포함된다.
위에서 기술한 바와 같이 실란에 의해 무기 기재를 변성시킴으로써, 이들 용도에서의 더욱 우수한 크로마토그래피 성능을 제공할 수 있다. 예를 들면, 퓸드 실리카 모세관 튜브를 고정 상으로 사용하고, 실란 위에서 기술한 바와 같은 1종 이상의 실란에 의해 변성시켜, 예를 들면, 모세관 크로마토그래피 또는 모세관 영역 전기영동 분야에서 사용할 수 있다. 크기가 360㎛ OD ×250㎛ ID인 퓸드 실리카 튜브[미국 아리조나주 피닉스에 소재한 폴리마이크로 테크놀로지스(Polymicro Technologies) 제조]가, 마이크로크로마토그래피 또는 미세유체 공학용의 실란 변성된 실리카 모세관 튜브의 제조에 적합하다.
모세관 일렉트로크로마토그래피는, 액체 크로마토그래피에서 통상적으로 사용되는 고체형 고정 상으로 충전된 모세관 칼럼내에서의, 전기영동 분리 방법의 전기적으로 구동되는 유동 특성을 활용한 하이브리드 기술이다. 역상 액체 크로마토그래피의 분리력을 모세관 전기영동의 높은 효율과 결합시켰다. 모세관 일렉트로크로마토그래피 분리 효율을 액체 크로마토그래피보다 더 높은 효율로 수득할 수 있는데, 그 이유는, 압력 구동되는 유동으로부터 비롯된 포물선형 유동 프로파일과 비교하였을 때, 분리 채널의 벽에 대한 마찰력의 감소로 인하여, 전기삼투 유동으로부터 비롯된 유동 프로파일이 평탄하기 때문이다. 또한, 모세관 일렉트로크로마토그래피에서는 액체 크로마토그래피에서보다 작은 입자 크기를 사용할 수 있는데, 그 이유는, 전기삼투 유동에 의해 배압(backpressure)이 발생하지 않기 때문이다. 액체 크로마토그래피 분리 메커니즘을 사용하여 칼럼 입자의 고정 상과 이동상 사이에 분배된 분석 대상물로 인하여, 모세관 일렉트로크로마토그래피는 중성 분자를 분리시킬 수 있다.
마이크로칩을 기본으로 하는 분리 장치는 다량의 샘플을 고속으로 분석하기 위해 개발되었다. 통상적인 다른 분리 장치에 비해, 이들 마이크로칩을 기본으로 하는 분리 장치는 샘플 처리량이 더 많고, 시료 및 시약 소모량이 감소되었으며, 화학적 폐기물이 감소되었다. 대부분의 분야에서, 마이크로칩을 기본으로 하는 분리 장치의 액체 유동 속도는 대략 1 내지 300nℓ/min이다. 마이크로칩을 기본으로 하는 분리 장치의 예에는 모세관 전기영동, 모세관 일렉트로크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피용 장치가 포함된다. 이와 같은 분리 장치는 고속 분석이 가능하며, 통상적인 다른 분석 장비에 비해 향상된 정밀도 및 신뢰도를 제공한다.
모놀리스 지지체 구조물(또는 포스트(post))을 반응성 이온 에칭 기술을 사용하여 유리 기재에서 에칭할 수 있다. 에칭 기술을 사용하여 5 내지 20㎛ 범위에서 유리 기재 성형물을 제조할 수 있다. 또한, 다공성 또는 비다공성 입자를 미세유체공학적 디자인으로 성형하여, 마이크로칩을 기본으로 하는 분리 장치의 마이크로채널내에 입자를 제공할 수 있다. 미세유체공학 용도로 사용하기 위한 다공성 입자, 비다공성 입자 및 모놀리스 구조물은 유리하게는 본원에 기술된 바와 같이 실란을 사용하여 변성시킬 수 있다.
