KR20060123173A - Ｓｅｃ-시스템 분비에 의한 개선된 발현 시스템 - Google Patents

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Abstract

Sec-시스템 분비 신호 펩티드를 사용하여 재조합 단백질을 생산하기 위한 개선된 방법 및 원핵세포 발현 시스템을 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec 분비 시스템을 사용하여 기술한다. 재조합 단백질 및 펩티드의 개선된 분비를 위한 코딩 서열 및 융합 단백질로서, 특이적인 신규 Sec-시스템 분비 신호 펩티드를 기술한다.
분비 신호 펩티드, 슈도모나스 플루오레센스, Sec 분비 시스템, 재조합 단백질

Description

ＳＥＣ-시스템 분비에 의한 개선된 발현 시스템{IMPROVED EXPRESSION SYSTEMS WITH SEC-SYSTEM SECRETION}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 "IMPROVED EXPRESSION SYSTEMS WITH SEC-SYSTEM SECRETION."하에 2003년 11월 21일 출원된 미국 가출원 번호 제60/524,124호를 우선권으로서 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 단백질 생산 분야에 속하고, Sec 표적 펩티드 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec 분비 시스템을 사용하여 적절히 프로세싱된 이종 단백질을 생산하기 위한 향상된 방법에 관한 것이다.
150개 초과의 재조합 생산된 단백질 및 펩티드가 미국 식품의약품안전청(FDA)에 의해 바이오테크놀로지 약물 및 백신으로서 사용하기 위해 승인되었고, 또다른 370개는 임상 실험 중에 있다. 화학 합성을 통해 생산되는 소분자 치료요법과 달리, 단백질 및 펩티드는 생존 세포내에서 가장 효율적으로 생산된다. 그러나, 박테리아 중의 재조합 단백질의 현재 생산 방법은 종종 부적절히 폴딩된, 응집된 또는 불활성 단백질을 생산하고, 많은 유형의 단백질이 공지된 방법을 사용해 비효율적으로 달성되는 2차 변형을 요구한다.
공지된 방법의 1차적 문제점의 하나는 세포 중에 과량의 단백질이 축적될 때 일어나는 세포질 중의 응집된 단백질로 만들어진 봉입체(inclusion bodies)의 형성에 있다. 재조합 단백질 생산의 또다른 문제점은 발현된 단백질의 적절한 2차 및 3차 형태를 설정하는 것이다. 종종 적절한 단백질 폴딩을 결정하는 디술파이드 결합을 박테리아 세포질이 능동적으로 억제하는 것이 한 가지 장벽이다(Derman et al. (1993) Science 262:1744-7). 결과로서, 많은 재조합 단백질, 특히 진핵 유래의 것은 박테리아에서 생산될 때 부적절히 폴딩되고 불활성된다.
재조합 시스템에서 적절히 폴딩된 단백질의 생산을 증가시키기 위한 수많은 시도가 있어왔다. 예를 들면, 연구자들은 봉입체의 형성 억제를 도와 줄 수 있는 발효 조건 (Schein (1989) Bio/Technology, 7:1141-1149)을 바꾸고, 프로모터의 강도를 변화시키거나 과발현된 섀퍼론 단백질을 사용했다 (Hockney (1994) Trends Biotechnol. 12:456-463).
분비
적절히 폴딩된 단백질의 수거를 증가시키기 위한 별법의 접근법은 세포내 환경으로부터 단백질을 분비시키는 것이다. 그람-음성 박테리아에서, 세포질에서 분비되는 단백질은 외막에 결합된 주변세포질 공간으로 또는 세포외 브로쓰로 종착될 수 있다. 응집된 단백질로 만들어진 봉입체는 단백질이 세포 세포질 밖으로 분비된다면 통상 형성되지 않는다. 주변세포질 공간으로의 분비 또한 적절한 디술파이드 결합 형성을 촉진하는 공지된 효과를 가진다 (Bardwell et al. (1994) Phosphate Microorg. 270-5; Manoil (2000) Methods in Enz. 326: 35-47). 재조합 단백질의 분비는 단백질의 보다 효율적인 단리; 트랜스제닉 단백질의 적절한 폴딩 및 디술파이드 결합 형성을 촉진시켜 활성 형태의 단백질의 백분율 증가를 초래할 수 있고; 봉입체의 감소된 형성 및 숙주세포에의 감소된 독성을 초래할 수 있으며; 증가된 백분율의 가용성 형태의 재조합 단백질을 제공할 수 있어 매력적이다. 배양 배지로의 관심 단백질의 분비력은 또한 단백질 생산용으로 배치 배양 보다는 연속 배양을 증진할 수 있다.
그람-음성 박테리아는 그의 이중 막을 통과하는 단백질의 활성 외부수송을 위한 수많은 시스템을 진화시켜왔다 (도 1 참조). 상기 분비 경로는 예를 들면 원형질 및 외막 모두를 통과하는 단일-단계 이동을 위해 ABC (타입 I) 경로, Path/Fla (타입 III) 경로 및 Path/Vir (타입 IV) 경로; 원형질막을 통과하는 이동을 위해 Sec (타입 II), Tat, MscL, 및 Holins 경로; 및 원형질 및 외막을 통과하는 두-단계 이동을 위해 Sec-플러스-핌브리알 어셔 포린 (fimbrial usher porin (FUP)), Sec-플러스-자가운반자 (autotransporter (AT)), Sec-플러스-투-파트너 (two partner) 분비 (TPS), Sec-플러스-주요 말단 분지 (main terminal branch (MTB)), 및 Tat-플러스-MTB 경로를 포함한다. 모든 박테리아가 상기 분비 경로들을 모두 가진 것은 아니다.
세가지 단백질 시스템 (타입 I, III 및 IV)은 단일 에너지-커플된 단계로 양 막 모두를 통과해 단백질을 분비한다. 네가지 시스템 (Sec, Tat, MscL 및 Holins)은 내막만을 통과해 분비하고 네가지의 다른 시스템(MTB, FUP, AT 및 TPS)은 외막 만을 통과해 분비한다.
신호 서열을 갖는 펩티드 분비의 가장 통상의 형태는 Sec 시스템을 포함한다. Sec 시스템은 세포질막을 통과하는 N-말단 신호 펩티드를 갖는 단백질의 외부수송에 관여한다 (Agarraberes and Dice (2001) Biochim Biophys Acta. 1513:1-24; Mueller et al. (2001) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 66:107-157). Sec 패밀리의 단백질 복합체는 원핵생물 및 진핵생물에서 보편적으로 발견된다. 박테리아 Sec 시스템은 운반 단백질, 섀퍼론 단백질 (SecB) 또는 신호 인지 입자 (Signal recognition particle (SRP)) 및 신호 펩티다제 (SPase I 및 SPase II)로 구성된다. 이. 콜라이(E. coli) 중의 Sec 운반 복합체는 세가지의 내재성 내막 단백질, Sec Y, SecE 및 SecG, 및 세포질 ATPase인 SecA로 구성된다. SecA는 SecY/E/G 복합체를 동원하여 활성 이동 채널을 형성한다. 섀퍼론 단백질 SecB는 신생 폴리펩티드쇄에 결합하여 그의 폴딩을 억제하고 SecA에 그를 표적화한다. 폴리펩티드 선형쇄는 Sec YEG 채널을 통해 연속적으로 운반되고, 신호 펩티드의 절단 후 단백질은 주변세포질에서 폴딩된다. 세개의 보조 단백질 (SecD, SecF 및 YajC)은 분비에는 필수적이 아니나 많은 조건하에 특히 저온에서 10배까지 분비를 촉진하는 복합체를 형성한다.
즉, 타입 II 분비 시스템을 통해 주변세포질로 운반된 단백질은 또한 추가 단계에서 세포외 배지로 외부이송될 수 있다. 메카니즘은 일반적으로 자가운반자, 투 파트너 분비 시스템, 주요 말단 분지 시스템 또는 핌브리알 어셔 포린을 통한다.
그람-음성 박테리아에서 12개의 공지된 분비 시스템 중에서, 8개는 발현된 단백질의 일부로서 발견된 표적 신호 펩티드를 이용하는 것으로 공지되어 있다. 상기 신호 펩티드는 분비 시스템의 단백질과 상호작용하여 단백질이 그의 적당한 목적지로 향하도록 세포를 적절히 지시한다. 상기 8개의 신호-펩티드-기재 분비 시스템 중 5개는 Sec-시스템을 포함하는 것이다. 상기 5개는 Sec-의존성 세포질막 이동에 관여하는 것으로 지칭되고 그안에서 작용하는 신호 펩티드는 Sec-의존성 분비 신호로 지칭될 수 있다. 적절한 분비 신호를 개발하는데에 있어 한가지 이슈는 신호가 적절히 발현되고 발현된 단백질로부터 절단되는 것을 보장하는 것이다.
Sec-의존성 단백질 외부이송의 상징은 외부이송된 단백질의 짧은 (약 30개 아미노산), 주로 소수성인 아미노-말단 신호 서열의 존재이다. 신호 서열은 단백질 외부이송을 돕고 외부이송된 단백질이 주변세포질에 도달할 때 주변세포질 신호 펩티다제에 의해 절단된다. 전형적인 N-말단 Sec-신호 펩티드는 1개 이상의 아르기닌 또는 리신 잔기를 갖는 N-도메인 이후에 연속적인 소수성 잔기를 함유하는 도메인 및 신호 펩티다제의 절단 부위를 함유하는 C-도메인을 함유한다.
박테리아 단백질 생산 시스템은 단백질을 세포질 밖으로 표적화하기 위해 트랜스제닉 단백질 제작물이 관심 단백질 및 분비 신호 모두를 함유하는 융합 단백질로서 조작되도록 개발되었다.
세포로부터 상청액으로 단백질을 분비하는 전략들이 개발되었다. 예를 들면, 조르지오 (Georgiou)에 의한 미국 특허 제5,348,867호는 세포 표면상의 펩티드 발현과 관련된다. 카이스트(Korea Advanced Institute of Science and Technology)에 의한 미국 특허 제6,329,172호는 슈도모나스 플루오레센스내의 ABC 운반자 및 관심 단백질과 공동 발현된 상기 운반자를 사용한 단백질의 세포외 분비 방법을 기술한다. 노보 노르디스크의 PCT 공개특허 WO 제96/17943호는 주변세포질로 표적화하기 위해 에이. 리티쿠스 (A. lyticus) 프로테아제 I 또는 소정의 바실러스(Bacillus) 프로테아제 서열의 일부를 사용한 주변세포질로부터의 유출에 의한 세포 유래 단백질의 세포외 발현에 관한 것이다. 베링거 인겔하임의 PCT 공개특허 WO 제02/40696호 및 미국 출원공개 제2003/0013150호는 박테리아 신호 펩티드 OmpA를 사용한 단백질의 세포외 발현을 기술한다. 상기 문헌들은 OmpA가 SecE와 단독으로 또는 아미노산 서열 SEGN를 포함한 단백질 또는 펩티드와 함께 상호작용함을 개시한다.
발현 증가를 위한 다른 전략들은 주변세포질로 단백질을 표적화함에 관한 것이다. 일부 연구는 비-Sec 타입 분비 (예를 들면, 트러스티즈 오브 유니버시티 오브 펜실바니아 (Trustees of the University of Pennsylvania)의 PCT 공개특허 WO 제03/079007호; 조르지오의 미국 공개특허 제2003/0180937호, 와이너 및 터너 (Weiner and Turner)의 미국 공개특허 제2003/0064435호; 리서치 파운데이션 오브 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕 (Research Foundation of the State University of New York)의 PCT 공개특허 WO 제00/59537호 참조)에 관한 것이다. 그러나, 대다수의 연구는 Sec-타입 분비 시스템을 사용한 외래 단백질의 분비에 관한 것이다.
많은 분비 신호가 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현에 사용되는 것으로 기술되어 왔다. 예를 들면, 셀트릭스 파마슈티칼스 인크 (Celtrix Pharmaceuticals, Inc.)의 미국 특허 제5,914,254호는 인터류킨 1-유사 단백질 유래 리더 서열 및 융합 파트너를 사용해 증가된 가용성 및 단백질 활성을 기술한다.
제넨테크의 미국 특허 제4,963,495호는 이. 콜라이 엔테로톡신에 대한 서열과 유사한 원핵 신호 서열과 함께 진핵 단백질, 특히 인간 성장 호르몬의 발현을 기술한다. 제넨테크의 유럽 특허 제0 177 343호는 피. 에루기노사 (P. aeruginosa) 엔테로톡신 A 신호 서열을 사용하여 달성될 수 있는 주변세포질 HGH의 발현을 기술한다.
바이오젠의 미국 특허 제5,082,783호는 호모 유래 Mfαl 신호 서열과 같은 DNA 신호 서열에 작동가능하게 연결된 액틴 또는 이소-1-시토크롬 c 프로모터와 같은 중간 강도 이하의 프로모터로부터 소마토메딘 C, 조직 플라스미노겐 활성자 또는 종양 괴사 인자와 같은 단백질의 발현을 기술한다.
파스탄 등 (Pastan, et al.)의 PCT 공개특허 WO 제89/10971호는 OmpA 신호 서열을 사용한 이. 콜라이 중의 슈도모나스 엑소톡신의 발현을 기술하고, 주변세포질 및 배지 중의 단백질 일부의 차등 발현을 보여준다.
노보 노르디스크의 미국 특허 제6,156,552호는 신호 서열을 이용한 이. 콜라이 중 또는 변형된 슈도모나스 리파제의 리파제 결핍 피. 멘도시나 (P. mendocina) 중의 발현을 기술한다. 신호 서열은 이. 콜라이 phoA 신호 서열일 수 있다. 노보자임(Novozyme)의 미국 특허 제6,495,357호; 제6,509,181호; 제6,524,827호; 제6,528,298호; 제6,558,939호; 제6,608,018호; 및 제6,617,143호는 발현된 효소에 바람직하게는 천연적인 신호 서열이나 또한 예를 들면 리조무코르(Rhizomucor) 종 유래이거나 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-인자에 대한 유전자 또는 바실러스 종 유래의 아밀라제 또는 프로테아제 유전자와 함께 발현된 리파제, 셀룰라제, 아밀라제 및 슈도모나드 유래의 효소를 비롯한 기타 효소의 생산도 기술한다.
조마 (Xoma)의 미국 특허 제5,595,898호; 제5,698,435호; 및 제6,204,023호는 펙테이트 라이아제 신호 펩티드를 사용한 키메라 항체 단편의 생산을 기술한다. 상기 특허는 펙테이트 라이아제 효소가 피. 플루오레센스 (P. fluorescens)를 비롯한 다양한 유기체에 공지되어있다고 기술하고 있으나, 서열에 대한 예시는 제공되지 않았다.
제넨테크의 미국 특허 제6,258,560호는 단백질에 바람직하게는 천연적이나 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 리더 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것으로 기술된 박테리아 신호 서열과 DNA-분해 단백질과의 이. 콜라이 중의 발현을 기술한다. 상기 특허는 단백질이 슈도모나드에서 발현될 수도 있다고 개시하고 있으나, 예시는 주어지지 않았다.
하버만 (Habermann) 및 어르틀 (Εrtl) 및 아벤티스 (Aventis)의 PCT 공개특허 WO 제01/21662호, WO 제02/068660호 및 미국 특허출원 제2003/0044906호는 이. 콜라이 유래 히루딘 유도체의 분비를 기술한다. 기술된 신호 서열 중의 하나는 슈도모나스 플루오레센스의 OprF 단백질 유래 서열이다. '662호 공개특허에서 확인된 용도는 문헌[De (1995) FEMS Micr. Let. 127:263-272]에 기술된 서열 NTLGLAIGSLIAATSFGVLA이다. 슈도모나드 내 발현 플라스미드 사용에 대한 기술은 공개문헌에 없고, 상기 전략을 이용한 히루딘의 발현 증가는 이. 콜라이내 대조군 발현과 비교시 매우 적다.
유니레버 페이턴트 홀딩스 비.비. (Unilever Patent Holdings B.V.)의 미국 특허 제5,641,671호는 바람직하게는 리파제 유전자에 대해 내재성인 신호 서열 및 안정화 단백질과 함께 피. 구루메 (P. glumae) 유래 슈도모나스 리파제 발현에 관한 것이다.
아트킨슨 등 (Atkinson et al.)의 유럽 특허 제EP 0 121 352호는 단백질의 주변세포질 발현을 개선시키기 위한 벡터에 사용할 슈도모나스 종 RS-16 카르복시펩티다제 유래의 시스테인 부재 리더 서열을 기술한다. 상기 특허는 신호 서열의 시스테인 잔기가 세포막과의 상호작용을 일으키고 분비를 지연시킬 수 있음을 개시한다. 개시된 신호 서열은 MRPSIHRTAIAAVLATAFVAGT이다.
세포질 밖으로 단백질을 표적화하는 신호 서열에 의존하는 전략들은 종종 부적절히 프로세싱된 단백질을 생산한다. 이는 Sec 시스템을 통해 분비하는 것들과 같은 아미노-말단 분비 신호에 특히 적용된다. 상기 시스템으로 종종 프로세싱되는 단백질은 분비 신호의 일부를 유지하거나 종종 부적절히 절단되는 링킹 요소를 요구하거나, 말단에서 절단된다.
상기 선행기술에서 명백한 바와 같이, 많은 전략들이 단백질을 숙주세포의 주변세포질로 표적화하기 위해 개발되었다. 그러나, 공지된 전략들은 치료용으로 정제될 수 있는 적절히 프로세싱된 활성 재조합 단백질의 고 수율을 일정하게 초래하지 않았다. 이전 전략들의 한가지 주된 제약은 부적당한 세포 시스템에서의 불 량한 분비 신호 서열을 갖는 단백질의 발현이었다.
따라서, 트랜스제닉 단백질을 적절한 프로세싱 형태로 생산하기 위해 재조합 폴리펩티드를 분비 및 적절히 프로세싱할 수 있는 향상된 대규모 발현 시스템에 대한 선행기술의 요구가 아직 있다. 이상적인 시스템은 고농도의 가용성 단백질을 생산하고 단백질을 주변세포질 및 가능하게는 세포외 배지로 표적화함을 가능케한다.
본 발명의 목적은 숙주세포내 적절히 프로세싱된 재조합 단백질의 발현 증가 방법 및 시스템을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 숙주세포내 활성 재조합 단백질의 발현 증가 방법 및 시스템을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 적절히 프로세싱된 재조합 단백질을 고농도로 발현하는 상업용 규모 시스템을 제공하는데 있다.
요약
본원발명은 세포 발현 시스템에서 적절히 프로세싱된 재조합 단백질의 고농도 생산 방법 및 향상된 조성물을 제공한다. 본 발명은 슈도모나스 플루오레센스가 분비된 단백질의 생산을 위한 향상된 플랫폼이라는 놀라운 발견에 기초한다. 특히, 피. 플루오레센스는 다른 박테리아 발현 시스템에서 전형적으로 발견되는 것보다 고농도로 그의 Sec 분비 시스템에 표적화된 외래 단백질을 놀랍게도 생산하고, 세포의 주변세포질로 상기 단백질을 보다 고농도로 운반하여 완전 프로세싱된 재조합 단백질의 회수 증가를 초래한다. 본 발명은 슈도모나스 플루오레센스 유기체 유래 신규하게 확인된 분비 신호를 포함하고 발현된 관심 단백질 또는 펩티드를 그람-음성 박테리아의 주변세포질 또는 세포외 환경으로 표적화함을 촉진할 수 있는 상기 서열을 도입하는 발현 시스템, 벡터 및 펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한 외래 단백질이 신호 펩티드 리더 서열와 함께 발현될 때 주변세포질내에서의 적절히 프로세싱된 형태의 외래 단백질의 향상된 생산을 제공하는 피. 플루오레센스 숙주세포를 포함한다.
한 실시태양에서, 포스페이트 결합 단백질 (phosphate binding protein (pbp)) 분비 신호, 외막 포린 (Outer membrane porin) E (OprE) 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 (azurin) 분비 신호, 철 (III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로부터 선택된 피. 플루오레센스 Sec-시스템 분비 펩티드인 또는 그에 실질적으로 동종인 서열을 갖는 단리된 펩티드가 제공된다.
또다른 실시태양에서, 단리된 핵산은 pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철 (III) 결합 단백질 및 지단백질 B 분비 신호로부터 선택된 피. 플루오레센스 Sec-시스템 분비 펩티드인 또는 그에 실질적으로 동종인 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 서열로 제공된다. 또다른 실시태양에서, pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철 (III) 결합 단백질 및 지단백질 B 분비 신호로부터 선택된 피. 플루오레센스 Sec-시스템 분비 펩티드인 또는 그에 실질적으로 동종인 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 핵산과 혼성화되는 핵산이 제공된다. 한 실시태양에서, 핵산은 엄격한 조건하에 혼성화된다.
한 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산 서열: Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala (서열 1)의 아미노산 2-24 이상의 포스페이트 결합 단백질 (pbp) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 별도의 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 핵산 서열: atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc (서열 2)에 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일한 것이다. 또다른 실시태양에서, 서열 2의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산 서열: Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala Gly Ala (서열 3)의 아미노산 2-21 이상의 서열을 갖는 외막 포린 E (OprE) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 핵산 서열: atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttg ggc gca atc gcc cag caa gca ggc gct (서열 4)에 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 4의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산 서열: Met Phe Ala Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala (서열 5)의 아미노산 2-20 이상의 서열을 갖는 아주린 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 핵산 서열: atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggc cag ttg ctt gct (서열 6)에 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 6의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산 서열: Met Gln Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala Thr Ala Met Ala (서열 7)의 아미노산 2-23 이상의 서열을 갖는 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 (LAObp 또는 KRObp) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 핵산 서열: atg cag aac tat aaa aaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtc tcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca (서열 8)에 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 8의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산 서열: Met Met Ile Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser (서열 9)의 아미노산 2-32 이상의 서열을 갖는 철 (III) 결합 단백질 [Fe(III)bp] 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 핵산 서열: atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctc acc cta ctc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct (서열 10)에 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 10의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산 서열: Met Ile Lys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala (서열 11)의 아미노산 2-17 이상의 서열을 갖는 지단백질 B (LprB) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 핵산 서열: atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct (서열 12)에 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 12의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양은 프로모터에 작동가능하게 연결된 피. 플루오레센스 Sec-시스템 분비 펩티드의 핵산과, pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철 (III) 결합 단백질 또는 지단백질 B 분비 신호이거나 실질적으로 동종인 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 또다른 실시태양에서, 벡터는 관심 재조합 펩티드 또는 단백질의 발현을 위한 코딩 서열을 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 발현 벡터는 재조합 단백질 또는 펩티드용 코딩 서열에 또는 분비 신호용 코딩 서열에 인접한 태그(tag) 서열을 추가로 포함한다.
발현 벡터를 포함하는 세포 또한 제공된다. 한 실시태양에서, 세포는 상기와 같이 피. 플루오레센스 Sec-시스템 분비 신호에 연결된 재조합 단백질을 발현한다. 세포는 주변세포질 부위에 단백질을 발현할 수 있다. 소정의 실시태양에서, 세포는 외부 세포벽을 통해 세포외로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 한 실시태양에서, 세포는 박테리아 세포이고, 소정의 부-실시태양에서, 세포는 피. 플루오레센스 세포 또는 이. 콜라이 세포이다. 다른 실시태양에서, 세포는 진핵세포이고, 효모 세포, 곤충 세포, 포유류 세포 또는 식물 세포일 수 있다.
한 실시태양에서, 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 또다른 실시태양에서, 세포는 슈도모나드이고 특정 실시태양에서, 세포는 슈도모나스 플루오레센스 세포이다.
또다른 실시태양에서, 숙주 세포에서 재조합 단백질을 제조하는 향상된 방법 및 시스템이 제공된다. 숙주 세포에서 관심 재조합 단백질 또는 펩티드에 작동가능하게 연결된 pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철 (III) 결합 단백질 또는 지단백질 B 분비 신호로부터 선택된 펩티드이거나 실질적으로 동종인 피. 플루오레센스 Sec-시스템 분비 펩티드의 발현 향상을 포함한다. 한 실시태양에서, 발현은 고밀도 세포 배양에서 일어난다. Sec-분비 신호는 세포에서 성숙 단백질로부터 절단될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 분비 신호는 절단되지 않고 세포는 분비 신호에 연결된 재조합 단백질을 발현한다. 한 실시태양에서, 태그 서열이 관심 단백질에 작동가능하게 연결된다.
별도 실시태양에서, 피. 플루오레센스내 Sec-시스템 분비 신호에 연결된 단백질을 발현함으로써 재조합 외래 분비 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 실시태양은 분비된 단백질의 발현용인 향상된 발현 플랫폼으로서 피. 플루오레센스의 인지에 기초한다. 한 실시태양에서, Sec-분비 신호는 피. 플루오레센스 게놈에서 유래하나, 또다른 실시태양에서, Sec-분비 신호는 이. 콜라이 게놈에서 유래한다. 다른 실시태양에서, 분비 신호는 발현되는 단백질에 대해 천연일 수 있다.
한 실시태양에서, 숙주 세포는 주변세포질이 있고 Sec-시스템 펩티드의 발현은 재조합 단백질을 세포 주변세포질로 표적화할 수 있다. 부 실시태양에서, 발현은 세포외 단백질의 생산을 초래한다. 본 방법은 주변세포질 또는 세포외 배지로부터 재조합 단백질을 정제하는 단계도 포함할 수 있다. Sec-신호는 단백질에 연결되어 발현될 수 있고 신호-연결된 단백질은 세포에서 정제될 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 상기 단리된 펩티드는 분비 신호와 관심 단백질 또는 펩티드의 융합 단백질이다. 그러나, 분비 신호는 단백질이 주변세포질로 표적화될 때 단백질로부터 절단될 수 있다. 한 실시태양에서, Sec-시스템 분비 신호와 단백질 또는 펩티드 사이의 연결은 분비 신호의 절단을 증가시키기 위해 변형된다.
한 실시태양에서, 본 방법은 세포에서 적절히 프로세싱된 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 또다른 실시태양에서, Sec-시스템 펩티드의 발현은 세포에서 활성 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 단백질이 Sec-분비 신호 없이 발현될 때보다 재조합 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다.
한 실시태양에서, 본 방법은 0.1 g/L 이상의 정확히 프로세싱된 단백질을 생산한다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 세포내에서 0.1 내지 1 g/L의 정확히 프로세싱된 단백질을 생산한다. 부 실시태양에서, 생산된 총 단백질은 약 2.0 이상 내지 약 50.0 g/L일 수 있다. 일부 실시태양에서, 정확히 프로세싱된 단백질 생산량은 재조합 단백질 총 생산량의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 또는 그 이상이다.
관심 대상인 단백질 또는 펩티드는 치료 유용한 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 한 실시태양에서, 단백질 또는 펩티드는 진핵생물 종 유래이다. 또다른 실시태양에서, 단백질 서열은 포유류 서열 유래이다. 또다른 실시태양에서, 단백질의 활성 형태는 한개 이상의 디술파이드 결합을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 단백질 또는 펩티드는 호르몬, 성장 인자, 세포외 수용체 또는 리간드, 프로테아제, 키나제, 혈액 단백질, 케모킨 또는 시토킨 또는 항체 유래이다.
도 1: 그람-음성 박테리아내 단백질 분비 시스템의 개요. 4개 시스템 (Sec, Tat, MscL 및 holins)은 내막을 통과해서만 이동시킨다. Sec 시스템에 의해 분비되는 단백질은 화살표로 표시된 바와 같이 4개의 외막 분비 시스템 중의 하나에 의해 주변세포질에 위치하거나 외막내에 통합되거나 외막을 통과해 운반된다. Tat 시스템에 의해 이동하는 단백질은 주로 주변세포질에 위치하나, 피. 에루기노사내 소수 단백질은 MTB 시스템에 의해 추가로 외부수송되는 것으로 발견되었다. Holins 및 MscL는 단백질을 주변세포질로만 운반한다. 타입 I, III 및 IV 시스템은 임의의 주변세포질 중간체 없이 양 막 모두를 통과해 단백질을 외부수송한다. 약어: FUP, 핌브리알 어셔 포린 (fimbrial usher porin); AT, 자가운반자 (autotransporter); TPS, 투-파트너 (two-partner) 분비 시스템; MTB, 주요 말단 분지 (main terminal branch); IM, 내막 (inner membrane); OM, 외막 (outer membrane).
