CN1882605A - 使用Sec－系统分泌的改进的表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明使用荧光假单胞菌Sec分泌系统描述了使用Sec－系统分泌信号肽制造重组蛋白的改进的方法和原核表达系统。本发明描述了特定的新型Sec－系统分泌信号肽作为重组蛋白和肽的改进分泌的融合蛋白和编码序列。

Description

使用Sec-系统分泌的改进的表达系统

相关申请的交叉参考

本申请要求2003年11月21日提交的名为“Improved ExpressionSystems With Sec-System Secretion”的美国临时申请60/524,124的优先权。

发明领域

本发明属于蛋白质制造领域并且是一种改进的通过使用Sec导向肽和荧光假单胞菌Sec分泌系统制造适当加工的外源蛋白的方法。

背景技术

美国食品药品管理局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)已经批准了超过150种重组产生的蛋白质和肽作为生物技术合成药和疫苗以及另外370种用于临床试验。与通过化学合成产生的小分子治疗剂不同，蛋白质和肽在活细胞内最有效地产生。然而，在细菌中制造重组蛋白的现有方法通常产生不当折叠、聚集或失活的蛋白质，并且许多类型的蛋白质要求二次修饰，这使用已知方法难以实现。

已知方法的一个主要问题在于在细胞质中形成由聚集蛋白构成的包含体，这在过量蛋白质在细胞中积聚时产生。重组蛋白制造中的另一问题是形成表达蛋白的恰当的二级和三级结构。一个障碍是细菌细胞质积极抑制了二硫键形成(其通常构成恰当蛋白质折叠的基础)(Derman等(1993)Science 262：1744-7)。因此，在细菌中进行制造时，许多重组蛋白，特别是真核来源的重组蛋白不当折叠和失活。

为提高重组系统中恰当折叠的蛋白质的产量，已经进行了许多尝试。例如，研究者改变了发酵条件(Schein(1989)Bio/Technology，7：1141-1149)，改变启动子强度或使用过度表达的伴侣蛋白(Hockney(1994)Trends Biotechnol.12：456-463)，这些有助于防止包含体的形成。

分泌

提高恰当折叠的蛋白质产量的另一方法是从细胞内环境中分泌蛋白质。在革兰氏阴性细菌中，细胞质分泌的蛋白质可以在周质空间中竖立(end up)、连接到外膜上，或在细胞外液体中。如果从细胞的细胞质中分泌出蛋白质，则通常不会形成由聚集蛋白构成的包含体。分泌到周质空间中还具有公知的促进恰当的二硫键形成的作用(Bardwell等(1994)Phosphate Microorg.270-5；Manoil(2000)Methods in Enz.326：35-47)。重组蛋白的分泌是有利的，因为这会产生更有效的蛋白质分离；可以促进转基因蛋白质的恰当折叠和二硫键形成，从而导致活性形式的蛋白质百分率的增加；可以减少包含体的形成并降低对宿主细胞的毒性；并且可以提高可溶形式的重组蛋白的百分率。相关蛋白质分泌进入培养基的能力也可能促进蛋白质制造的连续而非分批培养。

革兰氏阴性细菌已经演化出许多用于使蛋白质穿过其双重膜的有效输出的系统(参看图1)。这些分泌途径包括，例如：用于一步穿过内在质及外膜易位的ABC(I型)路径、Path/Fla(III型)路径和Path/Vir(IV型)路径；用于穿过质膜易位的Sec(II型)、Tat、MscL和Holins路径；和用于两步穿过内在质和外膜易位的Sec-加-fimbrial usher孔蛋白(FUP)、Sec-加-自动转运子(AT)、Sec-加-两partner分泌(TPS)、Sec-加-主末端分支(MTB)和Tat-加-MTB路径。并非所有细菌都具有所有这些分泌路径。

三种蛋白质系统(I、III和IV型)在单个能量结合步骤中同时穿过两膜分泌蛋白质。四种系统(Sec、Tat、MscL和Holins)仅穿过内膜分泌，另外四个系统(MTB、FUP、AT和TPS)仅穿过外膜分泌。

带有信号序列的肽的最常见分泌形式包括Sec系统。Sec系统负责使带有N-末端信号肽的蛋白质穿过细胞质膜输出(参看Agarraberesand Dice(2001)Biochim Biophys Acta.1513：1-24；Muller等(2001)Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.66：107-157)。在原核生物和真核生物中普遍发现Sec族蛋白复合物。细菌Sec系统包括转运蛋白、伴侣蛋白(SecB)或信号识别粒子(SRP)和信号肽酶(SPase I和SPase II)。大肠杆菌(E.coli)中的Sec转运复合物包括三种整合内膜蛋白，SecY、SecE和SecG，和细胞质ATPase、SecA。SecA吸收SecY/E/G复合物以形成活性易位通道。伴侣蛋白SecB结合到新生多肽链上以防止其折叠并将其导向SecA中。直线多肽链随后通过SecYEG通道转移，并在信号肽裂解之后，蛋白质在周质中折叠。三种辅助蛋白(SecD、SecF和YajC)形成了不是分泌所必须的但却在许多条件(特别是在低温)下最高10倍地刺激分泌的复合物。

转移到周质中(也就是通过II型分泌系统)的蛋白质还可以在进一步的步骤中被输出到细胞外介质中。其机制通常是通过自动转运子、两partner分泌系统、主末端分支系统或fimbrial usher孔蛋白。

在革兰氏阴性细菌中的十二种已知分泌系统中，八种采用了据发现作为表达蛋白的一部分的导向信号肽。这些信号肽与分泌系统的蛋白质互相作用，从而使细胞正确地将蛋白质引向其合适的目的地。这八种信号肽基分泌系统中的五种涉及Sec-系统。这五种被认为参与了Sec-依赖(Sec-dependent)的细胞质膜易位，而且在其中起作用的它们的信号肽可以被称作Sec依赖的分泌信号。产生恰当分泌信号的要点之一是确保信号被恰当地表达并从表达蛋白中裂解。

Sec-依赖的蛋白质输出的一个标志是在输出的蛋白质中存在短(大约30个氨基酸)的主要疏水的氨基末端信号序列。该信号序列辅助蛋白质输出并且在输出的蛋白质到达周质时被周质信号肽酶切除。典型的N-末端Sec-信号肽含有带有至少一个精氨酸或赖氨酸残基的N-区，然后是含有一段疏水残基的区，以及含有信号肽酶裂解位点的C-区。

已经研发出如下细菌蛋白制造系统——在该系统中，转基因蛋白结构通过基因工程设计成既包含相关蛋白质又包含试图将该蛋白质导出细胞质的分泌信号的融合蛋白。

已经研发出将蛋白质从细胞分泌到上清液中的方法。例如，Georgious的美国专利5,348,867集中于细胞表面上的肽表达。授予Korea Advanced Institute of Science and Technology的美国专利6,329,172描述了在荧光假单胞菌中的ABC转运子和通过使用这种与相关蛋白共表达的转运子将蛋白分泌到细胞外的方法。授予NovoNordisk的PCT公开WO 96/17943集中于通过从周质中渗漏来从细胞中进行蛋白质的细胞外表达，其使用了与相关蛋白质相连的A.lyticus蛋白酶I和某些杆菌蛋白酶的序列的一部分以将它们导向周质。授予Boehringer Ingelheim，Int.的PCT公开WO 02/40696和美国申请公开2003/0013150描述了使用细菌信号肽OmpA的蛋白质的细胞外表达。这些公开论述了OmpA单独与SecE相互作用或与包含氨基酸序列SEGN的蛋白质或肽结合相互作用。

提高表达的其它方法涉及将蛋白质导向周质。一些研究集中于非-Sec型分泌(参看，例如，授予Trustees of the University of Pennsylvania的PCT公开WO 03/079007；美国公开2003/0180937，授予Weiner andTurner的美国公开2003/0064435；和授予Research Foundaion of theState University of New York的PCT公开WO 00/59537)。然而，多数研究都集中于使用Sec-型分泌系统的外源蛋白分泌。

已经描述了许多用于表达重组肽或蛋白质的分泌信号。例如，授予Celtrix Pharmaceuticals，Inc.的美国专利5,914,254描述了使用来自白细胞介素-1-类蛋白质的融合partners和前导序列提高蛋白质的溶度和活性。

授予Genentech的美国专利4,963,495描述了使用原核信号序列(如大肠杆菌肠毒素的序列)的真核蛋白(特别是人类生长激素)表达。授予Genentech的欧洲专利0 177 343描述了周质HGH的表达，这可以通过使用P.aeruginosa肠毒素A信号序列来实现。

授予Biogen的美国专利5,082,783描述了来自最多具有中间强度的启动子(例如肌动蛋白)或有效地与DNA信号序列相连的异-1-细胞色素c启动子(例如来自酵母的Mfα1信号序列)的蛋白质(例如生长调节素C、组织纤溶酶原激活物或肿瘤坏死因子)的表达。

Pastan等的PCT公开WO 89/10971描述了使用OmpA信号序列在大肠杆菌中的假单胞菌外毒素表达，并且显示了周质和培养基中部分蛋白质的差异表达。

授予Novo Nordisk的美国专利6,156,552描述了使用信号序列在大肠杆菌或脂酶不足的门多萨假单胞菌中的修饰假单胞菌脂酶的表达。信号序列可以是大肠杆菌phoA信号序列。授予Novozyme的美国专利6,495,357、6,509,181、6,524,827、6,528,298、6,558,939、6,608,018和6,617,143也描述了用信号序列表达的脂酶、纤维素酶、淀粉酶和其它酶(包括假单胞菌属来源的酶)的制造，该信号序列优选原产于表达酶但也可以来自例如根毛素属、是来自啤酒酵母属的α-因子的基因或来自杆菌属的淀粉酶或蛋白酶基因。

授予Xoma的美国专利5,595,898、5,698,435和6,204,023描述了使用果胶酸裂解酶信号肽的嵌合抗体片段的制造。这些专利揭示了果胶酸裂解酶是包括荧光假单胞菌的各种有机体中已知的，尽管没有提供这些序列的例证。

授予Genentech的美国专利6,258,560描述了使用细菌信号序列在大肠杆菌中的DNA消化蛋白表达，该细菌信号序列被描述成优选原产于蛋白质但也可以选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠霉素、前导序列。该专利还指出，该蛋白质也可以在假单胞菌(Pseuomonads)中表达，尽管没有给出任何例证。

授予Habermann和Ertl和Aventis的PCT公开WO 01/21662、WO02/068660和美国申请公开2003/0044906描述了从大肠杆菌中分泌水蛭素(hirudin)衍生物。所述信号序列之一是来自荧光假单胞菌的OprF蛋白质的序列。在‘662公开中确定的应用是在De(1995)FEMS Micr.Let.127：263-272中描述的序列NTLGLAIGSLIAATSFGVLA。在该公开中没有描述在假单胞菌属中使用表达质粒，并且与大肠杆菌中的对照表达相比，使用该方法的水蛭素表达的增加仅是少量(marginal)的。

授予Unilever Patent Holdings B.V.的美国专利5,641,671涉及用稳定化蛋白质并优选用脂酶基因内生的信号序列从P.glumae中进行假单胞菌脂酶的表达。

授予Atkinson等的欧洲专利EP 0 121 352描述了在载体中使用来自假单胞菌属RS-16羧肽酶的无前导序列的半胱氨酸以增强蛋白质的周质表达。该专利揭示了在信号序列中的半胱氨酸残基可以促进与细胞膜的相互作用并阻碍分泌。所公开的信号序列是MRPSIHRTAIAAVLATAFVAGT。

依赖信号序列将蛋白质导出细胞质的的方法通常产生不当加工的蛋白质。对于氨基末端分泌信号(例如通过Sec系统引起分泌的那些分泌信号)尤为如此。通过该系统加工过的蛋白质通常或者保留一部分分泌信号，需要一种通常不当裂解的连接元素，或者在末端被截短。

从上述技术中可以明显看出，已经开发出许多将蛋白质导向宿主细胞周质的方法。然而，已知方法不能产生恰当加工的活性重组蛋白的始终如一的高收率，其可以提纯用于治疗。现有方法中的一个主要限制是在不适当的细胞系统中用不好的分泌信号序列进行的蛋白质表达。

因此，在该领域中仍然需要能够分泌和恰当加工重组多肽的改进的大规模表达系统以制造恰当加工形式的转基因蛋白质。理想系统产生大量的可溶蛋白质并可以将该蛋白质导向周质并可能导向细胞外介质中。

本发明的一个目的是提供一种在宿主细胞中提高恰当加工的重组蛋白表达的系统和方法。

本发明的另一目的是提供一种在宿主细胞中提高活性重组蛋白表达的系统和方法。

本发明的另一目的是提供一种具有高水平的恰当加工的重组蛋白表达的工业规模系统。

概述

本发明提供了用于在细胞表达系统中产生大量恰当加工的重组蛋白的改进的组合物和方法。令人惊讶地发现，荧光假单胞菌是一种改进的用于制造分泌蛋白质的平台，基于此发现形成本发明。特别地，与通常在其它细菌表达系统中观察到的相比，荧光假单胞菌令人惊讶地产生更大量的导向其Sec分泌系统的外源蛋白质，并且更大量地将这些蛋白质转移到细胞周质中，从而提高完全加工成的重组蛋白的回收率。本发明包括来自荧光假单胞菌有机体的新识别出的分泌信号，并且包括包含这些序列的肽、载体和表达系统，它们可以促进相关的表达蛋白质或肽导向到革兰氏阴性细菌周质或导入细胞外环境中。本发明还包括荧光假单胞菌宿主细胞，当与信号肽前导序列协同表达外源蛋白时，该宿主细胞可以提高恰当加工形式的外源蛋白的产量。

在一个具体实施方案中，提供了具有下述序列的分离肽——该序列是选自磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号的荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽或基本与其同源。

在另一具体实施方案中，提供了具有为一种肽编码的序列的分离核酸，该肽包括下述序列——其是选自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白和脂蛋白B分泌信号的荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽或基本与其同源。在另一具体实施方案中，提供了一种核酸，该核酸可以与具有为一种肽编码的序列的核酸杂交，该肽包括下述序列——其是选自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白和脂蛋白B分泌信号的荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽或基本与其同源。在一个具体实施方案中，核酸在严格条件下杂交。

在一个具体实施方案中，肽序列是氨基酸序列：Met Lys Leu LysArg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn AlaVal Ala(SEQ ID NO：1)的至少氨基酸2-24的磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号肽的序列，或基本与其同源。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列与核酸序列：atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act tttgtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc(SEQ ID NO：2)至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：2的核酸序列。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有氨基酸序列：Met Lys LysSer Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala Gly Ala(SEQ ID NO：3)的至少氨基酸2-21的序列的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号肽的序列或基本与其同源。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列与核酸序列：atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttgggc gca atc gcc cag caa gca ggc gct(SEQ ID NO：4)至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：4的核酸序列。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有氨基酸序列：Met Phe AlaLys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala(SEQ ID NO：5)的至少氨基酸2-20的序列的天青蛋白分泌信号肽的序列或基本与其同源。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列与核酸序列：atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggccag ttg ctt gct(SEQ ID NO：6)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：6的核酸序列。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有氨基酸序列：Met Gln AsnTyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala Thr AlaMet Ala(SEQ ID NO：7)的至少氨基酸2-23的序列的Lys-Arg-Orn结合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信号肽的序列或基本与其同源。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列与核酸序列：atg cag aac tat aaaaaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtc tcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca(SEQID NO：8)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：8的核酸序列。

在一具体实施方案中，肽序列是含有氨基酸序列：Met Met Ile ArgAsp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu Thr Leu LeuSer Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser(SEQ ID NO：9)的至少氨基酸2-32的序列的铁(III)结合蛋白[Fe(III)bp]分泌信号肽的序列或基本与其同源。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列与核酸序列：atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctc acc ctactc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct(SEQ ID NO：10)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：10的核酸序列。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有氨基酸序列：Met Ile Lys ArgAsn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala(SEQ ID NO：11)的至少氨基酸2-17的序列的脂蛋白B(LprB)分泌信号肽的序列或基本与其同源。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列与核酸序列：atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct(SEQ IDNO：12)至少60％，70％，80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：12的核酸序列。

另一具体实施方案是一种表达载体，其包括带有下述序列或与其同源的荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的核酸——该序列是可连接到启动子上的pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白或脂蛋白B分泌信号。在另一具体实施方案中，载体进一步包含用于相关重组蛋白或肽的表达的编码序列。在一个具体实施方案中，表达载体进一步包含与分泌信号的编码序列相邻或与重组蛋白或肽的编码序列相邻的标记序列。

本发明还提供了包括表达载体的细胞。在一个具体实施方案中，该细胞表达了与如本文所述的荧光假单胞菌Sec-系统分泌信号相连的重组蛋白。该细胞可以在周质隔室中表达蛋白质。在某些具体实施方案中，细胞还可以产生穿过外胞壁的细胞外重组蛋白。在一个具体实施方案中，细胞是细菌细胞，并且在某些具体实施方案中，细胞是荧光假单胞菌细胞或大肠杆菌细胞。在其它具体实施方案中，细胞是真核细胞，并且可以是酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。

在一个具体实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在另一具体实施方案中，细胞是假单胞菌，在特定具体实施方案中，细胞是荧光假单胞菌细胞。

在另一具体实施方案中，提供了改进的用于在宿主细胞中制备重组蛋白的方法和系统。改进包括荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的表达，该荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽是可与宿主细胞中的相关重组蛋白或肽相连的选自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白或脂蛋白B分泌信号的肽或与其同源。在一个具体实施方案中，表达在高密度细胞培养基中产生。Sec-分泌信号可以在细胞中从成熟蛋白质裂解。在另一具体实施方案中，分泌信号未裂解并且细胞表达出与分泌信号相连的重组蛋白。在一个具体实施方案中，标记序列可与相关蛋白质相连。

在另一具体实施方案中，提供了一种通过在荧光假单胞菌中表达出与Sec-系统分泌信号相连的蛋白质来制备重组外源分泌蛋白的方法。该具体实施方案是基于下述确认——即荧光假单胞菌被确认为是用于分泌的蛋白质表达的改进的表达平台。在一个具体实施方案中，Sec-分泌信号来自荧光假单胞菌基因组，但是在另一具体实施方案中，Sec-分泌信号来自大肠杆菌基因组。在其它具体实施方案中，分泌信号原产于待表达的蛋白质。

在一个具体实施方案中，宿主细胞含有周质，且Sec-系统肽的表达将重组蛋白导向细胞周质。在附属具体实施方案中，表达产生细胞外蛋白质。该方法还可以包括从周质或从细胞外介质中提纯重组蛋白的步骤。可以表达与蛋白质相连的Sec-信号并且可以从细胞中提纯与信号相连的蛋白质。因此，在一个具体实施方案中，该分离的肽是分泌信号与相关蛋白质或肽的融合蛋白。然而，还可以在将蛋白质导向周质时从蛋白质中裂解出分泌信号。在一个具体实施方案中，改进Sec-系统分泌信号与蛋白质或肽之间的连接以提高分泌信号的裂解。

在一个具体实施方案中，该方法可以在细胞中产生恰当加工的重组蛋白。在另一具体实施方案中，Sec-系统肽的表达可以在细胞中产生活性重组蛋白。与不用Sec-分泌信号表达的蛋白质相比，本发明的方法还可以提高重组蛋白的收率。

在另一具体实施方案中，该方法产生至少0.1克/升正确加工的蛋白质。在另一具体实施方案中，该方法在细胞中产生0.1至1克/升正确加工的蛋白质。在附属具体实施方案中，所得总蛋白质可以是至少大约2.0至大约50.0克/升。在一些具体实施方案中，所得正确加工的蛋白质的量为所得重组蛋白总量的至少大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％或更高。

相关蛋白质或肽可以是治疗上有效的蛋白质或肽。在一个具体实施方案中，该蛋白质或肽来自真核物类。在另一具体实施方案中，蛋白质序列来自哺乳动物序列。在另一具体实施方案中，活性形式的蛋白质包括至少一个二硫键。在又一具体实施方案中，蛋白质或肽来自激素、生长因子、细胞外受体或配体、蛋白酶、激酶、血蛋白、趋化因子或细胞因子或抗体。

附图简述

图1：革兰氏阴性细菌中的蛋白质分泌系统概观。四个系统(Sec、Tat、MscL和holins)仅穿过内膜转移。该Sec系统分泌的蛋白质位于周质中，结合到外膜内或通过箭头所示的四个外膜分泌系统之一传输穿过外膜。通过Tat系统易位的蛋白质主要位于周质中，但是已经发现铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中的一些蛋白质通过MTB系统进一步输出。Holins和MscL仅将蛋白质传输到周质内。I、III和IV型系统在不使用任何周质中间体的情况下穿过内膜和外膜输出蛋白质，缩写：FUP，fimbrial usher孔蛋白；AT，自动转运子；TPS，两partner分泌系统；MTB，主末端分支；IM，内膜；OM外膜。