본 발명은 본 발명의 특정한 바람직한 양태와 관련하여 기술하였지만, 상기의 기재 사항 및 하기의 실시예는 본 발명의 범주를 예시하기 위한 것일 뿐이며 당해 범주를 한정시키지는 않는다는 점이 이해되어야 한다. 본 발명의 실시에서는, 별도의 언급이 없는 한, 유기 화학, 중합체 화학, 생화학 등의 당해 기술분야의 숙련가들에게 알려진 통상적인 기술이 사용될 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 범주내에서의 이점 및 변성은 본 발명이 속한 기술분야의 숙련가들에게 명확할 것이다. 이와 같은 기술은 문헌에 모두 설명되어 있다.
다음의 실시예에서, 사용되는 값(예를 들면, 양, 온도 등)을 정확히 기재하고자 하였으나, 몇 가지 실험적 오차 및 편차는 설명되어야 했다. 별도의 언급이 없는 한, 온도는 섭씨(℃) 단위이며 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다. 모든 유기 용매는 제이.티. 배이커(J.T. Baker)(미국 뉴 저지주 필립스버그)로부터 입수하였다. 유기 실란 시약은 겔레스트(Gelest)(미국 펜실베니아주 툴리타운) 또는 실라 라보라토리즈(Silar Laboratories)(미국 노스 캐롤라이나주 윌밍턴)로부터 입수하였다. 입자 직경 5㎛, 평균 세공 직경 200Å 및 표면적 180㎡/g의 실리카 겔은 바리안, 인코포레이티드(Varian, Inc.)(미국 캘리포니아주 레이크 포레스트)로부터 입수하였다. 액체 크로마토그래피는 에질리언트(Agilent)(미국 캘리포니아주 파울로 알토)의 HP 1100 시리즈 모델을 사용하여 수행하였으며, 화학적 결합된 실리카 겔 칼럼은 바리안, 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 레이크 포레스트)로부터 입수하였다. 사용된 화학물질은 시그마-알드리치, 인코포레이티드(Sigma-Aldrich, Inc.)(미국 위스콘신주 밀워키)로부터 입수하였다. HPLC 등급 아세토니트릴, 메탄올 및 물은 브이더블유알 사이언티픽 프러덕츠(VWR Scientific Products)(미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수하였다.
별도의 언급이 없는 한, 모든 반응은 아르곤 불활성 분위기하에서 통상적인 방법으로 수행하였다.
약어:
k: 체류 인자, k = (tOR-tO)/tO
tR: 측정된 피크의 체류 시간
tO: 보유되지 않은 성분의 체류 시간
㎖: 밀리리터
실시예 1
트리메톡시실릴프로필아세트아미드의 제조
기계적 교반기, 환류 응축기 및 적가 깔대기가 장착된 3구 환저 플라스크를 3-아미노프로필트리메톡시실란(18g)(겔레스트, 인코포레이티드 제조), 톨루엔(40㎖)(알드리치 제조) 및 트리에틸아민(13g)(알드리치 제조)으로 충전시켰다. 교반을 시작하고, 적절한 아실 클로라이드, 예를 들면, 아세틸 클로라이드(18㎖(알드리치 제조)를 플라스크에 적가하였다. 당해 혼합물을 아르곤 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다.
실시예 2
알킬 및 극성 변성된 결합 상 의 제조
당해 실시예는 알킬 및 극성 변성된 결합 상의 일반적인 제조방법을 예시한다. 데시케이터에서, 5㎛ 입자 크기의 실리카 겔을 3주 동안 수산화리튬의 포화 수용액에 걸쳐 평형화시켰다. 평형화된 실리카 겔 샘플 10g을 크실렌 100㎖에 현탁시키고, 50몰% 과량의 장쇄 삼관능성 실란 및 피리미딘(계산된 등가량: 실리카 표면 1㎡당 시약 12μmole)을 가하였다. 당해 현탁액을 기계적으로 교반하고, 아르곤 분위기하에 24시간 동안 환류시켰다. 당해 혼합물을 여과시키고, 크실렌, 메틸렌 클로라이드, 테트라하이드로푸란, 아세톤, 메탄올 및 물-메탄올 혼합물로 잘 세척하여, 잔류하는 삼관능성 실란의 이탈 그룹의 가수분해를 촉진시켰다.