도 2: 피. 플루오레센스 gal2 분비 제작물. pD0W1122 및 DOWl123의 플라스미드 지도는 (A) pDOW1122가 oprF:gal2 융합물 (아미노산 서열은 B에 도시) 및 pDOWl123은 pbp:gal2 융합물 (아미노산 서열은 C에 도시)을 함유함을 보여준다. *은 예측되는 신호 펩티다제 절단 부위를 표시한다.
도 3: Gal2의 분비된 발현. oprF:gal2 (pDOW1122) 또는 pbp:gal2 (pDOW1123)을 발현하는 피. 플루오레센스 유래의 전체 브로쓰 샘플 (A)의 SDS-PAGE 분석의 이미지. 전체 브로쓰의 1/80 희석물을 10% NuPAGE 겔에 로딩하고 1X MOPS 완충제에서 수행시켰다. 가용성 (S), 불용성 (I), 및 세포 부재 배양 상청액 (SN) 분획의 웨스턴 분석은 B에 도시한다. A575=30로 표준화된 로딩된 배양물의 양은 겔 밑에 표시한다.
도 4: pelB:gal2의 이. 콜라이에서의 발현. pelB:gal2 (pDOW1138)에서 발현된 Gal2의 웨스턴 블롯 분석의 사진을 도시한다. 화살표는 불용성 (I) 및 가용성 (S) 분획에서의 프로세싱된 및 미프로세싱된 단백질을 지시한다. 유도 후 0 (I0) 및 3 시간 (I3)째에 취한 샘플을 A575=l로 표준화했다; 5㎕을4-12% NuPAGE 겔에 로딩하고 1X MES 완충제에서 수행했다.
도 5: 이. 콜라이 및 피. 플루오레센스 유래 정제된 scFv의 활성. 소규모 (B) 또는 대규모 (C) 발효물로부터 단리된 scFv의 활성을 측정하기 위해 사용된 ELISA 분석 (A). 활성은 흡광도로 표현하고; 항체 및 양은 각 바 아래에 나열한다. 3개 웰의 평균이 도시된다.
도 6: 항-디곡신(digoxin) scFv의 분비된 발현. A: 진탕 플라스크 규모에서의 피. 플루오레센스내 분비를 도시. B: 진탕 플라스크 규모에서 이. 콜라이내 분비를 도시. 모든 샘플을 20 OD (피. 플루오레센스는 OD575에서, 이. 콜라이는 OD600에서)로 표준화했다. 샘플을 4-12% BT 겔에서 MES 완충제로 수행했다. S=가용성, I=불용성. 숫자는 유도후 시간이다.
도 7: 진탕 플라스크 규모에서 분비된 항-디곡신 scFv의 웨스턴 블롯. 패널 A는 피. 플루오레센스 발현 단백질을, 패널 B는 이. 콜라이 발현 단백질을 도시한다. 샘플을 20 OD로 표준화했다. 단백질은 양 제작물 모두에서 100% 불용성이다. S=가용성, I=불용성. 0, 3, 24, 48은 유도후 시간을 나타낸다.
도 8: 항-디곡신 scFv의 정량에 의한 제작물 사이의 수율 비교. 10 ㎕의 각 샘플을 (BSA 표준물 포함)을 4-12% BT 겔에 로딩하고 1X MES 완충제에서 수행했다. 각 제작물의 유도 후 0, 3, 24, 48 시간의 샘플을 로딩했다. 피. 플루오레센스 분비된 제작물 pDOW1142 및 이. 콜라이 세포질 (pDOW1152) 및 분비된 (pDOW1153) 제작물을 검사했다. 화살표는 프로세싱된 및 미프로세싱된 분비된 scFv의 이동을 표시한다. BSA 표준물 곡선은 하기와 같이 수행했다: 1, 0.1 ㎍; 3, 0.60 ㎍; 5, 1.529 ㎍; 8. 1.85 ㎍.
도 9: 항-디곡신 scFv 정제물의 활성 분석. X-축은 시험된 샘플이다: pDOW1142, pDOW1152 또는 pDOW1153 함유 균주 유래 정제된 scFv; 폴리클로날 항-디곡신 항체 (양성); 또는 단백질 부재(음성). Y-축은 흡광도 값이다. 에러 바는 3중 샘플의 표준 편차를 나타낸다.
도 10: Skp 단백질을 5 mM 벤조에이트로 성장시킨 24시간 후에 유도했다. 비유도된 플라스크를 대조군으로서 사용했다. 세포를 유도 후 12 시간 후 수거하고 단백질을 가용성 및 불용성 분획으로 분리했다. 단백질을 4-12% NuPAGE 겔 (인 비트로겐 (Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드 소재) 상에서 MES 완충제를 사용해 분리했다. 약어는 하기와 같다: S=가용성, I=불용성, MW, 분자량; MWM, 분자량 마커.
도 11: 프로세싱 및 미프로세싱된 Skp 단백질의 아미노산 서열. 밑줄친 서열은 신호 서열 (상부) 및 MALDI-PSD로 인지된 서열 (하부)에 상응한다.
도 12: 양성 대조군인 DC265에 대비되는, pDOWl123로 형질전환되고 37°C에서 성장하고 O.OlmM IPTG로 유도된 JM109의 가용성 및 불용성 샘플의 SDS-PAGE 분리 이미지. 레인 l-가용성 DC265, 레인 2-불용성 DC265, 레인 3-씨블루 플러스(SeeBlue Plus) 2 레더, 레인 4-가용성 JM109/pDOW1123, 레인 5-불용성 JM109/pDOW1123. 5 ㎕ 20OD 표준화 샘플을 각 웰에 로딩했다. 4-12% Bis Tris 겔을 150 volt로 1x MES 완충제에서 약 50 분간 수행한 후 심플리 블루 세이프 스테인 (Simply Blue Safe Stain)으로 염색했다.
도 13: pDOWl123로 형질전환되고 O.OlmM IPTG로 유도되고 37°C에서 성장한 이. 콜라이 균주 JM109 유래 불용성 샘플의 SDS-PAGE 분리 이미지. 레인 1-3, 10 ㎕ 불용성 샘플. 레인 4, 10 ㎕ 양성 대조군 피. 플루오레센스 DC265의 1 :20 희석물. 12% Bis-Tris 겔을 200 volt로 약 50 분간 1x MES 완충제에서 수행한 후 노벡스 (Novex)(등록상표) 콜로이달 블루 스테인 키트 (Colloidal Blue Stain Kit)로 염색했다.
도 14: pDOWl123로 형질전환되고 O.OlmM IPTG로 유도되고 37°C에서 성장한 이. 콜라이 균주 JM109 유래 주변세포질 샘플의 SDS-PAGE 분석 이미지. 12% Bis- Tris 겔을 200 volt로 약 50 분간 MES 완충제에서 수행한 후 노벡스 (등록상표) 콜로이달 블루 스테인 키트로 염색했다. 레인 1, 10 ㎕ 양성 대조군 DC265의 1 :20 희석물. 레인 2-4, 10 ㎕ 주변세포질 샘플.
도 15: 37°C에서 성장한 JM109/pDOWl123의 0.01 mM IPTG-유도 배양물의 가용성, 불용성, 및 주변세포질 분획의 웨스턴 분석의 이미지. 샘플을 12% Bis Tris 겔에서 MES 완충제로 수행하고 1시간 30 volts로 니트로셀룰로오스로 전이한 후 항-His HRP로 프로빙했다. 레인 1, 양성 대조군의 불용성 부분의 1 :30 희석물 10 ㎕. 레인 2- 20 ㎕ 가용성 분획. 레인 3- 10 ㎕ 불용성 분획. 레인 4- 20 ㎕ 주변세포질 제조물.
본 발명은 피. 플루오레센스내 분비 신호 서열의 발견에 기초한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 단백질 또는 펩티드와 함께 발현시 관심 단백질 또는 펩티드의 분비를 개선시킬 수 있는 피. 플루오레센스 유기체 유래 신호 펩티드 서열, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산, 신호 펩티드 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 세포를 제공한다. 피. 플루오레센스 유래 Sec-분비 신호를 사용한 세포 발현 시스템내 적절히 프로세싱된 재조합 단백질의 고농도 생산을 위한 향상된 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 피. 플루오레센스가 다양한 단백질의 생산용 향상된 플랫폼임을 또한 인지한다. 특히, 피. 플루오레센스는 다른 박테리아 발현 시스템에서 전형적으로 얻어진 것보다 고농도로 정확히 프로세싱된 형태로 Sec 분비 시스템에 표적화된 외래 단백질을 생산하고, 세포의 주변세포질로 상기 단백질을 고농도로 운반하 여 완전히 프로세싱된 재조합 단백질의 회수 증가를 일으킨다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 Sec 분비 신호에 연결된 표적 단백질을 발현함으로써 피. 플루오레센스 세포내 외래 단백질을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
다른 박테리아 발현 시스템과 비교해 소정의 슈도모나드가 펩티드 및 효소의 상업용 발현을 위한 이점을 제공함이 이전에 증명되었다. 특히, 피. 플루오레센스가 유익한 발현 시스템으로서 확인되어 왔다. 피. 플루오레센스는 토양, 물 및 식물 표면 환경에 콜로니 형성하는 공통의 비병원균성 사물기생균(saprophyte)의 군을 포함한다. 피. 플루오레센스 유래 상업용 효소는 세제 첨가물과 같은 환경 오염을 감소시키기 위해 그리고 입체선택적 가수분해를 위해 사용되어왔다. 피. 플루오레센스는 병균을 제균하기 위해 농업적으로 또한 사용된다. 1990년대 후반에 다우 아그로사이언스 (Dow AgroSciences)에 의해 그 전체가 흡수합병된 마이코젠 (Mycogen)은 1980년대 중반에 피. 플루오레센스내에서 재조합 박테리아 단백질을 발현하기 시작했고 1985년 1월 22일에 피. 플루오레센스내 바실러스 터린기엔시스 톡신 (Bacillus thuringiensis toxin)의 발현에 대한 첫번째 특허 출원("Cellular encapsulation of biological pesticides")을 출원하였다. 1985년과 2004년 사이에, 마이코젠, 후에 다우 아그로사이언스 및 다른 회사는 살충, 제충 및 살선충 (nematocidal) 톡신의 생산 및 특정 톡신 서열 및 상기의 발현을 개선시키기 위한 일반 조작에 관한 특허 출원으로 피. 플루오레센스의 농업적 사용에 대해 투자했다.
다우 파마 (DowPharma)는 현재 재조합 단백질을 생산하기 위한 피. 플루오레 센스의 사용 분야에서 수개의 특허출원을 갖고 있다. 다우 글로발 테크놀로지스 (Dow Global Technologies)의 PCT 공개특허 번호 WO 제03/068926호 및 WO 제03/068948호는 슈도모나드, 특히 피. 플루오레센스가 숙주 세포로 사용될 수 있는 극한효소 (extremozyme) 과발현 시스템을 기술한다. 상기 문헌은 극한효소의 발현 및 신호 펩티드를 일반적으로 기술하나 특정 서열이 개시되지 않았고 세포가 분비에 우수함에 대한 아무런 인지도 없다.
2003년 4원 22일 출원된 다우 글로발 테크놀로지스의 PCT 공개특허 번호 WO 제03/089455호("Low-Cost Production of peptides")는 슈도모나드, 특히 피. 플루오레센스에서 콘카테머 전구체로서 항생 펩티드와 같은 소 펩티드를 생성하는 저비용 방법을 기술한다. 상기 문헌은 신호 펩티드와 함께 콘카테머 펩티드의 발현을 기술하나 특정 서열은 개시되어 있지 않다.
다우 글로발 테크놀로지스의 PCT 공개특허 번호 WO 제04/005221호("Benzoate and Antranilate Inducible Promoters")는 상업용 원핵생물 발효 시스템을 위한 피. 플루오레센스 유래 벤조에이트 또는 안트라닐레이트 유도가능 프로모터를 제공한다. 상기 문헌은 프로모터와 함께 신호 펩티드의 포함을 기술하나 특정 신호 서열은 개시되어 있지 않다.
펩티드
한 실시태양에서, 포스페이트 결합 단백질 (pbp) 분비 신호, 외막 포린 E (OprE) 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철 (III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로부터 선택된 피. 플루오레 센스 Sec-시스템 분비 펩티드인 또는 그에 실질적으로 동종인 아미노산 서열을 갖는 단리된 펩티드가 제공된다.
또다른 실시태양에서, pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철 (III) 결합 단백질 및 지단백질 B 분비 신호이거나 그에 실질적으로 동종인 아미노산 서열을 갖는 단리된 펩티드가 제공된다. 한 실시태양에서, 상기 단리된 펩티드는 관심 대상인 단백질 또는 펩티드 및 분비신호의 융합 단백질이다.
한 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산: Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala (서열 1) 이상의 포스페이트 결합 단백질 (pbp) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 서열 1의 아미노산 2-24 이상을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에서 절단되나 분비 신호 활성을 유지하는 서열 1의 절단물을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산: Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala Gly Ala (서열 3) 이상의 서열을 갖는 외막 포린 E (OprE) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 한 실시태양에서, 펩티드 서열은 서열 3의 아미노산 2-21 이상이거나 동종이다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에서 절단되나 분비 신호 활성을 유지하는 서열 3의 절단물을 포함한다. 한 실시태양에서, 서열 3의 펩티드는 2번 위치의 Lys이 Tyr으로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 3의 펩티드는 5번 위치의 Thr이 Ser으로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 3의 펩티드는 8번 위치의 Val이 Leu로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 3의 펩티드는 10번 위치의 Val이 Val 및 Arg로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 3의 펩티드는 14번 위치의 Ala이 Val로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 3의 펩티드는 15번 위치의 Ile이 Leu로 대체되어 변형된다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산: Met Phe Ala Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala (서열 5) 이상의 서열을 갖는 아주린 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 한 실시태양에서, 펩티드는 서열 5의 아미노산 2-20 이상이거나 동종이다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에서 절단되나 분비 신호 활성을 유지하는 서열 5의 절단물을 포함한다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 2번 및 3번 위치의 Phe-Ala이 Leu-Arg 또는 Ile-Arg으로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 5번 위치의 Leu이 Ala로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 6번 위치의 Val이 Ala로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 6-8번 위치의 Val-Ala-Val이 Ile-Ser-Ala로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 11번 위치의 Leu이 Ile로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 12번 위치의 Thr이 Ser로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 14번 위치의 Ala이 Leu 또는 Phe로 대체되어 변형된다. 한 실시태양 에서, 서열 5의 펩티드는 16번 위치의 Gly이 Ala로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 17번 위치의 Gln이 Ser 또는 Pro로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 18번 위치의 Leu이 Val로 대체되어 변형된다. 한 실시태양에서, 서열 5의 펩티드는 18-19번 위치의 Leu-Leu이 Val-Phe로 대체되어 변형된다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산: Met Gln Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala Thr Ala Met Ala (서열 7) 이상의 서열을 갖는 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 (LAObp 또는 KRObp) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 한 실시태양에서, 펩티드는 서열 7의 아미노산 2-23이거나 실질적으로 동종이다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에서 절단되나 분비 신호 활성을 유지하는 서열 7의 절단물을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산: Met Met Ile Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser (서열 9) 이상의 서열을 갖는 철 (III) 결합 단백질 [Fe(III)bp] 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 한 실시태양에서, 펩티드는 서열 9의 아미노산 2-32이거나 실질적으로 동종이다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에서 절단되나 분비 신호 활성을 유지하는 서열 9의 절단물을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노산: Met Ile Lys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala (서열 11) 이상의 서열을 갖는 지단백질 B (LprB) 분비 신호 펩티드의 서열이거나 실질적으로 동종이다. 한 실시태양에서, 펩티드는 서열 11의 아미노산 2-17이거나 실질적으로 동종이다. 또다른 실시태양에서, 펩티드 서열은 아미노 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에서 절단되나 분비 신호 활성을 유지하는 서열 11의 절단물을 포함한다.
별도 실시태양에서, 분비 신호는 이. 콜라이 단백질 유래 분비 신호이다. 한 실시태양에서, 분비 신호는 이. 콜라이 유래 단백질에 대한 천연 신호 서열이다. 한 실시태양에서, 단백질은 섀퍼론 단백질이다. 단백질은 디술파이드 결합 형성 단백질일 수 있다. 한 실시태양에서, 서열은 skp 단백질과 같은 이. 콜라이 섀퍼론 단백질의 천연 서열이다.
sec 경로용 신호 펩티드는 일반적으로 하기의 3가지 도메인으로 구성된다: (i) 양성적으로 대전된 n-영역, (ii) 소수성 h-영역 및 (iii) 비대전되었으나 극성인 c-영역. 신호 펩티다제용 절단 부위는 c-영역에 위치한다. 그러나, 신호 서열 보존 및 길이 정도 및 절단 부위 위치는 상이한 단백질 마다 변할 수 있다. 분비 신호 서열은 예를 들면 시그날피 (SignalP) 프로그램 또는 문헌[Hiller, et al. (2004) Nucleic Acids Research 32 (Web Server issue):W375-W379; URL: http://www.predisi.de에서 인터넷상으로 얻을 수 있음]에 기술된 바와 같이 분비 신호를 확인하기 위해 고안된 컴퓨터 프로그램을 이용해 확인된 임의의 서열일 수 있다.
서열 동종성
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종"은 i) 원래 단백질 또는 펩티드의 원하는 기능을 유지하고 주어진 원래 단백질 또는 펩티드 서열에 실질적으로 유사한 (즉, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 이상) 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드 또는 ii) 원래 핵산 서열의 원하는 기능을 유지하고 주어진 핵산 서열에 실질적으로 유사한 (즉, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 이상) 서열을 갖는 핵산을 의미한다. 본 발명 및 명세서의 모든 실시태양에서, 임의의 개시된 단백질, 펩티드 또는 핵산은 원하는 기능을 유지하는 동종 또는 실질적으로 동종인 단백질, 펩티드 또는 핵산으로 치환될 수 있다. 본 발명 및 명세서의 모든 실시태양에서, 임의의 핵산이 개시된 때, 본 발명은 개시된 핵산에 혼성화되는 모든 핵산을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
한 실시태양에서, 동종 폴리펩티드의 아미노산 서열은 주어진 원래 폴리펩티드의 변이체인데, 이때 변이체의 서열은 치환된 변이체가 원래 폴리펩티드의 원하는 기능을 유지하는 것을 조건으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30%를 비롯한 원래 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 약 30% 이하를 다른 아미노산 잔기로 대체하여 얻을 수 있다. 실질적 동종성을 갖는 변이체 아미노산은 주어진 폴리펩티드에 약 70% 이상 동종이거나 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동종일 것이다.
한 실시태양에서, 변이체는 유사하게 치환되거나 원래 폴리펩티드의 유사한 변이체일 것이다. 용어 "유사하게 치환된 변이체"는 원래 폴리펩티드에 비해 "유사한" 아미노산 잔기 치환인 상이한 잔기를 함유하나 모든 차이점이 "유사한" 치환이 아닌 변이체를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사한 변이체"는 각 상이한 잔기가 "유사한" 아미노산 잔기 치환인 변이체를 의미한다. 문맥에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사한" 아미노산 잔기는 표 1에서 도시된 바와 같이 15개 보존 또는 반보존 그룹 중의 임의의 하나의 일원인 잔기들을 지칭한다.
유사한 아미노산 치환 그룹
보존 그룹 (8) 반-보존 그룹 (7)
Arg, Lys Arg, Lys, His
Asp, Glu Asn, Asp, Glu, Gln
Asn, Gln
Ile, Leu, Val Ile, Leu, Val, Met, Phe
Ala, Gly Ala, Gly, Pro, Ser, Thr
Ser, Thr Ser, Thr, Tyr
Phe, Tyr Phe, Trp, Tyr
Cys (비-시스테인), Ser Cys (비-시스테인), Ser, Thr
한 실시태양에서, 치환의 50% 이상이 보존성 아미노산 치환으로 나타날 것이고, 나머지 치환은 반-보존성 치환일 것이다. 한 실시태양에서, 유사한 치환의 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상이 보존성 아미노산 치환으로 나타날 것이다.
또다른 실시태양에서, 유사한 치환의 50% 이상이 보존성 아미노산 치환으로 나타날 것이고, 유사한 치환의 나머지는 반-보존성 치환으로 나타날 것이다. 한 실시태양에서, 유사한 치환의 55% 이상, 또는 60% 이상, 또는 65% 이상, 또는 70% 이상, 또는 75% 이상, 또는 80% 이상이 보존성 아미노산 치환으로 나타날 것이다. 한 실시태양에서, 치환된 변이체는 주어진 원래 폴리펩티드의 유사한 변이체일 것이다.
핵산 서열
본 발명은 pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철 (III) 결합 단백질 및 지단백질 B 분비 신호와 실질적으로 동종인 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 단리된 핵산을 또한 포함한다. 본 발명의 또다른 측면에서, pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철 (III) 결합 단백질 또는 지단백질 B 분비 신호에 실질적으로 동종인 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 단리된 핵산과 혼성화되는 핵산이 제공된다. 소정의 실시태양에서, 혼성화 핵산은 고엄격 조건하에 결합할 것이다. 고엄격 조건은 전형적으로 68℃ 이상에서의 혼성화를 의미한다.
한 실시태양에서, 서열 1의 아미노산 2-24 이상의 포스페이트 결합 단백질 (pbp) 분비 신호 펩티드의 서열에 실질적으로 동종인 펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 제공된다. 별도의 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc (서열 2)이다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 2 서열에 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일한 것이다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 2 서열에 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 이상 동일한 것이다. 또다른 실시태양에서, 서열 2의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 서열 3의 아미노산 2-21 이상의 서열을 갖는 외막 포린 E (OprE) 분비 신호 펩티드의 서열에 실질적으로 동종인 펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 제공된다. 한 실시태양에서, 펩티드 서열은 서열 3의 펩티드이거나 실질적으로 동종인데, 여기서 2번 위치의 Lys이 Tyr으로 대체되고, 5번 위치의 Thr이 Ser으로 대체되고, 8번 위치의 Val이 Leu로 대체되고 10번 위치의 Val이 Val 및 Arg로 대체되고 14번 위치의 Ala이 Val로 대체되고 15번 위치의 Ile이 Leu로 대체된다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttg ggc gca atc gcc cag caa gca ggc gct (서열 4)이다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 4의 서열과 90% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 4의 서열과 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 4의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 서열 5의 아미노산 2-20 이상의 서열을 갖는 아주린 분비 신호 펩티드의 서열에 실질적으로 동종인 펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 제공된다. 한 실시태양에서, 펩티드 서열은 서열 5의 펩티드이거나 실질적으로 동종인데, 여기서 2번 및 3번 위치의 Phe-Ala이 Leu-Arg 또는 Ile-Arg으로 대체되고 5번 위치의 Leu이 Ala로 대체되고 6번 위치의 Val이 Ala로 대체되고 6-8번 위치의 Val-Ala-Val이 Ile-Ser-Ala로 대체되고 11번 위치의 Leu이 Ile로 대체되고 12번 위치의 Thr이 Ser로 대체되고 14번 위치의 Ala이 Leu 또는 Phe로 대체되고 16번 위치의 Gly이 Ala로 대체되고 17번 위치의 Gln이 Ser 또는 Pro로 대체되고 18번 위치의 Leu이 Val로 대체되고 18-19번 위치의 Leu-Leu이 Val-Phe로 대체된다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggc cag ttg ctt gct (서열 6)이다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 6의 서열과 90% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 6의 서열과 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 6의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에서, 서열 7의 아미노산 2-23 이상의 서열을 갖는 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 (LAObp 또는 KRObp) 분비 신호 펩티드의 서열에 실질적으로 동종인 펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 제공된다. 별도 실시태양에서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 atg cag aac tat aaa aaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtc tcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca (서열 8)이다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 8의 서열과 90% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 8의 서열과 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에서, 서열 8의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에 있어서, 적어도 서열 9의 아미노산 2-32의 서열을 가지는 철(III) 결합 단백질[Fe(III)bp] 분비 서열 펩티드의 서열과 실질적으로 상동인 펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 제공된다. 별도의 실시태양에 있어서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은: atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctc acc cta ctc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct(서열 10)이다. 또다른 실시태양에 있어서, 핵산 서열은 서열 10의 서열과 90% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에 있어서, 핵산 서열은 서열 10의 서열과 적어도 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 동일하다. 또다른 실시태양에 있어서, 서열 10의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
또다른 실시태양에 있어서, 적어도 서열 11의 아미노산 2-17의 서열을 가지는 지단백질 B(LprB) 분비 서열 펩티드의 서열과 실질적으로 상동인 펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 제공된다. 별도의 실시태양에 있어서, 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은: atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct(서열 12)이다. 또다른 실시태양에 있어서, 핵산 서열은 서열 12의 서열과 90% 이상 동일하다. 또다른 실시태양에 있어서, 핵산 서열은 서열 12의 서열과 적어도 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 동일하다. 또다른 실시태양에 있어서, 서열 12의 핵산 서열은 숙주 유기체의 코돈 사용도에 기초해 조정된다.
코돈 사용 또는 코돈 선호도는 당업계에 공지되어 있다. 선택된 코딩 서열은 그의 유전 코드를 변경하여 변형되어 박테리아 숙주 세포에 의해 사용된 것과 맞추어질 수 있고, 그의 코돈 서열은 증강되어 숙주에 의해 사용된 것에 보다 양호하게 비슷해질 수 있다. 유전 코드 선택 및 코돈 빈도 증강은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 방법들, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 본 방법을 보조하기 위한 유용한 온라인 인터넷 리소스는, 예를 들면: (1) http://www.kazusa.or.jp/codon/에서 입수 가능한 카즈사 DNA 연구소(일본 292-0818 지바 키사라즈 카즈사-카마타리 2-6-7)의 코돈 사용 데이터베이스; 및 (2) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=c의 NCBI 탁소노미(Taxonomy) 데이터베이스로부터 입수 가능한 유전 코드 표를 포함한다. 예를 들면, 슈도모나스(Pseudomonas)종이 NCBI 탁소노미 사이트의 유전 코드를 이용하여 보고되고, 카즈사 사이트에서는 http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/에 도시된 표의 코돈 사용 빈도를 나타내어 보고된다.
핵산 상동성
실질적으로 유사한 펩티드의 서열을 코딩하는 다양한 실질적으로 상동인 핵산이 제공될 수 있다는 점은 당업자에게 명백하다. 코딩 서열에 대한 상동성의 경우, 본원의 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 상동인 코딩 서열은, 본원에 개시된 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 비교하여, 리딩 프레임을 변경시키는 돌연변이는 30% 이하(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30%) 함유하고 조기 종결 코돈을 생성하는 것은 함유하지 않는다. 그러나, 핵산 서열은 원하는 발현 시스템 내의 상이한 코돈 사용에 기초하여 고안될 수 있다.
핵산 서열 상동성은 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 결정된다. 유용한 서열 정렬 및 상동성 결정 방법의 예는 이하에 기술된 것들을 포함한다.
상동성 서열에 대한 정렬 및 검색은 미국 국립생명공학정보센터(NCBI) 프로그램인 메가블라스트(MegaBLAST)(현재 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 입수 가능)를 사용하여 수행될 수 있다. 옵션으로 퍼센트 동일성을 아미노산 서열에 대해 70%, 또는 뉴클레오티드 서열에 대해 90%로 조정한 이 프로그램을 사용하면 조회하는 서열과의 상동성이 70%, 또는 90%, 또는 그 이상인 서열들을 확인할 것이다. 당업계에 공지된 다른 소프트웨어가 또한 상동인 서열들, 예를 들면, 본 발명에 따른 프로모터 염기 서열 또는 활성 인자-단백질을 코딩하는 염기 서열을 함유하는 정보 스트링과의 상동성이 70% 이상 또는 90% 이상인 서열들을 정렬하고(하거나) 검색하기 위해 입수 가능하다. 예를 들면, 조회하는 서열과의 상동성이 70% 이상 또는 90% 이상인 서열을 확인하기 위한 비교용 서열 정렬이, 예를 들면, GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지(미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 에비뉴 1710 위스콘신 대학교 생명공학 센터의 유전학 컴퓨터 그룹으로부터 입수 가능) 내에서 입수 가능한, 특정된 기본 매개변수 및 70% 또는 90%로 조정된 상동성의 정도에 대한 매개변수를 가지는 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 예를 들면, CLUSTAL 프로그램(미국 캘리포니아주 마운틴뷰의 인텔리제네틱스(Intelligenetics)의 PC/Gene 소프트웨어 패키지 내에서 입수 가능)이 사용될 수 있다.