图2：荧光假单胞菌gal2分泌结构。显示了pDOW1122和DOW1123的质粒图，(A)pDOW1122包含oprF:gal2融合(B中显示了氨基酸序列)，且pDOW1123包含pbp:gal2融合(C中显示的氨基酸序列)。*表示预定信号肽酶裂解位点。

图3：Gal2的分泌表达。来自表达oprF:gal2(Pdow1122)或pbp:gal2(Pdow1123)的荧光假单胞菌的整个培养液样品的SDS-PAGE分析图(A)。将整个培养液的1/80稀释液加载在10％NuPAGE凝胶上并在1XMOPS缓冲剂中电泳。图B显示了可溶(S)、不溶(I)和无培养上清细胞(SN)馏分的Western分析。在凝胶下方显示出加载的培养物的量，标准化至A575＝30。

图4：大肠杆菌中pelB:gal2的表达。显示了在pelB:gal2(Pdow1138)中表达的Gal2的western印迹分析图。箭头指向不溶(I)和可溶(S)馏分中加工处理和未加工处理的蛋白质。在诱导后0(I0)和3小时(I3)处取样的样品标准化至A575＝1；将5ul加载在4-12％NuPAGE凝胶上并在1X MES缓冲剂中电泳。

图5：来自大肠杆菌和荧光假单胞菌的提纯scFv的活性。使用ELISA检验(A)测量从小规模(B)或大规模(C)发酵中分离出的scFv的活性。活性以吸光度的形式表示；下面每条框列出了抗体和量；显示的是三个孔(well)的平均值。

图6：抗地高辛(anti-digoxin)scFv的分泌表达。A：显示了振荡培养瓶规模的在荧光假单胞菌中的分泌。B：显示了振荡培养瓶规模的在大肠杆菌中的分泌。所有样品均标准化至20OD(对于荧光假单胞菌为OD575，且对于大肠杆菌为OD600)。在MES缓冲剂中在4-12％BT凝胶上电泳样品。S＝可溶、I＝不溶。数字是以小时计的诱导后时间。

图7：振荡培养瓶规模的分泌的抗地高辛scFv的Western印迹。图A显示了荧光假单胞菌表达的蛋白质，图B显示了大肠杆菌表达的蛋白质。将样品标准化至20OD。蛋白质在两种构造中都是100％不溶。S＝可溶，I＝不溶，0、3、24、48代表诱导后时间。

图8：通过抗地高辛scFv的定量分析进行构造之间的收率比较。将10微升每种样品(包括BSA标准物)加载到4-12％BT凝胶上并在1X MES缓冲剂中电泳。对于每种构造，加载诱导后来自0、3、24、48小时的样品。检查荧光假单胞菌分泌的构造pDOW1142和大肠杆菌细胞质(pDOW1152)和分泌的(pDOW1153)构造。箭头表示加工处理和未加工处理的分泌scFv的迁移。如下电泳BAS标准曲线：1，0.1ug；3，0.60ug；5，1.529ug；8.1.85ug。

图9：提纯抗地高辛scFv的活性检验。X-轴上是受试样品：来自含pDOW1142、pDOW1152或pDOW1153的菌株的提纯scFv；多克隆的抗地高辛抗体(阳性)；或无蛋白质(阴性)。Y轴上是吸光度值。误差棒代表三份样品的标准偏差。

图10：在用5mM安息香酸盐生长24小时后，诱导的Skp蛋白质。使用未诱导的烧瓶作为对照。在诱导12小时后收取细胞并且将蛋白质分离成可溶和不溶馏分。使用MES缓冲剂在4-12NuPAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分离蛋白质。缩写如下：I，不溶；S，可溶；MW，分子量；MWM，分子量标记。

图11：加工处理和未加工处理的Skp蛋白质的氨基酸序列。加下划线的序列相当于信号序列(上方)和MALDI-PSD识别出的序列(下方)。

图12：与用pDOW1123转化的JM109、在37℃生长并用0.01mMIPTG诱导成阳性对照物DC265相比较，可溶和不溶样品的SDS-PAGE分离图。列1-可溶DC265，列2-不溶DC265，列3-SeeBlue Plus2 ladder，列4-可溶JM109/pDOW1123，列5-不溶JM109/pDOW1123。在每个孔内加载5微升20OD标准化样品。在150伏电压下在1×MES缓冲剂中电泳4-12％Bis Tris凝胶大约50分钟，然后用Simply Blue Safe Stain着色。

图13：从用pDOW1123转化并用0.01mM的IPTG诱导、在37℃生长的大肠杆菌菌株JM109中SDS-PAGE分离不溶样品的图。列1-3，10微升不溶样品。列4，阳性对照物荧光假单胞菌DC265的10微升1∶20稀释物。将12％Bis-Tris凝胶在200伏在1×MES缓冲剂中处理大约50分钟，并用NovexColloidal Blue Stain Kit着色。

图14：：来自用pDOW1123转化、在0.01mM IPTG中诱导并在37℃生长的大肠杆菌菌株JM109的周质样品的SDS-PAGE分析图。将12％Bis-Tris凝胶在200伏电压下在1×MES缓冲剂中电泳大约50分钟，并用NovexColloidal Blue Stain Kit着色。列1-DC265阳性对照物的10微升1∶20稀释物。列2-4 10微升周质样品。

图15：在37℃生长的用0.01mM IPTG-诱导的JM109/pDOW1123培养物的可溶、不溶和周质馏分的western分析图。将样品在12％BisTris凝胶上在MES缓冲剂中电泳并在30伏电压下转移到硝化纤维素中1小时，然后用抗-His HRP用探针探查。列1-阳性对照物的不溶部分的10微升1∶30稀释物。列2-20微升可溶部分。列3-10微升不溶部分。列4-20微升周质制品。

详述

本发明是以荧光假单胞菌中分泌信号序列的发现为基础的。在一个具体实施方案中，本发明提供了信号肽序列、编码信号肽的核酸、包括编码信号肽序列的核酸的载体和细胞，它们来自荧光假单胞菌有机体，该有机体在与该蛋白质或肽协同表达时可以提高相关蛋白质或肽的分泌。还提供了改进的使用来自荧光假单胞菌的Sec-分泌信号在细胞表达系统中产生大量正确加工的重组蛋白的方法。

本发明还确认了荧光假单胞菌是用于多种蛋白质制造的改进平台。特别地，与通常在其它细菌表达系统中观察到的相比，荧光假单胞菌以正确加工形式产生了更大量的导向Sec分泌系统的外源蛋白，并更大量地将这些蛋白质转移到细胞周质中，从而提高完全加工过的重组蛋白的回收率。因此，在一个具体实施方案中，本发明提供了一种通过表达与Sec分泌信号相连的目标蛋白质来在荧光假单胞菌中制造外源蛋白质的方法。

之前已经证实，某些假单胞菌与其它细菌表达系统相比，对肽和酶的商业表达提供了益处。特别地，已经确认荧光假单胞菌是有利的表达系统。荧光假单胞菌包括一组存在于土壤、水和植物表面环境中的常见的非病原腐生物。已经使用来自荧光假单胞菌的商业酶作为去垢添加剂以降低环境污染并用于立体选择性水解。还在农业上使用荧光假单胞菌控制病原体。在上世纪90年代末被Dow AgroSciences完全收购的Mycogen，在80年代中期开始在荧光假单胞菌中表达重组细菌蛋白并在1985年1月22日提交其关于荧光假单胞菌中的苏云金芽孢杆菌毒素表达的第一个专利申请(“Cellular encapsulation of biologicalpesticides”)。在1985和2004年之间，Mycogen，随后Dow Agro Sciences以及其它公司在关于农药(pesticidal)、杀虫剂和杀线虫毒素制造以及特定毒物序列和基因操作以提高它们的表达的专利申请中投资于荧光假单胞菌的农业应用。

DowPharma目前在使用荧光假单胞菌制造重组蛋白的应用领域中拥有一些待审专利申请。属于Dow Global Technologies的PCT申请WO 03/068926和WO 03/068948描述了使用假单胞菌，特别是荧光假单胞菌作为宿主细胞的extremoyzme过度表达系统。这些文献大致公开了与信号肽协同进行的extremozymes表达，但是没有公开具体序列并且没有确认这些细胞对分泌是优异的。

2003年4月22日提交的属于Dow Global Technologies的名为“Low-Cost Production of Peptides”的PCT公开WO 03/089455描述了制造作为假单胞菌(特别是荧光假单胞菌)中的contatemeric前体的小肽(例如抗菌肽)的低成本方法。该文献公开了与信号肽协同进行的concatameric肽的表达，但是没有公开具体序列。

属于Dow Global Technologies的名为“Benzoate and AntranilateInducible Promoters”的PCT申请WO 04/005221提供了用于商业原核发酵系统的来自荧光假单胞菌的安息香酸盐或邻氨基安息香酸盐可诱导的启动子。该文献公开了包含带有启动子的信号肽，但是没有公开具体信号序列。

肽

在一个具体实施方案中，提供了带有下述氨基酸序列的分离肽——该序列是选自磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白(azurin)，分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号的荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽或基本与其同源。

在另一具体实施方案中，提供了带有下述氨基酸序列的分离肽——该序列是pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白或脂蛋白B分泌信号或基本与它们同源。在一个具体实施方案中，分离肽是分泌信号与相关蛋白质或肽的融合蛋白。

在一个具体实施方案中，肽序列是至少氨基酸：Met Lys Leu LysArg Len Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn AlaVal Ala(SEQ ID NO：1)的磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号肽的序列，或基本与其同源。在另一具体实施方案中，肽序列包含SEQ ID NO：1的至少氨基酸2-24。在另一具体实施方案中，肽序列包括截短的SEQ IDNO：1，其从氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，但是保留分泌信号活性。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列：Met LysLys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Ile Ala Gln Gln Ala GlyAla(SEQ ID NO：3)的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号肽的序列或基本与其同源。在一个具体实施方案中，该肽是SEQ ID NO：3的至少氨基酸2-21或与其同源。在另一具体实施方案中，肽序列包括截短的SEQID NO：3，其从氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，但是保留分泌信号活性。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：3的肽修饰以使位置2的Lys被Tyr取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：3的肽修饰以使位置5的Thr被Ser取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：3的肽修饰以使位置8的Val被Leu取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：3的肽修饰以使位置10的Val被Val和Arg取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：3的肽修饰以使位置14的Ala被Val取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：3的肽修饰以使位置15的Ile被Leu取代。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列：Met PheAla Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala(SEQ ID NO：5)的天青蛋白分泌信号肽的序列或基本与其同源。在一个具体实施方案中，该肽是SEQ ID NO：5的至少氨基酸2-20或与其同源。在另一具体实施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO：5，其从氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，但是保留分泌信号活性。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置2和3的Phe-Ala被Leu-Arg或Ile-Arg取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置5的Leu被Ala取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置6的Val被Ala取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置6-8的Val-Ala-Val被Ile-Ser-Ala取代。在一个具体实施方案中，将SEQIDNO：5的肽修饰以使位置11的Leu被Ile取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置12的Thr被Ser取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置14的Ala被Leu或Phe取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置16的Gly被Ala取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置17的Gln被Ser或Pro取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置18的Leu被Val取代。在一个具体实施方案中，将SEQ ID NO：5的肽修饰以使位置18-19的Leu-Leu被Val-Phe取代。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列：Met GlnAsn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala ThrAla Met Ala(SEQ ID NO：7)的Lys-Arg-Orn结合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信号肽的序列或基本与其同源。在一个具体实施方案中，该肽是SEQ ID NO：7的氨基酸2-23或基本与其同源。在另一具体实施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO：7，其从氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，但是保留分泌信号活性。

在再一具体实施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列：Met MetIle Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu ThrLeu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser(SEQ ID NO：9)的铁(III)结合蛋白[Fe(III)bp]分泌信号肽的序列或基本与其同源。在一个具体实施方案中，该肽是SEQ ID NO：9的氨基酸2-32或基本与其同源。在另一具体实施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO：9，其从氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，但是保留分泌信号活性。

在另一具体实施方案中，肽序列是含有至少氨基酸序列：Met IleLys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala(SEQ IDNO：11)的脂蛋白B(LprB)分泌信号肽的序列或基本与其同源。在一个具体实施方案中，该肽是SEQ ID NO：11的氨基酸2-17或基本与其同源。在另一具体实施方案中，肽序列包括截短的SEQ ID NO：11，其从氨基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，但是保留分泌信号活性。

在另一具体实施方法中，分泌信号是来自大肠杆菌蛋白质的分泌信号。在一个具体实施方案中，分泌信号是用于来自大肠杆菌的蛋白质的内在信号序列。在一个具体实施方案中，蛋白质是伴侣蛋白质。蛋白质可以是二硫键形成的蛋白质。在一个具体实施方案中，该序列是大肠杆菌伴侣蛋白质(例如skp蛋白质)的内在序列。

sec路径的信号肽通常包括下列三个区域：(i)带正电的n-区，(ii)疏水h-区和(iii)不带电但是极性c-区。信号肽酶的裂解位点位于c-区。然而，在不同蛋白质之间，信号序列保持程度和长度以及裂解位点位置可以不同。分泌信号序列可以是，例如，使用为识别分泌信号而设计的电脑程序(例如SignalP程序)或如Hiller等(2004)Nucleic AcidsResearch 32(Web Server issue)：W375-W379所述识别出的任何序列；可在互联网上在URL： http://www.predisi.de查到。

序列同源性

此处所用的术语“同源”是指i)具有与给定原始蛋白质或肽的序列大致相似(也就是，至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％)的氨基酸序列并保留原始蛋白质或肽的所需功能的蛋白质或肽，或ii)具有与给定核酸的序列大致相似(也就是，至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或98％)的序列并保留原始核酸序列的所需功能的核酸。在本发明和公开的所有具体实施方案中，可以将任何公开的蛋白质、肽或核酸替换成保留所需功能的同源或基本同源的蛋白质、肽或核酸。在本发明和公开的所有具体实施方案中，当公开了任何核酸时，应该认为本发明还包括与所公开的核酸杂交的所有核酸。

在一个具体实施方案中，同源多肽的氨基酸序列是给定原始多肽的变体，其中可以通过将最多或大约30％(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30％)的原始多肽氨基酸残基取代成其它氨基酸残基来获得该变体的序列，条件是取代后的变体保留了原始多肽的所需功能。基本同源的变体氨基酸与给定多肽至少大约70％同源，或70、75、80、85、90、95、98、99或100％同源。

在一个具体实施方案中，变体可以是原始多肽的类似取代的变体或类似变体。术语“类似取代的变体”是指相对于原始多肽，含有不同残基(它们是“类似的”氨基酸残基取代基，但是其中并非所有的不同之处都是“类似的”取代基)的变体。此处所用的术语“类似变体”是指其中每个不同的残基都是“类似的”氨基酸残基取代基时的变体。本文中使用的术语“类似的”氨基酸残基是指下述残基——它们是表1所示的15个保守或半保守基团的任何一个。

表1.类似的氨基酸取代基
		保守基团(8)	半保守基团(7)
Arg，Lys	Arg，Lys，His
		Asp，Glu	Asn，Asp，Glu，Gln
Asn，Gln
		Ile，Leu，Val	Ile，Leu，Val，Met，Phe
Ala，Gly	Ala，Gly，Pro，Ser，Thr
		Ser，Thr	Ser，Thr，Tyr
Phe，Tyr	Phe，Trp，Thr
		Cys(非胱氨酸)，Ser	Cys(非胱氨酸)，Ser，Thr

在一个具体实施方案中，至少50％的取代基表现为保守氨基酸取代基，剩余取代基是半保守取代基。在其它具体实施方案中，至少60％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％的类似取代基表现为保守氨基酸取代基。

在一个具体实施方案中，至少50％的类似取代基表现为保守氨基酸取代基，剩余的类似取代基表现为半保守氨基酸取代基。在另一个具体实施例中，至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％的类似取代基表现为保守氨基酸取代基。在一个实施方案中，取代变体是给定原始多肽的类似变体。

核酸序列

本发明还包括带有为一种肽编码的序列的分离核酸，该肽包括与pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白和脂蛋白B分泌信号基本同源的序列。在本发明的另一方面，提供了杂合成下述分离核酸的核酸，该分离核酸带有为一种肽编码的序列，该肽包括与pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白和脂蛋白B分泌信号基本同源的序列。在某些具体实施方案中，杂合核酸在极其严格的条件下结合。极其严格的条件通常是指在68℃或更高的温度下杂合。

在一个具体实施方案中，提供了为与SEQ ID NO：1的至少氨基酸2-24的磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号肽的序列基本同源的肽序列编码的核酸。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列是：atg aaa ctgaaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtggcc(DEQ ID NO：2)。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ IDNO：2的序列至少80％，85％，90％，95％或98％相同。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：2的序列至少90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％或50％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：2的核酸序列。

在一个具体实施方案中，提供了为与含有SEQ ID NO：3的至少氨基酸2-21的序列的外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号肽的序列基本同源的肽序列编码的核酸。在一个具体实施方案中，肽序列是如下的SEQ IDNO：3的肽或与其基本同源——其中位置2的Lys被Tyr取代；其中位置5的Thr被Ser取代；其中位置8的Val被Leu取代；其中位置10的Val被Val和Arg取代；其中位置14的Ala被Val取代；其中位置15的Ile被Leu取代。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列是：atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttg ggc gca atc gcc cag caagca ggc gct(SEQ ID NO：4)。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：4的序列至少90％相同。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：4的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：4的核酸序列。

在另一具体实施方案中，提供了为与含有SEQ ID NO：5的至少氨基酸2-20的序列的天青蛋白分泌信号肽的序列基本同源的肽序列编码的核酸。在一个具体实施方案中，肽序列是如下的SEQ ID NO：5的肽或与其基本同源——其中位置2和3的Phe-Ala被Leu-Arg或Ile-Arg取代；其中位置5的Leu被Ala取代；其中位置6的Val被Ala取代；其中位置6-8的Val-Ala-Val被Ile-Ser-Ala取代；其中位置11的Leu被Ile取代；其中位置12的Thr被Ser取代；其中位置14的Ala被Leu或Phe取代；其中位置16的Gly被Ala取代；其中位置17的Gln被Ser或Pro取代；其中位置18的Leu被Val取代；或其中位置18-19的Leu-Leu被Val-Phe取代。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列是：atg ttt gcc aaa ctc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg agc ggc cag ttg cttgct(SEQ ID NO：6)。在一个具体实施方案中，该核酸序列与SEQ IDNO：6的序列至少90％相同。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：6的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：6的核酸序列。

在另一具体实施方案中，提供了为与含有SEQ ID NO：7的至少氨基酸2-23的序列的Lys-Arg-Orn结合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信号肽的序列基本同源的肽序列编码的核酸。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列是：atg cag aac tat aaa aaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtctcg atg gcg ttc agc gcc acg gcc atg gca(SEQ ID NO：8)。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：8的序列至少90％相同。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：8的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：8的核酸序列。

在再一具体实施方案中，提供了为与含有SEQ ID NO：9的至少氨基酸2-32的序列的铁(III)结合蛋白[Fe(III)bp]分泌信号肽的序列基本同源的肽序列编码的核酸。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列是：atg atg atc cgt gac aac cga ctc aag aca tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc ctcacc cta ctc agc ctg acc ctg ctc tcg ccc gcg gcc cat tct(SEQ ID NO：10)。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：10的序列至少90％相同。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：10的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：10的核酸序列。

在另一具体实施方案中，提供了为与含有SEQ IDNO：11的至少氨基酸2-17的序列的脂蛋白B(LprB)分泌信号肽的序列基本同源的肽序列编码的核酸。在另一具体实施方案中，为肽编码的核酸序列是：atg atc aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg agc gct(SEQ IDNO：12)。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：12的序列至少90％相同。在另一具体实施方案中，该核酸序列与SEQ ID NO：12的序列至少98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％相同。在另一具体实施方案中，根据宿主机体的密码子使用来调节SEQ ID NO：12的核酸序列。

密码子使用或密码子选择是本领域中公知的。可以如下修改所选编码序列：改变其遗传密码以配合细菌宿主细胞使用的序列，并且可以增强其密码子序列以更接近宿主使用的序列。可以按照本领域普通技术人员已知的各种方法(例如低聚核苷酸诱发突变)进行遗传密码选择和密码子频率增强。对此过程有帮助的有用的互联网在线资源包括，例如：(1)the Kazusa DNA Research Institute(2-6-7Kazusa-kamatari，Kisarazu、Chiba 292-0818日本)的密码子使用数据库并可在http://www.kazusa.or.jp/获得；以及(2)可以从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi？mode＝c  的NCBI Taxonomy数据库获得的遗传密码表。例如，假单胞菌属据描述使用了NCBI Taxonomy站点的遗传密码译码表11，并在Kazusa站点表现出 http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/所示的表中的密码子使用频率。