알킬 또는 극성 변성된 결합 상을 아세토니트릴/테트라하이드로푸란/물(1:1:1, 120㎖)로 가수분해시키고, 24시간 동안 환류시켰다. 반응이 완결되는 시점에서, 실리카 겔을 여과시키고, 결합 단계에서, 위에서 기술한 바와 같이 세척하였다. 생성된 고형 물질을 80℃ 오븐에서 20시간 동안 건조시켰다.
건조된 장쇄 실란 관능화된 실리카 겔(10g)을, 위에서 기술한 바와 같이 1차 결합 단계에서, 단쇄 극성 실란에 의해 변성시켰다. 2차 결합 단계에서, 실리카 겔을 MeOH:물(4:1)에서 0.5% 트리플루오로아세트산으로 실온에서 24시간 동안 가수분해시켰다. 당해 물질을 여과시키고, 기술한 바와 같이 1차 결합 단계에서 세척하였다. 샘플을 80℃에서 20시간 동안 건조시켰다.
결합 단계 이후에, 실리카 겔의 표면의 미반응된 실란올 그룹은 말단차단제와의 반응에 의해 차단되었다. 간단하게, 변성된 실리카 겔 약 10g을 크실렌 100㎖ 중에서 화학양론적 과량이 말단차단제, 예를 들면, 트리메틸클로로실란 20㎖와 함께 환류시켜, 실란올 차단 반응을 수행하였다. 당해 혼합물을 24시간 동안 환류시킨 후에, 실리카 겔을 여과시키고, 크실렌, 메틸렌 클로라이드, 테트라하이드로 푸란, 아세톤, 메탄올, 물로 반적하여 세척하여 정제하고, 마지막으로 메탄올로 세척하여 정제하였다. 극성 결합 상 실리카 겔을 80℃에서 20시간 동안 건조시켰다. 결합 상 표면 농도를 낮게 하기 위해, 감소된 실란 화학양론 및/또는 반응 온도를 사용할 수 있다.
크로마토그래피 성능의 측정을 위해, 생성된 결합 상을 길이 150mm × 내부직경 4.6mm의 칼럼 2개 에 각각 충전시켰다.
유사한 반응 및 방법을 수행하여 추가의 극성 변성된 결합 상을 제조하고, 미반응된 실란올을 이의 표면에 엔드캡핑하고, 극성 변성된 결합 실리카 겔로 충전된 칼럼을 제공하였다.
실시예 3 내지 11
이들 실시예는 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 상 1 내지 9를 제조하는 방법을 예시하고 있다. 각각의 상의 제조에 사용된 실란은 표 1에 기재되어 있다. 각각의 상에 대해, 다음의 사항을 제외하고는 실시예 2의 방법을 사용하였다:
실시예 3 (상 1): 장쇄 실란은 N-(3-트리메톡시실릴)프로필팔미타미드이고 단쇄 실란은 N-(3-(트리메톡시실릴)프로필아세트아미드)이다.
실시예 4 (상 2): 장쇄 실란은 O-옥틸-N-(트리에톡시실릴프로필)우레탄이고 단쇄 실란은 N-(3-(트리메톡시실릴)프로필아세트아미드)이다.
실시예 5 (상 3): 장쇄 실란은 N-(3-트리메톡시실릴)프로필팔미타미드이고 단쇄 실란은 말단차단제 트리메틸클로로실란이다.
실시예 6 (상 4): 장쇄 실란은 n-옥타데실트리클로로실란이고 단쇄 실란은 3-글리시독시트리메톡시실란이다.
실시예 7 (상 5): 장쇄 실란은 n-옥틸트리클로로실란이고 단쇄 실란은 3-글리시독시트리메톡시실란이다.