이들 및 다른 서열 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있고 육안 검사에 의한 수동 정렬, 또는 서열 정렬 알고리즘, 예컨대 상기 프로그램에 의해 구현되는 임의의 것들의 수동 또는 자동 적용에 의해 수행될 수 있다. 다양한 유용한 알고리즘은, 예를 들면: 문헌[W.R. Pearson & DJ. Lipman, Proc. Nat'l Acad. ScL USA 85:2444-48 (Apr 1988)]에 기재된 유사성 검색 방법; 문헌[T.F. Smith & M.S. Waterman, in Adv. Appl. Math. 2:482-89 (1981)] 및 [J. Molec. Biol. 147:195-97 (1981)]에 기재된 국부 상동성 방법; 문헌[S.B. Needleman & CD. Wunsch, J. Molec. Biol. 48(3):443-53 (Mar 1970)]에 기술된 상동성 정렬 방법; 및 예를 들면, 문헌[W.R. Pearson, Genomics 11(3):635-50 (Nov 1991)]; 문헌[W.R. Pearson, Methods Molec. Biol. 24:307-31 및 25:365-89 (1994)]; 및 문헌[D.G. Higgins & P.M. Sharp, Comp. Appl'ns in Biosci. 5:151-53 (1989)] 및 [D.G. Higgins & P.M. Sharp, Gene 73(1):237-44 (15 Dec 1988)]에 기술된 다양한 방법들을 포함한다.
고도의 엄격 혼성화 조건에서 수행된 핵산 혼성화가 또한 본원에 사용하기 위한 충분하게 상동인 서열을 얻기에 유용한 기술이다. 고도의 엄격 혼성화 조건은 일반적으로 68℃ 이상에서 수성 조건에서 수행된 혼성을 의미한다.
벡터
또다른 실시태양은 프로모터에 작동가능하게 연결된 pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철(III) 결합 단백질 또는 지단백질 B 분비 신호와 실질적으로 상동인 서열을 가지는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) Sec-시스템의 핵산을 포함하는 발현 벡터이다. 발현 가능한 코딩 서열이 선택된 숙주 세포 내에서 기능할 수 있는 전사 프로모터, 및 다른 요구되는 전사 및 번역 조절 인자에 작동가능하게 연결될 것이다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 전사 및 임의의 번역 조절 인자들이, 코딩 서열에 비해 숙주 세포 내에서 숙주 세포의 작용에 의해 조절 인자들이 코딩 서열의 발현을 지향할 수 있는 그런 배열(들) 내의 코딩하는 서열에 공유 부착된 임의의 구조를 의미한다.
벡터는 전형적으로 하나 이상의 표현형 선택 표지, 및 벡터의 유지를 보장하고, 바람직하다면 숙주 내의 증폭을 제공하기 위한 복제 원점을 포함할 것이다. 본 개시 내용에 따른 형질 전환에 적합한 숙주는 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 다양한 종들을 포함하며, 특히 바람직한 것은 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)의 숙주 세포 균주이다.
하나의 실시태양에 있어서, 벡터는 관심 대상인 Sec 분지 신호에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 위한 코딩 서열을 추가로 포함한다. 재조합 단백질 및 펩티드는 표적 폴리펩티드 코딩 서열이 리더 서열 및 그로부터 숙주가 단백질 또는 펩티드를 발현할 수 있는 기능적 유전자를 형성하기 위한 전사 및 번역 조절 인자에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 코딩 서열은, 입수 가능하다면, 표적 폴리펩티드에 대한 천연 코딩 서열일 수 있으나, 더욱 바람직하게는 선택된 발현 숙주 세포에 사용하기 위해, 예를 들면 숙주 종의 코돈 사용 편향성(bias)을 반영하기 위해 유전자를 합성하는 것에 의해 선택되거나, 개선되거나, 또는 최적화된 코딩 서열일 것이다. 본 발명의 하나의 실시태양에 있어서, 숙주 종은 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)이고, 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)의 코돈 편향성은 신호 서열 및 단백질 또는 펩티드 서열 모두를 고안하는 경우 고려된다. 유전자(들)는 하나 이상의 벡터(들) 내에서 구축되거나 또는 벡터(들) 내로 삽입되며, 그 후 발현 숙주 세포 내로 형질 전환될 수 있다.
다른 조절 인자들이 벡터(또한 "발현 제작물"로 불린다) 내에 포함될 수 있다. 상기 인자들은, 예를 들면, 전사 증강 인자 서열, 번역 증강 인자 서열, 다른 프로모터, 활성 인자, 번역 개시 및 종결 신호, 전자 종결 인자, 시스트론성 조절 인자, 폴리시스트론성 조절 인자, 태그 서열, 예컨대 뉴클레오티드 서열 "태그", 및 발현된 폴리펩티드의 확인, 분리, 정제, 또는 단리를 촉진하는 "태그" 펩티드 코딩 서열을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
또다른 실시태양에 있어서, 발현 벡터는 분비 신호에 대한 코딩 서열 또는 재조합 단백질 또는 펩티드에 대한 코딩 서열에 인접한 태그 서열을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에 있어서, 이런 태그 서열은 단백질의 정제를 가능하게 한다. 태그 서열은 친화성 태그, 예컨대 헥사-히스티딘 친화성 태그일 수 있다. 또다른 실시태양에 있어서, 친화성 태그는 글루타티온-S-전이효소 분자일 수 있다. 태그는 또한 형광성 분자, 예컨대 YFP 또는 GFP, 또는 상기 형광성 단백질의 유사체일 수 있다. 태그는 또한 항체 분자의 일부, 또는 정제에 유용한 공지된 결합 파트너에 대한 공지된 항원 또는 리간드일 수 있다.
본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 유전자는, 단백질 코딩 서열 이외에, 그것에 작동가능하게 연결된 다음의 조절 인자들을 포함할 수 있다: 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 전사 종결 인자, 번역 개시 및 종결 신호. 유용한 RBS는 본 발명에 따른 발현 시스템의 숙주 세포로 유용한 임의의 종, 바람직하게는 선택된 숙주 세포로부터 수득될 수 있다. 다수의 구체적이고 다양한 컨센서스(consensus) RBS, 예를 들면, 문헌[D. Frishman et al., Starts of bacterial genes: estimating the reliability of computer predictions, Gene 234(2):257-65 (8 Jul 1999)]; 및 [B.E. Suzek et al, A probabilistic method for identifying start codons in bacterial genomes, Bioinformatics 17(12): 1123-30 (Dec 2001)]에 기술되고 참고로 인용된 것들이 알려져 있다. 또한, 천연 또는 합성 RBS 중 어느 하나, 예를 들면, EP 제0207459호(합성 RBS); 문헌[O. Ikehata et al., Primary structure of nitrite hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expression in Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989)](AAGGAAG의 천연 RBS 서열)에 기술된 것들이 사용될 수 있다. 방법들, 벡터들, 및 번역 및 전사 인자들, 및 본 발명에 유용하 다른 인자들의 추가의 예들은, 예를 들면, 미국 특허 제5,055,294호(길로이(Gilroy)) 및 미국 특허 제5,128,130호(길로이 등); 미국 특허 제5,281,532호(람러(Rammler) 등); 미국 특허 제4,695,455호 및 제4,861,595호(반스(Barnes) 등); 미국 특허 제4,755,465호(그레이(Gray) 등); 및 미국 특허 제5,169,760호(윌콕스(Wilcox))에 기술된다.
슈도모나스(Pseudomonas)에 의해 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA의 전사는 증강 인자 서열을 벡터 또는 플라스미드 내로 삽입하는 것에 의해 증가된다. 전형적인 증강 인자는, 통상적으로 약 10 내지 300bp의 크기를 가지는, 프로모터 상에서 작용하여 그 전자를 증가시키는, DNA의 cis-작용 인자이다. 예들은 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 증강 인자들을 포함한다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포의 형질 전환을 가능하게 하는 복제 원점 및 선택 표지 및 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함하여 하류 구조 서열의 전사를 지향할 것이다. 상기 프로모터는 효소, 예컨대, 그 중에서도, 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), 산 포스파타제, 또는 열 충격 단백질을 코딩하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종 구조 서열은 번역 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 번역된 효소의 분비를 지향할 수 있는 리더 서열을 가지는 적절한 상에서 조립된다. 임의로 이종 서열은 원하는 특성, 예를 들면, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 확인 펩티드를 포함하는 융합 효소를 코딩할 수 있다.
벡터들은 숙주 세포 내에서 재조합 단백질을 발현하는데 유용하다고 당업계에 알려져 있고, 이들 중 임의의 것들은 본 발명에 따라 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 상기 벡터들은, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 및 파지 발현 벡터들을 포함한다. 유용한 플라스미드 벡터들의 예들은, 발현 플라스미드 pBBR1MCS, pDSK519, pKT240, pML122, pPS1O, RK2, RK6, pRO1600, 및 RSF1O1O을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 유용한 벡터들의 다른 예들은, 예를 들면, 문헌[N. Hayase, in Appl. Envir. Microbiol. 60(9):3336-42 (Sep 1994)]; [A.A. Lusbnikov et al., in Basic Life Sci. 30:657-62 (1985)]; [S. Graupner & W. Wackernagel, in Biomolec. Eng. 17(1):11-16. (Oct 2000)]; [H.P. Schweizer, in Curr. Opin. Biotech. 12(5):439-45 (Oct 2001)]; [M. Bagdasarian & K.N. Timmis, in Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:47-67 (1982)]; [T. Ishii et al., in FEMS Microbiol. Lett. 116(3):307-13 (Mar 1, 1994)]; [I.N. Olekhnovich & Y.K. Fomichev, in Gene 140(1):63-65 (Mar 11, 1994)]; [M. Tsuda & T. Nakazawa, in Gene 136(1-2):257-62 (Dec 22, 1993)]; [C. Nieto et al., in Gene 87(1):145-49 (Mar 1, 1990)]; [J.D. Jones & N. Gutterson, in Gene 61(3):299-306 (1987)]; [M. Bagdasarian et al., in Gene 16(1-3):237-47 (Dec 1981); [H.P. Schweizer et al., in Genet. Eng. (NY) 23:69-81 (2001)]; [P. Mukhopadhyay et al., in J. Bact. 172(1):477-80 (Jan 1990)]; [D.O. Wood et al., in J. Bact. 145(3):1448-51 (Mar 1981)]; 및 [R. Holtwick et al., in Microbiology 147(Pt 2):337-44 (Feb 2001)]에 기술된 것들을 포함한다.
슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포에 유용할 수 있는 발현 벡터의 추가의 예들은 지시된 레플리콘으로부터 유도된 표 2에 열거된 것들을 포함한다.
유용한 발현 벡터들의 일부 예
레플리콘 벡터(들)
PPS1O PCN39, PCN51
RSF1O1O PKT261-3
PMMB66EH
PEB8
PPLGN1
PMYC1050
RK2/RP1 PRK415
PJB653
PRO1600 PUCP
PBSP
발현 플라스미드 RSF1O1O은, 예를 들면, 문헌[F. Heffron et al., in Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72(9):3623-27 (Sep 1975)], 및 [K. Nagahari & K. Sakaguchi, in J. Bact. 133(3):1527-29 (Mar 1978)]에 기술된다. 플라스미드 RSF1O1O 및 그 유도체는 본 발명에 특히 유용한 벡터이다. 예시적으로, 당업계에 공지된 RSF1010의 유용한 유도체는, 예를 들면, pKT212, pKT214, pKT231 및 관련 플라스미드, 및 pMYC1050 및 관련 플라스미드(예를 들면, 미국 특허 제5,527,883호 및 제5,840,554호(톰슨(Thompson) 등)을 참조), 예컨대, pMYC1803을 포함한다. 플라스미드 pMYC1803은 조절 테트라사이클린 내성 표지 및 RSF1010 플라스미드로부터의 복제 및 기동 좌위를 지니는 RSF1O1O계 플라스미드 pTJS260(미국 특허 제5,169,760호(윌콕스)를 참조)으로부터 유도된다. 다른 예시적인 유용한 벡터들은 미국 특허 제4,680,264호(풀러(Puhler) 등)에 기술된 것들을 포함한다.
하나의 실시태양에 있어서, 발현 플라스미드가 발현 벡터로 사용된다. 또다른 실시태양에 있어서, RSF1010 또는 그 유도체가 발현 벡터로 사용된다. 또다른 실시태양에 있어서, pMYC1050 또는 그 유도체, 또는 pMYC1803 또는 그 유도체가 발현 벡터로 사용된다.
플라스미드는, 역시 플라스미드 내에 존재하는 선택 표지 유전자를 사용하여 숙주 세포 내에 유지될 수 있다. 이는 항생제 내성 유전자(들)(이 경우 상응하는 항생제(들)는 발효 배지에 첨가될 것이다), 또는 임의의 다른 유형의 당업계에서 유용하다고 알려진 선택 표지 유전자, 예를 들면, 프로토트로피(prototrophy)-회복 유전자(이 경우 플라스미드가 상응하는 형질, 예를 들면, 생촉매 형질, 예컨대 아미노산 생합성 또는 뉴클레오티드 생합성 형질 또는 탄소원 이용 형질에 대해 영양 요구성인 숙주 세포에 사용될 것이다)일 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 프로모터는 구조적 프로모터 또는 조절 프로모터일 수 있다. 유용한 조절 프로모터의 통상적인 예들은 lac 프로모터(즉, lacZ 프로모터), 특히 미국 특허 제4,551,433호(데보(DeBoer))에 기술된 tac 및 trc 프로모터, 및 Ptac16, Ptac17, PtacII, PlacUV5, 및 T71ac 프로모터로부터 유도된 계통의 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에 있어서, 프로모터는 숙주 세포 유기체로부터 유도되지 않는다. 특정 실시태양에 있어서, 프로모터는 이. 콜라이(E. coli) 유기체로부터 유도된다.
본 발명에 따른 발현 시스템에 유용한 비-lac-타입의 프로모터의 통상적인 예들은, 예를 들면, 표 3에 열거된 것들을 포함한다.
비-lac 프로모터의 예들
프로모터 유도 인자
PR 고온
PL 고온
Pm 알킬- 또는 할로-벤조에이트
Pu 알킬- 또는 할로-벤조에이트
Psal 살리실레이트
예를 들면, 문헌[J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo (1999) Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strins as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes, in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp.460-74 (ASM Press, Washington, D.C.)]; [H. Schweizer (2001) Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445]; 및 [R. Slater & R. Williams (2000) The Expression of Foreign DNA in Bacteria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp.125-54 (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)]을 참조한다. 선택된 박테리아 숙주 세포에 내재하는 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 가지는 프로모터가 또한 표적 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진(transgene), 예를 들면, 슈도모나스(Pseudomonas) 안트라닐레이트 또는 벤조에이트 오페론 프로모터(Pant, Pben)의 발현을 제어하는데 사용될 수 있다. 직렬 프로모터가 또한 하나 이상의 프로모터가 서열이 동일하거나 상이한 다른 하나, 예를 들면, Pant-Pben 직렬 프로모터(인터프로모터 혼성) 또는 Plac-Plac 직렬 프로모터에 공유 부착된 경우에 사용될 수 있다.
조절 프로모터는 프로모터가 그 일부분인 유전자의 전사를 제어하기 위해 프로모터 조절 단백질을 사용한다. 조절 프로모터가 본원에 사용되는 경우, 상응하는 프로모터 조절 단백질은 또한 본 발명에 따른 발현 시스템의 일부일 것이다. 프로모터 조절 단백질의 예들은 활성 인자 단백질, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 이화 생성물 활성 인자 단백질, MalT 단백질; AraC계 전사 활성 인자; 억제 인자 단백질, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) LacI 단백질; 및 이중-기능 조절 단백질, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) NagC 단백질을 포함한다. 다수의 조절-프로모터/프로모터-조절-단백질 쌍이 당업계에 공지되어 있다.
프로모터 조절 단백질은 효과 인자 화합물, 즉, 조절 단백질과 가역적으로 또는 비가역적으로 결합하여 단백질이 프로모터의 제어하에 있는 유전자의 하나 이상의 DNA 전사 영역에서 떨어지거나 결합할 수 있게 하여, 유전자의 전사 개시에 있어서 전사 효소의 작용을 가능하게 하거나 차단하는 화합물과 상호작용한다. 효과 인자 화합물들은 유도 인자 또는 공-억제 인자들로 분류되며, 이들 화합물들은 천연 효과 인자 화합물 및 무상 유도 인자 화합물들을 포함한다. 다수의 조절-프로모터/프로모터-조절-단백질/효과 인자-화합물의 세 개로 된 조가 당업계에 공지되어 있다. 효과 인자 화합물이 세포 배양 또는 발효 전체에 걸쳐 사용될 수 있지만, 조절 프로모터가 사용되는 바람직한 실시태양에 있어서, 원하는 양 또는 밀도의 숙주 세포 바이오매스의 성장 후에, 적절한 효과 인자 화합물이 직접 또는 간접적으로 원하는 표적 유전자(들)의 발현을 초래하는 순서로 배양에 첨가된다.
예로서, lac계 프로모터가 이용되는 경우, lacI 유전자가 또한 시스템 내에 존재할 수 있다. (보통) 구조적으로 발현된 유전자인 lacI 유전자는 이들 프로모터들의 lac 작동 인자에 결합하는 Lac 억제 인자 단백질(LacI 단백질)을 코딩한다. 따라서, lac계 프로모터가 이용되는 경우, lacI 유전자는 또한 발현 시스템에 포함되고 발현 시스템 내에서 발현될 수 있다. lac 프로모터계 구성원, 예를 들면, tac 프로모터의 경우에, 효과 인자 화합물은 유도 인자, 바람직하게는 무상 유도 인자, 예컨대 IPTG(이소프로필-D-1-티오갈락토피라노시드, "이소프로필티오갈락토시드"라고도 불림)이다.
챔피언(Champion)TM pET 발현 시스템은 높은 수준의 단백질 생성을 제공한다. 발현은 강한 T7lac 프로모터로부터 유도된다. 이 시스템은 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 관심 대상인 유전자의 높은 수준의 전사에 대한 높은 활성 및 특이성의 이점을 가진다. 프로모터 영역에 위치한 lac 작동 인자는, 플라스미드 안정성 및 세포 생존율을 개선하면서, 전통적인 T7계 벡터보다 촘촘한 조절을 제공한다(문헌[Studier, F. W. 및 B. A. Moffatt (1986) J Molecular Biology 189(1): 113-30]; [Rosenberg, et al. (1987) Gene 56(1): 125-35]). T7 발현 시스템은 관심 대상인 유전자의 높은 수준의 전사를 위한 T7 프로모터 및 T7 RNA 중합효소(T7 RNAP)를 사용한다. 높은 수준의 발현이 T7 발현 시스템 내에서 달성되는데, 이는 T7 RNAP가 천연 E. coli RNAP보다 더 진행성이고 관심 대상인 유전자의 전사에 전용이기 때문이다. 확인된 유전자의 발현은 숙주 세포 내에 T7 RNAP 공급원을 제공함으로써 유도된다. 이는 T7 RNAP 유전자의 염색체 복제를 함유하는 BL21 E. coli 숙주를 사용함으로써 수행된다. T7 RNAP 유전자는 IPTG에 의해 유도될 수 있는 lacUV5 프로모터의 제어하에 있다. T7 RNAP는 유도에 의해 발현됨 관심 대상인 유전자를 전사한다.
pBAD 발현 시스템은 특정 탄소원, 예컨대 글루코스, 글리세롤 및 아라비노스의 존재를 통해, 재조합 단백질의 촘촘하게 제어되고 적정가능한 발현을 가능하게 한다(문헌[Guzman, et al. (1995) J Bacteriology 177(14): 4121-30]). pBAD 벡터는 고유하게 고안되어 발현 수준들에 걸쳐 정밀한 제어를 제공한다. pBAD 벡터로부터의 이종 유전자 발현은 araBAD 프로모터에서 개시된다. 프로모터는 araC 유전자의 생성에 의해 양성 및 음성 조절된다. AraC는 L-아라비노스와 복합체를 형성하는 전사 조절 인자이다. L-아라비노스가 없는 경우, AraC 다이머는 전사를 차단한다. 최대의 전하 활성화를 위해, 두 가지 사건이 요구된다: (i) L-아라비노스는 AraC에 결합하여 전사가 시작되게 한다. (ii) cAMP 활성 인자 단백질(CAP)-cAMP 복합체는 DNA에 결합하고 AraC의 프로모터 영역의 정확한 위치에의 결합을 자극한다.
trc 발현 시스템은 E. coli 내에서 trc 프로모터로부터의 높은 수준의 조절된 발현을 가능하게 한다. trc 발현 벡터는 E. coli 내에서 진핵세포 유전자의 발현에 대해 최적화되어 왔다. trc 프로모터는 트립토판(trp) 및 락토스(lac) 프로모터로부터 유도된 강한 혼성 프로모터이다. 그것은 lacO 작동 인자 및 lacIQ 유전자의 생성물에 의해 조절된다(문헌[Brosius, J. (1984) Gene 27(2): 161-72]).
발현 시스템
하나의 실시태양에 있어서, 재조합 단백질의 생성을 위한 개선된 발현 시스템이 제공된다. 하나의 실시태양에 있어서, 시스템은 숙주 세포, 및 pbp 분비 신호, OprE 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 신호 또는 신호 서열과 실질적으로 상동인 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
별도의 실시태양에 있어서, 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 숙주 세포, 및 관심 대상인 단백질 또는 펩티드에 작동가능하게 연결된 임의의 게놈으로부터의 Sec 분비 신호를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 발현 시스템이 제공된다. 벡터는 상기한 특성 중 임의의 것을 가질 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, Sec 분비 신호는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)로부터 유도된다. 그러나, 또다른 실시태양에 있어서, Sec-분비 신호는 임의의 박테리아 게놈으로부터 유도된다. 하나의 실시태양에 있어서, 분비 신호는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 게놈이 아닌 박테리아 게놈으로부터 유도되며, 특정 실시태양에 있어서, 분비 신호는 이. 콜라이(E. coli) 게놈으로부터 유도된다. 분비 신호는, 특정 실시태양에 있어서, 단백질에 내재할 수 있다. 별도의 실시태양에 있어서, 분비 신호는 단백질에 내재하지 않는다.
예를 들면, 제공된 분비 시스템은 Sec 분비 신호, 예컨대 skp 단백질에 대한 분비 신호를 포함할 수 있다. 재조합 발현되는 단백질이 주변세포질 격실 또는 세포 밖 중 하나에 표적화된 실시태양에 있어서, 단백질의 천연 리더 서열은 관심 대상인 단백질에 작동가능하게 연결된 벡터 내에 포함될 수 있다.
다른 실시태양에 있어서, 상이한 단백질로부터 유도된 분비 신호 서열이 벡터 내에 포함될 수 있다. 놀랍게도, 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)가 Sec 분비 경로를 통해 적절하게 다양한 신호 서열을 가지는 단백질을 주변세포질로 표적화할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 신호 서열과 관심 대상인 단백질 또는 펩티드 사이에 추가의 변형이 제공되지 않는다. 그러나, 특정 실시태양에 있어서, 추가의 분열 신호가 혼입되어 펩티드의 아미노 말단의 적절한 처리를 촉진한다.
분비 시스템은 또한 이하에 기술되는 발효 배지를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, 시스템은 무기염 배지를 포함한다. 또다른 실시태양에 있어서, 시스템은 배지 중에 화학 유도 인자를 포함한다.
시스템은 또한 선택 프로모터일 수 있는 프로모터, 및 유도 인자를 포함할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 이 프로모터는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens)에 내재하지 않는 프로모터, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 프로모터이다. 특정 실시태양에 있어서, 이 프로모터는, 예를 들면, 유도 가능한 프로모터, 예컨대 lac 프로모터일 수 있다. 프로모터는 몇몇의 상이한 프로모터들(하나 이상은 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 유기체에 내재하지 않는다)의 혼성일 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 trc 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한, 예를 들면, tac 프로모터일 수 있다.
방법
하나의 실시태양에 있어서, Sec 분비 신호에 연결된 관심 대상의 융합 단백질을 발현하는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 숙주 세포를 포함하는 재조합 단백질의 개선된 제조 방법이 제공된다. 본 방법은 재조합 Sec 시스템 분비 신호 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 세포를 제공하는 단계, 및 단백질 또는 펩티드의 발현을 생성하는 조건하에서 세포를 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 벡터는 상기한 임의의 특성을 가질 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, Sec 분비 신호는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 게놈으로부터 유도된다. 또다른 실시태양에 있어서, Sec-분비 신호는 임의의 박테리아 게놈으로부터 유도된다. 하나의 실시태양에 있어서, 분비 신호는 박테리아 게놈으로부터 유도되고, 특정 실시태양에 있어서, 분비 신호는 이. 콜라이(E. coli) 게놈으로부터 유도된다. 분비 신호는, 특정 실시태양에 있어서, 단백질에 내재할 수 있다. 별도의 실시태양에 있어서, 분비 신호는 단백질에 내재하지 않는다.
별도의 실시태양에 있어서, 숙주 세포 내에서 관심 대상인 재조합 단백질 또는 펩티드에 작동가능하게 연결된 pbp, OprE, Lys-Arg-Orn 결합 단백질, 아주린, 철(III) 결합 단백질 또는 지단백질 B 분비 신호로 이루어진 군으로부터 선택된 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 신호의 발현을 포함하는, 임의의 숙주 세포 내에서 재조합 단백질을 제조하는 개선된 방법이 제공된다.
하나의 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 주변세포질이고 Sec-시스템 펩티드의 발현은 재조합 단백질을 세포의 주변세포질에 표적화한다. 하위 실시태양에 있어서, 발현은 세포 밖 단백질의 생성을 초래한다. 본 방법은 또한 재조합 단백질을 주변세포질로부터 또는 세포 밖 배지로부터 정제하는 단계를 포함할 수 있다. Sec-신호는 단백질에 연결되어 발현될 수 있고 신호-결합된 단백질은 세포로부터 정제될 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에 있어서, 이 단리된 펩티드는 분비 신호와 관심 대상인 단백질 또는 펩티드의 융합 단백질이다. 그러나, 분비 신호는 또한 단백질이 주변세포질에 표적화되는 경우 단백질로부터 분열될 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, Sec-시스템 분비 신호와 단백질 또는 펩티드 사이의 연결이 변형되어 분비 신호의 분열을 증가시킨다.
하나의 실시태양에 있어서, 본 방법은 숙주 세포의 주변세포질에 국한된 단백질을 제조할 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, 본 방법은 세포 내에서 적절하게 프로세싱된 재조합 단백질을 제조할 수 있다. 또다른 실시태양에 있어서, Sec-시스템 펩티드의 발현은 세포 내에서 활성 재조합 단백질을 제조할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 단백질이 Sec-분비 신호 없이 발현되는 경우와 비교하여 재조합 단백질의 증가된 수율을 초래할 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서, 본 방법은 주변세포질 격실 내에서 0.1 g/L 이상의 단백질을 제조한다. 또다른 실시태양에 있어서, 본 방법은 숙주 세포 내에서 0.1 내지 10 g/L의 주변세포질 단백질을 제조한다. 하위 실시태양에 있어서, 본 방법은 적어도 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 g/L의 주변세포질 단백질을 제조한다. 하나의 실시태양에 있어서, 제조된 전체 재조합 단백질은 1.0 g/L 이상이다. 일부 실시태양에 있어서, 제조된 주변세포질 단백질의 양은 제조된 전체 재조합 단백질의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상이다.
하나의 실시태양에 있어서, 본 방법은 0.1 g/L 이상의 정확하게 프로세싱된 단백질을 제조한다. 정확하게 프로세싱된 단백질은 천연 단백질의 아미노 말단을 가진다. 또다른 실시태양에 있어서, 본 방법은 숙주 세포 내에서 0.1 내지 10 g/L의 정확하게 프로세싱된 단백질을 제조한다. 하위 실시태양에 있어서, 본 방법은 적어도 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 g/L의 정확하게 프로세싱된 단백질을 제조한다. 하나의 실시태양에 있어서, 제조된 전체 정확하게 프로세싱된 재조합 단백질은 1.0 g/L 이상을 제조한다. 하위 실시태양에 있어서, 제조된 전체 정확하게 프로세싱된 단백질은 적어도 약 2.0, 3.0, 4.0, 5.O, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 15.0, 20.0 또는 50.0 g/L일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 제조된 정확하게 프로세싱된 단백질의 양은 정확하게 프로세싱된 형태의 전체 재조합 단백질의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상이다.