核酸同源性

本领域技术人员显而易见的是，可以提供多种基本同源的核酸，它们为基本类似的肽的序列编码。在编码序列同源性的情况下，与蛋白质编码核酸序列同源的编码序列含有与此处公开的蛋白质编码核酸序列相比不超过30％(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30％)的会导致读码框中的变化的突变并且不含会产生过早终止密码子的突变。然而，可以在改变所需表达系统中的密码子使用的基础上设计核酸序列。

按照本领域公知的各种方法测量核酸序列同源性。可用的序列比对和同源性测定方法的例子包括下述这些。

可以使用U.S.National Center for Biotechnology InfOrnation(NCBI)程序，MegaBLAST(目前可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/查到)进行同源序列的比对和检索。该程序的使用可以选择对于氨基酸序列在70％的等同百分比设置，或对于核苷酸序列在90％的设置，这种使用可以识别出与查询序列(querysequence)具有70％或90％或更高同源性的序列。本领域已知的其它软件也可用于同源序列(例如与本发明的含有启动子碱基序列或激活子-蛋白质-编码碱基序列的信息串至少70％或90％同源的序列)的比对和/或检索。例如，用于比较以识别出与查询序列至少70％或90％同源的序列的序列比对可以使用例如获自GCG序列分析软件包(SecquenceAnalysis Software Package，可获自Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705)的GAP、BESTFTT、BLAST、FASTA和TFASTA程序进行，在此过程中使用这些程序中指定的缺省参数加上70％或90％的同源性程度设置用的参数。也可以使用例如CLUSTAL程序(可以在来自Interlligenetics，Mountain View，Cal.的PC/Gene软件包中获得)。

这些和其它序列比对方法是本领域中公知的并且可以通过人工比对，通过目测，或通过序列比对算法(例如上述程序所包含的那些)。的人工或自动运用来进行。各种可用的算法包括，例如，在W.R.Pearson&D.J.Lipman，Proc.Nat’l  Acad.Sci.USA 85：2444-48(1988年4月)中描述的相似性检索法；T.F.Smith&M.S.Waterman，在Adv.Appl.Math.2：482-89(1981)及在J. Molec.Biol.147：195-97(1981)中描述的局部同源性检索法；在S.B.Needleman&C.D.Wunsch，J. Molec.Bial.48(3)：443-53(1970年3月)中描述的同源性比对法；以及例如W.R.Pearson在Genomics 11(3)：635-50(1991年11月)中；W.R.Pearson在Methods Mole.Biol.24：307-31和25：365-89(1994)中；以及D.G.Higgins&P.M.SharpComp.Appl’ns in Biosci.5：151-53(1989)和在Gene73(1)：237-44(1988年12月15日)中描述的各种方法。

在极其严格的杂合条件下进行的核酸杂合也是一种可用于获得本文所用的足够同源的序列的技术。极其严格的杂合条件通常是指在至少68℃的含水条件中进行的杂合。

载体

另一具体实施方案是一种表达载体，其包括带有下述序列的荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的核酸——该序列与可连接到启动子上的pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白或脂蛋白B分泌信号基本同源。可表达的编码序列有效地连接到能够在所选宿主细胞中起作用的转录启动子以及所有其它必须的转录和转译调节因子上。

术语“可连接”是指下述任何构造，即在该构造中，转录和任何转译调节因子相对于编码序列以这样的布置共价连接到编码序列上，使得在宿主细胞中并通过宿主细胞的作用，调节因子可以指引编码序列的表达。

载体通常包含一个或多个表型可选择标记和一个复制源以确保载体的维持并且如果需要，可以在宿主内提供扩增。适合按照本公开的内容进行转化的宿主包括假单胞菌属内的各种物类，特别优选的是荧光假单胞菌的宿主细胞株。

在一个具体实施方案中，载体进一步包含可连接到Sec分泌信号上的用于相关重组蛋白或肽的表达的编码序列。这些重组蛋白和肽可以从多核苷酸中表达，其中目标多肽编码序列可连接到前导序列和转录和转译调节因子上以形成功能基因，宿主细胞可从该功能基因中表达蛋白质或肽。编码序列可以是目标多肽的内在编码序列(如果可以得到的话)，但是更优选是经过选择、改进或最优化以用于宿主细胞的选定表达的编码序列：例如通过合成基因以反应宿主物类的密码子使用偏性。在本发明的一个具体实施方案中，宿主物类是荧光假单胞菌，并且在既设计信号序列又设计蛋白质或肽序列时，考虑荧光假单胞菌的密码子偏性。在一个或多个载体内构造基因，或将基因插入一个或多个载体内，然后将载体转化成表达宿主细胞。

在载体(也称作“表达构造”)中可以包含其它调节因子。这些因子包括，但不限于，例如，转录增强序列、转译增强序列、其它启动子、激活子、转译启动和终止信号、转录终止子、顺反子调节子、多顺反子调节子、标记序列，例如核苷酸序列“标记”和“标记”肽编码序列，这有助于表达出的多肽的识别、分离、提纯或隔离。

在另一具体实施方案中，表达载体进一步包含与分泌信号的编码序列相邻或与重组蛋白或肽的编码序列相邻的标记序列。在一个具体实施方案中，该标记序列使蛋白质可以提纯。标记序列可以是亲和标记物，例如六-组氨酸亲和标记物。在另一具体实施方案中，亲和标记物可以是谷胱甘肽-S-转译酶分子。标记物还可以是荧光分子，例如YFP或GFP，或这些荧光蛋白质的类似物。该标记物还可以是一部分抗体分子，或可用于提纯的已知的结合partner的已知抗原或配体。

本发明的蛋白质编码基因除了蛋白质编码序列外，还可以包括可与其相连的下列调节因子：启动子、核糖体结合位点(RBS)、转录终止子、转译启动和终止信号。可用的RBSs可获自可在本发明的表达系统中用作宿主细胞的任何物类，尤其获自选定的宿主细胞。许多特定的RBSs和多种一致认可的RBSs是已知的，例如，D.Frishman等人，Starts of bacterial genomes：estimating the reliability of computerpredictions，Gene 234(2)：257-65(1999年7月8日)中；以及B.E.Suzek等人，A probabilistic method for identifying start codons in bacterialgonomes，BioinfOrnatics 17(12)：1123-30(2001年12月)中描述和引用的那些。此外，可以使用天然的或合成的RBSs，例如，下列文献中描述的那些：EP 0207459(合成的RBSs)；O.Ikehata等人，Primary structureof nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of aRhodococcus species and its expression in Escherichia coli，Eur.J.Biochem.181(3)：563-70(1989)(AAGGAG的天然RBS序列)。在下列文献中描述了本发明中可用的方法、载体和转译及转录因子的其它例子，例如：授予Gilroy的美国专利No.5,055,294和授予Gilroy等人的美国专利No.5,128,130；授予Rammler等人的美国专利No.5,281,532；授予Barnes等人的美国专利No.4,695,455和4,861,595；授予Gray等人的美国专利No.4,755,465；以及授予Wilcox的美国专利No.5,169,760。

通过在载体或质粒中插入增强序列来提高假单胞菌对本发明的蛋白质的编码DNA的转录。典型的增强子是DNA的顺式作用元件，通常大小为大约10至300bp，其作用于启动子以提高其转录。例子包括各种假单胞菌增强子。

通常，重组表达载体包括复制源和允许假单胞菌宿主细胞转化的可选择的标记和来自高度表达基因的启动子以指示下游构造序列的转录。这些启动子可来自为3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或热休克蛋白质之类的酶编码的操纵子。用转译起始和终止序列并优选用能够指示转译酶分泌的前导序列在合适的阶段组装异质构造序列。任选地，异质序列可以编码包括损害所需特性(例如表达出的重组产品的稳定或简化的提纯)的N-末端识别肽的融合酶。

载体在本领域中已知可用于在宿主细胞中表达重组蛋白，并且可以使用这些载体中的任何一种以按照本发明表达基因。这些载体包括，例如，质粒、粘粒、噬菌体表达载体。可用的质粒载体的例子包括，但不限于，表达质粒pBBR1MCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600和RSF1010。此类可用载体的其它例子包括下列文献中描述的那些：N，Hayase，在Appl.Envir.Microbiol.60(9)：3336-42(1994年9月)中；A.A.Lushnikov等人，在Basic Life Sci.30：657-62(1985)中；S.Graupner&W.Wackernagel，在Biomolec.Eng.17(1)：11-16(2000年10月)中；H.P.Schweizer，在Curr.Opin.Biotech.12(5)：439-45(2001年10月)中；M.Bagdasarian&K.N.Timmis，在Curr.Topics.Microbiol.Immunol 96：47-67(1982)中；T.Ishii等人，在FEMS Microbiol Lett.116(3)：307-13(1994年3月1日)中；I.N.Olekhnovich&Y.K.FOrnichev，在Gene 140(1)：63-65(1994年3月11日)中；M.Tsuda&T.Nakazawa，在Gene 136(1-2)：257-62(1993年12月22日)中；C.Nieto等人，在Gene 87(1)：145-49(1990年3月1日)中；J.D.Jones&N.Gutterson，在Gene 61(3)：299-306(1987)中；M.Bagdasarian等人，在Gene 16(1-3)：237-47(1981年12月)中；H.P.Schweizer等人，在Genet.Eng.(NY)23：69-81(2001)中；P. Mukhopadhyay等人，在J.Bact.172(1)：477-80(1990年1月)中；D.O.Wood等人，在J.Bact.145(3)：1448-51(1981年3月)中；以及R.Holtwick等人，在Microbiology 147(Pt 2)：337-44(2001年2月)中。

可以在假单胞菌属宿主细胞中使用的表达载体的其它例子包括表2所列的来自所示复制子的那些载体。

表2.可用表达载体的一些例子
		复制子	载体
PPS10	PCN39，PCN51
		RSF1010	PKT261-3
	PMMB66EH
			PEB8
	PPLGN1
			PMYC1050
RK2/RP1	PRK415
			PJB653
PRO1600	PUCP
			PBSP

例如，F.Heffron等人在Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 72(9)：3623-27(1975年9月)中，和K.Nagahari&K.Sakaguchi在I.Bact.133(3)：1527-29(1978年3月)中描述了表达质粒RSF1010。质粒RSF1010及其衍生物是本发明中特别有效的载体。本领域中已知的、示例性的可用的RSF1010衍生物包括，例如pKT212、pKT214、pKT231和相关质粒，以及pMYC1050和相关质粒(参看，例如，授予Thompson等的美国专利5,527,883和5,840,554)，例如，pMYC1803。质粒pMYC1803来自RSF1010-基质粒pTJS260(参看授予Wilcox的美国专利5,169,760)，其从RSF1010质粒中携带调节的抗四环素标记物和复制和流通(mobilization)位点。其它示例性的可用载体包括授予Puhler等人的美国专利4,680,264中描述的那些。

在一个具体实施方案中，使用表达质粒作为表达载体。在另一具体实施方案中，使用RSF1010或其衍生物作为表达载体。在再一具体实施方案中，使用pMYC1050或其衍生物或pMYC1803或其衍生物作为表达载体。

可以使用选择标记基因(也存在于质粒中)将质粒保持在宿主细胞中。这可以是抗生素抗性基因，在这种情况下可以在发酵培养基中加入相应的抗生素，或者是已知在本领域内可用的任何其它类型的选择标记基因，例如原养恢复基因(prototrophy-restoring gene)，在这种情况下，在宿主细胞中使用对相应的特性(例如生物催化特性，例如氨基酸生物合成或核苷酸生物合成特性，或碳源利用特性)有营养缺陷的质粒。

按照本发明使用的启动子可以是组成型启动子或调节型启动子(regulated promoters)。可用的调节型启动子的常用例子包括来自lac启动子(也就是lacZ启动子)的那类启动子，尤其是授予DeBoer的美国专利4,551,433中描述的tac和trc启动子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5和T7lac启动子。在某些具体实施方案中，启动子来自大肠杆菌有机体。

本发明的表达系统中可用的非lac型启动子的常用例子包括，例如，表3中列的那些。

表3.非-lac启动子的例子
		启动子	诱导物
PR	高温
		PL	高温
Pm	烷基-或卤-安息香酸盐
		Pu	烷基-或卤-安息香酸盐
Psal	水杨酸盐

参看，例如：J.Sanchez-Romero&V.De Lorenzo(1999)GeneticEngineering of Nonpathogenic Pseudomonas Strains as Biocatalysts forIndustrial and Environmental Processes，在Manual of IndustrialMicrobiology(A.Demain&J.Davies，eds)中pp.460-74(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer(2001)Vectors to express foreign genesand techniques to monitor gene expression for Pseudomonads，CurrentOpinion in Biotechnology，12：439-445；以及R.Slater&R.Williams(2000)The Expression of Foreign DNA in Bacteria，在Molecular Biology andBiotechnology(J，Walker&R.Rapley.eds.)中pp.125-54(The Royal Societyof Chemistry，Cambridge，UK)。还可以使用含有原产于所选细菌宿主细胞的启动子的核苷酸序列的启动子以控制为目标多肽编码的转基因的表达，例如假单胞菌邻氨基安息香酸盐或安息香酸盐操纵子启动子(Pant，Pben)。还可以使用串联(tandem)启动子，其中一个以上的启动子互相共价连接，无论它们在序列上是否相同，例如Pant-Pben串联启动子(启动子间杂合)或Plac-Plac串联启动子。

调节型启动子采用了启动子调节蛋白以控制包含启动子作为其组成部分的基因的转录。当在此使用调节型启动子时，相应的启动子调节蛋白也可以是本发明的表达系统的一部分。启动子调节蛋白的例子包括：激活蛋白，例如大肠杆菌代谢产物激活蛋白，MalT蛋白；AraC族转录激活子；阻遏蛋白，例如大肠杆菌LacI蛋白；和双功能调节蛋白，例如大肠杆菌NagC蛋白。许多调节型启动子/启动子-调节蛋白对是本领域已知的。

启动子调节蛋白与效应化合物(也就是可逆或不可逆地与调节蛋白相连以使蛋白质能够释放或结合到该基因的处于启动子控制下的至少一个DNA转录调节区的化合物)相互作用，从而允许或阻碍转录酶在启动基因转录中的作用。将效应化合物分成诱导物或辅阻遏物，并且这些化合物包括天生的效应化合物和义务诱导化合物。许多调节型启动子/启动子-调节蛋白/效应化合物三件套是本领域已知的。尽管可以在整个细胞培养和发酵过程中随处使用效应化合物，但在使用调节型启动子的优选具体实施方案中，在生成了所需量或密度的宿主细胞生物量后，在培养物中加入合适的效应化合物以直接或间接引起所需目标基因的表达。

作为例子，在使用lac族启动子时，该系统中可以存在lacI基因。LacI基因(其(通常)是组成型表达的基因)对结合到这些启动子的lac操纵子上的Lac阻遏蛋白n(LacI蛋白)进行编码。因此，当使用lac族启动子时，在表达系统中也可以包含并表达lacI基因。在lac族启动子成员(例如tac启动子)的情况下，效应化合物是诱导物，优选IPTG(异丙基-D-1-硫代半乳糖苷，也称作“异丙基硫代半乳糖苷)之类的义务诱导物。

ChampionTMpET表达系统提供了高效的蛋白质生产。由强T7lac启动子诱导表达。该系统利用了噬菌体T7RNA聚合酶的高活性和特异性以大量转录相关基因。位于启动子区域的lac操纵基因提供了比传统T7-基载体更紧密的调节，从而改进质粒稳定性和细胞存活力(Studier，F.W.和B.A.Moffatt(1986)J Molegular Biology 189(1)：113-30；Rosenberg等人，(1987)Gene 56(1)：125-35)。T7表达系统使用了T7启动子和T7RNA聚合酶(T7RNAP)以大量转录相关基因。在T7表达系统中实现了高效表达，因为T7RNAP比天然大肠杆菌RNAP更具有加工性并且专门用于相关基因的转录。通过在宿主细胞中提供T7RNAP源来诱导确定基因的表达。这可以使用含有T7RNAP基因的染色体副本的BL21大肠杆菌宿主实现。T7RNAP基因处于可通过IPTG诱导的LacUV5启动子控制下。在诱导时表达T7RNAP并转录相关基因。

βBAD表达系统可以通过特定碳源(例如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖)的存在进行重组蛋白质的紧密受控的可滴定表达(Guzman等人(1995)JBacteriology 177(14)：4121-30)。βBAD载体独特地设计成对表达水平进行精确控制。在araBAD启动子上开始来自pBAD载体的异质基因表达。通过araC基因的产品正向和负向调节启动子。AraC是与L-阿拉伯糖形成复合物的转录调节子。在不存在L-阿拉伯糖的情况下，AraC二聚物阻碍了转录。为了获得最大的转录活化作用，要求两种情况：(i)L-阿拉伯糖结合到AraC上以使转录开始，(ii)cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP复合物结合到DNA上并促进AraC结合到启动子区域的正确位置上。

Trc表达系统可以在大肠杆菌中实现来自trc启动子的高效的受调节的表达。已经对大肠杆菌中的真核基因表达优化了trc表达载体。trc启动子是来自色氨酸(trp)和乳糖(lac)启动子的强杂合启动子。通过lacO操纵基因和lacIQ基因的产品进行调节(Brosius，J.(1984)Gene27(2)：161-72)。

表达系统

在一个具体实施方案中，提供了一种用于制造重组蛋白的改进的表达系统。在一个具体实施方案中，该系统包括宿主细胞和载体，该载体包含可与选自pbp分泌信号、OprE分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号的荧光假单胞菌Sec-系统分泌信号或与该信号序列基本同源的序列相连的重组蛋白或肽。

在另一具体实施方案中，提供了一种包含荧光假单胞菌宿主细胞和至少一个载体的表达系统，该载体包括来自可与相关蛋白质或肽相连的任何基因组的Sec分泌信号。载体可以具有上述任何特性。在一个具体实施方案中，Sec分泌信号来自荧光假单胞菌基因组。然而，在另一具体实施方案中，Sec-分泌信号来自任何细菌基因组。在一个具体实施方案中，分泌信号来自非荧光假单胞菌基因组的细菌基因组，并且在特定具体实施方案中，分泌信号来自大肠杆菌基因组。在某些具体实施方案中，分泌信号可以原产于该蛋白质。在另一具体实施方案中，分泌信号不是原产于蛋白质。

例如，提供的分泌系统可以包括Sec分泌信号，例如用于skp蛋白质的分泌信号。在将重组表达的蛋白质导向周质隔室或导向细胞外时，载体中可以包含可与相关蛋白质相连的该蛋白质的内在前导序列。

在其它具体实施方案中，载体中可以包括来自不同蛋白质的分泌信号序列。令人惊奇地，荧光假单胞菌可以恰当地通过其Sec分泌路径将带有各种信号序列的蛋白质导向周质中。在一些具体实施方案中，在信号序列和相关蛋白质或肽之间不提供进一步修饰。然而，在某些具体实施方案中，加入附加的裂解信号以促进肽的氨基末端的恰当加工。

分泌系统还可以包括如下所述的发酵培养基。在一个具体实施方案中，该系统包括无机盐培养基。在另一具体实施方案中，该系统在培养基中包括化学诱导物。

该系统还可以包括启动子(其可以是可选择启动子)和诱导物。有时，该启动子是非原产于荧光假单胞菌的启动子，例如大肠杆菌启动子。在某些具体实施方案中，该启动子是，例如，可诱导启动子，例如lac启动子。该启动子还可以是几种不同启动子的混合物，其中至少一种不是原产于荧光假单胞菌有机体。例如，启动子可以是trc启动子。启动子还可以是例如tac启动子。

方法

在一个具体实施方案中，提供了一种用于制造重组蛋白的改进的方法，其包括表达与Sec分泌信号相连的相关融合蛋白的荧光假单胞菌宿主细胞。该方法可以包括提供一种包含载体的荧光假单胞菌细胞，该载体对可与重组Sec系统分泌信号序列相连的重组蛋白或肽编码；并在产生蛋白质或肽表达的条件下培养该细胞。载体可以具有上述任何特性。在一个具体实施方案中，Sec分泌信号来自荧光假单胞菌基因组。在另一具体实施方案中，Sec-分泌信号来自任何细菌基因组。在一个具体实施方案中，分泌信号来自细菌基因组，并且在特定具体实施方案中，分泌信号来自大肠杆菌基因组。在某些具体实施方案中，分泌信号可以原产于该蛋白质。在另一具体实施方案中，分泌信号不是原产于蛋白质。

在另一具体实施方案中，提供了一种在任何宿主细胞中制备重组蛋白的改进的方法，包括可与宿主细胞中的相关重组蛋白或肽相连的选自pbp、OprE、Lys-Arg-Orn结合蛋白、天青蛋白、铁(III)结合蛋白或脂蛋白B分泌信号的荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的表达。

在一个具体实施方案中，宿主细胞含有周质，且Sec-系统肽的表达将重组蛋白导向细胞周质。在附属具体实施方案中，表达产生细胞外蛋白质。该方法还可以包括从周质或从细胞外介质中提纯重组蛋白的步骤。可以表达与蛋白质相连的Sec-信号并且可以从细胞中提纯与信号相连的蛋白质。因此，在一个具体实施方案中，该分离的肽是分泌信号与相关蛋白质或肽的融合肽。然而，还可以在将蛋白质导向周质时从蛋白质中裂解出分泌信号。在一个具体实施方案中，改进Sec-系统分泌信号与蛋白质或肽之间的连接以提高分泌信号的裂解。