실시예 8 (상 6): 장쇄 실란은 n-옥타데실트리클로로실란이고 단쇄 실란은 3-시아노프로필디메틸클로로실란이다.
실시예 9 (상 7): 장쇄 실란은 n-옥틸트리클로로실란이고 단쇄 실란은 3-시아노프로필디메틸클로로실란이다.
실시예 10 (상 8): 장쇄 실란은 n-옥타데실트리클로로실란이고 단쇄 실란은 N-(3-(트리메톡시실릴)프로필아세트아미드)이다.
실시예 11 (상 9): 장쇄 실란은 n-옥틸트리클로로실란이고 단쇄 실란은 N-(3-(트리메톡시실릴)프로필아세트아미드)이다.
실시예 12
본 발명의 극성 변성된 결합 상 및 알킬 결합 상의 불활성 및 화학적 안정성은 피리미딘, 프로카인아미드, 아미트리프틸린, 프로파라놀롤, 소르브산, 살리실산 및 나프탈렌의 체류 인자 및 피크 형태를 실험하여 조사하였다. 비대칭성은 크로마토그래피 피크의 형태를 나타내는 인자이며, 피크 정점 및 10% 피크 높이에서의 크로마토그래피 곡선의 배면과 전면 사이의 거리 비율로서 정의된다. 결합 상의 친실란성 활성은 엔겔하르트 시험(Engelhardt test)을 수행하여 추가로 평가하였 다. 결합 상의 소수성 선택도는 메틸렌 그룹의 상대 체류 시간, 입체 및 수소 결합 상호작용을 조사하여 연구하였다. 측정된 파라메터 측면에서, 체류 인자 k는 (tOR-tO)/tO(여기서, tR은 측정된 피크의 체류 시간이고, tO는 보유되지 않은 성분의 체류 시간이다)이다. 도 3A 내지 3D 및 도 4A 내지 4D는 산성 및 염기성 조건에서의 극성 변성된 결합 상 및 알킬 결합 상의 화학적 안정성을 보여준다. 라인 번호 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64 및 68은 톨루엔에 대한 체류 인자를 나타내며, 라인 번호 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65 및 69 는 산성 및 염기성 용액 중의 톨루엔에 대한 체류 인자를 나타낸다. 라인 번호 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66 및 70은 톨루엔에 대한 피크 비대칭성을 나타내며, 라인 번호 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67 및 71은 피리미딘에 대한 피크 비대칭성을 나타낸다.
도 3A 내지 3D 및 도 4A 내지 D에 나타낸 바와 같이, 톨루엔과 피리미딘에 대한 체류 시간, 대칭성 및 체류 인자는, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 10) 및 1% 트리플루오로아세트산(pH 1.5) 용액 둘 다에서 2달 이상(1500 내지 3000시간)의 기간에 걸친 연속 조작 동안 거의 일정하였으며 성능의 열화가 나타나지 않았다.
실시예 13
궤양치료제 및 세팔로스포린 항생제의 분리 실험을 통해, 극성 변성된 결합 상 및 알킬 결합 상의 상대 선택도를 연구하였다. 실시예 3에서 기술한 바와 같은 상 1을 포함하는 고정 상 및 C18 고정 상에서, 인산염 완충액(pH 7.0)과 메탄올의 혼합물을 이동상으로 사용하여 파모티딘(피크 1), 라니티딘(피크 2), 니자티딘(피크 3) 및 시메티딘(피크 4)의 혼합물을 크로마토그래피 분리하였다. 총 용출 시간은 10분 미만이었으며, 각각의 고정 상에서 약 14분이었다. 선택도가 상당히 차이가 났으며, 알킬 상 및 극성 변성된 상 사이의 분석 대상물의 용출 순서가 역전되었다. 크로마토그램은 도 5에 예시되어 있다.