일부 실시태양에 있어서, 단백질은 또한 활성 형태로 제조될 수 있다. 용어 "활성"은 생물학적 기능 또는 생물학적 효과의 존재를 의미하며, 이때 생물학적 기능 또는 효과는 상대적이거나 또는 상응하는 천연 단백질 또는 펩티드의 생물학적 기능 또는 효과에 실질적으로 상응한다. 단백질의 관점에서, 이는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가, 표준 매개변수를 사용한 상응하는 천연 단백질 또는 펩티드와 비교하여, 적어도 약 20%, 약 50%, 바람직하게는 적어도 60 내지 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 90 내지 95%의 활성을 가지는 생물학적 기능 또는 효과를 포함한다는 것을 의미한다. 단백질 또는 펩티드 활성의 결정은 특정 단백질 또는 펩티드에 대한 상응하는 표준, 표적화된 상대적인 생물학적 분석을 사용하여 수행될 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드 생물학적 기능 또는 효과의 하나의 표시는 재조합 폴리펩티드가 면역학적으로 천연 폴리펩티드와 교차 반응성이라는 점이다.
또다른 실시태양에 있어서, 50% 이상의 발현된 트랜스제닉 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 제조된 그들의 단편이 재생가능한 형태로 숙주 세포 내에서 제조될 수 있다. 또다른 실시태양에 있어서, 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 발현된 단백질이 활성 형태로 수득되거나 또는 활성 형태로 재생될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 재조합 단백질의 증가된 수율을 초래할 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, 본 방법은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75%의 전체 세포 단백질(tcp)로 재조합 단백질을 제조한다. "퍼센트 전체 세포 단백질"은 숙주 세포 내에서 응집체 세포 단백질의 퍼센트로서의 단백질 또는 펩티드의 양이다. 퍼센트 전체 세포 단백질의 결정은 당업계에 공지되어 있다.
특정 실시태양에 있어서, 숙주 세포는, 무기염 배지 내에서 성장하는 경우(즉, 약 4℃ 내지 약 55℃의 범위의 온도 내), 1% 이상의 tcp 및 40 g/L 이상의 세포 밀도의 재조합 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 그들의 단편 발현 수준을 가질 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에 있어서, 발현 시스템은 10 리터 이상의 발효 스케일에서 무기염 배지 내에서 성장하는 경우(즉, 약 4℃ 내지 약 55℃의 범위의 온도 내), 1% 이상의 tcp 및 40 g/L 이상의 세포 밀도의 펩티드 발현 수준의 재조합 단백질을 가질 것이다.
숙주 세포
하나의 실시태양에 있어서, 본 발명은 Sec-타입 분비 신호를 포함하는 재조합 단백질의 발현을 위한 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 발현 시스템을 제공한다. 본 발명의 이 태양은 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) Sec 분비 시스템이 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 및 비-슈도모나스 플루오레센스(non-P. fluorescens) Sec 신호 시스템 모두로부터의 분비 신호를 적절하게 처리하고 표적화할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다.
이 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 18(Gram-negative Proteobacteria Subgroup 18)"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 18"은, 예를 들면, 다음의 것들(예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호를 괄호 안에 나타냄): 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 생물형 A, 또한 생물변이형(biovar) 1 또는 생물변이형 I로도 불림(ATCC 13525); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 생물형 B, 또한 생물변이형 2 또는 생물변이형 II로도 불림(ATCC 17816); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 생물형 C, 또한 생물변이형 3 또는 생물변이형 III으로도 불림(ATCC 17400); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 생물형 F, 또한 생물변이형 4 또는 생물변이형 IV로도 불림(ATCC 12983); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 생물형 G, 또한 생물변이형 5 또는 생물변이형 V로도 불림(ATCC 17518); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 생물변이형 VI; 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Pf0-1; 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Pf-5(ATCC BAA-477); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) SBW25; 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 하위종 셀룰로사(NCIMB 10462)를 포함하는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)종의 모든 하위종, 변종, 균주, 및 다른 하위-특수 단위의 그룹으로 정의된다.
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 19"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 19"는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 생물형 A의 균주들의 그룹으로 정의된다. 이 생물형의 특히 바람직한 균주는 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 MB101(미국 특허 제5,169,760호(윌콕스)를 참조), 및 그의 유도체이다. 그의 바람직한 유도체의 예는 MB101 염색체 asd(아스파르테이트 탈수소효소 유전자) 좌위에 천연 E. coli PlacI-lacI-lacZYA 제작물(즉, PlacZ는 결손됨)을 삽입하여 구축된 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 MB214이다.
본 발명에 사용될 수 있는 부가적인 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 균주는 다음의 ATTC 지정을 가지는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 미굴라(Migula) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 로이토키토크(Loitokitok)를 포함한다: [NCIB 8286]; NRRL B-1244; NCB 8865 균주 CO1; NCIB 8866 균주 CO2; 1291 [ATCC 17458; IFO 15837; NCIB 8917; LA; NRRL B-1864; 피롤리딘; PW2 [ICMP 3966; NCPPB 967; NRRL B-899]; 13475; NCTC 10038; NRRL B-1603 [6; IFO 15840]; 52-1C; CCEB 488-A [BU 140]; CCEB 553 [IEM 15/47]; IAM 1008 [AHH-27]; IAM 1055 [AHH-23]; 1 [IFO 15842]; 12 [ATCC 25323; NIH 11; 덴 두렌 데 용(den Dooren de Jong) 216]; 18 [IFO 15833; WRRL P-7]; 93 [TR-1O]; 108 [52-22; IFO 15832]; 143 [IFO 15836; PL]; 149 [2-40-40; IFO 15838]; 182 [IFO 3081; PJ 73]; 184 [IFO 15830]; 185 [W2 L-1]; 186 [IFO 15829; PJ 79]; 187 [NCPPB 263]; 188 [NCPPB 316]; 189 [PJ227; 1208]; 191 [IFO 15834; PJ 236; 22/1]; 194 [클링게(Klinge) R-60; PJ 253]; 196 [PJ 288]; 197 [PJ 290]; 198 [PJ 302]; 201 [PJ 368]; 202 [PJ 372]; 203 [PJ 376]; 204 [IFO 15835; PJ 682]; 205 [PJ 686]; 206 [PJ 692]; 207 [PJ 693]; 208 [PJ 722]; 212 [PJ 832]; 215 [PJ 849]; 216 [PJ 885]; 267 [B-9]; 271 [B-1612]; 401 [C71A; IFO 15831; PJ 187]; NRRL B-3178 [4; IFO 15841]; KY 8521; 3081; 30-21; [IFO 3081]; N; PYR; PW; D946-B83 [BU 2183; FERM-P 3328]; P-2563 [FERM-P 2894; IFO 13658]; IAM-1126 [43F]; M-I; A506 [A5-06]; A505 [A5-O5-1]; A526 [A5-26]; B69; 72; NRRL B-4290; PMW6 [NCIB 11615]; SC 12936; A1 [IFO 15839]; F 1847 [CDC-EB]; F 1848 [CDC 93]; NCIB 10586; P17; F-12; AmMS 257; PRA25; 6133D02; 6519E01; N1; SC15208; BNL-WVC; NCTC 2583 [NCIB 8194]; H13; 1013 [ATCC 11251; CCEB 295]; IFO 3903; 1062; 또는 Pf-5.
또다른 실시태양에 있어서, 본 방법은 포스페이트 결합 단백질(pbp) 분비 신호, 외막 포린(porin) E(OprE) 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로부터 선택된 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) Sec-시스템 분비 펩티드를 가지는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 이 방법은 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) Sec 분비 신호가 분비된 단백질을 프로세싱하는 능력이 세포가 분비된 단백질을 제조하기에 이상적으로 적합하다는 점을 나타낸다는 아이디어에 기초한다. 따라서, 이들 세포들로부터 유도된 신호전달 시스템은 복합 발현 시스템 내에서의 이런 유형의 분비에 대해 이상적인 신호전달 시스템일 수 있다. 따라서, 확인된 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) Sec 시스템 분비 신호를 사용한 단백질 또는 펩티드의 발현 방법이 진핵 또는 원핵 기원 중 하나를 포함하는 임의의 주어진 숙주 시스템에 사용될 수 있다.
이 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 상기 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 세포를 포함하는, 재조합 단백질 또는 펩티드를 제조할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드를 제조하기 위해 가장 통상적으로 사용되는 시스템은 특정 박테리아 세포, 특히, E. coli를 포함하는데, 이는 그 상대적으로 저비용인 성장 요건 및 단백질을 큰 배치 배양 내에서 생성할 수 있는 잠재적인 능력 때문이다. 이스트(yeast)가 또한 생물학적으로 관련된 단백질 및 펩티드를 발현하기 위해, 특히 연구 목적을 위해 사용된다. 시스템은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 이들 시스템들은 양호하게 특성이 부여되어 있고, 일반적으로 허용 가능한 수준의 전체 단백질 발현을 제공하며 상대적으로 빠르고 저비용이다. 곤충 세포 발현 시스템이 또한 생물학적으로 활성인 형태의 재조합 단백질을 발현하기 위한 대안으로 밝혀졌다. 일부 경우에 있어서, 번역 후에 변형된 정확하게 폴딩된 단백질이 제조될 수 있다. 포유류 세포 발현 시스템, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포가 또한 재조합 단백질의 발현을 위해 사용되었다. 작은 규모인 경우, 이들 발현 시스템들은 종종 효과적이다. 특정 생물제제가, 특히 동물 또는 인간 건강 적용에서 단백질로부터 유도될 수 있다. 또다른 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 담배 세포, 옥수수, 아라비돕시스(Arabidopsis)종으로부터의 세포, 감자 또는 쌀 세포를 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아닌 식물 세포이다. 또다른 실시태양에 있어서, 트랜스제닉 유기체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 다세포 유기체가 본 방법에서 분석되거나 변형된다. 다세포 유기체를 분석하고(하거나) 변형시키는 기술은 일반적으로 이하에 기술된 세포를 변형시키기 위해 기술된 기술에 기초한다.
하나의 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 에셔리키아(Escherichia) 또는 슈도모나스(Pseudomonas)종을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 박테리아 세포일 수 있다. 전형적인 박테리아 세포는, 예를 들면, URL: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_2.html에서 미국 아리조나의 에스트렐라 마운틴 커뮤니티(Estrella Mountain Community) 대학의 엠제이 파라비(MJ Farabee) 박사에 의해 제공된 온라인 생물학 저서의 챕터인 "생물학적 다양성: 박테리아 및 아르키언(Biological Diversity: Bacteria and Archaeans)"에 기술된다. 특정 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 슈도모나드(Pseudomonad) 세포일 수 있고, 전형적으로 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 세포일 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 또한 E. coli 세포일 수 있다. 또다른 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 스포돕테라(Spodoptera), 트리코플루시아(Trichoplusia), 드로소필라(Drosophila) 또는 에스티그멘(Estigmene)종을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아닌 곤충 세포, 또는 뮤린(murine) 세포, 햄스터 세포, 원숭이, 영장류 또는 인간 세포를 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아닌 포유류 세포일 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 임의의 박테리아 분류군의 구성원일 수 있다. 세포는, 예를 들면, 진정생물의 임의의 종의 구성원일 수 있다. 숙주는 분류군: 애시드박테리아(Acidobacteria), 액티노박테리아(Actinobacteira), 애퀴피케(Aquificae), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 클로로비(Chlorobi), 클라미디에(Chlamydiae), 코로플렉시(Choroflexi), 크리시오제네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 데이노코커스(Deinococcus), 딕티요글로미(Dictyoglomi), 피브로박테레스(Fibrobacteres), 피르미쿠테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 겜마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 렌티스페레(Lentisphaerae), 니트로스피레(Nitrospirae), 플랑크토미세테스(Planctomycetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로케테스(Spirochaetes), 써모데술포박테리아(Thermodesulfobacteria), 써모미크로비아(Thermomicrobia), 써모토게(Thermotogae), 써머스(Thermus)(써말레스(Theamales)), 또는 베루코미크로비아(Verrucomicrobia) 중 임의의 하나의 구성원일 수 있다. 진정생물 숙주 세포의 실시태양에 있어서, 세포는 시아노박테리아(Cyanobacteria)를 제외한 진정생물의 임의의 종의 구성원일 수 있다.
박테리아 숙주는 또한 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 임의의 종의 구성원일 수 있다. 프로테오박테리아(Proteobacteria) 숙주 세포는 분류군 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria), 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria), 또는 입실론프로테오박테리아(Epsilonproteobacteria) 중 임의의 하나의 구성원일 수 있다. 또한, 숙주는 분류군 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 또는 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) 중 임의의 하나의 구성원, 및 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria)의 임의의 종의 구성원일 수 있다.
감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) 숙주의 하나의 실시태양에 있어서, 숙주는 분류군 에어로모나달레스(Aeromonadales), 알테로모나달레스(Alteromonadales), 엔테로박테리알레스(Enterobacteriales), 슈도모나달레스(Pseudomonadales), 또는 크산토모나달레스(Xanthomonadales) 중 임의의 하나의 구성원; 또는 엔테로박테리알레스(Enterobacteriales) 또는 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 중 임의의 종의 구성원일 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 엔테로박테리알레스(Enterobacteriales)목일 수 있거나, 숙주 세포는 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae)과의 구성원일 것이거나, 또는 얼비니아(Erwinia)속, 에셔리키아(Escherichia)속, 또는 세라티아(Serratia)속 중 임의의 하나의 구성원; 또는 에셔리키아(Escherichia)속의 구성원일 것이다. 슈도모나달레스(Pseudomonadales)목의 숙주 세포의 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 슈도모나다세(Pseudomonadaceae)과의 구성원, 심지어는 슈도모나스(Pseudomonas)속의 구성원일 것이다. 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacterial) 숙주는 E. coli 종의 구성원 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)종의 구성원을 포함한다.
다른 슈도모나스(Pseudomonas) 유기체가 또한 유용할 수 있다. 문헌[R.E. Buchanan 및 N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD, USA)](이하, "베르지(Bergey)(1974)")에 의해 "그람-음성 호기성 간균 및 구균"으로 기술된 과 및(또는) 속에 속하는 프로테오박테리아의 그룹을 포함하는 슈도모나드(Pseudomonad) 및 매우 관련된 종들은 그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1을 포함한다. 표 4는 이들 유기체들의 과 및 속을 나타낸다.
"그람-음성 호기성 간균 및 구균"(베르지(1974)) 부분에 열거된 과 및 속
과 I. 슈도모나다세(Pseudomonadaceae) 글루코노박터(Gluconobacter) 슈도모나스(Pseudomonas) 크산토모나스(Xanthomonas) 주글로에(Zoogloea)
과 II. 아조토박테라세(Azotobacteraceae) 아조모나스(Azomonas) 아조토박터(Azotobacter) 베이저링키아(Beijerinckia) 데르시아(Derxia)
과 III. 리조비아세(Rhizobiaceae) 아그로박테리아(Agrobacterium) 리조비움(Rhizobium)
과 IV. 메틸로모나다세(Methylomonadaceae) 메틸로코커스(Methylococcus) 메틸로모나스(Methylomonas)
과 V. 할로박테리아세(Halobacteriaceae) 할로박테리아(Halobacterium) 할로코커스(Halococcus)
다른 속 아세토박터(Acetobacter) 알칼리제네스(Alcaligenes ) 보르데텔라(Bordetella) 브루셀라(Brucella) 프란시셀라(Francisella) 써머스(Thermus)
"그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1"이 또한 분류에 사용된 기준에 따라 이 제목으로 분류되는 프로테오박테리아를 포함한다. 상기 제목은 또한 앞서 이 섹션으로 분류되었지만 더 이상은 아닌 그룹, 예컨대 애시도보락스(Acidovorax)속, 브레분디모나스(Brevundimonas)속, 부르크홀데리아(Burkholderia)속, 히드로게노파가(Hydrogenophaga)속, 오세아니모나스(Oceanimonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)속; 크산토모나스(Xanthomonas)속에 속하는 유기체(이전에는 크산토모나스(Xanthomonas)종이라 불림)를 재분류하여 생성된 스핑고모나스(Sphingomonas)속 (및 그들로부터 유도된 블라스토모나스(Blastomonas)); 베르지(1974)에 정의된 아세토박터(Acetobacter)에 속하는 유기체를 재분류하여 생성된 애시도모나스(Acidomonas)속을 포함한다. 또한, 숙주는 슈도모나스(Pseudomonas)속, 즉, 슈도모나스 에날리아(Pseudomonas enalia)(ATCC 14393)속, 슈도모나스 니그리파시엔스(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)속, 및 슈도모나스 푸트레파시엔스(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)속(각각 알터로모나스 할로플랑크티스(Alteromonas haloplanktis), 알터로모나스 니그리파시엔스(Alteromonas nigrifaciens) 및 알터로모나스 푸트레파시엔스(Alteromonas putrefaciens)로 재분류되었다)으로부터의 세포를 포함할 수 있다. 유사하게, 예를 들면, 슈도모나스 애시도보란스(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668) 및 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)은 각각 코마모나스 애시도보란스(Comamonas acidovorans) 및 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)로 재분류되었고; 슈도모나스 니그리파시엔스(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375) 및 슈도모나스 피시시다(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)은 각각 슈도알터로모나스 니그리파시엔스(Pseudoalteromonas nigrifaciens) 및 슈도알터로모나스 피시시다(Pseudoalteromonas piscicida)로 재분류되었다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1"은 또한 슈도모나다세(Pseudomonadaceae)과, 아조토박테라세(Azotobacteraceae)과(현재 슈도모나다세(Pseudomonadaceae)의 "아조토박터(Azotobacter) 그룹"이라는 동의어로 종종 불림), 리조비아세(Rhizobiaceae)과, 및 메틸로모나다세(Methylomonadaceae)과(현재 "메틸로코카세(Methylococcaceae)"로 종종 불림)를 포함한다. 따라서, 본원에 다르게 기술된 그 속들 이외에, "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 1"에 속하는 추가의 프로테오박테리아 속은: 1) 아조리조필러스(Azorhizophilus)속의 아조토박터(Azotobacter) 그룹 박테리아; 2) 셀비브리오(Cellvibrio)속, 올리겔라(Oligella)속, 및 테레디니박터(Teredinibacter)속의 슈도모나다세(Pseudomonadaceae)과 박테리아; 3) 첼라토박터(Chelatobacter)속, 엔시퍼(Ensifer)속, 리버리박터(Liberibacter)(또한 "칸디다터스 리버리박터(Candidatus Liberibacter)"라 불림)속, 및 시노리조비움(Sinorhizobium)속의 리조비아세(Rhizobiaceae)과 박테리아; 및 4) 메틸로박터(Methylobacter)속, 메틸로칼덤(Methylocaldum)속, 메틸로미크로비움(Methylomicrobium)속, 메틸로사르시나(Methylosarcina)속, 및 메틸로스페라(Methylosphaera)속의 메틸로코카세(Methylococcaceae)과 박테리아를 포함한다.
또다른 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 2"로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 2"는 다음의 속들(카탈로그-열거된, 공중 이용가능한, 기탁된 균주의 총 수가 괄호 안에 지시되고, 달리 지시하지 않으면 모두 ATCC에 기탁됨)의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 애시도모나스(Acidomonas)(2); 아세토박터(Acetobacter)(93); 글루코노박터(Gluconobacter)(37); 브레분디모나스(Brevundimonas)(23); 베이저링키아(Beijerinckia)(13); 데르시아(Derxia)(2); 브루셀라(Brucella)(4); 아그로박테리아(Agrobacterium)(79); 첼라토박터(Chelatobacter)(2); 엔시퍼(Ensifer)(3); 리조비움(Rhizobium)(144); 시노리조비움(Sinorhizobium)(24); 블라스토모나스(Blastomonas)(1); 스핑고모나스(Sphingomonas)(27); 알칼리제네스(Alcaligenes)(88); 보르데텔라(Bordetella)(43); 부르크홀데리아(Burkholderia)(73); 랄스토니아(Ralstonia)(33); 애시드보락스(Acidovorax)(20); 히드로게노파가(Hydrogenophaga)(9); 주글로에(Zoogloea)(9); 메틸로박터(Methylobacter)(2); 메틸로칼덤(Methylocaldum)(1, NCIMB); 메틸로코커스(Methylococcus)(2); 메틸로미크로비움(Methylomicrobium)(2); 메틸로모나스(Methylomonas)(9); 메틸로사르시나(Methylosarcina)(1); 메틸로스페라(Methylosphaera); 아조모나스(Azomonas)(9); 아조리조필러스(Azorhizophilus)(5); 아조토박터(Azotobacter)(64); 셀비브리오(Cellvibrio)(3); 올리겔라(Oligella)(5); 슈도모나스(Pseudomonas)(1139); 프란시셀라(Francisella)(4); 크산토모나스(Xanthomonas)(229); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)(50); 및 오세아니모나스(Oceanimonas)(4).
"그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 2"의 예시적인 숙주 세포 종은 다음의 박테리아(그 예시적인 균주(들)의 ATCC 또는 다른 기탁 번호를 괄호 안에 나타냄)를 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아니다: 애시도모나스 메탄올리카(Acidomonas methanolica)(ATCC 43581); 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti)(ATCC 15973); 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)(ATCC 19357); 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta)(ATCC 11568); 베이저링키아 인디카(Beijerinckia indica)(ATCC 9039 및 ATCC 19361); 데르시아 굼모사(Derxia gummosa)(ATCC 15994); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis)(ATCC 23456), 브루셀라 아보르터스(Brucella abortus)(ATCC 23448); 아그로박테리아 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(ATCC 23308), 아그로박테리아 라디오박터(Agrobacterium radiobacter)(ATCC 19358), 아그로박테리아 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)(ATCC 11325); 첼라토박터 헤인치(Chelatobacter heintzii)(ATCC 29600); 엔시퍼 아드헤렌스(Ensifer adhaerens)(ATCC 33212); 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum)(ATCC 10004); 시노리조비움 프레디(Sinorhizobium fredii)(ATCC 35423); 블라스토모나스 나타토리아(Blastomonas natatoria)(ATCC 35951); 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis)(ATCC 29837); 알칼리제네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750); 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)(ATCC 9797); 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)(ATCC 25416); 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)(ATCC 27511); 애시도보락스 파실리스(Acidovorax facilis)(ATCC 11228); 히드로게노파가 플라바(Hydrogenophaga flava)(ATCC 33667); 주글로에 라미게라(Zoogloea ramigera)(ATCC 19544); 메틸로박터 루테우스(Methylobacter luteus)(ATCC 49878); 메틸로칼덤 그라실레(Methylocaldum gracile)(NCIMB 11912); 메실로코커스 캅술라터스(Methylococcus capsulatus)(ATCC 19069); 메틸로미크로비움 아길레(Methylomicrobium agile)(ATCC 35068); 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica)(ATCC 35067); 메틸로사르시나 피브라타(Methylosarcina fibrata)(ATCC 700909); 메틸로스페라 한소니(Methylosphaera hansonii)(ACAM 549); 아조모나스 아길리스(Azomonas agilis)(ATCC 7494); 아조리조필러스 파스팔리(Azorhizophilus paspali)(ATCC 23833); 아조토박터 크로코컴(Azotobacter chroococcum)(ATCC 9043); 셀비브리오 믹스터스(Cellvibrio mixtus)(UQM 2601); 올리겔라 우레트랄리스(Oligella urethralis)(ATCC 17960); 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858); 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(ATCC 6223); 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637); 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)(ATCC 33913); 및 오세아니모나스 도우도로피(Oceanimonas doudoroffii)(ATCC 27123).
또다른 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 3"으로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 3"은 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스(Brevundimonas); 아그로박테리아(Agrobacterium); 시노리조비움(Sinorhizobium); 블라스토모나스(Blastomonas); 스핑고모나스(Sphingomonas); 알칼리제네스(Alcaligenes); 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 애시드보락스(Acidovorax); 히드로게노파가(Hydrogenophaga); 메틸로박터(Methylobacter); 메틸로칼덤(Methylocaldum); 메틸로코커스(Methylococcus); 메틸로미크로비움(Methylomicrobium); 메틸로모나스(Methylomonas); 메틸로사르시나(Methylosarcina); 메틸로스페라(Methylosphaera); 아조모나스(Azomonas); 아조리조필러스(Azorhizophilus); 아조토박터(Azotobacter); 셀비브리오(Cellvibrio); 올리겔라(Oligella); 슈도모나스(Pseudomonas); 테레디니박터(Teredinibacter); 프란시셀라(Francisella); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 크산토모나스(Xanthomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
또다른 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 4"로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 4"는 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스(Brevundimonas); 블라스토모나스(Blastomonas); 스핑고모나스(Sphingomonas); 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 애시드보락스(Acidovorax); 히드로게노파가(Hydrogenophaga); 메틸로박터(Methylobacter); 메틸로칼덤(Methylocaldum); 메틸로코커스(Methylococcus); 메틸로미크로비움(Methylomicrobium); 메틸로모나스(Methylomonas); 메틸로사르시나(Methylosarcina); 메틸로스페라(Methylosphaera); 아조모나스(Azomonas); 아조리조필러스(Azorhizophilus); 아조토박터(Azotobacter); 셀비브리오(Cellvibrio); 올리겔라(Oligella); 슈도모나스(Pseudomonas); 테레디니박터(Teredinibacter); 프란시셀라(Francisella); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 크산토모나스(Xanthomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
하나의 실시태양에 있어서, 숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 5"로부터 선택된다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 5"는 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 메틸로박터(Methylobacter); 메틸로칼덤(Methylocaldum); 메틸로코커스(Methylococcus); 메틸로미크로비움(Methylomicrobium); 메틸로모나스(Methylomonas); 메틸로사르시나(Methylosarcina); 메틸로스페라(Methylosphaera); 아조모나스(Azomonas); 아조리조필러스(Azorhizophilus); 아조토박터(Azotobacter); 셀비브리오(Cellvibrio); 올리겔라(Oligella); 슈도모나스(Pseudomonas); 테레디니박터(Teredinibacter); 프란시셀라(Francisella); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 크산토모나스(Xanthomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 6"으로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 6"은 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스(Brevundimonas); 블라스토모나스(Blastomonas); 스핑고모나스(Sphingomonas); 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 애시드보락스(Acidovorax); 히드로게노파가(Hydrogenophaga); 아조모나스(Azomonas); 아조리조필러스(Azorhizophilus); 아조토박터(Azotobacter); 셀비브리오(Cellvibrio); 올리겔라(Oligella); 슈도모나스(Pseudomonas); 테레디니박터(Teredinibacter); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 크산토모나스(Xanthomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 7"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 7"은 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 아조모나스(Azomonas); 아조리조필러스(Azorhizophilus); 아조토박터(Azotobacter); 셀비브리오(Cellvibrio); 올리겔라(Oligella); 슈도모나스(Pseudomonas); 테레디니박터(Teredinibacter); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 크산토모나스(Xanthomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 8"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 8"은 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스(Brevundimonas); 블라스토모나스(Blastomonas); 스핑고모나스(Sphingomonas); 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 애시드보락스(Acidovorax); 히드로게노파가(Hydrogenophaga); 슈도모나스(Pseudomonas); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 크산토모나스(Xanthomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 9"로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 9"는 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 브레분디모나스(Brevundimonas); 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 애시드보락스(Acidovorax); 히드로게노파가(Hydrogenophaga); 슈도모나스(Pseudomonas); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
숙주 세포는 "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 10"으로부터 선택될 수 있다. "그람-음성 프로테오박테리아 하위 그룹 10"은 다음의 속들의 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 슈도모나스(Pseudomonas); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 및 오세아니모나스(Oceanimonas).
숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 11"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 11"은 슈도모나스(Pseudomonas); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas); 및 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다. 숙주세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 12"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 12"는 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다. 숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 13"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 13"은 부르크홀데리아(Burkholderia); 랄스토니아(Ralstonia); 슈도모나스(Pseudomonas); 및 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다. 숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 14"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 14"는 슈도모나스(Pseudomonas) 및 잔토모나스(Xantomonas) 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다. 숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 15"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 15"는 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 프로테오박테리아 군으로 정의된다.
숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 16"으로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 16"은 하기 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예시 균주의 ATCC 또는 다른 기탁 번호를 괄호에 표시함)의 프로테오박테리아 군으로 정의된다: 슈도모나스 아비에타니필라(Pseudomonas abietaniphila) (ATCC 700689); 슈도모나스 아에루지노사(Peudomonas aeruginosa) (ATCC 10145); 슈도모나스 알칼리제네스(Peudomonas alcaligenes) (ATCC 14909); 슈도모나스 앵귈리셉티카(Pseudomonas anguilliseptica) (ATCC 33660); 슈도모나스 시트로넬로리스(Pseudomonas citronellolis) (ATCC 13674); 슈도모나스 플라베센스(Pseudomonas flavescens) (ATCC 51555); 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina) (ATCC 25411); 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas nitroreducens) (ATCC 33634); 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans) (ATCC 8062); 슈도모나스 슈도알칼리제네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes) (ATCC 17440); 슈도모나스 레시노보란스(Pseudomonas resinovorans) (ATCC 14235); 슈도모나스 스트라미네아(Pseudomonas straminea) (ATCC 33636); 슈도모나스 아가리치(Pseudomonas agarici) (ATCC 25941); 슈도모나스 알칼리필라(Pseudomonas alcaliphila); 슈도모나스 알기노보라(Pseudomonas alginovora); 슈도모나스 안데르소니(Pseudomonas andersonii); 슈도모나스 아스플레니(Pseudomonas asplenii) (ATCC 23835); 슈도모나스 아젤라이카(Pseudomonas azelaica) (ATCC 27162); 슈도모나스 베이제링키(Pseudomonas beijerinckii) (ATCC 19372); 슈도모나스 보레알리스(Pseudomonas borealis); 슈도모나스 보레오폴리스(Pseudomonas boreopolis) (ATCC 33662); 슈도모나스 브라시카세아럼(Pseudomonas brassicacearum); 슈도모나스 부타노보라(Pseudomonas butanovora) (ATCC 43655); 슈도모나스 셀룰로사(Pseudomonas cellulosa) (ATCC 55703); 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca) (ATCC 33663); 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis) (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 17418, ATCC 17461); 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi) (ATCC 4973); 슈도모나스 룬덴시스(Pseudomonas lundensis) (ATCC 49968); 슈도모나스 타에트롤렌스(Pseudomonas taetrolens) (ATCC 4683); 슈도모나스 시스시콜라(Pseudomonas cissicola) (ATCC 33616); 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens); 슈도모나스 디테르페니필라(Pseudomonas diterpeniphila); 슈도모나스 에롱가타(Pseudomonas elongata) (ATCC 10144); 슈도모나스 플렉텐스(Pseudomonas flectens) (ATCC 12775); 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans); 슈도모나스 브렌네리(Pseudomonas brenneri); 슈도모나스 체드렐라(Pseudomonas cedrella); 슈도모나스 코르루가타(Pseudomonas corrugata) (ATCC 29736); 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) (ATCC 35858); 슈도모나스 게스사르디(Pseudomonas gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis); 슈도모나스 만델리(Pseudomonas mandelii) (ATCC 700871); 슈도모나스 마르지날리스(Pseudomonas marginalis) (ATCC 10844); 슈도모나스 미굴라에(Pseudomonas migulae); 슈도모나스 뮤시돌렌스(Pseudomonas mucidolens) (ATCC 4685); 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis); 슈도모나스 로데시애(Pseudomonas rhodesiae); 슈도모나스 신산타(Pseudomonas synxantha) (ATCC 9890); 슈도모나스 톨라아시(Pseudomonas tolaasii) (ATCC 33618); 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii) (ATCC 700474); 슈도모나스 프레데릭스베르젠시스(Pseudomonas frederiksbergensis); 슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) (ATCC 19374); 슈도모나스 진제리(Pseudomonas gingeri); 슈도모나스 그라미니스( Pseudomonas graminis); 슈도모나스 그리몬티(Pseudomonas grimontii); 슈도모나스 할로데니트리피칸스(Pseudomonas halodenitrificans); 슈도모나스 할로필라(Pseudomonas halophila); 슈도모나스 히비스키콜라(Pseudomonas hibiscicola) (ATCC 19867); 슈도모나스 후티엔시스(Pseudomonas huttiensis) (ATCC 14670); 슈도모나스 히드로제노보라(Pseudomonas hydrogenovora); 슈도모나스 제세니( Pseudomonas jessenii) (ATCC 700870); 슈도모나스 킬로넨시스(Pseudomonas kilonensis); 슈도모나스 란체올라타(Pseudomonas lanceolata) (ATCC 14669); 슈도모나스 리니(Pseudomonas lini); 슈도모나스 마르지나타(Pseudomonas marginata) (ATCC 25417); 슈도모나스 메피티카(Pseudomonas mephitica) (ATCC 33665); 슈도모나스 데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans) (ATCC 19244); 슈도모나스 페르투치노제나(Pseudomonas pertucinogena) (ATCC 190); 슈도모나스 피크토룸(Pseudomonas pictorum) (ATCC 23328); 슈도모나스 사이크로필라(Pseudomonas psychrophila); 슈도모나스 풀바(Pseudomonas fulva) (ATCC 31418); 슈도모나스 몬테일리(Pseudomonas monteilii) (ATCC 700476); 슈도모나스 모셀리(Pseudomonas mosselii); 슈도모나스 오리지하비탄스(Pseudomonas oryzihabitans) (ATCC 43272); 슈도모나스 플레코글로시치다(Pseudomonas plecoglossicida) (ATCC 700383); 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) (ATCC 12633); 슈도모나스 리악탄스(Pseudomonas reactans); 슈도모나스 스피노사(Pseudomonas spinosa) (ATCC 14606); 슈도모나스 발레아리카(Pseudomonas balearica); 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola) (ATCC 43273); 슈도모나스 스투트체리(Pseudomonas stutzeri) (ATCC 17588); 슈도모나스 아미그달리(Pseudomonas amygdali) (ATCC 33614); 슈도모나스 아벨라네(Pseudomonas avellanae) (ATCC 700331); 슈도모나스 카리카파파예(Pseudomonas caricapapayae) (ATCC 33615); 슈도모나스 시초리( Pseudomonas cichorii) (ATCC 10857); 슈도모나스 피쿠세렉테(Pseudomonas ficuserectae) (ATCC 35104); 슈도모나스 푸르고바지나에(Pseudomonas fuscovaginae); 슈도모나스 멜리에(Pseudomonas meliae) (ATCC 33050); 슈도모나스 실링게(Pseudomonas syringae) (ATCC 19310); 슈도모나스 비리디플라바(Pseudomonas viridiflava) (ATCC 13223); 슈도모나스 테르모카록시도보란스(Pseudomonas thermocarhoxydovorans) (ATCC 35961); 슈도모나스 테르모톨레란스(Pseudomonas thermotolerans); 슈도모나스 티베르발렌시스(Pseudomonas thivervalensis); 슈도모나스 반코우베렌시스(Pseudomonas vancouverensis) (ATCC 700688); 슈도모나스 위스콘시넨시스(Pseudomonas wisconsinensis); 및 슈도모나스 시아메넨시스(Pseudomonas xiamenensis).
숙주 세포는 "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 17"로부터 선택될 수 있다. "그람 음성 프로테오박테리아 하위 그룹 17"은 하기 슈도모나스 종을 포함하는 당업계에 "형광성 슈도모나스"로 알려진 프로테오박테리아의 군으로 정의된다: 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans); 슈도모나스 브렌네리(Pseudomonas brenneri); 슈도모나스 세드렐라(Pseudomonas cedrella); 슈도모나스 코루가타(Pseudomonas corrugata); 슈도모나스 엑스트레모리엔탈리스(Pseudomonas extremorientalis); 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens); 슈도모나스 게사르디(Pseudomonas gessardii); 슈도모나스 리바넨시스(Pseudomonas libanensis); 슈도모나스 만델리(Pseudomonas mandelii); 슈도모나스 마르지날리스(Pseudomonas marginalis); 슈도모나스 미굴레(Pseudomonas migulae); 슈도모나스 무치돌렌스(Pseudomonas mucidolens); 슈도모나스 오리엔탈리스(Pseudomonas orientalis); 슈도모나스 로데시에(Pseudomonas rhodesiae); 슈도모나스 신산타(Pseudomonas synxantha); 슈도모나스 톨라아시(Pseudomonas tolaasii); 및 슈도모나스 베로니(Pseudomonas veronii).
다른 적절한 숙주는 그람 (+) 프로테오박테리아와 같이 참고자료의 다른 부분에 분류된 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 이. 콜라이이다. 이. 콜라이의 게놈 서열은 이. 콜라이 MG1655에 대해 밝혀졌고[Blattner, et al. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science 277(5331): 1453-74], 이. 콜라이 K12에 대한 DNA 마이크로어레이가 상업적으로 이용가능하다(MWG 인크., 하이포인트, NC). 이. 콜라이는 루리아-베르타니(LB) (10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ NaCl, 5 g/ℓ 효모 추출물)와 같은 영양 배지 또는 1% 글루코스와 같이 적절한 탄소 공급원를 가지는 M9 (6 g/ℓ Na2HPO4, 3 g/ℓ KH2PO4, 1 g/ℓ NH4Cl, 0.5 g/ℓ NaCl, pH 7.4)와 같은 한정 최소 배지에서 배양될 수 있다. 통상적으로, 이. 콜라이 세포의 밤샘 배양액을 희석하여 진동 플라스크 또는 발효기 중의 신선한 영양 또는 최소 배지에 접종하여 37 ℃에서 키운다.
숙주는 인간 또는 비인간 포유동물을 포함하는 포유류로부터 얻은 세포와 같이 포유류 기원일 수 있다. 포유류는 영장류, 원숭이, 돼지(porcine), 양, 소, 설치류, 유제류, 돼지(pig), 돼지(swine), 면양(sheep), 양(lamb), 염소, 소(cattle), 사슴, 노새, 말, 원숭이, 영장류(apes), 개, 고양이, 래트, 및 쥐를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
숙주 세포는 또한 식물 기원일 수도 있다. 유전자 및 조절 서열의 확인을 위해 어떠한 식물도 선택될 수 있다. 유전자 및 조절 서열의 단리를 위한 적절한 식물 표적의 예는 알파파, 사과, 살구, 애기장대, 아티초크, 아루굴라, 아스파라거스, 아보카도, 바나나, 보리, 콩, 비트, 블랙베리, 블루베리, 브로콜리, 방울양배추, 양배추, 카놀라, 칸탈로프, 당근, 카사바, 피마자, 꽃양배추, 셀러리, 체리, 치커리, 고수, 감귤류, 클레멘타인, 토끼풀, 코코넛, 커피, 옥수수, 목화, 크랜베리, 오이, 미송, 가지, 꽃상추, 에스캐롤(escarole), 유칼리나무, 회향, 무화과, 마늘, 호리병박, 포도, 그레이프프루트, 감로멜론, 지카마(jicama), 키위, 양상추, 부추, 레몬, 라임, 테다소나무, 아마인, 망고, 멜론, 버섯, 승도 복숭아, 견과류, 귀리, 기름야자나무, 유채, 오크라, 올리브, 양파, 오렌지, 장식용 식물, 야자, 파파야, 파슬리, 파스닙, 완두콩, 복숭아, 땅콩, 배, 후추, 감, 소나무, 파인애플, 질경이, 서양자두, 석류, 포플러, 감자, 호박, 모과, 라디아타 소나무, 래디스치오(radiscchio), 무, 평지씨, 나무딸기, 쌀, 호밀, 사탕수수(sorghum), 남부소나무, 대두, 시금치, 호박(squash), 딸기, 사탕무, 사탕수수(sugar cane), 해바라기, 고구마, 소합향, 탄제린, 찻잎, 담배, 토마토, 라이밀, 잔디, 순무, 포도나무, 수박, 밀, 얌 및 주키니를 포함하나 이에 제한되지 않을 것이다. 어떤 실시태양에서, 방법에 유용한 식물은 애기장대, 옥수수, 밀, 대두, 및 목화이다.
재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 위해, 또는 확인된 보상 유전자의 조절을 위해 어떠한 식물 프로모터든지 사용될 수 있다. 프로모터는 식물 RNA 중합효소 II 프로모터일 수 있다. 식물 프로모터에 포함된 요소는 전형적으로 전사 개시 부위에서 약 25 내지 35 염기쌍 상류(5')에 위치하는 TATA 박스 또는 골드버그-호그네스(Goldberg-Hogness) 박스, 및 70 내지 100 염기쌍 상류에 위치하는 CCAAT 박스일 수 있다. 식물에서, CCAAT 박스는 포유류 프로모터의 기능적으로 유사한 서열과 상이한 컨센서스(Concensus) 서열을 가질 수 있다[Messing et al. (1983) In Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., pp. 211-227]. 또한, 실제로 모든 프로모터는 전사 개시 부위에서 -100 bp 내지-1,000 bp 근처 또는 좀더 상류로부터 연장되는 추가적인 상류 활성화 서열 또는 인핸서를 포함한다[Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310; Gruss et al. (1981) Proc. Nat. Acad. ScL 78:943-947; and Khoury and Grass (1983) Cell 27:313-314].
단백질 생산/발효
본 발명의 방법은 숙주 세포 내에서 재조합 단백질 또는 펩티드의 생산을 최적으로 증가시킨다. 증가된 생산은 대안적으로 생산된 단백질 그람 당, 또는 숙주 단백질 그람 당 증가된 수준의 적절히 프로세스된 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 증가된 생산은 또한 재조합 단백질 그람 당, 또는 숙주 세포 단백질 그람 당 증가된 수준의 생산된 회수가능한 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 증가된 생산은 또한 증가된 총 수준 및 증가된 적절히 프로세스된, 활성 또는 가용성 단백질의 수준의 모든 조합일 수 있다.
재조합 단백질의 향상된 발현은 단백질 용해성에서의 증가일 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드는 숙주 세포의 세포질, 주변세포질 또는 세포외부 배지에서 생산되고 회수될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 불용성 또는 가용성일 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 1 이상의 표적 서열 또는 정제를 돕는 서열을 포함할 수 있다.
세포 성장
슈도모나스 숙주 세포를 벡터로 형질전환하는 것은 당업계에 알려진 어떠한 형질전환 방법을 사용하여 실시될 수 있고, 박테리아 숙주 세포는 온전한 세포 또는 프로토플라스트 (예를 들어, 사이토플라스트를 포함하는)로 형질전환될 수 있다. 형질전환 방법의 예로서는 전기천공법, 프로토플라스트 융합, 박테리아 접합, 및 2가 양이온 처리, 예를 들어 염화 칼슘 처리 또는 CaCl/Mg2+ 처리, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법과 같은 침공법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Morrison, J. Bact, 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology, 101: 347-362 (Wu et al., eds, 1983), Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 참조하라.
본원에서 사용될 때, "발효"라는 용어는 글자 그대로 발효가 이용되는 실시태양 및 비발효성 배양 방식이 이용되는 실시태양 양쪽 모두를 포함한다. 발효는 어떤 규모로든 실시될 수 있다. 한 실시태양에서, 발효 배지는 영양 배지, 최소 배지, 및 최소 염 배지 중에서 선택될 수 있고, 영양 배지가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 사용을 피한다. 다른 실시태양에서, 최소 배지 또는 최소 염 배지가 선택된다. 또다른 실시태양에서는, 최소 배지가 선택된다. 또다른 실시태양에서는 최소 염 배지가 선택된다. 최소 염 배지가 특히 바람직하다.
최소 염 배지는 미네랄 염 및 글루코스, 수크로스 또는 글리세롤과 같은 탄소 공급원으로 구성된다. 최소 염 배지의 예는 예를 들어 M9 배지, 슈도모나스 배지 (ATCC 179), 데이비스 앤 밍기올리(Davis and Mingioli) 배지([BD Davis & ES Mingioli (1950) in J. Bact. 60:17-28] 참조)를 포함한다. 최소 염 배지를 만들기 위해 사용되는 미네랄 염은 예를 들어, 인산 칼륨, 황산 또는 염화암모늄, 황산 또는 염화마그네슘, 및 염화칼슘, 붕산염, 및 철, 구리, 망간 및 아연의 황산염과 같은 미량 미네랄로부터 선택되는 것을 포함한다. 펩톤, 트립톤, 아미노산, 또는 효모 추출물과 같은 유기 질소 공급원은 최소 염 배지에 포함되지 않는다. 대신, 무기 질소 공급원이 사용되고, 이것은 예를 들어, 암모늄 염, 암모니아 수용액, 및 암모니아 가스로부터 선택될 수 있다. 바람직한 최소 염 배지는 탄소 공급원으로 글루코스를 함유할 것이다. 최소 염 배지와 비교하여, 최소 배지도 미네랄 염 및 탄소 공급원을 포함할 수 있으나, 매우 낮은 수준으로 첨가되더라도 예를 들어 낮은 수준의 아미노산, 비타민, 펩톤, 또는 다른 구성 성분으로 보충될 수 있다.
한 실시태양에서, 배지는 하기 표 5에 열거된 성분을 사용하여 제조될 수 있다. 성분은 다음 순서대로 첨가될 수 있다: 먼저 (NH4)HPO4, KH2PO4 및 시트르산을 약 30 리터의 증류수에 용해시키고; 그 후 미량 원소 용액을, 뒤이어 유코루브(Ucolub) N 115와 같은 소포제를 첨가할 수 있다. 그런 다음, 열 멸균(예를 들어 약 121 ℃에서) 뒤, 글루코스 MgSO4 멸균 용액 및 티아민-HCl을 첨가할 수 있다. 암모니아 수용액을 사용하여 pH를 약 6.8로 조절할 수 있다. 멸균 증류수를 그후 첨가하여 글리세롤 저장액 (123 ml)을 제외하고 초기 부피를 371로 조정할 수 있다. 화학물질은 머크(Merch)와 같은 다양한 공급처로부터 상업적으로 이용가능하다. 이 배지는 슈도모나스 종 및 연관된 박테리아의 성장에 대해 고밀도 세포배양(HCDC)을 가능하게 한다. HCDC는 배치 공정으로 시작하여 2상 페드-배치(fed batch) 배양으로 이어질 수 있다. 배치 내에서 무한히 성장한 후, 생물량 농도가 몇 배 증가할 수 있는 배가시간 3회의 기간에 걸쳐 감소된 특정 성장률에서 성장이 조절될 수 있다. 이러한 배양 방법의 추가적 세부사항은 문헌[Riesenberg, D.; Schulz, V.; Knorre, W. A.; Pohl, H. D.; Korz, D.; Sanders, E. A.; Ross, A.; Deckwer, W. D. (1991) "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate" J Biotechnol: 20(1) 17-27]에 설명되어 있다.
표 5 : 배지 조성
성분 초기 농도
KH2PO4 13.3 g/ℓ
(NH4)2HPO4 4.0 g/ℓ
시트르산 1.7 g/ℓ
MgSO4-7H2O 1.2 g/ℓ
미량 금속 용액 10 ㎖/ℓ
티아민 HCl 4.5 mg/ℓ
글루코스-H2O 27.3 g/ℓ
소포제 유코루브(Ucolub) N115 0.1 ㎖/ℓ
영양 용액
MgSO4-7H2O 19.7 g/ℓ
글루코스-H2O 770 g/ℓ
NH3 23 g
미량 금속 용액
6 g/ℓ Fe(III) 시트레이트 1.5 g/ℓ MnCl2-4H2O
0.8 g/ℓ ZmCH2COOl2-2H2O 0.3 g/ℓ H3BO3
0.25 g/ℓ Na2MoO4-2H2O 0.25 g/ℓ CoCl2 6H2O
0.15 g/ℓ CuCl2 2H2O 0.84 g/ℓ 에틸렌
디니트릴로-테트라아세트산 Na2 sah 2H2O
(트리트리플렉스 III, 머크)
본 발명에 따른 발현 시스템은 모든 발효 형태로 배양될 수 있다. 예를 들어, 배치, 페드-배치, 반연속, 및 연속발효 방식이 본원에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 시스템은 모든 발효 규모(즉, 부피)에서 형질전환 유전자 발현에 유용하다. 따라서, 예를 들어 마이크로리터-규모, 센티리터 규모, 및 데시리터 규모 발효 부피가 사용될 수 있고, 1 리터 규모 및 더 큰 발효 부피가 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 발효 부피는 1 리터 이상이다. 다른 실시태양에서, 발효 부피는 5 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 50 리터, 75 리터, 100 리터, 200 리터, 500 리터, 1,000 리터, 2,000 리터, 5,000 리터, 10,000리터 또는 50,000 리터 이상이다.
본 발명에서, 형질전환된 숙주 세포의 성장, 배양, 및(또는) 발효는 숙주 세포의 생존을 허용하는 온도, 바람직하게 약 4 ℃ 내지 약 55 ℃를 포함하는 온도 범위 내에서 실시된다. 따라서, 본 발명의 숙주 세포에 관해 본원에서 사용되는 "성장", "배양", 및 "발효"이라는 용어는 내재적으로 약 4 ℃ 내지 약 55 ℃를 포함하는 온도 범위 내에서의 "성장", "배양", 및 "발효"를 의미한다. 또한, "성장"은 활동적인 세포 분열 및(또는) 생장의 생물학적 상태, 및 비분열 및(또는) 비생장 세포가 대사적으로 유지되는, "유지"라는 용어와 동일한 의미를 가지는 생물학적 상태 양쪽 모두를 포함한다.
세포 밀도
재조합 분비 단백질 발현에서 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)를 사용하는 추가적인 장점은 이. 콜라이 또는 다른 박테리아 발현 시스템에 비해 높은 세포 밀도로 자라는 슈도모나스 플루오레센스의 능력을 포함한다. 이런 면에서, 본 발명에 따른 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템은 약 20 g/ℓ 이상의 세포 밀도를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 슈도모나스 플루오레센스 발현 시스템은 또한 부피 당 건조 세포 중량으로 측정되는 생물량의 관점에서 기술하면 약 70 g/ℓ 이상의 세포 밀도를 제공할 수 있다.
한 실시태양에서, 세포 밀도는 20 g/ℓ 이상일 것이다. 다른 실시태양에서, 세포 밀도는 25 g/ℓ, 30 g/ℓ, 35 g/ℓ, 40 g/ℓ, 45 g/ℓ, 50 g/ℓ, 60 g/ℓ, 70 g/ℓ, 80 g/ℓ, 90 g/ℓ, 100 g/ℓ, 110 g/ℓ, 120 g/ℓ, 130 g/ℓ, 140 g/ℓ 이상 또는 150 g/ℓ 이상일 것이다.
다른 실시태양에서, 유도 시 세포 밀도는 20 g/ℓ 내지 150 g/ℓ; 20 g/ℓ 내지 120 g/ℓ; 20 g/ℓ 내지 80 g/ℓ; 25 g/ℓ 내지 80 g/ℓ; 30 g/ℓ 내지 80 g/ℓ; 35 g/ℓ 내지 80 g/ℓ; 40 g/ℓ 내지 80 g/ℓ; 45 g/ℓ 내지 80 g/ℓ; 50 g/ℓ 내지 80 g/ℓ; 50 g/ℓ 내지 75 g/ℓ; 50 g/ℓ 내지 70 g/ℓ; 40 g/ℓ 내지 80 g/ℓ일 것이다.
대상 펩티드 또는 단백질의 단리
일반적으로, 본 방법은 종래 발현 시스템와 비교하여, 정확하게 또는 적절하게 프로세스된 발현되는 재조합 단백질의 수준을 증가시킨다. 특히, 본 발명은 증가된 수준의 적절하게 프로세스된 발현되는 재조합 단백질을 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포 내에서 재조합 단백질 또는 펩티드의 용해도를 향상시키는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 "가용성"이라는 용어는 단백질이 생리적 조건하에 완충액 중에 10 내지 30분간 약 5,000 내지 20,000x 중력에서 원심분리해도 침전되지 않는 것을 의미한다. 가용성 단백질은 봉입체 또는 다른 침전물의 일부가 아니다. 유사하게, "불용성"은 단백질 또는 펩티드가 생리적 조건하에 완충액 중에 10 내지 30분간 약 5,000 내지 20,000x 중력에서 원심분리하면 침전되는 것을 의미한다. 불용성 단백질 또는 펩티드는 봉입체 또는 다른 침전물의 일부일 수 있다. "봉입체"라는 용어는 단백질 또는 펩티드의 응집이 격리될 수 있는 세포 내에 함유된 세포내부 체를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 활성 재조합 단백질 또는 펩티드의 회수를 향상시킬 수 있다. 활성 단백질의 수준은, 예를 들어 편의에 따라 시험관 내 또는 생체 내 검정에 의해, 확인된 것과 원래의 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이형, 조각-치환된 폴리펩티드 및(또는) 잔기-치환된 폴리펩티드 간의 상호작용으로 측정될 수 있다. 따라서, 생체 내 검정은 예를 들어, 효소와 기질 간, 호르몬과 호르몬 수용체 간, 항체와 항원 간 등의 확인된 단백질과 대상 펩티드 간의 탐지가능한 상호작용을 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 탐지는 측색 변화, 방사성 변화, 용해도 변화, 젤 전기영동 및(또는) 겔 배재법 등에 의해 측정할 때의 분자량 변화의 측정을 포함한다. 생체 내 검정은 생리적 효과, 예를 들어 체중 증가, 전해질 균형의 변화, 혈액 응고 시간 변화, 응고 분해 및 항원 반응 유도의 변화를 탐지하는 검정을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 확인된 것과 대상 폴리펩티드 간의 상호작용의 변화를 탐지할 수 있도록 하는 변수가 존재하기만 하면 어떠한 검정이든 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,834,250호를 참조하라.
주변세포질로부터 재조합 단백질을 방출하기 위해, 클로로포름[Ames et al. (1984) J. Bacterial, 160: 1181-1183], 구아니딘-HCl, 및 트리톤 X-100[Naglak and Wang (1990) Enzyme Microb. Technol, 12: 603-611]과 같은 화학물질을 이용하는 처리가 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 화학물질들은 비활성이 아니고, 많은 재조합 단백질 생성물 또는 후속 정제 과정에 악영향을 미칠 수 있다. 외막을 투과가능하도록 하는 이. 콜라이 세포의 글리신 처리도 주변세포질의 내용물을 방출하는 것으로 보고되었다[Ariga et al. (1989) J Ferm. Bioeng., 68: 243-246]. 재조합 단백질의 주변세포질로부터의 방출을 위한 가장 널리 사용되는 방법은 삼투압 충격[Nosal and Heppel (1966) J. Biol Chem., 241: 3055-3062; Neu and Heppel (1965) J. Biol Chem., 240: 3685-3692], 암탉 흰자(HEW)-리소자임/에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) 처리[Neu and Heppel (1964) J. Biol Chem., 239: 3893-3900; Witholt et al. (1976) Biochim. Biophys. Acta, 443: 534-544; Pierce et al. (1995) ICheme Research. Event, 2: 995- 997], 및 조합된 HEW-리소자임/삼투압 충격 처리[French et al. (1996) Enzyme and Microb. Tech., 19: 332-338]이다. 프렌치법은 분리 완충액 중 세포의 재현탁 후 리소자임 처리 즉시 삼투압 충격이 이어지는 주변세포질의 분획 회수를 포함한다. 재조합 단백질인 S. 테르모비올라세우스(S. thermoviolaceus) α-아밀라아제의 과발현, 및 숙주 생물의 성장기가 회수에 미치는 영향도 논의한다.
전형적으로, 이러한 과정들은 삼투압적으로 안정화된 배지 중 먼저 붕괴된 후 비-안정화 배지 중에서의 선택적 방출을 포함한다. 이러한 배지의 조성물 (pH, 보호제) 및 사용되는 붕괴 방법 (클로로포름, HEW-리소자임, EDTA, 초음파 분해)은 보고된 특정 방법에 따라 다양하다. EDTA 대신 2극성 이온 세제를 사용하는 HEW-리소자임/EDTA 처리의 변형이 문헌[Stabel et al. (1994) Veterinary Microbiol, 38: 307-314]에 설명된다. 이. 콜라이를 붕괴시키기 위한 세포내 분해 효소 시스템의 이용에 대한 일반적인 검토에 대해서는, [Dabora and Cooney (1990 )in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 43, A. Fiechter, ed. (Springer-Verlag: Berlin), pp. 11-30]를 참조하라.