在一个具体实施方案中，该方法可以产生定位于宿主细胞周质中的蛋白质。在一个具体实施方案中，该方法在细胞中产生恰当加工的重组蛋白。在另一具体实施方案中，Sec-系统肽的表达可以在细胞中产生活性重组蛋白。与不用Sec-分泌信号表达的蛋白质相比，本发明的方法还可以提高重组蛋白的收率。

在一个具体实施方案中，该方法在周质隔室中产生至少0.1克/升蛋白质。在另一具体实施方案中，该方法在细胞中产生0.1至10克/升周质蛋白质。在附属具体实施方案中，该方法在细胞中产生至少大约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0克/升周质蛋白质。在一个具体实施方案中，所得重组蛋白总量为至少1.0克/升。在一些具体实施方案中，所得周质蛋白质的量为所得重组蛋白总量的至少大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或更多。

在一个具体实施方案中，该方法产生至少0.1克/升正确加工过的蛋白质。正确加工过的蛋白质具有天然蛋白质的氨基末端。在另一具体实施方案中，该方法在细胞中产生0.1至10克/升正确加工过的蛋白质。在附属具体实施方案中，该方法产生至少大约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0克/升正确加工过的蛋白质。在一个具体实施方案中，所得正确加工过的重组蛋白总量为至少1.0克/升。在附属具体实施方案中，所得正确加工过的蛋白质总量为至少大约2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0或50.0克/升。在一些具体实施方案中，所得正确加工过的蛋白质的量是正确加工形式的重组蛋白总量的至少大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或更多。

在一些具体实施方案中，可以产生活性形式的蛋白质。术语“活性”是指存在生物功能或生物效应，其中生物功能或效应比得上或基本相当于相应的天然蛋白质或肽的生物功能或效应。在蛋白质领域中，这通常意味着多核苷酸或多肽包括与使用标准参数的相应天然蛋白质或肽相比具有至少大约20％，大约50％，优选至少大约60-80％，最优选至少大约90-95％活性的生物功能或效应。蛋白质或肽活性的测定可以使用特定蛋白质或肽的相应的标准定向(targeted)比较生物检定法进行。重组蛋白或多肽生物功能或效应的一个指征是重组多肽在免疫学上可与天然多肽交叉反应。

在另一具体实施方案中，制成的表达出的转基因肽、多肽、蛋白质或它们的片段中超过50％可以在宿主细胞中以可复性(renaturable)形式制造。在另一具体实施方案中，表达出的蛋白质中大约60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％以活性形式获得或可以恢复成活性形式。

本发明的方法可以提高重组蛋白的收率。在一个具体实施方案中，该方法以总细胞蛋白量(tcp)的5、10、15、20、25、30、40或50、55、60、65、70或75％制造重组蛋白。“总细胞蛋白量百分比”是以合计细胞蛋白质百分比计的在宿主细胞中的蛋白质或肽的量。总细胞蛋白量百分比的测定方法是本领域技术人员已知的。

在特定具体实施方案中，当在无机盐培养基中生长时(也就是在大约4℃至大约55℃的温度范围内，包括4℃和55℃在内)，宿主细胞可以具有至少1％tcp的重组肽、多肽、蛋白质或它们的片段的表达水平和至少40克/升的细胞密度。在特别优选的具体实施方案中，当以至少10升的发酵规模在无机盐培养基中生长时(也就是在大约4℃至大约55℃的温度范围内，包括4℃和55℃在内)，表达系统具有至少5％tcp的重组蛋白质或肽表达水平或至少40克/升的细胞密度。

宿主细胞

在一个具体实施方案中，本发明提供了用于表达包含Sec-型分泌信号的重组蛋白的荧光假单胞菌表达系统。本发明的这一方面建立在下述意外发现的基础上——即发现荧光假单胞菌Sec分泌系统能够恰当地加工并从荧光假单胞菌和非荧光假单胞菌Sec信号系统中导出分泌信号。

在该具体实施方案中，宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群18(Gram-negative Proteobacteria Subgroup 18)”。“革兰氏-阴性变形菌亚群18”是指荧光假单胞菌属的所有亚种、变种、菌株及其它亚种单元(sub-special units)的集合，包括例如下列这些细胞(具有括号内所示的示范性菌株的ATCC或其它deposit数)：荧光假单胞菌生物型A，也称为生物变型1或生物变型I(ATCC 13525)；荧光假单胞菌生物型B，也称为生物变型2或生物变型II(ATCC 17816)；荧光假单胞菌生物型C，也称为生物变型3或生物变型III(ATCC 17400)；荧光假单胞菌生物型F，也称为生物变型4或生物变型IV(ATCC 12983)；荧光假单胞菌生物型G，也称为生物变型5或生物变型V(ATCC 17518)；荧光假单胞菌生物变型VI；荧光假单胞菌Pf0-1；荧光假单胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；荧光假单胞菌SBW25；以及荧光假单胞菌亚种细胞外层(NCIMB 10462)。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群19”。“革兰氏-阴性变形菌亚群19”是指荧光假单胞菌生物型A的所有菌株的集合。该生物型的特别优选的菌株是荧光假单胞菌菌株MB101(参看授予Wilcox的美国专利5,169,760)，及其衍生物。其优选衍生物的一个例子是荧光假单胞菌菌株MB214，其是通过在MB101染色体asd(天冬氨酸盐脱氢酶基因)位点插入天然大肠杆菌PlacI-lacI-lacZYA结构(也就是其中删除了PlacZ)而构成的。

本发明中可以使用的其它荧光假单胞菌菌株包括荧光假单胞菌Migula和荧光假单胞菌Loitokitok，具有下列ATCC名称：[NCIB 8286]；NRRL B-1244；NCIB 8865菌株CO1；NCIB 8866菌株CO2；1291[ATCC17458]；IFO 15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；吡咯烷；PW2[ICMP3966；NCPPB 967；NRRL B-899]；13475；NCTC 10038；NRRL B-1603[6；IFO 15840]；52-1C；CCEB 488-A[BU 140]；CCEB 553[1EM 15/47]；IAM1008[AHH-27]；IAM 1055[AHH-23]；1[IFO 15842]；12[ATCC 25323；NIH 11；den D0oren de Jong 216]；18[IFO 15833；WRRL P-7]；93[TR-10]；108[52-22；IFO 15832]；143[IFO 15836；PL]；149[2-40-40；IFO 15838]；182[IFO 3081；PJ 73]；184[IFO 15830]；185[W2L-1]；186[IFO 15829；PJ 79]；187[NCPPB 263]；188[NCPPB 316]；189[PJ227；1208]；191[IFO 15834；PJ 236；22/1]；194[Klinge R-60；PJ 253]；196[PJ288]；197[PJ 290]；198[PJ 302]；201[PJ 368]；202[PJ 372]；203[PJ 376]；204[IFO 15835；PJ 682]；205[PJ 686]；206[PJ 692]；207[PJ 693]；208[PJ722]；212[PJ 832]；215[PJ 849]；216[PJ 885]；267[B-9]；271[B-1612]；401[C71A；IFO 15831；PJ 187]；NRRL B-3178[4；IFO 15841]；KY 8521；3081；30-21；[IFO 3081]；N；PYR；PW；D946-B83[BU 2183；FERM-P3328]；P-2563[FERM-P 2894；IFO 13658]；IAM-1126[43F]；M-1；A506[A5-06]；A505[A5-05-1]；A526[A5-26]；B69；72；NRRL B-4290；PMW6[NCIB 11615]；SC 12936；A1[IFO 15839]；F 1847[CDC-EB]；F1848[CDC 93]；NCIB 10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC 2583[NCIB 8194]；H13；1013[ATCC 11251；CCEB 295]；IFO 3903；1062；或Pf-5。

在另一具体实施方案种，该方法提供了带有荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的融合蛋白的表达，该荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽选自磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号。该方法建立在下述理念上——即荧光假单胞菌Sec分泌信号加工分泌蛋白的能力表明这些细胞极其适合制造分泌蛋白。因此，源自这些细胞的信号发送系统在多重表达系统中对于这种分泌是理想的信号发送系统。因此，使用识别出的荧光假单胞菌Sec系统分泌信号表达蛋白质或肽的方法可用于任何给定的宿主系统，包括真核和原核来源的宿主系统。

在该具体实施方案中，宿主细胞可以是能够产生重组蛋白质或肽的任何细胞，包括上述荧光假单胞菌细胞。最常用于制造重组蛋白或肽的系统包括某些细菌细胞，特别是大肠杆菌，因为它们具有相对廉价的生长要求和潜在的在大批量培养物中制造蛋白质的能力。还使用酵母表达生物相关的蛋白质和肽，特别是用于研究用途。系统包括啤酒酵母(saccaromyces cerevisiae)或pichia pastoris。这些系统已经充分表征，提供了大致可接受的总蛋白表达水平并且相当快速和廉价。还出现了昆虫细胞表达系统作为以生物活性形式表达重组蛋白的一种备选方案。有时，可以制造后转译修饰的正确折叠的蛋白质。已经使用了哺乳动物细胞表达系统，例如中国仓鼠卵巢细胞，以表达重组蛋白。这些表达系统在小规模下通常有效。某些生物制剂可以由蛋白质制成，特别是在动物或人类保健用途中。在另一具体实施方案中，宿主细胞是植物细胞，包括，但不限于烟草细胞、玉米、来自拟南芥属(arabidopsis)的细胞、马铃薯或稻米细胞。在另一具体实施方案中，在该方法中分析和改变多细胞有机体，包括，但不限于转基因有机体。分析和/或改变多细胞有机体的技术大致基于下述用于改变细胞的技术。

在一个具体实施方案中，宿主细胞可以是原核生物，例如细菌细胞，包括但不限于埃希氏杆菌属或假单胞菌属。在例如由EstrellaMoumtain Community College，Arizona，USA的Dr MJ Parabee在URL：http://www.emc，micropa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BiobookDiversity_2.html上提供的“Biological Diversity：Bacteria and Archaeans”，ON-LineBiology Book的一章中描述了典型的细菌细胞。在某些具体实施方案中，宿主细胞可以是假单胞菌细胞，并且通常是荧光假单胞菌细胞。在其它具体实施方案中，宿主细胞也可以是大肠杆菌细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞，例如昆虫细胞，包括但不限于来自斜纹夜蛾、Trichoplusia Drosophila或estigmene属的细胞，或者哺乳动物细胞，包括但不限于鼠科动物细胞、仓鼠细胞、猴子细胞、灵长类细胞或人类细胞。

在一个具体实施方案中，宿主细胞可以是任何细菌分类群的一员。细胞可以是例如任何种类的真细菌的一员。宿主可以是下列分类群的任何一种中的一员：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿菌门(Chlorobi)、衣原体(Chlamydiae)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝细菌、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、恐球菌(Deinococcus)、网团菌门(Dictyoglomi)、螺旋体门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、Lentisphaerae、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体(Spirochaetes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热微菌门(Thermomicrobia)、热袍菌门(Thermotogae)、栖热菌(Thermus)(Thermales)、或疣微菌门(Verrucomicrobia)。在真细菌宿主细胞的具体实施方案中，该细胞可以是任何种类的真细菌的一员，不包括蓝细菌。

细菌宿主还可以是任何种类的变形菌的一员。变形菌宿主细胞可以是α-变形菌门、β-变形菌门、γ-变形菌门、δ-变形菌门、ε-变形菌门。此外，宿主可以是分类群α-变形菌门、β-变形菌门、γ-变形菌门的任何一种中的一员，和任何种类的γ-变形菌门的一员。

在γ-变形菌门宿主的具体实施方案中，宿主可以是分类群气单胞菌目、交替单胞菌目、肠杆菌目、假单胞菌目或黄单胞菌目；或任何种类的肠杆菌目或假单胞菌目的一员。在一个具体实施方案中，宿主细胞可以是肠杆菌目，宿主细胞是肠杆菌目中的一员，或Erwinia属、埃希氏杆菌属或沙雷氏菌属任何一种中的一员；或埃希氏杆菌属的一员。在假单胞菌目(pseudomonadales)的宿主细胞的一个具体实施方案中，宿主细胞可以是Pseudomonadaceae属的一员，甚至是Pseudomonas属的一员。γ-变形菌门宿主包括大肠杆菌属的成员和荧光假单胞菌属的成员。

其它假单胞菌属有机体也可用。假单胞菌属和关系很近的物类包括革兰氏阴性变形菌亚群1，其包括属于被R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(eds.)描述成“Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci”，Bergey’sManual of Determinative Bacteriology，pp.217-289(8th ed.，1974)(TheWilliams&Wilkins Co.，Baltimore，MD，USA)(下文中称“Bergey(1974)”)的科和/或属的变形菌的集合。表4呈现了有机体的这些科和属。

表4.在该部分中列示的科及属“Gram-Negative Aerobic Rodsand Cocci”(在Bergey(1974)中)
		科I.Pseudomonadaceae	葡萄糖杆菌属假单胞菌属黄单胞菌属菌胶团属
科II.固氮菌科(Azotobacteraceae)	氮单胞菌属(Azomonas)固氮菌属贝氏固氮菌属德克斯氏菌属(Derxia)
		科III.根瘤菌科(Rhizobiaceae)	土壤杆菌属根瘤菌属
科IV.甲基单胞菌(Methylomonadaceae)	甲基球菌属(Methylococcus)甲基单胞菌属(Methylomonas)
		科V.盐杆菌科(Halobacteriaceae)	嗜盐杆菌属(Halobacterium)嗜盐球菌属(Halococcus)
其它科	醋酸杆菌属产碱杆菌属博尔德氏杆菌属布氏杆菌属弗朗西斯氏菌属栖热菌属

“革兰氏-阴性变形菌亚群1”也包括按照分类学中采用的标准在标题中分类的变形菌。该标题也包括曾经——但已经不再归入该项中的类别，例如食酸菌属、短波单胞菌属、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、氢噬胞菌属、Oceanimonas、青枯菌属(Ralstonia)、以及寡养食单胞菌属，通过重组属于黄单胞菌属(以前被称为种)的有机体而获得的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)，通过重组属于Bergy(1974)中所定义的醋酸杆菌属的有机体而获得酸单胞菌属(Acidomonas)。此外，宿主可以包括来自假单胞菌属、Pseudomonas enalia(ATCC 14393)、黑色腐败假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)和Pseudomonasputrefaciens(ATCC 14393)的细胞，它们已经分别重新分类成Alteromonas haloplanktis、Alteromonas nigrifaciens和Alteromonasputrefaciens。类似地，已经分别将食酸假单胞菌属(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌属(ATCC 11996)重新分类成食酸丛毛单胞菌和睾丸酮丛毛单胞菌；并且已经分别将pseudomonas nigrifaciens(ATCC 19375)和pseudomonas piscicida(ATCC 15057)重新分类成Pseudoalteromonasnigrifaciens和Pseudoalteromonas piscicida。“革兰氏-阴性亚群1”还包括被归类为属于下列任何一科的变形菌门：假单胞菌科，固氮菌科(现在常称其异名，假单胞菌科的“固氮菌群”)，根瘤菌科，和甲基单胞菌(现在常称其异名，“Methylococcaceae”)。因此，除了在本文中其它地方描述的属，在“革兰氏-阴性亚群1”内的其它变形菌属包括：1)Azorhizophilus属的固氮菌类细菌；2)纤维弧菌素、寡源杆菌(Oligella)、和Teredinibacter属的假单胞菌科细菌；3)Chelatobacter、剑菌属、Liberibacter(也称为“Candidatus Liberibacter”)和中华根瘤菌属的根瘤菌科细菌；以及4)甲基杆菌属、甲基暖菌属、甲基微菌属、甲基八叠球菌属、和甲基球形菌属的甲基球菌科细菌。

在另一具体实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏-阴性变形菌亚群2”。“革兰氏-阴性变形菌亚群2”是指下列属的变形菌(除非另行说明，目录中所列的、可公开获得的、括号中所示的其标号菌株全部都标在ATCC上)：酸单胞菌属(2)；醋酸杆菌属(93)；葡萄糖杆菌属(37)；Brevundimonas(23)；拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌属(2)；布鲁氏菌(4)；土壤杆菌属(79)；Chelatobacter(2)；剑菌属(3)；根瘤菌属(144)；中华根瘤菌属(Sinorhizobium)(24)；Blastomonas(1)；鞘氨醇单胞菌(27)；产碱杆菌(88)；包特氏菌属(Bordetella)(43)；伯克霍尔德菌(73)；青枯菌属(Ralstonia)(33)；食酸菌(Acidovorax)(20)；氢噬胞菌属(9)；动胶菌属(Zoogloea)(9)；甲基杆菌(2)；甲基暖菌属(1 at NCIMB)；甲基球菌属(2)；甲基微菌属(2)；甲基单胞菌属(9)；甲基八叠球菌属(1)；甲基球形菌属；氮单胞菌属(9)；Azorhizophilus(5)；固氮菌属(64)；纤维弧菌属(3)；寡源杆菌(Oligella)(5)；假单胞菌(1139)；弗朗西斯氏菌属(4)；黄单胞菌属(229)；寡养食单胞菌(50)；和Oceanimonas(4)。

“革兰氏-阴性变形菌亚群2”的示例性宿主细胞类型包括，但不限于，下列细菌(带有ATCC或括号中所示的示例性菌株的其它标号)：甲醇酸单胞菌(ATCC 43581)；纹膜醋酸杆菌(Acetobacter aceti(ATCC15973)；氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)(ATCC 19357)；缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)(ATCC 11568)；印度贝氏固氮菌(ATCC 9039和ATCC 19361)；胶德克斯氏菌(Derxia gummosa)(ATCC 15994)；波状热菌(ATCC 23456)，流产布鲁氏菌(ATCC23448)；根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(ATCC 23308)；放射土壤杆菌(ATCC 19358)；毛根土壤杆菌(ATCC 11325)；Chelatobacter heintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(ATCC 10004)；费氏中华根瘤菌(ATCC 35423)；Blastomonas natatoria(ATCC 35951)；少动鞘氨醇单胞菌(ATCC 29837)；粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 8750)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋葱伯克霍尔德菌(ATCC 25416)；Ralstonia pickettii(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；黄色氢噬胞菌属(ATCC 33667)；分支菌胶团(生枝动胶菌Zoogloea ramigera)(ATCC19544)；Methylobacter luteus(ATCC 49878)；Methylocaldum gracile(NCIMB 11912)；荚膜甲基球菌属(Methylococcus capsulatus)(ATCC19069)；Methylomicrobium agile(ATCC 35068)；甲烷甲基单胞菌属(ATCC 35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM 549)；敏捷氮单胞菌属(ATCC 7494)；Azorhizophiluspaspali(ATCC 23833)；褐球固氮菌(ATCC 9043)；Cellvibrio mixtus(UQM 2601)；尿道寡源杆菌(ATCC 17960)；绿脓假单胞菌(ATCC10145)；荧光假单胞菌(ATCC 35858)；土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)(ATCC 6223)；嗜麦寡养食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC 13637)；野油菜黄单胞菌属(Xanthomonascampestris)(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。

在另一具体实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏-阴性变形菌亚群3”。“革兰氏-阴性变形菌亚群3”是指下列属的变形菌：Brevundimonas；土壤杆菌(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中华根瘤菌(Sinorhizobium)；Blastomonas；鞘氨醇单胞菌；产碱杆菌属(Alcaligenes)；伯克霍尔德菌；青枯菌属(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氢噬胞菌属；甲基杆菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；Azorhizophilus；固氮菌(Azotobacter)；纤维弧菌属；寡源杆菌(Oligella)；假单胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌属(Francisella)；寡养食单胞菌；黄单胞菌素；和Oceanimonas。

在另一具体实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏-阴性变形菌亚群4”。“革兰氏-阴性变形菌亚群4”是指下列属的变形菌：Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇单胞菌；伯克霍尔德菌；青枯菌属(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氢噬胞菌属；Mehtylobacter；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；Azorhizophilus；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌(Oligella)；假单胞菌；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌属(Francisella)；寡养食单胞菌；黄单胞菌素；和Oceanimonas。