실시예 14
세팔로스포린 항생제 혼합물의 분리 실험을 통해, 극성 변성된 결합 상 및 알킬 결합 상의 상대 선택도를 연구하였다. 실시예 3에서 기술한 바와 같은 상 1을 포함하는 고정 상 및 C18 고정 상에서, 인산염 완충액(pH 3.0)과 메탄올의 혼합물을 이동상으로 사용하여 세파드록실(피크 1), 세파클로(피크 2) 및 세팔렉신(피크 3)을 크로마토그래피 분리하였다. 총 용출 시간은 약 4분이었으며, 각각의 고정 상에서 약 6분이었다. 선택도가 상당히 차이가 났으며, 알킬 상 및 극성 변성된 상 사이의 분석 대상물의 용출 순서가 역전되었다. 크로마토그램은 도 6에 예시되어 있다.
실시예 15
또한, 중성의 완충되지 않은 이동상 조건하에서, 알킬 칼럼 및 극성 변성된 칼럼에서는 선택도의 차이가 나타나며, 이는 파라벤의 크로마토그래피 분석(도 7) 에 예시된 바와 같다. C18 알킬 결합 상에서, 에틸(피크 2), 프로필(피크 3) 및 부틸 파라벤(피크 4)의 상대 체류 비는, 내부 표시자로서의 메틸 파라벤(피크 1)와 비교하면 각각 1.94, 4.41 및 10.73이었다. 극성 변성된 결합 상 1에서, 각각의 값은 1.84, 3.94 및 9.02였다. 부틸과 프로필 파라벤 사이의 상대 체류 비로부터 계산된 메틸렌 선택도는 C18 알킬 결합 상에 대해 2.43이고, 극성 변성된 결합 상 1에 대해 2.29였다.
파라벤이, 고정 상과의 극성 상호작용 때문에 극성 변성된 결합 상 1에 더 장시간 체류하지만; 소수성 메커니즘에 의해 결합 상과 상호작용할 수 있는 메틸렌 그룹의 개수 측면에서 동족체 파라벤이 메틸 파라벤과 상이하기 때문에, C18 알킬 결합 상에서의 상대 체류 비가 더 높다.
실시예 16
클로나제판(피크 1) 내부 표준물질로서 갖는 경련방지제의 혼합물을 사용하여, 실시예 15에 기술한 바와 같이 본 실험을 수행하였다. 각각 도 8에 도시되어 있는 바와 같이, C18 알킬 결합 상을 사용한 클로라제페이트(피크 2) 및 디아제판(피크 3)의 상대 체류 비는 2.83 및 3.34였으며, 극성 변성된 결합 상 1을 사용하는 경우 1.98 및 2.09였다.
당해 경련방지제는 두 가지 상이한 고정 상에서의 체류 시간이 현저하게 상이하였으며, 당해 경항성은 실시예 15의 파라벤의 용출 프로파일에 비하여 역전되었다. 경련방지제는 주로 소수성 메커니즘을 통해 결합 상과 상호작용하였으며, C18 알킬 결합 상이 극성 변성된 결합 상보다 소수성이기 때문에, 경련방지제는 극성 변성된 결합 상 1보다 C18 상에 더 장시간 체류하였다. 따라서, 2개 결합 상 사이의 선택도 차이는, 분석 대상물이 이들과 반응하는 방식, 즉 상호작용의 메커니즘이 소수성 또는 극성인지의 여부에 의한 것이다.