세포질로부터 가용성 단백질 또는 굴절성 입자로서 재조합 단백질의 회수를 위한 종래 방법은 기계적 파괴에 의한 박테리아 세포의 해체를 포함한다. 기계적 붕괴는 전형적으로 액체 현탁액 중 국지적 캐비테이션 발생, 단단한 구슬과 함께 빠른 교반, 초음파 분해, 또는 세포 현탁액의 분쇄를 포함한다[Bacterial Cell Surface Techniques, Hancock and Poxton (John Wiley & Sons Ltd, 1988), Chapter 3, p. 55].
HEW-리소자임은 생화학적으로 세포벽의 펩티도글리칸 뼈대를 가수분해하도록 활동한다. 본 방법은 이. 콜라이를 난(卵) 알부민 (HEW-리소자임을 함유하는)으로 처리하여, 이후 스페로플라스트로 알려진 둥근 세포구를 생산한 [Zinder and Arndt (1956) Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 42: 586-590]에서 처음 개발되었다. 이러한 구조는 몇몇 세포벽 성분을 보유하나, 세포질 막이 노출되는 넓은 표면적을 가졌다. 미국 특허 제5,169,772호는 EDTA, 리소자임, 또는 유기 화합물을 이용한 20% 수크로스 용액과 같은 삼투압적으로 안정화된 배지 중 박테리아의 막을 붕괴하고, 박테리아를 저이온력 완충액에 노출시켜 붕괴된 박테리아의 주변세포질으로부터 비-헤파리나아제-유사 단백질을 방출하고, 비이온력-세척된 박테리아를 완충된 염 용액에 노출시켜 헤파리나아제-유사 단백질을 방출하는 것을 포함하는, 박테리아로부터 헤파리나아제를 정제하는 방법을 개시한다.
이러한 방법의 많은 다른 변형이 다양한 성공률로 넓은 범위의 발현 시스템에 사용되었다[Joseph-Liazun et al. (1990) Gene, 86: 291-295; Carter et al. (1992) Bio/Technology, 10: 163-167]. 리소자임을 생산하기 위한 재조합 세포 배양을 유도하려는 노력이 보고되었다. 유럽특허 제0 155 189호는 보통 이러한 숙주 세포를 세포 벽 구조의 파괴 또는 용해에 의해 죽이는 리소자임을 생산하기 위한 재조합 세포 배양의 유도 수단을 개시한다. 미국 특허 제 4,595,658호는 이. 콜라이의 주변세포질으로 운반된 단백질의 발현을 용이하도록 하는 방법을 개시한다. 이 방법은 세포의 리소자임 처리, 기계적 분쇄, 또는 삼투압 충격 처리 없이 주변세포질 내에 위치하는 단백질의 선택적 단리를 허용한다. 미국 특허 제4,637,980호는 직접 또는 간접적으로 생성물을 코딩하는 DNA 분자로 온도-민감성 용원을 형질전환하고, 유전자 생성물의 세포내부적 발현을 허용하는 조건 하에서 형질변환체를 배양하고, 파지가 코딩하는 기능을 유도하기 위해 온도를 높여 생성물을 발현시켜 박테리아 생성물을 생산하는 것을 개시한다. 문헌[Asami et al. (1997) J. Ferment, and Bioeng., 83: 511-516]는 T4 파지 감염에 의한 이. 콜라이 세포의 동시적 붕괴를 개시하고, 문헌[Tanji et al. (1998) J. Ferment, and Bioeng., 85: 74-78]는 이. 콜라이 세포의 완만한 붕괴를 위해 T 파지에 코딩되는 분해 유전자의 조절된 발현을 개시한다.
세포 분해 동안, 게놈 DNA는 세포질 밖 배지로 새어나오고, 이는 원심 분리 필드 내에서 고체 침전을 방해할 수 있는, 유체 점성도의 현저한 증가를 가져온다. DNA 중합체를 파괴하려는 기계적 붕괴 동안 가해지는 것과 같은 전단력의 부제에서, 점성 높은 유체에 기인한 고체의 더 느린 침전 속도는 원심분리 동안 고체와 액체가 제대로 분리되지 않는 원인이 된다. 기계적 전단력 외에, DNA 중합체를 분해하는 핵분해성 효소가 존재한다. 이. 콜라이에서, 내부 유전자 endA는 원래 주변세포질으로 분비되어 내부분해 방식으로 DNA를 올리고데옥시리보뉴클레오티드로 절단하는 엔도뉴클리아제(성숙 단백질의 분자량이 약 24.5 kD이다)를 코딩한다. endA는 이. 콜라이에 의해 상대적으로 약하게 발현된다는 것이 제안되었다[Wackernagel et al. (1995) Gene 154: 55- 59].
한 실시태양에서, 숙주 세포로부터 활성, 가용성 형태인 디술파이드을 결합 함유하는 확인된 폴리펩티드를 회수하기 위해 추가적인 디술파이드 결합 촉진 조건 또는 촉진제가 요구되지 않는다. 한 실시태양에서, 형질전환된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 단편은 활성 상태에서 폴딩된 분자내 입체구조를 갖는다. 한 실시태양에서, 형질전환된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 그의 단편은 활성 상태에서 1개 이상의 분자내 디술파이드 결합을 가지며, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20개 이상에 이르는 디술파이드 결합을 가질 수도 있다.
본 발명의 단백질은 황산암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 니켈 크로마토그래피, 히드록실라파타이트 크로마토크래피, 역상 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 분취 전기영동, 세제 용해화, 칼럼 크로마토그래피와 같은 이러한 물질을 이용한 선택적 침전, 면역정제법 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 잘 알려진 표준 기법으로 분리되고 상당한 순도로 정제될 수 있다. 예를 들어, 확립된 분자 부착성을 가지는 단백질은 반대로 리간드에 융합될 수 있다. 적절한 리간드를 이용하여, 단백질은 선택적으로 정제 칼럼에 흡수된 뒤, 상대적으로 순수한 형태로 칼럼으로부터 제거될 수 있다. 융합 단백질은 그 후 효소적 활성에 의해 제거된다. 또한, 단백질은 면역친화성 칼럼 또는 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 정제될 수 있다. 일반적인 기법은 예를 들어, 문헌[R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer- Verlag: N.Y. (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990); U.S. Pat. No. 4,511,503; S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al., Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000); and R. Mukhija, et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995)]에 추가로 설명되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌[Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol. 182], 및 이 시리즈의 다른 권[Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY]; 및 단백질 정제 생성물의 사용에 관한 제조자의 문헌, 예를 들어, 파마시아(Pharmacia, 피스카타웨이, N.J.), 또는 바이오-래드(Bio-Rad, 리치몬드, Calif)를 참조하라. 재조합 기법과의 조합은 적절한 조각, 예를 들어, FLAG 서열 또는 단백질 분해효소로 제거가능한 서열인 동등물에 대한 융합을 허락한다. 또한, 예를 들어, 문헌[Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; and Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif]도 참조하라.
발현된 단백질의 탐지는 당업계에 알려진 방법에 의해 행해지고, 예를 들어 방사성면역검정, 웨스턴 블랏팅 기법 또는 면역침전법을 포함한다.
재조합적으로 생산되고 발현된 효소는 수많은 방법으로 재조합 세포 배양으로부터 회수되고 정제될 수 있고, 필요하다면 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)가 최후 정제 단계에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 발현되는 특정 단백질은 불용성 응집체("봉입체")를 형성할 수 있다. 몇몇 실험방법이 봉입체로부터의 단백질 정제에 적절하다. 예를 들어, 봉입체의 정제는 전형적으로 예를 들어 50 mM TRIS/HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP, 및 1 mM PMSF로 이루어진 완충액 중에 인큐베이션에 의한 숙주세포의 붕괴에 의한 봉입체의 추출, 분리 및(또는) 정제를 포함한다. 세포 현탁액은 전형적으로 프렌치 프레스를 2 내지 3회 통과시켜 분해된다. 세포 현탁액은 또한 폴리트론(Polytron, 브링크만 인스트루먼츠(Brinkman Instruments)) 또는 얼음 위에서의 초음파 분해를 이용하여 균질화될 수 있다. 박테리아를 분해하는 대안적인 방법은 당업자에게 자명하다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra] 참조).
필요하다면, 봉입체는 가용화될 수 있고, 분해된 세포 현탁액은 전형적으로 원심분리하여 원하지 않는 불용성 물질을 제거할 수 있다. 봉입체를 형성하는 단백질은 융화성 완충액으로 희석 또는 투석하여 복원될 수 있다. 적절한 용매는 우레아 (약 4 M 내지 약 8 M), 포름아미드 (약 80% (v/v) 이상), 및 구아니딘 염산염 (약 4 M 내지 약 8 M)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구아니딘 염산염 및 유사한 시약은 변성제이나, 이 변성은 비가역적이지 않고, 변성제의 제거(예를 들어 투석에 의해) 또는 희석에 의해, 면역적으로 및(또는) 생물학적으로 활성있는 단백질의 재구성을 가능하게 하는 재생이 일어날 수 있다. 다른 적절한 완충액은 당업자에게 알려져 있다.
대안적으로, 숙주 주변세포질로부터 재조합 단백질 또는 펩티드를 정제하는 것이 가능하다. 숙주 세포의 분해 후, 재조합 단백질이 숙주 세포의 주변세포질 내로 수송되면, 박테리아의 주변세포질 분획은 당업자에게 알려진 다른 방법뿐 아니라 냉각 삼투압 충격에 의해 단리될 수 있다. 주변세포질로부터 재조합 단백질을 단리하기 위해, 예를 들어, 박테리아 세포는 펠렛을 형성하도록 원심분리될 수 있다. 펠렛은 20% 수크로스를 함유하는 완충액에 재현탁될 수 있다. 세포를 분해하기 위해, 박테리아를 원심분리하여, 펠렛을 냉각된 5 mM MgSO4에 재현탁하고 약 10분간 얼음 배쓰에 보관할 수 있다. 세포 현탁액을 원심분리하여 상등액을 따라내어 저장할 수 있다. 상등액에 존재하는 재조합 단백질을 당업자에게 잘 알려진 표준 분리 기법으로 숙주 단백질로부터 분리할 수 있다.
초기 염 분리는 많은 원하지 않는 숙주 세포 단백질 (또는 세포 배양 배지에서 기원한 단백질)을 목적 재조합 단백질로부터 분리할 수 있다. 이러한 예 중 하나는 황산 암모늄일 수 있다. 황산 암모늄은 단백질 혼합물에서 수분량을 효과적으로 감소시켜 단백질을 침전시킨다. 그런 다음 단백질은 그들의 용해도에 따라 침전한다. 단백질이 소수성일수록, 더 낮은 황산 암모늄 농도에서 침전될 가능성이 높다. 전형적인 실험방법으로는 단백질 용액에 포화 황산 암모늄을 첨가하여 결과 황산 암모늄 농도가 20 내지 30%가 되도록 하는 것을 포함한다. 이 농도는 소수성 단백질 대부분을 침전시킬 것이다. 그런 다음 침전물을 버리고 (목적 단백질이 소수성이지 않는 한) 황산 암모늄을 목적 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 농도로 상등액에 첨가한다. 그런 다음 침전물을 완충액 중에 가용화하고, 필요하다면 투석 또는 투석여과로 과량의 염을 제거한다. 냉각 에탄올 침전법과 같이 단백질의 용해도에 의존한 다른 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 복합 단백질 혼합물을 분리하는데 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 분자량은 상이한 세공 크기의 막 (예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Milipore) 막)을 통한 한외여과(Ultrafiltration)를 이용하여 더 크거나 더 작은 크기의 단백질로부터 재조합 단백질을 단리하는데 사용될 수 있다. 첫 단계로, 단백질 혼합물을 목적 단백질의 분자량보다 낮은 분자량 제한선을 가지는 세공 크기의 막을 통해 한외여과할 수 있다. 한외여과의 농축물을 그 후 목적 단백질의 분자량보다 큰 분자 제한선을 가지는 막에 대해 다시 한외여과할 수 있다. 재조합 단백질은 막을 통해 여과물로 빠져나갈 것이다. 그런 다음 여과물을 하기에 설명할 것과 같이 크로마토그래피할 수 있다.
재조합 단백질은 또한 그 크기, 총 표면전하, 소수성, 및 리간드에 대한 친화성에 기반하여 다른 단백질로부터 분리될 수 있다. 또한, 단백질에 대항하여 생성된 항체가 칼럼 매트릭스 및 면역정제될 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 모든 방법은 당업계에 잘 알려져있다. 크로마토그래피 기법이 어떠한 규모로든, 많은 다른 제조사 (예를 들어 파마시아 바이오테크)의 기기를 사용하여 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
실제로, 주변세포질을 표적으로 하는 이종 단백질이 종종 배양액에서 발견되는데(유럽특허 제 0 288 451호 참조), 아마도 외세포막의 손상 또는 유동성의 증가 때문일 것이다. 이러한 "수동적" 분비 속도는 외세포막의 투과성을 증가시키는 콜리신 (Miksch et al. (1997) Arch. Microbiol. 167: 143-150); 성장률 (Shokri et al. (2002) App Miocrobiol Biotechnol 58:386-392); TolIII 과발현 (Wan and Baneyx (1998) Protein Expression Purif. 14: 13-22); 박테리오신 분비 단백질 (Hsiung et al. (1989) Bio/Technology 7: 267-71), 콜리신 A 분해 단백질 (Lloubes et al. (1993) Biochimie 75: 451- 8), 주변세포질 단백질이 새어나오는 돌연변이 (Furlong and Sundstrom (1989) Developments in Indus. Microbio. 30: 141-8); 융합 파트너 (Jeong and Lee (2002) Appl.Environ. Microbio. 68: 4979-4985); 삼투압 충격에 의한 회수 (Taguchi et al. (1990) Biochimica Biophysica Acta 1049: 278-85)와 같은 다양한 기작을 이용하여 증가될 수 있다. 배양액 내에서의 이후 분포와 함께 가공된 단백질의 주변세포질 공간으로의 이동은 이. 콜라이에서 적절하게 폴딩된 활성 단백질을 생산하는데 사용되었다[Wan and Baneyx (1998) Protein Expression Purif. 14: 13-22; Simmons et al. (2002) J. Immun. Meth.263: 133-147; Lundell et al. (1990) J. Indust. Microbio.5 : 215-27].
그람 음성 박테리아는 그들의 이중막을 횡단하는 단백질 수송을 위한 수많은 시스템을 진화시켰다(도 1 참조). 이러한 분비 경로는 예를 들어, 세포막 및 외막을 횡단하는 단일 단계 이동에 대한 ABC (타입 I) 경로, Path/Fla (타입 III) 경로, 및 Path/Vir (타입 IV) 경로; 세포막을 횡단하는 이동에 대한 Sec (타입 II), Tat, MscL, 및 홀린스 경로; 및 세포막 및 외막을 횡단하는 2단계 이동에 대한 Sec-플러스-핌브리알 어셔 포린 (FUP) 경로, Sec-플러스-자가운반자 (AT) 경로, Sec-플러스-투 파트너 분비 (TPS) 경로, Sec-플러스-주요 말단 분지 (MTB) 경로, 및 Tat-MTB 경로를 포함한다. 모든 박테리아가 이러한 분비 경로 모두를 가지는 것은 아니다.
세 개의 단백질 시스템 (타입 I, III, 및 IV)는 단일 에너지-결합 단계에서 양쪽 막을 횡단하여 단백질을 분비한다. 네 개의 시스템 (Sec, Tat, MscL 및 홀린스)는 내막만을 횡단하여 분비하고, 다른 네 개의 시스템 (MTB, FUP, AT 및 TPS)는 외막만을 횡단하여 분비한다.
분비 신호 또는 본 발명의 숙주세포를 이용하여 주변세포질으로 운반되는 단백질은 또한 추가적 단계에서 세포외부 배지로 능동적으로 수송될 수도 있다. 능동 수송에 대한 알려진 기작은 일반적으로 자가운반자, 투-파트너 분비 시스템, 주요 말단 분지 시스템, 또는 핌브리알 어셔 포린에 의한다.
자가운반자(AT) 경로를 통해 운반되는 단백질은 보통 N-말단 Sec-타입 신호 펩티드, 중앙 패신저 도메인 및 C-말단 200 내지 300 아미노산 잔기의 α-도메인을 포함한다. 패신저 도메인이 서열 및 크기에서 현저하게 다양한 반면, 상이한 자가운반자들의 α-도메인은 매우 유사성이 높다. Sec 계 및 신호 펩티드의 절단에 의한 내막 횡단 분비에 이어, α-도메인의 올리고머는 패신저 도메인이 통과하여 분비되는 막공을 형성한다[Veiga et al. (2002) EMBO J., 21:2122-2131]. 자가운반자의 대부분은 그람 음성 병원균의 독성과 관련된다.
투-파트너 분비 (TPS) 시스템은 단백질들이 서열 유사성을 공유하지 않는 것으로 알려졌음에도 불구하고 기능적으로 AT 시스템과 유사하다. TPS 시스템은 인접한 유전자에서 코딩되는 두개의 신호-펩티드-함유 단백질로 이루어져 있다. 한 단백질은 패신저 도메인을 가지고, 다른 단백질은 α-도메인을 가진다. 두 단백질은 모두 Sec 시스템에 의해 주변세포질으로 분비되고, 패신저 도메인이 있는 단백질은 α-도메인이 있는 단백질에 의해 형성된 외막공을 통해 추가로 수송된다[Jacob-Dubuisson et al. (2001) MoI Microbiol. 40:306-13]. TPS 시스템의 대부분의 기질 단백질은 1651 내지 5640개의 아미노산의 큰 단백질들이다. 운반자를 위한 표적화 서열인 N-말단 250개 잔기에서 높은 유사성을 보이나, 그들의 C-말단 서열은 매우 다양하다. 주요 말단 분지 (MTB)는 주변세포질으로부터 세포외부 배지로 이미 폴딩된 단백질을 이동시키는 큰 복합체이다. 복합체는 10개 이상의 단백질 구성물로 이루어지고, 이들 중 몇몇은 4형 섬모 생물발생계와 유사 서열을 공유한다[Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-108] 기능적 MTB 시스템을 코딩하는 유전자는 흔히 게놈에서 집단(cluster)을 형성한다. MTB에 의한 단백질 분비의 표적화 신호 및 분자적 기작은 잘 알려져있지 않다.
FUP 계는 그람 음성 프로테오박테리아 및 시아노박테리아에서 수많은 선모가 생물발생한 이유이다. 각각의 선모의 구조 단백질을 코딩하는 오페론은 또한 선모-특이적 주변세포질성 섀퍼론 단백질 및 핌브리아-특이적 외막 어셔 단백질도 코딩한다. 이러한 모든 단백질들은 Sec 형 신호 펩티드를 가진 전구체 단백질로 합성될 수 있다. Sec 시스템에 의해 내막을 횡단하여 이동된 후, 선모 서브유닛은 주변세포질에서 선모의 자기조립을 방지하는 섀퍼론 단백질에 둘러싸인다. 섀퍼론 및 어셔 단백질 간의 상호작용이 단백질 서브유닛을 방출하고, 이는 그후 서로 상호작용하고 외막을 횡단하여 어셔 단백질을 통해 분비된다.
탈변성(renaturation) 및 리폴딩
불용성 단백질은 탈변성되거나 리폴딩되어 2차 및 3차 단백질 입체구조를 형성할 수 있다. 단백질 리폴딩 단계는 필요하다면 재조합 생성물의 입체 구조가 완성될 때 사용될 수 있다. 리폴딩 및 재생은 단백질의 분리/결합을 촉진하는 것으로 당업계에 알려진 시약을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 단백질은 디티오트레이톨과 함께 인큐베이션하고, 산화된 글루타치온 디소듐 염과 인큐베이션한 뒤, 우레아와 같은 리폴딩제를 함유하는 완충액에서 인큐베이션 할 수 있다.
재조합 단백질도 예를 들어 포스페이트-완충 염수 (PBS) 또는 200 mM NaCl을 포함하는 50 mM Na-아세테이트, pH 6 완충액으로 투석하여 탈변성될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 단백질 분해효소 억제제를 함유하는 500 mM NaCl, 20% 글리세롤, 20 mM 트리스/HCl pH 7.4 중 6M 내지 1M 우레아 선형 구배를 이용하여 Ni NTA 칼럼과 같은 칼럼에 고정된 채로 탈변성될 수 있다. 탈변성은 1.5 시간 이상의 기간에 걸쳐 실시될 수 있다. 탈변성 후, 단백질은 250 mM 이미다졸을 첨가하여 용리할 수 있다. 이미다졸은 PBS 또는 200 mM NaCl을 첨가한 50 mM 소듐 아세테이트 pH 6 완충액에 대한 최종 투석 단계에 의해 제거될 수 있다. 정제된 단백질은 4 ℃ 또는 -80 ℃에 보관할 수 있다.
다른 방법은, 예를 들어 문헌[MH Lee et al., Protein Expr. Purif., 25(1): p. 166-73 (2002), W.K. Cho et al., J. Biotechnology, 77(2-3): p. 169-78 (2000), Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements), Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series, Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY, S. Roe, Protein Purificaion Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al., Protein Purificaions, Wiley-Lisa, Inc. (1996)]에 기재된 것을 포함한다.
활성 단백질 또는 펩티드 분석
활성 단백질은 그 서열이 얻어지는 천연 단백질 또는 펩티드의 활성의 20% 미만, 30% 또는 40% 이상, 바람직하게 50%, 60% 또는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 미만, 90% 또는 95% 이상의 특이적 활성을 가질 수 있다. 또한, 기질 특이성 (kcat/Km)은 선택적으로 천연 단백질 또는 펩티드와 실질적으로 유사하다. 전형적으로, kcat/Km은 천연 단백질 또는 펩티드의 30%, 40% 또는 50% 이상; 더욱 바람직하게 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상이다. 단백질 및 펩티드의 활성 및 기질 특이성 (Kcat/Km)의 검정 및 정량적 측정 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따라 제조된 재조합 단백질 또는 펩티드의 활성은 당업계에 알려진 종래의 또는 표준 시험관 내 또는 생체내 단백질 특이적 검정에 의해 측정될 수 있다. 슈도모나스 생산된 분비 재조합 단백질 또는 펩티드의 활성은 재조합 단백질이 생리적 조건과 동일 또는 유사한 조건하에 천연 단백질 또는 펩티드로부터 일반적으로 관찰되는 활성과 실질적으로 유사하거나 또는 동등한 활성을 보이는지 결정하기 위해 대응되는 천연 단백질의 활성과 비교될 수 있다.
재조합 단백질의 활성은 종전에 확립된 천연 단백질 또는 펩티드의 표준 활성과 비교될 수 있다. 대안적으로, 재조합 단백질 또는 펩티드의 활성은 천연 단백질 또는 펩티드와의 동시적, 또는 실질적으로 동시적인 비교 검정에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 검정은 재조합 단백질 또는 펩티드와, 발현된 효소와 기질 간, 발현된 호르몬과 호르몬 수용체 간, 발현된 항체와 항원 간과 같은 표적 간의 탐지가능한 상호작용을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 탐지는 측색 변화, 증식 변화, 세포 사멸, 세포 반발, 방사성 변화, 용해도 변화, 젤 전기영동 및(또는) 젤 제외 방법에 의해 측정되는 분자량 변화, 인산화 능력, ELISA 검정과 같은 항체 특이성 검정 등의 측정을 포함할 수 있다. 또한, 생체 내 검정은 천연 단백질 또는 펩티드의 생리적 영향, 예를 들어 체중 증가, 전해질 균형의 변화, 혈액 응고 시간의 번화, 응고 분해 및 항원 반응 유도의 변화와 비교하여 슈도모나스 생산 단백질 또는 펩티드의 생리적 효과를 탐지하는 검정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 모든 시험관 내 또는 생체 내 검정은 이러한 활성이 검정가능한 것인 한, 천연 단백질 또는 펩티드에 대한 비교 분석을 가능하도록 하는 슈도모나스 생산 재조합 단백질 또는 펩티드의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에서 생산된 단백질 또는 펩티드는 단백질 또는 펩티드와, 예를 들어 천연 단백질이 정상적으로 상호작용하는 신호 경로의 기질 또는 구성요소와 같은 단백질 또는 펩티드와 정상적으로 상호작용하는 분자 간의 상호작용을 촉진하거나 또는 헉제하는 능력을 검정할 수 있다. 이러한 검정은 전형적으로 단백질 또는 펩티드가 표적 분자와 상호작용하도록 하는 조건 하에, 단백질을 기질 분자와 합하는 단계를 포함할 수 있고, 단백질과 표적 분자 간의 상호작용의 생화학적 결과를 탐지할 수 있다.
단백질 또는 펩티드 활성을 결정하는데 이용될 수 있는 검정은, 예를 들어 문헌[Ralph, P. J., et al. (1984) J. Immunol. 132:1858 or Saiki et al. (1981) J. Immunol. 127:1044, .Steward, W. E. II (1980) The Interferon Systems. Springer-Verlag, Vienna and New York, Broxmeyer, H. E., et al. (1982) Blood 60:595, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, L, E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, and "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S. L. and A. R. Kimmel eds., 1987, AK Patra et al., Protein Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000), Kodama et al., J. Biochem. 99: 1465-1472 (1986); Stewart et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 5209-5213 (1993); (Lombillo et al., J. Cell Biol. 128:107-115 (1995); (Vale et al., Cell 42:39-50 (1985)]에 기재되어 있다.
관심대상인 단백질
숙주 세포는 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하도록 설계될 수 있다. 어떤 종 및 어떤 크기일 수 있다. 그러나, 특정 실시태양에서는, 재조합 단백질 또는 펩티드가 치료적으로 유용한 단백질 또는 펩티드이고, 어떤 실시태양에서는 단백질은 인간 단백질과 같은 포유류 단백질일 수 있으며, 예를 들어 성장 인자, 시토카인, 케모카인 또는 혈액 단백질일 수 있다. 재조합 단백질 또는 펩티드는 천연 단백질 또는 펩티드와 유사한 방식으로 프로세스될 수 있다. 특정 실시태양에서는, 단백질 또는 펩티드는 코딩 서열에 분비 신호를 포함하지 않는다. 특정 실시태양에서는, 재조합 단백질 또는 펩티드는 100 kD 미만, 50 kD 미만, 또는 30 kD 미만의 크기이다. 특정 실시태양에서는 재조합 단백질 또는 펩티드는 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개의 아미노산 이상의 펩티드이다.
분자 유전학 및 유전 공학 기법을 위해 필요한 방대한 서열 정보가 공개적으로 널리 이용가능하다. 인간을 비롯한 포유류의 완전한 뉴클레오티드 서열, 유전자, cDNA 서열, 아미노산 서열 및 게놈에 대해 진뱅크(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)에서 접근할 수 있다. 또한 유전자 및 그의 생성물에 관한 정보를 통합한 전자 백과사전인 진카드(GeneCards)로부터 추가적인 정보를 얻을 수 있고, 바이츠만(Weizmann) 게놈 및 생물정보학 과학연구소(http://bioinforma.tics.weizmann.ac.il/cards/)로부터 생물 의학적 응용을 얻을 수 있으며, 뉴클레오티드 서열 정보는 EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스(http://www.ebi.ac.uk/embl/) 또는 DNA 데이터뱅크 또는 일본 사이트 (DDBJ, http://www.ddbi.nig.ac.jp/)에서 얻을 수 있다. 아미노산 서열 정보를 위한 추가적인 사이트로는 조지타운 단백질 정보원 웹사이트(http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/) 및 스위스-프로트(Swiss-Prot) (http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)를 포함한다.