在一个具体实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏-阴性变形菌亚群5”。“革兰氏-阴性变形菌亚群5”是指下列属的变形菌：甲基杆菌属；甲基暖菌属；甲基球菌属；甲基微菌属；甲基单胞菌属；甲基八叠球菌属；甲基球形菌属；氮单胞菌属；Azorhizophilus；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌(Oligella)；假单胞菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗朗西斯氏菌属(Francisella)；寡养食单胞菌；黄单胞菌素；和Oceanimonas。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群6”。“革兰氏-阴性变形菌亚群6”是指下列属的变形菌：Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇单胞菌；伯克霍尔德菌；青枯菌属(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氢噬胞菌属；氮单胞菌属；Azorhizophilus；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌(Oligella)；假单胞菌；Teredinibacter；寡养食单胞菌；黄单胞菌属；和Oceanimonas。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群7”。“革兰氏-阴性变形菌亚群7”是指下列属的变形菌：氮单胞菌属；Azorhizophilus；固氮菌；纤维弧菌属；寡源杆菌(Oligella)；假单胞菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡养食单胞菌；黄单胞菌属；和Oceanimonas。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群8”。“革兰氏-阴性变形菌亚群8”是指下列属的变形菌：Brevundimonas；Blastomonas；鞘氨醇单胞菌；伯克霍尔德菌；青枯菌属(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氢噬胞菌属；假单胞菌；寡养食单胞菌；黄单胞菌属；和Oceanimonas。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群9”。“革兰氏-阴性变形菌亚群9”是指下列属的变形菌：Brevundimonas；伯克霍尔德菌；青枯菌属(Ralstonia)；食酸菌(Acidovorax)；氢噬胞菌属；假单胞菌；寡养食单胞菌；和Oceanimonas。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群10”。“革兰氏-阴性变形菌亚群10”是指下列属的变形菌：伯克霍尔德菌；青枯菌属(Ralstonia)；假单胞菌；寡养食单胞菌；和黄单胞菌属。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群11”。“革兰氏-阴性变形菌亚群11”是指下列属的变形菌：假单胞菌属；寡养单胞菌属；和黄单胞菌属。宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群12”。“革兰氏-阴性变形菌亚群12”是指下列属的变形菌：伯克霍尔德菌；青枯菌；假单胞菌。宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群13”。“革兰氏-阴性变形菌亚群13”是指下列属的变形菌：伯克霍尔德菌；青枯菌；假单胞菌属；和黄单胞菌属。宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群14”。“革兰氏-阴性变形菌亚群14”是指下列属的变形菌：假单胞菌属和黄单胞菌属。宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群15”。“革兰氏-阴性变形菌亚群15”是指假单胞菌属的变形菌。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群16”。“革兰氏-阴性变形菌亚群16”是指下列属的变形菌(带有ATCC或括号中所示的示例性菌株的其它标号)：Pseudomonas abietaniphila(ATCC 700689)；铜绿假单胞菌(ATCC 10145)；产碱假单胞菌(ATCC 14909)；Pseudomonasanguilliseptica(ATCC 33660)；Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674)；Pseudomonas flavescens(ATCC 51555)；门多萨假单胞菌(ATCC25411)；硝基还原假单胞菌(ATCC 33634)；Pseudomonas oleovorans(ATCC 8062)；加产碱假单胞菌(ATCC 17440)；Pseudomonasresinovorans(ATCC 14235)；Pseudomonas straminea(ATCC 33636)；蘑菇假单胞菌(ATCC 25941)；Pseudomonas alcaliphila；Pseudomonasalginovora；Pseudomonas  andersonii；Pseudomonas  asplenii (ATCC23835)；Pseudomonas azelaica(ATCC 27162)；Pseudomonas beijerinckii(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；Pseudomonas boreopolis(ATCC33662)；Pseudomonas brassicacearum；Pseudomonas butanovora(ATCC43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC 55703)；Pseudomonas aurantiaca(ATCC 33663)；Pseudomonas chlororaphis  (ATCC 9446，ATCC13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；Pseudomonas fragi(ATCC 4973)；Pseudomonas lundensis(ATCC 49968)；Pseudomonas taetrolens(ATCC4683)；Pseudomonas cissicola(ATCC  33616)；Pseudomonascoronafaciens；Pseudomonas diterpeniphila；Pseudomonas elongata(ATCC10144)；Pseudomonas flectens(ATCC  12775)；PseudomonasazotofOrnans；Pseudomonas  brenneri；Pseudomonas  cedrella；Pseudomonas corrugata(ATCC 29736)；Pseudomonas extremorientalis；荧光假单胞菌(ATCC 35858)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonaslibanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC 700871)；Pseudomonasmarginalis(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；Pseudomonasmucidolens(ATCC 4685)；Pseudomonas orientalis；Pseudomonasrhodesiae；Pseudomonas synxantha(ATCC 9890)；Pseudomonas tolaasii(ATCC 33618)；Pseudomonas veronii(ATCC 700474)；Pseudomonasfrederiksbergensis；Pseudomonas geniculata(ATCC 19374)；Pseudomonasgingeri；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonashalodenitrificans；Pseudomonas halophila；Pseudomonas hibiscicola(ATCC19867)；Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670)；Pseudomonashydrogenovora；Pseudomonas jessenii(ATCC 700870)；Pseudomonaskilonensis；Pseudomonas lanceolata(ATCC 14669)；Pseudomonas lini；Pseudomonas marginata(ATCC 25417)；Pseudomonas mephitica(ATCC33665)；Pseudomonas denitrificans(ATCC 19244)；Pseudomonaspertucinogena(ATCC 190)；Pseudomonas pictorum(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；Pseudomonas fulva(ATCC 31418)；Pseudomonas monteilii(ATCC 700476)；Pseudomonas mosselii；Pseudomonas oryzihabitans(ATCC 43272)；Pseudomonas plecoglossicida(ATCC 700383)；Pseudomonas putida(ATCC 12633)；Pseudomonasreactans；Pseudomonas spinosa(ATCC 14606)；Pseudomonas balearica；Pseudomonas luteola(ATCC 43273)；Pseudomonas stutzeri(ATCC17588)；Pseudomonas amygdali(ATCC 33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；Pseudomonas caricapapayae(ATCC 33615)；Pseudomonas cichorii(ATCC 10857)；Pseudomonas ficuserectae(ATCC35104)；Pseudomonas fuscovaginae；Pseudomonas meliae(ATCC 33050)；假单胞菌(Pseudomonas syringae)(ATCC 19310)；Pseudomonasviridiflava(ATCC 13223)；Pseudomonas thermocarboxydovorans(ATCC35961)；Pseudomonas thermotolerans；Pseudomonas thivervalensis；Pseudomonas vancouverensis(ATCC 700688)；Pseudomonaswisconsinensis；和Pseudomonas xiamenensis。

宿主细胞可以选自“革兰氏-阴性变形菌亚群17”。“革兰氏-阴性变形菌亚群17”是指在本领域中被称作“荧光假单胞菌属”的变形菌，包括属于例如下列假单胞菌属的变形菌：Pseudomonas azotofOrnans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；Pseudomonas corrugata；Pseudomonas extremorientalis；荧光假单胞菌；Pseudomonas gessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii；边缘假单胞菌；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens；Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae；产黄假单胞菌；Pseudomonas tolaasii；和Pseudomonas veronii。

其它合适的宿主包括在本文献其它部分中分类的那些，例如革兰氏(+)变形菌。在一个具体实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。对于大肠杆菌MG1655，已经确立了大肠杆菌的基因组序列(Blattner等，(1997)The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science277(5331)：1453-74)，且对于大肠杆菌K12(MWG Inc，High Point，NC)，可通过商业途径获得DNAmicroarrays。可以在富营养培养基，例如Luria-Bertani(LB)(10克/升胰胨，5克/升NaCl，5克/升酵母提取物)，或确定的基本培养基，例如M9(6克/升Na₂HPO₄，3克/升KH₂PO₄，1克/升NH₄Cl，0.5克/升NaCl，pH7.4)中用1％葡萄糖之类的合适碳源培养大肠杆菌。常规地，将大肠杆菌的过夜培养物稀释并在振荡培养瓶或发酵器中植入新的富营养或标准培养基中并在37℃生长。

宿主还可以来自哺乳动物，例如来自哺乳动物(包括任何人类或非人类哺乳动物)的细胞。哺乳动物可以包括，但不限于灵长动物、猴子、猪科、绵羊科、牛科、啮齿动物、有蹄动物、猪、swine、羊、羔羊、山羊、家畜、鹿、骡、马、猴子、猿、狗、猫、鼠和小鼠。

宿主细胞还可以来自植物。对于基因和调节序列的识别，可以选择任何植物。对于基因和调节序列的分离，合适的植物目标的例子包括，但不限于，苜蓿、苹果、杏、拟南芥(arabidopsis)、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、花茎甘蓝、球芽甘蓝、卷心菜、菜籽油、罗马甜瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽叶、柑橘属果树、克莱门氏小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、蔓越橘、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣(endive)、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、葡萄柚、甘露、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜籽、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、番木瓜、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、radiscchio、萝卜、油菜籽、覆盆子、稻米、黑麦、高粱、美国长叶松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、sugarbeet、甘蔗、向日葵、甘薯、苏合香、柑橘(tangerine)、茶、烟草、番茄、黑小麦、草地、芜菁甘蓝、葡萄树、西瓜、小麦、山药和绿皮密生西葫芦。在一些具体实施方案中，在该方法中可用的植物为拟南芥(Arabidopsis)、玉米、小麦、大豆和棉花。

对于重组蛋白或肽的表达，或对于识别的补充基因的调节，可以使用任何植物启动子。植物启动子中包含的元件可以是通常位于转录初始位点的大约25至35上游碱基对(5’)之间的TATA框或Goldberg-Hogness框，和位于70和100上游碱基之间的CCAAT框。在植物中，CCAAT框具有与哺乳动物启动子的功能类似序列不同的一致序列(Messing等(1983)In：Genetic Engineering of Plants，Kosuge等，eds.，pp.211-227)。此外，几乎所有启动子都在转录初始位点的上游包括延伸大约-100bp至-1000bp或更高的附加的上游激活序列或增强子(Benoist and Chambon(1981)Nature 290：304-310；Gruss等(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.78：943-947；和Khoury and Gruss(1983)Cell27：313-314)。

蛋白质制造/发酵

本发明的方法最适宜提高宿主细胞中重组蛋白质或肽的产量。提高的产量可以是恰当加工过的蛋白质或肽在所得每克蛋白质中或在每克宿主蛋白质中的含量提高。提高的产量还可以是制成的可回收的蛋白质或肽在每克重组蛋白中或在每克宿主细胞蛋白质中的含量提高。提高的产量还可以是提高的总量与提高的恰当加工的、活性或可溶蛋白质含量的任意结合。

重组蛋白的改进表达可以是蛋白质的溶度提高。可以从宿主细胞的细胞质、周质或细胞外培养基中制造并回收重组蛋白或肽。蛋白质或肽可以是不溶或可溶的。蛋白质或肽可以包括一个或多个定向序列以协助提纯。

细胞生长

可以使用本领域已知的任何转化方法用载体进行假单胞菌宿主细胞的转化，并且细菌宿主细胞可以作为完整细胞或作为内在质体(也就是包括胞质体)转化。示例性的转化方法包括穿孔法(例如电穿孔)、内在质体融合、细菌接合、和二价阳离子处理，例如氯化钙处理或CaCl/Mg2+处理，或本领域其它公知的方法。参看，例如，Morrison，J.Bact.，132：349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods inEnzymology，101：347-362(Wu等，eds，1983)，Sambrok等，MolecularCloning，A Laboratory Manual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transferand Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等，eds，1994)。

此处所用的术语“发酵”既包括使用字面意义的发酵的具体实施情况，又包括使用其它非发酵型培养方式的具体实施情况。发酵可以在任何规模下进行。在一个具体实施方案中，发酵培养基可以选自富营养(rich)培养基、基本培养基和无机盐培养基；可以使用富营养培养基，但优选避免使用。在另一具体实施方案中，选择基本培养基或无机盐培养基。在再一具体实施方案中，选择基本培养基。在又一具体实施方案中，选择无机盐培养基。无机盐培养基特别优选。

无机盐培养基包括无机盐和碳源，例如葡萄糖、蔗糖或甘油。无机盐培养基的例子包括，例如，M9培养基、假单胞菌培养基(ATCC179)、Davis and Mingioli培养基(参看，BD Davis&ES Mingioli(1950)，在J.Bact.60：17-28中)。用于制造无机盐培养基的无机盐包括选自例如磷酸钾、硫酸铵或氯化铵、硫酸镁或氯化镁、和微量矿物质(例如氯化钙、铁、铜、锰和锌的硼酸盐和硫酸盐)的那些无机盐。在无机盐培养基中不包含任何有机氮源，例如胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物。相反，使用无机氮源并且其可以选自例如铵盐、氨水和气态氨。优选无机盐培养基包含葡萄糖作为碳源。与无机盐培养基相比，基本培养基还可以包含无机盐和碳源，但是可以补充少量氨基酸、维生素、胨或其它成分，尽管这些只能以非常小的量加入。

在一个具体实施方案中，可以使用下表5所列的组分制备培养基。可以按照下列顺序添加组分：首先可以将(NH₄)HPO₄、KH₂PO₄和柠檬酸溶于大约30升蒸馏水；然后可以加入微量元素的溶液，然后加入防沫剂，例如Ucolub N115。然后，在热杀菌(例如大约121℃)后，可以加入葡萄糖MgSO₄和硫胺素-HCL的无菌溶液。使用氨水实现大约6.8的pH控制。然后加入无菌蒸馏水将初始体积调节至371减甘油原料(123毫升)。这些化学品可购自各个供应商，例如Merck。该培养基可以进行高细胞密度培养(HCDC)以生长假单胞菌属和相关细菌。HCDC可以作为分批法开始，然后进行两相进料分批培养。在分批部件中无限生长之后，可以在降低的比生长速率下经过3加倍时间控制生长，其中生物量浓度可以提高数倍。Riesenberg，D.；Schulz，V.；Knorre，W.A.；Pohl，H.D.；Korz，D.；Sanders，E.A.；Ross，A.；Derckwer，W.D.(1991)“Hign cell density cultivation of Escherichia coli at controlledspecific growth rate”J Bviotechnol：20(1)17-27描述了这些培养程序的进一步细节。

表5：培养基组成
		组分	初始浓度
KH2PO4	13.3克/升
		(NH4)2HPO4	4.0克/升
柠檬酸	1.7克/升
		MgSO4-7H2O	1.2克/升
微量金属溶液	10毫升/升
		硫胺素HCl	4.5毫克/升
葡萄糖-H2O	27.3克/升
		防沫剂Ucolub N115	0.1毫升/升
		进料溶液
MgSO4O-7H2O	19.7克/升
		葡萄糖-H2O	770克/升
NH3	23克
微量金属溶液
		6克/升Fe(III)柠檬酸盐1.克/升MnCl2-4H2O
0.8克/升ZmCH2COOl2-2H2O 0.3克/升H3BO3
		0.25克/升Na2MoO4-2H2O 0.25克/升CoCl26H2O
0.15克/升CuCl22H2O 0.84克/升乙烯
		二次氮基-四乙酸Na2sah 2H2O
(Ttritriplex III，Merck)

可以以任何发酵形式培养本发明的表达系统。例如，此处可以使用分批、进料-分批、半连续和连续发酵模式。

本发明的表达系统可用于任何发酵规模(也就是体积)的转基因表达。因此，可以使用例如微升规模、厘升规模和分升规模发酵体积；可以使用1升规模和更大的发酵体积。在一个具体实施方案中，发酵体积为1升或更高。在另一具体实施方案中，发酵溶剂为5升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、200升、500升、1000升、2000升、5000升、10000升或50000升或更高。

在本发明中，在允许宿主细胞存活的温度范围内，优选在大约4℃至大约55℃(包括4℃和55℃在内)的温度，进行转化的宿主细胞的生长、培养和/或发酵。因此，例如，此处对于本发明的宿主细胞使用的术语“生长”，“培养”和“发酵”本质上是指在大约4℃至大约55℃(包括4℃和55℃在内)的温度范围内的“生长”、“培养”和“发酵”。此外，“生长”用于指活性细胞分裂和/或增大的生物状态，以及代谢维持非分裂和/或非增大细胞的生物状态，术语“生长”的后一种用法与术语“维持”同义。

细胞密度

在表达重组分泌蛋白质中使用荧光假单胞菌的另一优点包括荧光假单胞菌与大肠杆菌或其它细菌表达系统相比以高细胞密度生长的能力。为此，本发明的荧光假单胞菌表达系统可以提供大约20克/升或更高的细胞密度。本发明的荧光假单胞菌表达系统还可以提供至少大约70克/升的细胞密度，其表示成生物量/单位体积，生物量是作为干燥细胞重量测得的。

在一个具体实施方案中，细胞密度为至少20克/升。在另一具体实施方案中，细胞密度为至少25克/升，30克/升，35克/升，40克/升，45克/升，50克/升，60克/升，70克/升，80克/升，90克/升，100克/升，110克/升，120克/升，130克/升，140克/升，或至少150克/升。

在另一具体实施方案中，诱导时的细胞密度为20克/升至150克/升；20克/升至120克/升；20克/升至80克/升；25克/升至80克/升；30克/升至80克/升；35克/升至80克/升；40克/升至80克/升；45克/升至80克/升；50克/升至80克/升；50克/升至75克/升；50克/升至70克/升；40克/升至80克/升。

相关蛋白质或肽的分离

通常，该方法与传统的表达系统相比，提高了表达出的正确或恰当加工的重组蛋白的量。特别地，本发明提高了恰当加工的重组蛋白的量。

在某些具体实施方案中，本发明提供了一种改进宿主细胞中重组蛋白或肽的溶度的方法。此处所用的术语“可溶”是指在生理条件下在缓冲剂中旋转10-30分钟时，蛋白质在大约5000至20000×重力的离心作用下不沉淀。可溶蛋白质不构成包含体或其它沉淀物的组成部分。类似地，“不溶”是指在生理条件下在缓冲剂中旋转10-30分钟时，蛋白质或肽在大约5000至20000×重力的离心作用下沉淀。不溶蛋白质或肽可以构成包含体或其它沉淀物的组成部分。术语“包含体”包括细胞内包含的任何细胞内物体，在其中隔出蛋白质或肽的聚集体。

本发明还提高了活性重组蛋白或肽的回收率。可以通过任何方便的活体外或活体内检定法测量识别出的与母体多肽、多肽变体、片段(segment)取代的多肽和/或残基取代的多肽之间的相互作用，从而测量活性蛋白质含量。因此，可以使用活体外检定法测定识别出的相关蛋白质和肽之间(例如酶与底物之间、激素与激素受体之间、抗体与抗原之间等)的任何可检出的相互作用。这种检测可以包括测量比色变化、放射性变化、溶度变化、分子量变化(通过凝胶电泳和/或凝胶排阻法等测得)。活体内检定法包括，但不限于，检测生理效应(例如重量增加、电解质平衡变化、凝血时间变化、血凝块溶解变化和抗原反应的诱导)的检定法。通常，可以使用任何活体内检定法，只要存在可变参数以检测识别出的多肽与相关多肽之间相互作用的变化。参看，例如，美国专利5,834,250。

为了从周质中释放重组蛋白，已经使用了包含化学品(例如氯仿)的处理(Ames等(1984)J.Bacteriol.，160：1181-1183)、胍-HCl和TritonX-100(Naglak and Wang(1990)Enzyme Microb.Technol.，12：603-611)。然而，这些化学品非惰性并且可能对许多重组蛋白产品或随后的提纯程序产生有害影响。还提出了大肠杆菌细胞的甘氨酸处理(其导致外膜的渗透)以释放周质内含物(Ariga等(1989)J.Ferm.Bioeng.，68：243-246)。最广泛使用的重组蛋白的周质释放方法是渗压休克(Nosal and Heppel(1966)J.Biol.Chem.，241：3055-3062；Neu andHeppel(1965)J.Biol.Chem.，240：3685-3692)、鸡蛋清(HEW)-溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)处理(Neu and Heppel(1964)J.Biol.Chem.，239：3893-3900；Witholt等(1976)Biochim.Biophys.Acta，443：534-544；Pierce等(1995)ICheme Research.Event，2：995-997)、和结合的HEW-溶菌酶/渗压休克处理(French等(1996)Enzyme and Microb.Tech.，19：332-338)。French法包括细胞在分馏缓冲剂中再悬浮，然后回收周质馏分，其中渗压休克之后立即进行溶菌酶处理。还论述了重组蛋白，热紫链霉菌α-淀粉酶的过度表达和宿主有机体的生长相对回收率的影响。

通常，这些程序包括在渗透性稳定培养基中的初始分裂(disruption)，然后在非稳定培养基中选择性释放。在所述特定程序之间，这些培养基的组成(pH、保护剂)和所用分裂方法(氯仿、HEW-溶菌酶、EDTA、超声处理)可以改变。Stabel等(1994)VeterinaryMicrobiol.，38：307-314论述了使用两极离子型去垢剂代替EDTA以改变HEW-溶菌酶/EDTA处理，对于使用细胞内分解酶系统分裂大肠杆菌的概述，参看Dabora和Cooney(1990)在Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，卷43，A.Fiechter，ed.(Springer-Verlag：Berlin)，pp.11-30中。

从细胞质中以可溶蛋白或折射粒子的形式回收重组蛋白的传统方法包括通过机械破坏使细菌细胞分解。机械破坏通常包括在液体悬浮液中产生局部空化，用硬珠进行迅速搅动，或细胞悬液的研磨(BacterialCell Surface Technique，Hancock and Poxton(John Wiley&Sons Ltd，1988)，第3章，55页)。