실시예 17
감기 치료제의 분리에 의해 입증된 바와 같이, 상이한 극성 변성된 고정 상은 분석 대상물 선택도에서 차이를 나타낸다. 슈도에페드린(피크 1) 및 아세트아미노펜(피크 2)의 분리는 HPLC 칼럼에 충전된 C18, 상 3 및 상 8로 이루어진 고정 상에서 연구하여, 아세토니트릴/25mM 제2인산수소칼륨 완충액(15:85)을 이동상 조건에서 사용하여 용출시켰다. 극성-삽입된 고정 상(상 3) 칼럼에서의 용출 순서, 극성-삽입된 상에 더욱 장시간 보유되는 아세트아미노펜 및 주로 알킬 상에 추가로 보유되는 슈도에페드린(도 9A)에 비해, 2개 약물의 용출 순서는 주로 알킬 고정 상(C18 및 상 8)에서 역전된다. 이와 같은 차이는, 각각의 약물 분자의 고정 상과의 상호작용의 차이에 기인할 수 있다. 아세트아미노펜은 이의 구조 중에 페놀성 하이드록실 및 아미드 잔기를 가지며, 극성-삽입된 상의 극성 관능 그룹과 강한 극성 상호작용을 나타낼 수 있다. 다른 한편으로, 슈도에페드린은 하이드록실화 메틸아미노프로필 쇄를, 주로 소수성 메커니즘을 통해 상호작용할 수 있는 페닐 환 상에 갖는다. 이동상의 유기 성분이 증가하면, 주로 알킬 상에서의 두 가지 약물의 용출 순서는 스위칭된다. 그러나, 극성-삽입된 상에서의 두 가지 약물의 용출 순서는 변하지 않는다(도 9B). 이는, 고정 상의 극성 성질의 차이를 명확히 입증한다.
실시예 18
본 발명이 극성 변성된 상은 선택도의 차이를 입증하며, 산성 화합물의 분리 특징이 통상적인 알킬 상에 비해 양호하다는 것을 입증한다. 0.1% 포름산 및 아세토니트릴 혼합물을 이동상으로 사용하여, 4-아미노벤조산(피크 1), 소르브산(피크 2) 및 벤조산(피크 3)의 혼합물을 C18 고정 상 및 극성 변성된 상 8에서 크로마토그래피하였다. 두 가지 상의 총 용출 시간은 약 15분이었다(도 10). 소르브산과 벤조산 사이의 완전한 분해능이 극성 변성된 결합 상에서만 달성되었으며, 상기한 이동상 조건을 사용한 이들 두 가지 화합물의 분리는 알킬 결합 상에서는 불가능하였다.
실시예 19
염기성 화합물은 알킬 상에 테일링되는 경향이 있는데, 이는 실리카 표면의 실란올과 염기성 화합물과의 상호작용 때문이다. 이에 따라 종종 체류 시간이 증가하고 성능이 저하(피크 형태)된다. 본 발명의 극성 변성된 결합 상(상 1) 중의 하나 상의 염기성 화합물의 복합 혼합물의 분리를 연구하였다. 염기성 화합물의 세 가지 상이한 혼합물을 분리하였다(도 11A 내지 11C 참조). 아닐린 동족체의 분리[아닐린(피크 1), o-톨루이딘(피크 2), 2-에틸아닐린(피크 3), N-에틸아닐린(피 크 4), N,N-디메틸아닐린(피크 5) 및 N-프로필아닐린(피크 6)]가 도 11A에 도시되어 있다. β-차단제의 분리[프락톨롤(피크 1), 핀돌롤(피크 2), 비스프롤롤(피크 3) 및 알프레놀롤(피크 4)]가 도 11B에 도시되어 있다. 트리사이클릭 항우울제의 분리[데스메틸 독세핀(피크 1), 프로트립틸린(피크 2), 데시프라민(피크 3), 노르트립틸린(피크 4), 독세핀(피크 5), 임프라민(피크 6), 아미트리프틸린(피크 7) 및 트리미프라민(피크 8)]가 도 11C에 도시되어 있다. 고정 상 1로 충전된 칼럼은 상당한 선택도와 함께 뛰어난 피크 형태를 나타낸다(도 11A 내지 11C).