본 발명에서 발현될 수 있는 단백질의 예는 예를 들어 레닌, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 트롬보포이틴; 난포자극호르몬; 칼시토닌; 황체형성호르몬; 글루카곤; VIIIC 인자, LX 인자, 조직 인자, 및 폰 빌레브란츠 인자와 같은 응혈 인자; C 단백질과 같은 항-응고 인자; 심방 나트륨이뇨인자; 폐 계면활성제; 유도키나아제 또는 인간 요소 또는 조직 플라스미노겐 활성인자 (t-PA)와 같은 플리스미노겐 활성인자; 봄베신; 트롬빈; 조혈성장인자; 종양괴사인자-α 및 β; 엔케팔리나아제; 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민; 물러관 억제물질; 렉사틴 A-사슬; 렉사틴 B-사슬; 프로렉사틴; 쥐 생식샘자극호르몬-연관 펩티드; β-락타마제와 같은 미생물 단백질; DNA 분해효소; 인히빈; 액티빈; 혈관내피성장인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자 수용체; 인테그린; A 또는 D 단백질; 류마티스 인자; 뇌-유래 향신경 인자(BDNF), 뉴로트롬핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 NGF-β와 같은 신경세포성장인자와 같은 향신경 인자; 카디오트롬핀-1 (CT-1)과 같은 카디오트롬핀 (심장 비대 인자); 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); aFGF 및bFGF와 같은 섬유모세포 성장 인자; 상피 세포 성장 인자 (EGF); TGF-α 및 TGF-βl, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-β와 같은 전환 성장 인자 (TGF); 인슐린 유사 성장인자 I 및 II (IGF-I 및 IGF-II); des(l-3)-IGF-I (대뇌 IGF-I); 인슐린 유사 성장인자 결합단백질; CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19와 같은 CD 단백질; 적혈구생성인자; 골유도 인자; 면역독소; 뼈 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론 α, β, 및 γ와 같은 인터페론; M-CSF, GM- CSF, 및 G-CSF와 같은 집락자극인자 (CSFs); 인터루킨 (ILs), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 항-HER-2 항체; 과산소 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 분해(decay) 촉진 인자; AIDS 외피의 일부와 같은 바이러스 항원; 운반 단백질; 귀소(homing) 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 항체; 및 상기 열거된 폴리펩티드 중 어떤 것의 단편과 같은 분자를 포함한다.
특정 실시태양에서, 단백질 또는 펩티드는 IL-1, IL-1a, IL- 1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12엘라스티, IL-13, IL- 15, EL-16, IL-18, IL-18BPa, IL-23, IL-24, VIP, 적혈구 생성인자, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), MSF, FLT-3 리간드, EGF, 섬유모세포 성장인자 (FGF; 예를 들어, αFGF (FGF-1), βFGF (FGF-2), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 또는 FGF-7), 인슐린 유사 성장인자 (예를 들어, IGF-1, IGF-2); 종양 괴사 인자 (예를 들어, TNF, 림프독소), 신경세포 성장인자 (예를 들어, NGF), 혈관내피 성장인자 (VEGF); 인터페론 (예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ); 백혈병 억제 인자(LIF); 섬모 향신경인자 (CNTF); 온코스타틴 M; 줄기 세포 인자 (SCF); 전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-α, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3); TNF 상과 (예를 들어, LIGHT/TNFSF14, STALL-1/TNFSF13B (BLy5, BAFF, THANK), TNFα/TNFSF2 및 TWEAK/TNFSF12); 또는 케모카인 (BCA-l/BLC-1, BRAK/Kec, CXCL16, CXCR3, ENA-78/LIX, 이오탁신-1, 이오탁신-2/MPIF-2, 엑소더스-2/SLC, 프락탈킨/뉴로탁신, GROα/MGSA, HCC-1, I-TAC, 림포탁틴/ATAC/SCM, MCP-1/MCAF, MCP-3, MCP-4, MDC/STCP-1/ABCD-1, MIP-1, MIP-1, MIP-2/GRO, MlP-3/엑소더스/LARC, Mff-3/엑소더스-3/ELC, MIP- 4/PARC/DC-CK1, PF-4, RANTES, SDFl, TARC, 또는 TECK)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 슈도모나스 종의 숙주 세포에 의한 멀티 서브유닛 단백질 또는 펩티드의 생산이 제공된다. 발현될 수 있는 멀티서브유닛 단백질은 동형(homometric) 또는 이형(heterometric) 단백질을 포함한다. 멀티서브유닛 단백질은 동일하거나 상이한 2 이상의 서브유닛을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 서브유닛을 포함하는 동형 단백질일 수 있다. 단백질은 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 서브유닛을 포함하는 이형 단백질일 수 있다. 예시적인 멀티서브유닛 단백질은, 이온 채널 수용체를 포함하는 수용체; 콘드로이틴을 포함하는세포외부 매트릭스 단백질; 콜라겐; MHC 단백질, 전체 사슬 항체 및 항체 단편을 포함하는 면역조절자; RNA 중합효소 및 DNA 중합효소를 포함하는 효소; 및 막 단백질을 포함한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 숙주 세포에 의한 혈액 단백질의 생산이 제공된다. 본 실시태양에서 발현되는 혈액 단백질은 인간 및 소 알부민을 포함하는 알부민와 같은 운반자 단백질, 트랜스페린, 재조합 트랜스페린 반(半) 분자, 햅토글로빈, 피브로노겐 및 다른 항응고 인자, 보충 요소, 이뮤노글로빈, 효소 억제제, 앵지오텐신 및 브래디키닌과 같은 물질의 전구체, 인슐린, 엔도테린, 및 α, β, γ-글로빈을 포함하는 글로빈, 및 포유류 혈액에서 주로 발견되는 다른 종류의 단백질, 펩티드, 및 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 인간 혈청 알부민[Lawn, L.M., et al. (1981) Nucleic Acids Research, 9:6103-6114] 및 인간 혈청 트랜스페린[Yang, F. el al. (1984) Proa Natl. Acad. ScL USA 81:2752-2756]을 포함하는 수많은 혈액 단백질의 아미노산 서열이 보고되었다[S. S. Baldwin (1993) Comp. Biochem Physiol. 106b:203-218 참조].
본 발명의 한 실시태양에서, 슈도모나스 플루오레센스 종의 숙주 세포에 의한 재조합 효소 또는 보조인자의 생산이 제공된다. 본 실시태양에서 발현되는 효소 및 보조인자는 알돌라아제, 아민 산화효소, 아미노산 산화효소, 아스파르타아제, B12 의존 효소, 카르복시펩티다아제, 카르복시에스테라아제, 카르복실라아제, 케모트립신, CoA 필요 효소, 시아노히드린 합성효소, 시스타티온 합성효소, 탈카르복실라아제, 탈수소효소, 알콜 탈수소효소, 데히드라타아제, 디아포라아제, 디옥시지나아제, 이노에이트 환원효소, 에폭시드 히드라아제, 푸메라아제, 갈락토스 산화효소, 글루코스 이성화효소, 글루코스 산화효소, 글리코실트랜스퍼라제, 메틸트랜스퍼라제, 니트릴 히드라아제, 뉴클레오시드 인산화효소, 산화환원효소, 옥시니틸라아제, 펩티다제, 글리코실트랜스퍼라제, 페록시다제, 치료적으로 활성 폴리펩티드에 융합된 효소, 조직 플라스미노겐 활성제, 유로키나제, 렙틸라제, 스트렙토키나제; 카탈라제, 수퍼옥시드 디스뮤타제; DNA 분해효소, 아미노산 히드롤라제 (예를 들어 아스파라지나제, 아미도리드롤라제); 카르복시펩티다제; 단백질 분해효소, 트립신, 펩신, 키모트립신, 파파인, 브로멜라인, 콜라지나제; 뉴라미니다제; 락타아제, 말타아제, 수크라제, 및 아라비노푸라노시다아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 실시태양에서는, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 종의 숙주 세포에 의한 재조합 단일쇄, Fab 단편 및(또는) 전쇄 항체, 또는 그의 단편이나 부분들이 생산된다. 단일쇄 항체는 안정적으로 폴딩된 단일 폴리펩티드쇄 상의 항체의 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. Fab 단편은 특정 항체의 일편일 수 있다. Fab 단편은 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. Fab 단편은 2개의 사슬: 경쇄 및 중쇄 단편을 포함할 수 있다. 이 단편들은 링커 또는 디술파이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
재조합 단백질 또는 펩티드의 코딩 서열은 입수가능하다면 표적 폴리펩티드의 천연 코딩 서열일 수 있지만, 보다 바람직하게는 예컨대, 피. 플루오레센스(P. fluorescens)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 종에서의 코돈 사용 편향성(bias)을 반영하도록 유전자를 합성함으로써, 선택된 발현 숙주 세포에서 사용하기 위해 선택, 개선 또는 최적화된 코딩 서열일 것이다. 이로부터 제조된 유전자(들)은 하나 이상의 벡터 내에서 제작되거나 그 내로 삽입될 것이고, 이는 그 다음 발현 숙주 세포 내로 형질전환될 것이다. "발현가능한 형태(expressible form)"로 제공된다라고 일컬어지는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 선택된 박테리아 발현 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 하나 이상의 유전자를 포함하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
특정 실시태양에서, 관심 대상인 단백질은 천연 단백질, 예를 들어 천연 포유류 또는 인간 단백질이거나, 혹은 이들과 실질적으로 상동적이다. 이들 실시태양에서, 단백질은 콘카테머(concatemeric) 형태로 발견되지는 않지만 분비 신호, 및 임의로 정제 및(또는) 인식을 위한 태그 서열에만 연결된다.
다른 실시태양에서, 관심 대상인 단백질은 약 20 내지 약 42℃의 온도에서 활성인 단백질이다. 하나의 실시태양에서, 단백질은 생리학적 온도에서 활성이며 고온 또는 극한의 온도, 예를 들어 65℃를 초과하는 온도로 가열될 경우에는 불활성화된다.
하나의 실시태양에서, 관심 대상인 단백질은 약 20 내지 약 42℃의 온도에서 활성이고(이거나) 고온 또는 극한의 온도, 예를 들어 65℃를 초과하는 온도로 가열될 경우에 불활성화되고; 천연 단백질, 예를 들어 천연 포유류 또는 인간 단백질이거나 그와 실질적으로 상동적이며, 핵산으로부터 콘카테머 형태로 발현되지 않고; 프로모터는 피. 플루오레센스(P. fluorescens)의 천연 프로모터는 아니지만 다른 유기체, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)로부터 유래된 것이다.
다른 실시태양에서, 단백질은 생산된 경우 추가의 표적화 서열, 예를 들어 단백질을 세포외 배지로 표적화하는 서열도 포함한다. 하나의 실시태양에서, 추가의 표적화 서열은 단백질의 카르복시-말단에 작동가능하게 연결된다. 다른 실시태양에서, 단백질은 자가운반자에 대한 분비 신호, 두 파트너 분비 시스템, 주요 말단 분지 시스템 또는 핌브리알 어셔 포린(fimbrial usher porin)을 포함한다.
실시예 1. Sec-시스템 분비 신호 펩티드의 특징화
슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 신호 펩티드는 이. 콜라이(E. coli) 알칼리성 포스파타제(phoA) 코딩 서열-게놈 DNA 융합체의 형성 및 발현을 특징으로 한다. 발현된 융합체 중 6개의 특징을 추가로 규명했다.
PhoA 융합체로 확인된 분비된 유전자에 대한 신호 서열에 대한 절단 부위는, 다른 슈도모나스로부터의 상동 단백질과 SPScan 프로그램(Menne et al (2000) Bioinformatics 16:741-742)으로 비교하여 추론했다. 추정 지단백질의 절단 부위는 신호 펩티다제 II 모티프와 비교하여 추론했다(신호 펩티다제 II는 지단백질의 신호 서열을 특이적으로 절단한다). 6개의 신호 펩티드 전부를 신호P(추정 신호 펩티드 분석용 소프트웨어 프로그램; 덴마크 테크니컬 유니버시티의 생물학 서열 분석 센터, http://www.cbs.dtu.dk/services/신호P/에서 사용가능함)를 사용하여 분석했다. 문헌[H Nielson et al. (1997) Protein Engineering 10:1-6]도 참조. 일부 경우에는, 신호 펩티드의 특징을 더 규명하기 위해 보충 자료를 사용했다. pbp의 경우, 프로세싱된 융합 단백질을 MALDI-TOF 분석하여 절단 정보를 얻었다(하기 실시예 5 참조). 이 정보는 표 6에 나타냈다.
Sec-시스템 분비 신호 펩티드의 실체(identity)
실체 추정 아미노산 서열
추정 포스페이트 결합 단백질 서열 1의 2-24
추정 포린 E1 전구체 서열 3의 2-21
추정 아주린 서열 5의 2-20
추정 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 서열 7의 2-23
추정 Fe(III) 결합 단백질 서열 9의 2-32
추정 주변세포질 지단백질 B 전구체 서열 11의 2-17
phoA 융합 단백질의 웨스턴 분석
융합 단백질이 생산되었는지 여부를 분석하기 위해, 원심분리로 전체-세포 분획(세포질 및 및 주변세포질) 및 세포-부재 액체배지 분획으로 분리한 배양물 상에서 알칼리성 포스파타제에 대한 항체로 웨스턴 분석을 실시했다. 삽입 부위를 결정한 5개의 균주 중, 4개의 신호 서열(추정 아주린, 추정 포스페이트 결합 단백질, 추정 주변세포질 지단백질 B, 추정 Fe(III) 결합 단백질)은 예상되던 크기의 융합 단백질을 생산했고, 1개(추정 oprE 단백질)는 예상하던 것보다 약 40 kD 작은 단백질을 생산했으며, 1개(추정 Lys-Arg-Orn 결합 단백질)는 예측되던 것보다 약 20 kD 작은 단백질을 생산했다. 웨스턴 분석 및 PhoA 활성 분석 결과는, 신호 서열이 이종성 PhoA 단백질을 피. 플루오레센스(P. fluorescens)의 주변세포질로 운반했음을 보여준다.
실시예 2. pbp-scFv 융합체의 제작, 발현 및 특징화
포스페이트 결합 단백질의 추정 24개 아미노산 신호 서열(즉, Met1을 포함)을 gal2 scFv 유전자(gal2)에 융합하여 서열 15 및 16를 생산했고(표 참조), 주변세포질 및(또는) 배양 상청액으로의 분비에 대해 시험했다. 융합체는 이하와 같이 제작했다.
Figure 112006035007397-PCT00001
Figure 112006035007397-PCT00002
pbp-scFv 벡터의 제작: 피. 플루오레센스(P. fluorescens) oprF 및 포스페이트 결합 단백질(pbp) 추정 신호 서열을, 중첩 연장에 의한 스플라이싱(splicing by overlap extension; SOE) PCR로 +2 위치에서 Gal2 코딩 서열의 부분에 융합했다. 프라이머 sig_pbp_for(
Figure 112006035007397-PCT00003
; 서열 17) 및 pbp_gal2SOE_rev(
Figure 112006035007397-PCT00004
; 서열 18)(pbp_gal2SOE_for(
Figure 112006035007397-PCT00005
; 서열 19의 역상보체(reverse complement)를 포함)를 사용하고, 피. 플루오레센스(P. fluorescens) pbp 분비 신호 펩티드를 주형으로 사용하여 PCR을 수행했다. 이로부터 pbp 신호 펩티드 코딩 서열 및 gal2 단일쇄 항체(scAb 또는 scFv)의 5' 말단에 대한 코딩 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 단편이 생산되었다.
gal2 ORF도 증폭했다. 프라이머 pbp_gal2SOE_for(서열 19) 및 scFv2rev(
Figure 112006035007397-PCT00006
; 서열 20)를 사용하고, gal2-코딩 폴리뉴클레오티드를 주형으로 사용하여 PCR을 수행했다. 이로부터 pbp 신호 펩티드 3' 말단에 대한 코딩 서열 및 gal2의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편이 생산되었다.
신호 서열의 예상되는 -1 아미노산(제안된 절단 부위 앞의 마지막 아미노산)을 gal2 scFv의 +2 아미노산(Ala)에 융합시켰다. 이 융합체는 천연 pbp 단백질의 상응하는 아미노산 잔기가 그러한 것처럼, 재조합 신호 펩티다제 절단 부위 바로 다음의 아미노산(+1)이 Ala이라는 점에서 포스페이트 결합 단백질 신호 펩티드의 융합체와 매치되었다.
이로부터 제조된 융합체를 Ptac 프로모터 조절하의 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 벡터 pMYCl803으로 클로닝하여, pDOW1123(pbp:gal2) 플라스미드를 제조했다. 이 플라스미드를 pCN51-lacI 플라스미드를 보유하는 피. 플루오레센스(P. fluorescens) MB101 균주(lac 억제자를 포함함)로 형질전환하여, 균주 DC217을 제조했다. 이 플라스미드를 이. 콜라이(E. coli) JM109 균주에도 형질전환했다.
이. 콜라이(E. coli)에서의 분비를 위한 scFv 클론 제작: gal2 ORF를 pET27b(+)로 라이게이션하여, pelB 신호 서열이 Gal2의 +2 위치의 알라닌 잔기와 융합되도록 했다. 발현 분석을 위해 올바른 클론을 BL21(DE3)Gold(스트라타진(Stratagene))에 형질전환했다.
피. 플루오레센스(P. fluorescens) 대 이.콜라이(E. coli)에서의 Gal2 scFv 분비: 상기 기술한 바와 같이, 2개의 추정 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 분비 신호와 함께, 이. 콜라이(E. coli) 발현/분비를 위한 pelB 분비 신호를 +2 위치에서 gal2 오픈 리딩 프레임에 융합했다(즉, 융합체에서는 Gal2의 N-말단 메티오닌을 제거하여 표시된 신호 서열로 치환했다(도 2)). 이종 단백질을 주변세포질 및(또는) 배양 배지로 분비하는 능력에 대해, 외막 포린 F(oprF) 및 포스페이트 결합 단백질(pbp) 신호 서열을 시험했다. oprF 및 pbp 리더 서열 제작물 모두 2O L 규모에서 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 내에서 발현되고 프로세싱되는 것으로 나타났다. 두 제작물 모두 ~9-10 g/L의 단백질을 생산했는데, 이들 대부분은 불용성 분획에서 발견되었다(도 3B). oprF 신호 서열의 약 50%가 프로세싱된 반면, pbp 신호의 ~100%는 프로세싱되었다(도 3A 및 3B).
또한, pbp:gal2 융합체로부터 프로세싱된 Gal2의 소량(<1%)은 배양 배지로 분비되는 것처럼 보였다(도 3B). oprF 신호 서열처럼, pelB 신호 서열은 프로세싱되는 것처럼 보였다(도 4). 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된 pelB-gal2 융합체는 ~1.6 g/L의 단백질을 생산했고 이 중 ~54%가 프로세싱되었다. 이 중, 11%는 가용성 분획에서 발견되었다. 피. 플루오레센스(P. fluorescens) pbp:gal2 제작물에 비해 이. 콜라이(E. coli) 제작물에 대해 보다 높은 백분율의 총 단백질이 가용성 분획에서 발견되었지만, 프로세싱된 단백질의 전체 수율은 피. 플루오레센스(P. fluorescens)에서 현저히 높았다.
분비된 Gal2 발효 요약(*BSA 표준과 비교)
이. 콜라이( E. coli ) 피. 플루오레센스 ( P. fluorescens ) Pf/Ec
발효 시간(hr) 8-9 50-70 8
최대 Gal2 역가(*g/L) 1.6(0.8 프로세싱된) 9.3(25% cv) 6(12)
건조 바이오매스(g/L) 18 (7O) 4
Gal2/바이오매스(%w/w) 8.9(4.4 프로세싱된) 13 1.5(3)
scFv 활성의 분석: 정제된 Gal13 및 Gal2 항-β-갈락토시다제 scFv의 활성을 측정하기 위해 효소 결합 면역검정법(ELISA)을 개발했다. 변화하는 양의 정제된 scFv를 β-갈락토시다제로 코팅된 마이크로플레이트 웰에 첨가했다. 결합된 항체를 항-His 태그 항체 및 알칼리성 포스파타제에 결합된 항-마우스 항체로 검출했다(도 5A). β-갈락토시다제에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 양성 대조군으로 사용했다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, 소규모 발현 실험에서 정제된 Gal2 항체는 현저한 활성을 나타냈다. 이 결과들은 봉입체(Gal2)로부터 단리된, 탈변성가능한 활성 항체를 보여준다.
실시예 3: 이. 콜라이( E. coli ) 대 피. 플루오레센스( P. fluorescens )에서 항-디곡신 scFv의 분비.
항-디곡신 scFv를 이. 콜라이(E. coli)에서 분비 발현시키기 위해 pET27d 벡터에 클로닝했다. 항-디곡신 scFv를 pelB 리더에 번역 융합시켜 pDOW1153을 제조했다. 피. 플루오레센스(P. fluorescens)에서는, 항-디곡신 scFv를 포스페이트 결합 단백질 분비 신호 서열에 번역 융합시켜 pDOW1142를 제조했다. SDS-PAGE(도 6) 및 웨스턴 분석(도 7) 결과, 피. 플루오레센스(P. fluorescens)와 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된 항-디곡신 scFv는 모두 불용성이었다. 이. 콜라이(E. coli) 클론은 도입 3시간 후 60 ㎍/ml의 단백질을 생산했고, pelB 분비 리더는 프로세싱되지 않은 것으로 보였다. 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 클론 pDOW1142는 BSA 표준과 비교해 SDS-PAGE의 밀도법 측정시 1.23 mg/ml의 단백질을 생산해, pDOW1153보다 ~20X 많은 단백질을 생산했다(도 8). pDOW1142를 보유하고 있는 피. 플루오레센스(P. fluorescens)에 의한 항-디곡신 scFv의 발현은, 2O L 규모에서 밀도법으로 측정시 ~15-20 g/L로 나타났다(데이터를 도시하지는 않음). 진탕 플라스크 규모에서 관찰시, 모든 단백질은 적절하게 프로세싱된 것으로 보였다.
정제된 항-디곡신 scFv 활성의 분석. 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 및 이. 콜라이(E. coli) 제작물 모두로부터 항-디곡신 scFv를 정제했다. 효소-결합 면역검정법(ELISA)을 사용하여 활성을 분석했다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 분비 제작물 pDOW1142을 보유하는 피. 플루오레센스(P. fluorescens)로부터 단리된 항-디곡신 scFv는, 폴리클로날 항체 대조군이 그러한 것처럼 활성인 것으로 나타났다. 그러나, 이. 콜라이(E. coli) 세포질 제작물 pDOW1152는 활성 항-디곡신 scfV를 포함하는 것으로 밝혀진 반면, 분비 항-디곡신 scFv 제작물 pDOW1153을 보유하고 있는 이. 콜라이(E. coli)로부터 정제된 단백질은 불활성이며 대부분 프로세싱되지 않은 것으로 나타났다(도 10).
이러한 결과들은 피. 플루오레센스(P. fluorescens)가 이. 콜라이(E. coli) 분비 제작물보다 19x 더 많은 단백질을 생산한다는 것을 입증하고 있다. 더욱이, 이. 콜라이(E. coli) 제작물에 사용된 pelB 분비 신호는 피. 플루오레센스(P. fluorescens)의 포스페이트 결합 단백질 분비 신호처럼 효과적으로 프로세싱되지는 않는 것처럼 보였다. 단백질은 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 및 이. 콜라이(E. coli)에서 모두 거의 완전히 불용성이었다. 그러나, 이. 콜라이(E. coli) 세포질 단백질과 함께 정제된 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 분비 단백질은 활성인 것으로 나타났다.
실시예 4. pbp:gal2의 특징화를 위한 MALDI-TOF 분석
매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간(Matrix-assisted laser desorption time-of-flight; MALDI-TOF) 질량 분광분석법을 사용하여 분비된 성숙 단백질 pbp:gal2의 아미노산 조성을 특징화하고, 추정 신호 펩티다제 절단이 pbp 신호 펩티드에 대한 추정 신호 펩티다제 절단 부위에서 일어났는지를 검증했다. 이 분석을 위해 pbp:gal2에 대해 펩티드 질량 지문(peptide mass fingerprint)을 얻었고, 이 데이터를 추론된 아미노산 서열의 이론적 펩티드 질량 지문과 비교했다. 이 펩티드 질량 지문을 생성하기 위해 단백질을 엔도뉴클레아제 Lys-C로 분해하고, 이로부터 생성된 펩티드의 질량을 측정했다. N-말단 펩티드 서열을 포스트-소스-디케이(MALDI-PSD)로 측정했다. 프로세싱되지 않은 단백질에 상응하는 펩티드 질량은 관찰하지 않았다. 결과는 예측한 대로였다(데이터는 도시하지 않음).
실시예 5: pbp-hGH 융합체의 제작, 발현 및 특징화
피. 플루오레센스(P. fluorescens) 포스페이트 결합 단백질 분비 리더를 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자의 성숙 도메인 N-말단에 융합하고, 주변세포질로의 분비에 대해 시험했다.
주형으로서 피. 플루오레센스(P. fluorescens) pbp 신호 서열 클론으로부터 sig_pbp_for(서열 17) 및 pbp_hgh(
Figure 112006035007397-PCT00007
; 서열 21) 프라이머를 사용하여 pbp 신호-서열 코딩 영역을 PCR 증폭한 다음, 겔-정제했다. 이로부터 신호 펩티드 코딩 서열 및 hGH의 성숙 도메인 5' 말단에 대한 코딩 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 단편이 생산되었다.
hGH의 성숙 도메인만을 증폭하도록 설계된 프라이머 ELVIfor(
Figure 112006035007397-PCT00008
; 서열 22) 및 ELVIrev (
Figure 112006035007397-PCT00009
; 서열 23)를 사용하여, 인간 뇌하수체 cDNA 라이브러리(클론테크(Clontech), 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 인간 성장 호르몬을 코딩하는 cDNA를 PCR-증폭하고 pMYC1803/SpeI XhoI에 클로닝하여, pDOW2400을 형성했다. 프라이머 pbp_hgh_revcomp(
Figure 112006035007397-PCT00010
; 서열 24) 및 hgh_rev (
Figure 112006035007397-PCT00011
; 서열 25)를 사용하여 pDOW2400으로부터 성숙 hGH 유전자를 증폭한 다음, 스트라타프렙(Strataprep) 컬럼(스트라타진)으로 정제하여 프라이머 및 기타 반응 성분들을 제거했다. pbp-hGH 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해, 2개의 PCR 반응물을 조합하고 sig_pbp_for(서열 17) 및 hgh_rev(서열 25)로 다시 증폭하여 두 조각을 연결하였다. 이 단편을 pDOW1269에 라이게이션하여 pDOW1323-10을 형성했다(pbp-hGH를 tac 프로모터 조절하에 둠). 라이게이션 혼합물을 피. 플루오레센스(P. fluorescens)로 형질전환했다. 이 융합체의 DNA 및 아미노산 서열은 (서열 26) 및 (서열 27)에 각각 나타냈다.
Figure 112006035007397-PCT00012
이로부터 제조된 균주들을 먼저 진탕 플라스크 규모에서 시험했다. 프로세싱된 단백질 및 프로세싱되지 않은 단백질에 대해 예상되는 크기의 유도된 밴드(각각 22.2 kDa 및 24.5 kDa)를 SDS-PAGE로 검출했다. 약 절반의 단백질이 프로세싱되었고(주변세포질로의 국소화를 나타냄), 프로세싱된 단백질의 약 절반은 가용성 분획에서, 그리고 절반은 불용성 분획에 존재했다(데이터는 도시하지 않음). 발현 연구를 20-L의 바이오리액터로 스케일업했다. 쿠마씨-염색한 SDS-PAGE 겔의 밀도법 측정 결과, 생산된 전체 hGH의 18%가 프로세싱되었고 가용성이었다. 균주는 모든 형태의 hGH를 3.2 g/L 생산했고, 프로세싱되고 가용성인 hGH는 0.6 g/L였다.
실시예 6: 피. 플루오레센스( P. fluorescens )에서 Skp 섀퍼론 단백질의 발현
천연 리더 서열을 갖는 이. 콜라이(E. coli) Skp 단백질을 피. 플루오레센스(P. fluorescens)에서 발현시켰다(도 10). 배양 24시간 후, 5 mM의 벤조에이트를 첨가하여 Skp를 유도했다(벤조에이트 프로모터는 PCT 공보 WO 04/005221에 기재되어 있음). 유도 12시간 후, 유도된 단백질 및 유도되지 않은 단백질 샘플을 20,00Og에서 원심분리하여 가용성 및 불용성 분획으로 분리했다. 단백질은 4-12% NuPAGE 상에서 MES 완충액으로 분리했다. 유도된 가용성 샘플에서만 약 17 kDa 분자량에서 이. 콜라이(E. coli) Skp 단백질이 관찰되었다(도 10에서 화살표로 표시).