HEW＝溶菌酶起到生物化学作用以水解细胞壁的肽葡聚糖骨架。该方法最初是Zinder和Arndt(1956)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，42：586-590开发出的，其用卵清蛋白(其含有HEW-溶菌酶)处理大肠杆菌以制造之后被称作内在质球的圆形细胞球。这些结构保留了一些细胞壁组分，但是具有大的暴露出细胞质膜的表面积。美国专利5,169,772公开了一种从细菌中提纯肝素酶的方法，包括在渗透稳定的培养基(例如20％蔗糖溶液)中使用例如EDTA、溶菌酶或有机化合物破坏细菌包膜，通过用低离子强度的缓冲剂处理细菌来从破裂细菌的周质空间释放出非肝素酶类的蛋白质，并且通过用缓冲盐溶液处理低离子强度洗涤过的细菌来释放肝素酶类的蛋白质。

可以在多种表达系统上以不同的成功程度使用这些方法的许多不同变体(Joseph-Liazun等，(1990)Gene，86：291-295；Carter等(1992)Bio/Technology，10：163-167)。提出了诱导重组细胞培养以产生溶菌酶的努力。EP 0 155 189公开了一种诱导重组细胞培养以产生溶菌酶的方法，其通常被认为通过破坏或溶解细胞壁结构来杀灭这些宿主细胞。

美国专利4,595,658公开了一种促进输送到大肠杆菌周质空间中的蛋白质外化的方法。该方法不需要使用溶菌酶处理、机械研磨或细胞的渗压休克处理就可以选择性分离位于周质中的蛋白质。美国专利4,637,980公开了如下制造细菌产品：用直接或间接对产品编码的DNA分子转化热敏溶原性细菌，在许可条件下培养转化体以在细胞内表达基因产品，并通过提高温度诱发噬菌体编码功能来使产品外化。Asami等(1997)J.Ferment.and Bioeng.，83：511-516公开了通过T4噬菌体传染进行大肠杆菌细胞的同步破裂，且Tanji等(1998)J.Ferment.andBioeng.，85：74-78公开了在T4噬菌体中编码的溶菌基因的受控表达以产生大肠杆菌细胞的温和破裂。

在细胞溶菌作用下，染色体组DNA从细胞质渗出到培养基中，并导致流体粘度的明显提高，这阻碍了离心力场中的固体沉降。在不存在剪切力(例如在机械破坏以分解DNA聚合物的过程中产生的剪切力)，通过粘性流体的较慢的固体沉降速率越慢会在离心过程中导致固体与液体的较差分离。除了机械剪切力，存在使DNA聚合物降解的核酸分解酶。在大肠杆菌中，外源基因endA对通常分泌到周质中并以内切核苷酸方式将DNA裂解成的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶编码(成熟蛋白质的分子量为大约24.5kD)。已经提出，大肠杆菌相对较弱地表达endA(Wackernagel等(1995)Gene 154：55-59)、

在一个具体实施方案中，不要求附加的二硫键助长条件和试剂来从宿主细胞中回收活性可溶形式的含二硫键的识别出的多肽。在一个具体实施方案中，转基因肽、多肽、蛋白质或其片段具有激活态的折叠分子内构造。在一个具体实施方案中，转基因肽、多肽、蛋白质或片段在激活态下含有至少一个分子内二硫键；并且可以含有最多2、4、6、8、10、12、14、16、18或20或更多二硫键。

本发明的蛋白质可以通过本领域公知的标准技术分离提纯至相当纯度，包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、镍色谱法、羟磷灰石色谱法、反相色谱法、植物血凝素色谱法、制备电泳法、去垢剂增溶、用这些物质进行选择性沉淀作为柱色谱法、免疫纯化法和其它方法。例如，具有确定分子粘合性能的蛋白质可以可逆融合配体。使用合适的配体，可以将蛋白质选择性吸附到提纯柱上，然后以相对纯净的形式从柱中释放出来。然后通过酶活性去除融合蛋白。此外，可以使用免疫亲和柱或Ni-NTA柱提纯蛋白质。在例如R.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag：N.Y.(1982)；Deutscher，Guide to Protein Purification，Academic Press(1990)；美国专利4,511,503；S.Roe，Protein Purification Techniques：APractical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AK Patra等，ProteinExpr Purif，18(2)：p/182-92(2000)；和R.Mukhija等，Gene 165(2)：p.303-6(1995)中进一步描述了通用技术。还可以参看，例如，Ausubel等(1987和定期增补)；Deutscher(1990)“Guide to Protein Purification，”Methods in Enzymology卷182和该系列的其它卷；Coligan等(1996和定期增补)Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene，NY；和关于蛋白质提纯产品引用的制造商文献，例如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。结合重组技术可以融合到合适的片段上，例如融合到FLAG序列或可经由蛋白酶可去除序列融合的对等物上。参看，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie 12：69-70；Hochuli(1990)“Purification of Recombinant Proteins with Metal ChelateAbsorbent”，在Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle and Methods12：87-98，Plenum Press，NY中；和Crowe等(1992)QLAexpress：TheHigh Level Expression&Protein Purification System QULAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。

表达蛋白质的检测是通过本领域已知的方法实现的并且包括，例如，放射性免疫测定、Western印迹技术或免疫沉淀反应。

可以通过许多方法从重组细胞培养物中回收和提纯重组制成和表达的酶，例如如果需要，对于最终提纯步骤可以使用高效液相色谱法(HPLC)。

在本发明中表达的某些蛋白质可以形成不溶聚集体(“包含体”)。对于从包含体中提纯蛋白质，适合使用几种方案。例如，包含体提纯通常包括通过宿主细胞的破裂(例如通过在50mM TRIS/HCL pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgCl₂，1mM DTT，0.1mM ATP，和1mM PMSF的缓冲剂中培养)来提取、分离和/或提纯包含体。通过French Press 2-3次，从而使细胞悬液进行细胞溶解。也可以使用Polytron(BrinkmanInstruments)使细胞悬液均化或在冰上进行声处理。其它溶解细菌的方法是本领域技术人员显而易见的(参看，例如上述Sambrook等；上述Ausubel等)。

如果需要，可以使包含体溶解，并且通常将溶解的细胞悬液离心分离以去除不需要的不溶物。可以通过用相容缓冲剂稀释或渗析来使形成包含体的蛋白质复性(renature)。合适的溶剂包括，但不限于脲(大约4M至大约8M)、甲酰胺(至少大约80％，体积/体积基)，和盐酸胍(大约4M至大约8M)。尽管盐酸胍和类似试剂是变性剂，但该变性不是不可逆的，并且在变性剂去除(例如通过渗析)或稀释时产生复性，从而可以重新形成免疫和/或生物活性的蛋白质。其它合适的缓冲剂是本领域技术人员已知的。

或者，可以从宿主周质中提纯重组蛋白质或肽。在宿主细胞溶解后，当将重组蛋白输出到宿主细胞的周质中时，可以通过冷渗压休克以及本领域技术人员已知的其它方法分离细菌的周质馏分。为了从周质中分离重组蛋白，例如，可以离心处理细菌细胞以形成丸粒。这些丸粒可以在含有20％蔗糖的缓冲剂中重新悬浮。为了溶解细胞，可以离心处理细菌并将丸粒重新悬浮在冰冷的5mM MgSO₄中并在冰浴中保持大约10分钟。可以离心处理细胞悬液并将上清液滗析并保存。可以通过本领域技术人员公知的标准分离技术从宿主蛋白质中分离上清液中存在的重组蛋白。

初始盐分分离可以从相关重组蛋白中分离许多不需要的宿主细胞蛋白质(或来自细胞培养基的蛋白质)。一个这样的例子可以是硫酸铵。硫酸铵通过有效减少蛋白质混合物中水的量来使蛋白质沉淀。蛋白质随后根据其溶度沉淀。蛋白质越疏水，就越可能在较低的硫酸铵浓度下沉淀。典型的方案包括在蛋白质溶液中加入饱和硫酸铵，从而使所得硫酸铵浓度在20-30％之间。该浓度会使多数疏水蛋白质沉淀。然后弃置沉淀物(除非相关蛋白质是疏水的)并在上清液中加入硫酸铵至已知能使相关蛋白质沉淀的浓度。然后使沉淀物溶于缓冲剂并根据需要通过渗析或透滤法去除过量的盐。依靠蛋白质溶度进行的其它方法(例如冷乙醇沉淀法)是本领域技术人员公知的，并可用于分馏络合蛋白质混合物。

可以使用透过不同孔径大小的膜(例如Amicon或Millipore膜)的超滤利用重组蛋白的分子量将其与具有更大或更小尺寸的蛋白质分离。作为第一步骤，可以透过下述膜超滤蛋白质混合物——该膜的孔径大小可以截留比相关蛋白质的分子量小的分子量。然后再将超滤的渗余物用下述膜超滤——该膜具有大于相关蛋白质分子量的分子截留。重组蛋白可以透过膜进入滤液。然后如下对该滤液进行色谱分析。

还可以根据尺寸、表面净电荷、疏水性和对配体的亲合力将重组蛋白与其它蛋白质分离。此外，可以将蛋白质的抗体结合到柱基质(column matrices)上并将蛋白质免疫提纯。所有这些方法都是本领域公知的。对本领域技术人员显而易见的是，可以使用来自许多不同制造商(例如Pharmacia Biotech)以任何规模进行色谱技术。

实践中，通常在培养液中发现导向周质的异质蛋白质(参看欧洲专利EP 0 288 451)，这可能是由于损害或提高了外细胞膜流动性。可以使用各种渗透外细胞膜的机制提高该“被动”分泌的速率：大肠杆菌素(Miksch等(1997)Arch.Microbiol.167：143-150)；生长速率(Shokri等，(2002)App Miocrobiol Biotechnol 58：386-392)；TolIII过度表达(Wan和Baneyx(1998)Protein Expression Purif14：13-22)；细菌素释放蛋白(Hsiung等(1989)Bio/Technology 7：267-71)、大肠杆菌素A溶解蛋白(Lloubes等(1993)Biochimie 75：451-8)、使周质蛋白渗漏的突变体(Furlong和Sundstrom(1989)Developments in Indus.Microbio.30：141-8)；融合partner(Jeong和Lee(2002)Appl.Environ.Microbio.68：4979-4985)；通过渗压休克回收(Taguchi等(1990)BiochimicaBiophysica Acta 1049：278-85)。将工程蛋白运送到周质空间中，随后局部定位在培养液中，由此在大肠杆菌中制造恰当折叠的活性蛋白质(Wan和Baneyx(1998)Protein Expression Purif.14：13-22；Simmons等(2002)J.Immun.Meth.263：133-147；Lundell等(1990)J.Indust.Microbio.5：215-27)。

革兰氏-印迹细菌已经演化出许多用于穿过双重膜输出蛋白质的系统(参看图1)。这些分泌途径包括，例如：用于一步穿过内在质及外膜易位的ABC(I型)路径、Path/Fla(III型)路径和Path/Vir(IV型)路径；用于穿过质膜易位的Sec(II型)、Tat、MscL和Holins路径；和用于两步穿过内在质和外膜易位的Sec-加-fimbrial usher孔蛋白(FUP)、Sec-加-自动转运子(AT)、Sec-加-两partner分泌(TPS)、Sec-加-主末端分支(MTB)和Tat-加-MTB路径。并非所有细菌都具有所有这些分泌路径。

三种蛋白质系统(I、III和IV型)在单个能量结合步骤中同时穿过内膜和外膜分泌蛋白质。四种系统(Sec、Tat、MscL和Holins)仅穿过内膜分泌，另外四个系统(MTB、FUP、AT和TPS)仅穿过外膜分泌。

使用本发明的分泌信号或宿主细胞转运到周质中的蛋白质还可以在进一步的步骤中主动输出到细胞外介质中。用于主动转运的已知机制通常是通过自动转运子、两partner分泌系统、主末端分支系统或fimbrial usher孔蛋白。

使用本发明的分泌信号或宿主细胞转运到周质中的蛋白质还可以在进一步的步骤中主动输出到细胞外介质中。用于主动转运的已知机制通常是通过自动转运子、两partner分泌系统、主末端分支系统或fimbrial usher孔蛋白。

通过自动转运子(AT)路径转运的蛋白质通常含有N-末端Sec-型信号肽、中央通道区(central passenger domain)和α-区的C-末端250-300氨基酸残基。不同自动转运子的α-区高度同源，而通道区在序列和尺寸上明显不同。通过Sec系统和信号肽的裂解穿过内膜分泌后，α-区的低聚物形成外膜孔蛋白，通过该孔蛋白分泌通道区(Veiga等(2002)EMBO J.，21：2122-2131)。通道区或者被释放到环境中，或者残留在细胞表面上。多数自动转运子与革兰氏-阴性病原体的毒性有关。

两-partner分泌(TPS)系统在功能上与AT系统类似，尽管蛋白质没有共享序列同源性。TPS系统由两个通过相邻基因编码的含信号肽的蛋白质构成。一个蛋白质含有通道区，另一个含有α-区。两个蛋白质都通过Sec系统分泌到周质中，并且带有通道区的蛋白质进一步通过由带有α-区的蛋白质形成的外膜孔输出(Jacob-Dubuisson等(2001)Mal Microbiol.40：306-13)。TPS系统的多数底物蛋白是来自1651至5640氨基酸的大蛋白质。尽管它们与N-末端250残基(其是转运子的导向序列)极其相似，但它们的C-末端序列非常不同。

主末端分支(MTB)是使已经折叠的蛋白质从周质转译到细胞外介质中的大复合物。该复合物包含至少10个蛋白质组分，其中一些与4型菌毛生源系统共享序列同源性(Pugsley(1993)Microbiol.Rev.57：50-108)。编码功能MTB系统的基因通常在基因组中形成聚簇。尚未充分理解MTB作用下的蛋白质分泌的导向信号和分子机制。

FUP系统是革兰氏-阴性变形菌和蓝细菌中许多纤毛(菌毛)的生物形成原因。为每一伞毛的结构蛋白编码的操纵子也为伞毛类周质伴侣蛋白和伞毛类外膜usher蛋白编码。所有这些蛋白质都可以用Sec-型信号肽合成为前体蛋白。在通过Sec系统穿过内膜转移后，将菌毛亚基结合到伴侣蛋白上，这防止菌毛在周质中的自组装。伴侣蛋白与usher蛋白之间的相互作用释放出蛋白质亚基，其随后相互作用并通过usher蛋白穿过外膜分泌。

复性和再折叠

可以将不溶蛋白复性或再折叠以产生二级和三级蛋白质构象。可以在完成重组产品的构造时根据需要使用蛋白质再折叠步骤。可以使用本领域已知的促进蛋白质离解/结合的试剂实现再折叠和复性。例如，可以用二硫苏糖醇培养蛋白质，然后用氧化谷胱甘肽二钠盐培养，然后用含有脲之类的再折叠剂的缓冲剂培养。

还可以如下将重组蛋白复性：例如用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或50mM乙酸钠pH 6缓冲剂加上200mM NaCl将其渗析。或者，使用含有蛋白酶抑制剂的在500mM NaCl，20％甘油，20mM Tris/HCl pH7.4中的直线6M-1M脲梯度溶液将蛋白质固定在柱(例如Ni NTA柱)上，与此同时将蛋白质再折叠。复性可以进行1.5小时或更久。复性之后，加入250mM咪唑来洗脱蛋白质。通过用PBS或50mM乙酸钠pH6缓冲剂加上200mM NaCl进行的最终渗析步骤去除咪唑。将提纯的蛋白质储存在4℃下或冰冻在-80℃下。

其它方法包括，例如，MH Lee等，Protein Expr.Purif.，25(1)：p.166-73(2002)，W.K.Cho等，J.Biotechnology，77(2-3)：p 169-78(2000)，Ausubel等(1987和定期增补)，Deutscher(1990)“Guide to ProteinPurification，”Methods in Enzymology卷182和该系列的其它卷；Coligan等(1996和定期增补)Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene，NY，S.Roe，Protein Purification Techniques：A Practical Approach(Practical Approach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag等，ProteinMethods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)中描述的那些。

活性蛋白或肽分析

活性蛋白可以具有作为序列来源的天然蛋白质或肽的至少20％，30％或40％，且优选至少50％，60％或70％，且最优选至少80％，90％或95％的比活性。此外，底物特异性(K_cat/K_m)任选大致类似于天然蛋白质或肽。通常，K_cat/K_m是天然蛋白或肽的至少30％，40％或50％；并优选至少60％，70％，80％或90％。蛋白质和肽活性以及底物特异性(K_cat/K_m)的检定和定量测量方法是本领域技术人员公知的。

按照本发明制成的重组蛋白或肽的活性可以通过本领域已知的任何蛋白质特定传统或标准活体外或活体内检定法测量。可以将假单胞菌分泌成的重组蛋白或肽的活性与相应原始蛋白质的活性进行比较以测定重组蛋白是否表现出与通常在相同或类似的生理条件下在原始蛋白或肽中观察到的活性大致类似或相当的活性。

可以将重组蛋白的活性与之前确立的天然蛋白质或肽的标准活性进行比较。或者，可以在与天然蛋白质或肽的同时或大致同时的对比检定法中测定重组蛋白质或肽的活性。例如，可以使用活体外检定法测定重组蛋白质或肽与目标之间(例如表达酶与底物之间、表达激素与激素受体之间、表达抗体与抗原之间等)的任何可检出的相互作用。这种检测可以包括测量比色变化、增殖变化、细胞死亡、细胞排斥、放射性变化、溶度变化、分子量变化(通过凝胶电泳和/或凝胶排阻法等测得)、磷酸化能力，抗体特异性检定法(例如ELISA检定法)等等。此外，活体内检定法包括，但不限于，与天然蛋白质或肽的生理效应比较起来检测假单胞菌制成的蛋白质或肽的生理效应(例如重量增加、电解质平衡变化、凝血时间变化、血凝块溶解变化和抗原反应的诱导)的检定法。通常，可以使用任何可与天然蛋白质或肽进行对比分析的活体外或活体内检定法来测定假单胞菌制成的重组蛋白或肽的活性，只要这种活性是可检定的。或者，可以检定本发明中制成的蛋白质或肽的刺激或抑制蛋白质或肽与下述分子之间的相互作用的能力——该分子通常会与蛋白质或肽相互作用，例如，通常与原始蛋白质相互作用的信号路径的底物或组分。这些检定法通常包括在允许蛋白质或肽与目标分子相互作用的条件下将蛋白质与底物分子结合的步骤，并且检测出与蛋白质和目标分子相互作用的生物化学后果。

在下列文献中描述了可用于测定蛋白质或肽活性的检定法：Ralph，P.J.，等(1984)J.Immunol.132：1858或Saiki等(1981)J.Immunol.127：1044，Steward，W.B.II(1980)The Interferon Systerms.Springer-Verlag，Vienna and New York，Broxmeyer，H.E.，等(1982)Blood 60：595，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis eds，1989，以及“Methods in Enzymology：Guide to Molecular Cloning Techniques”，Academic Press，Berger，S.L.和A.R.Kimmel eds.，1987，AK Patra等，Protein Expr Purif，18(2)：p/182-92(2000)，Kodama等，J.Biochem.99：1465-1472(1986)；Stewart等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA90：5209-5213(1993)；(Lombillo等，J.Cell Biol.128：107-115(1995)；(Vale等，Cell 42：39-50(1985))

相关蛋白质

宿主细胞可以设计成表达重组蛋白质或肽。这些可以具有任何类型和任何尺寸。然而，在某些具体实施方案中，重组蛋白或肽是治疗上有效的蛋白质或肽。在一些具体实施方案中，蛋白质可以是哺乳动物蛋白质，例如人类蛋白质，并且可以是例如，生长因子、细胞因子、趋化因子或血蛋白。重组蛋白或肽可以按照类似方法加工成天然蛋白或肽。在某些具体实施方案中，蛋白质或肽在编码序列中不包括分泌信号。在某些具体实施方案中，重组蛋白或肽在尺寸上低于100kD，低于50kD，或低于30kD。在某些具体实施方案中，重组蛋白或肽是至少5，10，15，20，30，40，50或100个氨基酸的肽。

可以广泛地公开获得分子遗传学和遗传工程技术所需的详尽的序号信息。哺乳动物以及人类的完整核苷酸序列、基因、cDNA序列、氨基酸序列和基因组的获得方法可获自GenBank，URL地址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez。附加信息还可获自GeneCards，来自WeizmannInstitute of Science Genome and BioinfOrnatics( http://bioinfOrnatics.weizmann.ac.il/cards/)的关于基因及其产品以及生物医学应用的电子百科全书集成信息，核苷酸序列信息还可获自EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/)或DNA数据库或Japan(DDBJ，http://www.ddbj.nig.ac.jp/)；氨基酸序列的信息的其它站点包括Georgetown的蛋白质信息资源网站( http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/)和Swiss-Prot( http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)。