실시예 20
다수의 신규한 알킬 상은 결합 밀도가 커서, 높은 pH 값에서도 염기성 화합물의 피크 형태 및 안정성이 향상된다. 그러나, 결합 밀도가 증가함에 따라 100% 수성 이동상 중에서의 체류 시간이 불안정하게 되는데, 그 이유는 이들 상이 매우 소수성이기 때문이다. 본 발명의 극성 변성된 결합 상은 이와 같은 딜레마에 대한 해답을 제공하여, 100% 수성 이동상 조건에서의 안정하고 재현 가능한 분석 대상물 체류 시간을 제공한다. 도 12A는 뉴클레오티드의 분리[5'-CTP(피크 1), 5'-CMP(피크 2), 5'-GDP(피크 3), 5'-GMP(피크 4), 5'-ADP(피크 5) 및 5'-AMP(피크 6)]를 보여주며, 도 12B는 100% 수성 이동상 조건하의 극성 변성된 결합 상 1에서의 카테콜라민의 분리[노르에피네프린(피크 1), 에피네프린(피크 2) 및 도파민(피크 3)]를 입증한다.
실시예 21
유기/수성 비가 높은 이동상은 분석 대상물이 더욱 효율적으로 탈용매화되어 감도, 분해능 및 질량 정확성(mass accuracy)이 증대되기 때문에, LC/MS 분석에 이상적이다. 본 발명의 극성 변성된 결합 상은 이동상 중의 고농도의 유기 용매에서 지방산의 체류[리놀렌산(피크 1), 리놀레산(피크 2) 및 올레산(피크 3)](도 13A 참조) 및 비타민의 체류[δ-토코페롤(피크 1), γ-토코페롤(피크 2) 및 α-토코페롤(피크 3)](도 13B 참조)가 뛰어남을 입증한다. 따라서, 본 발명의 극성 변성된 결합 상은 LC/MS 분석에 유용하여, 최적의 MS 신호 강도를 수득한다.
실시예 22
알킬 및 극성 변성된 결합 상의 선택도를 펩티드의 분리에 대해 추가로 연구하였다. 옥틸 상(C8) 및 상 2(극성-삽입된 C8 알킬)에서, 0.1% TFA 및 아세토니트릴의 이동상 혼합물을 사용하여, Gly-Tyr(피크 1), Val-Tyr-Val(피크 2), 메티오닌 엔케팔린(피크 3), 앤지오텐신 II(피크 4) 및 류신 엔케팔린(피크 5)의 혼합물을 크로마토그래피하였다. 도 14에 도시한 바와 같이, 총 용출 시간은 약 12분이었다. 선택도가 상당히 상이하였으며, 알킬 결합 상과 극성 변성된 결합 상 사이에서의 메티오닌 엔케팔린 및 앤지오텐신 II의 용출 순서가 역전되었다.

Claims (18)

  1. 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 평형화된 후에 1종 이상의 화학식 1의 실란에 의해 변성된 무기 기재를 포함하는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
    화학식 1
    R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
    위의 화학식 1에서,
    R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
    α는 0 또는 1이며,
    β는 0 내지 30이고,
    γ는 0, 1 또는 2이며,
    δ는 0 내지 3이고,
    R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
    Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -CH2C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN-, -NC-, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
    X는 이탈 그룹이다.
  2. 제1항에 있어서, 무기 기재가 금속 산화물 또는 메탈로이드 산화물인, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 무기 기재가 모놀리스 또는 다공성 입자 형태인, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 무기 기재가 실리카를 포함하는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 무기 기재가 2종 이상의 실란에 의해 변성된 실리카 겔을 포함하는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 실리카 겔이 제1 실란에 의해 변성되고, 후속적으로 당해 실리카 겔 기재가 제2 실란에 의해 변성되는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 실리카 겔 기재가, δ가 0 내지 3인 1종 이상의 실란과 δ가 0 또는 1인 1종 이상의 실란에 의해 변성되는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 추가의 실란이 말단차단(endcapping) 실란인, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  9. 제1항에 있어서, X가 할로겐, 알콕시, 아미노 또는 아실옥시인, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  10. 제1항에 있어서, Q, R1 또는 R2가 키랄 인지(recognition) 리간드인, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  11. 제5항에 있어서, 실리카 겔이 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 실리카 겔을 평형화시키는 단계(a), 1종 이상의 실란에 의해 실리카 겔을 변성시키는 단계(b) 및 말단차단 실란에 의해 실리카 겔을 추가로 변성시키는 단계(c)에 의해 변성되는, 크로마토그래피에서의 고정 상으로 사용하기 위한 조성물.