단백질은 MALDI 포스트 소스 디케이(PSD)에 의해 Skp로 확인되었다. 잘라낸 17 kDa 단백질 밴드의 키모트립신 분해물을 준비했다. Skp의 이론적인 분해물로부터 예측된 크기와 매치되는 2개의 키모트립신 단편이 관찰되었다(표 8). 1378.7 m/z에서 질량 이온을 갖는 추정 N-말단 펩티드를 MALDI-PSD로 추가 분석한 결과, 예상되던 N-말단 아미노산 서열인 ADKIAIVNMGSLF로 밝혀졌는데, 이는 리더 서열이 예상되던 바와 같이 Ala20 와 Ala21 사이의 프로세싱된 부위에 상응하여 제거되었음을 나타낸다(도 11).
Figure 112006035007397-PCT00013
실시예 7: 이. 콜라이( E. coli )에서 피. 플루오레센스( P. fluorescens ) 신호 서열의 발현
피. 플루오레센스(P. fluorescens) 유래의 신호 서열은 이. 콜라이(E. coli)에서 기능하여, Pbp:Gal2 단백질이 프로세싱되어 주변세포질로 분비되도록 한다.
이. 콜라이(E. coli) 균주 JM109(프로메가)를 pDOW1123(pbp:gal2 융합체) 또는 pDOW1141(oprF:gal2 융합체)로 형질전환했다. Pbp:gal2를 코딩하는 pDOW1123으로 형질전환된 JM109는, 37℃에서 성장시킬 경우 0.4 mM 및 0.01 mM의 IPTG로 유도시 Gal2 단백질을 발현했다(도 12). 0.01 mM의 IPTG로 유도된 배양물은 양성 대조군에 필적하는 발현을 나타냈다(DC265, 피. 플루오레센스(P. fluorescens)에서 발현된 bpb:gal2).
도 12에서 28 kDa 영역에서 관찰된 2개의 밴드는 신호 서열의 세포내 프로세싱(절단) 전과 후의 Gal2를 나타낸다. 이들 두 밴드는 SDS-PAGE에 의해 불용성 분획에서 관찰되었고, DC245에 의해 생산된 프로세싱된 Gal2 및 프로세싱되지 않은 Gal2와 함께 이동했다(도 13). MALDI-PSD에 의한 각각의 밴드를 N-말단 시퀀싱하여, 아래쪽 밴드는 Gal2이며 예상하던 대로 프로세싱되었음을 확인했다(FPTIP LSRPF). 위쪽 밴드는 프로세싱되지 않은 Gal2 서열을 포함하고 있었다. SDS-PAGE 겔 상에서, 주변세포질 샘플은 프로세싱된 Gal2와 일치하는 크기의 밴드를 나타냈다(도 14).
0.01 mM IPTG로 유도하고 37℃에서 성장시킨 JM109/pDOW1123 샘플의 가용성, 불용성 및 주변세포질 분획에 대해 웨스턴 블롯을 수행했다. 그 결과, 세 분획 모두에서 프로세싱된 Gal2 단백질이 발견되는 것으로 나타났다(도 15).
SEQUENCE LISTING <110> Retallack, Diane M. <120> IMPROVED EXPRESSION SYSTEMS WITH SEC-SYSTEM SECRETION <130> 00588.105021 <140> 10/996,007 <141> 2004-11-22 <160> 31 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> P. fluorescens <220> <223> Phosphate binding protein (pbp) secretion signal peptide <400> 1 Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala 20 <210> 2 <211> 72 <212> DNA <213> P. fluorescens <220> <223> Phosphate binding protein (pbp) secretion signal <400> 2 atgaaactga aacgtttgat ggcggcaatg acttttgtcg ctgctggcgt tgcgaccgcc 60 aacgcggtgg cc 72 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> P. fluorescens <220> <223> Outer Membrane Porin E (OprE) secretion signal peptide <400> 3 Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gln Gln Ala Gly Ala 20 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> P. fluorescens <220> <223> Outer Membrane Porin E (OprE) secretion signal <400> 4 atgaagaagt ccaccttggc tgtggctgta acgttgggcg caatcgccca gcaagcaggc 60 gct 63 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> P. fluorescens <220> <223> Azurin secretion signal peptide <400> 5 Met Phe Ala Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly 1 5 10 15 Gln Leu Leu Ala 20 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> P. fluorescens <220> <223> Azurin secretion signal <400> 6 atgtttgcca aactcgttgc tgtttccctg ctgactctgg cgagcggcca gttgcttgct 60 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> P. fluorescens <220> <223> Lys-Arg-Orn binding protein secretion signal peptide <400> 7 Met Gln Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala 1 5 10 15 Phe Ser Ala Thr Ala Met Ala 20 <210> 8 <211> 69 <212> DNA <213> P. fluorescens <220> <223> Lys-Arg-Orn binding protein secretion signal <400> 8 atgcagaact ataaaaaatt ccttctggcc gcggccgtct cgatggcgtt cagcgccacg 60 gccatggca 69 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> P. fluorescens <220> <223> Iron (III) binding protein [Fe(III)bp] secretion signal peptide <400> 9 Met Met Ile Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser 20 25 30 <210> 10 <211> 96 <212> DNA <213> P. fluorescens <220> <223> Iron (III) binding protein [Fe(III)bp] secretion signal <400> 10 atgatgatcc gtgacaaccg actcaagaca tcccttctgc gcggcctgac cctcacccta 60 ctcagcctga ccctgctctc gcccgcggcc cattct 96 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> P. fluorescens <220> <223> Lipoprotein B (LprB) secretion signal peptide <400> 11 Met Ile Lys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ala <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> lipoprotein B (LprB) secretion signal <400> 12 atgatcaaac gcaatctgct ggttatgggc cttgccgtgc tgttgagcgc t 51 <210> 13 <211> 277 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> oprF:gal2 fusion <400> 13 Met Lys Leu Lys Asn Thr Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala 1 5 10 15 Ala Thr Ser Phe Gly Val Leu Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 20 25 30 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 35 40 45 Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln 50 55 60 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val 85 90 95 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala 100 105 110 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Gly Pro Ala 115 120 125 Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly 165 170 175 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp 180 185 190 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 195 200 205 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 225 230 235 240 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 245 250 255 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His 260 265 270 His His His His His 275 <210> 14 <211> 277 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> pbp:gal2 fusion <400> 14 Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 20 25 30 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 35 40 45 Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln 50 55 60 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val 85 90 95 Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala 100 105 110 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Gly Pro Ala 115 120 125 Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly 165 170 175 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp 180 185 190 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 195 200 205 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 225 230 235 240 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 245 250 255 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His 260 265 270 His His His His His 275 <210> 15 <211> 834 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Phosphate binding protein secretion leader-gal2-His tag fusion <400> 15 atgaaactga aacgtttgat ggcggcaatg acttttgtcg ctgctggcgt tgcgaccgcc 60 aacgcggtgg ccgcccaggt gcagctgcag gagtcgggcc caggactggt gaagccttcg 120 gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggtggttcca tcagtagtta tcactggagc 180 tggatccggc agcccccagg gaagggactg gagtggattg ggtatatcta ttacagtggg 240 agcaccaact acaacccctc cctcaagaat cgagtcacca tatctgtaga cacgtccaag 300 aaccagttct ccctgaacct gaggtctgtg accgctgcag acacggccgt gtattactgt 360 gcgcgaggaa cgtatggccc agccggagat gcttttgata tctgggggca agggaccacg 420 gtcaccgtct cgagtggtgg aggcggttca ggcggaggtg gcagcggcgg tggcggatcg 480 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctattggaga cagagtcacc 540 atcacctgcc gggccagtga gggtatttat cactggttgg cctggtatca gcagaagcca 600 gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcctctagtt tagccagtgg ggccccatca 660 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 720 gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtaatt atccgctcac tttcggcgga 780 gggaccaagc tggagatcaa acgtgcggcc gcacatcacc atcatcacca ttaa 834 <210> 16 <211> 277 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Phosphate binding protein secretion leader-gal2-His tag fusion peptide <400> 16 Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 20 25 30 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 35 40 45 Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln 50 55 60 Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val 85 90 95 Asp Thr Ser Lys Met Gln Phe Ser Leu Asn Leu Arg Ser Val Thr Ala 100 105 110 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Gly Pro Ala 115 120 125 Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly 165 170 175 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp 180 185 190 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 195 200 205 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Phe Ile Ser Ser Leu Gln Pro 225 230 235 240 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 245 250 255 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His 260 265 270 His His His His His 275 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sig_pbp_for <400> 17 gctctagagg aggtaactta tgaaactgaa acg 33 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> pbp_gal2SOE_rev <400> 18 ctgcacctgg gcggccaccg cgtt 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> pbp_gal2SOE_for <400> 19 aacgcggtgg ccgcccaggt gcag 24 <210> 20 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> scFv2rev <400> 20 acgcgtcgac ttattaatgg tgatgatggt gatgtgcggc cgcacgtttg atc 53 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> pbp_hgh <400> 21 gggaatggtt gggaaggcca ccgcgttggc 30 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ELVIfor <400> 22 agagaactag taaaaaggag aaatccatgg ctacaggctc ccggacgtcc 50 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer ELVIrev <400> 23 agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccac 38 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer pbp_hgh_revcomp <400> 24 gccaacgcgg tggccttccc aaccattccc 30 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer hgh_rev <400> 25 agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccacag agcggcac 48 <210> 26 <211> 648 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Phosphate binding protein secretion leader - human growth hormone fusion <400> 26 atgaaactga aacgtttgat ggcggcaatg acttttgtcg ctgctggcgt tgcgaccgcc 60 aacgcggtgg ccttcccaac cattccctta tccaggcctt ttgacaacgc tatgctccgc 120 gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac acctaccagg agtttgaaga agcctatatc 180 ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag aacccccaga cctccctctg tttctcagag 240 tctattccga caccctccaa cagggaggaa acacaacaga aatccaacct agagctgctc 300 cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc 360 ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac 420 ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg aggctggaag atggcagccc ccggactggg 480 cagatcttca agcagaccta cagcaagttc gacacaaact cacacaacga tgacgcacta 540 ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc 600 ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag ggcagctgtg gcttctaa 648 <210> 27 <211> 215 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Phosphate binding protein secretion leader - human growth hormone fusion peptide <400> 27 Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg 20 25 30 Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala 35 40 45 Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln 50 55 60 Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu 65 70 75 80 Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu 100 105 110 Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly 115 120 125 Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly 130 135 140 Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly 145 150 155 160 Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn 165 170 175 Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys 180 185 190 Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser 195 200 205 Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Skp chymotrypsin peptide #1 <400> 28 Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu Phe 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Skp chymotrypsin peptide #2 <400> 29 Gln Gln Val Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn Glu 1 5 10 15 Phe <210> 30 <211> 161 <212> PRT <213> E. coli unprocessed Skp protein <400> 30 Met Lys Lys Trp Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ala Gln Ala Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Gln Val Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn 35 40 45 Glu Phe Lys Gly Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu 50 55 60 Gln Ala Lys Met Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg 65 70 75 80 Thr Lys Leu Glu Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln 85 90 95 Lys Ala Gln Ala Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala 115 120 125 Asn Ser Gln Asp Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr 130 135 140 Asn Ser Ser Asp Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val 145 150 155 160 Lys <210> 31 <211> 140 <212> PRT <213> E. coli processed Skp protein <400> 31 Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu Phe Gln Gln Val 1 5 10 15 Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn Glu Phe Lys Gly 20 25 30 Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu Gln Ala Lys Met 35 40 45 Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg Thr Lys Leu Glu 50 55 60 Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln Lys Ala Gln Ala 65 70 75 80 Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu Arg Gly Lys Leu 85 90 95 Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala Asn Ser Gln Asp 100 105 110 Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr Asn Ser Ser Asp 115 120 125 Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val 130 135 140

Claims (151)

  1. 포스페이트 결합 단백질(pbp) 분비 신호, 외막 포린 E(OprE) 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 펩티드에 대한 분비 신호 코딩 서열, 또는 상기 코딩 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열이 포스페이트 결합 단백질(pbp) 분비 신호, 또는 상기 pbp 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열이 서열 2와 80% 이상 또는 85% 이상 동일한 것인 핵산.
  4. 제2항에 있어서, 상기 서열이 서열 2와 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 것인 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 상기 서열이 pbp 분비 신호를 코딩하는 서열, 서열 2의 서열, 서열 2와 80% 이상 동일한 서열, 서열 2와 85% 이상 동일한 서열, 서열 2와 90% 이상 동일한 서열, 및 서열 2와 95% 이상 동일한 서열로부터 선택되는 핵산 서 열에 혼성화하는 것인 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 핵산 서열을 발현하도록 선택된 숙주 유기체의 코돈 선호성(preference)을 반영하도록 조정된, 서열 2의 서열을 포함하는 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 상기 서열이 외막 포린 E(OprE) 분비 신호, 또는 상기 OprE 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 상기 서열이 서열 4와 80% 이상, 또는 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 것인 핵산.
  9. 제1항에 있어서, 상기 서열이 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 상기 서열이 서열 6과 80% 이상, 또는 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 것인 핵산.
  11. 제1항에 있어서, 상기 서열이 아주린 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 서열이 서열 8과 80% 이상, 또는 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 것인 핵산.
  13. 제1항에 있어서, 상기 서열이 철(III) 결합 단백질 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 상기 서열이 서열 10과 80% 이상, 또는 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 것인 핵산.
  15. 제1항에 있어서, 상기 서열이 지단백질(lipoprotein) B 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 서열이 서열 12와 80% 이상, 또는 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 것인 핵산.
  17. 제1항에 있어서, 상기 서열이 서열 4와 80% 이상 동일한 서열, 서열 6과 80% 이상 동일한 서열, 서열 8과 80% 이상 동일한 서열, 서열 10과 80% 이상 동일한 서열, 및 서열 12와 80% 이상 동일한 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 혼성화하는 것인 핵산.
  18. 제1항에 있어서, 핵산 서열을 발현하도록 선택된 숙주 유기체의 코돈 선호성(preference)을 반영하도록 조정된, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 핵산.
  19. 제5항 또는 제17항에 있어서, 상기 혼성화가 엄격한 조건하에서 이루어지는 것인 핵산.
  20. 제19항에 있어서, 상기 혼성화가 68℃에서 이루어지는 것인 핵산.
  21. pbp 분비 신호, OprE 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 펩티드를 코딩하는 핵산 분비 신호 서열, 상기 분비 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열, 또는 상기 분비 신호 서열에 혼성화하는 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12로 구성된 군으로부터 선택되는 것이거나, 분비 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열인 벡터.
  23. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 포스페이트 결합 단백질(pbp) 분비 신호, 또는 상기 pbp 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 서열 2와 80% 이상 또는 85% 이상 동일한 것인 벡터.
  25. 제23항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 서열 2와 90% 이상 또는 95% 이상 동일한 것인 벡터.
  26. 제23항에 있어서, 핵산 서열을 발현하도록 선택된 숙주 유기체의 코돈 선호성(preference)을 반영하도록 조정된, 서열 2의 분비 신호 서열을 포함하는 벡터.
  27. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 외막 포린 E(OprE) 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 벡터.
  28. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 벡터.
  29. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 아주린 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 벡터.
  30. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 철(III) 결합 단백질 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 벡터.
  31. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 지단백질 B 분비 신호, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 코딩하는 것인 벡터.
  32. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 서열 4와 80% 이상 동일한 서열, 서열 6과 80% 이상 동일한 서열, 서열 8과 80% 이상 동일한 서열, 서열 10과 80% 이상 동일한 서열, 및 서열 12와 80% 이상 동일한 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 혼성화하는 것인 벡터.
  33. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 핵산 서열을 발현하도록 선택된 숙주 유기체의 코돈 선호성(preference)을 반영하도록 조정된, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 및 서열 12로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  34. 제21항에 있어서, 분비 신호 서열에 혼성화하는 서열을 포함하는 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 혼성화가 엄격한 조건하에서 이루어지는 것인 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 상기 혼성화가 68℃에서 이루어지는 것인 벡터.
  37. 제21항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 관심 대상인 재조합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 숙주에 대해 천연인 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 피. 플루오레센스(P. fluorescens)에 대해 천연인 벡터.
  40. 제37항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 숙주 유기체에 대해 천연이 아닌 단백질 또는 펩티드로부터 유래된 것인 벡터.
  41. 제37항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 슈도모나드(Pseudomonad)가 아닌 유기체로부터 유래된 것인 벡터.
  42. 제37항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 진핵 세포 유기체로부터 유래된 것인 벡터.
  43. 제37항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 포유류 유기체로부터 유래된 것인 벡터.
  44. 제37항에 있어서, 신호 펩티드 서열과 재조합 단백질 또는 펩티드 서열 간에 연결(linkage) 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  45. 제44항에 있어서, 상기 연결 서열이 신호 펩티다제에 의해 절단될 수 있는 것인 벡터.
  46. 제37항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드 서열이 제2의 신호 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제2의 신호 서열이 외막 분비 신호에 표적화된 서열을 포함하는 것인 벡터.
  48. 제21항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는 벡터.
  49. 제48항에 있어서, 상기 프로모터가 박테리아 숙주 세포에 대해 천연인 벡터.
  50. 제48항에 있어서, 상기 프로모터가 박테리아 숙주 세포에 대해 천연이 아닌 벡터.
  51. 제48항에 있어서, 상기 프로모터가 이. 콜라이(E. coli)에 대해 천연인 벡터.
  52. 제48항에 있어서, 상기 프로모터가 유도성 프로모터인 벡터.
  53. 제48항에 있어서, 상기 프로모터가 lac 프로모터 또는 lac 프로모터의 유도체인 벡터.
  54. pbp 분비 신호, OprE 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 펩티드를 코딩하는 핵산 분비 신호 서열, 상기 분비 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열, 상기 분비 신호 서열에 혼성화하는 서열, 또는 상기 코딩 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 재조합 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 발현 벡터 내에 존재하는 것인 재조합 세포.
  56. 제54항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 pbp 서열인 재조합 세포.
  57. 제54항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 OprE 서열인 재조합 세포.
  58. 제54항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 관심 대상인 재조합 단백질 또는 펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 재조합 세포.
  59. 제54항에 있어서, 상기 핵산에 의해 코딩된 분비 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된 관심 대상인 단백질 또는 펩티드를 발현하는 재조합 세포.
  60. 제59항에 있어서, 단백질 또는 펩티드가 세포의 주변세포질 구획(periplasmic compartment)에서 발현되는 재조합 세포.
  61. 제54항에 있어서, 세포 내의 효소가 관심 대상인 단백질 또는 펩티드로부터 신호 펩티드를 절단하는 재조합 세포.
  62. 제54항에 있어서, 박테리아 숙주로부터 유래된 것인 재조합 세포.
  63. 제62항에 있어서, 상기 숙주가 슈도모나드(Pseudomonad)인 재조합 세포.
  64. 제63항에 있어서, 상기 숙주가 피. 플루오레센스(P. fluorescens)인 재조합 세포.
  65. 제62항에 있어서, 상기 숙주가 이. 콜라이(E. coli)인 재조합 세포.
  66. pbp 분비 신호, OprE 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 펩티드를 코딩하는 아미노산 서열, 또는 상기 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 단리된 펩티드.
  67. 제66항에 있어서, 상기 분비 펩티드가 포스페이트 결합 단백질(pbp) 분비 신호, 또는 pbp 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  68. 제66항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 1의 아미노산 2-24와 90% 이상 동일한 것인 펩티드.
  69. 제66항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 1의 아미노산 2-24와 95% 이상 동일한 것인 펩티드.
  70. 제66항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 1의 아미노산 2-24와 98% 이상 동일한 것인 펩티드.
  71. 제66항에 있어서, 상기 분비 펩티드가 외막 포린 E(OprE) 분비 신호, 또는 OprE 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  72. 제66항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열 3의 아미노산 2-21과 90% 이상 동일한 것인 펩티드.
  73. 제66항에 있어서, 상기 분비 펩티드가 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 또는 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  74. 제66항에 있어서, 상기 분비 펩티드가 아주린 분비 신호, 또는 이 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  75. 제66항에 있어서, 상기 분비 펩티드가 철(III) 결합 단백질 분비 신호, 또는 이 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  76. 제66항에 있어서, 상기 분비 펩티드가 지단백질 B 분비 신호, 또는 이 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  77. 제66항에 있어서, 관심 대상인 재조합 단백질 또는 펩티드에 작동가능하게 연결된 펩티드.
  78. 제77항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 유기체가 아닌 유기체로부터 유래된 것인 펩티드..
  79. a. 숙주 세포; 및
    b. pbp 분비 신호, OprE 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 신호, 또는 이 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 벡터
    를 포함하는, 재조합 단백질 또는 펩티드를 발현하기 위한 발현 시스템.
  80. 제79항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 pbp 서열인 시스템.
  81. 제79항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 OprE 서열인 시스템.
  82. 제79항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호인 시스템.
  83. 제79항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 아주린 분비 신호인 시스템.
  84. 제79항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 철(III) 결합 단백질 분비 신호인 시스템.
  85. 제79항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 지단백질 B 분비 신호인 시스템.
  86. 제79항에 있어서, 상기 분비 신호 서열이 관심 대상인 재조합 단백질 또는 펩티드에 작동가능하게 연결된 것인 시스템.
  87. 제79항에 있어서, 상기 세포가 핵산에 의해 코딩되는 분비 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된 관심 대상인 단백질 또는 펩티드를 발현하는 시스템.
  88. 제87항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩티드가 세포의 주변세포질 구획에서 발현되는 시스템.
  89. 제87항에 있어서, 세포 내의 효소가 관심 대상인 단백질 또는 펩티드로부터 신호 펩티드를 절단하는 시스템.
  90. 제79항에 있어서, 상기 세포가 박테리아 숙주로부터 유래된 것인 시스템.
  91. 제90항에 있어서, 상기 숙주가 슈도모나드(Pseudomonad)인 시스템.
  92. 제91항에 있어서, 상기 숙주가 피. 플루오레센스(P. fluorescens)인 시스템.
  93. 제90항에 있어서, 상기 상기 숙주가 이. 콜라이(E. coli)인 시스템.
  94. 제79항에 있어서, 발효 배지를 추가로 포함하는 시스템.
  95. 제94항에 있어서, 상기 발효 배지가 화학 유도 인자를 포함하는 것인 시스템.
  96. pbp 분비 신호, OprE 분비 신호, Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호, 아주린 분비 신호, 철(III) 결합 단백질 분비 신호 및 지단백질 B 분비 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Sec-시스템 분비 신호, 또는 이 신호 서열과 실질적으로 상동적인 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 세포를 제공하고, 재 조합 단백질 또는 펩티드가 발현되는 조건하에서 상기 세포를 성장시키는 것을 포함하는, 숙주 세포에서의 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 분비 신호가 pbp 분비 신호인 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 분비 신호가 OprE 분비 신호인 방법.
  99. 제96항에 있어서, 상기 분비 신호가 Lys-Arg-Orn 결합 단백질 분비 신호인 방법.
  100. 제96항에 있어서, 상기 분비 신호가 아주린 분비 신호인 방법.
  101. 제96항에 있어서, 상기 분비 신호가 철(III) 결합 단백질 분비 신호인 방법.
  102. 제96항에 있어서, 상기 분비 신호가 지단백질 B 분비 신호인 방법.
  103. 제96항에 있어서, 상기 세포를 무기염 배지에서 성장시키는 방법.
  104. 제96항에 있어서, 상기 세포를 높은 세포 밀도에서 성장시키는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 세포를 20 g/L 이상의 세포 밀도에서 성장시키는 방법.
  106. 제96항에 있어서, 재조합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  107. 제96항에 있어서, 상기 재조합 단백질을 친화력 크로마토그래피로 정제하는 방법.
  108. 제96항에 있어서, 재조합 단백질과 분비 신호의 작동가능한 연결이 숙주 세포에 대해 천연인 효소에 의해 절단될 수 있는 것인 방법.
  109. 제109항에 있어서, 상기 분비 신호가 발현 동안 재조합 단백질로부터 절단되는 것인 방법.
  110. 제96항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 숙주 유기체에 대해 천연인 단백질 또는 펩티드로부터 유래된 것인 방법.
  111. 제96항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 유기체에 대해 천연인 단백질 또는 펩티드로부터 유래된 것인 방법.
  112. 제96항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 숙주 유기체에 대해 천연이 아닌 단백질 또는 펩티드로부터 유래된 것인 방법.
  113. 제96항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 슈도모나드(Pseudomonad)가 아닌 유기체로부터 유래된 것인 방법.
  114. 제96항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 진핵 세포 유기체로부터 유래된 것인 방법.
  115. 제96항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 2개 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  116. 제96항에 있어서, 세포 내의 재조합 단백질에 하나 이상의 디술파이드 결합이 형성되는 방법.
  117. 제96항에 있어서, 신호 펩티드 서열과 재조합 단백질 또는 펩티드 서열 간에 연결 서열을 추가로 포함하는 방법.
  118. 제96항에 있어서, 50% 이상의 재조합 단백질이 천연 아미노 말단을 포함하는 방법.
  119. 제96항에 있어서, 80% 이상의 재조합 단백질이 천연 아미노 말단을 포함하는 방법.
  120. 제96항에 있어서, 90% 이상의 재조합 단백질이 천연 아미노 말단을 포함하는 방법.
  121. 제96항에 있어서, 50% 이상의 재조합 단백질이 활성인 방법.
  122. 제96항에 있어서, 80% 이상의 재조합 단백질이 활성인 방법.
  123. 제96항에 있어서, 50% 이상의 재조합 단백질이 주변세포질 구획에서 발현되는 방법.
  124. 제96항에 있어서, 75% 이상의 재조합 단백질이 주변세포질 구획에서 발현되는 방법.
  125. 제96항에 있어서, 90% 이상의 재조합 단백질이 주변세포질 구획에서 발현되는 방법.
  126. 제96항에 있어서, 상기 세포가 슈도모나드(Pseudomonad) 세포인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 세포가 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 세포인 방법.
  128. 제96항에 있어서, 상기 세포가 이. 콜라이(E. coli) 세포인 방법.
  129. 재조합 Sec 시스템 분비 신호 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 세포를 제공하고, 단백질 또는 펩티드가 발현되는 조건하에서 상기 세포를 성장시키는 것을 포함하는, 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 개선된 발현 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 신호 서열이 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 게놈으로부터 유래된 것인 방법.
  131. 제129항에 있어서, 상기 신호 서열이 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 게놈으로부터 유래된 것이 아닌 방법.
  132. 제129항에 있어서, 상기 신호 서열이 이. 콜라이(E. coli) 게놈으로부터 유 래된 것인 방법.
  133. 제129항에 있어서, 상기 세포를 무기염 배지에서 성장시키는 방법.
  134. 제129항에 있어서, 상기 세포를 높은 세포 밀도에서 성장시키는 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 세포를 20 g/L 이상의 세포 밀도에서 성장시키는 방법.
  136. 제129항에 있어서, 재조합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  137. 제136항에 있어서, 상기 재조합 단백질을 친화력 크로마토그래피로 정제하는 방법.
  138. 제129항에 있어서, 재조합 단백질과 분비 신호의 작동가능한 연결이 숙주 세포에 대해 천연인 효소에 의해 절단될 수 있는 것인 방법.
  139. 제138항에 있어서, 상기 분비 신호가 발현 동안 재조합 단백질로부터 절단되는 것인 방법.
  140. 제129항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 슈도모나드(Pseudomonad) 유기체로부터 유래된 것인 방법.
  141. 제129항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 슈도모나드(Pseudomonad)가 아닌 유기체로부터 유래된 것인 방법.
  142. 제129항에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 펩티드가 진핵 세포 유기체로부터 유래된 것인 방법.
  143. 제129항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 2개 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  144. 제129항에 있어서, 세포 내의 재조합 단백질에 하나 이상의 디술파이드 결합이 형성되는 방법.
  145. 제129항에 있어서, 신호 펩티드 서열과 재조합 단백질 또는 펩티드 서열 간에 연결 서열을 추가로 포함하는 방법.
  146. 제129항에 있어서, 50% 이상의 재조합 단백질이 천연 아미노 말단을 포함하는 방법.
  147. 제129항에 있어서, 80% 이상의 재조합 단백질이 활성인 방법.
  148. 제129항에 있어서, 90% 이상의 재조합 단백질이 활성인 방법.
  149. 제129항에 있어서, 50% 이상의 재조합 단백질이 주변세포질 구획에서 발현되는 방법.
  150. 제129항에 있어서, 75% 이상의 재조합 단백질이 주변세포질 구획에서 발현되는 방법.
  151. 제129항에 있어서, 90% 이상의 재조합 단백질이 주변세포질 구획에서 발현되는 방법.
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