可以在本发明中表达的蛋白质的例子包括如下分子，例如肾素、生长激素，包括人类生长激素；牛科生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激索；促甲状腺激素；脂蛋白；α-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；血栓形成素；促卵胞成熟激素；降血钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如第VIIIC因子、克雷斯马斯因子(factor IX)、组织因子、和von Willebrands因子；抗凝血因子，例如蛋白质C；atrial naturietic因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)的；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；米勒管抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance)；松弛素A-链；松弛素B-链；prorelaxin；鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或诸如NCF-β的神经生长因子；心脏营养素(心脏肥大因子)，例如心脏营养素-1(CT-1)；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1；TGF-β2；TGF-β3；TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑ICF-1)、胰岛素样生长因子；I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白质，例如CD-3、CD-4、CD-8、CD-19；促红细胞生成素；osteoinductive factors；免疫毒素；骨形态生成蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β、和-γ；菌落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(ILs)，例如IL-1至IL-10；抗-HER-2抗体；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白质；促衰变因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；homing受体；粘附分子(addressins)；调节蛋白；抗体；和上列多肽的任一种的片段。

在某些具体实施方案中，蛋白质或肽可以选自IL-1、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-12elasti、IL-13、IL-15、、IL-16、IL-18、IL-18BPa、IL-23、IL-24、VIP、促红细胞生成素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、血小板源生长因子(PDGF)、MSF、FLT-3配体、BGF、成纤维细胞生长因子(FGF；例如，αFGF(FGF-1)、βFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6或FGF-7)、胰岛素样生长因子(例如，IGF-1、IGF-2)；肿瘤坏死因子(例如，TNF、淋巴细胞毒素)、神经生长因子(例如，NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)；干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ)；白血病抑制因子(LIF)；睫状神经营养因子(CNTF)；制瘤素M；干细胞因子(SCF)；转化生长因子(例如，TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)；TNF总科(例如，LIGHT/TNFSF14、STALL-1/TNFSF13B(BLy5、BAFF、THANK)、TNFα/TNFSF2和TWEAK/INFSF12)；或趋化激素(chemokines)(BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIXEotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1/ABCD-1、MIP-1□、MIP-1□、MIP-2□/GRO□、MIP-3□/Exodus/LARC、MIP-3/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1、TARC、或TECK)。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了通过假单胞菌属宿主细胞制造重组多亚基蛋白质。可表达的多亚基蛋白质包括同数和异数(homomeric和heteromeric)蛋白质。多亚基蛋白质可以包括两个或多个可以相同或不同的亚基。例如，蛋白质可以是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亚基的同数蛋白质。蛋白质还可以是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亚基的异数蛋白质。示例性的多亚基蛋白质包括：包括离子通道受体的受体；包括软骨素的细胞外基质蛋白质；胶原；包括MHC蛋白质、全链抗体和抗体片段的免疫调节剂；包括RNA聚合酶、DNA聚合酶的酶；和膜蛋白质。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了通过宿主细胞制造血蛋白。该具体实施方案中表达的血蛋白包括，但不限于主要在哺乳动物的血液中发现的载体蛋白，例如白蛋白(包括人血清蛋白和牛白蛋白)、转铁蛋白、重组转运半分子(transferrin half-molecules)、结合珠蛋白、纤维蛋白原和其它抗血友病因子、补体成分、免疫球蛋白、酶抑制剂、诸如血管紧张素和血管舒缓激肽的物质的前体、胰岛素、内皮缩血管肽、和球蛋白(包括α、β、γ-球蛋白)，以及其它类型的prote ins、肽及其片段。已经提出了许多血蛋白的氨基酸序列(参看，S.S.Baldwin(1993)Comp.Biochem Physiol.106b：203-218)，包括人类血清白蛋白的氨基酸序列(Lawn，L.M.，等(1981)Nucleic Acids Research，9：6103-6114)和人类血清血蛋白转铁蛋白的氨基序列(Yang，F.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：2752-2756)。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了通过荧光假单胞菌属的宿主细胞制造重组酶或辅因子。在该具体实施方案中表达的酶和辅因子包括但不限于醛缩酶、胺氧化酶、氨基酸氧化酶、天门冬氨酸酶、B12依赖酶、羧肽酶、carboxyesterase、carboxylyases、chemotrypsin、CoA所需酶、氰醇合成酶、cystathione synthases、脱羧酶、脱氢酶、醇脱氢酶、脱水酶、心肌黄酶、加双氧酶、enoate reductases、epoxidehydrases、fumerases、半乳糖氧化酶、葡萄糖异构酶、葡糖氧化酶、glycosyltrasferases、甲基转移酶、腈水化酶、核苷磷酸化酶、氧化还原酶、oxynitilases、肽酶、glycosyltrasferase、过氧化物酶、稠合到具有治疗活性的多肽上的酶、组织纤溶酶原激活物、蛇毒凝血酶、链激酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶；脱氧核糖核酸酶、氨基酸水解酶(例如，天门冬酰胺酶、氨基水解酶)；羧肽酶；蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胶原酶；神经氨酸酶；乳糖酶、麦芽糖酶、蔗糖酶、和阿拉伯呋喃糖酶。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了通过荧光假单胞菌属的宿主细胞制造重组单链、Fab片段和/或全链抗体或它们的片段或部分。单链抗体可以包括在稳定折叠的多肽单链上的抗体的抗原结合区域。Fab片段可以是一段特定的抗体。Fab片段可以含有抗原结合位点。Fab片段可以含有2条链：轻链和重链片段。这些片段可以通过连接键或二硫键连接。

重组蛋白或肽的编码序列可以是目标多肽的内在编码序列(如果可以得到的话)，但是更优选是经过选择、改进或最优化以用于宿主细胞的选定表达的编码序列：例如通过合成基因以反应假单胞菌类型(例如荧光假单胞菌)的密码子使用偏性。在一个或多个载体内构造所得基因，或将所得基因插入一个或多个载体内，然后将载体转化成表达宿主细胞。被称作以“可表达形式”提供的核酸或多核苷酸是指含有至少一个可通过所选细菌表达宿主细胞表达的基因的核酸或多核苷酸。

在某些具体实施方案中，相关蛋白质是天然蛋白质(例如天然哺乳动物或人类蛋白质)，或与其基本同源。在这些具体实施方案中，蛋白质未发现具有串联体(concatameric)形式，而是仅连接到分泌信号上并任选连接到用于提纯和/或识别的标记序列上。

在其它具体实施方案中，相关蛋白质是在大约20至大约42℃具有活性的蛋白质。在一个具体实施方案中，蛋白质在生理温度具有活性并且在加热至高温或极端温度(例如超过65℃)时失活。

在其它具体实施方案中，相关蛋白质是在大约20至大约42℃具有活性和/或在加热至高温或极端温度(例如超过65℃)时失活的蛋白质；其是天然蛋白质(例如天然哺乳动物或人类蛋白质)，或与其基本同源，并且不以串联体形式从核酸中表达；而且启动子不是荧光假单胞菌中的内在启动子，而是来自另一有机体，例如大肠杆菌。

在其它具体实施方案中，制成的蛋白质还包括附加的导向序列，例如将蛋白质导向细胞外介质的序列。在一个具体实施方案中，附加的导向序列可连接到蛋白质的羧基末端上。在另一具体实施方案中，蛋白质包括自动转运子的分泌信号、两partner分泌系统、主末端分支系统或fimbrial usher孔蛋白。

实施例

实施例1.Sec-分泌信号肽的表征

通过大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)编码序列-染色体组DNA融合体的形成和表达来表征荧光假单胞菌Sec-系统分泌信号肽。进一步表征六个表达的融合体的特性。

用SPScan程序(Menne等(2000)BioinfOrnatics 16：741-742)与来自其它假单胞菌的同源蛋白进行比较，从而推导出被确认为PhoA融合体的分泌基因的信号序列的裂解位点。通过与信号肽酶II基序进行比较推导出putative脂蛋白的裂解位点；信号肽II特定裂解脂蛋白的信号序列。使用SignalP(用于分析putative信号肽的软件程序；获自Centerfor Biological Sequence Analysis of the Technical University of Denmark，在 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。还参看H Nielson等(1997)Protein Engineering 10：1-6。在有些情况下，使用增补来源进一步表征信号肽的特性。在pbp的情况下，通过加工过的融合蛋白的MALDI-TOF分析(参看下面的实施例5)获得裂解信息。该信息列在表6中。

表6.Sec-系统分泌信号肽的特性
		特性	Putative氨基酸序列
Putative磷酸盐结合蛋白	SEQ ID NO：1的2-24
		Putative孔蛋白E1前体，OprB	SEQ ID NO：3的2-21
Putative天青蛋白	SEQ ID NO：5的2-20
		Putative Lys-Arg-Orn结合蛋白	SEQ ID NO：7的2-23
Putative Fe(III)结合蛋白	SEQ ID NO：9的2-32
		Putative周质脂蛋白B前体	SEQ ID NO：11的2-17

PhoA融合蛋白的Western分析

为了分析是否制成了融合蛋白，在培养物(其通过离心分离到全细胞馏分(细胞质和周质)和无细胞培养液馏分中)上用抗体对碱性磷酸酶进行Western分析。在五个菌株(对其测定插入位点)中，四个信号序列(Putative天青蛋白、Putative磷酸盐结合蛋白、Putative周质脂蛋白B、Putative Fe(III)结合蛋白)产生了具有预定尺寸的融合蛋白，一个(Putative oprE蛋白)产生了比预定尺寸小大约40kD的蛋白质，一个(Putative Lys-Arg-Orn结合蛋白)产生了比预定尺寸小大约20kD的蛋白质。Western分析和PhoA活性分析表明信号序列将异质PhoA蛋白质输送到荧光假单胞菌的周质中。

实施例2.pbp-scFv融合体的构造、表达和表征

将磷酸盐结合蛋白(也就是包括Met1)的Putative 24氨基酸信号序列融合到gal2 scFv基因(gal2)上以产生SEQ ID Nos15和16(见表)并测试分泌到周质中和/或培养上清液中的情况。如下所述构造融合体。

磷酸盐结合蛋白分泌前导-gal2-His标记融合体

核酸序列(SEQ ID NO：15)
	atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gccgcc cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc actgtc tct ggt ggt tcc atc agt agt tat cac tgg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tggatt ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac aac ccc tcc ctc aag aat cga gtc acc ata tct gta gacacg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aac ctg agg tct gtg acc gct gca gac acg gcc gtg gta tat tac tgt gcgcga gga acg tat ggc cca gcc gga gat gct ttt gat atc tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcg agtggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc agc ggc ggt ggc gga tcg gac atc cag atg acc cag tct cct tccacc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt gag ggt att tat cac tgg ttg gcctgg tat cag cag aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt tta gcc agt ggg gcccca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat tttgca act tat tac tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc aaa cgtgcg gcc gca cat cac cat cat cac cat taa
氨基酸序列(SEQ ID NO：16)
	Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala AsnAla Val Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr LeuSer Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro ProGly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser LeuLys Asn Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Asn Leu Arg Ser ValThr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Gly Pro Ala Gly Asp Ala

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ilr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser IleGly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr GlnGln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu The Ile Ser Ser Leu Gln Pro AspAsp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly ThrLys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His

磷酸盐结合蛋白分泌前导-gal2-His标记融合体

核酸序列(SEQ ID NO：15)

氨基酸序列(SEQ ID NO：16)

pbp-scFv载体的构造：通过重叠延伸法(SOE)PCR使用拼接将荧光假单胞菌oprF和磷酸盐结合蛋白(pbp)putative信号序列在+2位置融合到部分Gal2编码序列上。使用荧光假单胞菌pbp分泌信号肽作模板，使用引物sig_pbp_for(gctctagagg aggtaactta tgaaactgaa acg；SEQID NO：17)和pbp_gal2SO_rev(ctgcacctgg gcggccaccg cgtt；SEQ IDNO：18)(包括pbp_gal2SOE_for(aacgcggtgg ccgcccaggt gcag；SEQ IDNO：19))进行PCR。这产生含有pbp信号肽编码序列和gal2单链抗体(scAb或scFv)的5’末端的编码序列的寡核苷酸片段。

还扩增gal2ORF。使用引物pbp_gal2SOE_for(SEQ ID NO：19)和scFv2rev(acgcgtcgac ttattaatgg tgatgatggt gatgtgcggc cgcacgtttg atc；SEQID NO：20)并使用gal2-编码多核苷酸作模板进行PCR。这产生含有pbp信号肽的3’末端编码序列和gal2的开放读码框(ORF)的多核苷酸片段。

将信号序列的指定-1氨基酸(提出的裂解位点前面的最后一个氨基酸)融合到gal2scFv(Ala)的+2氨基酸上。该融合体与磷酸盐结合蛋白信号肽的匹配之处在于紧随重组信号肽酶裂解位点的氨基酸(+1)是Ala，正如活性pbp蛋白中相应的氨基酸残基那样。

在Ptac启动子的控制下将所得融合体克隆到荧光假单胞菌载体Pmyc1803中以产生质粒Pdow1123(pbp:gal2)。将质粒转化成携带质粒pCN51-lacI(包括lac阻遏物)的荧光假单胞菌菌株MB101，产生菌株DC217。还将质粒转化成大肠杆菌菌株JM109。

用于在大肠杆菌中分泌的ScFv无性系的构造：将gal2 ORF结合到pET2b(+)上，从而使pelB信号序列在Gal2的+2位置融合到丙氨酸残基上。将正确的无性系转化成BL21(DE3)Gold(stratagene)以用于表达分析。

比较荧光假单胞菌与大肠杆菌中的Gal2 scFv分泌：如上所述，将用于大肠杆菌表达/分泌的pelB分泌信号与两个putative荧光假单胞菌分泌信号一起在+2位置融合到gal2开放读码框上，也就是去除融合体中的Gal2的N-末端蛋氨酸并替换成指定的信号序列(图2)。测试外膜孔蛋白F(oprF)和磷酸盐结合蛋白(pbp)信号序列将异质蛋白分泌到周质中和/或培养基中的能力。据发现，在20升规模的荧光假单胞菌中表达和加工了OprF和pbp前导序列构造。这两种构造都产生大约9-10克/升蛋白质，它们大部分被发现在不溶馏分中(图3B)。大约50％的oprF信号序列被加工，而大约100％的pbp信号被加工(图3A和3B)。

此外，来自pbp:gal2融合体的少量(＜1％)加工过的Gal2表现出已经分泌到培养基中(图3B)。与oprF信号序列类似，pelB信号序列表现出确实被加工过(图4)。在大肠杆菌中表达的pelB-gal2融合体产生大约1.6克/升的蛋白质，其大约54％被加工过的。其中，11％被发现在可溶馏分中。尽管与荧光假单胞菌pbp:gal2构造相比，对于大肠杆菌构造，蛋白质总量中有更大的比率被发现在可溶馏分中，但是在荧光假单胞菌中加工过的蛋白质的总收率明显更高。

实施例7：分泌Gal2发酵概述(*与BSA标准相比)
					大肠杆菌	荧光假单胞菌	Pf/Ec
发酵时间(小时)	8-9	50-70	8
				最大Gal2滴定度(*克/升)	1.6(0.8加工过)	9.3(2.5％cv)	6(12)
干燥生物量(克/升)	18	(70)	4
				Gal2/生物量(％w/w)	8.9(4.4加工过)	13	1.5(3)

ScFv活性的分析：进行酶联免疫测定法(ELISA)以测量纯化Gal13和Gal2抗-β-半乳糖苷酶scFv的活性。在涂有β-半乳糖苷酶的微板孔中加入不同量的纯化scFv。使用与碱性磷酸酶共轭的抗-His标记抗体和抗-mouse抗体检测结合抗体(图5A)。使用抗β-半乳糖苷酶的兔子多克隆抗体作为正对照物。如图6B所示，从小规模表达实验中提纯的Gal2抗体表现出明显的活性。这些结果表明来自包含体(Gal2)的分离的可复性活性抗体。

实施例3：比较大肠杆菌与荧光假单胞菌中的抗-地高辛scFv的分泌

将抗-地高辛scFv克隆到pET27d载体中以在大肠杆菌中进行分泌表达。将抗-地高辛scFv转译融合到pelB前导物(leader)上，产生pDOW1153。在荧光假单胞菌中，将抗-地高辛scFv转译融合到磷酸盐结合蛋白分泌信号序列上，产生pDOW1142。SDS-PAGE(图6)和Western分析(图7)表明在荧光假单胞菌和大肠杆菌中表达的抗-地高辛scFv都不可溶。大肠杆菌无性系在3小时诱导后产生60微克/毫升的蛋白质，且pelB分泌前导物没有表现出被加工。荧光假单胞菌无性系pDOW1142产生比pDOW1153多大约20倍的蛋白质，其中表达的蛋白质为1.23毫克/毫升(通过与BSA标准比较时SDS-PAGE的光密度分析法测得)(图8)。通过光密度分析法以20升规模测定时，携带pDOW1142的荧光假单胞菌进行的抗-地黄辛scFv表达为大约15-20克/升(数据未显示)。如在振荡培养瓶规模下观察的那样，所有蛋白质似乎都被恰当地加工。

纯化抗-地高辛scFv活性的分析。从荧光假单胞菌和大肠杆菌结构中提纯抗-地高辛scFv。使用酶联免疫吸附检定法(ELISA)评估活性。如图9所示，从携带分泌结构pDOW1142的荧光假单胞菌中分离出的抗-地高辛scFv被发现如多克隆抗体对照物一样是活性的。然而，大肠杆菌细胞质结构pDOW1152被发现含有活性抗-地高辛scFv，而从携带分泌的抗-地高辛scFv结构pDOW1153的大肠杆菌中提纯的蛋白质被发现无活性并且大量未被加工(图10)。

这些结果表明，荧光假单胞菌产生比大肠杆菌分泌的结构多19倍的蛋白质。此外，在大肠杆菌结构中使用的pelB分泌信号不如在荧光假单胞菌中的磷酸盐结合蛋白分泌信号那样被有效地加工。蛋白质在荧光假单胞菌和大肠杆菌中都几乎完全不溶。然而，纯化的荧光假单胞菌分泌的蛋白质与纯化的大肠杆菌胞浆蛋白质一起被发现是活性的。

实施例4.用于pbp:gal2的表征的MALDI-TOF分析

使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析来表征分泌的成熟蛋白质pbp:gal2的氨基酸组成以证实已经在pbp信号肽的putative信号肽酶裂解位点产生putative信号肽酶裂解。对于该分析，对于pbp:gal2获得肽质量指纹谱，并且将这些数据与推导氨基酸序列的理论肽质量指纹谱进行比较。为了产生这些肽质量指纹谱，用endoproteinase Lys-C消化蛋白质，并且测定所得肽的质量。通过源后衰减(MALDI-PSD)测定N-末端肽序列。没有观察到与未加工的蛋白质对应的肽质量。结果与预期的相同(数据未显示)。

实施例5：pbp-hGH融合体的构造、表达和表征

将荧光假单胞菌磷酸盐结合蛋白分泌前导物融合到人类生长激素(hGH)基因的成熟区域的N-末端并测试其分泌到周质中的情况。使用sig_pbp_for(SEQ ID NO：17)和pbp_hgh(gggaatggttgggaaggcca ccgcgttggc；SEQ ID NO：21)引物，从作为模板的荧光假单胞菌pbp信号序列的无性系中PCR扩增pbp信号序列编码区，然后进行凝胶提纯。这产生含有pbp信号肽编码序列和hGH的成熟区域的5’末端的编码序列的寡核苷酸片段。

使用引物ELVIfor(agagaactag taaaaaggag aaatccatgg ctacaggctcccggacgtcc；SEQ ID NO：22)和ELVIrev(agagactcga gtcattagaa gccacagctgccctccac；SEQ ID NO：23)，从人类垂体cDNA库(Clontech，Palo AltoCA)中PCR-扩增人类生长激素的编码cDNA，它们被设计成仅扩增hGH的成熟区域，并且克隆到pMYC1803/SpeI XhoI中，形成pDOW2400。使用引物pbp_hgh_revcomp(gccaacgcgg tggccttcccaaccattccc；SEQ ID NO：24)和hgh_rev(agagactcga gtcattagaa gccacagctgccctccacag agcggcac；SEQ ID NO：25)从pDOW2400中扩增成熟的hGH基因，然后用Strataprep柱(Stratagene)提纯以去除引物和其它反应组分。为了制造pbp-hGH融合体的编码多核苷酸，将两个PCR反应结合并再用sig_pbp_for(SEQ ID NO：17)和hgh_rev(SEQ ID NO：25)扩增以连接这两段。将该片段结合到pDOW1269上以形成pDOW1323-10，使pbp-hGH处于tac启动子的控制下。将ligation mix转化到荧光假单胞菌中。该融合体的DNA和氨基酸序列分别表现在(SEQ ID NO：26)和(SEQ ID NO：27)中。