  12. 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 무기 기재를 평형화시켜 무기 기재의 표면 위에 조절된 양의 물을 제공하는 단계(a), 1종 이상의 화학식 1의 실란에 의해 무기 기재를 변성시키는 단계(b) 및 말단차단 실란에 의해 무기 기재를 추가로 변성시키는 단계(c)를 포함하는, 무기 기재의 변성방법.
    화학식 1
    R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
    위의 화학식 1에서,
    R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
    α는 0 또는 1이며,
    β는 0 내지 30이고,
    γ는 0, 1 또는 2이며,
    δ는 0 내지 3이고,
    R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
    Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -CH2C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN-, -NC-, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
    X는 이탈 그룹이다.
  13. 제12항에 있어서, δ가 0 내지 3인 제2 실란에 의해 무기 기재를 변성시키는 단계를 추가로 포함하는, 무기 기재의 변성방법.
  14. 제12항에 있어서, 규정된 상대 습도가 50% 미만인, 무기 기재의 변성방법.
  15. 제12항에 있어서, 무기 기재가 금속 또는 메탈로이드 산화물 기재인, 무기 기재의 변성방법.
  16. 규정된 상대 습도를 갖는 분위기에서 평형화된 후에 1종 이상의 화학식 1의 실란에 의해 변성된 무기 기재를 포함하는 고정 상을 사용하는 크로마토그래피 분리를 수행함을 포함하는, 다수의 분석 대상물의 분리방법.
    화학식 1
    R1 δ-Qα-(CH2)βSiR2 γX3 -γ
    위의 화학식 1에서,
    R1은 수소, C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이고,
    α는 0 또는 1이며,
    β는 0 내지 30이고,
    γ는 0, 1 또는 2이며,
    δ는 0 내지 3이고,
    R2는 C1-C100 치환되거나 치환되지 않은 하이드로카빌, 사이클로알킬, 헤테로 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴(여기서, 치환체는 C1-C12 하이드로카빌, 하이드록실, 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 설포 및 카보닐로부터 선택된다)이며,
    Q는 독립적으로 -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NCO-, -CHOHCHOH-, CH2OCHCH2O-, -(CH2CH2O)n-, -(CH2CH2CH2O)n-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -CH2C(O)CH2-, -S-, -SS-, -CHOH-, -O-, -SO-, -SO2-, -SO3-, -OSO3-, -SO2NH-, -SO2NMe-, -NH-, -NMe-, -NMe2 +-, -N[(CH2)n]2 +-, -CN-, -NC-, -CHOCH-, -NHC(NH)NH-, -NO2, -NO 및 -OPO3-(여기서, n은 1 내지 30이다)로부터 선택되고,
    X는 이탈 그룹이다.
  17. 제16항에 있어서, 크로마토그래피 분리가 박층 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 이온 쌍 크로마토그래피, 역상 이온 쌍 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 키랄 인지 크로마토그래피, 관류 크로마토그래피, 일렉트로크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 마이크로칼럼 액체 크로마토그래피, 모세관 크로마토그래피, 액체-고체 크로마토그래피, 제조용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피, 침강 액체 크로마토그래피, 결합 상 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 섬광 크로마토그래피, 액체 크로마토그래 피 질량 분석기, 기체 크로마토그래피, 미세유체를 기본으로 하는 분리, 고체 상 추출 분리 또는 모놀리스를 기본으로 하는 분리를 사용하여 수행되는, 다수의 분석 대상물의 분리방법.
  18. 고정 상이 제1항에 기재된 변성된 무기 기재를 포함하는, 크로마토그래피 칼럼.
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