磷酸盐结合蛋白分泌前导物-人类生长激素融合核酸序列(SEQID NO：26)

atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gct gct ggc gtt gcg aac gcc aac gcg gtg gcc ttccca acc att ccc tta tcc agg cct ttt gac aac gct atg ctc cgc gcc cat cgt ctg cac cag ctg gcc ttt gacacc tac cag gag ttt gaa gaa gcc tat atc cca aag gaa cag aag tat tca ttc ctg cag aac ccc cag acctcc ctc tgt ttc tca gag tct att ccg aca ccc tcc aac agg gag gaa aca caa cag aaa tcc aac cta gag ctgctc cgc atc tcc ctg ctg ctc atc cag tcg tgg ctg gag ccc gtg cag ttc ctc agg agt gtc ttc gcc aac agcctg gtg tac ggc gcc tct gac agc aac gtc tat gac ctc cta aag gac cta gag gaa ggc atc caa acg ctgatg ggg agg ctg gaa gat ggc agc ccc cgg act ggg cag atc ttc aag cag acc tac agc aag ttc gac acaaac tca cac aac gat gac gca cta ctc aag aac tac ggg ctg ctc tac tgc ttc agg aag gac atg gac aaggtc gag aca ttc ctg cgc atc gtg cag tgc cgc tct gtg gag ggc agc tgt ggc ttc taa
	氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala AsnAla Val Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His ArgLeu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln LysTyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser AsnArg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln SerTrp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala SerAsp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly ArgLeu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr AsnSer His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp MetAsp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

磷酸盐结合蛋白分泌前导物-人类生长激素融合核酸序列(SEQID NO：26)

氨基酸序列(SEQ ID NO：27)

首先以振荡培养瓶规模测试所得菌株。通过SDS-PAGE检测加工过和未加工的蛋白质的预计尺寸(分别是22.2kDa和24.5kDa)诱导带。大约一半的蛋白质被加工过(表明定向到周质中)，在加工过的蛋白中，大约一半在可溶馏分中，一半在不溶馏分中(数据未显示)。表达研究的规模最高为20升生物反应器。Coomassie-染色的SDS-PAGE凝胶的光密度分析发表明所得hGH总量的18％被加工过并可溶。菌株产生3.2克/升所有形式的hGH；加工过和可溶的hGH为0.6克/升。

实施例6：荧光假单胞菌中的Skp伴侣蛋白表达

在荧光假单胞菌中表达具有内在前导序列的大肠杆菌Skp蛋白质(图10)。在生长24小时后，加入5mM安息香酸盐诱导Skp(在PCT公开WO 04/005221中描述了安息香酸盐启动子)。在诱导12小时后，通过在20,000克的离心处理将诱导和未诱导蛋白质的样品分离入可溶和不溶馏分。使用MES缓冲剂在4-12％NuPAGE上分离蛋白质。仅在诱导的可溶样品中在大约17kDa的分子量观察到大肠杆菌Skp蛋白质(由图10中的箭头表示)。

通过MALDI源后衰减(PSD)将蛋白质识别为Skp。制备切离17kDa蛋白质带的胰凝乳蛋白酶消化液。观察两个胰凝乳蛋白酶片段，它们与由Skp的理论消化液预测的尺寸匹配(表8)进一步通过MALDI-PSD分析具有1378.7m/z的离子质量的putative N-末端肽，其显示出ADKIAIVNMGSLF的预计N-末端氨基酸序列，表明已经按照预期去除了前导序列，相当于Ala²⁰与Ala²¹之间的加工位点(图11)。

表8.Skp的胰凝乳蛋白酶肽质量的理论和观察值比较
				片段	序列	理论值[M+H]+	观察值[M+H]+
12	ADKIAIVNMGSLF*QQVAQKTGVSNTLENEF	1378.71892.9	1378.91893.1

^*通过MALDI-PSD进一步分析该片段。

实施例7：在大肠杆菌中的荧光假单胞菌信号序列表达

来自荧光假单胞菌的信号序列在大肠杆菌中起作用，可以使pbp:Gal2蛋白质被加工并分泌到周质中。

用pDOW1123(pbp:gal2融合)或pDOW1141(oprF:gal2融合)转化大肠杆菌菌株JM109(Promega)。用编码为pbp:gal2的pDOW1123转化的JM109表明，在37℃生长时用0.4mM和0.01mM IPTG诱导时的Gal2蛋白质的表达(图12)。用0.01mM IPTG诱导的培养物表现出与正对照物(在荧光假单胞菌中表达的DC265，pbp:gal2)相当的表达。

在图12中在28kDa区域中看到的两条带代表信号序列的细菌加工(裂解)之前和之后的Gal2。通过SDS-PAGE在不溶馏分中观察到这两个带，并且与通过DC245制成的加工过和未加工的Gal2共迁移(图13)。通过MALDI-PSD确定每个带的N-末端序列，从而证实下方带是Gal2并如预期被加工(FPTIPLSRPF)。上方带含有未加工的Gal2的序列。在SDS-PAGE凝胶上，周质样品显示出在尺寸上与加工过的Gal2一致的带(图14)。

在用0.01mM IPTG诱导并在37℃生长的JM109/pDOW1123样品的可溶、不溶和周质馏分上进行Western印迹法。结果表明在所有三个馏分中都发现了加工过的Gal2(图15)。

图3：未加工的gal2    加工过的gal2

php:gal2(pDOW1123)和oprF:gal2(pDOW1122)中的Western分析

20升规模的表达(32小时诱导)

图5：A碱性磷酸酶接合的抗-mouse抗体

抗-His标记单克隆抗体

用6×His标记的Gal2scFv

β-半乳糖苷酶

B ELISA检定法   分泌的oprF:gal2再折叠蛋白质和通过Ni-NTA提纯的细胞质gal13天然蛋白质

C从荧光假单胞菌或大肠杆菌中分离出的Gal13抗体活性的ELISA测量

图9：抗地黄辛ELISA

图11：未加工的Skp蛋白质的氨基酸序列。下划线的序列相当于信号序列

加工过的Skp蛋白质的氨基酸序列。下划线的序列相当于被识别为MALDI-PSD的信号序列。

Claims (151)

1.一种分离的核酸序列，其包含荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的分泌信号编码序列或与该编码序列基本同源的序列——该分泌信号肽选自磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号、外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号。

2.如权利要求1的核酸，其中该序列为磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号或与该pbp信号序列基本同源的序列编码。

3.如权利要求2的核酸，其中该序列与SEQ ID NO：2至少80％或至少85％相同。

4.如权利要求2的核酸，其中该序列与SEQ ID NO：2至少90％或至少95％相同。

5.如权利要求1的核酸，其中该序列与选自下列序列的核酸序列杂交：pbp分泌信号编码的序列、SEQ ID NO：2的序列、与SEQ ID NO：2至少80％相同的序列、与SEQ ID NO：2至少85％相同的序列、与SEQID NO：2至少90％相同的序列、与SEQ ID NO：2至少95％相同的序列。

6.如权利要求1的核酸，其包含SEQ ID NO：2的序列，其调节至反映选定表达核酸序列的宿主机体的密码子偏性。

7.如权利要求1的核酸，其中该序列为外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号或与该OprE信号序列基本同源的序列编码。

8.如权利要求7的核酸，其中该序列与SEQ ID NO：4至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。

9.如权利要求1的核酸，其中该序列为Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

10.如权利要求9的核酸，其中该序列与SEQ ID NO：6至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。

11.如权利要求1的核酸，其中该序列为天青蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

12.如权利要求11的核酸，其中该序列与SEQ ID NO：8至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。

13.如权利要求1的核酸，其中该序列为铁(III)结合蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

14.如权利要求13的核酸，其中该序列与SEQ ID NO：10至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。

15.如权利要求1的核酸，其中该序列为脂蛋白B分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

16.如权利要求15的核酸，其中该序列与SEQ ID NO：12至少80％、或至少85％、至少90％或至少95％相同。

17.如权利要求1的核酸，其中该序列与选自下列序列的核酸序列杂交：与SEQ ID NO：4至少80％相同的序列、与SEQ ID NO：6至少80％相同的序列、与SEQ ID NO：8至少80％相同的序列、与SEQ ID NO：10至少80％相同的序列和与SEQ ID NO：12至少80％相同的序列。

18.如权利要求1的核酸，其包含选自SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的核酸序列，其被调节至反映选定表达核酸序列的宿主机体的密码子偏性。

19.如权利要求5或17的核酸，其中杂交是在严格条件下进行的。

20.如权利要求19的核酸，其中杂交在68℃进行。

21.一种重组载体，其包含编码荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的核酸分泌信号序列——该分泌信号肽选自pbp分泌信号、OprE分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号；或与该分泌信号序列基本同源的序列；或与该分泌信号序列杂交的序列。

22.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列是选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12，或是与该分泌信号序列基本同源的序列。

23.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列为磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号或与该pbp信号序列基本同源的序列编码。

24.如权利要求23的载体，其中分泌信号序列与SEQ ID NO：2至少80％或至少85％相同。

25.如权利要求23的载体，其中分泌信号序列与SEQ ID NO：2至少90％或至少95％相同。

26.如权利要求23的载体，其包含SEQ ID NO：2的分泌信号序列，其被调节至反映选定表达核酸序列的宿主机体的密码子偏性。

27.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列为外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

28.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列为Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

29.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列为天青蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

30.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列为铁(III)结合蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

31.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列为脂蛋白B分泌信号或与该信号序列基本同源的序列编码。

32.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列与选自下列序列的核酸序列杂交：与SEQ ID NO：4至少80％相同的序列、与SEQ ID NO：6至少80％相同的序列、与SEQ ID NO：8至少80％相同的序列、与SEQID NO：10至少80％相同的序列和与SEQ ID NO：12至少80％相同的序列。

33.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12，其被调节至反映选定表达核酸序列的宿主机体的密码子偏性。

34.如权利要求21的载体，其包含与分泌信号序列杂交的序列。

35.如权利要求34的载体，其中杂交是在严格条件下进行的。

36.如权利要求35的载体，其中杂交在68℃进行。

37.如权利要求21的载体，其中分泌信号序列被可操纵地连接到相关重组蛋白或肽的编码序列上。

38.如权利要求37的载体，其中重组蛋白或肽原产于宿主。

39.如权利要求38的载体，其中重组蛋白或肽原产于荧光假单胞菌。

40.如权利要求37的载体，其中重组蛋白或肽来自不是原产于宿主有机体的蛋白质或肽。

41.如权利要求37的载体，其中重组蛋白或肽来自非假单胞菌的有机体。

42.如权利要求37的载体，其中重组蛋白或肽来自真核有机体。

43.如权利要求37的载体，其中重组蛋白或肽来自哺乳动物有机体。

44.如权利要求37的载体，其在信号肽序列与重组蛋白或肽序列之间进一步包含连接序列。

45.如权利要求44的载体，其中连接序列可被信号肽酶裂解。

46.如权利要求37的载体，其中重组蛋白或肽序列被可操纵地连接到第二信号序列上。

47.如权利要求46的载体，其中第二信号序列包含导向外膜分泌信号的序列。

48.如权利要求21的载体，其中载体进一步包含启动子。

49.如权利要求48的载体，其中启动子原产于细菌宿主细胞。

50.如权利要求48的载体，其中启动子不是原产于细菌宿主细胞。

51.如权利要求48的载体，其中启动子原产于大肠杆菌。

52.如权利要求48的载体，其中启动子是可诱导启动子。

53.如权利要求48的载体，其中启动子是lac启动子或lac启动子的衍生物。

54.一种重组细胞，其包含编码荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的核酸分泌信号序列——该分泌信号肽选自pbp分泌信号、OprE分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号；与该分泌信号序列基本同源的序列；或与该分泌信号序列杂交的序列，或与该编码序列基本同源的序列。

55.如权利要求54的重组细胞，其中分泌信号序列在表达载体中。

56.如权利要求54的重组细胞，其中分泌信号序列是pbp序列。

57.如权利要求54的重组细胞，其中分泌信号序列是OprE序列。

58.如权利要求54的重组细胞，其中分泌信号序列被可操纵地连接到相关重组蛋白或肽上。

59.如权利要求54的重组细胞，其中细胞表达被可操纵地连接到由该核酸编码的分泌信号肽上的相关蛋白质或肽。

60.如权利要求59的细胞，其中该蛋白质或肽表达在细胞的周质隔室中。

61.如权利要求54的细胞，其中细胞中的酶使信号肽从相关蛋白质或肽裂解。

62.如权利要求54的细胞，其中细胞来自细菌宿主。

63.如权利要求62的细胞，其中宿主是假单胞菌。

64.如权利要求63的细胞，其中宿主是荧光假单胞菌。

65.如权利要求62的细胞，宿主是大肠杆菌。

66.一种分离肽，其包含荧光假单胞菌Sec-系统分泌肽的编码氨基酸序列——该分泌信号肽选自pbp分泌信号、OprE分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号，或与该信号序列基本同源的序列。

67.如权利要求66的肽，其中分泌肽包含磷酸盐结合蛋白(pbp)分泌信号或与该pbp信号序列基本同源的序列。

68.如权利要求66的肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸2-24至少90％相同。

69.如权利要求66的肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸2-24至少95％相同。

70.如权利要求66的肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸2-24至少98％相同。

71.如权利要求66的肽，其中分泌肽包含外膜孔蛋白E(OprE)分泌信号或与该OprE信号序列基本同源的序列。

72.如权利要求66的肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：3的氨基酸2-21至少90％相同。

73.如权利要求66的肽，其中分泌肽包含Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列。

74.如权利要求66的肽，其中分泌肽包含天青蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列。

75.如权利要求66的肽，其中分泌肽包含铁(III)结合蛋白分泌信号或与该信号序列基本同源的序列。

76.如权利要求66的肽，其中分泌肽包含脂蛋白B分泌信号或与该信号序列基本同源的序列。

77.如权利要求66的肽，其被可操纵地连接到相关重组蛋白或肽上。

78.如权利要求77的肽，其中重组蛋白或肽来自不是荧光假单胞菌有机体的有机体。

79.一种用于表达重组蛋白或肽的表达系统，包含：

a.一种宿主细胞；和

b.一种载体，其包含被可操纵地与荧光假单胞菌Sec-系统分泌信号相连的重组蛋白或肽——该分泌信号选自pbp分泌信号、OprE分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号、或与该信号序列基本同源的序列。

80.如权利要求79的系统，其中分泌信号序列是pbp序列。

81.如权利要求79的系统，其中分泌信号序列是OprE序列。

82.如权利要求79的系统，其中分泌信号序列是Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号。

83.如权利要求79的系统，其中分泌信号序列是天青蛋白分泌信号。

84.如权利要求79的系统，其中分泌信号序列是铁(III)结合蛋白分泌信号。

85.如权利要求79的系统，其中分泌信号序列是脂蛋白B分泌信号。

86.如权利要求79的系统，其中分泌信号序列被可操纵地连接到相关重组蛋白或肽上。

87.如权利要求79的系统，其中细胞表达被可操纵地与由该核酸编码的分泌信号肽相连的相关蛋白质或肽。

88.如权利要求87的系统，其中该蛋白质或肽表达在细胞的周质隔室中。

89.如权利要求87的系统，其中细胞中的酶使信号肽从相关蛋白质或肽裂解。

90.如权利要求79的系统，其中细胞来自细菌宿主。

91.如权利要求90的系统，其中宿主是假单胞菌。

92.如权利要求91的系统，其中宿主是荧光假单胞菌。

93.如权利要求90的系统，其中宿主是大肠杆菌。

94.如权利要求79的系统，进一步包含发酵培养基。

95.如权利要求94的系统，其中发酵培养基包含化学诱导物。

96.一种用于在宿主细胞中表达重组蛋白或肽的方法，包括提供一种包含载体的细胞，该载体编码与荧光假单胞菌Sec系统分泌信号可操纵地连接的重组蛋白或肽——该分泌信号选自pbp分泌信号、OprE分泌信号、Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号、天青蛋白分泌信号、铁(III)结合蛋白分泌信号和脂蛋白B分泌信号、或与该信号序列基本同源的序列；并在产生重组蛋白或肽的表达的条件下生长该细胞。

97.如权利要求96的方法，其中分泌信号是pbp分泌信号。

98.如权利要求96的方法，其中分泌信号是OprE分泌信号。

99.如权利要求96的方法，其中分泌信号是Lys-Arg-Orn结合蛋白分泌信号。

100.如权利要求96的方法，其中分泌信号是天青蛋白分泌信号。

101.如权利要求96的方法，其中分泌信号是铁(III)结合蛋白分泌信号。

102.如权利要求96的方法，其中分泌信号是脂蛋白B分泌信号。

103.如权利要求96的方法，其中细胞在无机盐培养基中生长。

104.如权利要求96的方法，其中细胞以高细胞密度生长。

105.如权利要求104的方法，其中细胞以至少20克/升的细胞密度生长。

106.如权利要求96的方法，额外包括将重组蛋白提纯。

107.如权利要求96的方法，其中通过亲和色谱法提纯重组蛋白。

108.如权利要求96的方法，其中重组蛋白与分泌信号的可操纵的连接可被原产于宿主细胞的酶裂解。

109.如权利要求109的方法，其中分泌信号在表达过程中与重组蛋白裂解。

110.如权利要求96的方法，其中重组蛋白或肽来自原产于宿主有机体的蛋白质或肽。

111.如权利要求96的方法，其中重组蛋白或肽来自原产于荧光假单胞菌的蛋白质或肽。

112.如权利要求96的方法，其中重组蛋白或肽来自不是原产于宿主有机体的蛋白质或肽。

113.如权利要求96的方法，其中重组蛋白或肽来自不是假单胞菌的有机体。

114.如权利要求96的方法，其中重组蛋白或肽来自真核有机体。

115.如权利要求96的方法，其中重组蛋白包含包括至少两个半胱氨酸残基的序列。

116.如权利要求96的方法，其中在细胞中在重组蛋白中形成至少一个二硫键。

117.如权利要求96的方法，在信号肽序列与重组蛋白或肽序列之间进一步包含连接序列。

118.如权利要求96的方法，其中至少50％重组蛋白包含天然氨基末端。

119.如权利要求96的方法，其中至少80％重组蛋白包含天然氨基末端。

120.如权利要求96的方法，其中至少90％重组蛋白包含天然氨基末端。

121.如权利要求96的方法，其中至少50％重组蛋白是活性的。

122.如权利要求96的方法，其中至少80％重组蛋白是活性的。

123.如权利要求96的方法，其中至少50％重组蛋白表达在周质隔室中。

124.如权利要求96的方法，其中至少75％重组蛋白表达在周质隔室中。

125.如权利要求96的方法，其中至少90％重组蛋白表达在周质隔室中。

126.如权利要求96的方法，其中细胞是假单胞菌细胞。

127.如权利要求126的方法，其中细胞是荧光假单胞菌细胞。

128.如权利要求96的方法，其中细胞是大肠杆菌细胞。

129.一种用于在荧光假单胞菌宿主细胞中表达重组蛋白的改进的方法，包括提供一种包含载体的荧光假单胞菌细胞，该载体编码与重组Sec系统分泌信号序列可操纵地相连的重组蛋白或肽；并在产生该蛋白或肽的表达的条件下生长该细胞。

130.如权利要求129的方法，其中信号序列来自荧光假单胞菌基因组。

131.如权利要求129的方法，其中信号序列不是来自荧光假单胞菌基因组。

132.如权利要求129的方法，其中信号序列来自大肠杆菌基因组。

133.如权利要求129的方法，其中细胞在无机盐培养基中生长。

134.如权利要求129的方法，其中细胞以高细胞密度生长。

135.如权利要求134的方法，其中细胞以至少20克/升的细胞密度生长。

136.如权利要求129的方法，额外包括将重组蛋白提纯。

137.如权利要求136的方法，其中通过亲和色谱法提纯重组蛋白。

138.如权利要求129的方法，其中重组蛋白与分泌信号的可操纵的连接可被原产于宿主细胞的酶裂解。

139.如权利要求138的方法，其中分泌信号在表达过程中与重组蛋白裂解。

140.如权利要求129的方法，其中重组蛋白或肽来自假单胞菌有机体。

141.如权利要求129的方法，其中重组蛋白或肽来自不是假单胞菌的有机体。

142.如权利要求129的方法，其中重组蛋白或肽来自真核有机体。

143.如权利要求129的方法，其中重组蛋白包含包括至少两个半胱氨酸残基的序列。

144.如权利要求129的方法，其中在细胞中在重组蛋白中形成至少一个二硫键。

145.如权利要求129的方法，在信号肽序列与重组蛋白或肽序列之间进一步包含连接序列。

146.如权利要求129的方法，其中至少50％重组蛋白包含天然氨基末端。

147.如权利要求129的方法，其中至少80％重组蛋白是活性的。

148.如权利要求129的方法，其中至少90％重组蛋白是活性的。

149.如权利要求129的方法，其中至少50％重组蛋白表达在周质隔室中。

150.如权利要求129的方法，其中至少75％重组蛋白表达在周质隔室中。

151.如权利要求129的方法，其中至少90％重组蛋白表达在周质隔室中。

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